ES2330335T3 - Purificacion de peptidos tipo glucagon. - Google Patents
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Abstract
Método para purificar un péptido similar al glucagón de una composición que comprende dicho péptido similar al glucagón y al menos una impureza relacionada, que el método es un proceso cromatográfico de líquidos de alto rendimiento de fase inversa donde el solvente usado para elución es pH-tamponado en la gama de pH 4 a pH 10, dicho solvente es pH-tamponado para prevenir variaciones de pH superiores a +/-1.0 unidades de pH del punto de referencia durante la fase de elución, y dicho solvente comprende un alcohol en una concentración del 20% p/p al 60% p/p, donde una impureza relacionada es una impureza que tiene similitud estructural al péptido similar al glucagón objetivo y es seleccionada del grupo que consiste en una forma truncada, una forma extendida, una forma desamidada, una forma incorrectamente plegada, una forma con glicosilación indeseada, una forma oxidada, una forma que resulta a partir de la racemización, una forma carente de aminoácidos en la cadena intra-peptídica, una forma que tiene aminoácidos extra en la cadena intra-peptídica y una forma en la cual se ha producido una acilación en otro residuo que el deseado.
Description
Purificación de péptidos tipo glucagón.
La presente invención se refiere al campo de
purificación de proteínas. En particular, la invención se refiere a
un método para purificar un péptido similar al glucagón de una
composición que comprende el péptido similar al glucagón y al menos
una impureza relacionada por cromatografía líquida de alto
rendimiento de fase inversa.
Para la purificación y el análisis de proteínas
y de péptidos (polipéptidos), la cromatografía es un método bien
conocido y muy utilizado. Se aplican varios principios
cromatográficos diferentes, entre ellos, la cromatografía líquida
de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC). El
principio de separación por RP-HPLC se basa en la
asociación hidrofóbica entre el soluto de polipéptido y ligandos
hidrofóbicos en la superficie de resina cromatográfica. La
purificación por RP-HPLC normalmente consiste en una
o más de las siguientes secciones: equilibrado, carga, lavado,
elución y regeneración.
El sistema solvente más frecuentemente aplicado
en RP-HPLC se basa en agua/acetonitrilo/ácido
trifluoroacético (TFA) y la elución de solutos normalmente se
obtiene aumentando el contenido orgánico, es decir, acetonitrilo,
del líquido aplicado a la columna cromatográfica. El acetonitrilo
tiene un fuerte efecto selectivo y desnaturalizante en los solutos
de polipéptido en RP-HPLC (Boysen, R.I. et
al., J. Biol. Chem. 277, 23-31 (2002)) y
combinado con TFA (consecuentemente a bajo pH - 2), este sistema es
aplicado como una herramienta analítica estándar en la industria
farmacéutica y otras industrias (Snyder, L.R. et al.,
"Practical HPLC method development", 2ª ed., capítulo 11 en
"Biochemical samples: Proteins, nucleic acids, carbohydrates, and
related compounds", John Wiley & Sons Inc., Nueva York,
1997). También, en escala de producción, se ha utilizado ampliamente
acetonitrilo a pH bajo para la purificación de polipéptido, es
decir, para la purificación de la insulina humana (Kroeff, E.P.
et al., J. Chromatogr. 461, 45-61 (1989)). Se
ha utilizado una resina de fase inversa basada en polímero
insustituida para la recuperación inicial de glucagón de las
glándulas del páncreas (US 4.617.376). La columna cromatográfica fue
manejada a pH 2,8 con acetonitrilo como el solvente orgánico y
glicina como el componente tampón. No hubo indicaciones de
eliminación de impurezas relacionadas por esta fase. Varios
análogos de glucagón obtenidos a partir de síntesis de péptidos
fueron purificados en una columna C_{18} con un gradiente lineal
en un sistema de acetonitrilo/TFA a bajo pH (Krstenanski, J.L. et
al., J. Biochem. 25, 3839-3845 (1986)). El
glucagón ha sido aislado de pez elasmobranquio en una columna
C_{18} usando un gradiente de acetonitrilo lineal a bajo pH
utilizando TFA como sustancia tampón (Conlon J.M. y L Thim. Gen.
Comp. Endocrinol. 60, 398-405 (1985)). El glucagón
recombinante en pollos fue expresado en E. coli y
posteriormente fue purificado usando varias fases incluida la
RP-HPLC con un gradiente lineal en un sistema de
acetonitrilo/TFA a bajo pH (Kamisoyama H. et al. Anim. Sci.
J. 71, 428-431 (2000)).
La insulina y el glucagón han sido separados de
pez elefante en una columna C_{18} usando un gradiente lineal de
acetonitrilo a pH 7,65 utilizando 50 mM de acetato de amonio como
sistema tampón (Berks B.C., et al., Biochem. J. 263,
261-266 (1989)).
WO 99/52934 expone un método de
RP-HPLC para la separación de varios derivados
insulínicos, con el cual se logró una separación mejorada entre los
componentes objetivo y las impurezas relacionadas glicosiladas por
medio de la adición de iones de calcio. La purificación fue
realizada a 22-25ºC usando etanol como el solvente
orgánico, y Tris o Bis-tris como componente tampón
en la gama de pH de aprox. 7,0-7,2, es decir, por
encima del punto isoeléctrico de la insulina.
También se ha descrito un proceso de
purificación para la insulina que incluye fases de
RP-HPLC en las columnas C_{18} con etanol como
agente de elución orgánico a bajo pH usando tampón de sulfato de
amonio y a pH cercano al neutro usando tampón tris (Mollerup I.
et al., "Insulin purification" en "Encyclopedia of
bioprocess technology", Eds. Flickinger M.C. y Drew S.W., pág.
1491-1498, John Wiley & Sons Inc. 1999). Las
impurezas relacionadas de la insulina fueron eliminadas por medio
de estos métodos.
En una columna C_{18} se ha obtenido
separación de productos yodados de glucagón usando distintos
gradientes comenzando con metanol al 40% en agua con 10 mM de tampón
fosfato y trietilamina a pH 3,0, y finalizando al 50% de
(acetonitrilo/0.1 M de carbonato de amonio, pH 9,0) o finalizando al
12,5% de (acetonitrilo/0.1 M de tris-HCl, pH 9,0)
(Rojas F.J. et al., Endo. 113, 711-719
(1983)). Los productos de glucagón fueron separados por esta
RP-HPLC de modo mixto (de solventes y pH) según el
grado de yodación. Además, los métodos fueron usados para separar
digeridos enzimáticos de glucagón y glucagón yodado.
Como es el caso para muchos otros polipéptidos,
los péptidos similares al glucagón incluidos los análogos y
derivados han sido ampliamente purificados usando la
RP-HPLC que aplica un gradiente lineal de
acetonitrilo con pequeñas cantidades de TFA como sustancia tampón a
bajo pH, es decir, debajo del punto isoeléctrico (pl) del
componente polipeptidíco objetivo. Se ha aislado
GLP-1 de intestinos pequeños de dos especies, cerdos
y seres humanos (Ørskov C. et al., J. Biol. Chem. 264,
12826-12829 (1989)). La purificación se obtuvo
usando un gradiente lineal en un sistema de etanol/TFA, y se obtuvo
una purificación adicional usando una elución isocrática en un
sistema de acetonitrilo/TFA, ambos a bajo pH en una columna
C_{18}. Estas dos formas de GLP-1 relacionadas
(GLP-1 y GLP-1 de extensión NH_{2}
terminal) no fueron separadas por ninguno de los métodos.
Se ha aplicado un sistema de
RP-HPLC basado en acetonitrilo/TFA para la
investigación de formas de GLP-1 en perros en el
íleon (Namba M. et al., Biomedical Res. 11(4),
247-254 (1990)). Hubo algunas indicaciones de que
distintas formas fueron separadas, y que estándares de amida
GLP-1 y
des-Gly^{37}-GLP-1
sintéticamente obtenidos tuvieron tiempos de elución ligeramente
diferentes aplicando este método. Se ha aplicado una columna C_{4}
en un sistema de RP-HPLC basado en acetonitrilo/TFA
a bajo pH para purificación de proteínas de fusión de un derivado
de GLP-1 y de exendina-4 con
fragmentos de anticuerpos y albúmina de suero humano (WO
02/46227).
Varios productos de ruptura de preproglucagón
han sido separados en una columna C_{18} con elución de gradiente
en un sistema de acetonitrilo/TFA a bajo pH (Noe B.D. y Andrews
P.C., Péptidos 7, 331-336 (1986)).
Se ha usado una columna de cianopropilo en un
sistema de RP-HPLC basado en acetonitrilo/TFA a
bajo pH para la purificación de varios análogos de
GLP-1 obtenidos a partir de síntesis química (WO
98/08871).
GLP-2 ha sido separado de otros
péptidos relacionados con proglucagón de intestinos de dos
especies, cerdos y seres humanos (Buhl T. et al., J. Biol.
Chem. 263, 8621-8624 (1988)). La purificación se
obtuvo usando un gradiente lineal en un sistema de acetonitrilo/TFA
a bajo pH y se aplicó purificación adicional usando una elución
isocrática en un sistema de etanol/TFA, ambos a bajo pH en una
columna C_{18}. Por el último método, se separó citocromo C
oxidasa de GLP-2, no obstante, estas dos formas de
GLP- 2 relacionadas (GLP-2 y GLP-2
de extensión NH_{2} terminal) no fueron separadas.
WO 01/04156 expone variantes de
exendina-4 y variantes de GLP-1
obtenidas tanto sintéticamente como por tecnología recombinante. Las
variantes obtenidas de síntesis de péptidos fueron purificadas en
una columna C_{18} aplicando elución de gradiente de un sistema
de acetonitrilo/TFA a bajo pH, mientras que los péptidos
recombinantes fueron purificados en una columna C8 aplicando un
gradiente lineal de un sistema de acetonitrilo/TFA a bajo pH.
WO 00/41548 expone el uso de una columna
C_{18} aplicando elución de gradiente de un sistema de
acetonitrilo/TFA a bajo pH para purificar exendina-3
y exendina-4 obtenidos de síntesis de péptidos. WO
99/25727 expone el uso de una columna C_{18} aplicando elución de
gradiente de un sistema de acetonitrilo/TFA a bajo pH para
purificar varios agonistas de exendina (análogos y derivados de
exendina) obtenidos a partir de síntesis de péptidos.
Se ha separado glucagón, GLP-1 y
GLP-2 de extractos de páncreas humano en una
columna C_{18} usando un gradiente lineal en un sistema de
acetonitrilo/TFA a bajo pH (Suda K. et al., Biomedical Res.
9, 39-45 (1988)).
El nivel de flujo y los efectos de la
temperatura han sido descritos para una purificación por
RP-HPLC de un análogo de GLP-1
obtenido a partir de tecnología recombinante en una columna
C_{18} con etanol como agente de elución orgánico sin controlar
el pH de los solventes cromatográficos (Schou O., presentado en la
6ª Conferencia de Interlaken sobre avances en producción de
productos biológicos, Interlaken, Suiza, 25-28 de
marzo, 2003).
EP 0708179 expone el uso de síntesis de fase
sólida para generar varios análogos y derivados de
GLP-1. Un protocolo de purificación empleado
incluyó la purificación en una columna C_{18} a 45ºC usando un
gradiente lineal en un sistema de acetonitrilo/TFA a bajo pH. Otro
protocolo de purificación incluyó dos fases de
RP-HPLC a temperatura ambiente: purificación en una
columna C_{4} usando un gradiente lineal en un sistema de
acetonitrilo/TFA a bajo pH seguida de purificación en una columna
C_{18} usando un gradiente lineal en un sistema de
acetonitrilo/carbonato de amonio a pH 7,7. Varias impurezas
relacionadas y material de inicio fueron eliminados por el método de
dos fases dando como resultado una pureza HPLC de aprox. 99% del
componente objetivo y un rendimiento general de sólo 14,8%.
Senderoff et al. (J. Pharm. Sci. 87,
183-189 (1998)) utilizaron síntesis de fase sólida
y tecnología recombinante usando expresión en levadura para generar
GLP-1 humano nativo para estudios de cambios
conformacionales. El protocolo de purificación para el
GLP-1 recombinante incluyó entre otros dos fases de
RP-HPLC usando etanol como el agente de elución
orgánica. La primera fase de RP-HPLC fue realizada
a pH 10,7 con 0,05 M de hidróxido amónico como tampón, mientras que
la segunda fase de RP-HPLC fue realizada a bajo pH
(debajo de pH 3) con el 1% de ácido acético como tampón. El
protocolo de purificación dio como resultado una pureza de
GLP-1 de aprox. el 98,5%, no obstante, el producto
sufrió cambios conformacionales drásticos dando como resultado
dificultades en la redisolución del producto. Además, el alto pH
implicado en las fases del proceso incluida la primera fase de
RP-HPLC indujo productos de degradación catalizada
por bases, que fueron menos bioactivos que el compuesto objetivo.
Se empleó una tercera fase de RP-HPLC (condiciones
no especificadas) como una de diferentes fases para reprocesar el
GLP-1 objetivo y devolverlo a la estructura
conformacional correcta.
US 2003/144471 se refiere a un método para la
producción de análogos y derivados de GLP-1
recombinante usando un método de HPLC de fase inversa para la
purificación en un sistema tampón de gradiente lineal que comprende
tris, sulfato de sodio y etanol.
La presente invención se basa en la aplicación
de solventes con pH tamponado que comprenden un alcohol como el
agente de elución orgánico para la purificación por
RP-HPLC de péptidos similares al glucagón y análogos
y derivados del mismo a pH cercano al neutro. La presente invención
facilita la eficacia de separación y aplicación aumentadas para uso
industrial en comparación con la técnica actual dentro de la
purificación por RP-HPLC de péptidos similares al
glucagón usando sistemas de solvente basados en alcohol.
Sorprendentemente, la separación de compuestos peptídicos similares
al glucagón objetivo y las impurezas relacionadas es mejorada por la
metodología nueva y da como resultado productos peptídicos
similares al glucagón más estables.
El uso de pH cercano al neutro durante la
purificación por RP-HPLC tiene la ventaja de que la
agregación potencial es evitada en la columna para estos péptidos
similares al glucagón, lo cual será reflejado por un ejemplo. Esto
resulta sorprendente porque la insulina y el glucagón como se
presentó más arriba pueden ser manejados a bajo pH sin agregación
en la columna, presentando aquí la diferencia en la naturaleza
entre la insulina y el glucagón por un lado y los péptidos
similares al glucagón por otro lado.
El uso de alcohol durante la purificación por
RP-HPLC tiene la ventaja adicional de inducir mejor
conservación conformacional de péptidos en comparación con el
acetonitrilo más comúnmente usado. Además, el acetonitrilo (y TFA)
son productos químicos tóxicos que, debido a cuestiones
medioambientales y de salud, no son adecuados y se debería evitar su
uso en escala industrial. Los alcoholes generalmente son menos
tóxicos y más adecuados para el uso industrial.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Cromatograma de AU_{280} comparado
con tiempo para la separación preparatoria usando gel de sílice 120
\ring{A} sustituido en C_{4} y elución a pH 3,5 de
Arg^{34}-GLP-1
(7-37) de impurezas relacionadas que son impurezas
glicosiladas.
Figura 2. Cromatograma de AU_{280} comparado
con tiempo para la separación preparatoria usando gel de sílice 120
\ring{A}
sustituido en C_{4} y elución a pH 7,5 de Arg^{34}-GLP-1 (7-37) de impurezas relacionadas que son impurezas glicosiladas al igual que la forma truncada, Arg^{34}-GLP-1 (9-37).
sustituido en C_{4} y elución a pH 7,5 de Arg^{34}-GLP-1 (7-37) de impurezas relacionadas que son impurezas glicosiladas al igual que la forma truncada, Arg^{34}-GLP-1 (9-37).
Figura 3. Cromatograma de AU_{280} comparado
con tiempo para la separación preparatoria usando gel de sílice 200
\ring{A} sustituido en C_{18} y elución a pH 3,5 de
Arg^{34}-GLP-1
(7-37) de impurezas relacionadas que son impurezas
glicosiladas.
Figura 4. Cromatograma de AU_{280} comparado
con el tiempo para la separación preparatoria usando gel de sílice
200 \ring{A} sustituido en C_{18} y elución a pH 7,5 de
Arg^{34}-GLP-1
(7-37) de impurezas relacionadas que son impurezas
glicosiladas al igual que la forma truncada,
Arg^{34}-GLP-1
(9-37).
Figura 5. Cromatograma de AU_{280} comparado
con tiempo para la separación preparatoria usando gel de sílice 120
\ring{A} sustituido en Ci8 y elución a pH 7,5 de Arg^{34}
-GLP-1 (7-37) de impurezas
relacionadas que son impurezas glicosiladas al igual que la forma
truncada, Arg^{34}-GLP-1
(9-37).
Figura 6. Cromatograma de AU_{280} comparado
con el tiempo para la separación preparatoria de
Arg^{34}-GLP-1(7-37)
de impurezas relacionadas que son impurezas glicosiladas usando gel
de sílice 120 \ring{A} sustituido en C_{4} y elución a pH 7,5
en un solvente sin tampón pH.
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Lo siguiente es una definición detallada de los
términos usados en la especificación.
El término "purificar" un péptido de una
composición que comprende el péptido y uno o más contaminantes
significa aumentar el grado de pureza del péptido en la composición
reduciendo el contenido de al menos un contaminante de la
composición.
El término "impureza relacionada" según se
utiliza en este caso significa una impureza que tiene similitud
estructural con el péptido similar al glucagón objetivo. Una
impureza relacionada tiene estructura química o física diferente al
péptido similar al glucagón objetivo y es una forma truncada, una
forma extendida (aminoácidos extra, varios derivados etc.), una
forma desamidada, una forma incorrectamente plegada, una forma con
glicosilación indeseada que incluye sialilación, formas oxidadas,
formas que resultan a partir de racemización, formas carentes de
aminoácidos extra en la cadena intra-peptídica,
formas que tienen aminoácidos extra en la cadena
intra-peptídica, formas en las cuales ha ocurrido
una acilación en un residuo distinto al deseado.
El término "tampón" según se utiliza en
este caso se refiere a un compuesto químico que reduce la tendencia
del pH de un solvente cromatográfico a cambiar con el tiempo como
ocurriría de lo contrario. Los tampones incluyen pero no se limitan
a productos químicos tales como acetato sódico, carbonato sódico,
citrato sódico, glicil-glicina, glicina, histidina,
lisina, fosfato sódico, borato, TRIS
(Tris-hidroximetil-aminometano),
etanolamina o mezclas derivadas.
El término "péptido similar al glucagón"
según se utiliza en este caso se refiere a los péptidos homólogos
péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), péptido
similar al glucagón 2 (GLP-2) y oxintomodulina (OXM)
derivados del gen de preproglucagón, las exendinas al igual que los
análogos y derivados de los mismos. Las exendinas encontradas en el
monstruo de Gila son homólogos al GLP-1 y también
ejercen un efecto insulinotrópico. Ejemplos de exendinas son
exendina-4 y exendina-3.
Los péptidos similares al glucagón poseen las
siguientes secuencias (SEC ID Nº 1-5):
El término "análogo" según se utiliza en
este caso en referencia a un péptido significa un péptido
modificado donde uno o más residuos de aminoácidos del péptido han
sido sustituidos por otros residuos de aminoácidos y/o donde uno o
más residuos de aminoácidos han sido delecionados del péptido y/o
donde uno o más residuos de aminoácidos han sido delecionados del
péptido y/o donde uno o más residuos de aminoácidos han sido
añadidos al péptido. Esa adición o deleción de residuos de
aminoácidos puede tener lugar en el N-terminal del
péptido y/o en el C-terminal del péptido. Para
describir los análogos se utilizan frecuentemente dos sistemas
diferentes y simples: Por ejemplo
Arg^{34}-GLP-1(7-37)
o K34R-GLP-1 (7-37)
designa un análogo de GLP-1 donde la lisina que
ocurre naturalmente en la posición 34 ha sido sustituida con
arginina (abreviatura estándar de una sola letra para los
aminoácidos usados según la nomenclatura
IUPAC-IUB).
El término "derivado" según se utiliza en
este caso en relación con un péptido parental significa una
proteína parental químicamente modificada o un análogo de la misma,
donde al menos un sustituyente no está presente en la proteína
parental o un análogo de la misma, es decir, una proteína parental
que ha sido modificada de manera covalente. Modificaciones típicas
son amidas, carbohidratos, grupos alquilo, grupos acilo, ésteres,
pegilaciones y similares. Un ejemplo de un derivado de
GLP-1 (7-37) es Arg^{34},
Lys^{26}(N^{\varepsilon}-(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil)))-GLP-1
(7-37).
La expresión "un fragmento del mismo" según
se utiliza en este caso en relación con un péptido significa
cualquier fragmento del péptido con al menos el 20% de los
aminoácidos del péptido parental. Así, para la albúmina de suero
humano, un fragmento comprenderá al menos 117 aminoácidos puesto que
la albúmina de suero humano tiene 585 aminoácidos. En una forma de
realización, el fragmento tiene al menos el 35% de los aminoácidos
del péptido parental. En otra forma de realización, el fragmento
tiene al menos el 50% de los aminoácidos del péptido parental. En
otra forma de realización, el fragmento tiene al menos el 75% de
los aminoácidos del péptido parental.
El término "variante" según se utiliza en
este caso en relación con un péptido significa un péptido
modificado, es decir, un análogo del péptido parental, un derivado
del péptido parental o un derivado de un análogo del péptido
parental.
El término "péptido de
GLP-1" según se utiliza en este caso significa
GLP-1 (7-37), un análogo de
GLP-1, un derivado de GLP-1 o un
derivado de un análogo de GLP-1.
El término "péptido GLP-2"
según se utiliza en este caso significa GLP-
2(1-33), un análogo de GLP-2,
un derivado de GLP-2 o un derivado de un análogo de
GLP-2.
El término "péptido de
exendina-4" según se utiliza en este caso
significa exendina-4(1-39),
un análogo de exendina-4, un derivado de
exendina-4 o un derivado de un análogo de
exendina-4.
El término "péptido similar al glucagón
estable en plasma" según se utiliza en este caso significa un
péptido similar al glucagón químicamente modificado, es decir, un
análogo o un derivado que muestra una semivida de eliminación de
plasma in vivo de al menos 10 horas en el hombre, según se
determina por el siguiente método. El método para la determinación
de la semivida de eliminación de plasma de un péptido similar al
glucagón en el hombre es: El compuesto es disuelto en un tampón
isotónico, pH 7,4, PBS o cualquier otro tampón adecuado. La dosis
es inyectada periféricamente, preferiblemente en el abdomen o muslo
superior. Se toman muestras de sangre para la determinación del
compuesto activo a intervalos frecuentes y para una duración
suficiente para cubrir la parte de eliminación terminal (p. ej.
Predosis, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24 (día 2), 36 (día 2), 48
(día 3), 60 (día 3), 72 (día 4) y 84 (día 4) horas postdosis). La
determinación de la concentración de compuesto activo es realizada
como se describe en Wilken et al., Diabetologia
43(51): A143, 2000. Los parámetros farmacocinéticos
derivados son calculados a partir de los datos de
concentración-tiempo para cada sujeto individual
usando métodos no compartimentales, usando el software
comercialmente disponible WinNonlin versión 2.1 (Farsight, Cary, NC,
EEUU). La constante del nivel de eliminación terminal es estimada
por regresión log-lineal en la parte terminal
log-lineal de la curva de concentración- tiempo y es
usada para calcular la semivida de eliminación.
El término "péptido similar al glucagón
protegido contra DPP-IV" según se utiliza en
este caso significa un péptido similar al glucagón que ha sido
químicamente modificado para restituir dicho péptido resistente a la
aminopeptidasa-4 dipeptidil peptidasa de plasma
(DPP-IV) que la forma nativa de dicho péptido.
El término "péptido exendina-4
inmunomodulado" según se utiliza en este caso significa un
péptido exendina-4 que es un análogo o un derivado
de la exendina-4(1-39) que
tiene una respuesta inmunitaria reducida en seres humanos en
comparación con la
exendina-4(1-39). El método
para evaluar la respuesta inmunitaria es medir la concentración de
anticuerpos reactivos al péptido exendina-4 después
de 4 semanas de tratamiento del paciente.
El término "producto de péptido similar al
glucagón" según se utiliza en este caso significa el producto de
péptido purificado que se utilizará para la producción de una
composición farmacéutica. Así, el producto de péptido similar al
glucagón normalmente es obtenido como el producto de la fase final
de purificación, de secado o de condicionamiento. El producto puede
ser cristales, precipitado, solución o suspensión. El producto de
péptido similar al glucagón también es conocido en la técnica como
el principio activo, es decir, el ingrediente farmacéutico activo.
El término "punto isoeléctrico" según se utiliza en este caso
significa el valor de pH donde la carga neta global de una
macromolécula tal como un polipéptido es cero. En los polipéptidos
puede haber muchos grupos cargados y en el punto isoeléctrico la
suma de todas estas cargas es cero. A un pH por encima del punto
isoeléctrico la carga neta global del polipéptido será negativa,
mientras que a valores de pH debajo del punto isoeléctrico la carga
neta global del polipéptido será positiva.
El término "farmacéutico" según se utiliza
en este caso con referencia a una composición significa que es útil
para tratar una enfermedad o un trastorno.
El término "farmacéuticamente aceptable"
según se utiliza en este caso significa adecuados para aplicaciones
farmacéuticas normales, es decir, que no generan eventos adversos
en los pacientes, etc.
El término "cantidad eficaz" según se
utiliza en este caso significa una dosificación que es suficiente
para ser eficaz para el tratamiento del paciente en comparación con
la ausencia de tratamiento.
El término "composición farmacéutica" según
se utiliza en este caso significa un producto que comprende un
compuesto activo o una sal derivada del mismo junto con excipientes
farmacéuticos tales como tampón, conservante y, opcionalmente, un
modificador de tonicidad y/o un estabilizador. De ese modo, una
composición farmacéutica es también conocida en la técnica como una
fórmula farmacéutica.
El término "excipientes" según se utiliza
en este caso significa los compuestos químicos que normalmente son
añadidos a composiciones farmacéuticas, p. ej. tampones, agentes de
tonicidad, conservantes y similares.
El término "tratamiento de una enfermedad"
según se utiliza en este caso significa dirigir y cuidar de un
paciente que ha desarrollado la enfermedad, la condición o el
trastorno. El propósito del tratamiento es combatir la enfermedad,
la condición o el trastorno. El tratamiento incluye la
administración de los compuestos activos para eliminar o controlar
la enfermedad, la condición o el trastorno y aliviar los síntomas o
complicaciones asociadas a la enfermedad, la condición o el
trastorno.
En un primer aspecto, la invención se refiere a
un método para la purificación de un péptido similar al glucagón de
una composición que comprende dicho péptido similar al glucagón y
al menos una impureza relacionada, cuyo método es un proceso
cromatográfico de líquidos de alto rendimiento de fase inversa en
el cual el solvente usado para la elución es pH tamponado en la
gama de pH 4 a pH 10, dicho solvente es pH tamponado para prevenir
variaciones de pH superiores a +/-1.0 unidades de pH desde el punto
de referencia durante la fase de elución, y dicho solvente comprende
un alcohol en una concentración del 20% p/p al 60% p/p, donde una
impureza relacionada es una impureza que tiene similitud
estructural con el péptido similar al glucagón objetivo y es
seleccionada del grupo que consiste en una forma truncada, una
forma extendida, una forma desamidada, una forma incorrectamente
plegada, una forma con glicosilación no deseada, una forma oxidada,
un forma que se produce a partir de la racemización, una forma
carente de aminoácidos en la cadena intrapeptídica, una forma que
tiene aminoácidos extra en la cadena
intra-peptídica y una forma en la cual se ha
producido una acilación en otro residuo que no es el deseado.
La fracción de GLP objetivo y las impurezas son
eluidas y separadas por un gradiente de cambio de fase, lineal o
asintótico o isocráticamente en solvente orgánico, o en
combinaciones de los mismos. El gradiente componente de solvente
orgánico sería de una concentración inferior a una más alta. La
elución también puede ser posible cambiando el pH y/o la
temperatura en la sección de elución.
La solución de equilibrado y la muestra para la
aplicación pueden o no contener el solvente orgánico. El solvente
orgánico podría ser pero no se limita a cualquier alcohol alifático
monohídrico (metanol, etanol, propanoles y butanoles). Los
componentes de sal opcionales para cualquier sección de la
purificación cromatográfica puede ser cualquier sal que incluya y no
se limite a: NaCl, KCl, NH_{4}Cl, CaCl_{2}, acetato sódico,
acetato de potasio, acetato amónico, etc. Cualquier componente
tampón puede ser usado incluidos, a título enunciativo y no
limitativo: tampones de citrato, tampones de fosfato, tris
tampones, tampones de borato, tampones de carbonato, tampones de
acetato, tampones de amonio, tampones de glicina etc. El método
también se aplica a cualquier elección de resina de fase inversa
cromatográfica opcionalmente con cualquier tipo de sustitución,
incluidos, a título enunciativo y no limitativo: La resina basada
en sílice, tal como Kromasil 100 C_{18}, la resina basada en
polímero tal como Source de Amersham Biosciences, materiales Poros
de Applied Biosystems, p. ej. resinas de fase inversa Poros R1, R2
y R3, resinas basadas en cerámico de Ciphergen, resinas basadas en
óxido metálico y otras. Preferiblemente, se utiliza una resina
basada en
sílice.
sílice.
En una forma de realización de la invención el
solvente es pH tamponado en la gama de aproximadamente pH 5 a
aproximadamente pH 9.
En otra forma de realización de la invención el
solvente es pH tamponado a un pH superior al punto isoeléctrico de
dicho péptido similar al glucagón.
En otra forma de realización de la invención el
solvente es pH tamponado para prevenir variaciones de pH superiores
a +/- 1.0 unidades de pH del punto de referencia durante la fase de
elución.
En otra forma de realización de la invención el
solvente es pH tamponado para prevenir variaciones de pH superiores
a +/- 0.5 unidades de pH del punto de referencia durante la fase de
elución.
En otra forma de realización de la invención el
alcohol es etanol.
En otra forma de realización de la invención el
alcohol es 2-propanol.
En otra forma de realización de la invención, el
alcohol es seleccionado del grupo que consiste en metanol, 1
propanol y hexilenglicol.
En otra forma de realización de la invención, el
proceso cromatográfico de líquidos de alto rendimiento de fase
inversa es realizado usando una resina cromatográfica basada en
sílice.
En otra forma de realización de la invención la
resina es un gel de sílice sustituido, tal como gel de sílice de
C_{4}, C_{6}, C_{8}, C_{12}, C_{16}, C_{18}, C_{20},
fenilo obenceno sustituido.
En otra forma de realización de la invención el
proceso cromatográfico de líquidos de alto rendimiento de fase
inversa es realizado usando una resina cromatográfica que es un
material de base polimérica.
Los métodos de RP-HPLC con la
selectividad aumentada de péptidos similares al glucagón cerca del
pH neutro preferiblemente corresponden a la eliminación de
impurezas relacionadas con una estructura física o química
diferente al péptido similar al glucagón objetivo, y es seleccionado
del grupo que consiste en formas truncadas, todo tipo de formas
extendidas (aminoácidos extra, varios derivados etc.), formas
desamidadas, formas incorrectamente plegadas, formas con
glicosilación indeseada incluida la sialilación, formas oxidadas,
formas que resultan a partir de la racemización, formas carentes de
aminoácidos en la cadena intra-peptídica, formas que
tienen aminoácidos extra en la cadena
intra-peptídica y otros.
En una forma de realización de la invención la
impureza relacionada es una forma truncada de dicho péptido similar
al glucagón.
En otra forma de realización de la invención la
impureza relacionada es una forma glicosilada de dicho péptido
similar al glucagón.
En otra forma de realización de la invención el
solvente comprende un alcohol en una concentración de
aproximadamente el 20%p/p a aproximadamente el 40%p/p.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido similar al glucagón es GLP-1,
un análogo de GLP-1, un derivado de
GLP-1 o un derivado de un análogo de
GLP-1.
En otra forma de realización de la presente
invención el
Arg^{34}-GLP-1(7-37),
Gly^{8}-GLP-1(7-36)-amida,
Gly^{8}-GLP-1(7-37),
Val^{8}-GLP-1
(7-36)-amida, Val^{8}
-GLP-1(7-37),
Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}
Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Lys^{22}-GLP-1
(7-37),
Val^{8}Arg^{22}-GLP-1
(7-36)-amida,
Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}His^{22}-GLP-1
(7-37),
Val^{8}Trp^{19}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Tyr^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Leu^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Tyr^{18}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}
Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}Ile^{33}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Ile^{33}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37),
Val^{8}
Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37),
sus análogos y derivados de cualquiera de éstos.
\newpage
En otra forma de realización de la presente
invención el derivado de GLP-1 o un derivado de un
análogo de GLP-1 tiene un residuo de lisina, tal
como una lisina, donde un sustituyente lipofílico opcionalmente vía
un separador es fijado al grupo amino épsilon de dicha lisina.
En otra forma de realización de la presente
invención el sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de
carbono, preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a
18 átomos de carbono.
En otra forma de realización de la presente
invención el separador está presente y es seleccionado de un
aminoácido, p. ej. beta-Ala, L-Glu o
aminobutiroilo.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido similar al glucagón es un péptido similar al
glucagón protegido contra DPPIV. La peptidasa DPPIV hidroliza los
péptidos similares al glucagón y la tasa de depuración de péptidos
similares al glucagón puede ser reducida por estos análogos de las
formas naturales de péptidos similares al glucagón que son
protegidos contra DPPIV, es decir, aquellos análogos que bajo
condiciones fisiológicas tienen un nivel de hidrólisis inferior por
la enzima DPPIV. En otra forma de realización de la presente
invención el péptido similar al glucagón es un péptido similar al
glucagón estable en plasma.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido similar al glucagón es un derivado de un
análogo de GLP-1 que es Arg^{34},
Lys^{26}(N^{\varepsilon}-(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil)))-GLP-1(7-37).
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido similar al glucagón es un péptido
GLP-1 que tiene de 25 a 37 residuos de aminoácidos,
preferiblemente de 27 a 35 residuos de aminoácidos, incluso más
preferiblemente de 29 a 33 residuos de aminoácidos.
En una forma de realización de la presente
invención el péptido similar al glucagón es GLP-2,
un análogo de GLP-2, un derivado de
GLP-2 o un derivado de un análogo de
GLP-2.
En otra forma de realización de la presente
invención el derivado de GLP-2 o un derivado de un
análogo de GLP-2 tiene un residuo de lisina, tal
como una lisina, donde un sustituyente lipofílico opcionalmente vía
un separador es fijado al grupo amino épsilon de dicha lisina.
En otra forma de realización de la presente
invención el sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de
carbono, preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a
18 átomos de carbono.
En otra forma de realización de la presente
invención el separador está presente y es seleccionado de un
aminoácido, p. ej. beta-Ala, L-Glu,
aminobutiroilo.
En otra forma de realización de la presente
invención, el péptido similar al glucagón tiene de 27 a 39 residuos
de aminoácidos, preferiblemente de 29 a 37 residuos de aminoácidos,
incluso más preferiblemente, de 31 a 35 residuos de
aminoácidos.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido similar al glucagón es
Gly^{2}-GLP-2(1-33).
En una forma de realización de la presente
invención, el péptido similar al glucagón es
exendina-4, un análogo de
exendina-4, un derivado de
exendina-4, o un derivado de un análogo de
exendina-4.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido similar al glucagón es
exendina-4.
En otra forma de realización de la presente
invención el péptido similar al glucagón es el análogo de
exendina-4 ZP-10
(HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2).
En otra forma de realización de la presente
invención el derivado de exendina-4 o derivado de
un análogo de exendina-4 es acilado o pegilado.
En otra forma de realización de la presente
invención, el péptido similar al glucagón es un péptido
exendina-4 estable.
En otra forma de realización de la presente
invención, el péptido similar al glucagón es un péptido
exendina-4 protegido contra
DPP-IV.
En otra forma de realización de la presente
invención, el péptido similar al glucagón es un péptido
exendina-4 inmunomodulado.
En otra forma de realización de la presente
invención el derivado de exendina-4 o derivado de
un análogo de exendina-4 tiene un residuo de lisina,
tal como una lisina, donde un sustituyente lipofílico opcionalmente
vía un separador es fijado al grupo amino épsilon de dicha
lisina.
\newpage
En otra forma de realización de la presente
invención, el sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de
carbono, preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a
18 átomos de carbono.
En otra forma de realización de la presente
invención el separador está presente y es seleccionado de un
aminoácido, p. ej. beta-Ala, L-Glu o
aminobutiroilo.
En otra forma de realización de la presente
invención, el péptido similar al glucagón es un péptido
exendina-4 que tiene de 30 a 48 residuos de
aminoácidos, de 33 a 45 residuos de aminoácidos, preferiblemente de
35 a 43 residuos de aminoácidos, incluso más preferiblemente de 37
a 41 residuos de aminoácidos.
En una forma de realización de la invención el
péptido GLP-2 es seleccionado de la lista que
consiste en:
K30R-GLP-2(1-33);
S5K-GLP-2(1-33);
S7K-GLP-2(1-33);
D8K-GLP-2(1-33);
E9K-GLP-2(1-33);
M10K-GLP-2(1-33);
N11
K-GLP-2(1-33);
T12K-GLP-2(1-33);
I13K-GLP-2(1-33);
L14K-GLP-2(1-33);
D15K-GLP-2(1-33);
N16K-GLP-2(1-33);
L17K-GLP-2(1-33);
A18K-GLP-2(1-33);
D21K-GLP-2(1-33);
N24K-GLP-2(1-33);
Q28K-GLP-2(1-33);
S5K/K30R-GLP-2(1-33);
S7K/K30R-GLP 2(1-33);
D8K/K30R-GLP-2(1-33);
E9K/K30R-GLP-2(1-33);
M10K/
K30R-GLP-2(1-33); N11 K/K30R-GLP-2(1-33); T12K/K30R-GLP-2(1-33); I13K/K30R-GLP-2(1-33); L14K/K30R-GLP-2(1-33); D15K/K30R-GLP-2(1-33); N16K/K30R-GLP 2(1-33); L17K/K30R-GLP-2(1-33); A18K/K30R-GLP-2(1-33); D21 K/K30R-GLP-2(1-33); N24K/K30R-GLP-2(1-33); Q28K/K30R-GLP-2(1-33); K30R/D33K-GLP-2
(1-33); D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/S7K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2
(1-33); D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); y derivados de los mismos.
K30R-GLP-2(1-33); N11 K/K30R-GLP-2(1-33); T12K/K30R-GLP-2(1-33); I13K/K30R-GLP-2(1-33); L14K/K30R-GLP-2(1-33); D15K/K30R-GLP-2(1-33); N16K/K30R-GLP 2(1-33); L17K/K30R-GLP-2(1-33); A18K/K30R-GLP-2(1-33); D21 K/K30R-GLP-2(1-33); N24K/K30R-GLP-2(1-33); Q28K/K30R-GLP-2(1-33); K30R/D33K-GLP-2
(1-33); D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/S7K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2
(1-33); D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2(1-33); y derivados de los mismos.
En una forma de realización de la invención, el
derivado de GLP-2 es seleccionado del grupo que
consiste en
S5K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
S7K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
D8K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
E9K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
M10K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
N11K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
T12K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
I13K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L14K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
D15K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
N16K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(octanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(nonanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(decanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(undecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(dodecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(tridecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(tetradecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(pentadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(heptadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(octadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(nonadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K(3-(eicosanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(octanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(nonanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(decanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(undecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(dodecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(tridecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(tetradecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(pentadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(hexadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(heptadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(octadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(nonadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(9-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(eicosanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(octanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(nonanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(decanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(undecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(dodecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(tridecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(tetradecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(pentadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(hexadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(heptadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(octadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(nonadecanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
L17K(4-(eicosanoilamino)butanoil)-GLP-2(1-33);
A18K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
D21K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
N24K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
Q28K(3-(hexadecanoilamino)propionil)-GLP-2(1-33);
S5K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
S7K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
D8K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
E9K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
M10K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
N11K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
T12K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
I13K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L14K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
D15K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
N16K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(octanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(nonanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(decanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(undecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(dodecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(tridecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(tetradecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(pentadecanoilamino)propionil)/K30R-G
LP-2(1-33);
L17K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(heptadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(octadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(nonadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(3-(eicosanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(octanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(nonanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(decanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(undecanoilamino)butanoil)/K30R-G
LP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(dodecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(tridecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(tetradecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(pentadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2
(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(hexadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(heptadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(octadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(nonadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K((S)-4-carboxi-4-(eicosanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(octanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(nonanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(decanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(undecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(dodecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(tridecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(tetradecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(pentadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(hexadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(heptadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(octadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(nonadecanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
L17K(4-(eicosanoilamino)butanoil)/K30R-GLP-2(1-33);
A18K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
D21K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
N24K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
Q28K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R-GLP-2(1-33);
D3E/S5K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/S7K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D8K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/E9K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/M10K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/N 11
K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/T12K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/I13K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-G
LP-2(1-33);
D3E/L14K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D15K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/N16K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(octanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(nonanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(decanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(undecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(dodecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(tridecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(tetradecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(pentadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(heptadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(octadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(nonadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(3-(eicosanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(octanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(nonanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(decanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(undecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(dodecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(tridecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(tetradecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(pentadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(hexadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(heptadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(octadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(nonadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K((S)-4-carboxi-4-(eicosanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(octanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(nonanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(decanoilamino)butanoil)/K30RID33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(undecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(dodecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(tridecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(tetradecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-G
LP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(pentadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(hexadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(heptadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(octadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(nonadecanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/L17K(4-(eicosanoilamino)butanoil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/A18K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/D21
K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
D3E/N24K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33);
y
D3E/Q28K(3-(hexadecanoilamino)propionil)/K30R/D33E-GLP-2(1-33).
Se pueden encontrar métodos para la preparación
de GLP-2, análogos de los mismos al igual que
derivados de GLP-2 en, p. ej., WO 99/43361 y WO
00/55119.
En otra forma de realización de la invención el
péptido similar al glucagón es un análogo insulinotrópico de
exendina-4 (1-39), p. ej.
Ser^{2}Asp^{3}-exendina-4(1-39)
donde los residuos de aminoácidos en la posición 2 y 3 han sido
sustituidos con serina y ácido aspártico, respectivamente (este
análogo en particular también es conocido en la técnica como
exendina-3).
En otra forma de realización de la invención, el
péptido similar al glucagón es un derivado de
exendina-4 donde el sustituyente introducido es
seleccionado de amidas, carbohidratos, grupos alquilo, ésteres y
sustituyentes lipofílicos. Un ejemplo de un derivado
insulinotrópico de
exendina-4(1-39) y análogos
del mismo es
Tyr^{31}-exendina-4(1-31)-amida.
En otra forma de realización de la invención el
péptido similar al glucagón es un péptido
exendina-4 estable. En otra forma de realización de
la invención, el péptido similar al glucagón es un péptido
exendina-4 protegido contra DPP-IV.
En otra forma de realización de la invención, el péptido similar al
glucagón es un péptido exendina-4
inmunomodulado.
Se pueden encontrar métodos para la preparación
de exendina-4, análogos de la misma y derivados de
exendina-4 en, p. ej., WO 99/43708, WO 00/41546 y
WO 00/55119.
El péptido similar al glucagón parental puede
ser producido por síntesis peptídica, p. ej. síntesis peptídica de
fase sólida usando química Boc o Fmoc u otras técnicas bien
establecidas. El péptido similar al glucagón parental también puede
ser producido por un método que comprende el cultivo de una célula
huésped que contiene una secuencia de ADN que codifica el
polipéptido y que es capaz de expresar el polipéptido en un medio
nutritivo adecuado bajo condiciones que permiten la expresión del
péptido, después de lo cual el péptido resultante es recuperado del
cultivo.
El medio usado para cultivar las células puede
ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar las células
huéspedes, tales como medios mínimos o complejos que contengan
suplementos apropiados. Medios adecuados están disponibles de
proveedores comerciales o pueden ser preparados según recetas
publicadas (p. ej. en catálogos de la American Type Culture
Collection). El péptido producido por las células luego puede ser
recuperado del medio de cultivo por procedimientos convencionales
incluida la separación de las células huéspedes del medio por
centrifugado o filtración, precipitación de los componentes
proteínicos del sobrenadante o filtrado mediante una sal, p. ej.
sulfato de amonio, purificación por una variedad de procedimientos
cromatográficos, p. ej. cromatografía de intercambio fónico,
cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad, o
similares, según el tipo de péptido en cuestión.
La secuencia de ADN que codifica el péptido
parental puede ser adecuadamente de origen genómico o de ADNc, por
ejemplo, obtenido preparando una biblioteca genómica o de ADNc y
explorando las secuencias de ADN que codifican todo o parte del
péptido por hibridación usando sondas de oligonucleótidos
sintéticos conforme a las técnicas estándar (véase, por ejemplo,
Sambrook, J, Fritsch, EF y Maniatis, T, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York,
1989). La secuencia de ADN que codifica el péptido también puede
ser preparada sintéticamente por métodos estándar establecidos, p.
ej. el método de fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers,
Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, o el
método descrito por Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984),
801-805. La secuencia de ADN también puede ser
preparada por reacción en cadena de polimerasa usando cebadores
específicos, por ejemplo como se describe en US 4.683.202 o Saiki
et al., Science 239 (1988), 487-491.
La secuencia de ADN puede ser insertada en
cualquier vector que puede convenientemente ser sometido a
procedimientos de ADN recombinante, y la elección de vector
frecuentemente dependerá de la célula huésped en la cual será
introducida. Así, el vector puede ser un vector de replicación
autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad
extracromosómica, cuya replicación es independiente de la
replicación cromosómica, p. ej., un plásmido. De forma alternativa,
el vector puede ser uno que, al ser introducido en una célula
huésped, es integrado en el genoma de la célula huésped y replicado
con el o los cromosomas en los cuales ha sido integrado.
El vector es preferiblemente un vector de
expresión en el cual la secuencia de ADN que codifica el péptido
está operativamente enlazada a segmentos adicionales requeridos
para la transcripción del ADN, tal como un promotor. El promotor
puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad
transcripcional en la célula huésped de elección y puede ser
derivado de genes que codifican proteínas bien homólogas o
heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados
para dirigir la transcripción del ADN que codifica el péptido de la
invención en una variedad de células huéspedes son bien conocidos
en la técnica, cf. por ejemplo Sambrook et al.,
supra.
La secuencia de ADN que codifica el péptido
también puede, de ser necesario, ser conectada operativamente a un
terminador adecuado, señales de poliadenilación, secuencias
potenciadoras transcripcionales y secuencias potenciadoras
traduccionales. El vector recombinante de la invención además puede
comprender una secuencia de ADN que permita que el vector se
replique en la célula huésped en cuestión.
El vector también puede comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complementa un defecto
en la célula huésped o uno que confiera resistencia a un fármaco,
p. ej. ampicilina, canamicina, tetraciclina, cloranfenicol,
neomicina, higromicina o metotrexato.
Para dirigir un péptido parental de la presente
invención en la vía secretora de las células huéspedes, una
secuencia señal secretora (también conocida como una secuencia
guía, secuencia prepro o secuencia pre) puede ser proporcionada en
el vector recombinante. La secuencia señal secretora está unida a
la secuencia de ADN que codifica el péptido en el marco de lectura
correcto. Las secuencias señal secretoras comúnmente están situadas
5' a la secuencia de ADN que codifica el péptido. La secuencia señal
secretora puede ser aquella normalmente asociada al péptido o puede
provenir de un gen que codifica otra proteína segregada.
Los procedimientos usados para enlazar las
secuencias de ADN que codifican este péptido, el promotor y
opcionalmente el terminador y/o la secuencia señal secretora,
respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que
contengan la información necesaria para la replicación, son
conocidos por expertos en la técnica (cf., por ejemplo, Sambrook
et al., supra).
La célula huésped en la cual se introduce la
secuencia de ADN o el vector recombinante puede ser cualquier
célula que sea capaz de producir este péptido e incluye bacterias,
levadura, hongos y células eucarióticas superiores. Ejemplos de
células huéspedes adecuadas bien conocidas y usadas en la técnica
son, sin limitación, líneas celulares de E. coli,
Saccharomyces cerevisiae, o BHK o CHO de mamífero.
Las composiciones farmacéuticas que contienen un
péptido similar al glucagón purificado según la presente invención
normalmente contienen varios excipientes farmacéuticos, tales como
conservantes, agentes isotónicos y agentes tensioactivos. La
preparación de las composiciones farmacéuticas es bien conocida por
los expertos en la materia. Para facilitar la lectura, se hace
referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª
edición, 1995.
Las composiciones farmacéuticas que contienen un
péptido similar al glucagón purificado según la presente invención
pueden ser administradas por vía parenteral a pacientes que
necesiten tratamiento de este tipo. La administración parenteral
puede ser realizada por inyección subcutánea, inyección
intramuscular o inyección intravenosa mediante una jeringa,
opcionalmente una jeringa tipo pluma. De forma alternativa, la
administración puede ser realizada por infusión, p. ej. usando una
bomba de infusión.
La presente invención es ilustrada con mayor
detalle por medio de los siguientes ejemplos de los cuales, no
obstante, no se debe interpretar que limiten el alcance de la
protección. Las características descritas en la descripción
precedente y en los siguientes ejemplos pueden ser, tanto
separadamente como en cualquier combinación de los mismos, esencial
para realizar la invención en diversas formas de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
RP-HPLC analítica. El
análisis por RP-HPLC para la
identificación/verificación de valores máximos recogidos se efectuó
en una columna Waters Symmetry RP-18, 3,5 \mum,
100 \ring{A}, 4,6 x 150 mm. El tampón A consistió en 0,15 M
(NH_{4})_{2}SO_{4} en acetonitrilo al 7,8% (p/p), pH
2,5, y el tampón B contenía acetonitrilo al 63,4% (p/p). Los
gradientes lineales de B al 37-44,1% en 15 min
seguidos de B al 44,1-100% en 10 min fueron
ejecutados a un nivel de flujo de 1 ml/min. La temperatura
cromatográfica fue mantenida a 60ºC y se realizó detección UV a 214
nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura (S. cerevisiae) por tecnología de
ADN recombinante convencional como se describe en WO 98/08871.
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} en el
caldo de fermentación luego fue purificado por cromatografía en fase
inversa convencional y posteriormente precipitado en el pH
isoeléctrico del péptido, es decir, a pH 5,4. El precipitado fue
aislado por centrifugado.
El precipitado isoeléctrico que contiene
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} y las
impurezas relacionadas, entre otras la impureza truncada
Arg^{34}GLP-1_{(9-37)} fue
disuelta en agua y el pH fue ajustado a 3,5. Se cargaron 15 ml de la
solución (0,91 mg/ml) a 20 ml de resina de (dimetilbutil
dimetilsilil) sílice 120 \ring{A} sustituida en C_{4} (tamaño
de partícula 10 \mum, YMC) equilibrados con 40 ml 0,15 mol/kg de
sulfato de amonio, 5 mmol/kg de ácido cítrico, etanol al 25% (p/p)
pH 3,5. La columna fue lavada con 10 ml de solución de equilibrado
y la elución fue realizada con un gradiente lineal de etanol al
35-45% (0,15 mol/kg de sulfato de amonio, 5 mmol/kg
de ácido cítrico) durante 240 ml.
En la Fig. 1 se muestra un cromatograma de la
purificación preparatoria. Del perfil cromatográfico se puede
observar que las impurezas glicosiladas fueron separadas, no
obstante, no se obtuvieron valores máximos definidos ni separación
entre la forma truncada y la fracción GLP-1. Tampoco
se observó ninguna separación entre
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} y
Arg^{34}GLP-1_{(9-37)} por
análisis de RP-HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura, capturado por RP-LC y
precipitado como se describe en el ejemplo 2.
El precipitado isoeléctrico conteniendo
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} e
impurezas relacionadas, entre otras la impureza truncada
Arg^{34}GLP-1_{(9-37)}, fue
disuelta en agua y el pH fue ajustado a 7,5. Se cargaron 15 ml de la
solución (0,91 mg/ml) a 20 ml de gel de (dimetilbutil dimetilsilil)
sílice 120 \ring{A} sustituido en C_{4} (tamaño de partícula 10
\mum, YMC) equilibrados con 40 ml 0,15 mol/kg de sulfato de
amonio, 5 mmol/kg de ácido cítrico, etanol al 25% (p/p) pH 7,5. La
columna fue lavada con 10 ml de solución de equilibrado y la
elución fue realizada con un gradiente lineal de etanol al
30-40% (5 mol/kg de sodio dihidrógeno fosfato, 210
mmol/kg de acetato de potasio) durante 240 ml.
En la Fig. 1 se muestra un cromatograma de la
purificación preparatoria. Solamente del perfil cromatográfico se
puede observar que las impurezas glicosiladas fueron separadas y
además, la separación entre la forma truncada y la fracción de
GLP-1 objetivo se obtuvo a un pH controlado por
tampón de 7,5 de los solventes cromatográficos. Además, los
resultados de los análisis por RP-HPLC de las
fracciones dadas en la Tabla 1 muestran que el contenido de la forma
truncada, Arg^{34}
GLP-1_{(9-37)}, en el valor máximo
ha sido reducido a un nivel aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante la comparación de los perfiles
cromatográficos de los ejemplos 1 y 2, se observa una ventaja
adicional del pH neutro: un valor máximo principal mucho más alto y
más estrecho y por tanto se obtiene una concentración de agrupación
deseada más alta. Diferencias insignificantes en la preparación
entre los ejemplos 1 y 2 son: sistema tampón diferente para
controlar el pH de las pruebas cromatográficas respectivas y
diferentes sistemas de sal. Además, se empleó la misma pendiente de
gradiente, pero con diferente concentración de inicio de etanol
para obtener retención similar.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura (S. cerevisiae) por tecnología del
ADN recombinante convencional, como se describe en WO 98/08871.
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} en caldo
de fermentación libre de la célula fue purificado por cromatografía
de intercambio de cationes y el pH de la agrupación resultante que
contiene Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue ajustado a pH 9,0. 10 ml de la agrupación que contiene
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} (3,49
mg/ml) e impurezas relacionadas, entre otros la impureza truncada
Arg^{34}GLP-1_{(9-37)}, fueron
cargados a 20 ml de gel de (octadecil dimetil silil) sílice 200
\ring{A} sustituido en C_{18} (tamaño de partícula 15 \mum)
equilibrado con 40 ml de un solvente que contiene 0,15 mol/kg de
sulfato de amonio, 5 mmol/kg de ácido cítrico, etanol al 25% (p/p),
pH 3,5. La columna fue lavada con 10 ml de solución de equilibrado y
la elución fue realizada con un gradiente lineal de etanol al
35-45% (0,15 mol/kg de sulfato de amonio, 5 mmol/kg
de ácido cítrico) durante 240 ml. La temperatura fue mantenida a
23ºC durante toda la prueba.
En la Fig. 3 se muestra un cromatograma de la
purificación preparatoria. Las impurezas glicosiladas fueron
separadas, no obstante, la fracción de GLP- 1 objetivo no fue eluida
adecuadamente porque fibriló en la columna y no fue posible
recogerla. Por tanto, no se debería emplear pH bajo en relación con
un ligando altamente hidrofóbico, tal como C_{18}.
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura (S. cerevisiae) por tecnología del
ADN recombinante convencional, como se describe en WO 98/08871.
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} fue
capturado por cromatografía de intercambio de cationes como se
describe en el ejemplo 4.
10 ml de la agrupación (pH 8,9 a temperatura
ambiente) conteniendo
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} (3,49
mg/ml) e impurezas relacionadas, entre otros la impureza truncada
Arg^{34}GLP-1_{(9-37)}, fue
cargada a 20 ml de gel de (octadecil dimetil silil) sílice 200
\ring{A} sustituido en C_{18} (tamaño de partícula 15 \mum)
equilibrado con 40 ml de un solvente que contiene 250 mmol/kg de
cloruro de potasio, 5 mmol/kg de dihidrógeno fosfato de potasio,
etanol al 25%(p/p), pH 7,5. La columna fue lavada con 10 ml de
solución de equilibrado y la elución fue realizada con un gradiente
lineal de etanol al 30-40% (250 mmol/kg de cloruro
de potasio, 5 mmol/kg de dihidrógeno fosfato de potasio) durante 240
ml. La temperatura fue mantenida a 23ºC durante toda la prueba.
En la Fig. 4 se muestra un cromatograma de la
purificación preparatoria. Solamente del perfil cromatográfico se
puede observar que las impurezas glicosiladas fueron separadas y
además, la separación entre la forma truncada y la fracción de
GLP-1 objetivo se obtuvo a un pH controlado por
tampón de 7,5 de los solventes cromatográ-
ficos.
ficos.
Al comparar los perfiles cromatográficos de
ejemplos 4 y 5 se muestra que la fracción de GLP-1
objetivo sólo puede ser recogida de la prueba cromatográfica a pH
neutro. Diferencias insignificantes en la preparación entre los
ejemplos 4 y 5 son: sistema tampón diferente para controlar el pH de
las pruebas cromatográficas respectivas y diferentes sistemas de
sal. Además, se empleó la misma pendiente de gradiente, pero con
diferente concentración de inicio de etanol para obtener retención
similar.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura y capturado por cromatografía de
intercambio de cationes como se describe en el ejemplo 4.
51 ml de la agrupación (pH 7,45 a 22,5ºC)
conteniendo
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} (0.7
mg/ml) e impurezas relacionadas, entre otros la impureza truncada
Arg^{34}GLP-1_{(9-37)}, fue
cargada a 20 ml de gel de (octadecil dimetil silil) sílice 200
\ring{A} sustituido en C_{18} (tamaño de partícula 15 \mum)
equilibrado con 40 ml de un solvente que contiene 250 mmol/kg de
cloruro de potasio, 5 mmol/kg de dihidrógeno fosfato de potasio,
etanol al 25%(p/p), pH 7,5. La columna fue lavada con 10 ml de
solución de equilibrado y la elución fue realizada con un gradiente
lineal de etanol al 30-40% (250 mmol/kg de cloruro
de potasio, 5 mmol/kg de dihidrógeno fosfato de potasio) durante
240 ml. La temperatura fue mantenida a 4ºC durante toda la
prueba.
Se obtuvieron valores máximos definidos y
separación entre
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}, la forma
truncada Arg^{34}GLP-1_{(9-37)}
y formas glicosiladas del péptido a esta temperatura, similar a lo
presentado en el ejemplo 5. La diferencia insignificante en la
preparación entre este ejemplo y el ejemplo 5 es el uso de una
muestra diferente para cargar.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura y capturado por cromatografía de
intercambio de cationes como se describe en el ejemplo 4.
51 ml de la agrupación (pH 8,88 a 24,6ºC)
conteniendo
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} (0,7
mg/ml) e impurezas relacionadas, entre otros la impureza truncada
Arg^{34}GLP-1_{(9-37)}, fue
cargada a 20 ml de gel de (octadecil dimetil silil) sílice 200
\ring{A} sustituido en Ces (tamaño de partícula 15 \mum)
equilibrado con 40 ml de un solvente que contiene 250 mmol/kg de
cloruro de potasio, 5 mmol/kg de dihidrógeno fosfato de potasio,
etanol al 25%(p/p), pH 7,5. La columna fue lavada con 10 ml de
solución de equilibrado y la elución fue realizada con un gradiente
lineal de etanol al 25-35% (250 mmol/kg de cloruro
de potasio, 5 mmol/kg de dihidrógeno fosfato de potasio) durante
240 ml. La temperatura fue mantenida a 50ºC durante toda la
prueba.
Se obtuvieron valores máximos distintivos y
separación entre
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}, la forma
truncada Arg^{34}GLP-1_{(9-37)}
y formas glicosiladas del péptido a esta temperatura, similar a lo
presentado en el ejemplo 5. La diferencia insignificante en la
preparación entre este ejemplo y el ejemplo 5 es el uso de una
muestra diferente para cargar.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura y capturado por cromatografía de
intercambio de cationes como se describe en el ejemplo 4.
51 ml de la agrupación (pH 8,89 a 20,9ºC)
conteniendo
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} (0,7
mg/ml) e impurezas relacionadas, entre otros la impureza truncada
Arg^{34}GLP-1_{(9-37)} fue
cargada a 20 ml de gel de (octadecil dimetil silil) sílice 120
\ring{A} sustituido en C_{18} (tamaño de partícula 15 \mum)
equilibrado con 40 ml de un solvente que contiene 250 mmol/kg de
cloruro de potasio, 5 mmol/kg de dihidrógeno fosfato de potasio,
etanol al 25%(p/p), pH 7,5. La columna fue lavada con 10 ml de
solución de equilibrado y la elución fue realizada con un gradiente
lineal de etanol al 30-40% (250 mmol/kg de cloruro
de potasio, 5 mmol/kg de dihidrógeno fosfato de potasio) durante
240 ml. La temperatura fue mantenida a 23ºC durante toda la
prueba.
En la Fig. 5 se muestra un cromatograma de la
purificación preparatoria. Solamente del perfil cromatográfico se
puede observar que impurezas glicosiladas fueron separadas y
además, la separación entre la forma truncada y la fracción de
GLP-1 objetivo se obtuvo a un pH controlado por
tampón de 7,5 de los solventes cromatográficos. De hecho, se
alcanzó una resolución más alta entre el valor máximo de
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} y los
valores máximos circundantes incluido
Arg^{34}GLP-1_{(9-37)} con el
material 120 \ring{A} que con el material 200 \ring{A} descrito
en el ejemplo 5. La diferencia insignificante en la preparación
entre este ejemplo y el ejemplo 5 es el uso de una muestra diferente
para cargar.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura y capturado por cromatografía de
intercambio de cationes como se describe en el ejemplo 4.
63 ml de la agrupación (pH 8,84 a 22,1ºC)
conteniendo
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} (0,6
mg/ml) e impurezas relacionadas, entre otros la impureza truncada
Arg^{34}GLP-1_{(9-37)}, fueron
cargados a 20 ml de gel de (octadecil dimetil silil) sílice 120
\ring{A} sustituido en C_{18} (tamaño de partícula 15 \mum)
equilibrado con 40 ml de un solvente que contiene 250 mmol/kg de
cloruro de potasio, 5 mmol/kg de dihidrógeno fosfato de potasio,
etanol al 25%(p/p), pH 7,0. La columna fue lavada con 10 ml de
solución de equilibrado y la elución fue realizada con un gradiente
lineal de etanol al 30-40% (250 mmol/kg de cloruro
de potasio, 5 mmol/kg de fosfato de dihidrógeno de potasio) durante
240 ml. La temperatura fue mantenida a 23ºC durante toda la
prueba.
Se obtuvieron valores máximos distintivos y
separación entre Arg^{34}GLP- 1_{(7-37)}, la
forma truncada
Arg^{34}GLP-1_{(9-37)} y formas
glicosiladas del péptido a este pH, similar a lo presentado en el
ejemplo 8. La diferencia insignificante en la preparación entre
este ejemplo y el ejemplo 8 es el uso de una muestra diferente para
cargar.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura y capturado por cromatografía de
intercambio de cationes como se describe en el ejemplo 4.
La purificación fue realizada como se describe
en el ejemplo 9, pero el pH de los solventes fue 8,0.
Se obtuvieron valores máximos distintivos y
separación entre
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}, la
forma truncada
Arg^{34}GLP-1_{(9-37)} y formas
glicosiladas del péptido a este pH, similar a lo presentado en el
ejemplo 8. La diferencia insignificante en la preparación entre
este ejemplo y el ejemplo 8 es el uso de una muestra diferente para
cargar.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura, capturado por RP-LC y
precipitado como se describe en el ejemplo 2.
El precipitado isoeléctrico que contiene
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} e
impurezas relacionadas, entre otros la impureza truncada
Arg^{34}GLP-1_{(9-37)}, fue
disuelto en agua y el pH fue ajustado a 7,5. Se cargaron 15 ml de la
solución (0,91 mg/ml) a 20 ml de gel de (dimetilbutil dimetilsilil)
sílice 120 \ring{A} sustituido en C_{4} (tamaño de partícula 10
\mum, YMC) equilibrados con 40 ml 210 mmol/kg de acetato de
potasio, etanol al 25% (p/p) pH 7,5. La columna fue lavada con 10 ml
de solución de equilibrado y la elución fue realizada con un
gradiente lineal de etanol al 30-40%(210 mmol/kg de
acetato de potasio) durante 240 ml, es decir, en un sistema sin una
sustancia tampón al pH aplicado.
En la Fig. 6 se muestra un cromatograma de la
purificación preparatoria. Solamente, del perfil cromatográfico se
puede observar que impurezas glicosiladas fueron separadas, no
obstante, no se obtuvieron valores máximos distintivos ni
separación entre la forma truncada y la fracción de
GLP-1 objetivo.
Mediante la comparación de perfiles
cromatográficos de los ejemplos 3 y 11 se muestra que la fracción
de GLP-1 objetivo puede ser separada de la impureza
truncada a pH 7,5 si el pH es controlado por una sustancia tampón, y
así, la realización de la separación. a pH neutro sin una sustancia
tampón para controlar el pH reduce la eficiencia de separación del
sistema. No se aplicaron otras diferencias en la preparación entre
los ejemplos 3 y 11.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura (S. cerevisiae) por tecnología
recombinante convencional como se describe en otro lugar (WO
98/08871).
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} en el
caldo de fermentación fue luego purificado por cromatografía en fase
inversa con elución en un tampón de glicina a pH 9,0.
33 ml del eluato a pH 7,5 (1,1 mg/ml) fue
cargado a una columna de 20 ml de Source 15 RPC (Amersham Pharmacia
Biotech) de poliestireno/divinil benceno (tamaño de partícula 15
\mumm), equilibrados con 40 ml de etanol al 25%, 250 mmol/kg de
cloruro de potasio, 5 mmol/kg de citrato sódico, pH 6,75. La
columna fue lavada con 10 ml de solución de equilibrado y la elución
fue realizada con un gradiente lineal de etanol al
35-45% (250 mmol/kg de cloruro de potasio, 5
mmol/kg de citrato de sodio), pH 6,75 durante 240 ml. La
temperatura fue mantenida a 23ºC durante toda la prueba.
Se obtuvieron valores máximos distintivos y
separación entre Arg^{34}
GLP-1_{(7-37)} y formas
glicosiladas del péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura (S. cerevisiae) por tecnología
recombinante convencional como se describe en otro lugar (WO
98/08871). Arg^{34}
GLP-1_{(7-37)} en el caldo de
fermentación fue luego purificado por cromatografía en fase inversa
con elución en un tampón de glicina a pH 9,0.
4,6 ml de la solución (1,2 mg/ml) fue cargada a
una columna 3 ml RPC PolyBio (BioSepra) (tamaño de partícula 15
\mum), equilibrada con 6 ml de etanol al 25%, 250 mmol/kg de
cloruro de potasio, 5 mmol/kg de NaH_{2}PO_{4}, pH, 5. La
columna fue lavada con 1,5 ml de solución de equilibrado y la
elución fue realizada con un gradiente lineal de etanol al
35-45% (250 mmol/kg de cloruro de potasio, 5
mmol/kg de NaH_{2}PO_{4}), pH 7,5 durante 36 ml. La temperatura
fue mantenida a 23ºC durante toda la prueba.
Se obtuvieron valores máximos distintivos y
separación entre
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} y formas
glicosiladas del péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)}
fue expresado en levadura (S. cerevisiae) por tecnología
recombinante convencional como se describe en otro lugar (WO
98/08871).
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} en el
caldo de fermentación luego fue purificado por cromatografía en fase
inversa convencional y posteriormente precipitado en el pH
isoeléctrico del péptido, es decir, a pH 5,4. El precipitado fue
aislado por centrifugado.
30 g de isoprecipitado fue disuelto en 1,5 L de
agua. El pH fue ajustado a 8,37. Agrupaciones de 220 ml de la
solución fueron ajustadas a aproximadamente pH 3,5 y cargadas a una
columna 78 ml Source 30S (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada
con etanol al 45% (p/p), 20 mmol/kg de ácido cítrico, 75 mol/kg de
cloruro de potasio, pH 3,5. La columna fue lavada con 160 ml de
etanol al 45% (p/p), 20 mol/kg de ácido cítrico, 87,5 mol/kg de
cloruro de potasio, pH 3,5 y
Arg^{34}GLP-1_{(7-37)} fue
eluido con 400 ml de 200 mmol/kg de glicina, pH 9,0 Los eluados
fueron agrupados. 160 ml de la agrupación CIEC (1,8 mg/ml) fueron
ajustados a pH 7,5 y cargados a 78 ml de gel de sílice (OdDMeSi)
120 \ring{A} sustituido en C_{18} (tamaño de partícula 15
\mum) equilibrado con 160 ml de un solvente que contiene 250
mmol/kg de cloruro sódico, 5 mmol/kg de fosfato dihidrógeno de
sodio, etanol al 25%(p/p), pH 7,0. La columna fue lavada con 40 ml
de solución de equilibrado y la elución fue realizada con un
gradiente lineal de etanol al 28-38% (250 mmol/kg de
cloruro de sodio, 5 mmol/kg de dihidrógeno fosfato de sodio)
durante 936 ml. La temperatura fue mantenida a 23ºC durante toda la
prueba.
Se obtuvieron valores máximos distintivos y
separación entre
Arg^{34}^{34}GLP-1_{(7-37)} y
formas glicosiladas del péptido.
Diferencias insignificantes en la preparación
entre los ejemplos 14 y 5 son: carga más alta, muestra diferente
para carga, sistemas de tampón y sal diferentes y escala más
grande.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
fue obtenido a partir del péptido parental, Arg^{34}
GLP-1_{(7-37)}, por acilación como
se describe en WO 00/55119.
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
fue cargado a 20 ml de gel de (octadecil dimetil silil) sílice
sustituido en C_{18} (tamaño de partícula 15 \mum)
equilibrado con 40 ml de etanol al 25% p/p. La columna fue lavada
con 10 ml de etanol al 25% p/p, 250 mmol/kg de cloruro de potasio,
20 mmol/kg de propano bis-tris, pH 6,5 y
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
fue eluido con un gradiente lineal de etanol al
37-47,5% (250 mmol/kg de cloruro de potasio, 20
mmol/kg de propano bis-tris, pH 6,5) durante 480 ml.
La temperatura fue mantenida a 50ºC durante toda la prueba.
Se obtuvieron valores máximos distintivos y
separación entre
Arg^{34}Lys^{26}N^{\varepsilon}(-\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil))GLP-1_{(7-37)}
y formas des- y diaciladas y además, impurezas desconocidas
relacionadas fueron separadas en el flanco trasero.
\vskip1.000000\baselineskip
Lys^{17}Arg^{30}GLP-2_{(1-33)}
fue expresado en levadura (S. cerevisiae) por tecnología del
ADN recombinante convencional, p. ej. como se describe en WO
98/08871.
Lys^{17}Arg^{30}GLP-2_{(1-33)}
fue capturado por RP-LC y precipitado al pH
isoeléctrico de
Lys^{17}Arg^{30}GLP-2_{(1-33)}
(pH 4,0). El péptido fue además purificado en una columna de
hidroxiapatita y eluido con 100 mmol/kg de fosfato de hidrógeno de
potasio, pH 7,8 La agrupación de la captura fue purificada por
cromatografía de intercambio de aniones a pH 8.
La agrupación de la fase de intercambio de
aniones fue cargada a 4 L de gel de (octadecil dimetil silil)
sílice 100 \ring{A} sustituido en C_{18} (tamaño de partícula
15 \mum) equilibrado con etanol al 25% p/p, 10 mmol/kg de
dihidrógeno fosfato de sodio, 250 mmol/kg de cloruro de potasio, pH
7,5. La columna fue lavada con 7,8 L de etanol al 25%(10 mmol/kg de
dihidrógeno fosfato de sodio, 250 mmol/kg de cloruro de potasio, pH
7,5) seguido de 23,6 L de etanol al 34% (10 mmol/kg de dihidrógeno
fosfato de sodio, 250 mmol/kg de cloruro de potasio, pH 7,5). La
elución de
Lys^{17}Arg^{30}GLP-2_{(1-33)}
fue realizada con un gradiente lineal de etanol al
34-40% (10 mmol/kg de dihidrógeno fosfato de sodio,
250 mmol/kg de cloruro de potasio, pH 7,5) durante 78,6 L. La
temperatura fue mantenida a 23ºC durante toda la prueba. Se
obtuvieron valores máximos distintivos y separación entre
Lys^{17}Arg^{30}GLP-2_{(1-33)}
y una forma met-oxidada del péptido. Además,
Lys^{17}Arg^{30}GLP-2_{(1-33)}
fue separado de la impureza truncada (des His-Ala
Lys^{17}Arg^{30}
GLP-2_{(1-33)}.
GLP-2_{(1-33)}.
\vskip1.000000\baselineskip
Arg^{30}Lys^{17}N^{\varepsilon}(\beta-Ala(N^{\alpha}-hexadecanoil))
GLP-2_{(1-33)} fue obtenido a
partir del péptido parental,
Lys^{17}Arg^{30}GLP-2_{(1-33)},
por acilación como se describe en WO 00/55119.
Arg^{30}Lys^{17}N^{\varepsilon}(\beta-Ala(N^{\alpha}-hexadecanoil))
GLP-2_{(1-33)} fue cargado a 4 L
de gel de (octadecil dimetil silil) sílice 100 \ring{A}
sustituido en C_{18} (tamaño de partícula 15 \mum) equilibrados con 12 L de etanol al 40% p/p, 10 mmol/kg de fosfato de dihidrógeno de sodio, 250 mmol/kg de cloruro potasio, pH 7,5. La columna fue lavada con 4 L del solvente de equilibrado y 4 L de etanol al 43% p/p, 10 mmol/kg de fosfato de dihidrógeno de sodio, 227 mmol/kg de cloruro de potasio, pH 7,5. Arg^{30}Lys^{17}N^{\varepsilon}(\beta-Ala(N^{\alpha}-hexadecanoil)) GLP-2_{(1-33)} fue eluido con un gradiente lineal de etanol al 45-60% p/p (211 - 94 mmol/kg de cloruro de potasio, 10 mmol/kg de dihidrógeno fosfato de sodio, pH 7,5.) durante 120L. La temperatura fue mantenida a 23ºC durante toda la prueba.
sustituido en C_{18} (tamaño de partícula 15 \mum) equilibrados con 12 L de etanol al 40% p/p, 10 mmol/kg de fosfato de dihidrógeno de sodio, 250 mmol/kg de cloruro potasio, pH 7,5. La columna fue lavada con 4 L del solvente de equilibrado y 4 L de etanol al 43% p/p, 10 mmol/kg de fosfato de dihidrógeno de sodio, 227 mmol/kg de cloruro de potasio, pH 7,5. Arg^{30}Lys^{17}N^{\varepsilon}(\beta-Ala(N^{\alpha}-hexadecanoil)) GLP-2_{(1-33)} fue eluido con un gradiente lineal de etanol al 45-60% p/p (211 - 94 mmol/kg de cloruro de potasio, 10 mmol/kg de dihidrógeno fosfato de sodio, pH 7,5.) durante 120L. La temperatura fue mantenida a 23ºC durante toda la prueba.
Se obtuvieron valores máximos distintivos y
separación entre
Arg^{30}Lys^{17}N^{\varepsilon}(\beta-Ala(N^{\alpha}-hexadecanoil))
GLP-2_{(1-33)} y la forma
des-acilada más otras impurezas relacionadas.
\vskip1.000000\baselineskip
La
exendina-4(1-39) (con la
secuencia de aminoácidos HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGA
PPPS) y Exendina-4(2-39) (con la secuencia de aminoácidos GEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSS
GAPPPS) fueron sintetizadas por métodos de síntesis de fase sólida estándar usando química Fmoc.
PPPS) y Exendina-4(2-39) (con la secuencia de aminoácidos GEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSS
GAPPPS) fueron sintetizadas por métodos de síntesis de fase sólida estándar usando química Fmoc.
Una solución de
Exendina-4(1-39) conteniendo
la impureza relacionada
Exendina-4(2-39) fue disuelta
en agua a una concentración total de 1 mg de péptido/ml. 6 ml de la
solución fue cargada a una columna de 7,85 ml que contiene gel de
(octadecil-dimetil silil) sílice 120 \ring{A}
sustituido en C_{18} (tamaño de partícula 15 \mum)
equilibrados con 15,7 ml de un solvente que contiene etanol al 25%
p/p, monohidrato de di-hidrógeno fosfato de sodio al
0,069% p/p, acetato de potasio de 2,06% p/p, pH 4,02. La columna
fue lavada con 3,9 ml de solución de equilibrado. La elución fue
realizada con un gradiente isocrático de etanol al 36% durante 157
ml (20 CV) seguido de 23,6 ml de gradiente lineal (3 CV) de etanol
al 36% a 39% en monohidrato de di-hidrógeno fosfato
de sodio al 0,069% p/p, acetato de potasio al 2,06% p/p, pH 4,02.
Posteriormente, la elución fue realizada por un gradiente de fase a
etanol al 59% en monohidrato de fosfato de
di-hidrógeno de sodio al 0,069% p/p, acetato de
potasio al 2.06% p/p, pH 4,02 mantenido para 7,85 ml (1 CV). El
experimento fue realizado a temperatura ambiente.
Se obtuvieron valores máximos distintivos y
separación entre Exendina- 4(1-39) y
Exendina-4(2-39),
Exendina-4(1- 39) de elución antes de
Exendina- 4(2-39).
\vskip1.000000\baselineskip
Exendina-4(1-39)
y Exendina-4(2-39) fueron
sintetizados por métodos de síntesis de fase sólida estándar usando
química Fmoc.
Una solución de
Exendina-4(1-39) conteniendo
la impureza relacionada
Exendina-4(2-39) fue disuelta
en agua a una concentración total de 1 mg de péptido/ml. 8 ml de la
solución fueron cargados a una columna de 7,85 ml conteniendo gel
de (octadecil-dimetil silil) sílice 120 \ring{A}
sustituido en C_{18} (tamaño de partícula 15 \mum) equilibrada
con 15,7 ml de un solvente que contiene etanol al 25% p/p,
di-hidrógeno fosfato de sodio monohidrato al 0,069%
p/p, acetato de potasio de 2,06% p/p, pH 3,5. La columna fue lavada
con 3,9 ml de solución de equilibrado. La elución fue realizada con
un gradiente isocrático de etanol al 37% durante 110 ml (14 CV)
seguido de 24 ml de gradiente lineal (3 CV) de etanol al 37% al 39%
en di-hidrógeno fosfato de sodio monohidrato 0,069%
p/p, acetato de potasio al 2,06% p/p, pH 3,5. Posteriormente, la
elución fue realizada por un gradiente lineal a etanol al 59% en
di-hidrógeno fosfato de sodio monohidrato al 0,069%
p/p, acetato de potasio al 2,06% p/p, pH 3,5 durante 71 ml (9 CV).
El experimento fue realizado a temperatura ambiente.
Se obtuvieron valores máximos distintivos y
separación entre
Exendina-4(1-39) y
Exendina-4(2-39),
Exendina-4(1- 39) de elución antes que
Exendina-4(2-39).
\vskip1.000000\baselineskip
L-His^{1}
Exendina-4(1-39) y
D-His^{1}
Exendina-4(1-39) (con la
secuencia de aminoácidos HGEGTFTSDLSKQ
MEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS) fueron sintetizadas por métodos de síntesis de fase sólida estándar usando química Fmoc.
MEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS) fueron sintetizadas por métodos de síntesis de fase sólida estándar usando química Fmoc.
Una solución de L-His^{1}
Exendina-4(1-39) conteniendo
la impureza relacionada D-His^{1}
Exendina-4(1-39) fueron
disueltas en agua a una concentración total de 1 mg de péptido/ml.
8 ml de la solución fueron cargados a una columna de 7,85 ml que
contiene gel de (octadecil-dimetil silil) sílice 120
A sustituido en C_{18} (tamaño de partícula 15 \mum)
equilibrada con 15,7 ml de un solvente que contiene etanol al 25%
p/p, di-hidrógeno fosfato de sodio monohidrato al
0,069% p/p, acetato de potasio al 2,06% p/p, pH 3,5. La columna fue
lavada con 3,9 ml de solución de equilibrado. La elución fue
realizada con un gradiente isocrático de etanol al 37% durante 63 ml
(8 CV) seguido de 24 ml de gradiente lineal (3 CV) de etanol al 37%
al 39% en di-hidrógeno fosfato de sodio monohidrato
0,069% p/p, acetato de potasio al 2,06% p/p, pH 3,5.
Posteriormente, la elución fue realizada por un gradiente lineal a
etanol al 59% en di-hidrógeno fosfato de sodio
monohidrato al 0,069% p/p, acetato de potasio al 2,06% p/p, pH 3,5
durante 71 ml (9 CV). El experimento fue realizado a la temperatura
ambiente.
Se obtuvo separación entre
L-His^{1}
Exendina-4(1-39) y
D-His^{1} Exendina- 4(1-39)
y fue confirmada por análisis de tiempo de retención,
D-His^{1}
Exendina-4(1-39) de elución
antes de L-His^{1}
Exendina-4(1-39).
\vskip1.000000\baselineskip
L-His^{1}
Exendina-4(1-39) y
D-His^{1}
Exendina-4(1-39) fueron
sintetizados por métodos de síntesis de fase sólida estándar usando
química Fmoc.
Una solución de L-His^{1}
Exendina-4(1-39) conteniendo
la impureza relacionada D-His^{1}
Exendina-4(1-39) fueron
disueltas en agua a una concentración total de 1 mg de péptido/ml.
8 ml de la solución fueron cargados a una columna de 7,85 ml que
contiene gel de (octadecil-dimetil silil) sílice 120
A sustituido en C_{18} (tamaño de partícula 15 \mum)
equilibrados con 15,7 ml de un solvente que contiene etanol de 25%
p/p, MES al 0,13% p/p, acetato de potasio al 2,06% pH 6,7. La
columna fue lavada con 3,9 ml de solución de equilibrado. La
elución fue realizada con un gradiente isocrático de etanol al 34%
durante 157 ml (20 CV) seguido de un 24 ml de gradiente lineal (3
CV) de etanol al 34% a 39% en MES al 0.13% p/p, acetato de potasio
al 2,06% p/p, pH 6,7. Posteriormente, la elución fue realizada por
un gradiente de fase a etanol al 59% en MES al 0,13% p/p, acetato
de potasio al 2,06% p/p, pH 6,7 mantenido por 7,85 ml (1 CV). El
experimento fue realizado a temperatura ambiente.
Se obtuvo la separación entre
L-His^{1}
Exendina-4(1-39) y
D-His^{1}
Exendina-4(1-39) y fue
confirmada por análisis de tiempo de retención,
D-His^{1}
Exendina-4(1-39) de elución
antes de L-His^{1}
Exendina-4(1-39).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet US 4617376 A [0003]
\bullet WO 9952934 A [0005]
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\bullet WO 9808871 A [0011] [0110] [0117]
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<120> Purificación de péptidos tipo
glucagón
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<130> 6643.000-DK
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<160> 7
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glia monster
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Serina en posición 39 es
amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gila monster
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Serina en posición 39 es amidada
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (44)..(44)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lisina en posición 44 es amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Constructo sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
Claims (37)
1. Método para purificar un péptido similar al
glucagón de una composición que comprende dicho péptido similar al
glucagón y al menos una impureza relacionada, que el método es un
proceso cromatográfico de líquidos de alto rendimiento de fase
inversa donde el solvente usado para elución es
pH-tamponado en la gama de pH 4 a pH 10, dicho
solvente es pH-tamponado para prevenir variaciones
de pH superiores a +/-1.0 unidades de pH del punto de referencia
durante la fase de elución, y dicho solvente comprende un alcohol
en una concentración del 20% p/p al
60% p/p,
60% p/p,
donde una impureza relacionada es una impureza
que tiene similitud estructural al péptido similar al glucagón
objetivo y es seleccionada del grupo que consiste en una forma
truncada, una forma extendida, una forma desamidada, una forma
incorrectamente plegada, una forma con glicosilación indeseada, una
forma oxidada, una forma que resulta a partir de la racemización,
una forma carente de aminoácidos en la cadena
intra-peptídica, una forma que tiene aminoácidos
extra en la cadena intra-peptídica y una forma en
la cual se ha producido una acilación en otro residuo que el
deseado.
2. Método según la reivindicación 1, donde
dicho solvente es pH tamponado en la gama de pH 5 a pH 9.
3. Método según la reivindicación 1, donde
dicho solvente es pH- tamponado a un pH que es superior al punto
isoeléctrico de dicho péptido similar al glucagón.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho solvente es
pH-tamponado para prevenir variaciones de pH
superiores a +1- 0,5 unidades de pH del punto de referencia durante
la fase de elución.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho alcohol es etanol.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho alcohol es
2-propanol.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho alcohol es seleccionado
del grupo que consiste en metanol, 1- propanol y hexilen glicol.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el solvente además comprende
una o más sales seleccionadas del grupo que consiste en: NaCl, KCl,
NH_{4}Cl, CaCl_{2}, acetato sódico, acetato de potasio y acetato
amónico.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde el tampón es seleccionado del
grupo que consiste en: tampón citrato, tampón fosfato, tampón tris,
tampón borato, tampón carbonato, tampón acetato, tampón amonio y
tampón glicina.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho proceso cromatográfico
líquido de alto rendimiento de fase inversa es realizado usando una
resina cromatográfica basada en sílice.
11. Método según la reivindicación 10, donde
dicha resina es un gel de sílice sustituido, tal como gel de sílice
sustituido en C_{4}, C_{6}, C_{8}, C_{12}, C_{16},
C_{18}, C_{20}, fenilo o benceno.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, donde dicho proceso
cromatográfico de líquido de alto rendimiento de fase inversa es
realizado usando una resina cromatográfica que es un material de
base polimérica.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicha impureza relacionada es
una forma truncada de dicho péptido similar al glucagón.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicha impureza relacionada es
una forma glicosilada de dicho péptido similar al glucagón.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho solvente comprende un
alcohol en una concentración del 20% p/p al 40% p/p.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho péptido similar al
glucagón es GLP-1, un análogo al
GLP-1, un derivado de GLP-1 o un
derivado de un análogo de GLP-1.
17. Método según la reivindicación 16, donde
dicho análogo de GLP-1 es seleccionado del grupo
que consiste en
Arg^{34}-GLP-1(7-37),
Gly^{8}-GLP-1(7-36)-amida,
Gly^{8}-GLP-1(7-37),
Val^{8}-GLP-1
(7-36)-amida,
Val^{8}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Asp^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Lys^{22}-GLP-
1(7-36)-amida,
Val^{8}Lys^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Arg^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}Arg^{22}-
GLP-1(7-37),
Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-36)-amida,
Val^{8}His^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Trp^{19}Glu^{22}
-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Tyr^{16}Glu^{22}GLP-1(7-37),
Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Leu^{16}Glu^{22}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Tyr^{18}Glu^{22}-GLP-1
(7-37),
Val^{8}Glu^{22}His^{37}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Glu^{22}Ile^{33}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37),
Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}
Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37), análogos de los mismos y derivados de cualquiera de estos.
Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Glu^{22}Val^{25}Ile^{33}-GLP-1(7-37), Val^{8}Trp^{16}Glu^{22}Val^{25}-GLP-1(7-37), análogos de los mismos y derivados de cualquiera de estos.
18. Método según la reivindicación 16, donde
dicho derivado de GLP-1 o un derivado de un análogo
de GLP-1 tiene un residuo de lisina, tal como una
lisina, donde un sustituyente lipofílico opcionalmente vía un
separador es fijado al grupo amino épsilon de dicha lisina.
19. Método según la reivindicación 18, donde
dicho sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de carbono,
preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, por ejemplo 12 a 18
átomos de carbono.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 18-19, donde dicho separador está
presente y es seleccionado de un aminoácido, por ejemplo,
beta-Ala, L-Glu o
aminobutiroilo.
21. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho péptido similar al
glucagón es un péptido similar al glucagón protegido contra
DPPIV.
22. Método según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, donde dicho péptido similar al
glucagón es un péptido similar al glucagón estable en plasma.
23. Método según la reivindicación 16, donde
dicho derivado de un análogo de GLP-1 es Arg^{34},
Lys^{26}(N^{\varepsilon}-(\gamma-Glu(N^{\alpha}-hexadecanoil)))-GLP-1(7-37).
24. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 16-23, donde dicho péptido similar
al glucagón tiene de 25 a 37 residuos de aminoácidos,
preferiblemente de 27 a 35 residuos de aminoácidos, incluso más
preferiblemente de 29 a 33 residuos de aminoácidos.
25. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-15, donde dicho péptido similar
al glucagón es GLP-2, un análogo de
GLP-2, un derivado de GLP-2 o un
derivado de un análogo de GLP-2.
26. Método según la reivindicación 25, donde
dicho derivado de GLP-2 o un derivado de un análogo
de GLP-2 tiene un residuo de lisina, tal como una
lisina, donde un sustituyente lipofílico opcionalmente vía un
separador es fijado al grupo amino épsilon de dicha lisina.
27. Método según la reivindicación 26, donde
dicho sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de carbono,
preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a 18 átomos
de carbono.
28. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 26-27, donde dicho separador está
presente y es seleccionado de un aminoácido, p. ej.
beta-Ala, L-Glu, aminobutiroilo.
29. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 25-28, donde dicho péptido similar
al glucagón tiene de 27 a 39 residuos de aminoácidos,
preferiblemente de 29 a 37 residuos de aminoácidos, incluso más
preferiblemente de 31 a 35 residuos de aminoácidos.
30. Método según la reivindicación 25, donde
dicho péptido similar al glucagón es
Gly^{2}-GLP-2(1-33).
31. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-15, donde dicho péptido similar
al glucagón es exendina-4, un análogo de
exendina-4, un derivado de
exendina-4, o un derivado de un análogo de
exendina-4.
32. Método según la reivindicación 31, donde
dicho péptido similar al glucagón es
exendina-4.
33. Método según la reivindicación 31, donde
dicho péptido similar al glucagón es ZP-10, es
decir HGEGTFTSDL
SKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2.
SKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK-NH2.
34. Método según la reivindicación 31, donde
dicho derivado de exendina-4 o derivado de un
análogo de exendina-4 es acilado o pegilado.
35. Método según la reivindicación 31, donde
dicho derivado de exendina-4 o derivado de un
análogo de exendina-4 tiene un residuo de lisina,
tal como una lisina, donde un sustituyente lipofílico opcionalmente
vía un separador es fijado al grupo amino épsilon de dicha
lisina.
36. Método según la reivindicación 35, donde
dicho sustituyente lipofílico tiene de 8 a 40 átomos de carbono,
preferiblemente de 8 a 24 átomos de carbono, p. ej. 12 a 18 átomos
de carbono.
37. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 35-36, donde dicho separador está
presente y es seleccionado de un aminoácido, p. ej.
beta-Ala, L-Glu o
aminobutiroilo.
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