ES2341403T3 - Sintesis de policetidos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para producir un macrólido de 14 miembros que tiene un grupo 13-metilo, comprendiendo dicho procedimiento cultivar un organismo transformante que contiene ADN que codifica y está dispuesto para expresar una multienzima PKS (policétido sintasa) que produce un macrólido de 14 miembros, comprendiendo dicha multienzima PKS un módulo de carga y una pluralidad de módulos de extensión; en el que dicho módulo de carga está adaptado para cargar un residuo de malonilo y para efectuar luego la descarboxilación del residuo cargado para proporcionar una unidad de iniciador de acetato que se transfiere a una adyacente de dichos módulos de extensión; en el que dicho módulo de carga es de la forma KSq-ATq-ACP en la que: (a) KSq representa un dominio de tipo cetosintasa que se diferencia de un dominio KS de un módulo de extensión por tener un residuo de glutamina en lugar de una cisteína en el sitio activo; (b) ATq representa un dominio aciltransferasa que carga un malonilo y tiene un residuo de arginina en el sitio activo; y (c) ACP representa una proteína portadora de acilos; y en el que los módulos de extensión no están naturalmente asociados a un módulo de carga que efectúa la descarboxilación de un residuo de malonilo.
Description
Síntesis de policétidos.
La presente invención se refiere a
procedimientos para preparar macrólidos de 14 miembros mediante
síntesis recombinante. Los genes biosintéticos de policétidos o
porciones de los mismos que pueden derivarse de diferentes
agrupaciones de genes biosintéticos de policétidos se manipulan para
permitir la producción de policétidos novedosos específicos de
estructura predicha. Esta invención se refiere particularmente a la
sustitución de material genético que codifica la unidad de
iniciador natural con otros genes con el fin de preparar macrólidos
de 14 miembros con preferencialmente una unidad de iniciador de
acetato, a la vez que se minimiza la formación de subproductos que
contienen una unidad de iniciador diferente.
Los policétidos son una clase grande y
estructuralmente diversa de productos naturales que incluye muchos
compuestos que poseen propiedades antibióticas u otras
farmacológicas tales como eritromicina, tetraciclinas, rapamicina,
avermectina, monensina, epotilonas y FK506. En particular, los
policétidos se producen abundantemente por Streptomyces y
bacterias de actinomicetos relacionadas. Se sintetizan por la
condensación en etapas repetida de aciltioésteres de un modo
análogo al de la biosíntesis de ácidos grasos. La mayor diversidad
estructural encontrada entre los policétidos naturales surge de la
selección de (normalmente) acetato o propionato como unidades de
iniciador o "extendedor"; y del diferente grado de
procesamiento del grupo \beta-ceto observado
después de cada condensación. Ejemplos de etapas de procesamiento
incluyen reducción a \beta-hidroxiacil-,
reducción seguida de deshidratación a 2-enoil- y
reducción completa al aciltioéster saturado. El resultado
estereoquímico de estas etapas de procesamiento también se
especifica para cada ciclo de extensión de cadenas.
La biosíntesis de policétidos se inicia por un
grupo de enzimas formadoras de cadenas conocidas como policétido
sintasas. Se han descrito dos clases de policétido sintasa (PKS) en
actinomicetos. Una clase, llamada PKS de tipo I, representada por
las PKS para los macrólidos eritromicina, oleandomicina, avermectina
y rapamicina, está constituida por un conjunto diferente o
"módulo" de enzimas para cada ciclo de extensión de cadenas de
policétidos. Para un ejemplo véase la Figura 1 (Cortés, J. y col.
Nature (1990) 348:176-178; Donadio, S. y col.
Science (1991) 2523:675-679; Swan, D.G. y col. Mol.
Gen. Genet. (1994) 242:358-362; MacNeil, D. J. y
col. Gene (1992) 115:119-125; Schwecke, T. y col.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:7839-7843).
El término "módulo de extensión" como se
usa en este documento se refiere al conjunto de dominios contiguos
desde un dominio
\beta-cetoacil-ACP sintasa
("AKS") hasta el siguiente dominio proteína portadora de acilos
("ACP") que realiza un ciclo de extensión de cadenas de
policétidos. El término "módulo de carga" se usa para
referirse a cualquier grupo de dominios contiguos que realiza la
carga de la unidad de iniciador sobre la PKS y así hace que esté
disponible para el dominio KS del primer módulo de extensión. La
longitud del policétido formado se ha modificado, en el caso de la
biosíntesis de eritromicina, por la relocalización específica usando
ingeniería genética del dominio enzimático de la PKS productora de
eritromicina que contiene la cadena que libera la actividad de
tioesterasa/ciclasa (Cortés y col. Science (1995)
268:1487-1489; Kao, C.M. y col. J. Am. Chem. Soc.
(1995) 117:9105-9106).
Se ha mostrado que la deleción en el marco del
ADN que codifica parte del dominio cetoreductasa en el módulo 5 de
la pKS productora de eritromicina (también conocida como
6-desoxieritronolida B sintasa, DEBS) conduce a la
formación de análogos de eritromicina
5,6-didesoxi-3-\alpha-micarosil-5-oxoeritronolida
B,
5,6-didesoxi-5-oxoeritronolida
B y
5,6-didesoxi-6\beta-epoxi-5-oxoeritronolida
B (Donadio, S. y col. Science (1991) 252:675-679).
Asimismo, la alteración de residuos de sitios activos en el dominio
enoilreductasa de módulo 4 en DEBS, por ingeniería genética del ADN
que codifica la PKS correspondiente y su introducción en
Saccharopolyspora erythraea, condujo a la producción de
6,7-anhidroeritromicina C (Donadio, S. y col. Proc
Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:7119-7123).
La solicitud de patente internacional número WO
93/13663 describe tipos adicionales de manipulación genética de los
genes de DEBS que pueden producir policétidos cambiados. Sin
embargo, se ha notificado que muchos esfuerzos han sido
improductivos (Hutchinson, C. R. y Fujii, I. Annu. Rev. Microbiol.
(1995) 49:201-238, en la pág. 231). Se ha desvelado
la secuencia de ADN completa de los genes de Streptomyces
hygroscopicus que codifican la PKS de tipo I modular que
gobierna la biosíntesis del policétido inmunodepresor macrocíclico
rapamicina (Schwecke, T. y col. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:7839-7843). La secuencia de ADN está depositada
en la base de datos EMBL/Genbank con el número de registro
X86780.
La segunda clase de PKS, llamada PKS de tipo II,
está representada por las sintasas para compuestos aromáticos. Las
PKS de tipo II sólo contienen un único conjunto de actividades
enzimáticas para la extensión de cadenas y éstas se vuelven a usar
como apropiadas en ciclos sucesivos (Bibb, M. J. y col. EMBO J.
(1989) 8:2727-2736; Sherman, D. H. y col. EMBO J.
(1989) 8:2717-2725;
Fernandez-Moreno, M.A. y col. J. Biol. Chem. (1992)
267:19278-19290). Las unidades de "extendedor"
para las PKS de tipo II son normalmente unidades de acetato y la
presencia de ciclasas específicas impone la ruta preferida para la
ciclación de la cadena completa en un producto aromático
(Hutchinson, C. R. y Fujii, I. Annu. Rev. Microbiol. (1995)
49:201-238). Los policétidos híbridos se han
obtenido mediante la introducción de clones de ADN que contiene
genes de PKS de tipo II en otro cepa que contiene una agrupación de
genes de PKS de tipo II diferente, por ejemplo, mediante la
introducción de ADN derivado del agrupamiento de genes para
actinorrodina, un policétido pigmentado de azul de Streptomyces
coelicolor, en una cepa productora de policétidos antraquinona
de Streptomyces galileus (Bartel, P. L. y col. J. Bacteriol.
(1990) 172:4816-4826).
El número mínimo de dominios requeridos para la
extensión de cadenas de policétidos en una PKS de tipo II cuando se
expresa en una célula huésped de Streptomyces coelicolor (la
"PKS mínima") se ha definido, por ejemplo, en la solicitud de
patente internacional número WO 95/08548 de forma que contiene los
tres siguientes polipéptidos que son productos de los genes act
I: primer KS; en segundo lugar un polipéptido llamando CLF
con similitud de secuencias de aminoácidos de extremo a extremo
respecto a la KS pero en la que el residuo del sitio activo
esencial de la KS, concretamente un residuo de cisteína, está
sustituido o bien por un residuo de glutamina, o en el caso de la
PKS para un pigmento de espora tal como el producto génico
whiE (Chater, K. F. y Davis, N. K. Mol. Microbiol. (1990)
4:1679-1691) por un residuo de ácido glutámico
(Figura 2); y finalmente una ACP. Se ha establecido, por ejemplo,
en la solicitud de patente internacional número WO 95/08548 que el
CLF es un factor que determina la longitud de cadena de la cadena de
policétido que se produce por la PKS mínima. Sin embargo, se ha
encontrado (Shen, B. y col. J. Am. Chem. Soc. (1995)
117:6811-6821) que cuando el CLF para el octacétido
actinorrodina se usa para sustituir el CLF por el decacétido
tetracenomicina en células huésped de Streptomyces
glaucescens no se encuentra que se haya cambiado el producto de
policétido de un decacétido a un octacétido, por lo que queda poco
clara la función exacta del CLF. Se ha propuesto una nomenclatura
alternativa en la que la KS se designa KS\alpha y el CLF se
designa KS\beta para reflejar esta falta de conocimiento (Meurer,
G. y col. Chemistry and Biology (1997) 4:433-443).
El mecanismo por el que las unidades de iniciador de acetato y las
unidades de extendedor de acetato se cargan sobre la PKS de tipo II
no es conocido, pero se especula que la
malonil-CoA:ACP aciltransferasa de la ácido graso
sintasa de la célula huésped puede cumplir la misma función para la
PKS de tipo II (Revill, W. P. y col. J. Bacteriol. (1995)
177:3946-3952).
La solicitud de patente internacional número WO
95/08548 describe la sustitución de genes de PKS actinorrodina por
ADN heterólogo de otras agrupaciones de genes de PKS de tipo II para
obtener policétidos híbridos. La misma solicitud de patente
internacional WO 95/08548 describe la construcción de una cepa de
Streptomyces coelicolor que sustancialmente carece de la
agrupación de genes nativos para actinorrodina y el uso en esa cepa
de un vector de plásmido pRM5 derivado del vector de bajo número de
copias SCP2* aislado de Streptomyces coelicolor (Bibb, M. J.
y Hopwood, D. A. J. Gen. Microbiol. (1981) 126:427) y en el que el
ADN que codifica PKS heterólogo puede expresarse bajo el control de
la región promotora divergente act I/act III del agrupamiento
de genes de actinorrodina (Fernandez-Moreno, M.A. y
col. J. Biol. Chem. (1992) 267:19278-19290). El
plásmido pRM5 también contiene ADN del agrupamiento de genes
biosintéticos de actinorrodina que codifica el gen para una
proteína de activador específica, ActII-orf4. La
proteína Act II-orf4 se requiere para la
transcripción de los genes colocados bajo el control del promotor
bidireccional de actI/act II y activa la expresión génica durante
la transición de fase de crecimiento a estacionaria en el micelio
vegetativo (Hallam, S. E. y col. Gene (1988)
74:305-320).
Las agrupaciones de tipo II en
Streptomyces son conocidas por estar activadas por los genes
de activador específicos de la ruta (Narva, K. E. y Feitelson, J.
S. J. Bacteriol. (1990) 172:326-333;
Stutzman-Engwall, K. J. y col. J. Bacteriol. (1992)
174:144-154; Fernandez-Moreno, M.A.
y col. Cell (1991) 66:769-780; Takano, E. y col.
Mol. Microbiol. (1992) 6:2797-2804; Takano, E. y
col. Mol. Microbiol. (1992) 7:837-845). El producto
génico DnrI complementa una mutación en el gen actII-orf4 de
S. coelicolor implicando que las proteínas de DnrI y
ActII-orf4 actúan sobre dianas similares. Se ha
descrito un gen (srmR) (documento EP 0 524 832 A2) que se
localiza próximo al agrupamiento de genes de PKS de tipo I para el
policétido macrólido espiramicina. Este gen activa específicamente
la producción del antibiótico macrólido espiramicina, pero no se han
encontrado otros ejemplos de un gen tal. Por tanto, no se han
descrito homólogos de la familia de
ActII-orf4/DnrI/RedD de activadores que actúen
sobre los genes de PKS de
tipo I.
tipo I.
Aunque se ha identificado un gran número de
policétidos terapéuticamente importantes, sigue existiendo la
necesidad de obtener policétidos novedosos que tengan propiedades
potenciadas o posean bioactividad completamente novedosa. Los
policétidos complejos producidos por las PKS de tipo I son
particularmente valiosos porque incluyen compuestos con utilidad
conocida como agentes antihelmínticos, insecticidas,
inmunodepresores, antifúngicos o antibacterianos. Debido a su
complejidad estructural, tales policétidos novedosos no pueden
obtenerse fácilmente por síntesis química total o por
modificaciones químicas de policétidos conocidos.
También existe la necesidad de desarrollar rutas
fidedignas y específicas para utilizar módulos individuales en la
práctica de manera que todos, o una gran fracción de genes de PKS
híbridos que están construidos, sean viables y produzcan el
producto de policétido deseado.
La solicitud de patente internacional en trámite
número PCT/GB97/01819, documento WO 98/01546, desvela que un
ensamblaje de genes de PKS (particularmente de tipo I) codifica un
módulo de carga que va seguido de al menos un módulo de extensión.
Por tanto, la Figura 1 muestra la organización de los genes de DEBS.
El primer marco de lectura abierto codifica la primera multienzima
o casete (DEBS 1) que está constituido por tres módulos: el módulo
de carga (carga de ery) y dos módulos de extensión (módulos 1 y 2).
El módulo de carga comprende una aciltransferasa y una proteína
portadora de acilos. Esto pueden contrastarse con la Fig. 1 del
documento WO 93/13663 (citado anteriormente). Ésta muestra que ORF1
sólo está constituido por dos módulos, el primero de los cuales es
de hecho tanto el módulo de carga como el primer módulo de
extensión. El documento WO 98/01546 describe en términos generales
la producción de un ensamblaje de genes de PKS híbridos que
comprende un módulo de carga y al menos un módulo de extensión. El
documento WO 98/01546 también describe (véase también Marsden, A.
F. A. y col. Science (1998) 279:199-202) la
construcción de un ensamblaje de genes de PKS híbridos injertando
el módulo de carga de amplia especificidad para la policétido
sintasa productora de avermectina en el primer componente de
multienzima (DEBS 1) para la PKS eritromicina en lugar del módulo de
carga normal. Pueden prepararse ciertos policétidos novedosos
usando el ensamblaje de genes de PKS híbridos como se describe, por
ejemplo, en la solicitud de patente internacional en trámite WO
98/01571, número (PCT/GB97/01810). La solicitud de patente WO
98/01546 describe además la construcción de un ensamblaje de genes
de PKS híbridos injertando el módulo de carga para la policétido
sintasa productora de rapamicina en el primer componente de
multienzima (DEBS 1) para la PKS eritromicina en lugar del módulo
de carga normal. El módulo de carga de la PKS rapamicina se
diferencia de los módulos de carga de DEBS y la PKS avermectina en
que comprende un dominio CoA ligasa, un dominio enoilreductasa
("ER") y una ACP de manera que ácidos orgánicos adecuados que
incluyen la unidad de iniciador natural ácido
3,4-dihidroxiciclohexanocarboxílico pueden activarse
in situ en el dominio de carga PKS y con o sin reducción por
el dominio ER transferirse a la ACP para la carga intramolecular de
la KS de módulo de extensión 1 (Schwecke, T. y col. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1995) 92:7839-7843).
Las secuencias de ADN se han desvelado para
varios agrupamientos de genes de PKS de tipo I que gobiernan la
producción de policétidos macrólidos de 16 miembros que incluyen la
PKS tilosina de Streptomyces fradiae (documento EP 0
791 655 A2), la PKS nidamicina de Streptomyces caelestis
(Kavakas, S. J. y col. J. Bacteriol. (1998)
179:7515-7522) y la PKS espiramicina de
Streptomyces ambofaciens (documento EP 0791 655 A2). Todas
estas secuencias de genes tienen en común que muestran que el módulo
de carga de la PKS se diferencia del módulo de carga de DEBS y de
la PKS avermectina en que están constituidos por un dominio que se
parece a los dominios KS de los módulos de extensión, un dominio AT
y una ACP (Figura 3). El dominio similar a KS del extremo N
adicional se ha llamado KSq porque se diferencia en cada caso de una
KS de extensión por la sustitución específica del residuo de
cisteína de sitio activo esencial para la actividad de
\beta-cetoacil-ACP sintasa por un
residuo de glutamina (Q en la notación de una sola letra). La
función del dominio KSq es desconocida (Kavakas, S. J. y col. J.
Bacteriol. (1998) 179:7515-7522), pero su presencia
en estas PKS para macrólidos de 16 miembros es sorprendente porque
las unidades de iniciador de tilosina, nidamicina y espiramicina
parecen ser propionato, acetato y acetato respectivamente, es
decir, el mismo tipo de unidad de iniciador que en DEBS. El dominio
AT adyacente al KSq se llama en este caso el dominio ATq.
Cuando el módulo de carga entero de la PKS
tilosina se usó para sustituir el módulo de carga análogo en la PKS
espiramicina en S. ambofaciens (Kuhstoss y col. Gene (1996)
183:231-236) se estableció que la naturaleza de la
unidad iniciadora estaba cambiado de acetato a propionato. Debido a
que no se entendía la función del dominio KSq no se hizo
divulgación específica que revelara ni la importancia del dominio
KSq ni la posible utilidad de estos módulos de carga que contienen
KSq para asegurar la pureza del producto de policétido con respecto
a la unidad de iniciador, incluso a altos niveles de producción de
macrólidos. La interpretación de sus resultados se estableció como:
"Por tanto, creemos que los experimentos aquí descritos
proporcionan un fuerte apoyo experimental para la hipótesis que los
dominios AT en sistemas de PKS de tipo I seleccionan el sustrato
apropiado en cada etapa en la síntesis" (Kuhstoss y col. Gene
(1996) 183:231-236, at p. 235). Estos autores
observaron la analogía con la proteína CLF en sistemas de PKS de
tipo II y que se cree que la última proteína participa en la
determinación de la longitud de cadena. Establecen: "KSq puede
cumplir una función similar, aunque está poco claro por qué tal
función sería necesaria en la síntesis de estos policétidos de 16
miembros cuando no se necesita para la síntesis de otros policétidos
complejos tales como 6-DEB o rapamicina. En
cualquier caso, es poco probable que la KSq participe en la elección
del sustrato en cada etapa de síntesis". (Kuhstoss y col. Gene
(1996) 183:231-236).
Se ha mostrado que cuando se usa ingeniería
genética para eliminar el módulo de carga de DEBS, la DEBS truncada
resultante en Sacch. erythraea continúa produciendo bajos
niveles de eritromicinas que contienen una unidad de iniciador de
propionato (Pereda, A. y col. Microbiology (1995)
144:543-553). La misma publicación muestra que
cuando en esta DEBS truncada la AT específica de
metilmalonil-CoA de módulo de extensión 1 se
sustituyó por una AT específica de malonil-CoA de
un módulo de extensión de la PKS rapamicina, los productos también
tenían bajos niveles de eritromicinas que contenían una unidad de
iniciador de propionato demostrando que el origen de las unidades
de iniciador no es la descarboxilación de los grupos
(metil)malonilo cargados en la enzima por la AT de módulo 1,
sino de la acilación directa de la KS de módulo de extensión 1 por
propionil-CoA. Ésta es, a diferencia de un informe
previo usando DEBS1+TE parcialmente purificado, una PKS bimodular
truncada derivada de DEBS (Kao, C. M. y col. J. Am. Chem. Soc.
(1995) 117:9105-9106) y funcionalmente equivalente a
DEBS1-TE (Brown, M. J. B. y col., J. Chem. Soc.
Chem. Commun. (1995) 1517-1518; Cortés, J. y col.
Science (1991) 2523:675-679) que estableció que los
orígenes de las unidades de iniciador para DEBS pueden incluir
unidades de malonato de metilo que se cargan en el módulo 1 y son
descarboxiladas por la KS de módulo 1 (Pieper, R. y col.
Biochemistry (1997) 36:1846-1851). Ahora se ha
encontrado que cuando la proteína DEBS1-TE se
purifica completamente de extractos de Sacch. erythraea
recombinante no contiene tal actividad descarboxilasa específica
(Weissmann, K. y col. (1998) Biochemistry, 37,
11012-11017), confirmando adicionalmente que las
unidades de iniciador no se producen de hecho a partir de la
descarboxilación de unidades de extensión mediadas por la KS de
módulo de extensión 1.
Se sabe que el módulo de carga de DEBS tiene una
especificidad ligeramente más ancha que el propionato solo, y en
particular unidades de iniciador de acetato se usan tanto in
vitro como in vivo cuando la PKS que contiene este
módulo de carga es parte de una PKS que se expresa tanto en
Sacch. Erythraea, el huésped natural para la producción de
eritromicina (véase, por ejemplo, Cortés, J. y col. Science (1995)
268:1487-1489), como en un huésped heterólogo tal
como S. coelicolor (Kao, C. M. y col. J. Am. Chem. Soc.
(1994) 116:11612-11613; Brown, M. J. B. y col. J.
Chem. Soc. Chem. Commun. (1995) 1517-1519).
Experimentos in vitro usando DEBS1-TE
purificado han demostrado que la propionil-CoA y la
acetil-CoA son sustratos alternativos que
suministran eficazmente unidades de propionato y acetato
respectivamente al módulo de carga (Wiessmann, K. E. H. y col.
Chemistry and Biology (1995) 2:583-589; Pieper, R. y
col. J. Am. Chem. Soc. (1995) 117:11373-11374). El
resultado de la competencia entre unidades de iniciador de acetato
y propionato está influenciado por las concentraciones
intracelulares respectivas de propionil-CoA y
acetil-CoA que prevalecen en la célula huésped usada
(véase, por ejemplo, Kao, C. M. y col. Science (1994)
265:509-512; Pereda, A. y col. Microbiology (1995)
144:543-553). También está determinado por el nivel
de expresión de la PKS huésped de manera que como se desvela, por
ejemplo, en la solicitud de patente internacional en trámite número
PCT/GB97/01819, cuando la DEBS recombinante u otra PKS híbrida que
contiene el módulo de carga de DEBS se sobreexpresa en Sacch.
erythraea, los productos son generalmente mezclas cuyos
componentes sólo se diferencian en la presencia de o bien una unidad
de iniciador de acetato o de propionato.
El documento WO 91/16334 desvela la producción
de
G-desoxi-15-noreritromicinas
modificando genéticamente la región responsable de la
G-hidroxilación. Liu y col., JACS 1997 (119)
10559-10554 desvelan
G-desoxi-2-nor-15-noreritronolida
B producida por un procedimiento en el que la AT en el módulo G
está sustituida por una AT específica de malonilo.
Existe la necesidad de desarrollar
procedimientos fidedignos para evitar la formación de mezclas de
policétidos con unidades de iniciador tanto de acetato como de
propionato y de permitir la incorporación específica de unidades de
iniciador inusuales. Ahora se ha encontrado sorprendentemente que la
función de los dominios de carga en las PKS para los macrólidos de
16 miembros tilosina, nidamicina y espiramicina es diferente de la
de los dominios de carga de la PKS avermectina y de DEBS. Se ha
comprobado que el dominio KSq de la PKS tilosina y el dominio AT
asociado, que aquí se llama ATq, juntos son responsables de la
producción altamente específica de unidades de iniciador de
propionato porque la ATq es específica para la carga de
metilmalonil-CoA y no de
propionil-CoA como se pensaba previamente; y la KSq
es responsable de la descarboxilación altamente específica de la
unidad de malonato de metilo unida a enzima para formar la unidad de
propionato unida al dominio ACP del módulo de carga y situada
apropiadamente para ser transferida a la KS del módulo de extensión
1 para la iniciación de la extensión de cadenas. En un modo
similar, la ATq de las PKS espiramicina y nidamicina, y la KSq
adyacente, son responsables de la carga específica de unidades de
malonato en vez de unidades de acetato como se creía previamente, y
de su posterior descarboxilación específica para proporcionar
unidades de iniciador de acetato para la extensión de cadenas de
policétidos.
Se ha encontrado ahora aquí que no sólo las PKS
para los macrólidos de 16 miembros anteriormente mencionados, sino
también las PKS para ciertos macrólidos de 14 miembros,
particularmente la PKS oleandomicina de Streptomyces
antibioticus (Figura 4) y también las PKS para ciertos
policétidos ionóforos de poliéter, particularmente la PKS monensina
putativa de Streptomyces cinnamonensis (Figura 4), poseen un
dominio de carga que comprende un dominio KSq, un dominio ATq y una
ACP. En la Figura 4 se muestra un alineamiento de secuencias de los
dominios KSq y de los dominios ATq ligados adyacentes que se han
identificado, que muestran el sitio activo conservado residuo de
glutamina (Q) en los dominios KSq y un residuo de arginina que está
conservado en todos los dominios AT de extensión y también está
completamente conservado en los dominios ATq. Este residuo no es
característicamente arginina en los dominios AT de ni los módulos
de carga de DEBS ni de PKS avermectina, en los que el sustrato para
la AT es un éster de acil-CoA no carboxilado
(Haydock, S. F. y col. FEBS Letters (1995)
374:246-248). La abreviatura ATq se usa aquí para
distinguir simplemente los dominios AT encontrados inmediatamente al
extremo C de Ksq de AT de extensión, y la marca no tiene otro
significado.
Esta invención proporciona un procedimiento para
producir un macrólido de 14 miembros que tiene un grupo
13-metilo como se explica en la reivindicación
1.
El dominio KSq puede ser "natural" o
genéticamente manipulado, por ejemplo, resultante de mutagénesis
dirigida al sitio de ácido nucleico que codifica una KS diferente
tal como una KS de un módulo de extensión.
La funcionalidad de carga se proporciona por un
dominio de tipo AT (aciltransferasa) que se parece a un dominio AT
de un módulo de extensión convencional que tiene un residuo de
arginina en el sitio activo, que no es el caso con los dominios AT
de módulos de cargadores que cargan acetato o propionato, por
ejemplo, en sistemas de DEBS o de PKS avermectina. Puede llamarse
Atq. De nuevo, puede ser "natural" o genéticamente manipulado,
por ejemplo, por mutagénesis de una AT de un módulo de
extensión.
El módulo de carga es de la forma:
Ksq-ATq-ACP
en la que ACP es proteína portadora
de
acilos.
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Una realización preferida usa un cultivo que
produce un policétido de 14 miembros que tiene una unidad de
iniciador de acetato deseada caracterizada por la ausencia
sustancial de policétidos con diferentes unidades de iniciador. Por
tanto, por ejemplo,
C13-metil-eritromicina puede
producirse sustancialmente libre de análogos naturales que resultan
de la incorporación de unidades de iniciador de propionato.
Es particularmente útil proporcionar un módulo
de carga del tipo KSq-ATq-ACP para
un ensamblaje de genes de PKS que produce un macrólido de 14
miembros con el fin de preparar un macrólido de 14 miembros que
contiene exclusivamente o casi exclusivamente una unidad de
iniciador de acetato, incluso cuando tal ensamblaje de genes de PKS
se expresa a altos niveles en una célula huésped de actinomiceto.
Las PKS particularmente adecuadas para este fin son los componentes
de PKS para la biosíntesis de eritromicina, metimicina,
oleandomicina, tilosina, espiramicina, midecamicina y nidamicina
para todos los cuales es conocida al menos en parte la organización
génica y modular. Las fuentes particularmente adecuadas de los genes
que codifican un módulo de carga del tipo
KSq-ATq-ACP son los módulos de carga
de oleandomicina, espiramicina, nidamicina, metimicina y monensina
que son específicos para la carga de unidades de malonato que luego
se descarboxilan a unidades de iniciador de acetato.
En el módulo de carga del tipo
KSq-ATq-ACP, los dominios o
porciones de los mismos pueden derivarse de las mismas fuentes o de
diferentes y comprenden tanto dominios naturales como manipulados.
Por ejemplo, el dominio ATq puede sustituirse por un dominio AT
derivado de cualquier módulo de extensión de una PKS de tipo I que
tiene especificidad para cargar unidades de malonato, mientras que
el dominio KSq se elige por tener una especificidad de apareamiento
hacia unidades de malonato.
El módulo de carga del tipo
KSq-ATq-ACP puede ligarse a una PKS
híbrida producida, por ejemplo, como en los documentos WO 98/01546
y WO 98/01571. Es particularmente útil ligar un módulo de carga tal
a ensamblajes de genes que codifican PKS híbridas que producen
derivados novedosos como se describen, por ejemplo, en los
documentos WO 98/01546 y WO 98/01571.
Los organismos transformantes usados en la
invención pueden albergar plásmidos recombinantes, o los plásmidos
pueden integrarse. Un plásmido con una secuencia int se integrará en
un sitio de unión específico (att) del cromosoma del huésped. Los
organismos transformantes pueden modificar los productos iniciales,
por ejemplo, llevando a cabo todas o algunas de las modificaciones
biosintéticas normales en la producción de eritromicinas (como se
muestra en la Figura 5) y para otros policétidos. Puede hacerse uso
de organismos mutantes de forma que se bloqueen algunas de las
rutas normales, por ejemplo, para producir productos sin uno o más
grupos hidroxi "naturales" o grupos de azúcar.
La invención puede usarse para proporcionar
tanto macrólidos de 14 miembros de anillo previamente obtenidos
como macrólidos de 14 miembros de anillo novedosos en una forma más
pura con respecto a la naturaleza de la unidad de iniciador de
acetato que la que hasta ahora era posible. Éstos incluyen
macrólidos de 14 miembros de anillo que son tanto "naturales"
como que pueden diferenciarse del compuesto "natural"
correspondiente:
- a)
- en el estado de oxidación de una o más de las unidades de cétidos (es decir, selección de alternativas del grupo: -CO-, -CH(OH)-, alqueno -CH-, y -CH_{2}-) en las que la estereoquímica de cualquier -CH(OH)- también es independientemente seleccionable;
- b)
- en ausencia de una cadena lateral de metilo "natural"; o
- c)
- en la estereoquímica de metilo "natural"; y/o sustituyentes de anillo distintos de metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
También es posible preparar derivados de
macrólidos de 14 miembros de anillo que tienen las diferencias del
producto natural identificado en dos o más de los puntos a) a c)
anteriores.
También puede prepararse derivados de cualquiera
de los policétidos anteriormente mencionados que se han sometido
adicionalmente a procesamiento por enzimas de no PKS, por ejemplo,
una o más de hidroxilación, epoxidación, glicosilación y
metilación.
La presente invención proporciona un
procedimiento novedoso de obtención de macrólidos de 14 miembros
complejos tanto conocidos como novedosos que tienen una unidad de
iniciador de acetato prácticamente libre de productos que sólo se
diferencian en que tienen una unidad de iniciador de propionato.
Los vectores de plásmido adecuados y las células
genéticamente modificadas adecuadas para la expresión de genes de
PKS que incorporan un módulo de carga cambiado son aquellos
descritos en el documento WO 98/01546 como adecuados para la
expresión de genes de PKS híbridos de tipo I. Ejemplos de huéspedes
eficaces son Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces
coelicolor, Streptomyces avermitilis, Streptomyces griseofuscus,
Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces fradiae, Streptomyces
longisporoflavus, Streptomyces hygroscopicus, Micromonospora
griseorubida, Streptomyces lasaliensis, Streptomyces venezuelae,
Streptomyces antibioticus, Streptomyces lividans, Streptomyces
rimosus, Streptomyces albus, Amycolatopsis mediterranei y
Streptomyces tsukubaensis. Éstos incluyen huéspedes en los
que los plásmidos derivados de SCP2* son conocidos por replicarse
autónomamente tales como, por ejemplo, S. coelicolor, S.
avermitilis y S. griseofuscus; y otros huéspedes tales
como Saccharopolyspora erythraea en la que los plásmidos
derivados de SCP2* se integran en el cromosoma mediante
recombinación homóloga entre secuencias en el inserto de plásmido y
en el cromosoma; y todos aquellos vectores que se transforman
integrativamente mediante vectores de plásmido suicidas.
Aunque previamente se han notificado algunas
13-metileritromicinas (también conocidas como
15-noreritromicinas) (Kibwage y col., J.
Antibiotics, 40, 1-6, 1987; Weber & McAlpine,
patente de EE.UU. 5.141.926), éstas se han limitado a
15-noreritromicina C y
6-desoxi-15-noreritromicinas
B y D. Además, no sólo se han encontrado éstas
15-noreritromicinas como componentes extremadamente
menores coexpresados con altos niveles de eritromicinas
"naturales" (13-etileritromicinas), sino que
los homólogos de 13-metilo
(15-noreritromicinas A y B) para las eritromicinas
"naturales" más deseables y biológicamente activas
(eritromicina A y B) nunca se han aislado previamente. La
modificación química de eritromicinas "naturales" ha demostrado
ser un medio extremadamente eficaz para potenciar la bioeficacia de
las moléculas "naturales". Por tanto, sería concebible que la
modificación química de eritromicinas novedosas produjera
similarmente compuestos con bioeficacias deseables y potenciadas.
El documento WO 98/01546 describe en términos generales la
producción de policétidos novedosos mediante tecnologías de ADN
recombinante y el uso de estas tecnologías para generar
eritromicinas novedosas, muchas de las cuales tienen diferentes
unidades de iniciador respecto a la unidad de iniciador de
propionato característica de las eritromicinas "naturales", se
describe en la solicitud de patente internacional en trámite WO
98/01546. Alguna modificación química de estas eritromicinas
novedosas también se describe en las solicitudes de patente
internacional en tramitación junto con la presente PCT/IB98/02100 y
PCT/IB98/02099, es decir, los documentos WO 99/35157 y WO 99/35156.
Sin embargo, es evidente que la capacidad para producir
eritromicinas novedosas con buenos niveles de expresión y en
ausencia sustancial de eritromicinas novedosas o naturales con
diferentes unidades de iniciador es esencial para facilitar la
capacidad para lograr una amplia variedad de modificaciones
químicas para tales eritromicinas novedosas. La capacidad potenciada
para producir policétidos con buenos niveles de expresión y en
ausencia sustancial de policétidos con diferentes unidades de
iniciador se ha descrito en esta solicitud son miembros de familias
y los inventores describen ahora la capacidad para producir
13-metileritromicinas con buenos niveles de
expresión y en ausencia sustancial de eritromicinas con diferentes
unidades de iniciador. El uso de esta tecnología ha permitido ahora
la preparación de grandes cantidades de
13-metileritromicinas que por primera vez ha
permitido a los inventores llevar a cabo una amplia variedad de
modificaciones químicas que previamente sólo habían sido posibles
partiendo de las eritromicinas "naturales".
Algunas realizaciones de la invención se
describirán ahora con referencia a los dibujos adjuntos en los
que:
La Fig 1 es un diagrama que muestra el
funcionamiento de 6-desoxieritronolida B sintasa
(DEBS), una 6-desoxieritronolida B
(6-DEB) productora de PKS modular, un precursor de
eritromicina A.
La Fig 2 proporciona la comparación de
secuencias de aminoácidos de los dominios KS y los dominios CLF de
agrupaciones de genes de PKS de tipo II representativas. El sitio
activo cisteína (C) de los dominios KS está señalado con una flecha
en la figura y se alinea con la glutamina (Q) o ácido glutámico (E)
de los dominios CLF. Las abreviaturas usadas y los números de
registro relevantes de Genbank/EMBL son: GRA: granaticina de
Streptomyces violaceoruber (X63449); HIR: policétido
desconocido de Saccharopolyspora hirsuta (M98258); ACT,
actinorrodina de Streptomyces coelicolor (X63449); CIN:
policétido desconocido de Streptomyces cinnamonensis
(Z11511); VNZ: jadomicina de Streptomyces venezuelae
(L33245); NOG: antraciclinas de Streptomyces nogalater
(Z48262); TCM: tetracenomicina de S. glaucescens (M80674);
DAU: daunomicina de Streptomyces sp. C5 (L34880); PEU,
doxorubicina de Streptomyces peucetius (L35560); WHI:
pigmentos de esporas WhiE de Streptomyces coelicolor
(X55942).
La Fig 3 muestra la organización de genes de las
PKS para tres macrólidos de 16 miembros de anillo, tilosina,
espiramicina y nidamicina.
La Fig 4 muestra el alineamiento de secuencias
de aminoácidos de didominios de carga KSq-ATq de las
PKS para nidamicina, platenolida (espiramicina), monensina,
oleandomicina y tilosina. Las secuencias para los didominios de
carga monensina y oleandomicina no se han desvelado previamente.
La Fig. 5. Las etapas enzimáticas que convierten
6-desoxieritronolida B en eritromicina A en
Saccharopolyspora erythraea
La Fig. 6 es un diagrama que muestra la
construcción del plásmido pJLK117.
La Fig. 7 muestra las estructuras de dos
oligonucleótidos.
La presente invención se ilustrará ahora, pero
no pretende limitarse, por medio de algunos ejemplos.
Todos los espectros de RMN se midieron en
CDCl_{3} usando un espectrómetro Bruker 500 MHz DMX a menos que
se indique lo contrario y las posiciones de los picos se expresan en
partes por millón (ppm) a campo bajo de tetrametilsilano. El número
atómico mostrado en la estructura de RMN no es representativo de la
nomenclatura estándar, pero los datos de RMN guardan relación con
ese ejemplo particular.
\vskip1.000000\baselineskip
- Columna
- Waters Symmetry 5_ C18 2,1 mm X 150 mm
- Flujo
- 0,29 ml/min
- Fase móvil
- Gradiente: A:B (22:78) a A:B (38:62) durante 12 minutos, luego a A:B (80:20) por el minuto 15. Mantener durante 1 minuto. Reequilibrar antes de la siguiente muestra. En la que A = acetonitrilo y B = acetato de amonio 0,01 M en 10% de acetonitrilo y 0,02% de TFA
- Instrumento
- Adquirido con un cromatógrafo de líquidos Hewlett-Packard 1050 con interfaz a un espectrómetro de masas VG Platform II equipado con una fuente de APCI
\vskip1.000000\baselineskip
- Columna
- Waters Symmetry 5_ C18 2,1 mm X 150 mm
- Flujo
- 0,29 ml/min
- Fase móvil
- Gradiente: 28:72 de acetonitrilo: NH4OAc 10 mM a 50:50 en 18 minutos. 50:50 hasta 25 minutos. De Nuevo a 28:72, reequilibrar durante 7 minutos
- Instrumento
- Adquirido con EM/CL de Hewlett Packard 1100 con fuente de APCI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el plásmido pCJR24 como se describe
en el documento PCT/GB97/01819. pPFL43 es un plásmido basado en
pCJR24 que contiene el gen que codifica una policétido sintasa
híbrida que contiene el módulo de carga de la PKS monensina
putativa (aislado de S. cinnamonensis), los módulos de
extensión de DEBS 1 y 2 y la tioesterasa terminadora de cadena. El
plásmido pPFL43 se construyó del siguiente modo:
- Los siguientes oligonucleótidos sintéticos: 5'-CCATATGGCCGCATCCGCGTCAGCGT-3' y 5'-GGCTAGCG GGTCCTCGTCCGTGCCGAGGTCA-3' se usan para amplificar el ADN que codifica el módulo de carga productor de monensina putativa usando un cósmido que contiene el extremo 5' de los genes de PKS productores de monensina putativa de S. cinnamonensis o ADN cromosómico de S. cinnamonensis como molde. El producto de PCR de 3,3 kpb se purifica por electroforesis en gel, se trata con T4 polinucleótido cinasa y se liga al plásmido pUC18, que se ha linealizado por digestión con Sma I y luego se trata con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación se usó para transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes y los clones individuales se examinaron para el plásmido deseado pPFL40. El plásmido pPFL40 se identificó por patrón de restricción y análisis de secuencias.
El plásmido pHD30His es un derivado de pNEWAVETE
(documento PCT/GB97/01810) que contiene el modulo de carga de
avermectina, los módulos de extensión de eritromicina 1 y 2 y el
dominio de tioesterasa ery. El plásmido pNEWAVETE se cortó con
EcoRI y HinDIII y se introdujo un ligador de oligonucleótidos
sintético que codifica la adición de una cola de polihistidina del
extremo C al polipéptido. Los siguientes oligonucleótidos:
- 5'-AATTCACATCACCATCACCATCACTAGTAGGAGGTCTGGCCATCTAGA-3'
- y
- 5'-AGCTTCTAGATGGCCAGACCTCCTACTAGTGATGGTGATGGTGATGTG-3' se hibridaron juntos y el dúplex se ligó a pNEWAVETE cortado con EcoRI y HinDIII. El plásmido resultante se cortó con NdeI y XbaI y se ligó en el plásmido pCJR24 que previamente había sido cortado con las dos mismas enzimas para producir el plásmido pND30His.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pPFL40 se digirió con Nde I y
Nhe I y el fragmento de 3,3 kpb se purificó por
electroforesis en gel y se ligó a pND30-His
previamente digerido con Nde I y Nhe I y se trató con
fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación se usó para transformar
células DH10B de E. coli electrocompetentes y los clones
individuales se examinaron para el plásmido deseado pPFL43. El
plásmido pPFL43 se identificó por análisis de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pPFL43 se usó para transformar
protoplastos de NRRL2338 de S. erythraea. Se seleccionaron
colonias resistentes a tiostreptona en medio R2T20 que contenía 10
\mug/ml de tiostreptona. Se probaron varios clones para la
presencia de pPFL43 integrado en el cromosoma por hibridación por
transferencia de Southern de su ADN genómico con ADN marcado con
DIG que contenía el fragmento de PKS mon que codificaba el
módulo de carga. De esta forma se seleccionó un clon con una copia
integrada de pPFL43.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo Saccharopolyspora erythraea
NRRL2338 (pPFL43), construido con el dominio de carga natural
desplazado por un inserto de ADN de cargador de
monensina-D1 TE, producido como se describe en el
Ejemplo 2 se inoculó en 30 ml de medio de agua de grifo con 50
ug/ml de tiostreptona en un matraz Erlenmeyer de 300 ml. Después de
tres días de incubación a 29ºC, este matraz se usó para inocular 300
ml de medio ERY-P en un matraz de 300 ml. El caldo
se incubó a 29ºC a 200 rpm durante 6 días. Después de este tiempo,
todo el caldo se ajustó a pH 8,5 con NaOH, luego se extrajo con un
volumen igual de acetato de etilo. El extracto de acetato de etilo
se evaporó a sequedad a 45ºC bajo una corriente de nitrógeno usando
un evaporador Zymark TurboVap LV, luego se reconstituyó en 0,0625
volúmenes de metanol para concentrar el extracto 16 veces. Las
estructuras de los productos se confirmaron por EM/CL,
Procedimiento A. Como componente principal se observó un pico de
tiempo de retención de 4,0 min, con valor de m/z de 720
(M+H)^{+}, requerido para
13-metil-eritromicina A. Se observó
un segundo pico con un tiempo de retención de 6,4 min y con valor de
m/z de 704 (M+H)^{+}, requerido para
13-metil-eritromicina B.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó NRRL2338 (pPFL43) de
Saccharopolyspora erythraea en 1000 ml de medio de agua de
grifo con 50 \mug/ml de tiostreptona en un matraz Fernbach de 2,8
l. Después de tres días de incubación a 29ºC, este matraz se usó
para inocular 8 l de medio ERY-P en un recipiente de
fermentador Microferm de 14 l (New Brunswick Scientific Co., Inc.,
Edison, NJ). El caldo se incubó a 28ºC con una tasa de aireación de
8 l/min, agitación a 800 rpm y con pH mantenido entre 6,9 y 7,3 con
NaOH o H_{2}SO_{4} (15%). Se añadió agua para mantener el
volumen al nivel de volumen de 24 horas. La fermentación continuó
durante 167 horas. Después de este tiempo, la presencia de
13-metil-eritromicina A y B se
confirmó ajustando una muestra de caldo del fermentador a pH 8,5
con NaOH, luego extrayendo con un volumen igual de acetato de etilo.
El extracto de acetato de etilo se evaporó a sequedad a 45ºC bajo
una corriente de nitrógeno usando un evaporador Zymark TurboVap LV,
luego se reconstituyó en 0,25 volúmenes de metanol para concentrar
el extracto 4 veces. Las estructuras de los productos se
confirmaron por EM/CL, Procedimiento A. Como componente principal se
observó un pico de tiempo de retención de 4,1 min, con valor de m/z
de 720 (M+H)^{+}, requerido para
13-metil-eritromicina A. Se observó
un segundo pico con un tiempo de retención de 6,6 min y con valor
de m/z de 704 (M+H)^{+}, requerido para
13-metil-eritromicina B.
Se procesaron aproximadamente 35 litros de caldo
que contenía aproximadamente 2,8 gramos de
13-metil-eritromicina A para la
recuperación de producto. El caldo se filtró a través de una unidad
cerámica Ceraflo de tamaño piloto y se cargó en una columna de
resina XAD-16 de 500 ml. El producto se eluyó usando
100% de metanol. Se preparó una columna de adsorción
CG-161 de 175 ml y se equilibró con 20% de
metanol/agua. Una parte de la disolución del producto se ajustó con
20% de metanol y se cargó en la columna, no se observó un gran
avance del producto. El lavado de la columna con hasta el 40% de
metanol/agua fracasó en eliminar cualquier nivel significativo de
impurezas. La elución con 50% de metanol/agua logró la separación
cromatográfica del producto de las dos impurezas principales,
13-metil-eritromicina B y un
producto de degradación,
13-metil-deshidroeritromicina A.
Los cortes más puros se combinaron y se redujeron en volumen a
aproximadamente el 75% usando evaporación para lograr una
concentración de metanol < 10%. Para potenciar la extracción de
la 13-metil-eritromicina A se
añadió bicarbonato sódico sólido hasta que se obtuvo una
concentración total de 250 mM. La fase de producto acuosa se
extrajo 2x con cloruro de metileno usando cada vez la mitad del
volumen total. El volumen se redujo a sólidos de color amarillo
claro mediante evaporación. La
13-metil-eritromicina A se purificó
disolviendo los cristales brutos en cloruro de metileno a
temperatura ambiente y diluyendo al 15% de cloruro de metileno con
hexano. La disolución turbia se colocó a -10ºC durante ^{\sim}30
minutos cuando el líquido se decantó a un 2º matraz quedando atrás
la mayoría de las impurezas como un aceite. El matraz se dejó
durante la noche a -10ºC, seguido por filtración de los cristales
blanquecinos de
13-metil-eritromicina A al día
siguiente. Se aislaron aproximadamente 300 miligramos de
13-metil-eritromicina A del
tratamiento final parcial del volumen de caldo de 35 l.
Se utilizaron aproximadamente 100 gramos de
aguas madres evaporadas adicionalmente para aislar
13-metil-eritromicina B. La
13-metil-eritromicina A residual se
eliminó con extracción repetitiva de la muestra inicial con ácido
acético acuoso (pH 5). La posterior fase de cloruro de metileno se
purificó por cromatografía en 700 g de gel de sílice usando 20% de
metanol en cloruro de metileno. Las fracciones enriquecidas en
13-metil-eritromicina B, como se
determina por EM/CL, se combinaron y se evaporaron para dar
^{\sim}11,0 gramos de aceite oscuro. El aceite se disolvió en una
cantidad mínima de metanol y se cargó en 500 ml de resina
CG-161 de Amberchrom. La
13-metil-eritromicina B se eluyó con
2 volúmenes de lecho por hora con 40% de metanol en agua
desionizada. Las fracciones de volumen de un lecho se recogieron y
se ensayaron por EM/CL. Las fracciones 42 a 62 se combinaron, se
diluyeron con ^{\sim}20% de metanol con agua desionizada y se
neutralizaron a pH 7,5 con bicarbonato sódico. La disolución
resultante se extrajo una vez con 4 l de cloruro de metileno, se
concentró hasta ^{\sim}500 ml y se secó sobre sulfato de magnesio
anhidro. Después de eliminar el MgSO_{4} por filtración, el
filtrado se evaporó para dar ^{\sim}110 mg de sólidos de color
marrón claro. Los 110 mg de
13-metil-eritromicina B bruta se
disolvieron en ^{\sim}3,0 mililitros de acetonitrilo de calidad
para HPLC y se cargaron en una placa de cromatografía preparativa
en capa fina (PTLC) de gel de sílice de 20 cm x 20 cm, 2 mm de
espesor. La placa se reveló con 60:40 de metanol:acetonitrilo. La
porción deseada de sílice de la placa de PTLC (visualización con
yodo) se eliminó y se extrajo con acetona de calidad para HPLC. El
extracto de acetona se evaporó para dar 12,1 mg de sólido
transparente.
La identificación de las muestras de
13-metil-eritromicina A y
13-metil-eritromicina B se confirmó
por espectroscopia de masas (Procedimiento B de EM/CL) y
espectroscopia de RMN. Un pico de muestra de
13-metil-eritromicina tenía un
tiempo de retención de 4,7 min, con valor de m/z de 720
(M+H)^{+}, requerido para
13-metil-eritromicina A. El pico de
muestra de 13-metil-eritromicina B
tenía un tiempo de retención de 7,6 min, con valor de m/z de 704
(M+H)^{+},
requerido para 13-metil-eritromicina B.
requerido para 13-metil-eritromicina B.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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El plásmido pPFL35 es un plásmido basado en
pCJR24 que contiene un gen de PKS que comprende un módulo de carga,
el primer y segundo módulos de extensión de DEBS y la tioesterasa
terminadora de cadenas. El módulo de carga comprende el ADN del
dominio KSq del módulo de carga de la PKS oleandomicina fusionada a
la AT específica de malonil-CoA de módulo 2 de la
PKS rapamicina, ligado a su vez a la ACP del dominio de carga de
DEBS. El plásmido pPFL35 se construyó por medio de varios plásmidos
intermedios del siguiente modo:
\newpage
- Un segmento de ADN de 411 pb del gen eryAI de S. erythraea que se extendía desde el nucleótido 1279 hasta el nucleótido 1690 (Donadio, S. y col., Science (1991) 2523:675-679) se amplificó por PCR usando los siguientes cebadores de oligonucleótidos sintéticos:
- 5'-TGGACCGCCGCCAATTGCCTAGGCGGGCCGAACCCGGCT-3' y
- 5'-CCTGCAGGCCATCGCGACGACCGCGACCGGTTCGCC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Como molde se usó el ADN de un plásmido
designado pKSW, derivado de pT7-7 y
DEBS1-TE en los que se habían introducido nuevos
sitios Pst I y HindIII para flanquear la KS1 del primer
módulo de extensión. El producto de PCR de 441 pb se trató con T4
polinucleótido cinasa y se ligó al plásmido pUC18, que había sido
linealizado por digestión con Sma I y luego se trató con
fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación se usó para transformar
células DH10B de E. coli electrocompetentes y los clones
individuales se examinaron para el plásmido deseado, pPFL26. Los
nuevos sitios Mfe I/Avr II que limitan con el inserto son
adyacentes al sitio Eco RI en el poliligador de pUC18. El plásmido
pPFL26 se identificó por patrón de restricción y análisis de
secuencias.
Un sitio de restricción Mfe I se localiza
a 112 pb del extremo 5' del ADN que codifica la
propionil-CoA:ACP transferasa del módulo de carga
de DEBS. El plásmido pKSW se digirió con Mfe I y Pst I y se
ligó con el inserto de 411 pb obtenido digiriendo el plásmido
pPFL26 con Mfe I y Pst I. La mezcla de ligación se usó para
transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes y los
clones individuales se examinaron para el plásmido deseado, pPFL27.
El plásmido pPFL27 contiene un gen de PKS que comprende el módulo de
carga de DEBS, el primer y segundo módulos de extensión de DEBS y
la tioesterasa terminadora de cadenas de DEBS. El plásmido pPFL27
se identificó por su patrón de restricción.
El plásmido pPFL27 se digirió con Nde I y
Avr II y se ligó a un inserto de 4,6 kpb derivado de digerir el
plásmido pMO6 (documento PCT/GB97/01819) con Nde I y Avr II.
El plásmido pMO6 contiene un gen de PKS que comprende el módulo de
carga de DEBS, el primer y segundo módulos de extensión de DEBS y la
tioesterasa terminadora de cadenas de DEBS, excepto que el segmento
de ADN que codifica la AT específica de malonato de metilo dentro
del primer módulo de extensión se ha sustituido específicamente con
el ADN que codifica la AT específica de malonato de módulo 2 de la
PKS rap. La mezcla de ligación se usó para transformar células DH10B
de E. coli electrocompetentes y los clones individuales se
examinaron para el plásmido deseado, pPFL28. El plásmido pPFL28
contiene un gen de PKS híbrido que comprende el módulo de carga de
DEBS, la AT específica de malonato de módulo 2 de la PKS rap, la
ACP del módulo de carga de DEBS, seguido del primer y segundo
módulos de extensión de DEBS y la tioesterasa terminadora de
cadenas de DEBS. El plásmido pPFL28 se identificó por análisis de
restric-
ción.
ción.
Un segmento de ADN que codifica el dominio KSq
del gen oleAI de S. antibioticus que se extiende desde el
nucleótido 1671 hasta el nucleótido 3385 se amplificó por PCR usando
los siguientes cebadores de oligonucleótidos sintéticos:
- 5'-CCACATATGCATGTCCCCGGCGAGGAA-3' y
- 5'-CCCTGTCCGGAGAAGAGGAAGGCGAGGCCG-3'
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y ADN cromosómico de
Streptomyces antibioticus como molde. El producto de PCR se
trató con T4 polinucleótido cinasa y se ligó al plásmido pUC18, que
había sido linealizado por digestión con Sma I y luego se
trató con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación se usó para
transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes y
los clones individuales se examinaron para el plásmido deseado,
pPFL31. El nuevo sitio Nde I que limita con el inserto es
adyacente al sitio Eco RI del poliligador pUC18, mientras que
el nuevo sitio Bsp EI limita con el sitio Hin dIII de la
región del ligador. El plásmido pPFL31 se identificó por análisis de
restricción y de
secuencias.
El plásmido pPFL31 se digirió con Nde I y
Avr II y el inserto se ligó con el plásmido pPFL28 que había sido
digerido con Nde I y Avr II. La mezcla de ligación se
usó para transformar células DH10B de E. coli
electrocompetentes y los clones individuales se examinaron para el
plásmido deseado, pPFL32. El plásmido pPFL32 se identificó por
análisis de restricción.
El plásmido pPFL32 se digirió con Nde I y
Xba I y el inserto se ligó al plásmido pCJR24, que había
sido digerido con Nde I y Xba I y purificado por
electroforesis en gel. La mezcla de ligación se usó para
transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes y los
clones individuales se examinaron para el plásmido deseado, pPFL35.
El plásmido pPFL35 se identificó por análisis de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pPFL35 se usó para transformar
protoplastos de NRRL2338 de S. erythraea. Se seleccionaron
colonias resistentes a tiostreptona en medio R2T20 (Yamamoto y
col.) que contenía 10 \mug/ml de tiostreptona. Se probaron
varios clones para la presencia de pPFL35 integrado en el cromosoma
por hibridación por transferencia de Southern de su ADN genómico
con ADN marcado con DIG que contenía el fragmento de PKS rap que
codificaba AT de módulo 2. De esta forma se identificó un clon con
una copia integrada de pPFL35.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo NRRL2338 (pPFL35) de
Saccharopolyspora erythraea, construido con el dominio de
carga natural desplazado por un inserto de ADN de KSQ
oleandomicina-AT2 de
rapamicina-D1TE, preparado como se describe en el
Ejemplo 6, se inoculó en 30 ml de medio de agua de grifo con 50
ug/ml de tiostreptona en un matraz Erlenmeyer de 300 ml. Después de
dos días de incubación a 29ºC, este matraz se usó para inocular 300
ml de medio ERY-P en un matraz de 300 ml. El caldo
se incubó a 29ºC a 200 rpm durante 6 días. Después de este tiempo,
todo el caldo se ajustó a pH 8,5 con NaOH, luego se extrajo con un
volumen igual de acetato de etilo. El extracto de acetato de etilo
se evaporó a sequedad a 45ºC bajo una corriente de nitrógeno usando
un evaporador Zymark TurboVap LV, luego se reconstituyó en 0,25
volúmenes de metanol para concentrar el extracto 4 veces. Las
estructuras de los productos se confirmaron por EM/CL,
Procedimiento A. Se observó un pico con un tiempo de retención de
4,0 min y con un valor de m/z de 720 (M+H)^{+}, requerido
para 13-metil-eritromicina A
(C_{36}H_{65}NO_{13}). Se observó un segundo pico con un
tiempo de retención de 6,4 min y con valor de m/z de 704
(M+H)^{+}, requerido para
13-metil-eritromicina B
(C_{36}H_{65}NO_{12}).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pPFL44 es un plásmido basado en
pCJR24 que contiene el gen que codifica una policétido sintasa
híbrida que contiene el módulo de carga de PKS espiramicina, los
módulos de extensión de eritromicina 1 y 2 y la tioesterasa
terminadora de cadenas. El plásmido pPFL44 se construyó del
siguiente modo:
Los siguientes oligonucleótidos sintéticos:
- 5'-CCATATGTCTGGAGAACTCGCGATTTCCCGCAGT-3' y
- 5'-GGCTAGCGGGTCGTCGTCGTCCCGGCTG-3'
se usaron para amplificar el ADN que codifica el
módulo de carga productor de espiramicina usando ADN cromosómico de
la S. ambofaciens productora de espiramicina preparada según
el procedimiento descrito por Hopwood y col. (1985). El
producto de PCR de 3,3 kpb se purificó por electroforesis en gel, se
trató con T4 polinucleótido cinasa y se ligó al plásmido pUC18, que
había sido linealizado por digestión con Sma I y luego se
trató con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación se usó para
transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes y
los clones individuales se examinaron para el plásmido deseado
pPFL41. El plásmido pPFL41 se identificó por patrón de restricción
y análisis de secuencias.
El plásmido pPFL41 se digirió con Nde I y
Nhe I y el fragmento de 3,3 kpb se purificó por
electroforesis en gel y se ligó a pND30 (un plásmido derivado del
plásmido pCJR24 que tiene como inserto el módulo de carga de PKS
ave y los módulos de extensión 1 y 2 o DEBS y la tioesterasa
de DEBS) (documento PCTGB97/01810) previamente digerido con
Nde I y Nhe I y se trató con fosfatasa alcalina. La
mezcla de ligación se usó para transformar células DH10B de E.
coli electrocompetentes y los clones individuales se probaron
para el plásmido deseado pPFL44. El plásmido pPFL44 se identificó
por análisis de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pPFL44 se usó para transformar
protoplastos de NRRL2338 de S. erythraea. Se seleccionaron
colonias resistentes a tiostreptona en medio R2T20 que contenía 10
\mug/ml de tiostreptona. Se probaron varios clones para la
presencia de pPFL44 integrado en el cromosoma por hibridación por
transferencia de Southern de su ADN genómico con ADN marcado con
DIG que contenía el fragmento de PKS espiramicina que codificaba el
módulo de carga. De esta forma se identificó un clon con una copia
integrada de pPFL44.
El cultivo NRRL2338 (pPFL44) de
Saccharopolyspora erythraea, construido con el dominio de
carga natural desplazado por inserto de ADN de cargador de
espiramicina-D1TE, se inoculó en 30 ml de medio de
agua de grifo con 50 ug/ml de tiostreptona en un matraz Erlenmeyer
de 300 ml. Después de tres días de incubación a 29ºC, este matraz
se usó para inocular 300 ml de medio ERY-P en un
matraz de 300 ml. El caldo se incubó a 29ºC a 200 rpm durante 6
días. Después de este tiempo, todo el caldo se ajustó a pH 8,5 con
NaOH, luego se extrajo con un volumen igual de acetato de etilo. El
extracto de acetato de etilo se evaporó a sequedad a 45ºC bajo una
corriente de nitrógeno usando un evaporador Zymark TurboVap LV,
luego se reconstituyó en 0,0625 volúmenes de metanol para
concentrar el extracto 16 veces. Las estructuras de los productos se
confirmaron por EM/CL, Procedimiento A. Como componente principal
se observó un pico de tiempo de retención de 4,0 min, con valor de
m/z de 720 (M+H)^{+}, requerido para
13-metil-eritromicina A
(C_{36}H_{65}NO_{13}). Se observó un segundo pico con un
tiempo de retención de 6,4 min y con valor de m/z de 704
(M+H)^{+}, requerido para
13-metil-eritromicina B
(C_{36}H_{65}NO_{12}).
El plásmido pJLK114 es un plásmido basado en
pCJR24 que contiene un gen de PKS que comprende el módulo de carga
ery, el primer y segundo módulos de extensión de la PKS ery y la
tioesterasa terminadora de cadenas ery, excepto que el segmento de
ADN entre el extremo de la aciltransferasa y el inicio de la ACP del
segundo módulo de extensión de ery ha sido sustituido por un
ligador de oligonucleótidos sintético que contiene los sitios de
reconocimiento de las siguiente enzimas de restricción: AvrII,
BglII, SnaBI, PstI, SpeI, NsiI, Bsu36I y HpaI. Se construyó por
medio de varios plásmidos intermedios del siguiente modo (Figura
6).
El fragmento de ADN de aproximadamente 1,47 kpb
del gen de eryAI de S. erythraea se amplificó por PCR usando
como cebadores los oligonucleótidos sintéticos:
- 5'-TACCTAGGCCGGGCCGGACTGGTCGACCTGCCGGGTT-3' y
- 5'-ATGTTAACCGGTCGCGCAGGCTCTCCGTCT-3' y el plásmido pNTEP2 (Oliynyk, M. y col., Chemistry and Biology (1996) 3:833-839; documento WO98/01546) como molde. El producto de PCR se trató con T4 polinucleótido cinasa y luego se ligó con el plásmido pUC18, que había sido linealizado por digestión con SmaI y luego se trató con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación se usó para transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes y las colonias individuales se examinaron para su contenido de plásmidos. El plásmido deseado pJLK02 se identificó por su patrón de restricción y secuenciación de ADN.
El fragmento de ADN de aproximadamente 1,12 kpb
del gen de eryAI de S. erythraea se amplificó por PCR usando
como cebadores los oligonucleótidos sintéticos:
- 5'-ATGTTAACGGGTCTGCCGCGTGCCGAGCGGAC-3' y
- 5'-CTTCTAGACTATGAATTCCCTCCGCCCAGC-3' y el plásmido pNTEPH como molde. El producto de PCR se trató con T4 polinucleótido cinasa y luego se ligó con el plásmido pUC18, que había sido linealizado por digestión con SmaI y luego se trató con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación se usó para transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes y las colonias individuales se examinaron para su contenido de plásmidos. El plásmido deseado pJLK03 se identificó por su patrón de restricción y secuenciación de ADN.
El plásmido pJLK02 se digirió con PstI y HpaI y
el inserto de 1,47 kpb se ligó con el plásmido pJLK03 que había
sido digerido con PstI y HpaI. La mezcla de ligación se usó para
transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes y
las colonias individuales se examinaron para su contenido de
plásmidos. El plásmido deseado pJLK04 se identificó por su patrón
de restricción.
El plásmido pJLK01 (documento PCT/GB97/01819) se
digirió con PstI y AvrII y el inserto de 460 pb se ligó con el
plásmido pJLK04 que había sido digerido con PstI y AvrII. La mezcla
de ligación se usó para transformar células DH10B de E. coli
electrocompetentes y las colonias individuales se examinaron para su
contenido de plásmidos. El plásmido deseado pJLK05 se identificó
por su patrón de restricción.
El plásmido pJLK05 se digirió con ScaI y XbaI y
el plásmido pNTEPH se digirió con NdeI y ScaI y estos dos
fragmentos se ligaron con el plásmido pCJR24 que había sido digerido
con NdeI y XbaI. La mezcla de ligación se usó para transformar
células DH10B de E. coli electrocompetentes y las colonias
individuales se examinaron para su contenido de plásmidos. El
plásmido deseado pJLK07 se identificó por su patrón de
restricción.
Los dos oligonucleótidos sintéticos Plf y Plb
(Figura 7) se disolvieron cada uno en tampón TE. Se mezclaron 10
\mul de cada disolución (0,5 nmol/\mul) y se calentaron durante
2 minutos a 65ºC y luego se enfriaron lentamente hasta temperatura
ambiente. El plásmido pJLK07 se digirió con AvrII y HpaI y se ligó
con los oligonucleótidos hibridados. La mezcla de ligación se usó
para transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes
y las colonias individuales se examinaron para su contenido de
plásmidos. El plásmido deseado pJLK114 se identificó por su patrón
de restricción.
El plásmido pJLK117 es un plásmido basado en
pCJR24 que contiene un gen de PKS que comprende el módulo de carga
de ery, el primer y segundo módulos de extensión de la PKS ery y la
tioesterasa terminadora de cadenas de ery, excepto que el segmento
de ADN entre el extremo de la aciltransferasa y el inicio de la ACP
del segundo módulo de extensión de ery ha sido sustituido por un
ligador de oligonucleótidos sintético que contiene los sitios de
reconocimiento de las siguientes enzimas de restricción. AvrII,
BglII, SnaBI, PstI, SpeI, NsiI, Bsu36I y NheI.
Se construyó por medio de varios plásmidos
intermedios del siguiente modo (Figura 6).
El plásmido pJLK114 se digirió con NdeI y XbaI y
el inserto de aproximadamente 9,9 kpb se ligó con el plásmido pUC18
que había sido digerido con NdeI y XbaI. La mezcla de ligación se
usó para transformar células DH10B de E. coli
electrocompetentes y las colonias individuales se examinaron para su
contenido de plásmidos. El plásmido deseado pJLK115 se identificó
por su patrón de restricción.
El plásmido pJLK13 (PCT/GB97/01819) se digirió
con Bsu36I y XbaI y el fragmento de 1,1 kpb se ligó con el plásmido
pJLK115 que había sido digerido con Bsu36I y XbaI. La mezcla de
ligación se usó para transformar células DH10B de E. coli
electrocompetentes y las colonias individuales se examinaron para su
contenido de plásmidos. El plásmido deseado pJLK116 se identificó
por su patrón de restricción.
El plásmido pJLK116 se digirió con NdeI y XbaI y
el fragmento de 9,9 kpb se ligó con el plásmido pCJR24 que había
sido digerido con NdeI y XbaI. La mezcla de ligación se usó para
transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes y
las colonias individuales se examinaron para su contenido de
plásmidos. El plásmido deseado pJLK117 se identificó por su patrón
de restricción.
El plásmido pJLK29 es un plásmido basado en
pJLK117, excepto que el fragmento de ADN que codifica el bucle
reductor de módulo 10 de la PKS rap ha sido insertado en mcs. Se
construyó por medio de varios plásmidos intermedios del siguiente
modo. (Figura 5)
El segmento de ADN de aproximadamente 2,2 kpb
del gen de rapB de S. hygroscopicus que codifica el bucle
reductor de módulo 10 se amplificó por PCR usando como cebadores los
oligonucleótidos sintéticos:
- 5'-TAAGATCTTCCGACGTACGCGTTCCAGC-3' y
- 5'-ATGCTAGCCACTGCGCCGACGAATCACCGGTGG-3' y como molde un fragmento de aproximadamente 7 kpb que había sido obtenido por digestión del cósmido cos 26 (Schwecke, T. y col. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839-7843) con ScaI y SphI. El producto de PCR se trató con T4 polinucleótido cinasa y luego se ligó con el plásmido pUC18, que había sido linealizado por digestión con SmaI y luego se trató con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación se usó para transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes y las colonias individuales se examinaron para su contenido de plásmidos. El plásmido deseado pJLK121.1 se identificó por su patrón de restricción y secuenciación de ADN.
El plásmido pJLK121.1 se digirió con BglII y
NheI y el fragmento de 2,2 kpb se ligó con el plásmido pJLK117 que
había sido digerido con BglII y NheI. La mezcla de ligación se usó
para transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes
y las colonias individuales se examinaron para su contenido de
plásmidos. El plásmido deseado pJLK29 se identificó por su patrón
de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
El segmento de ADN de aproximadamente 6,1 kpb de
la agrupación de genes de PKS eritromicina de S. erythraea
que codifica el fragmento de ADN desde el inicio de la ACP de módulo
2 hasta el inicio de la ACP de módulo 3 se amplificó por PCR usando
como cebadores los oligonucleótidos sintéticos:
- 5'-TACCTGAGGGACCGGCTAGCGGGTCTGCCGCGTG-3' y
- 5'-ATGCTAGCCGTTGTGCCGGCTCGCCGGTCGGTCC-3' y el plásmido pBAM25 (publicado como pBK25 por Best, D J y col. Eur J Biochem (1992) 204: 39-49) como molde. El producto de PCR se trató con T4 polinucleótido cinasa y luego se ligó con el plásmido pUC18, que había sido linealizado por digestión con SmaI y luego se trató con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación se usó para transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes y las colonias individuales se examinaron para su contenido de plásmidos. El plásmido deseado pJLK50 se identificó por su patrón de restricción y secuenciación de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa JLK10 es una variante de la cepa
NRRL2338 en la que el bucle reductor de módulo 2 de ery (es decir,
el dominio KR) está sustituido por el bucle reductor del módulo 10
de rapamicina. Se construyó usando el plásmido pJLK54 que se
construyó del siguiente modo.
El plásmido pJLK54 es un plásmido basado en
pJLK29 que contiene un gen de PKS que comprende el módulo de carga
de ery, el primer, el segundo y el tercer módulos de extensión de la
agrupación de ery y la tioesterasa terminadora de cadenas de ery,
excepto que el segmento de ADN entre el extremo de la
aciltransferasa y el inicio de la ACP del segundo módulo de
extensión de ery ha sido sustituido por el segmento equivalente de
módulo 10 de la PKS rapamicina. Se construyó del siguiente
modo.
El plásmido pJLK50 se digirió con NheI y el
inserto de 6,1 kpb se ligó con el plásmido pJLK29 que había sido
digerido con NheI. La mezcla de ligación se usó para transformar
células DH10B de E. coli electrocompetentes y las colonias
individuales se examinaron para su contenido de plásmidos. El
plásmido deseado pJLK54 se identificó por su patrón de
restricción.
Uso del plásmido pJLK54 para la construcción de
NRRL2338/pJLK54 de S. erythraea y la producción de derivados
de TKL
Se usaron aproximadamente 5 \mug de plásmido
pJLK54 para transformar protoplastos de NRRL2338 de S.
erythraea y se aislaron colonias resistentes a tiostreptona
estables. A partir de varias colonias se obtiene ADN total y se
analiza por hibridación por transferencia de Southern para confirmar
que el plásmido se ha integrado en la TE.
Construcción de la cepa JLK10 de S.
erythraea y su uso en la producción de
13-metil-10,11-deshidro-eritromicina
A. La cepa JLK10 de S. erythraea es un mutante de
NRRL2338 de S. erythraea en el que el "bucle reductor"
del módulo 2 de ery, es decir, el dominio cetoreductasa, está
sustituido por el "bucle reductor" del módulo 10 de
rapamicina. Se construyó partiendo de NRRL2338 de S.
erythraea en la que se había integrado el plásmido pJLK54.
NRRL2338/pJLK54 de S. erythraea se sometió a varias rondas de
crecimiento no selectivo que dieron como resultado un segundo
cruzamiento concomitante con la pérdida del plásmido integrado. Los
clones en los que se había producido la sustitución del gen de
eritromicina que codificaba DEBS1 con la versión mutante se
identificaron por hibridación por transferencia de Southern. Uno de
éstos se llamó la cepa JLK10 de S. erythraea y se usó para
inocular medio SM3 (el medio eryP dio resultados similares) y se
dejó cultivar durante siete a diez días a 28-30ºC.
Después de este tiempo, el caldo se centrifugó y el pH del
sobrenadante se ajustó a pH 9. Entonces, el sobrenadante se extrajo
tres veces con un volumen igual de acetato de etilo y el disolvente
se eliminó mediante evaporación. Los productos se analizaron por
HPEM/CL, EM/EM y RMN ^{1}H. Se identificó el siguiente macrólido
C-13-metileritromicina A (acompañado
de productos de procesamiento incompleto por enzimas
pos-PKS).
El plásmido pPFL50 es un plásmido basado en
pPFL43 del que se ha eliminado un fragmento de ADN que codifica KR1
(en parte), ACP1 y el módulo 2 de la PKS eritromicina y la TE
eritromicina. Se construyó del siguiente modo. El plásmido pPFL43
se digirió con SfuI y XbaI para eliminar un fragmento de 6,5 kb. Los
nucleótidos protuberantes en 5' se llenaron con fragmento de Klenow
de ADN polimerasa I y el plásmido se recircularizó. La mezcla de
ligación se usó para transformar células DH10B de E. coli
electrocompetentes y las colonias individuales se examinaron para
su contenido de plásmidos. El plásmido deseado pPFL50 se identificó
por su patrón de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron aproximadamente 5 \mug de plásmido
pPFL50 para transformar protoplastos de la cepa JLK10 de S.
erythraea y se aislaron colonias resistentes a tiostreptona
estables. A partir de varias colonias se obtuvo ADN total y se
analizó por hibridación por transferencia de Southern para confirmar
que el plásmido se había integrado en la región homóloga del ADN
cromosómico. La cepa JLK10/pPFL50 de S. erythraea se usó para
inocular medio SM3 que contenía 5 \mug/ml de tiostreptona (el
medio eryP que contenía 5 \mug/ml de tiostreptona dio resultados
similares) y se dejó cultivar durante siete a diez días a
28-30ºC. Después de este tiempo, el caldo se
centrifugó y el pH del sobrenadante se ajustó a pH 9. Entonces, el
sobrenadante se extrajo tres veces con un volumen igual de acetato
de etilo y el disolvente se eliminó mediante evaporación. Los
productos se analizaron por HPEM/CL, EM/EM y RMN ^{1}H. Se
identificó el macrólido
C-13-metil-10,11-deshidro-eritromicina
A (acompañado de productos de procesamiento incompleto por enzimas
pos-PKS)
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron aproximadamente 5 \mug de plásmido
pPFL50 para transformar protoplastos de NRRL2338 de S.
erythraea y se aislaron colonias resistentes a tiostreptona
estables. A partir de varias colonias se obtuvo ADN total y se
analizó por hibridación por transferencia de Southern para confirmar
que el plásmido se había integrado en la región homóloga del ADN
cromosómico. Se usó NRRL2338/pPFL50 de S. erythraea para
inocular medio SM3 que contenía 5 \mug/ml de tiostreptona (el
medio eryP que contiene 5 \mug/ml de tiostreptona da resultados
similares) y se dejó cultivar durante siete a diez días a
28-30ºC. Después de este tiempo, el caldo se
centrifugó y el pH del sobrenadante se ajustó a pH 9,5. Entonces,
el sobrenadante se extrajo tres veces con un volumen igual de
acetato de etilo y el disolvente se eliminó mediante evaporación.
Los productos se analizaron por HPEM/CL, EM/EM y RMN ^{1}H. Se
identificó el macrólido
C-13-metileritromicina A (acompañado
de productos de procesamiento incompleto por enzimas
pos-PKS).
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pCB121 es un plásmido que contiene
el módulo de carga de monensina y KS del módulo 1 de monensina
seguido de la AT de módulo 1 de eritromicina y parte de la KR de
módulo 1 de eritromicina. Se construyó por medio de varios
plásmidos intermedios del siguiente modo.
El segmento de ADN de aproximadamente 1,8 kpb
del agrupamiento de genes de PKS monensina de Streptomyces
cinnamonensis que codifica parte de la ACP del módulo de
carga y KS de módulo 1 se amplificó por PCR usando como cebadores
los oligonucleótidos sintéticos:
- 5'-CGTTCCTGAGGTCGCTGGCCCAGGCGTA-3'
- 5'-CGAAGCTTGACACCGCGGCGCGGCGCGG-5'
y un cósmido que contiene el extremo 5' de los
genes de PKS monensina de S. cinnamonensis o alternativamente
ADN cromosómico de S. cinnamonensis como molde. El producto
de PCR se trató con T4 polinucleótido cinasa y luego se ligó con el
plásmido pUC18, que había sido linealizado por digestión con SmaI y
luego se trató con fosfatasa alcalina. La mezcla de ligación se usó
para transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes
y las colonias individuales se examinaron para su contenido de
plásmidos. El plásmido deseado pPFL45 se identificó por su patrón
de restricción.
El plásmido pPFL45 se digirió con NdeI y Bsu36I
y el fragmento de aproximadamente 2,6 kpb se ligó en el plásmido
pPFL43 que había sido digerido con NdeI y Bsu36I. La mezcla de
ligación se usó para transformar células DH10B de E. coli
electrocompetentes y las colonias individuales se examinaron para su
contenido de plásmidos. El plásmido deseado pPFL47 se identificó
por su patrón de restricción.
El plásmido pCJR24 se digirió con HindIII, los
nucleótidos protuberantes en 5' se llenaron con fragmento de Klenow
de ADN polimerasa I y se religaron. La mezcla de ligación se usó
para transformar células DH10B de E. coli electrocompetentes
y las colonias individuales se examinaron para su contenido de
plásmidos. El plásmido deseado pCB135 se identificó por su patrón
de restricción, faltando el sitio de reconocimiento para
HindIII.
El plásmido pKS1W es un vector derivado de
pNTEP2 (documento GB97/01810) que contiene una tricétido sintasa
derivada de DEBSITE con los únicos sitios de restricción
introducidos en los límites de KS1. El plásmido pKS1W se obtiene
por medio de varios plásmidos intermedios del siguiente modo.
Para la amplificación por PCR para el plásmido
pMO09 se usaron los siguientes oligonucleótidos sintéticos como
cebadores mutagénicos conteniendo uno un sitio MunI y el otro un
sitio PstI:
- 5'-GCGCGCCAATTGCGTGCACATCTCGAT-3' y
- 5'-CCTGCAGGCCATCGCGACGACCGCGACCGGTTCGCCG-3'
Para la amplificación por PCR para el plásmido
pMO10 se usaron los siguientes oligonucleótidos sintéticos como
cebadores mutagénicos conteniendo uno un sitio HindIII y el otro un
sitio EcoRV:
- 5'-GTCTCAAGCTTCGGCATCAGCGGCACCAA-3' y
- 5'-CGTGCGATATCCCTGCTCGGCGAGCGCA-3'
Para la amplificación por PCR para el plásmido
pMO13 se usaron los siguientes oligonucleótidos sintéticos como
cebadores mutagénicos conteniendo uno un sitio PstI y el otro un
sitio HindIII:
- 5'-GATGGCCTGCAGGCTGCCCGGCGGTGTGAGCA-3' y
- 5'-GCCGAAGCTTGAGACCCCCGCCCGGCGCGGTCGC-3'
La PCR se llevó a cabo en pNTEP2 (documento
GB97/01810) como molde usando Pwo ADN polimerasa y un ciclo de:
96ºC (1 min); hibridación a 50ºC (3 min); y extensión a 72ºC (1
min), y 25 ciclos de: 96ºC (1 min); hibridación a 50ºC (1 min); y
extensión a 72ºC (1 min) en presencia de 10% (vol/vol) de
dimetilsulfóxido. Los productos se repararon en los extremos y se
clonaron en pUC18 digerido con SmaI y la mezcla de ligación se
transformó en DH10B de E. coli. El ADN de plásmido se
preparó a partir de colonias individuales. Los plásmidos deseados
para pMO09 (3,8 kpb), pMO10 (3,9 kpb) y pMO13 (4,3 kpb) se
identificaron por su patrón de restricción y secuenciación de
ADN.
El plásmido pMO13 se digirió con HindIII y el
inserto de 1,2 kpb se clonó en pMO10 que había sido digerido con
HindIII. La mezcla de ligación se transformó en DH10B de E.
coli. El plásmido deseado (5,0 kpb) se identificó por su patrón
de restricción y se designó pMO11.
El plásmido pMO09 se digirió con PstI y el
inserto de 1,6 kpb se clonó en pMO11 que había sido digerido con
PstI. La mezcla de ligación se transformó en DH10B de E.
coli. El plásmido deseado (6,6 kpb) se identificó por su patrón
de restricción y se designó pMO12.
El plásmido pMO12 se digirió con MunI y EcoRV y
el fragmento de 3,9 kpb se clonó en pNTEPH (véase más adelante) que
había sido digerido con MunI y EcoRV. La mezcla de ligación se
transformó en DH10B de E. coli. El plásmido deseado (13.
kpb) se identificó por su patrón de restricción y se designó
pKS1W.
El plásmido pNTEPH se obtuvo a partir de pNTEP2
eliminando el sitio HindIII. pNTEP2 se digirió con HindIII, los
nucleótidos protuberantes en 5' se llenaron con fragmento de Klenow
de ADN polimerasa I y se religaron. El plásmido deseado (13,6 kpb)
se identificó por su patrón de restricción.
El plásmido pKSW1 se digirió con NdeI y XbaI y
el fragmento de aproximadamente 11,2 kpb se ligó con el plásmido
pCB135 que había sido digerido con NdeI y XbaI. La mezcla de
ligación se usó para transformar células DH10B de E. coli
electrocompetentes y las colonias individuales se examinaron para su
contenido de plásmidos. El plásmido deseado pCB136 se identificó
por su patrón de restricción.
El plásmido pCB136 se digirió con SfuI y XbaI
para eliminar un fragmento de 6,5 kb, los nucleótidos protuberantes
en 5' se llenaron con fragmento de Klenow de ADN polimerasa I y se
religaron. La mezcla de ligación se usó para transformar células
DH10B de E. coli electrocompetentes y las colonias
individuales se examinaron para su contenido de plásmidos. El
plásmido deseado pCB137 se identificó por su patrón de
restricción.
El plásmido pPFL47 se digirió con NdeI y HindIII
y el inserto de aproximadamente 4,4 kpb se ligó con el plásmido
pCB137 que había sido digerido con NdeI y HindIII. La mezcla de
ligación se usó para transformar células DH10B de E. coli
electrocompetentes y las colonias individuales se examinaron para su
contenido de plásmidos. El plásmido deseado pCB121 se identificó
por su patrón de restricción.
Se usaron aproximadamente 5 \mug de plásmido
pCB121 para transformar protoplastos de JLK10 de S. erythraea
y se aislaron colonias resistentes a tiostreptona estables. A
partir de varias colonias se obtuvo ADN total y se analizó por
hibridación por transferencia de Southern para confirmar que el
plásmido se había integrado en la región homóloga del ADN
cromosómico. La cepa JLK10/pCB121 de S. erythraea se usó para
inocular medio SM3 que contenía 5 \mug/ml de tiostreptona (el
medio eryP que contenía 5 \mug/ml de tiostreptona dio resultados
similares) y se dejó cultivar durante siete a diez días a
28-30ºC. Después de este tiempo, el caldo se
centrifugó y el pH del sobrenadante se ajustó a pH 9. Entonces, el
sobrenadante se extrajo tres veces con un volumen igual de acetato
de etilo y el disolvente se eliminó mediante evaporación. Los
productos se analizaron por HPEM/CL, EM/EM y RMN ^{1}H. Se
identificó el macrólido
C13-metil-10,11-deshidro-eritromicina
A (acompañado de productos de procesamiento incompleto por
enzimas
pos-PKS):
pos-PKS):
Se usaron aproximadamente 5 \mug de plásmido
pCB121 para transformar protoplastos de NRRL2338 de S.
erythraea y se aislaron colonias resistentes a tiostreptona
estables. A partir de varias colonias se obtuvo ADN total y se
analizó por hibridación por transferencia de Southern para confirmar
que el plásmido se había integrado en la región homóloga del ADN
cromosómico. Se usó NRRL2338/pPFL50 de S. erythraea para
inocular medio SM3 que contenía 5 \mug/ml de tiostreptona (el
medio eryP que contenía 5 \mug/ml de tiostreptona dio resultados
similares) y se dejó cultivar durante siete a diez días a
28-30ºC. Después de este tiempo, el caldo se
centrifugó y el pH del sobrenadante se ajustó a pH=9. Entonces, el
sobrenadante se extrajo tres veces con un volumen igual de acetato
de etilo y el disolvente se eliminó mediante evaporación. Los
productos se analizaron por HPEM/CL, EM/EM y RMN ^{1}H. Se
identificó el macrólido C13-eritromicina A
(acompañado de productos de procesamiento incompleto por enzimas
pos-PKS):
Aunque la presente invención se ilustra por los
ejemplos enumerados anteriormente, no deben considerarse como
limitantes del alcance de la invención. Las descripciones anteriores
ilustran por primera vez la construcción de un ensamblaje de genes
de PKS de tipo I que contiene un módulo de carga que contiene KSq
completa o parcialmente heterólogo y su uso para obtener productos
de policétido de utilidad como productos intermedios sintéticos o
como materiales bioactivos tales como antibióticos. Al experto en la
materia se le ocurrirá fácilmente que un módulo de carga que
contiene KSq completa o parcialmente heterólogo de otros conjuntos
de genes de PKS podría usarse para sustituir el módulo de carga de
DEBS, o de hecho en un conjunto de genes de PKS bastante diferente.
También se le ocurrirá fácilmente al experto en la materia que la
especificidad adicional proporcionada por la discriminación más
eficaz hecha entre metilmalonil-CoA y
malonil-CoA por una ATq, seguido de la
descarboxilación específica por una KSq, es preferible a la
discriminación imperfecta entre propionil-CoA y
acetil-CoA que es una característica del módulo de
carga de DEBS y de muchos otros módulos de carga de PKS ya que
maximiza la producción de un único producto en vez de una mezcla
que se diferencia entre sí en la naturaleza de la unidad de
iniciador. El evitar tales mezclas aumenta los rendimientos y evita
la necesidad de procedimientos de separación tediosos y
difíciles.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al
respecto.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (10)
1. Un procedimiento para producir un macrólido
de 14 miembros que tiene un grupo 13-metilo,
comprendiendo dicho procedimiento cultivar un organismo
transformante que contiene ADN que codifica y está dispuesto para
expresar una multienzima PKS (policétido sintasa) que produce un
macrólido de 14 miembros, comprendiendo dicha multienzima PKS un
módulo de carga y una pluralidad de módulos de extensión; en el que
dicho módulo de carga está adaptado para cargar un residuo de
malonilo y para efectuar luego la descarboxilación del residuo
cargado para proporcionar una unidad de iniciador de acetato que se
transfiere a una adyacente de dichos módulos de extensión; en el
que dicho módulo de carga es de la forma
KSq-ATq-ACP en la que:
- (a)
- KSq representa un dominio de tipo cetosintasa que se diferencia de un dominio KS de un módulo de extensión por tener un residuo de glutamina en lugar de una cisteína en el sitio activo;
- (b)
- ATq representa un dominio aciltransferasa que carga un malonilo y tiene un residuo de arginina en el sitio activo; y
- (c)
- ACP representa una proteína portadora de acilos; y en el que los módulos de extensión no están naturalmente asociados a un módulo de carga que efectúa la descarboxilación de un residuo de malonilo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el compuesto producido es un compuesto de fórmula 1:
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
R_{1} es H o OH;
R_{2}-R_{4} son cada uno independientemente H,
CH_{3} o CH_{2}CH_{3}; R_{5} es H o OH; y R_{6} es H,
CH_{3} o CH_{2}CH_{3}; R_{7} es H o desosamina; R_{8} es
H, CH_{3} o CH_{2}CH_{3}; R_{9} es OH, micarosa (R_{12}
es H) o cladinosa (R_{12} es CH_{3}), R_{10} es H; o R_{9}
= R_{10} = O; y R_{11} es H, CH_{3} o CH_{2}CH_{3}, con la
condición de que cuando R_{2}-R_{4} sea
CH_{3}, R_{6} sea CH_{3}, R_{8} sea CH_{3} y R_{11} sea
CH_{3}, entonces R_{1} y R_{5} no son H y R_{12} no es H; o
también cuando R_{2}-R_{4} sea CH_{3}, R_{6}
sea CH_{3}, R_{8} sea CH_{3} y R_{11} sea CH_{3},
entonces R_{1} y R_{5} no son OH y R_{12} no es H.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el compuesto producido es 15-noreritromicina
A.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el compuesto producido es 15-noreritromicina
B.
5. El procedimiento de cualquier reivindicación
precedente, en el que el dominio KSq se deriva por mutagénesis de
un dominio KS de un módulo de extensión.
6. El procedimiento de cualquier reivindicación
precedente, en el que el dominio ATq es un dominio AT de módulo de
extensión natural de una PKS de tipo I.
7. El procedimiento de cualquier reivindicación
precedente, en el que dicho módulo de carga se corresponde con el
módulo de carga de la multienzima PKS de oleandomicina,
espiramicina, nidamicina, metimicina o monensina.
8. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la pluralidad de módulos de
extensión se corresponde con los módulos de extensión de una PKS
seleccionada de eritromicina, narbomicina, picromicina,
lancamicina, kujimicina o megalomicina.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que la pluralidad de módulos de extensión se corresponde con los
módulos de extensión de la PKS eritromicina.
10. El procedimiento de cualquier reivindicación
precedente, en el que el organismo transformante se selecciona de:
Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces coelicolor,
Streptomyces avermitilis, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces
cinnamonensis, Streptomyces fradiae, Streptomyces longisporoflavus,
Streptomyces hygroscopicus, Micromonospora griseorubida,
Streptomyces lasaliensis, Streptomyces venezuelae, Streptomyces
antibioticus, Streptomyces lividans, Streptomyces rimosus,
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