ES2341669T3 - Metodos y composiciones para la deteccion y el analisis de acidos nucleicos por amplificacion de señal. - Google Patents
Metodos y composiciones para la deteccion y el analisis de acidos nucleicos por amplificacion de señal. Download PDFInfo
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Abstract
Un sistema de detección de ácido nucleico que comprende: una sonda oligonucleotídica aniónica marcada con un fluoróforo; y un politiofeno catiónico crómico por afinidad hidrosoluble que interacciona con dicha sonda formando una doble cadena neutra; en el que dicha doble cadena neutra exhibe cambios en su espectro de absorción en presencia de un polinucleótido diana.
Description
Métodos y composiciones para la detección y el
análisis de ácidos nucleicos por amplificación de señal.
La presente invención se refiere a métodos,
artículos y composiciones para la detección y el análisis de ácidos
nucleicos en una muestra. Más específicamente, la invención se
refiere a un sistema integrado novedoso de detección de
polinucleótido por amplificación de señal exento de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) que combina un receptor específico,
un transductor óptico y un mecanismo de amplificación. El sistema de
la presente invención es altamente sensible, permitiendo la
detección específica de oligonucleótidos y polinucleótidos
presentes en pequeñas cantidades (concretamente, del orden de
aproximadamente 20 copias).
Son necesarios biosensores de ADN sencillos y
ultrasensibles específicos de secuencia para el diagnóstico rápido
de infecciones y enfermedades genéticas, así como para aplicaciones
ambientales y forénsicas^{1}. Con este fin, se han propuesto
diversos sensores de ADN ópticos y
electroquímicos^{2-8}. Sin embargo, la mayoría de
estos sensores de ADN propuestos se basan en alguna forma de
amplificación química tal como PCR^{9}, que a su vez puede
requerir el uso de mezclas complejas y aparatos sofisticados para
efectuar las reacciones enzimáticas necesarias.
Más recientemente, se han descrito métodos
rápidos de detección de ADN basados en fluorescencia basados en
polímeros catiónicos conjugados
hidrosolubles^{10-14, \ 23-26}. En
este caso, se usa un polímero policatiónico como multicromóforo que
recoge la luz (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de
patente de Estados Unidos nº US 2004/0219556 A1 (4 de noviembre de
2004) (Bazan et al.)). Se proporciona un sensor basado en un
ácido nucleico peptídico neutro (PNA) y que tiene un cromóforo de
señalización que tiene una secuencia de bases complementaria de un
polinucleótido diana de interés. Tras la puesta en contacto del
polinucleótido diana en una muestra, se lleva el multicromóforo
policatiónico a la proximidad del cromóforo de señalización
mediante interacciones electrostáticas con el polinucleótido diana.
La excitación del multicromóforo produce entonces la emisión de luz
del cromóforo de señalización. Aunque este método proporciona un
modo rápido y fiable para medir la cantidad de polinucleótidos en
una muestra, no permite por sí mismo la detección de cantidades muy
pequeñas de nucleótidos en la muestra.
Por tanto, sigue habiendo necesidad de un método
que permita una detección rápida y altamente sensible de
polinucleótidos en una muestra sin recurrir a técnicas de
amplificación de nucleótidos tales como PCR. Además, sigue habiendo
la necesidad de composiciones y artículos de fabricación útiles en
dicho método.
La presente invención busca satisfacer estas y
otras necesidades.
La presente invención se refiere a un método que
proporciona una detección rápida y específica de oligonucleótidos y
polinucleótidos monocatenarios o bicatenarios, y a composiciones y
artículos de fabricación útiles para efectuar dichos métodos.
La presente invención se refiere adicionalmente
a un método que proporciona la detección rápida y específica de
oligonucleótidos y polinucleótidos monocatenarios o bicatenarios en
muestras, y a composiciones y artículos de fabricación útiles para
efectuar dichos métodos.
En una realización, la presente invención se
refiere a un sistema de detección de ácido nucleico que comprende
una sonda oligonucleotídica aniónica, un transductor polimérico
catiónico conjugado hidrosoluble y un mecanismo de amplificación
fotónica intrínseco. El transductor polimérico catiónico conjugado
hidrosoluble sirve también como contraión localizado, promoviendo
la hibridación específica. Además, el transductor polimérico, cuando
se combina con sondas de captura marcadas con un fluoróforo,
proporciona una amplificación de señal y límites de detección
mejorados.
El sistema de detección de ácido nucleico de la
presente invención es capaz de detectar específica y rápidamente del
orden de 20 oligonucleótidos monocatenarios. En una realización de
la presente invención, los oligonucleótidos monocatenarios a
detectar pueden extraerse de muestras clínicas.
Ventajosamente, el sistema de detección de ácido
nucleico de la presente invención es adecuado para una evaluación
rápida de la identidad de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP),
genes y patógenos sin necesidad de amplificación de ácido
nucleico.
En una realización, la presente invención se
refiere a un sistema de detección de ácido nucleico que comprende
un politiofeno catiónico crómico por afinidad hidrosoluble; una
sonda de captura oligonucleotídica aniónica marcada con un
fluoróforo para formar una doble cadena con el politiofeno
catiónico crómico por afinidad hidrosoluble y una muestra
sospechosa de contener un oligonucleótido diana complementario.
En una realización, la presente invención se
refiere a un método para detectar moléculas de ácido nucleico de
poca longitud que comprende: proporcionar un politiofeno catiónico
crómico por afinidad hidrosoluble; poner en contacto el politiofeno
catiónico crómico por afinidad hidrosoluble con una sonda de captura
oligonucleotídica aniónica marcada con un fluoróforo para formar
una doble cadena y poner en contacto la doble cadena con una muestra
sospechosa de contener un oligonucleótido diana complementario.
Resultarán evidentes alcances y aplicabilidades
adicionales a partir de la descripción detallada dada a continuación
en la presente memoria. Sin embargo, se entenderá que esta
descripción detallada, aunque indica realizaciones preferidas de la
invención, se da sólo a modo de ejemplo, puesto que resultarán
evidentes diversos cambios y modificaciones para los expertos en la
técnica.
En los dibujos adjuntos:
La Figura 1 ilustra: A. Estructura química del
polímero 1 y espectros de absorción UV-visible de
(a) polímero de triple cadena 1/X1/Y1 (coincidencia perfecta), (b)
polímero de doble cadena 1/[X1+Alexa Fluor (AF) 546] y (c) polímero
de triple cadena 1/X1+AF546/Y1 (coincidencia perfecta) en agua a
55ºC. B. Espectros de fluorescencia con excitación a 420 nm, de (a)
polímero de triple cadena 1/X1/Y1 (coincidencia perfecta), (b)
polímero de doble cadena 1/[X1+AF546]; (c) polímero de triple cadena
1/X1+AF546/Y1 (coincidencia perfecta) en agua a 55ºC;
la Figura 2 ilustra la intensidad de
fluorescencia corregida (después de la resta de la señal debida a la
doble cadena inicial) medida a 572 nm en agua a 55ºC, con excitación
a 420 nm, en función del número de copias de oligonucleótido diana
de 20 unidades: (cuadrados) coincidencia perfecta; (círculos) dos
desapareamientos; (triángulos) un desapareamiento;
la Figura 3 ilustra una descripción esquemática
del mecanismo de detección de la amplificación de señal de la
presente invención, basado en los cambios conformacionales del
politiofeno catiónico y la transferencia de energía para una
detección de ADN ultransensible, selectiva y rápida;
la Figura 4 ilustra: A. Intensidad de
fluorescencia corregida (después de la resta de la señal debida a la
doble cadena inicial) medida a 572 nm, con excitación a 420 nm, en
función del número de copias de ADN genómico: (línea oscura) TAN 101
+ ADN genómico de tipo silvestre (coincidencia perfecta); (línea
clara) TAN 100 + ADN genómico de tipo silvestre (un
desapareamiento). B. Intensidad de fluorescencia corregida (después
de la resta de la señal debida a la doble cadena inicial) medida a
572 nm, con excitación a 420 nm, en función del número de copias de
ADN genómico: (línea oscura) TAN 101 + ADN genómico mutado
(coincidencia perfecta); (línea clara) TAN 100 + ADN genómico mutado
(un desapareamiento);
la Figura 5 ilustra la intensidad de
fluorescencia corregida (después de la resta de la señal debida a la
doble cadena inicial) medida a 572 nm, con excitación a 420 nm, en
agua pura a 55ºC, en función del número de copias de oligonucleótido
diana de 20 unidades: (línea oscura) coincidencia perfecta; (línea
clara) dos desapareamientos;
la Figura 6 ilustra la intensidad de
fluorescencia corregida (después de la resta de la señal debida a la
doble cadena inicial) medida a 572 nm, con excitación a 420 nm, en
agua pura a 65ºC, en función del número de copias de amplicón diana
de 150 pb; (línea oscura) coincidencia perfecta (amplicón de C.
albicans); (línea clara) dos desapareamientos (amplicón de C.
dubliniensis); y
la Figura 7 ilustra la intensidad de
fluorescencia corregida (después de la resta de la señal debida a la
doble cadena inicial) medida a 572 nm, con excitación a 420 nm, en
agua pura a 65ºC, en función del número de copias de ADN genómico:
(línea oscura) TAN 102a + ADN genómico de tipo silvestre
(coincidencia perfecta); (línea clara) TAN 103a + ADN genómico de
tipo silvestre (un desapareamiento).
La terminología usada en la presente memoria es
sólo con el fin de describir realizaciones particulares y no se
pretende que limite el alcance de la presente invención.
El uso de las formas singulares "un",
"una" y "el/la" incluye las referencias plurales a menos
que el contexto disponga claramente otra cosa. Por tanto, por
ejemplo, la referencia a "un polinucleótido diana" incluye una
pluralidad de polinucleótidos diana.
Como se usa en esta memoria descriptiva y
reivindicaciones, las palabras "comprender" (y cualquier forma
de comprender, tal como "comprende" y "comprendiendo"),
"tener" (y cualquier forma de tener tal como "tiene" y
"teniendo"), "incluir" (y cualquier forma de incluir tal
como "incluye" e "incluyendo") o "contener" (y
cualquier forma de contener tal como "contiene" y
"conteniendo") son incluyentes o de extremos abiertos y no
excluyen elementos o etapas de proceso adicionales no indicados.
\newpage
El término "aproximadamente" se usa para
indicar que un valor incluye una variación inherente de error por el
dispositivo o método que se esté empleando para determinar el
valor.
Términos tales como "conectado",
"unido" y "ligado" pueden usarse intercambiablemente en la
presente memoria y comprenden la conexión, unión, ligamiento o
conjugación directos así como indirectos a menos que el contexto
disponga claramente otra cosa.
Cuando un valor se indica explícitamente, ha de
entenderse que los valores que son de aproximadamente la misma
cantidad o cuantía que el valor indicado están también dentro del
alcance de la invención, así como los intervalos basados en
ellos.
A menos que se defina otra cosa o el contexto
disponga claramente otra cosa, todos los términos técnicos y
científicos usados en la presente memoria tienen el mismo
significado entendido habitualmente por un experto en la técnica a
la que pertenece esta invención. Aunque puede usarse cualquier
método y material similar o equivalente a los descritos en la
presente memoria en la práctica o ensayo de la invención, se
describen ahora los métodos y materiales
preferidos.
preferidos.
Todas las publicaciones mencionadas en la
presente memoria se incorporan por la presente como referencia con
fines de dar a conocer y describir los materiales y metodologías
particulares por los que se citó la referencia. Las publicaciones
examinadas en la presente memoria se proporcionan únicamente para su
divulgación antes de la fecha de presentación de la presente
solicitud. Nada en la presente memoria ha de considerarse como una
admisión de que la invención no está autorizada a antedatar dicha
divulgación en virtud de la invención anterior.
Los términos "polinucleótido",
"oligonucleótido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido
nucleico" se usan intercambiablemente en la presente memoria
para designar una forma polimérica de nucleótidos de cualquier
longitud, y pueden comprender ribonucleótidos,
desoxirribonucleótidos, análogos de los mismos o mezclas de los
mismos. Estos términos designan sólo la estructura primaria de la
molécula. Por tanto, los términos incluyen ácido
desoxirribonucleico tri-, bi- y monocatenario ("ADN") así como
ácido ribonucleico tri-, bi- y monocatenario ("ARN"). Incluyen
también formas modificadas (por ejemplo, mediante alquilación y/o
adición de casquete) y no modificadas del
polinucleótido.
polinucleótido.
Más particularmente, los términos
"polinucleótido", "oligonucleótido", "ácido nucleico"
y "molécula de ácido nucleico" incluyen
polidesoxirribonucleótidos (que contienen
2-desoxi-D-ribosa),
polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa),
incluyendo ARNt, ARNr, ARNh y ARNm, cortados y empalmados o no,
cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N- o
C-glucósido de una base de purina o pirimidina, y
otros polímeros que contengan un esqueleto de fosfato u otro
polianiónico, y otros polímeros de ácido nucleico específicos de
secuencia sintéticos ,a condición de que los polímeros contengan
nucleobases en una configuración que permita el apareamiento de
bases y el apilamiento de bases, tal como se encuentra en ADN y ARN.
No se pretende una distinción en longitud entre los términos
"polinucleótido", "oligonucleótido", "ácido nucleico"
y "molécula de ácido nucleico" y estos términos se usan
intercambiablemente en la presente memoria. Por tanto, estos
términos incluyen, por ejemplo,
3'-desoxi-2',5'-ADN,
N3',P5'-fosforamidatos de
oligodesoxirribonucleótido, ARN sustituido con
2'-O-alquilo, ADN bi- y
monocatenario, así como ARN bi- y monocatenario e híbridos de los
mismos incluyendo, por ejemplo, híbridos entre ADN y ARN, e
incluyen también tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo,
marcajes, alquilación, "casquetes", sustitución de uno o más
de los nucleótidos por un análogo, modificaciones internucleotídicas
tales como, por ejemplo, aquellas con ligamientos cargados
negativamente (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos,
etc.), aquellas que contienen restos pendientes tales como, por
ejemplo, proteínas (incluyendo enzimas (por ejemplo proteasas),
toxinas, anticuerpos, péptidos señal,
poli-L-lisina, etc.), aquellas con
intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellas
que contienen quelatos (por ejemplo, de metales, metales
radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellas que contienen
alquilantes, aquellas con ligamientos modificados (por ejemplo,
ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.), así como
formas no modificadas del polinucleótido u oligonucleótido.
Como se usan en la presente memoria, los
términos "nucleósido" y "nucleótido" incluirán aquellos
restos que contengan no sólo las bases de purina y pirimidina
conocidas, sino también otras bases heterocíclicas que se hayan
modificado. Dichas modificaciones incluyen purinas o pirimidinas
metiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros heterociclos. Los
nucleósidos o nucleótidos modificados pueden incluir también
modificaciones en el resto de azúcar, por ejemplo, en el que uno o
más de los grupos hidroxilo se reemplazan por halógeno, grupos
alifáticos o se funcionalizan en forma de éteres, aminas o
similares. El término "unidad nucleotídica" se pretende que
comprenda los nucleósidos y nucleótidos.
Adicionalmente, las modificaciones de unidades
nucleotídicas incluyen transposición, adición, sustitución o
alteración de otro modo de grupos funcionales en la base de purina o
pirimidina que formen enlaces de hidrógeno con una pirimidina o
purina complementaria respectiva. La unidad nucleotídica modificada
resultante puede formar opcionalmente un par de bases con otras de
dichas unidades nucleotídicas modificadas, pero no con A, T, C, G o
U. Pueden incorporarse sitios abásicos que no eviten la función del
polinucleótido; preferiblemente, el polinucleótido no comprende
sitios abásicos. Algunos o todos los residuos del polinucleótido
pueden modificarse opcionalmente de una o más maneras.
\newpage
Las pares de bases estándar A-T
y G-C se forman en condiciones que permiten la
formación de puentes de hidrógeno entre N3-H y
C4-oxi de timidina y N1 y
C6-NH_{2}, respectivamente, de adenosina, y entre
C2-oxi, N3 y C4-NH_{2} de
citidina y C2-NH_{2}, N'-H y
C6-oxi, respectivamente, de guanosina. Por tanto,
por ejemplo, la guanosina
(2-amino-6-oxi-9-beta-D-ribofuranosilpurina)
puede modificarse para formar isoguanosina
(2-oxi-6-amino-9-beta-D-ribofuranosilpurina).
Dicha modificación da como resultado una base nucleosídica que no
formará ya eficazmente un par de bases estándar con citosina. Sin
embargo, la modificación de la citosina
(1-beta-D-ribofuranosil-2-oxi-4-aminopirimidina)
para formar isocitosina
(1-beta-D-ribofuranosil-2-amino-4-oxipirimidina)
da como resultado un nucleótido modificado que no formará
eficazmente un par de bases con guanosina, sino que formará un par
de bases con isoguanosina. La isocitosina está disponible en Sigma
Chemical Co. (St. Louis, Mo.); la isocitidina puede prepararse
mediante el método descrito por Switzer et al. (1993)
Biochemistry 32: 10489-10496 y las
referencias citadas en la misma; la
2'-desoxi-5-metilisocitidina
puede prepararse mediante el método de Tor et al. (1993)
J. Am. Chem. Soc. 115: 4461-4467 y las
referencias citadas en la misma; y los nucleótidos de isoguanina
pueden prepararse usando el método descrito por Switzer et
al. (1993), supra y Mantsch et al. (1993)
Biochem. 14: 5593-5601, o mediante el método
descrito en la patente de EE.UU. nº 5.780.610 de Collins et
al. Pueden sintetizarse otros pares de bases no naturales
mediante el método descrito en Piccirilli et al. (1990)
Nature 343: 33-37 para la síntesis de
2,6-diaminopirimidina y su complemento
(1-metilpirazolo-[4,3]pirimidin-5,7-(4H,6H)-diona).
Son conocidas otras de dichas unidades nucleotídicas modificadas
que forman pares de bases únicas, tales como las descritas en Leach
et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:
3675-3683 y Switzer et al., supra.
Las condiciones de hibridación incluirán
típicamente concentraciones de sal de menos de aproximadamente 1 M,
más habitualmente de menos de aproximadamente 500 mM y
preferiblemente de menos de aproximadamente 200 mM. Las
temperaturas de hibridación pueden ser del orden de 5ºC, pero son
típicamente mayores de 22ºC, más típicamente mayores de
aproximadamente 30ºC y preferiblemente superiores a aproximadamente
37ºC. Los fragmentos más largos pueden requerir temperaturas de
hibridación mayores para hibridación específica. Otros factores
pueden afectar al rigor de la hibridación, incluyendo la composición
de bases y la longitud de las cadenas complementarias, la presencia
de disolventes orgánicos y la extensión del desapareamiento de
bases, y la combinación de parámetros usada es más importante que
la medida absoluta de cualquiera de ellos solo. Las condiciones de
hibridación adecuadas para un formato de ensayo dado pueden
determinarse por un experto en la técnica; los parámetros no
limitantes que pueden ajustarse incluyen las concentraciones de
componentes de ensayo, las sales usadas y su concentración, fuerza
iónica, temperatura, tipo y concentración de tampón, pH de la
disolución, presencia y concentración de reactivos de bloqueo para
reducir la unión al fondo tal como secuencias repetidas o
disoluciones de proteína de bloqueo, los tipos y concentraciones de
detergentes, moléculas tales como polímeros que aumentan la
concentración relativa de los polinucleótidos, iones metálicos y sus
concentraciones, quelantes y sus concentraciones y otras condiciones
conocidas en la técnica.
"Determinación multiparamétrica" designa en
la presente memoria un ensayo u otro método analítico en el que
pueden ensayarse simultáneamente múltiples analitos.
La muestra que comprende o se sospecha que
comprende el polinucleótido diana puede ser cualquier fuente de
material biológico que comprenda polinucleótidos que pueda obtenerse
de un organismo vivo directa o indirectamente, incluyendo células,
tejido o fluido, y los depósitos dejados por ese organismo,
incluyendo virus, micoplasmas y fósiles. La muestra puede
comprender un polinucleótido diana preparado total o parcialmente
mediante medios sintéticos. Típicamente, la muestra se obtiene en
forma de o se dispersa en un medio predominantemente acuoso. Los
ejemplos no limitantes de la muestra incluyen sangre, orina, semen,
leche, esputo, moco, torunda bucal, torunda vaginal, torunda
rectal, aspirado, aguja de biopsia, sección de tejido obtenida por
ejemplo mediante cirugía o autopsia, plasma, suero, fluido espinal,
fluido linfático, secreciones externas de la piel, tractos
respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva,
tumores, órganos, muestras de constituyentes de cultivo celular
in vitro (incluyendo, pero sin limitación, medio
acondicionado resultante del crecimiento de células en el medio de
cultivo celular, células supuestamente infectadas por virus, células
recombinantes y componentes celulares), y una colección
recombinante que comprenda secuencias polinucleotídicas.
La muestra puede diluirse, disolverse,
suspenderse, extraerse o tratarse de otro modo para solubilizar y/o
purificar cualquier polinucleótido diana presente o volverlo
accesible a los reactivos que se usan en un esquema de
amplificación o a reactivos de detección. Cuando la muestra contiene
células, las células pueden lisarse o permeabilizarse para liberar
los polinucleótidos de las células. Pueden usarse tampones de
permeabilización de una etapa para lisar células que permitan
efectuar etapas adicionales directamente después de la lisis, por
ejemplo una reacción en cadena de la polimerasa.
El polinucleótido diana puede ser monocatenario,
bicatenario o de orden superior, y puede ser lineal o circular. Los
polinucleótidos diana monocatenarios ejemplares incluyen genomas
víricos de ARNm, ARNr, ARNt, ARNhn, ARNmc o ADNmc, aunque estos
polinucleótidos pueden contener secuencias complementarias
internamente y estructura secundaria significativa. Los
polinucleótidos diana bicatenarios ejemplares incluyen ADN genómico,
ADN mitocondrial, ADN de cloroplasto, genomas víricos de ARNbc o
ADNbc, plásmidos, fagos y viroides. El polinucleótido diana puede
prepararse sintéticamente o purificarse a partir de una fuente
biológica. El polinucleótido diana puede purificarse para eliminar
o reducir uno o más componentes indeseados de la muestra o para
concentrar el polinucleótido diana. A la inversa, cuando el
polinucleótido diana está demasiado concentrado para el ensayo
particular, puede diluirse el polinucleótido diana.
Se sintetizó el polímero 1 según el trabajo
publicado anteriormente^{10,13}. Basándose en medidas de
cromatografía de permeación en gel calibrada con muestras de
polivinilpiridinio monodispersado, el polímero tenía un peso
molecular numérico medio de 11.000 con un índice de polidispersidad
de 2,0. Se adquirieron los oligonucleótidos marcados y no marcados
en Integrated DNA Technologies, Inc. Para los estudios de
oligonucleótidos de 20 unidades, la sonda (X1) y dianas (Y1, Y2 y
Y3) derivaban de sondas diseñadas para la detección de la especie de
levadura Candida^{10}. Para la detección de la mutación de
corte y empalme de tirosinemia de tipo I IVS12+5 G->A^{21}, la
secuencia de sonda de captura de 15 unidades complementaria de la
secuencia mutada en el genoma era (TAN 100) 5'-CCG
GTG AAT ATC TGG-3', y la sonda de captura
complementaria de ADN de tipo silvestre era (TAN 101)
5'-CCG GTG AGT ATC TGG-3'. Se
unió Alexa Fluor 546 al extremo 5' de las sondas oligonucleotídicas.
Se diluyeron todas las disoluciones oligonucleotídicas con agua
esterilizada y se efectuaron todas las diluciones y manejos de
disolución con recipientes de plástico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo ADN genómico humano de sangre de
paciente como se describe anteriormente^{22} y se almacenó
congelado a -20ºC hasta su uso^{22}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se registraron los espectros de absorción
UV-visible (Figura 1A) usando un espectrofotómetro
Hewlett-Packard (modelo 8452A). Se registraron los
espectros de fluorescencia (Figura 1B) usando un espectrofluorómetro
Varian Cary Eclipse. Se obtuvieron las curvas de calibración de
fluorescencia (Figuras 2 y 4) usando un fluorómetro portátil
corriente^{13} modificado para la medida de la emisión de Alexa
Fluor a 572 nm. En todos los casos, se efectuó la excitación a 420
nm y se obtuvieron los puntos de datos de fluorescencia en las
curvas de calibración a partir de la media de 5 medidas ópticas a
572 nm. Se obtuvo cada medida óptica mediante la integración de la
señal fluorescente durante un periodo de 10 segundos. Para todas las
medidas ópticas, se utilizaron celdas de cuarzo de 3 ml con una
longitud del camino óptico de 1,0 cm. Se calculó el límite de
detección por ser tres veces la desviación estándar de las medidas
ópticas para la señal de blanco dividida entre la pendiente de la
curva de calibración. Se prepararon dobles cadenas mezclando
cantidades estequiométricas del polímero y de la sonda de captura
oligonucleotídica, dando una concentración de 2,14 \muM
(disolución madre). Se diluyó entonces el complejo resultante a las
concentraciones deseadas. Se llevaron a cabo experimentos de
hibridación a 55ºC para los oligonucleótidos de 20 unidades y a 65ºC
para la detección de SNP de tirosinemia. Para los estudios de
tirosinemia, se desnaturalizaron las muestras en primer lugar a
100ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfirieron 350 pg de preparación de ADN
genómico a una concentración de 350 pg/\mul a una mezcla de PCR
de 19 \mul que contenía KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM
(pH 9,1), 0,1% de Triton X-100, MgCl_{2} 2,5 mM,
concentraciones 0,4 \muM de los cebadores ECal61
[5'-CAAGAAGGTTGGTTACAACCCAAAGA-3'] y
Ecal184
[5'-AGGTCTTAC
CAGTAACTTTACCGGAT-3']), trifosfato de desoxinucleósido 200 \muM (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.), 3,3 \mug de albúmina de suero bovino (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Ontario, Canadá) por \mul y 0,025 U de ADN polimerasa Taq (Promega, Madison, Wis.) combinado con el anticuerpo TaqStart (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, Calif.). Se sometieron las mezclas de PCR a ciclación térmica (3 min a 95ºC y después 40 ciclos de 30 s a 95ºC para la etapa de desnaturalización, 30 s a 55ºC para la etapa de reasociación y 30 s a 72ºC para la etapa de extensión) en un ciclador térmico PTC-200 (MJ Research Inc., Watertown, Mass.). Se purificaron los productos de la amplificación por PCR mediante el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen Inc., Mississauga, Ontario, Canadá) usando agua desionizada para eluir los amplicones.
CAGTAACTTTACCGGAT-3']), trifosfato de desoxinucleósido 200 \muM (Amersham Biosciences, Piscataway, N.J.), 3,3 \mug de albúmina de suero bovino (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Ontario, Canadá) por \mul y 0,025 U de ADN polimerasa Taq (Promega, Madison, Wis.) combinado con el anticuerpo TaqStart (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, Calif.). Se sometieron las mezclas de PCR a ciclación térmica (3 min a 95ºC y después 40 ciclos de 30 s a 95ºC para la etapa de desnaturalización, 30 s a 55ºC para la etapa de reasociación y 30 s a 72ºC para la etapa de extensión) en un ciclador térmico PTC-200 (MJ Research Inc., Watertown, Mass.). Se purificaron los productos de la amplificación por PCR mediante el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen Inc., Mississauga, Ontario, Canadá) usando agua desionizada para eluir los amplicones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron 7 ml de sangre de voluntarios sanos
usando tubos Vacutainer^{TM} que contenían (K3)EDTA
(tapones de color lavándula, número de orden 366450, Becton
Dickinson). Se usaron 200 \mul de esta sangre para la extracción
y purificación de ADN usando el MagneSil KF Genomic System (nº de
cat. MD1460) de Promega. Se efectuaron las preparaciones de muestra
según las instrucciones del fabricante (MagneSil^{TM}, KF Genomic
System, MD1460rev01) excepto por una ligera modificación: en la
etapa IVb del protocolo de Promega, se usaron 200 \mul de TE en
lugar de 200 \mul de agua exenta de nucleasa. Se manejaron las
partículas magnéticas usando un procesador de partículas magnéticas
KingFisher^{TM} de Thermo Labsystems controlado por el programa
"PromegaGenomic" versión 1.0 (MagneSil^{TM} KF Genomic
System, programa descargado del sitio web como
"KfmLMagGenomv1_0").
La presente invención se refiere a un sistema
integrado novedoso de detección de ADN con amplificación de señal
exento de PCR que combina un receptor específico, un transductor
óptico y un mecanismo de amplificación. Este sistema de detección
novedoso está basado en las diferentes interacciones electrostáticas
y conformaciones entre un politiofeno catiónico (concretamente,
polímero 1) y un ADNmc o ADNbc y la transferencia de energía eficaz
entre la triple cadena (complejación entre el politiofeno catiónico
y el ADNbc) y los fluoróforos vecinos unidos a sondas de ADNmc o
ADNbc. Ha de entenderse que, en el caso de ADNmc, la formación de
cadenas triples ocurre mediante la hibridación de cadenas de ADNmc
complementarias, combinado con la complejación con el politiofeno
catiónico. El presente sistema de detección permite la detección de
polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de muestras clínicas en
sólo unos pocos minutos, sin necesidad de amplificación de ácido
nucleico. En una realización adicional de la presente invención, el
sistema de detección polimérico puede adaptarse fácilmente para
detección multiparamétrica en disolución usando diferentes
fluorórofos unidos a sondas de ADNmc o usando micromatrices sobre
soportes sólidos.
En una realización, la presente invención se
refiere a un sistema de detección de ácido nucleico novedoso que
comprende una sonda oligonucleotídica aniónica, un transductor
polimérico catiónico crómico por afinidad conjugado hidrosoluble y
un mecanismo de amplificación fotónica intrínseco. El transductor
polimérico catiónico crómico por afinidad conjugado hidrosoluble
sirve también como contraión localizado que promueve la hibridación
específica. En una realización de la presente invención, el
transductor polimérico catiónico comprende un politiofeno catiónico
crómico por afinidad conjugado hidrosoluble (Figura 1; polímero 1).
Dicho politiofeno catiónico se ha descrito anteriormente y se
preparó siguiendo procedimientos conocidos en la
bibliografía^{10,13}.
El politiofeno catiónico conjugado hidrosoluble
como se usa en la presente memoria exhibe propiedades crómicas por
afinidad (cambios del espectro de absorción
UV-visible tras la unión que provienen de cambios
conformacionales), cuando se pone en presencia de ácidos nucleicos
monocatenarios (mc) o bicatenarios (bc)^{10,13}. Por
ejemplo, el polímero 1 en medios acuosos proporciona una disolución
amarilla (\lambda_{máx}= 397 nm) correspondiente a una
conformación de ovillo aleatorio poco conjugada del politiofeno.
Cuando se añade una cantidad estequiométrica (basada en una unidad
repetida) de una sonda de captura no marcada de 20 unidades
(concretamente X1:
5'-CATGATTGMCCATCCACCA-3'), la
mezcla se vuelve roja (\lambda_{máx}= 527 nm), correspondiente a
una forma plana altamente conjugada del politiofeno. Esto es
indicativo de la formación de la denominada "doble cadena"
neutra (cadena de captura) entre el politiofeno catiónico y la
sonda oligonucleotídica aniónica. Tras la adición de un
oligonucleótido complementario (concretamente Y1:
3'-GTACTAACTTGGTAGGTGGT-5') a la
cadena de captura, se forma una triple cadena. La formación de la
triple cadena da como resultado un cambio de color adicional de la
mezcla, volviendo la mezcla a un color amarillo (\lambda_{máx}=
421 nm; Figura 1A, a). Se observan ligeros cambios en los espectros
de absorción (datos no mostrados) con la adición de oligonucleótidos
que tienen dos desapareamientos (concretamente Y2:
3'-GTACTAACTTCGAAGGTGGT-5') o
sólo un desapareamiento (concretamente Y3:
3'-GTACTAACTTCGTAGGTGGT-5').
La detección fluorimétrica de ácidos nucleicos
es también posible usando el sistema de detección de ADN novedoso
de la presente invención. La detección fluorimétrica es posible
debido a que la fluorescencia del
poli-(3-alcoxi-4-metiltiofenos)
está inactivada en la forma plana agregada (doble cadena), mientras
que la forma de triple cadena amarilla es fluorescente, teniendo un
máximo de emisión a 530 nm (Figura 1B, a) cuando se excita a 420
nm.
Se mejoró adicionalmente la especificidad y
sensibilidad del transductor polimérico combinándolo con sondas de
captura marcadas con un fluoróforo (por ejemplo, Alexa Fluor 546)
para inducir una transferencia de energía de resonancia Förster
(FRET). Usando este transductor mejorado, la doble cadena
estequiométrica sigue exhibiendo un color rojo (Figura 1A, b) y
fluorescencia inactivada (Figura 1B, b). Cuando hibrida esta doble
cadena con su oligonucleótido complementario, puede observarse una
nueva banda de absorción a 420 nm, correspondiente a la formación
de una triple cadena (Figura 1A, c). El máximo de emisión de la
triple cadena resultante (530 nm) se superpone claramente con el
espectro de absorción del fluoróforo (Alexa Fluor 546) que tiene
bandas de absorción a 516 y 556 nm (Figura 1A, c) y que emite
entonces a longitudes de onda más largas (máximo de emisión a 572
nm; Figura 1B, c). Cuando se añade un ADN no complementario o
desapareado a la doble cadena, no se detecta cambio de color: la
disolución de doble cadena permanece roja. Esto es indicativo de una
inhibición del mecanismo de FRET. En consecuencia, la intensidad de
fluorescencia medida con la cadena de ADNmc complementaria perfecta
(condiciones experimentales idénticas) es siempre mayor comparada
con las obtenidas con dianas que tienen uno o dos
desapareamientos.
Sorprendentemente, partiendo de una gran
cantidad de sondas de doble cadena estequiométricas (aprox.
10^{10} copias), pudieron detectarse fácil y específicamente en
una muestra (3 ml) del orden de aproximadamente 30 copias de un
oligonucleótido de 20 unidades usando el presente sistema de
detección de ADN novedoso. Además, las dianas complementarias
perfectas podían distinguirse todavía a dichas bajas concentraciones
de las secuencias que tenían dos o únicamente un desapareamiento.
El límite de detección que se calcula a partir de estos datos
usando un fluorómetro de LED azul habitual fue sólo de 5 copias en
un volumen de 3 ml, lo que es igual a una concentración 3 zM (3 x
10^{-21} M). Se obtuvo un límite de detección algo mayor (30
copias en un volumen de 3 ml; 18 zM) usando un espectrofluorómetro
comercial (Varian Cary Eclipse). El uso de sondas de captura
marcadas con un fluoróforo en el sistema de detección de ADN de la
presente invención proporciona una señal amplificada
"conectada"^{15} que puede describirse como un proceso de
"superiluminación" o "reacción en cadena de
fluorescencia" (FCR). Como se ilustra en la FIG. 3, se cree que
esta transferencia de energía altamente eficaz es debida
principalmente a la formación de agregados de cadenas dobles en
disolución antes de la introducción de la diana^{10,13}. Estos
agregados darían entonces lugar a una transferencia de energía muy
eficaz entre una triple cadena dada y un gran número de cromóforos
Alexa Fluor vecinos. Es más, este cromóforo muestra un
desplazamiento de Stokes de sólo 16 nm y un rendimiento cuántico de
fluorescencia del 95% con una vida útil de fluorescencia de 3,6 ns.
Estos son parámetros excelentes para una transferencia de energía
intermolecular altamente eficaz entre moléculas conjugadas
agregadas^{16-20}.
En una realización de la presente invención, el
sistema de detección de ácido nucleico novedoso puede usarse
también para la detección ultransensible de ADNbc. Cuando se usan
sondas de captura marcadas con un fluoróforo para inducir la
amplificación de señal, pueden detectarse niveles de concentración
extremadamente bajos de ADNbc. Debido a que la reacción de
hibridación de sonda-diana está en competición con
la rehibridación del ADNbc, la mayoría de técnicas de detección
directa de ADN reseñadas anteriormente se basan en la disponibilidad
de la secuencia diana como ADNmc. En el caso del transductor de
politiofeno usado en la presente invención, estudios previos han
mostrado que la presencia de ADNbc no complementario puede conducir
a señales falsas positivas puesto que el transductor de politiofeno
tiene una mayor afinidad, en comparación con las sondas de ADNmc,
por ADNbc^{10,13}.
Se han elaborado condiciones experimentales que
potencian selectivamente la reacción de reconocimiento entre la
sonda de captura de ADN y la diana de ADN. Específicamente, en agua
pura a 65ºC, todo el material de ADN desnaturalizado permanece
desnaturalizado y la hibridación ocurre esencialmente sólo con las
sondas de ADNmc marcadas en las cadenas dobles, promovida por el
transductor de politiofeno catiónico unido electrostáticamente que
sirve también como contraión localizado para las cargas negativas de
los restos fosfato.
En una realización de la presente invención, el
sistema de detección de ácido nucleico novedoso puede usarse
también para distinguir polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en
muestras de ADN genómico humano no amplificado. En una realización
adicional, el sistema de detección de ácido nucleico novedoso puede
usarse para distinguir SNP asociados a enfermedad en muestras de
ADN genómico humano no amplificado. La alta especificidad y
sensibilidad de la detección potenciada por (FRET), combinado con
la capacidad del transductor de politiofeno de promover la
hibridación en condiciones por lo demás desfavorables, permite
distinguir los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) asociados
a enfermedad en muestras de ADN genómico humano no amplificado. La
Figura 4A muestra curvas de calibración obtenidas ensayando ADN
genómico humano normal (concretamente de tipo silvestre) con
secuencias de sonda complementarias del tipo silvestre (TAN 101:
5'-CCG GTG AGT ATC TGG-3') y con
secuencias mutadas (TAN 100: 5'-CCG GTG AAT
ATC TGG-3')^{21}. De forma similar, la Figura 4B
muestra curvas de calibración obtenidas ensayando ADN genómico
humano mutado (de pacientes enfermos) con secuencias de sonda
complementarias del tipo silvestre (TAN 101: 5'-CCG
GTG AGT ATC TGG-3'), y con secuencias mutadas (TAN
100: 5'-CCG GTG AAT ATC
TGG-3'). Se obtuvieron estos datos en
aproximadamente 5 minutos, ilustrando la facilidad y rapidez con
que el sistema de detección de ácido nucleico de la presente
invención permite distinguir al ADN de tipo silvestre
aproximadamente del ADN mutado. El sistema de detección de ácido
nucleico de la presente invención permite la detección de un
polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en un genoma completo, sin
amplificación ni enriquecimiento previos de la diana, y a niveles
de concentración similares a los conseguidos con oligonucleótidos de
20 unidades (Figura 2). Por ejemplo, aunque se diseñaron únicamente
oligonucleótidos de 15 unidades para sondear tirosinemia en el
genoma humano, es conocido que existen en la naturaleza numerosos
loci que presentan sólo un desapareamiento con estas sondas, sobre
todo en los extremos del gen. Sorprendentemente, no pudo detectarse
una señal de hibridación significativa usando estas secuencias diana
no específicas.
Se obtienen condiciones de hibridación muy
rigurosas llevando a cabo las reacciones de hibridación en agua
pura a 65ºC. En estas condiciones rigurosas, el transductor de
politiofeno catiónico localizado en la sonda de captura es el único
contraión disponible para neutralizar el esqueleto de fosfato de los
ácidos nucleicos, permitiendo así una excelente especificidad.
Estos rasgos sugieren una amplia aplicabilidad del sistema de
detección de ácido nucleico de la presente invención. En una
realización, el sistema de detección de ácido nucleico podría usarse
para detectar selectivamente secuencias de ácido nucleico en mezclas
complejas.
Se efectuaron experimentos similares a los
descritos en relación con la Figura 2 en un espectrofluorómetro
comercial (Varian Cay Eclipse). Se obtuvo también una detección
altamente sensible y selectiva de oligonicleótidos mc, como se
muestra en la Figura 5. En este caso, el límite de detección es de
aproximadamente 30 copias en 3 ml de agua pura a 55ºC.
Se ensayó también la aplicabilidad del método
para diversos tipos de material genético, concretamente productos
de PCR (amplicones) y ADN genómico humano. Aunque el método de la
presente invención se dirige a eliminar la necesidad de
amplificación por PCR, los productos de amplicón son una elección
obvia porque se usan ampliamente en la investigación
biotecnológica. Además, son también un modelo de ADN bicatenario y
sirven por tanto como un buen intermedio entre los oligonucleótidos
y el genoma humano completo. Para este estudio, se usó la sonda
X1+AF546 (véase la Figura 2) con amplicones de C. albicans y
C. dubliniensis.
Se obtuvo la Figura 6 usando el mismo
procedimiento que se describe anteriormente. Esta figura muestra que
el método de la presente invención puede distinguir fácilmente
amplicones perfectamente coincidentes de los que difieren en sólo
dos nucleótidos en un ADNbc de 150 nucleótidos de longitud. Este
alto grado de selectividad se obtuvo usando el proceso de
amplificación de señal intrínseca descrito anteriormente y
condiciones experimentales optimizadas (agua pura a 65ºC).
\newpage
Para ADN humano, y usando los mismos cálculos y
bases de datos que los descritos en la sección experimental, se
ensayó el método de la presente invención usando otra secuencia de
sonda, esta vez específica de la mutación E357X, que se reseña
también como causante de tirosinemia hereditaria [ref. 21 en el
texto]. Se diseñaron y sintetizaron específicamente nuevas sondas
específicas de la mutación E357X, concretamente, TAN 102a:
5'-/5Alex546N/AGGAGCCAGAAAACTTCG-3 y TAN
103a:'5'-/5Alex546N/AGGAGCCATAAAACTTCG-3 por IDT DNA
Technologies Inc. Para ensayar la aplicabilidad del método de la
presente invención a ADN genómico humano extraído usando diversas
técnicas de extracción, se eligió ADN genómico humano extraído
usando otro método ampliamente usado, a saber, el protocolo de
Promega.
La Figura 7 se obtuvo usando el mismo protocolo
experimental que se describe anteriormente. Las curvas obtenidas
con las sondas TAN102a y TAN103a específicas de la mutación E357X
son muy similares a las obtenidas para la mutación IVS12 (Figura
4). La mayor sensibilidad de detección en el presente caso es debida
al número aumentado de unidades cromofóricas poliméricas cuando se
trabaja con sondas más largas de 18 unidades (en comparación con
las sondas de 15 unidades usadas para la mutación IVS12). Este
ejemplo adicional de detección de SNP en ADN genómico humano no
amplificado completo confirma la capacidad del método de la presente
invención de detectar selectiva y específicamente unas pocas copias
de cadenas de ADN en presencia de una cantidad mucho más grande de
material de ADN no específico.
\vskip1.000000\baselineskip
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23. Publicación de solicitud de patente de
Estados Unidos nº US 2005/0003386 A1 (6 de enero de 2005) (Bazan
et al.)
24. Publicación de solicitud de patente de
Estados Unidos nº US 2004/0219556 A1 (4 de noviembre de 2004) (Bazan
et al.).
25. Publicación de solicitud de patente de
Estados Unidos nº US 2004/0142344 A1 (22 de julio de 2004) (Bazan
et al.).
26. Publicación de solicitud de patente de
Estados Unidos nº US 2004/0142206 A1 (22 de julio de 2004).
Claims (13)
1. Un sistema de detección de ácido nucleico que
comprende:
una sonda oligonucleotídica aniónica marcada con
un fluoróforo; y
un politiofeno catiónico crómico por afinidad
hidrosoluble que interacciona con dicha sonda formando una doble
cadena neutra;
en el que dicha doble cadena neutra exhibe
cambios en su espectro de absorción en presencia de un
polinucleótido diana.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un kit que comprende un recipiente o
recipientes que comprenden:
una sonda oligonucleotídica aniónica marcada con
un fluoróforo; y
un politiofeno catiónico crómico por afinidad
hidrosoluble que interacciona con dicha sonda formando una doble
cadena neutra;
en el que dicha doble cadena neutra exhibe
cambios en su espectro de absorción en presencia de un
polinucleótido diana.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un artículo de fabricación que comprende:
un vial que contiene una sonda oligonucleotídica
aniónica marcada con un fluoróforo y que contiene un politiofeno
catiónico crómico por afinidad que interacciona con dicha sonda
formando una doble cadena neutra, en el que dicha doble cadena
neutra exhibe cambios en su espectro de absorción en presencia de un
polinucleótido diana; o
envasados conjuntamente, un vial que contiene
una sonda oligonucleotídica aniónica marcada con un fluoróforo y un
vial que contiene un politiofeno catiónico crómico por afinidad que
interacciona con dicha sonda formando una doble cadena neutra, en el
que dicha doble cadena neutra exhibe cambios en su espectro de
absorción en presencia de un polinucleótido diana.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un método de medida de la presencia de un
polinucleótido diana que comprende:
proporcionar una sonda oligonucleotídica
aniónica marcada con un fluoróforo y un politiofeno catiónico
crómico por afinidad que interacciona con dicha sonda formando una
doble cadena neutra, en el que dicha doble cadena neutra exhibe
cambios en su espectro de absorción en presencia de un
polinucleótido diana;
poner en contacto un polinucleótido diana con
dicha doble cadena neutra; y
medir los cambios en el espectro de absorción de
dicha doble cadena neutra en presencia de dicho polinucleótido diana
para cuantificar o analizar la complementariedad de dicho
polinucleótido diana respecto a dicha sonda.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un ensayo basado en el método de la
reivindicación 4.
6. El sistema de detección de ácido nucleico
como se define en la reivindicación 1, en el que dicho
polinucleótido diana deriva del genoma humano, una fuente bacteriana
o una fuente vírica o es un amplicón.
7. El sistema de detección de ácido nucleico
como se define en la reivindicación 6, en el que dicho
polinucleótido diana se desnaturaliza antes de su uso en el
sistema.
8. El kit como se define en la reivindicación 2,
en el que dicho polinucleótido diana deriva del genoma humano, una
fuente bacteriana o una fuente vírica o es un amplicón.
9. El kit como se define en la reivindicación 8,
en el que dicho polinucleótido diana se desnaturaliza antes de su
uso en el sistema.
10. El artículo de fabricación como se define en
la reivindicación 3, en el que dicho polinucleótido diana deriva del
genoma humano, una fuente bacteriana o una fuente vírica o es un
amplicón.
11. El artículo de fabricación como se define en
la reivindicación 10, en el que dicho polinucleótido diana se
desnaturaliza antes de su uso en el sistema.
12. El método como se define en la
reivindicación 4, en el que dicho polinucleótido diana deriva del
genoma humano, una fuente bacteriana o una fuente vírica o es un
amplicón.
13. El método como se define en la
reivindicación 12, en el que dicho polinucleótido diana se
desnaturaliza antes de su uso en el sistema.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US65771705P | 2005-03-03 | 2005-03-03 | |
| US657717P | 2005-03-03 |
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Family Applications (1)
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