ES2341796T3 - Metodo para determinar la capacidad de respuesta a los inhibidores de chk1. - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar si un inhibidor de CHK-1 está inhibiendo su diana molecular CHK-1, comprendiendo el método: (a) determinar la presencia de una molécula de CHK-1 fosforilada en una primera muestra a partir de un paciente de ensayo con cáncer que ha recibido un agente dañino del ADN, y (b) determinar la presencia de una CHK-1 fosforilada en una segunda muestra a partir del paciente de ensayo con cáncer que ha recibido un agente dañino del ADN y un inhibidor de CHK-1, en el que un incremento en la cantidad de CHK-1 fosforilada en la segunda muestra comparado con la primera muestra es indicativo de que el inhibidor de CHK-1 está inhibiendo su diana molecular CHK-1.
Description
Método para determinar la capacidad de respuesta
a los inhibidores de CHK1.
La presente invención se refiere al uso de un
biomarcador como indicador de la actividad de un agente terapéutico
dentro de un paciente de ensayo con cáncer. El biomarcador de la
presente invención puede usarse, por ejemplo, para determinar
cuándo administrar un agente terapéutico o seleccionar una dosis
terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico para un
paciente.
La quimioterapia y la exposición a la radiación
son actualmente las principales opciones para el tratamiento del
cáncer, pero la utilidad de estos dos enfoques está seriamente
limitada por los drásticos efectos adversos que tienen sobre los
tejidos normales y por el frecuente desarrollo de la resistencia de
las células tumorales. Por lo tanto, es bastante deseable mejorar
la eficacia de dichos tratamientos de un modo que no incremente la
toxicidad asociada a estos. Un modo para lograr esto es mediante el
uso de agentes potenciadores específicos. Típicamente, estos
agentes se diseñan para usarse en combinación con los agentes que ya
existen o nuevos.
Una célula individual se replica haciendo una
copia exacta de sus cromosomas y segregando a estos después en
células separadas. Este ciclo de replicación del ADN, separación y
división de cromosomas está regulado por mecanismos presentes en la
célula que mantienen el orden de las etapas y garantizan que cada
etapa se lleve a cabo de manera precisa. La clave de estos procesos
son los puntos de control del ciclo celular (Hartwell et
al., Science, (1989)
246(4930):629-34) donde las células pueden
parar para asegurarse de que los mecanismos de reparación del ADN
tienen tiempo para funcionar antes de continuar a través del ciclo
en la mitosis. Hay tres de dichos puntos de control en el ciclo
celular - el punto de control G1/S que está regulado por p53, la
fase S y el punto de control G2/M que se controla mediante el punto
de control cinasa 1 (CHK1) de Ser/Thr cinasa.
El CHK1 se activa a través de la fosforilación
de Ser 317 y/o Ser 345 por ataxia-xelangiectasia
(ATR) y/o ataxia-xelangiectasia mutada (ATM)
después de daño al ADN inducido tanto por quimioterapia o
radioterapia (Zhao, H. et al., (2001) Molecular Cell
Biology 21, 7239-7249). El CHK1, a su
vez, fosforila numerosos sustratos incluyendo cdc25A, cdc25C, y TLK
(desordenados como la cinasa). La fosforilación de cdc25A y cdc25C
por CHK1 conduce a su inactivación a través de la degradación y
relocalización, respectivamente. La inactivación de cdc25A y cdc25C
conduce entonces a la parada del ciclo celular en las fases S y G2
del ciclo celular, respectivamente. Además de la parada del ciclo
celular que media CHK1 después del daño al ADN, han surgido nuevos
resultados en la bibliografía de que CHK1 está implicado en los
procesos de reparación del ADN también (Sengupta et al.,
Journal de Cell Biology, 166,
6:801-813, 2004). Además, los resultados también han
sugerido una supuesta función de CHK1 en la división celular.
Específicamente, CHK1 parece tener una función en la regulación de
la entrada en mitosis previniendo la activación prematura de
ciclina B-Cdk1 a través de la regulación de cdc25B
(Kramer et al., Nature Cell Biology, 6; 9;
884-891, 2004) y en la regulación de la iniciación
de la replicación.
Como la parada del ciclo celular inducida por
estos puntos de control es un mecanismo crucial por el cual las
células pueden superar el daño procedente de la radio- o
quimio-terapia, su anulación por nuevos agentes
debería incrementar la sensibilidad de las células tumorales
respecto a las terapias que dañan el ADN. Además, la anulación
específica en tumores del punto de control G1/S por mutaciones en
p53 en la mayoría de los tumores puede explotarse para proporcionar
agentes selectivos de tumores. Un método para diseñar los
quimiosensibilizantes que anulen el punto de control G2/M es
desarrollar inhibidores de la quinasa reguladora clave de G2/M CHK1
y se ha mostrado que este método funciona en varios estudios de
prueba de concepto. (Koniaras et al., Oncogene, 2001,
20:7453; Luo et al., Neoplasia, 2001,
3:411; Busby et al., Cancer Res., 2000,
60:2108; Jackson et al., Cancer Res., 2000,
60:566).
Un biomarcador es una característica que es
medida objetivamente y evaluada como un indicador de los procesos
biológicos normales, procesos patógenos o respuestas farmacológicas
frente a una intervención terapéutica (Atkinson et al,
Clin. Pharmacol. Ther., 69: 89-95
(2001)). Se piensa que el desarrollo de nuevos biomarcadores
contrastados conducirá tanto a reducciones significativas en el
cuidado de la salud como en los gastos de desarrollo de fármacos e
implicará mejoras en el tratamiento para una amplia variedad de
enfermedades y afecciones.
Para diseñar óptimamente ensayos clínicos y
obtener el máximo de información de estos ensayos, se requiere un
biomarcador. El marcador tiene que medirse en tejidos experimentales
y tumorales y debe correlacionarse con la inhibición de la ruta.
Además, el biomarcador debe mostrar activación de la ruta corriente
arriba y la inactivación de la ruta corriente abajo. Idealmente,
estos marcadores también se correlacionarán con eficacia y por eso
podrán usarse en última instancia para la selección de
pacientes.
La presente invención está basada, en parte, en
métodos que pueden usarse para determinar la respuesta de un
paciente frente a un inhibidor de CHK1, que incluyen determinar si
se administra un inhibidor de CHK1, cuándo se administraría un
inhibidor de CHK1 y determinar una dosis terapéuticamente eficaz de
un inhibidor de CHK1. Específicamente, los métodos de la presente
invención incluyen la determinación de una o más moléculas de
transducción de señal de CHK1 activadas tales como CHK1 fosforilada.
La presencia de una molécula de transducción de señal de CHK1
activada indica que debería administrarse un inhibidor de CHK1. En
otro método de la invención, el método incluye la determinación de
la presencia de H2AX fosforilado como un indicador de si se ha
administrado a un paciente una dosis apropiada de un inhibidor de
CHK1.
Los biomarcadores de la presente invención
pueden usarse en el tratamiento o la profiláxis de enfermedades
neoplásicas tales como cáncer cervical, cáncer de cabeza y cuello,
carcinoma de mama, ovario, pulmón (células no pequeñas), páncreas,
esofágico, gástrico, intestino delgado, hepático, colon, próstata u
otros tejidos, así como leucemias y linfomas, incluyendo leucemia
linfocítica crónica, tumores del sistema nervioso central y
periférico y otros tipos de tumores tales como melanoma y sarcomas
incluyendo fibrosarcoma, mesotelioma y osteosarcoma y tumores
endocrinos tales como tumores de células de islote y tumores
tiroides.
De acuerdo con esto, la invención proporciona un
método de acuerdo con las reivindicaciones.
La muestra de la invención puede ser cualquier
muestra apropiada tal como una muestra del tumor, sangre periférica,
un raspado celular, un folículo piloso, una punción cutánea o
bucal.
La molécula de la ruta de transducción de señal
de CHK1 activada puede estar CHK1 fosforilada o H2AX fosforilada.
La CHK1 fosforilada puede administrarse mediante un anticuerpo de
CHK1, por ejemplo, un anticuerpo fosfoespecífico.
La Fig. 1 representa un diagrama de bloques que
muestra que la gemcitabina (Gem) aparece en la fosforilación de
CHK1.
Las Figs. 2A-B representan un
diagrama de bloques que muestra la fosforilación de CHK1 después del
tratamiento de combinación de gemcitabina (Gem) y el inhibidor de
CHK y la gemcitabina sola.
La Fig. 3 representa un diagrama de bloques que
muestra la fosforilación de CHK1 de secciones tumorales de ratón
con Xenoinjerto H460 después del tratamiento con gemcitabina (Gem),
inhibidor de Chk (Chki) y una combinación de ambos.
La Fig. 4 representa un diagrama de bloques que
muestra la cuantificación de la fosforilación de CHK1 en folículos
pilosos de biopsias de piel de ratón - después del tratamiento con
gemcitabina (Gem), inhibidor de Chk (Chki) y una combinación de
ambos.
La Fig. 5 representa un diagrama de bloques que
muestra la cuantificación de 53BP1 en células Hela con diferentes
cantidades de hidrocloruro de doxorubicina (Dox) y un inhibidor de
CHK1 (Chki).
La Fig. 6 representa un diagrama de bloques que
muestra la cuantificación de fosfo-H2AX de células
SW620 tratadas con gemcitabina (Gem) y un inhibidor de CHK
(Chki).
La Fig. 7 representa un diagrama de bloques que
muestra el % de células positivas de fosfo-H2AX
cuando las células se tratan con cantidades variables de
gemcitabina (Gem) y un inhibidor de CHK (Chki).
La Fig. 8 representa un diagrama de bloques que
muestra el % de células positivas de fosfo-H2AX
cuando las células se tratan con la combinación de hidrocloruro de
doxorubicina (dox) y un inhibidor de CHK.
La presente invención proporciona biomarcadores
para predecir la respuesta de un paciente frente a un inhibidor de
CHK1. Pueden usarse los biomarcadores predictivos para indicar, por
ejemplo, cuándo administrar un inhibidor de CHK1 o determinar la
cantidad de un inhibidor de CHK1 que puede usarse para tratar con
eficacia a un paciente con cáncer.
La presente aplicación describe un número de
diferentes biomarcadores que pueden usarse para predecir la
respuesta de pacientes frente a un inhibidor de CHK1. Los
biomarcadores de la invención incluyen moléculas de transducción de
señal de CHK1 activadas. Una molécula de transducción de señal de
CHK1 activada es cualquier molécula que esté directamente o
indirectamente modificada, por ejemplo activada o desactivada, como
resultado de la activación de CHK1. Por ejemplo, una molécula de
transducción de señal de CHK1 activada puede ser CHK1 fosforilada.
Otras moléculas que sirven como molécula de transducción de señal
de CHK1 activada incluyen TLK1/2 fosforilada, CDC25, ciclina B,
Aurora B o fosfohistona H3. Además, una molécula de la ruta de
transducción de señal de CHK1 incluye una molécula que se active
por ATR o ATM tal como H2AX.
En un ejemplo, el biomarcador es H2AX. La
presencia de H2AX fosforilado (también conocido como H2AX gamma)
después de la administración de tanto un agente dañino del ADN y un
inhibidor de CHK comparado con un control (una muestra tomada del
paciente antes de la administración de CHK1 y un agente dañino del
ADN o antes de la administración de un agente dañino del ADN) es
indicativa de que se ha administrado una dosis apropiada de un
inhibidor de CHK1.
La presente invención proporciona un número de
biomarcadores que pueden usarse para predecir la respuesta de un
paciente frente a un inhibidor de CHK1. Un método ilustrativo para
detectar la presencia de un biomarcador incluye obtener una muestra
de tejido tumoral o experimental de un sujeto de ensayo en ausencia
de tratamiento con un agente dañino del ADN o agente inductor del
estrés celular y determinar la presencia del biomarcador. En otro
método ilustrativo, el método para detectar la presencia de un
biomarcador incluye obtener una muestra de tejido tumoral o
experimental de un sujeto de ensayo que ha recibido un agente dañino
del ADN y determinar la presencia del biomarcador.
Típicamente, se administra un agente dañino del
ADN a un paciente de ensayo con cáncer. Un agente dañino del ADN es
un agente extremadamente tóxico inductor, por ejemplo, de la ruptura
del ADN de doble cadena. Sin ajustarse a ninguna teoría particular,
se piensa que una vez ha sido administrada una cantidad suficiente
de un agente dañino del ADN a un paciente con cáncer, las células
reaccionan activando las rutas de respuesta de daño del ADN
incluyendo la activación de los puntos de control del ciclo celular.
Se piensa que la cinasa del punto de control del ciclo celular,
CHK1, para las células permitiendo así reparar el ADN y su
inhibición conduce a que las células tumorales se sensibilicen
frente a los agentes cancerígenos.
Los agentes dañinos del ADN que pueden usarse en
la presente invención incluyen cualquier agente dañino del ADN
apropiado. Los ejemplos de agentes dañinos del ADN incluyen agentes
alquilantes tales como ciclofosfamida; otros agentes que producen
roturas del ADN mono o bicatenario tales como agentes platinizantes,
incluyendo cisplatino, carboplatino y oxaliplatino;
anti-metabolitos tales
5-fluorouracilo, fludarabina y gemcitabina;
inhibidores de topoisomerasa I o III tales como doxorubicina,
etoposido y topotecano; y agentes inductores del estrés tales como
anticuerpos frente a proteínas de la superficie celular tales como
rituximab, cetuximab o trastuzumab, agentes radiomiméticos tales
como bleomicina y radiación gamma.
Puede usarse cualquier muestra apropiada para
determinar la presencia de un biomarcador de la invención. En un
ejemplo, la muestra es una muestra de tejido experimental, por
ejemplo, la muestra puede ser una muestra de sangre periférica,
saliva, un raspado celular, bucal, folículo piloso, punción cutánea
o esputo.
De forma alternativa, pueden tomarse muestras
tumorales de cualquier paciente que reciba a un agente dañino del
ADN. Por ejemplo, el tumor puede ser un tumor no sólido tal como
leucemia, mieloma múltiple o linfoma, o puede ser un tumor sólido,
por ejemplo tumores del conducto bilial, óseo, de vejiga,
cerebro/SNC, mama, ovario, intestino delgado, colorectal, cervical,
endométrico, gástrico, de cabeza y cuello, hepático, de pulmón,
músculo, neuronal, esofágico, de ovario, pancreático, membranas
pleural/peritoneal, próstata, renal, de piel, testicular, de
tiroides, uterino, tumores vulvales y otros tipos de tumores tales
como melanoma y sarcomas incluyendo fibrosarcoma, mesotelioma y
osteosarcoma, y tumores endocrinos tales como tumores de células de
islote y tumores de tiroides.
En un ejemplo, el método incluye determinar a
partir de una muestra de un paciente de ensayo la presencia de una
molécula de la ruta de transducción de señal CHK1 activada. En otro
ejemplo, el método incluye determinar a partir de una muestra de un
paciente de ensayo que se está tratando con un agente dañino del ADN
la presencia de una molécula de la ruta de transducción de señal
CHK1 activada. Se determina la presencia de una molécula de la ruta
de transducción de señal CHK1 activada tal como CHK1 fosforilada o
H2AX fosforilada.
Los solicitantes han determinado que después de
la administración de un inhibidor de CHK1 es posible predecir si un
inhibidor de CHK1 está inhibiendo su diana molecular. El método
incluye tomar una segunda muestra del paciente de ensayo que ha
recibido un inhibidor de CHK1 y determinar la CHK1 fosforilada.
Típicamente, la muestra se toma de 4 a 24 horas después de la
administración del inhibidor de CHK1. Los pacientes que han
recibido una dosis terapéuticamente eficaz de un inhibidor de CHK1
tendrán una cantidad mayor (por ejemplo, al menos de dos veces) de
CHK1 fosforilado durante un periodo de tiempo más largo, por
ejemplo, en un periodo de 24 horas, comparado con la cantidad de
CHK1 fosforilada determinada a partir de la primera muestra. Sin
vincularse a ninguna teoría, los solicitantes piensan que la mayor
cantidad de CHK1 fosforilada después de la administración de un
inhibidor de CHK1 es porque después de la inhibición de moléculas
corriente abajo de CHK, las células tienden a compensar aumentando
la activación de moléculas corriente arriba de CHK1.
\newpage
La determinación de la presencia de una molécula
de la ruta de transducción de señal CHK1 activada de la invención
puede realizarse usando cualquier método conocido en la técnica. Por
ejemplo, puede visualizarse CHK1 fosforilado o H2AX fosforilado
haciendo reaccionar las proteínas con anticuerpos tales como
anticuerpos monoclonales dirigidos contra los aminoácidos serina
fosforilada, treonina o tirosina que están presentes en las
proteínas. Por ejemplo, se describen anticuerpos monoclonales
útiles para aislar e identificar proteínas que contienen
fosfotirosina en la patente de EE.UU. Nº. 4.543.439.
Los procedimientos y reactivos requeridos para
determinar una proteína CHK1 activada pueden realizarse fácilmente
por cualquier experto en la técnica. Un agente de interés que puede
usarse para detectar una molécula de transducción de señal de CHK1
activada incluye cualquier molécula tal como un peptidomimético,
proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, un anticuerpo
u otro fármaco candidato, que pueda unirse a la proteína. En un
ejemplo, pueden usarse anticuerpos que estén comercialmente
disponibles para detectar una molécula de transducción de señal de
CHK1 activada. Por ejemplo, anticuerpos contra CHK1 fosforilado y
CDC2 están disponibles en Cell Signaling (Beverly, MA), anticuerpos
contra CDC25A Ab-3 fosforilado están disponibles en
Lab-vision (Fremont, CA); anticuerpos contra Aurora
B están disponibles en Abeam (Cambridge, MA); anticuerpos contra
H2AX fosforilado están disponibles en Upstate Biotechnology
(Upstate, NY).
Típicamente, pueden marcarse anticuerpos usados
para visualizar la molécula de transducción de señal de CHK1
activada mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica,
por ejemplo, usando una molécula indicadora. Una molécula
indicadora, según se usa en este documento, es una molécula que
proporciona una señal analíticamente identificable permitiendo que
cualquier experto en la técnica identifique cuándo se ha unido un
anticuerpo a una proteína que se dirige contra éste. La detección
puede ser tanto cualitativa como cuantitativa. Las moléculas
indicadoras comúnmente usadas incluyen fluoróforos, enzimas,
biotina, moléculas quimioluminiscentes, moléculas bioluminiscentes,
digoxigenina, avidina, estreptavidina o radioisótopos. Las enzimas
comúnmente usadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa
alcalina, glucosa oxidasa y beta-galactosidasa,
entre otras. Los sustratos que se usan con estas enzimas se eligen
generalmente para la producción, bajo hidrólisis por la enzima
correspondiente, de un cambio de color detectable. Por ejemplo, el
fosfato de p-nitrofenilo es adecuado para el uso
con moléculas indicadoras de fosfatasa alcalina; se usan comúnmente
para peroxidasa de rábano picante,
1,2-fenilendiamina, ácido
5-aminosalicílico o toluidina. La incorporación de
una molécula indicadora sobre un anticuerpo puede ser por cualquier
método conocido por el experto en la técnica.
Después de la separación y visualización de las
proteínas, la cantidad de cada tipo de proteína puede evaluarse
mediante procedimientos fácilmente disponibles. Por ejemplo,
mediante el uso del análisis por transferencia Western que incluye
separar electroforéticamente proteínas sobre un gel de
poliacrilamida y después detectar las proteínas separadas, puede
cuantificarse la cantidad relativa de cada proteína evaluando su
densidad óptica. De forma alternativa, pueden usarse otros métodos
tales como FACS, inmunohistoquímica, ELISA, etc...
En los métodos de la invención, pueden
detectarse una o más de las moléculas de la ruta de transducción de
señal de CHK1 activada. Por ejemplo, puede montarse un sistema de
ensayo que pueda detectar la presencia de múltiples moléculas de la
ruta de transducción de señal de CHK1 activada.
El método de la presente invención también
incluye identificar la presencia de H2AX fosforilado (también
conocido como H2AX gamma) después de la administración de tanto un
agente dañino del ADN como un inhibidor de CHK1 a un paciente de
ensayo con cáncer. En la elección del agente dañino del ADN, debe
haberse determinado previamente la capacidad de que el agente
dañino del ADN fosforile H2AX en presencia o ausencia de un
inhibidor de CHK1. En un ejemplo, el método de la invención usa un
agente dañino del ADN que, si se administra solo sin CHK1, da como
resultado un modesto incremento o ningún incremento en la
fosforilación de H2AX. Los ejemplos de dichos agentes dañinos del
ADN incluyen Gemcitabina y dox. En este ejemplo, la combinación del
inhibidor de Chk 1 y del agente dañino del ADN produce un gran
incremento, por ejemplo, una respuesta sinérgica, en la
fosforilación de H2AX. De acuerdo con el método de la invención, un
incremento en presencia de H2AX fosforilado comparado con un
control (el control puede ser una muestra tomada del paciente antes
de la administración de un agente dañino del ADN y del inhibidor de
CHK1) indica que el inhibidor de CHK1 se ha administrado a una dosis
terapéuticamente eficaz.
Puede detectarse H2AX fosforilado usando
cualquier agente tal como un peptidomimético, una proteína, un
péptido, un ácido nucleico, una molécula pequeña, un anticuerpo u
otro fármaco candidato, que pueda unirse a la proteína. Los
anticuerpos que se unen al H2AX fosforilado son conocidos en la
técnica, por ejemplo, anticuerpos contra H2AX fosforilado están
disponibles en Upstate Biotechnology (Upstate, NY).
Se conocen inhibidores de CHK1 en la técnica,
por ejemplo, el inhibidor de CHK1 puede incluir, por ejemplo, un
péptido, un anticuerpo, una molécula antisentido o una molécula
pequeña. Los inhibidores de CHK1 útiles en la presente invención
incluyen, sin limitación, los descritos o reivindicados en las
siguientes publicaciones, cuyas descripciones totales se incorporan
como referencia en este documento. Ejemplos de inhibidores de
molécula pequeña de CHK1 incluyen compuestos de
2-ureidotiofeno, que se describen en el documento
WO03029241, compuestos de 3-ureidotiofeno, que se
describen en el documento WO03028731 y el inhibidor de Chkl XL844
(Exilixis, CA). Otros inhibidores de CHK1 se describen en los
documentos PCT/GB2004/005400, US 20050256157, US 20050245563, US
20050245525, WO 2002070494, US 20040014765 y US 2003199511. Se
describen oligonucleótidos de CHK1 antisentido en el documento WO
200157206 y la patente de EE.UU. 6.211.164. Se describen ácido
nucleico de CHK1 interferente (siNA) y ARN interferente corto
(siRNA) en el documento de EE.UU. 20050196765.
Brevemente, se pusieron en placas 3 X 10^{6}
células SW620 y/o HT29 en platos de cultivo de tejidos de 10 cm y
se dejaron adherirse durante 24 horas a 37ºC. Las células se
trataron entonces con una titulación de agentes dañinos del ADN
(SN-38 (CQ International, China), doxorubicina
(Sigma-Aldrich, MO) o gemcitabina (CQ
International, China)). La células se recogieron luego después de
una incubación de 8 horas con agentes dañinos del ADN en tampón de
lisis Onyx con proteasa e inhibidores de fosfatasa (Tris 20 mM, NaCl
137 mM, EGTA 1 mM, Triton X al 1%, glicerol al 10%, MgCl2 1,5 mM,
dilución 1:100 del grupo II de cóctel de inhibidor de Calbiochem
Fofatasa, \beta-glicerofosfato 10 mM, DTT 1 mM,
PMSF a 7 \mug/ml, 20 KUI/ml de aprotinina, Pefabloc 1 mM,
leupeptina a 0,1 mg/ml). Fueron generados entonces lisados
proteicos, se determinó la concentración de proteína y se cargó
igual proteína y se analizó mediante análisis de transferencia
Western usando una dilución 1:100 de anticuerpo monoclonal de
conejo fosfo-CHK (Ser 345) (133D3) adquirido en Cell
Signaling (Beverly, MA). El análisis de transferencia Western
mostró una sobre-regulación dependiente de la dosis
de fosfo-CHK después del daño al ADN. Para
caracterizar a continuación la activación de CHK1, se trataron
células SW620 y HT29 con gemcitabina (100 nM) o SN38 (100 nM) y las
células se recogieron a diferentes tiempos (de 30 minutos a 24
horas). El análisis de transferencia Western mostró una activación
dependiente del tiempo de fosfo-CHK con una
activación máxima entre las 4 y 8 horas. Se examinó entonces un
panel de líneas celulares tumorales para determinar cómo de ancho
se activaba en CHK de células tumorales y si el estado de p53
impactaba en la activación de CHK. El panel de líneas celulares se
colocó en placas y se trató durante 8 horas con 100 nM de
gemcitabina. Se recogieron lisados celulares y se evaluó la
sobre-regulación de fosfo-CHK. El
análisis de transferencia Western mostró que
fosfo-CHK se sobre-regula en un
panel de líneas celulares tumorales, aunque a diferentes
niveles.
También se examinó la regulación de
fosfo-CHK mediante inmunohistoquímica (IHC).
Brevemente, se pusieron en placas células HeLa o A549 sobre
portaobjetos y se dejó que se adhirieran durante 24 horas a 37ºC.
Las células entonces se trataron durante 5 horas con 100 nM de
gemcitabina. Las células se fijaron con PFA al 4% en PBS (8 minutos
a temperatura ambiente), se permeabilizaron con
Triton-X al 0,5% en PBS, se lavaron con PBS y se
lavaron con Tween 20 al 0,05% en PBS. Las células se bloquearon
entonces con suero de cabra al 10% durante 1 hora a temperatura
ambiente, se incubaron con una dilución 1:50 de anticuerpo
monoclonal de conejo fosfo-CHK (Ser 345) (133D3)
adquirido en Cell Signaling (Beverly, MA) en suero de cabra al 10%
durante 90 minutos, se lavaron dos veces con PBS y una vez con
Tween 20 al 0,5% en PBS. Las células se incubaron entonces durante
60 minutos con dilución 1:300 de IgG anti-conejo de
Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, OR) en suero de cabra al 10%, se
lavaron dos veces con PBS, se tiñeron los núcleos con solución de
Hoescht (2/\mug/ml) durante 5 minutos y las células se aclararon
con PBS. La tinción de fosfo-CHK se cuantificó
entonces usando el análisis Metamorph (Universal Imaging Corp,
Dowington, PA). Se midió el área de la señal de
fosfo-CHK respecto al área nuclear como se muestra
en la Fig. 1. Se obtuvieron resultados similares usando medidas de
intensidad. Los resultados muestran un gran incremento en
fosfo-CHK después del tratamiento con
gemcitabina.
Se inyectaron 1 X 10^{7} células H460 que
expresaban p53 negativo dominante en el flanco derecho de ratas
desnudas macho que habían sido irradiadas con radiación 5 Gy 6 días
antes de la implantación. El día 20, cuando los tumores alcanzaban
un tamaño de 8 gramos, a los animales se les administró IV 20 mg/kg
de gemcitabina en solución salina al 0,9%. Los tumores se
recogieron entonces en puntos de tiempo variables incluyendo 1,5,
2, 2,5, 4, 6, 8 y 24 horas después de la administración de
gemcitabina. Una sección del tumor se homogenizó entonces en tampón
de lisis Swedish (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, sustitución de
NP-40 al 1%, y vanadato de sodio 1 mM con
inhibidores de proteasa como se recomienda (Roche Applied Science,
IN) e inhibidores de fosfatasa I y II como se recomienda
(Sigma-Aldrich, MO). Se generaron entonces lisados
proteicos, se determinó la concentración de proteína y se cargó
igual proteína y se analizó por análisis de transferencia Western
usando un anticuerpo monoclonal de conejo fosfo-CHK
(Ser 345) (133D3) adquirido en Cell Signaling (Beverly, MA). El
análisis de transferencia Western mostró la activación de CHK a las
2 horas con una activación máxima a las 8 horas. A las 24 horas, se
des- regula fosfo-CHK significativamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Brevemente, se pusieron en placas 3 X 10^{6}
de SW620 en platos de cultivo de tejidos de 10 cm y se dejaron
adherirse durante 24 horas a 37ºC. Las células se trataron entonces
con gemcitabina 100 nM o 30 nM, inhibidor de CHK 100 nM o 500 nM o
una combinación de gemcitabina 100 nM y 30 nM, 100 nM o 500 nM
durante 8 horas. Se recogió entonces un grupo de células para el
análisis de transferencia Western. Los compuestos que contenían
medio se eliminaron de las células restantes y se añadió de nuevo
medio de cultivo de tejidos. Las células se recogieron entonces 22
horas más tarde, se generaron lisados proteicos como se describe
antes y se analizaron por análisis de transferencia Western usando
el anticuerpo fosfo-CHK. El análisis de
transferencia Western mostró un incremento en
fosfo-CHK después del tratamiento con gemcitabina
sola y un incremento dependiente de la dosis respecto a la
gemcitabina sola en fosfo-CHK después del
tratamiento de combinación. No se observó ningún incremento en
fosfo-CHK después del tratamiento de células con el
inhibidor de CHK solo.
También se examinó la regulación de
fosfo-CHK por IHC como se describe antes en el
Ejemplo 1 usando células HeLa y A549. Las Fig. 2A y 2B muestran un
incremento mayor en fosfo-CHK después del
tratamiento de combinación de gemcitabina e inhibidor de CHK según
se compara con la gemcitabina sola.
Se inyectaron 3 X 10^{6} células H460 que
expresaban p53 negativo dominante en el flanco derecho de ratones
desnudos macho. El día 25, cuando los tumores alcanzaron un tamaño
de 0,6-0,8 gramos, a los animales se les administró
IV con gemcitabina (30 ó 60 mg/kg), inhibidor de Chk (5, 20 ó 40
mg/kg) o la combinación. Siete horas más tarde, los tumores se
retiraron después, se fijaron y se tiñeron para CHK1 fosforilado
(Cell Signalling 2345)-DAB con contratinción de
verde de metilo. Las secciones se cuantificaron entonces mediante
análisis del valor H. El valor H se calcula puntuando la intensidad
de las células (0, 1, 2 ó 3) y multiplicando por el valor que
representa el número de células positivas (0, 1
(1-25%), 2 (26-50%), 3
(51-75%) y 4 (76-100%). El análisis
mostrado en la Figura 3 mostró un incremento en la tinción de
fosfo-Chk como se compara con cualquier agente
solo. Los estudios de combinación similares se completaron con
irinotecano e inhibidor de Chk. De nuevo, los datos mostraron un
incremento en la tinción de fosfo-Chk como se
compara con cualquier agente solo (datos no mostrados).
Se administró IV gemcitabina (30 ó 60 mg/kg) a
ratones desnudos, inhibidor de Chk (5, 20 ó 40 mg/kg) o la
combinación según la sección anterior. Siete horas más tarde, se
recogieron después biopsias de la piel que contenían folículos
pilosos, se fijaron y tiñeron para CHK1 fosforilado (Cell Signalling
2345)-DAB con contratinción de verde de metilo. Los
resultados mostraron tinción positiva (marrón) en células basales de
folículo piloso en ratones tratados. La tinción era específica a
los núcleos celulares. Ocurrió una tinción rara u ocasional en los
grupos tratados con inhibidor de Chk. No se observó ninguna tinción
en los grupos tratados con gemcitabina. Las secciones se
cuantificaron entonces por análisis del valor H. El valor H se
calcula puntuando la intensidad de las células (0, 1, 2 ó 3) y
multiplicando por el valor que representa el número de células
positivas (0, 1 (1-25%), 2
(26-50%), 3 (51-75%) y 4
(76-100%). Los análisis mostrados en la Figura 4
muestran que la tinción de los folículos pilosos se incrementa
ampliamente en los grupos de combinación comparado con los otros
grupos de tratamiento. Además se observó una respuesta frente a la
dosis del inhibidor de Chk con los incrementos mayores alcanzados a
dosis eficaces.
Se completaron estudios de combinación similares
con irinotecano e inhibidor de Chk. De nuevo, los datos mostraron
un incremento en la tinción de fosfo-Chk según se
compara con cualquier otro agente solo (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Se pusieron en placas células HeLa sobre
portaobjetos y se dejó que se adhirieran durante 24 horas a 37ºC.
Las células se trataron entonces durante 5 horas con
Adriamycin^{TM} 100 nM e inhibidor de CHK 500 nM. Las células se
trataron entonces como se describe en el Ejemplo 1. El anticuerpo
primario usado para los estudios fue una dilución 1:120 de
anti-53BP1 policlonal de conejo (Novus, CO) y el
anticuerpo secundario fue una dilución 1:300 de IgG
anti-conejo de Alexa Fluor 488 (Molecular Probes,
OR). Los focos se cuantificaron midiendo la intensidad fluorescente
por número de núcleos (determinado mediante tinción de Hoescht)
usando análisis Metaphorph. La Figura 5 muestra una disminución en
la intensidad fluorescente cuando el inhibidor de CHK se combina con
hidrocloruro de Doxorubicina (Adriamycim^{TM}).
\vskip1.000000\baselineskip
Brevemente, se pusieron en placas 3 X 10^{6}
células SW620 y/o A549 en platos de cultivo de tejidos de 10 cm y
se dejó que se adherieran durante 24 horas a 37ºC. Las células
entonces se trataron con vehículo, gemcitabina 100 nM, o
gemcitabina 100 nM e inhibidor de CHK 500 nM. Las células entonces
se recogieron después de una incubación de 5 horas directamente en
tampón de muestra SDS (NuPAGE Nº. NP007). Las muestras entonces se
sonicaron, se pasaron a través de una aguja del calibre 21, se
calentaron a 100ºC durante 5 minutos, se microcentrifugaron y
analizaron mediante análisis de transferencia Western. Se generaron
entonces lisados proteicos, se determinó la concentración de
proteína y se cargo igual proteína y se analizó mediante análisis de
transferencia Western usando una dilución 1:5000 de un H2AX Serina
139 anti-fosfo monoclonal de ratón (Upstate, NY).
Los datos mostraron un gran incremento en
fosfo-H2AX cuando las células se trataron en
combinación con gemcitabina e inhibidor de CHK y no hubo ningún
cambio o hubo un cambio muy modesto cuando cualquier compuesto se
usó solo.
También se examinó fosfo-H2AX
mediante un ensayo ELISA cuantitativo. Brevemente, se pusieron en
placas 3 X 10^{6} SW620 en platos de cultivo de tejidos de 10 cm
y se dejó que se adhirieran durante 24 horas a 37ºC. Las células
entonces se trataron con vehículo, gemcitabina 100 nM, inhibidor de
Chk 30, 50, 100 y 500 nM o la combinación de gemcitabina y todas
las concentraciones del inhibidor de Chk durante 7 horas y entonces
se recuperaron en tampón de lisis (Tris HCl 20 mM, base Tris 28 mM,
LDS al 0,4%, Glicerol al 2%, EDTA 0,10 mM) que contenía inhibidores
de fosfatasa (Calbiochem Nº. Cat. 534625, CA).
Se determinaron las concentraciones de proteína
y los niveles de p-H2AX se cuantificaron mediante
ensayo ELISA usando anticuerpo de H2AX total (Novus Biologicals,
Nº. Cat. NB100-383, CO) para capturar el H2AX total
y el anticuerpo anti-fosfo-histona
H2AX Eu-marcado de LANCE (Ser 139) (Upstate, Nº.
Cat. 05-636, NY) para detectar al H2AX fosforilado.
Como se muestra en la Figura 6, se observó un gran incremento en
fosfo-H2AX en el tratamiento de combinación.
También se examinó fosfo-H2AX
mediante IHC como se describe antes en el Ejemplo 1 excepto con los
siguientes cambios. Se pusieron en placas células HeLa o A549 en
placas de 96 pocillos y se trataron con gemcitabina 100 nM o sin
ésta y concentraciones crecientes de inhibidor de CHK (de 0 a 1
\muM) durante 5 horas antes de la fijación y tinción. Se incubó
sobre células fijadas una dilución 1:400 de una H2AX Serina 139
anti-fosfo monoclonal de ratón (Upstate, NY)
seguido de una dilución 1:300 de IgG anti-ratón de
Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, OR). Se realizó la
cuantificación usando algoritmos de Cellomics Cell Health y se
presentó como % de células positivas de fosfo-H2AX.
La Fig. 7 muestra la cuantificación que demuestra un incremento
dependiente de la dosis fuerte en el % de células positivas de
fosfo-H2AX cuando las células se tratan con la
combinación de gemcitabina e inhibidor de CHK. Se observó usando
inmunotinción que el H2AX fosforilado estaba presente en todo el
núcleo, no limitado a los focos.
\vskip1.000000\baselineskip
También se examinó fosfo-H2AX
mediante IHC como se describe antes en el Ejemplo 1 excepto con los
siguientes cambios. Se trataron las células HeLa o A549 con o sin
doxorubicina 100 nM (Adriamycin^{TM}) y concentraciones
crecientes de inhibidor de CHK (de 0 a 1 \muM) durante 5 horas
antes de la fijación y tinción. Se incubó sobre células fijadas un
dilución 1:400 de una H2AX Serina 139 anti-fosfo
monoclonal de ratón (Upstate, NY) seguido de una dilución 1:300 de
IgG anti-ratón de Alexa Fluor 594 (Molecular Probes,
OR). Se realizó la cuantificación usando algoritmos de Cellomics
Cell Health y se presentó como el % de células positivas de
fosfor-H2AX. La Fig. 8 es la cuantificación que
demuestra un fuerte incremento dependiente de la dosis en el % de
células A549 positivas de fosfo-H2AX cuando las
células se tratan con la combinación de Adriamycin^{TM} y el
inhibidor de CHK.
Claims (10)
1. Un método para determinar si un inhibidor de
CHK-1 está inhibiendo su diana molecular
CHK-1, comprendiendo el método:
- (a)
- determinar la presencia de una molécula de CHK-1 fosforilada en una primera muestra a partir de un paciente de ensayo con cáncer que ha recibido un agente dañino del ADN, y
- (b)
- determinar la presencia de una CHK-1 fosforilada en una segunda muestra a partir del paciente de ensayo con cáncer que ha recibido un agente dañino del ADN y un inhibidor de CHK-1, en el que un incremento en la cantidad de CHK-1 fosforilada en la segunda muestra comparado con la primera muestra es indicativo de que el inhibidor de CHK-1 está inhibiendo su diana molecular CHK-1.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de la reivindicación 1, en el que
la muestra es una muestra de tumor, sangre periférica, un raspado
celular, un folículo piloso, una punción cutánea o bucal.
3. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, en el que la CHK1 fosforilada
se determina mediante un anticuerpo de CHK1.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que la CHK1 fosforilada
se fosforila en Ser 345.
5. Un método para determinar si un inhibidor de
CHK-1 está inhibiendo su diana molecular
CHK-1, comprendiendo el método:
- (a)
- determinar la presencia de H2AX fosforilado en una primera muestra a partir de un paciente de ensayo con cáncer que ha recibido un agente dañino del ADN; y
- (b)
- determinar la presencia de H2AX fosforilado en una segunda muestra a partir del paciente de ensayo con cáncer que ha recibido un agente dañino del ADN y un inhibidor de CHK-1, en el que un incremento en la presencia de H2AX fosforilado en la segunda muestra comparado con la primera muestra es indicativo de que un inhibidor de CHK1 está inhibiendo su diana molecular CHK-1.
\vskip1.000000\baselineskip
6. El método de la reivindicación 5, en el que
la muestra es una muestra de sangre con células tumorales en
circulación.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el cáncer es un tumor no
sólido o un tumor sólido.
8. El método de la reivindicación 7, en el que
el tumor es leucemia, mieloma múltiple o linfoma.
9. El método de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el agente dañino del ADN es
un agente alquilante, un anti-metabolito, un
inhibidor de topoisomerasa, un agente radiomimético o radiación
gamma.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
el anti-metabolito es
5-fluorouracilo, fludarabina o gemcitabina.
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