ES2341892T5 - Toxina clostridial activable por toxinas clostridiales - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓN
Toxina clostridial activable por toxinas clostridiales
La presente solicitud de patente reivindica prioridad conforme a 35 U.S.C. §119(e) respecto de la solicitud de patente provisional estadounidense con n.° de serie 60/718.616 presentada el 19 de septiembre de 2005.
La capacidad de las toxinas clostridiales, tales como, p. ej., las neurotoxinas botulínicas (BoNT) BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G, la neurotoxina tetánica (TeNT), la neurotoxina de C. Baratii (BaNT) y la neurotoxina butírica (BuNT), para inhibir la transmisión neuronal se está explotando en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, véase, p. ej., William J. Lipham, “COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS Of BOTULINUM TOXIN” (Slack, Inc., 2004). Las toxinas clostridiales comercialmente disponibles como composiciones farmacéuticas incluyen las preparaciones de BoNT/A, tales como, p. ej., BOTOX® (Allergan, Inc., Irvine, CA), Dysport®/Reloxin®, (Beaufour Ipsen, Porton Down, Inglaterra), Linurase® (Prollenium, Inc., Ontario, Canadá), Neuronox® (Medy-Tox, Inc., Ochang-myeon, Corea del Sur), BTX-A (Lanzhou Institute Biological Products, China) y Xeomin® (Merz Pharmaceuticals, GmbH., Frankfurt, Alemania); y las preparaciones de BoNT/B, tales como, p. ej., MyoBloc™/NeuroBloc™ (Elan Pharmaceuticals, San Francisco, CA). Como ejemplo, el BOTOX® está aprobado en la actualidad en uno o más países para las siguientes indicaciones: acalasia, espasticidad en adultos, fisura anal, dolor de espalda, blefaroespasmo, bruxomanía, distonía cervical, temblor esencial, líneas glabelares o líneas faciales hipercinéticas, dolor de cabeza, espasmo hemifacial, hiperactividad de vejiga, hiperhidrosis, parálisis cerebral juvenil, esclerosis múltiple, trastornos mioclónicos, líneas labiales nasales, disfonía espasmódica, estrabismo y trastorno nervioso VII.
El creciente uso de terapias con toxinas clostridiales en el tratamiento de una amplia selección de dolencias del ser humano hace necesario aumentar la eficiencia con la que se producen estas toxinas. Sin embargo, puede resultar difícil cubrir las necesidades de la creciente demanda de tales tratamientos con toxinas. Un problema por resolver es la necesidad de convertir todas las toxinas clostridiales en la forma bicatenaria de la molécula para conseguir una actividad óptima. Históricamente, esta conversión se ha hecho en uno de estos dos modos. El primer procedimiento simplemente purifica una toxina clostridial de la propia cepa bacteriana, basándose, de ese modo, en la proteasa endógena natural usada para convertir la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria. El segundo procedimiento utiliza una proteasa exógena que convierte la forma monocatenaria en la cadena doble, bien aprovechando un sitio de escisión fortuito encontrado en la ubicación apropiada o mediante el diseño genético de un sitio de escisión por proteasa de las proteasas exógenas comercialmente disponibles que se usan habitualmente. Sin embargo, ambos procedimientos presentan varias desventajas. Por ejemplo, los procedimientos que emplean una proteasa endógena tienen bajos rendimientos de toxina, porque las cepas clostridiales nativas habitualmente producen poca toxina. Además, estas cepas son poco apropiadas para la investigación, dificultando así los esfuerzos por mejorar las características terapéuticas y cosméticas de las toxinas clostridiales sometidas a manipulación genética. Por último, hay varias cepas clostridiales que no producen la proteasa endógena necesaria para convertir la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria. Una desventaja del uso de proteasas exógenas es la falta de especificidad de la proteasa que da como resultado toxina inactiva debido a la escisión proteolítica de ubicaciones inapropiadas. Además, muchas de las proteasas actualmente disponibles proceden de fuentes animales que no cumplen las normas de correcta fabricación (NCF), por lo que requieren más etapas de purificación durante el procedimiento de fabricación. De este modo, los procedimientos usados actualmente para convertir la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria son ineficaces, incómodos de realizar y conducen a unos costes globales de producción mayores. Estas desventajas representan un obstáculo relevante para la producción comercial a escala global de las toxinas clostridiales y constituyen, por tanto, un problema muy importante, pues las formas bicatenarias de estas toxinas son necesarias para aplicaciones científicas, terapéuticas y cosméticas. Además, están en aumento tanto la cantidad de toxinas clostridiales que se prevé para futuras terapias como la demanda de toxinas con mayores propiedades terapéuticas. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar mejores procedimientos para generar moléculas bicatenarias de toxinas clostridiales para cubrir esta necesidad.
La presente invención proporciona toxinas clostridiales modificadas que se basan en un nuevo procedimiento para convertir la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria. Éstas y otras ventajas relacionadas son útiles para diversas aplicaciones clínicas, terapéuticas y cosméticas, tales como, p. ej., el tratamiento de trastornos neuromusculares, trastornos neuropáticos, trastornos oculares, dolor, daños musculares, dolor de cabeza, enfermedades cardiovasculares, trastornos neurosiquiátricos, trastornos endocrinos, cánceres, trastornos óticos y líneas faciales hipercinéticas, así como otros trastornos en los que la administración de toxinas clostridiales a un mamífero puede producir un efecto beneficioso.
Breve descripción de las figuras
La FIG. 1 muestra un esquema del paradigma actual del procesamiento posterior a la traducción de las toxinas clostridiales. Las toxinas clostridiales son traducidas en forma de un polipéptido monocatenario de aproximadamente 150 kDa que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación y un dominio de unión. Un enlace disulfuro formado desde un residuo de cisteína del dominio enzimático y un residuo de cisteína del dominio de translocación forma un bucle bicatenario. En este bucle bicatenario hay un sitio de escisión por
proteasa para una proteasa natural que puede ser producida endógenamente desde la cepa clostridial que sintetiza la toxina, o exógenamente desde una fuente encontrada en el medio ambiente. La escisión del sitio de escisión por proteasa por parte de la proteasa natural convierte la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria. La forma bicatenaria de la toxina se mantiene unida por el enlace tipo disulfuro y las interacciones no covalentes que hay entre las dos cadenas.
La FIG. 2 muestra un esquema del paradigma actual de la liberación de neurotransmisores y la intoxicación con toxinas clostridiales en una neurona central y periférica. La FIG. 2a muestra un esquema del mecanismo de la liberación de neurotransmisores de una neurona central y periférica. El proceso de liberación se puede describir como aquél que comprende dos etapas: 1) acoplamiento de la vesícula, en el que la proteína SNARE unida a una vesícula que contiene moléculas neurotransmisoras se asocia con las proteínas SNARE de unión a la membrana ubicadas en la membrana plasmática; 2) liberación de neurotransmisores, en la que la vesícula se fusiona con la membrana plasmática y las moléculas neurotransmisoras son sometidas a exocitosis. La FIG. 2b muestra un esquema del mecanismo intoxicación por la actividad de las toxinas tetánica y botulínica de una neurona central y periférica. El proceso de intoxicación se puede describir como aquél que comprende cuatro etapas: 1) unión a un receptor, en la que la toxina clostridial se une a un sistema receptor clostridial e inicia el proceso de intoxicación; 2) interiorización del complejo, en el que tras la unión de la toxina, una vesícula que contiene el complejo de toxina/sistema receptor es sometida a endocitosis dentro de la célula; 3) translocación de la cadena ligera, en la que múltiples hechos dan lugar a la liberación de la cadena ligera activa dentro del citoplasma; y 4) modificación de la diana enzimática, en la que la cadena ligera activa de la toxina clostridial escinde proteolíticamente su sustrato de SNARE diana, tal como, p. ej., SNAP-25, VAMP o sintaxina, evitando así el acoplamiento de la vesícula y la liberación de neurotransmisores.
LA FIG. 3 muestra un esquema de la ubicación subcelular y los sitios de escisión de la SNAP-25, VAMP y sintaxina. La VAMP se ubica en la membrana de la vesícula sináptica, mientras que la SNAP-25 y la sintaxina se ubican en la membrana plasmática. BoNT/A y BoNT/E escinden a la SNAP-25 cerca del terminal carboxilo, liberando nueve o 26 residuos, respectivamente. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G y TeNT actúan sobre la parte central conservada de la VAMP (recuadro blanco) y liberan la mitad citosólica amino-terminal de la VAMP en el citosol. BoNT/C1 escinde a la SNAP-25 cerca del terminal carboxilo, así como escinde a la sintaxina en un único sitio cerca de la superficie de la membrana citosólica. La acción de BoNT/C1 da como resultado la liberación de una gran parte del dominio citosólico de la sintaxina, mientras que solo se libera una pequeña parte de la SNAP-25 mediante la proteolisis selectiva de BoNT/C1.
La FIG. 4 muestra un esquema de toxinas clostridiales modificadas. La FIG. 4a muestra una toxina clostridial modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial que comprende un sitio de escisión de BoNT/A derivado, p. ej., de un miembro de la familia de la SNAP-25 susceptible a la escisión por BoNT/A. La escisión del sitio de escisión de BoNT/A por parte de BoNT/A convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en la forma bicatenaria. La FIG. 4b muestra una toxina clostridial modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial que comprende un sitio de escisión de BoNT/E derivado, p. ej., de un miembro de la familia de la SNAP-25 susceptible a la escisión por BoNT/E. La escisión del sitio de escisión de BoNT/E por parte de BoNT/E convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en la forma bicatenaria.
La FIG. 5 muestra un esquema de toxinas clostridiales modificadas. La FIG. 5a muestra una toxina clostridial modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial que comprende un sitio de escisión de BoNT/B derivado, p. ej., de un miembro de la familia de la VAMP susceptible a la escisión por BoNT/B. La escisión del sitio de escisión de BoNT/B por parte de BoNT/B convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en la forma bicatenaria. La FIG. 5b muestra una toxina clostridial modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial que comprende un sitio de escisión de BoNT/D derivado, p. ej., de un miembro de la familia de la VAMP susceptible a la escisión por BoNT/D. La escisión del sitio de escisión de BoNT/D por parte de BoNT/D convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en la forma bicatenaria. La FIG. 5c muestra una toxina clostridial modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial que comprende un sitio de escisión de BoNT/F derivado, p. ej., de un miembro de la familia de la VAMP susceptible a la escisión por BoNT/F. La escisión del sitio de escisión de BoNT/F por parte de BoNT/F convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en la forma bicatenaria. La FIG. 5d muestra una toxina clostridial modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial que comprende un sitio de escisión de BoNT/G derivado, p. ej., de un miembro de la familia de la VAMP susceptible a la escisión por BoNT/G. La escisión del sitio de escisión de BoNT/G por parte de BoNT/G convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en la forma bicatenaria. La FIG. 5e muestra una toxina clostridial modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial que comprende un sitio de escisión de TeNT derivado, p. ej., de un miembro de la familia de la VAMP susceptible a la escisión por TeNT. La escisión del sitio de escisión de TeNT por parte de TeNT convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en la forma bicatenaria.
La FIG. 6 muestra un esquema de toxinas clostridiales modificadas. La FIG. 6a muestra una toxina clostridial modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial que comprende un sitio de escisión de BoNT/C1 derivado, p. ej., de un miembro de la familia de la sintaxina susceptible a la escisión por BoNT/C1. La escisión del sitio de escisión de BoNT/C1 por parte de BoNT/C1 convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en la forma bicatenaria. La FIG. 6b muestra una toxina clostridial modificada que comprende un dominio enzimático, un dominio de translocación y un dominio de unión, y un bucle bicatenario que incluye un sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial que comprende un sitio de escisión de BoNT/C1 derivado, p. ej., de un miembro de la familia de la SNAP-25 susceptible a la escisión por BoNT/C1. La escisión del sitio de escisión de BoNT/C1 por parte de BoNT/C1 convierte la forma monocatenaria de la toxina modificada en la forma bicatenaria.
La FIG. 7 muestra un mapa plasmídico del constructo de expresión procariota pET29b/BoNT/A-A17 que comprende una molécula de polinucleótido de la SEQ ID NO: 225 que codifica una BoNT/A modificada de SEQ ID NO: 203 ligada operativamente a un polipéptido de unión a polihistidina carboxi-terminal. Hay un sitio de escisión de la proteasa tripsina ligado operativamente entre el polipéptido de unión a polihistidina y la BoNT/A modificada. Las abreviaturas son las siguientes: Pt7: una región promotora del bacteriófago T7; ED: una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNt /A; A17: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión del sustrato de BoNT/A; TD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/A; Tripsina: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión de tripsina; 6xHis: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a polihistidina; T7 TT: una región de terminación de la transcripción del bacteriófago T7; origen de f1: un origen de replicación del bacteriófago f1; Kanamicina: una molécula de polinucleótido que codifica una aminofosfotransferasa que confiere resistencia a la kanamicina; origen de pBR322: un origen de pBR322 de la región de replicación plasmídica; lacl: una molécula de polinucleótido que codifica una lactosa I.
La FIG. 8 muestra un mapa plasmídico del constructo de expresión procariota pET29b/BoNT/A-BT35 que comprende una molécula de polinucleótido de la SEQ ID NO: 227 que codifica una BoNT/A modificada de SEQ ID NO: 205 ligada operativamente a un polipéptido de unión a polihistidina carboxi-terminal. Hay un sitio de escisión de la proteasa tripsina ligado operativamente entre el polipéptido de unión a polihistidina y la BoNT/A modificada. Las abreviaturas son las siguientes: Pt7: una región promotora del bacteriófago T7; ED: una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/A; BT35: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión del sustrato de BoNT/B y un sitio de escisión del sustrato de TeNT; TD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/A; Tripsina: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión de tripsina; 6xHis: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a polihistidina; T7 TT: una región de terminación de la transcripción del bacteriófago T7; origen de f1: un origen de replicación del bacteriófago f1; Kanamicina: una molécula de polinucleótido que codifica una aminofosfotransferasa que confiere resistencia a la kanamicina; origen de pBR322: un origen de pBR322 de la región de replicación plasmídica; lacl: una molécula de polinucleótido que codifica una lactosa I.
La FIG. 9 muestra un mapa plasmídico del constructo de expresión procariota pET29b/BoNT/A-Csyn8 que comprende una molécula de polinucleótido de la SEQ ID NO: 229 que codifica una BoNT/A modificada de SEQ ID NO: 207 ligada operativamente a un polipéptido de unión a polihistidina carboxi-terminal. Hay un sitio de escisión de la proteasa tripsina ligado operativamente entre el polipéptido de unión a polihistidina y la BoNT/A modificada. Las abreviaturas son las siguientes: Pt7: una región promotora del bacteriófago T7; ED: una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/A; Csyn8: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión del sustrato de BoNT/C1; TD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/A; Tripsina: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión de tripsina; 6xHis: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a polihistidina; T7 TT: una región de terminación de la transcripción del bacteriófago t 7; origen de f1: un origen de replicación del bacteriófago f1; Kanamicina: una molécula de polinucleótido que codifica una aminofosfotransferasa que confiere resistencia a la kanamicina; origen de pBR322: un origen de pBR322 de la región de replicación plasmídica; lacl: una molécula de polinucleótido que codifica una lactosa I.
La FIG. 10 muestra un mapa plasmídico del constructo de expresión procariota pET29b/BoNT/A-DF39 que comprende una molécula de polinucleótido de la SEQ ID NO: 231 que codifica una BoNT/A modificada de SEQ ID NO: 209 ligada operativamente a un polipéptido de unión a polihistidina carboxi-terminal. Hay un sitio de escisión de la proteasa tripsina ligado operativamente entre el polipéptido de unión a la polihistidina y la BoNT/A modificada. Las abreviaturas son las siguientes: Pt7: una región promotora del bacteriófago T7; ED: una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/A; DF39: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión del sustrato de BoNT/D y un sitio de escisión del sustrato de BoNt /F; TD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/A; Tripsina: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión de tripsina; 6xHis: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a polihistidina; T7 TT: una región de terminación de la transcripción del bacteriófago T7; origen de f1: un origen de replicación del bacteriófago f1; Kanamicina: una molécula de polinucleótido que codifica una aminofosfotransferasa que confiere resistencia a la kanamicina; origen de pBR322: un origen de pBR322 de la
región de replicación plasmídica; lacl: una molécula de polinucleótido que codifica una lactosa I.
La FIG. 11 muestra un mapa plasmídico del constructo de expresión procariota pET29b/BoNT/A-E8 que comprende una molécula de polinucleótido de la SEQ ID NO: 233 que codifica una BoNT/A modificada de SEQ ID NO: 211 ligada operativamente a un polipéptido de unión a polihistidina carboxi-terminal. Hay un sitio de escisión de la proteasa tripsina ligado operativamente entre el polipéptido de unión a polihistidina y la BoNT/A modificada. Las abreviaturas son las siguientes: Pt7: una región promotora del bacteriófago T7; ED: una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/A; E8: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión del sustrato de BoNT/E; TD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/A; Tripsina: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión de tripsina; 6xHis: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a polihistidina; T7 TT: una región de terminación de la transcripción del bacteriófago T7; origen de f1: un origen de replicación del bacteriófago f1; Kanamicina: una molécula de polinucleótido que codifica una aminofosfotransferasa que confiere resistencia a la kanamicina; origen de pBR322: un origen de pBR322 de la región de replicación de plásmidos; lacl: una molécula de polinucleótido que codifica una lactosa I.
LA FIG. 12 muestra un mapa plasmídico del constructo de expresión procariota pET29b/BoNT/A-G8 que comprende una molécula de polinucleótido de la SEQ ID NO: 235 que codifica una BoNT/A modificada de SEQ ID NO: 213 ligada operativamente a un polipéptido de unión a polihistidina carboxi-terminal. Hay un sitio de escisión de la proteasa tripsina ligado operativamente entre el polipéptido de unión a polihistidina y la BoNT/A modificada. Las abreviaturas son las siguientes: Pt7: una región promotora del bacteriófago T7; ED: una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/A; G8: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión del sustrato de BoNT/G; TD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/A; Tripsina: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión de tripsina; 6xHis: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a polihistidina; T7 TT: una región de terminación de la transcripción del bacteriófago T7; origen de f1: un origen de replicación del bacteriófago f1; Kanamicina: una molécula de polinucleótido que codifica una aminofosfotransferasa que confiere resistencia a la kanamicina; origen de pBR322: un origen de pBR322 de la región de replicación plasmídica; lacl: una molécula de polinucleótido que codifica una lactosa I.
La FIG. 13 muestra un mapa plasmídico del constructo de expresión de levadura pPICZ A/BoNT/A-A17 que comprende una molécula de polinucleótido de la SEQ ID NO: 236 que codifica una BoNT/A modificada de SEQ ID NO: 203 ligada operativamente a los polipéptidos carboxi-terminales de unión a polihistidina y c-myc. Las abreviaturas son las siguientes: Paoxi: una región promotora de la aldehído oxidasa 1; ED: una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/A; A17: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión del sustrato de BoNT/A; TD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/A; cmyc: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a c-myc; 6xHis: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a polihistidina; AOX1 TT: una región de terminación de la transcripción de la aldehído oxidasa 1; ZeocinTM: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de resistencia a ZeocinTM; origen de pUC: un origen de pUC de la región de replicación plasmídica.
La FIG. 14 muestra un mapa plasmídico del constructo de transferencia de baculovirus pBACgus3/BoNT/A-A17 que comprende una molécula de polinucleótido de la SEQ ID NO: 237 que codifica una BoNT/A modificada de SEQ ID NO: 203 ligada operativamente a un polipéptido de unión a polihistidina carboxi-terminal. Hay un sitio de escisión de la proteasa trombina ligado operativamente entre la BoNT/A modificada y el polipéptido de unión a polihistidina. Las abreviaturas son las siguientes: Pph: una región promotora de polihedrina; gp64: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido señal gp64; ED: una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/A; A17: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión del sustrato de BoNT/A; TD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/A; Trombina: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión de la proteasa trombina; 6xHis: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a polihistidina; origen de pUC: un origen de pUC de la región de replicación plasmídica; Ampicilina: una molécula de polinucleótido que codifica una p-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina; origen de f1: un origen de replicación del bacteriófago f1; gus: una molécula de polinucleótido que codifica una p-glucuronidasa.
La FIG. 15 muestra un mapa plasmídico del constructo de expresión en mamíferos pSecTag2/BoNT/A-A17 que comprende una molécula de polinucleótido de la SEQ ID NO: 238 que codifica una BoNT/A modificada de SEQ ID NO: 203 ligada operativamente a los polipéptidos carboxi-terminales de unión a polihistidina y c-myc. Las abreviaturas son las siguientes: Pcmv: una región promotora de citomegalovirus; IgK: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de una inmunoglobulina K; ED: una molécula de polinucleótido que codifica un dominio enzimático de BoNT/A; A17: una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión del sustrato de BoNT/A; TD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de translocación de BoNT/A; BD, una molécula de polinucleótido que codifica un dominio de unión de BoNT/A; c-myc: una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a c-myc; 6xHis; una molécula de polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a polihistidina; BGH pA: un sitio de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino; origen de f1: un origen de replicación del bacteriófago f1; Psv4o: una región promotora del virus de simio 40; ZeocinTM: una región que codifica un polipéptido de resistencia a ZeocinTM; origen de pUC: un origen de pUC de
la región de replicación plasmídica; Ampicilina: una molécula de polinucleótido que codifica una p-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina.
Descripción detallada
Las toxinas clostridiales producidas por Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Clostridium baratii y Clostridium butyricum son las más usadas en tratamientos terapéuticos y cosméticos de seres humanos y otros mamíferos. Las cepas de C. botulinum producen siete tipos antigénicamente distintos de toxinas botulínicas (BoNT) que han sido identificados mediante la investigación de brotes de botulismo en el hombre (BoNT/A, /B, /E y /F), animales (BoNT/C1 y /D) o han sido aislados del suelo (BoNT/G). Las BoNT poseen entre sí una identidad de los aminoácidos del aproximadamente 35% y comparten la misma organización de los dominios funcionales y la misma arquitectura estructural global. Los expertos en la técnica reconocen que, dentro de cada tipo de toxina clostridial, pueden existir subtipos que difieren algo en su secuencia de aminoácidos y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Por ejemplo, en la actualidad, hay cuatro subtipos de BoNT/A, BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3 y BoNT/A4, mostrando los subtipos específicos una identidad de los aminoácidos del aproximadamente 89% al ser comparados con otro subtipo de BoNT/A. Aunque los siete serotipos de BoNT tienen estructura y propiedades farmacológicas similares, cada uno presenta además características bacteriológicas heterogéneas. Por el contrario, la toxina tetánica (TeNT) es producida por un grupo uniforme de C. tetani. Otras dos especies clostridiales, C. baratii y C. butyricum, también producen toxinas BaNT y BuNT, respectivamente, que son similares a BoNT/F y BoNT/E, respectivamente.
Las toxinas clostridiales son traducidas en forma de polipéptido monocatenario de aproximadamente 150 kDa que, posteriormente, es escindido mediante escisión proteolítica dentro de un bucle de disulfuro por una proteasa natural (Fig. 1). Esta escisión tiene lugar dentro de una región del bucle bicatenario diferenciada creada entre dos residuos de cisteína que forman un enlace de tipo disulfuro. Este procesamiento posterior a la traducción produce una molécula bicatenaria que comprende una cadena ligera (LC) de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada (HC) de aproximadamente 100 kDa que se mantienen juntas por el único enlace de tipo disulfuro y por interacciones no covalentes entre las dos cadenas. Actualmente se desconoce la proteasa natural usada para convertir la molécula monocatenaria en la cadena doble. En algunos serotipos, tales como, p. ej., BoNT/A, la proteasa natural se produce endógenamente por el serotipo bacteriano y la escisión tiene lugar dentro de la célula antes de que la toxina sea liberada en el medio ambiente. Sin embargo, en otros serotipos, tales como, p. ej., BoNT/E, la cepa bacteriana parece no producir una proteasa endógena capaz de convertir la forma monocatenaria de la toxina en la forma bicatenaria. En estas situaciones, la toxina se libera de la célula en forma de toxina monocatenaria que luego es posteriormente convertida en la forma bicatenaria por una proteasa natural encontrada en el medio ambiente.
Cada molécula bicatenaria madura comprende tres dominios funcionalmente distintos: 1) un dominio enzimático ubicado en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene una actividad endopeptidasa dependiente del cinc que se dirige específicamente a los componentes del núcleo del aparto de liberación de neurotransmisores (Tabla 1); 2) un dominio de translocación contenido en la mitad amino-terminal de la HC (Hn) que facilita la liberación de la LC desde las vesículas intracelulares hacia el citoplasma de la célula diana (Tabla 1); y 3) un dominio de unión encontrado en la mitad carboxi-terminal de la HC (Hc) que determina la actividad de unión y la especificidad de unión de la toxina con el complejo receptor ubicado en la superficie de la célula diana (Tabla 1).
Todas las actividades de unión, de translocación y enzimática de estos tres dominios funcionales son necesarias para la toxicidad. Aunque todavía no se conocen con exactitud todos los detalles de este proceso, el mecanismo de intoxicación celular global mediante el cual las toxinas clostridiales entran en una neurona e inhiben la liberación de neurotransmisores es similar independientemente del tipo. Aunque los solicitantes no desean quedar limitados a la siguiente descripción, se puede describir el mecanismo de intoxicación como aquél que comprende al menos cuatro etapas: 1) unión a un receptor, 2) interiorización del complejo, 3) translocación de la cadena ligera y 4) modificación de la diana enzimática (véase la FIG. 2). El proceso se inicia cuando el dominio Hc de una toxina clostridial se une a
un complejo receptor específico de una toxina ubicado en la superficie de la membrana plasmática de una célula diana. Se cree que la especificidad de unión de un complejo receptor se consigue, en parte, por la combinaciones específicas de los gangliósidos y los receptores de proteínas que parecen comprender con claridad cada complejo de receptor y toxina clostridial. Una vez unidos, los complejos de toxina/receptor son interiorizados mediante endocitosis y las vesículas interiorizadas son clasificadas en vías intracelulares específicas. La etapa de translocación parece estar desencadenada por la acidificación del compartimento vesicular. Este proceso parece iniciar dos importantes reajustes estructurales dependientes del pH que aumentan la hidrofobicidad y promueven la formación de la forma bicatenaria de la toxina. Una vez activada, la endopeptidasa de la cadena ligera de la toxina es liberada de la vesícula intracelular en el citosol, en el que se dirige específicamente a uno de los tres componentes del núcleo conocidos del aparato de liberación de neurotransmisores. Estas proteínas del núcleo, la proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP)/sinaptobrevina, la proteína asociada al sinaptosoma de 25 kDa (SNAP-25) y la sintaxina, son necesarias para el acoplamiento de la vesícula sináptica y la fusión en el terminal nervioso, y son miembros de la familia de receptores de proteínas de unión al factor sensible a la W-etilmaleimida (SNARE). BoNT/A y BoNT/E escinden a la SNAP-25 en la región carboxiterminal, liberando un segmento de nueve o veintiséis aminoácidos, respectivamente, y BoNT/C1 también escinde a la SNAP-25 cerca del terminal carboxilo. Los serotipos botulínicos BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G, y la toxina tetánica actúan sobre la parte central conservada de la VAMP y liberan la mitad amino-terminal de la VAMP en el citosol. BoNT/C1 escinde a la sintaxina en un único sitio cerca de la superficie de la membrana citosólica. La proteolisis selectiva de los SNARE sinápticos es responsable del bloqueo de la liberación de neurotransmisores provocado por las toxinas clostridiales in vivo. Las dianas de proteínas SNARE de las toxinas clostridiales son comunes a la exocitosis en una variedad de tipos no neuronales; en estas células, como en las neuronas, la actividad peptidasa de la cadena ligera inhibe la exocitosis, Véase, p. ej., Yann Humeau y col., “How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release”, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton y col., “Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility”, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli y col., “The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons”, 11(9) Trends Microbiol., 431-437, (2003).
La presente invención revela toxinas clostridiales modificadas que se pueden convertir de la forma de polipéptido monocatenario a la forma bicatenaria usando la actividad enzimática de una toxina clostridial. Esto se consigue reemplazando el sitio de escisión de una proteasa natural encontrado en la región del bucle bicatenario por un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial. En una modificación en la que la sustitución del sitio de escisión del sustrato de toxina clostridial es el sustrato para la toxina clostridial, la activación se realiza usando una toxina clostridial que tenga una actividad enzimática de BoNT/A. Esta sustitución del sitio de escisión permitirá a estas toxinas modificadas activarse entre sí, eliminando la dependencia de una proteasa diferente. Por ejemplo, una BoNT/A modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A permitirá a una toxina clostridial que tenga actividad enzimática de BoNT/A escindir el sitio de escisión del sustrato de BoNT/A de la BoNT/A modificada, produciendo así la forma bicatenaria de la toxina. En una modificación en la que la sustitución del sitio de escisión del sustrato de toxina clostridial es el sustrato para una toxina clostridial diferente, la activación se realiza usando una toxina clostridial que tenga una actividad enzimática de BoNT/C1. Por ejemplo, una BoNT/A modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 permitirá a una toxina clostridial que tenga actividad enzimática de BoNT/C1 escindir el sitio de escisión del sustrato de BoNT/C1 de la BoNT/A modificada, produciendo así la forma bicatenaria de la toxina.
La presente invención proporciona toxinas clostridiales modificadas que comprenden un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, en las que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial está ubicado en una región del bucle bicatenario de la toxina clostridial modificada en las que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial deriva de fragmentos autocatalíticos de las propias toxinas clostridiales. Se prevé el uso de cualquier sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, incluyendo, sin limitación, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de sustrato de TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT y un sitio de escisión de sustrato de BuNT.
Otros aspectos de la presente invención proporcionan moléculas de polinucleótido que codifican toxinas clostridiales modificadas que comprenden un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, en las que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario.
Otros aspectos de la presente invención proporcionan procedimientos para producir una toxina clostridial modificada que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial como se define en las reivindicaciones está ubicado en la región del bucle bicatenario. Otros aspectos de la presente invención proporcionan procedimientos para producir en una célula una toxina clostridial modificada que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial como se define en las reivindicaciones, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario y para expresar el constructo de expresión en la célula
Los aspectos de la presente invención proporcionan, en parte, una toxina clostridial. Como se usa en la presente memoria, la expresión “toxina clostridial” significa cualquier polipéptido que pueda ejecutar el mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial entra en una neurona e inhibe la liberación de neurotransmisores, y
engloba la unión de una toxina clostridial a un complejo receptor de baja o alta afinidad, la interiorización del complejo de toxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de la toxina clostridial en el citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato de toxina clostridial.
Una toxina clostridial incluye, sin limitación, variantes naturales de toxinas clostridiales, tales como, p. ej., isoformas de toxinas clostridiales y subtipos de toxinas clostridiales; variantes no naturales de toxinas clostridiales, tales como, p. ej., variantes conservadoras de toxinas clostridiales, variantes no conservadoras de toxinas clostridiales, variantes quiméricas de toxinas clostridiales y fragmentos activos de toxinas clostridiales de las mismas, o cualquier combinación de las mismas. Como se usa en la presente memoria, la expresión “variante de toxina clostridial”, bien sea natural o no natural, significa una toxina clostridial que tiene al menos un cambio de un aminoácido de la región correspondiente de las secuencias de referencia reveladas (véase la Tabla 1) y se puede describir en porcentaje de identidad con la región correspondiente de esa secuencia de referencia. Como ejemplos no restrictivos, una variante de BoNT/A que comprende los aminoácidos 1-1296 de la SEQ ID NO: 1 tendrá al menos una diferencia de un aminoácido, tal como, p. ej., la sustitución, eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la región de los aminoácidos 1-1296 de la SEQ ID NO: 1; una variante de BoNT/B que comprende los aminoácidos 1-1291 de la SEQ ID NO: 2 tendrá al menos una diferencia de un aminoácido, tales como, p. ej., la sustitución, eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la región de los aminoácidos 1-1291 de la SEQ ID NO: 2; una variante de BoNT/C1 que comprende los aminoácidos 1-1291 de la SEQ ID NO: 3 tendrá al menos una diferencia de un aminoácido, tales como, p. ej., la sustitución, eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la región de los aminoácidos 1-1291 de la SEQ ID NO: 3; una variante de BoNT/D que comprende los aminoácidos 1 1276 de la SEQ ID NO: 4 tendrá al menos una diferencia de un aminoácido, tales como, p. ej., la sustitución, eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la región de los aminoácidos 1-1276 de la SEQ ID NO: 4; una variante de BoNT/E que comprende los aminoácidos 1-1252 de la SEQ ID NO: 5 tendrá al menos una diferencia de un aminoácido, tal como, p. ej., la sustitución, eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la región de aminoácidos 1-1252 de la SEQ ID NO: 5; una variante de BoNT/F que comprende los aminoácidos 1-1274 de la SEQ ID NO: 6 tendrá al menos una diferencia de un aminoácido, tal como, p. ej., la sustitución, eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la región de los aminoácidos 1-1274 de la SEQ ID NO: 6; una variante de BoNT/G que comprende los aminoácidos 1-1297 de la SEQ ID NO: 7 tendrá al menos una diferencia de un aminoácido, tal como, p. ej., la sustitución, eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la región de los aminoácidos 1-1297 de la SEQ ID NO: 7; y una variante de TeNT que comprende los aminoácidos 1-1315 de la SEQ ID NO: 8 tendrá al menos una diferencia de un aminoácido, tal como, p. ej., la sustitución, eliminación o adición de un aminoácido, en comparación con la región de aminoácidos 1-1315 de la SEQ ID NO: 8.
Se puede usar cualquiera de una variedad de procedimientos de alineación de secuencias para determinar el porcentaje de identidad, incluyendo, sin limitación, procedimientos globales, procedimientos locales y procedimientos híbridos, tales como, p. ej., los procedimientos de aproximación de segmentos. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos rutinarios al alcance de cualquier experto en la técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la presente memoria.
Los procedimientos globales alinean secuencias del principio al fin de la molécula y determinan el mejor alineamiento sumando las puntuaciones de los pares de residuos individuales e imponiendo penalizaciones por los huecos. Los procedimientos no restrictivos incluyen, p. ej., CLUSTAL W, véase, p. ej., Julie D. Thompson y col., “CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice”; 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); y la mejora iterativa, véase, p. ej., Osamu Gotoh, “Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments”, 264(4) J. Mol. Biol. 823 838 (1996).
Los procedimientos locales alinean secuencias mediante la identificación de uno o más motivos conservados compartidos por todas las secuencias de entrada. Los procedimientos no restrictivos incluyen, p. ej., Match-box, véase, p. ej., Eric Depiereux y Ernest Feytmans, “Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences”, 8(5) CABIOS 501-509 (1992); el muestreo de Gibbs, véase, p. ej., C. E. Lawrence y col., “Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment”, 262(5131) Science 208-214 (1993); Align-M, véase, p. ej., Ivo Van Walle y col., “Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences”, 20(9) Bioinformatics,:1428-1435 (2004).
Los procedimientos híbridos combinan aspectos funcionales de los procedimientos de alineamiento tanto globales como locales. Los procedimientos no restrictivos incluyen, p. ej., la comparación segmento a segmento, véase, p. ej., Burkhard Morgenstern y col., “Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based On Segment-To-Segment Comparison”, 93(22) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 12098-12103 (1996); T-Coffee, véase, p. ej., Cédric Notredame y col., “T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment”, 302 (1) J. Mol. Biol. 205-217 (2000); MUSCLE, véase, p. ej., Robert C. Edgar, “MUSCLE: Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput”, 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797 (2004); y DIALIGN-T, véase, p. ej., Amarendran R. Subramanian y col., “DIALIGN-T.- An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment”, 6(1) BMC Bioinformatics 66 (2005).
Como se usa en la presente memoria, la expresión “variante natural de toxina clostridial” significa cualquier toxina clostridial producida sin la ayuda de la manipulación humana, incluyendo, sin limitación, las isotermas de toxinas clostridiales producidas a partir de transcriptos cortados y empalmados alternativamente, las isotermas de toxinas clostridiales producidas mediante la mutación espontánea y los subtipos de toxinas clostridiales. Los ejemplos no restrictivos de una isoforma de toxina clostridial incluyen, p. ej., isoformas de BoNT/A, isoformas de BoNT/B, isoformas de BoNT/C1, isoformas de BoNT/D, isoformas de BoNT/E, isoformas de BoNT/F, isoformas de BoNT/G e isoformas de TeNT. Los ejemplos no restrictivos de un subtipo de toxina clostridial incluyen, p. ej., los subtipos de BoNT/A BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3 y BoNT/A4; los subtipos de BoNT/B BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B divalente y BoNT/B no proteolítica; los subtipos de BoNT/C1 BoNT/C1-1 y BoNT/C1-2; los subtipos de BoNT/E BoNT/E1, BoNT/E2 y BoNTE3; y los subtipos de BoNT/F BoNT/F1, BoNT/F2, BoNT/F3 y BoNT/F4.
Como se usa en la presente memoria, la expresión “variante no natural de toxina clostridial” significa cualquier toxina clostridial producida con la ayuda de la manipulación humana, incluyendo, sin limitación, las toxinas clostridiales producidas mediante ingeniería genética usando mutagénesis aleatoria o un diseño racional, y las toxinas clostridiales producidas mediante síntesis química. Los ejemplos no restrictivos de las variantes no naturales de toxinas clostridiales incluyen, p. ej., las variantes conservadoras de toxinas clostridiales, las variantes no conservadoras de toxinas clostridiales, las variantes quiméricas de toxinas clostridiales y los fragmentos activos de toxinas clostridiales.
Como se usa en la presente memoria, la expresión “variante conservadora de toxina clostridial” significa una toxina clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de la toxina clostridial de referencia (Tabla 1). Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, un tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilidad, lipofilidad, capacidad de unión covalente, capacidad de unión mediante enlaces de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, y similares, o cualquier combinación de las mismas. Una variante conservadora de toxina clostridial puede funcionar de una manera sustancialmente igual a la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante conservadora de toxina clostridial, y se puede sustituir por la toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente invención. Una variante conservadora de toxina clostridial puede sustituir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos, diez o más aminoácidos, 20 o más aminoácidos, 30 o más aminoácidos, 40 o más aminoácidos, 50 o más aminoácidos, 100 o más aminoácidos, 200 o más aminoácidos, 300 o más aminoácidos, 400 o más aminoácidos, o 500 o más aminoácidos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante conservadora de toxina clostridial. Una variante conservadora de toxina clostridial también puede sustituir al menos 10 aminoácidos contiguos, al menos 15 aminoácidos contiguos, al menos 20 aminoácidos contiguos, o al menos 25 aminoácidos contiguos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante conservadora de toxina clostridial, que posee una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%, una identidad de los aminoácidos del 65%, una identidad de los aminoácidos del 75%, una identidad de los aminoácidos del 85% o una identidad de los aminoácido del 95% con la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante conservadora de toxina clostridial. Los ejemplos no restrictivos de una variante conservadora de toxina clostridial incluyen, p. ej., las variantes conservadoras de BoNT/A, las variantes conservadoras de BoNT/B, las variantes conservadoras de BoNT/C1, las variantes conservadoras de BoNT/D, las variantes conservadoras de BoNT/E, las variantes conservadoras de BoNT/F, las variantes conservadoras de BoNT/G y las variantes conservadoras de TeNT.
Como se usa en la presente memoria, la expresión “variante no conservadora de toxina clostridial” significa una toxina clostridial en la que 1) al menos un aminoácido está eliminado de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial; 2) al menos un aminoácido está añadido a la toxina clostridial de referencia en la que se basa la toxina clostridial no conservadora; o 3) al menos un aminoácido está sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de la toxina clostridial de referencia (Tabla 1). Una variante no conservadora de toxina clostridial puede funcionar de una manera sustancialmente similar a la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial, y se puede sustituir por la toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente invención. Una variante no conservadora de toxina clostridial puede eliminar uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos y diez o más aminoácidos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial. Una variante no conservadora de toxina clostridial puede añadir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos y diez o más aminoácidos a la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial. Una variante no conservadora de toxina clostridial puede sustituir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos, diez o más aminoácidos, 20 o más aminoácidos, 30 o más aminoácidos, 40 o más aminoácidos, 50 o más aminoácidos, 100 o más aminoácidos, 200 o más aminoácidos, 300 o más aminoácidos, 400 o más aminoácidos, o 500 o más aminoácidos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial. Una variante no conservadora de toxina clostridial también puede sustituir al menos 10 aminoácidos contiguos, al menos 15 aminoácidos contiguos, al menos 20 aminoácidos contiguos, o al menos 25 aminoácidos contiguos de la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial, que posee una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%, una identidad de los aminoácidos del 65%, una identidad de los
aminoácidos del 75%, una identidad de los aminoácidos del 85% o una identidad de los aminoácido del 95% con la toxina clostridial de referencia en la que se basa la variante no conservadora de toxina clostridial. Los ejemplos no restrictivos de una variante no conservadora de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes no conservadoras de BoNT/A, variantes no conservadoras de BoNT/B, variantes no conservadoras de BoNT/C1, variantes no conservadoras de BoNT/D, variantes no conservadoras de BoNT/E, variantes no conservadoras de BoNT/F, variantes no conservadoras de BoNT/G y variantes no conservadoras de TeNT.
Como se usa en la presente memoria, la expresión “variante quimérica de toxina clostridial” significa una molécula que comprende al menos una parte de una toxina clostridial y al menos una parte de al menos otra proteína para formar una toxina con al menos una propiedad diferente de las toxinas clostridiales de referencia de la Tabla 1. Una clase de variante quimérica de toxina clostridial comprende una toxina clostridial modificada en la que el dominio de unión celular endógeno de una toxina clostridial natural está bien modificado o reemplazado con un dominio de unión celular de otra molécula. Tal toxina clostridial modificada posee una actividad de unión celular alterada, porque la toxina modificada puede, p. ej., usar el mismo receptor presente sobre la superficie de una célula diana de toxina clostridial natural, a lo que se denomina actividad de unión celular aumentada para una célula diana de toxina clostridial natural; usar un receptor diferente presente sobre la superficie de una célula diana de toxina clostridial natural, a lo que se denomina actividad de unión celular alterada para una célula diana de toxina clostridial natural, o usar un receptor diferente presente sobre la superficie de la célula diana de toxina no clostridial, a lo que se denomina actividad de unión celular alterada para una célula diana de toxina clostridial no natural.
Una variante quimérica de toxina clostridial puede ser una toxina clostridial modificada con una mayor actividad de unión celular capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial natural, p. ej., una neurona motora. Un modo de lograr este aumento de la actividad de unión es mediante la modificación del dominio diana endógeno de una toxina clostridial natural para aumentar una actividad de unión celular de la toxina por su receptor natural. Tales modificaciones realizadas en un dominio diana dan como resultado, p. ej., una mayor actividad de unión celular que aumenta la afinidad de unión por un receptor de toxina clostridial endógeno presente en una célula diana de toxina clostridial natural; una mayor actividad de unión celular que aumenta la especificidad de unión por un subgrupo de receptores de toxinas clostridiales endógenos presentes en una célula diana de toxina clostridial natural; o una mayor actividad de unión celular que aumenta tanto la afinidad de unión como la especificidad de unión. En, p. ej., Lance E. Steward, y col., “Modified Clostridial Toxins with Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous Clostridial Toxin Receptors”, publicación de patente internacional n.° 2006/008956 (14 de marzo de 2006), Lance E. Steward, “Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capability, and Enhanced Targeting Activity”, solicitud de patente provisional estadounidense n.° 60/807.063 (11 de julio de 2006), se describen ejemplos no restrictivos de toxinas clostridiales modificadas como un aumento de la actividad de unión celular por un receptor de toxina clostridial natural; cuyos contenidos se encuentran incorporados en su totalidad en el presente documento por referencia.
Una variante quimérica de toxina clostridial puede ser una toxina clostridial modificada con una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial natural, p. ej., una neurona motora. Uno modo de conseguir esta capacidad alterada es mediante la sustitución del dominio diana endógeno de una toxina clostridial natural con un dominio diana de otra molécula que se una selectivamente con un receptor diferente presente sobre la superficie de una célula diana de toxina clostridial natural. Tal modificación realizada en un dominio diana da como resultado una toxina modificada que es capaz de unirse selectivamente a un receptor de toxinas no clostridiales (receptor diana) presente en una célula diana de toxina clostridial. Esta mayor actividad de unión por una célula diana de toxina clostridial natural permite la administración de dosis menos eficaces de una toxina clostridial modificada a un individuo, porque se enviará más toxina a la célula diana. De este modo, las toxinas clostridiales modificadas con una mayor actividad de unión reducirán la dispersión no deseada de la toxina hacia zonas a las que no se dirige el tratamiento, reduciendo o previniendo así los efectos secundarios no deseados asociados a la difusión de una toxina clostridial en una ubicación no deseada. En, p. ej., Lance E. Steward y col., “Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells”, publicación de patente internacional n.° 2006/009831 (14 de marzo de 2005); Lance E. Steward y col., “Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use”, solicitud de patente estadounidense n.° 11/376.696 (15 de marzo de 2006); y Lance E. Steward, “Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells”, solicitud de patente provisional estadounidense n.° 60/807.062 (11 de julio de 2006), se describen ejemplos no restrictivos de toxinas clostridiales modificadas con una capacidad de unión celular alterada para una célula diana de toxina clostridial; cuyos contenidos se encuentran incorporados en su totalidad en el presente documento por referencia.
Una variante quimérica de toxina clostridial puede ser una toxina clostridial modificada con una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar una célula distinta de una célula diana de toxina clostridial natural, p. ej., una célula distinta de una neurona motora. Estas toxinas modificadas consiguen esta intoxicación usando un receptor diana presente en una célula diana de toxina no clostridial. Esta capacidad redirigida se consigue sustituyendo un dominio diana natural de una toxina clostridial con un dominio diana que presente una actividad de unión selectiva por un receptor de una toxina no clostridial presente en una célula diana de toxina no clostridial. Tales modificaciones realizadas en un dominio diana dan como resultado una toxina modificada que es capaz de unirse selectivamente a un receptor de toxina no clostridial (receptor diana) presente en una célula diana de toxina no clostridial (redirigida). Una toxina clostridial modificada con una actividad alterada dirigida a una célula diana de
toxina no clostridial se puede unir a un receptor diana, translocarse en el citoplasma y ejercer su efecto proteolítico sobre el complejo de SNARE de la célula diana de toxina no clostridial. En, p. ej., Keith A. Foster y col., “Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions”, patente estadounidense n.° 5.989.545 (23 de noviembre de 1999); Clifford C. Shone y col., “Recombinant Toxin Fragments”, patente estadounidense n.° 6.461.617 (8 de octubre de 2002); Conrad P. Quinn y col., ”Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion”, patente estadounidense n.° 6.632.440 (14 de octubre de 2003); Lance E. Steward y col., “Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis”, patente estadounidense n.° 6.843.998 (18 de enero de 2005); Stephan Donovan, “Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain”, publicación de patente estadounidense n.° 2002/0037833 (28 de marzo de 2002); Keith A. Foster y col., “Inhibition of Secretion from Nonneural Cells”, publicación de patente estadounidense n.° 2003/0180289 (25 de septiembre de 2003); J. Oliver Dolly y col., “Activatable Recombinant Neurotoxins”, WO 2001 /014570 (1 de marzo de 2001); Keith A. Foster y col., “Retargeted Toxin Conjugates”, publicación de patente internacional n.° WO 2005/023309 (17 de marzo de 2005); Lance E. Steward y col., “Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use”, publicación de patente estadounidense n.° 11/376.696 (15 de marzo de 2006); y Lance E. Steward, “Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Capabilities for Non-Clostridial Toxin Target Cells”, publicación de patente provisional estadounidense n.° 60/807.059, (11 de julio de 2006), se describen ejemplos no restrictivos de toxinas clostridiales modificadas con una actividad alterada dirigida a una célula diana de toxina no clostridial; cuyos contenidos se encuentran incorporados en su totalidad en el presente documento por referencia. La capacidad de redirigir los efectos terapéuticos asociados a toxinas clostridiales ha aumentado enormemente el número de aplicaciones médicas capaces de usar una terapia con toxinas clostridiales. Como ejemplo no restrictivo, las toxinas clostridiales modificadas redirigidas a neuronas sensoriales son útiles en el tratamiento de diversos tipos de dolor crónico, tales como, p. ej., hiperalgesia y alodinia, dolor neuropático y dolor inflamatorio, véase, p. ej., Foster, supra, (1999); y Donovan, supra, (2002); y Stephan Donovan, “Method For Treating Neurogenic Inflammation Pain with Botulinum Toxin and Substance P Components”, patente estadounidense n.° 7.022.329 (4 de abril de 2006). Como otro ejemplo no restrictivo, las toxinas clostridiales modificadas redirigidas a células pancreáticas son útiles en el tratamiento de la pancreatitis, Véase, p. ej.: Steward, supra, (2005).
De este modo, en una realización, una variante quimérica de toxina clostridial puede comprender una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria, en la que el dominio de unión comprende una mayor actividad de unión celular capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial natural. En otra realización, una variante quimérica de toxina clostridial puede comprender una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria, en la que el dominio de unión comprende una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial natural. En otra realización más, una variante quimérica de toxina clostridial puede comprender una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria, en la que el dominio de unión comprende una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar una célula diana de toxina clostridial no natural.
También se prevé que cualquiera de una variedad de fragmentos de toxinas clostridiales pueda ser útil en aspectos de la presente invención con la condición de que estos fragmentos activos puedan ejecutar el mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. De este modo, los aspectos de esta realización pueden incluir fragmentos de toxinas clostridiales que tengan una longitud de, p. ej., al menos 300 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos, al menos 500 aminoácidos, al menos 600 aminoácidos, al menos 700 aminoácidos, al menos 800 aminoácidos, al menos 900 aminoácidos, al menos 1.000 aminoácidos, al menos 1.100 aminoácidos y al menos 1.200 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir fragmentos de toxinas clostridiales que tengan una longitud de, p. ej., como máximo 300 aminoácidos, como máximo 400 aminoácidos, como máximo 500 aminoácidos, como máximo 600 aminoácidos, como máximo 700 aminoácidos, como máximo 800 aminoácidos, como máximo 900 aminoácidos, como máximo 1.000 aminoácidos, como máximo 1.100 aminoácidos y como máximo 1.200 aminoácidos.
También se prevé que cualquiera de una variedad de fragmentos de toxinas clostridiales que comprendan la cadena ligera puede ser útil en aspectos de la presente invención con la condición de que estos fragmentos de cadenas ligeras puedan dirigirse específicamente a los componentes del núcleo del aparato de liberación de neurotransmisores y participar así en la ejecución del mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las cadenas ligeras de toxinas clostridiales son de una longitud de aproximadamente 420-460 aminoácidos y comprenden un dominio enzimático (Tabla 1). La investigación ha demostrado que no es necesaria toda la longitud de una cadena ligera de toxina clostridial para la actividad enzimática del dominio enzimático. Como ejemplo no restrictivo, no se requieren los ocho primeros aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A (residuos 1-8 de la SEQ ID NO: 1) para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no restrictivo, no se requieren los ocho primeros aminoácidos de la cadena ligera de TeNT (residuos 1-8 de la SEQ ID NO: 8) para la actividad enzimática. Asimismo, el terminal carboxilo de la cadena ligera no es necesario para la actividad. Como ejemplo no restrictivo, no se requieren los 32 últimos aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A (residuos 417-448 de la SEQ ID NO: 1) para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no restrictivo, no se requieren los 31 últimos aminoácidos de la cadena ligera de TeNT (residuos 427-457 de la SEQ ID NO: 8) para la actividad enzimática. De este modo, los aspectos de esta realización pueden incluir cadenas ligeras de toxinas clostridiales que comprendan un dominio enzimático que tenga una longitud de, p. ej., al menos 350 aminoácidos, al menos 375 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos, al menos 425 aminoácidos y al menos 450 aminoácidos. Otros
aspectos de esta realización pueden incluir cadenas ligeras de toxinas clostridiales que comprendan un dominio enzimático que tenga una longitud de, p. ej., como máximo 350 aminoácidos, como máximo 375 aminoácidos, como máximo 400 aminoácidos, como máximo 425 aminoácidos y como máximo 450 aminoácidos.
También se prevé que cualquiera de una variedad de regiones Hn de toxinas clostridiales que comprendan un dominio de translocación puede ser útil en aspectos de la presente invención con la condición de que estos fragmentos activos puedan facilitar la liberación de LC de las vesículas intracelulares en el citoplasma de la célula diana y participar así en la ejecución del mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las regiones Hn de las cadenas pesadas de toxinas clostridiales son de una longitud de aproximadamente 410-430 aminoácidos y comprenden un dominio de translocación (Tabla 1). La investigación ha demostrado que no es necesaria toda la longitud de una región Hn de una cadena pesada de toxina clostridial para la actividad de translocación del dominio de translocación. De este modo, los aspectos de esta realización pueden incluir regiones Hn de toxinas clostridiales que comprendan un dominio de translocación que tenga una longitud de, p. ej., al menos 350 aminoácidos, al menos 375 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos y al menos 425 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir regiones Hn de toxinas clostridiales que comprendan un dominio de translocación que tenga una longitud de, p. ej., como máximo 350 aminoácidos, como máximo 375 aminoácidos, como máximo 400 aminoácidos y como máximo 425 aminoácidos.
También se prevé que cualquiera de una variedad de regiones He de toxinas clostridiales que comprendan un dominio de unión puede ser útil en aspectos de la presente invención con la condición de que estos fragmentos activos puedan determinar la actividad de unión y la especificidad de unión de la toxina con el complejo receptor ubicado en la superficie de la célula diana y ejecutar el mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las regiones He de las cadenas pesadas de toxinas clostridiales son de una longitud de aproximadamente 400-440 aminoácidos y comprenden un dominio de unión (Tabla 1). La investigación ha demostrado que no es necesaria toda la longitud de una región He de una cadena pesada de toxina clostridial para la actividad de unión del dominio de unión. De este modo, los aspectos de esta realización pueden incluir regiones He de toxinas clostridiales que comprendan un dominio de unión que tenga una longitud de, p. ej., al menos 350 aminoácidos, al menos 375 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos y al menos 425 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir regiones He de toxinas clostridiales que comprendan un dominio de unión que tenga una longitud de, p. ej., como máximo 350 aminoácidos, como máximo 375 aminoácidos, como máximo 400 aminoácidos y como máximo 425 aminoácidos.
De este modo, en una realización, una toxina clostridial comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio de translocación de toxina clostridial y un dominio de unión de toxina clostridial. En un aspecto de esta realización, una toxina clostridial comprende una variante natural de toxina clostridial, tal como, p. ej., una isoforma de toxina clostridial o un subtipo de toxina clostridial. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial comprende una variante de toxina clostridial no natural, tal como, p. ej., una variante conservadora de toxina clostridial, una variante no conservadora de toxina clostridial o un fragmento activo de toxina clostridial, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial comprende un dominio enzimático de toxina clostridial o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de toxina clostridial o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de toxina clostridial o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos. En otros aspectos de esta realización, una toxina clostridial puede comprender una BoNT/A, una BoNT/B, una BoNT/C1, una BoNT/D, una BoNT/E, una BoNT/F, una BoNT/G o una TeNT.
En otra realización, una toxina clostridial comprende una BoNT/A. En un aspecto de esta realización, una BoNT/A comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/A y un dominio de unión de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/A comprende la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/A comprende una variante natural de BoNT/A, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/A o un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/A comprende una variante natural de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1 o un subtipo de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/A comprende una variante no natural de BoNT/A, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/A, una variante no conservadora de BoNT/A o un fragmento activo de BoNT/A, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/A comprende una variante no natural de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, una variante no conservadora de BoNT/A de SEQ ID NO: 1 o un fragmento activo de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/A comprende un dominio enzimático de BoNT/A o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/A o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/A o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/A comprende un dominio enzimático de BoNT/A de los aminoácidos 1-448 de SEQ ID NO: 1 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/A de los aminoácidos 449-871 de la SEQ ID NO: 1 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/A de los aminoácidos 872-1296 de la SEQ ID NO: 1 o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75%
con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 1 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 1 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 1.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40 , 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1.
En otra realización, una toxina clostridial comprende una BoNT/B. En un aspecto de esta realización, una BoNT/B comprende un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/B y un dominio de unión de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/B comprende la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/B comprende una variante natural de BoNT/B, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/B o un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/B comprende una variante natural de BoNT/B de la SEQ ID NO: 2, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/B de la SEQ ID NO: 2 o un subtipo de BoNT/B de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/B comprende una variante no natural de BoNT/B, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/B, una variante no conservadora de BoNT/B o un fragmento activo de BoNt /B, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/B comprende una variante no natural de BoNT/B de la SEQ ID NO: 2, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/B de SEQ ID NO: 2, una variante no conservadora de BoNT/B de SEQ ID NO: 2 o un fragmento activo de BoNT/B de SEQ ID NO: 2, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/B comprende un dominio enzimático de BoNT/B o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/B o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/B o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/B comprende un dominio enzimático de BoNT/B de los aminoácidos 1-441 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/B de los aminoácidos 442-858 de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/B de los aminoácidos 859-1291 de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 2 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los
aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 2 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 2.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40 , 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2.
En otra realización, una toxina clostridial comprende una BoNT/C1. En un aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende un dominio enzimático de BoNT/C1, un dominio de translocación de BoNT/C1 y un dominio de unión de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende la SEQ ID NO: 3. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante natural de BoNT/C1, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/C1 o un subtipo de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante natural de BoNT/c 1 de SEQ ID NO: 3, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 3 o un subtipo de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 3. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante natural de BoNT/C1, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/C1, una variante no conservadora de BoNT/C1 o un fragmento activo de BoNT/C1, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/C1 comprende una variante no natural de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 3, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 3, una variante no conservadora de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 3 o un fragmento activo de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 3, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/C1 comprende un dominio enzimático de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/C1 comprende un dominio enzimático de BoNT/C1 de los aminoácidos 1-449 de la SEQ ID NO: 3 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/C1 de los aminoácidos 450-866 de la SEQ ID NO: 3 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/C1 de los aminoácidos 867-1291 de la SEQ ID NO: 3 o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 3 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 3 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 3.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3.
En otra realización, una toxina clostridial comprende una BoNT/D. En un aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/D y un dominio de unión de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende la SEQ ID NO: 4. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende una variante natural de BoNT/D, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/D o un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/D comprende una variante natural de BoNT/D de la s Eq ID NO: 4, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/D de la SEQ ID NO: 4 o un subtipo de BoNT/D de la SEQ ID NO: 4. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D comprende una variante no natural de BoNT/D, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/D, una variante no conservadora de BoNT/D o un fragmento activo de BoNt /D, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D comprende una variante no natural de BoNT/D de la SEQ ID NO: 4, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/D de SEQ ID NO: 4, una variante no conservadora de BoNT/D de SEQ ID NO: 4 o un fragmento activo de BoNT/D de SEQ ID NO: 4, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D comprende un dominio enzimático de BoNT/D o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/D o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/D o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D comprende un dominio enzimático de BoNT/D de los aminoácidos 1-445 de SEQ ID NO: 4 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/D de los aminoácidos 446-862 de la SEQ ID NO: 4 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/D de los aminoácidos 863-1276 de la SEQ ID NO: 4 o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 4 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 4 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 4.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100,
200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40 , 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4.
En otra realización, una toxina clostridial comprende una BoNT/E. En un aspecto de esta realización, una BoNT/E comprende un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/E y un dominio de unión de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/E comprende la SEQ ID NO: 5. En otro aspecto de esta realización, una BoNt /E comprende una variante natural de BoNT/E, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/E o un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/E comprende una variante natural de BoNT/E de la SEQ ID NO: 5, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/E de la SEQ ID NO: 5 o un subtipo de BoNT/E de la SEQ ID NO: 5. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E comprende una variante no natural de BoNT/E, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/E, una variante no conservadora de BoNT/E o un fragmento activo de BoNt /E, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E comprende una variante no natural de BoNT/E de la SEQ ID NO: 5, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/E de SEQ ID NO: 5, una variante no conservadora de BoNT/E de SEQ ID NO: 5 o un fragmento activo de BoNT/E de SEQ ID NO: 5, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E comprende un dominio enzimático de BoNT/E o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/E o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/E o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E comprende un dominio enzimático de BoNT/E de los aminoácidos 1-422 de SEQ ID NO: 5 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/E de los aminoácidos 423-845 de la SEQ ID NO: 5 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/E de los aminoácidos 846-1252 de la SEQ ID NO: 5 o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 5 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 5 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 5.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido
que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40 , 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5.
En otra realización, una toxina clostridial comprende una BoNT/F. En un aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/F y un dominio de unión de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende una variante natural de BoNT/F, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/F o un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/F comprende una variante natural de BoNT/F de la SEQ ID NO: 6, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/F de la SEQ ID NO: 6 o un subtipo de BoNT/F de la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/F comprende una variante no natural de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/F, una variante no conservadora de BoNT/F o un fragmento activo de BoNt /F, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/F comprende una variante no natural de BoNT/F de la SEQ ID NO: 6, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/F de SEQ ID NO: 6, una variante no conservadora de BoNT/F de SEQ ID NO: 6 o un fragmento activo de BoNT/F de SEQ ID NO: 6, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/F comprende un dominio enzimático de BoNT/F o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/F o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/F o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/F comprende un dominio enzimático de BoNT/E de los aminoácidos 1-439 de SEQ ID NO: 6 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/F de los aminoácidos 440-864 de la SEQ ID NO: 6 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/F de los aminoácidos 865-1274 de la SEQ ID NO: 6 o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 6 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 6 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 6.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la
SEQ ID NO: 6. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40 , 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6.
En otra realización, una toxina clostridial comprende una BoNT/G. En un aspecto de esta realización, una BoNT/G comprende un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio de translocación de BoNT/G y un dominio de unión de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/G comprende la SEQ ID NO: 7. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/G comprende una variante natural de BoNT/G, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/G o un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, una BoNT/G comprende una variante natural de BoNT/G de la s Eq ID NO: 7, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/G de la SEQ ID NO: 7 o un subtipo de BoNT/G de la SEQ ID NO: 7. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/G comprende una variante no natural de BoNT/G, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/G, una variante no conservadora de BoNT/G o un fragmento activo de BoNt /G, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/G comprende una variante no natural de BoNT/G de la SEQ ID NO: 7, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/G de SEQ ID NO: 7, una variante no conservadora de BoNT/G de SEQ ID NO: 7 o un fragmento activo de BoNT/G de SEQ ID NO: 7, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/G comprende un dominio enzimático de BoNT/G o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/G o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/G o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/G comprende un dominio enzimático de BoNT/G de los aminoácidos 1-446 de SEQ ID NO: 7 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/G de los aminoácidos 447-863 de la SEQ ID NO: 7 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/G de los aminoácidos 864-1297 de la SEQ ID NO: 7 o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 7 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 7 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 7.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40 , 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7.
En otros aspectos de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos más de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos de esta realización, una BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7.
En otra realización, una toxina clostridial comprende una TeNT. En un aspecto de esta realización, una TeNT comprende un dominio enzimático de TeNT, un dominio de translocación de TeNT y un dominio de unión de TeNT. En un aspecto de esta realización, una TeNT comprende la SEQ ID NO: 8. En otro aspecto de esta realización, una TeNT comprende una variante natural de TeNT, tal como, p. ej., una isoforma de TeNT o un subtipo de TeNT. En otro aspecto de esta realización, una TeNT comprende una variante natural de TeNT de la SEQ ID NO: 8, tal como, p. ej., una isoforma de TeNT de la SEQ ID NO: 8 o un subtipo de TeNT de la SEQ ID NO: 8. En otro aspecto más de esta realización, una TeNT comprende una variante no natural de TeNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de TeNT, una variante no conservadora de TeNT o un fragmento activo de TeNT, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una TeNT comprende una variante no natural de TeNT, de la SEQ ID NO: 8, tal como, p. ej., una variante conservadora de TeNT de la SEQ ID NO: 8, una variante no conservadora de TeNT de la SEQ ID NO: 8 o un fragmento activo de TeNT de la SEQ ID NO: 8, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una TeNT comprende un dominio enzimático de TeNT o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de TeNT o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de TeNT o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una TeNT comprende un dominio enzimático de TeNT de los aminoácidos 1-457 de SEQ ID NO: 8 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de TeNT de los aminoácidos 458-879 de la SEQ ID NO: 8 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de TeNT de los aminoácidos 880-1315 de la SEQ ID NO: 8 o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 8 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 8 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 8.
En otros aspectos de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40 , 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8.
En otros aspectos de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de
esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50,100, 200, 500 o 8 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos de esta realización, una TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8.
Los aspectos de la presente invención proporcionan, en parte, un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial. Como se usa en la presente memoria, la expresión “sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial” significa un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para que una toxina clostridial produzca una proteolisis detectable en el enlace escindible en condiciones adecuadas para una actividad proteasa de la toxina clostridial. Por definición, un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial es susceptible a la escisión por parte de al menos una toxina clostridial en condiciones adecuadas para la actividad proteasa de la toxina clostridial. Se prevé que un sitio de escisión del sustrato de toxina clostridial de cualquiera y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de la presente invención con la condición de que el sitio de escisión del sustrato de toxina clostridial pueda ser escindido por una toxina clostridial y deriva de fragmentos autocatalíticos de las propias toxinas clostridiales. De este modo, en aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial puede ser, p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una longitud de al menos 7 aminoácidos, una longitud de al menos 8 aminoácidos, una longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud de al menos 10 aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos, una longitud de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos 25 aminoácidos, una longitud de al menos 30 aminoácidos, una longitud de al menos 40 aminoácidos, una longitud de al menos 50 aminoácidos o una longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial puede ser p. ej., de una longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como máximo 8 aminoácidos, de una longitud de como máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de como máximo 10 aminoácidos, de una longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como máximo 30 aminoácidos, de una longitud de como máximo 40 aminoácidos, de una longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una longitud de como máximo 60 aminoácidos.
Un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial útil en los aspectos de la invención incluye, sin limitación, un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial natural; variantes naturales de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial; y variantes no naturales de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, tales como, p. ej., variantes conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, variantes no conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial y peptidomiméticos de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial. Como se usa en la presente memoria, la expresión “variante de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial”, bien sea natural o no natural, significa un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial que tiene al menos un cambio de un aminoácido de la región correspondiente de las secuencias de referencia reveladas, y se puede describir en porcentaje de identidad con la región correspondiente de esa secuencia de referencia. Se puede usar cualquiera de una variedad de procedimientos de alineación de secuencias para determinar el porcentaje de identidad, incluyendo, sin limitación, procedimientos globales, procedimientos locales y procedimientos híbridos, tales como, p. ej., los procedimientos de aproximación de segmentos. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos rutinarios al alcance de cualquier experto en la técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la presente memoria.
Como se usa en la presente memoria, la expresión “variante natural de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial” significa cualquier sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial producido sin la ayuda de manipulación humana, incluyendo, sin limitación, las isoformas de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial producidas a partir de transcriptos cortados y empalmados alternativamente, las isoformas de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial producidas mediante mutación espontánea y los subtipos de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial.
Como se usa en la presente memoria, la expresión “variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial” significa cualquier sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial producido con la ayuda de manipulación humana; incluyendo, sin limitación, las variantes de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial producidas mediante ingeniería genética usando mutagénesis aleatoria o un diseño racional y las variantes de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial producidas mediante síntesis química. Los ejemplos no restrictivos de variantes naturales de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales incluyen, p. ej., variantes conservadoras de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales, variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales y peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales.
Como se usa en la presente memoria, la expresión “variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de
toxina clostridial” significa un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia. Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, un tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilidad, lipofilidad, capacidad de unión covalente, capacidad de unión mediante enlaces de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica, y similares, o cualquier combinación de las mismas. Una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial puede funcionar de una manera sustancialmente similar al sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante conservadora del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial, y se puede sustituir por el sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente invención. Una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial puede sustituir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos o cinco o más aminoácidos del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante conservadora del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial. Una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial también puede poseer una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%, una identidad de los aminoácidos del 65%, una identidad de los aminoácidos del 75%, una identidad de los aminoácidos del 85% o una identidad de los aminoácidos del 95% con el sitio de escisión del sustrato de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante conservadora del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial. Los ejemplos no restrictivos de una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, variantes conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, variantes conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, variantes conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, variantes conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, variantes conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, variantes conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, variantes conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de TeNT, variantes conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de BaNT y variantes conservadoras de un sitio de escisión de sustrato de BuNT.
Como se usa en la presente memoria, la expresión “variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial” significa un sitio de escisión de sustrato de una toxina clostridial en el que 1) al menos un aminoácido está eliminado del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial; 2) al menos un aminoácido está añadido al sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia en el que se basa el sitio de escisión no conservador del sustrato de la toxina clostridial; o 3) al menos un aminoácido está sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que no comparte ninguna propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia (Tabla 3). Una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial puede funcionar de una manera sustancialmente similar al sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia en el que se basa el sitio de escisión no conservador del sustrato de la toxina clostridial, y se puede sustituir por el sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente invención. Una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial puede añadir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos y diez o más aminoácidos al sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial. Un sitio de escisión no conservador de sustrato de toxina clostridial puede sustituir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, o cinco o más aminoácidos del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial. Una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial también puede poseer una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%, una identidad de los aminoácidos del 65%, una identidad de los aminoácidos del 75%, una identidad de los aminoácidos del 85% o una identidad de los aminoácidos del 95% con el sitio de escisión del sustrato de toxina clostridial de referencia en el que se basa la variante no conservadora del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial. Los ejemplos no restrictivos de una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial incluyen, p. ej., variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de BoNT/A, variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de BoNT/B, variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de BoNT/C1, variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de no BoNT/D, variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de BoNT/E, variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de BoNT/F, variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de BoNT/G, variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de TeNT, variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de BaNT y variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de BuNT.
Como se usa en la presente memoria, la expresión “peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial” significa un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por un oligómero no natural que tiene al menos una propiedad similar a la del primer aminoácido. Los ejemplos de las propiedades incluyen, sin limitación, la topografía de un elemento estructural primario peptídico, la funcionalidad de un elemento estructural primario peptídico, la topología de un elemento estructural secundario peptídico, la funcionalidad de un elemento estructural secundario peptídico, y similares, o cualquier combinación de las mismas. Un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial puede funcionar de una manera sustancialmente similar al sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia en el que se basa el
peptidomimético del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial, y se puede sustituir por el sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente invención. Un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial puede sustituir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos o cinco o más aminoácidos del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial de referencia en el que se basa el peptidomimético del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial. Un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial también puede poseer una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50%, una identidad de los aminoácidos del 65%, una identidad de los aminoácidos del 75%, una identidad de los aminoácidos del 85% o una identidad de los aminoácidos del 95% con el sitio de escisión del sustrato de toxina clostridial de referencia en el que se basa el peptidomimético del sitio de escisión del sustrato de la toxina clostridial. Para consultar ejemplos de procedimientos con peptidomimético, véase, p. ej.: Amy S. Ripka y Daniel H. Rich, “Peptidomimetic design”, 2(4) CURR. OPIN. CHEM. BIOL. 441-452 (1998); y M. Angels Estiarte y Daniel H. Rich, “Peptidomimetics for Drug Design”, 803-861 (BURGER'S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY, Vol. 1 PRINCIPLE AND PRACTICE, Donald J. Abraham ed., Wiley-Interscience, VI edición 2Q03). Los ejemplos no restrictivos de una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial incluyen, p. ej., peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/A, peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/B, peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/C1, peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/D, peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/E, peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/F, peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BoNT/G, peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de TeNT, peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BaNT y peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de BuNT.
Un tipo de sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial deriva de dianas de sustratos in vivo de toxinas clostridiales, tales como, p. ej., las proteínas SNARE. Las dianas de SNARE naturales de las toxinas clostridiales incluyen, sin limitación, la familia de la SNAP-25, la familia de la VAMP y la familia de la sintaxina. La SNAP-25 y la sintaxina están asociadas a la membrana plasmática, mientras que la VAMP está asociada a la membrana de la vesícula sináptica (véase, la FIG. 3). BoNT/A y BoNT/E reconocen y escinden específicamente a la SNAP-25 en dos sitios diferentes de la parte carboxi-terminal de la proteína (Tabla 2). TeNT y BoNt /B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G se dirigen específicamente a la parte central conservada de las VAMP (también conocidas como sinaptobrevina) en distintos enlaces en función de la toxina (Tabla 3). BoNT/C1 escinde la sintaxina en un único sitio cerca de la superficie de la membrana citosólica, además de la SNAP-25 cerca del terminal carboxilo (Tablas 2 y 4). Las tres dianas proteicas de estas toxinas clostridiales son conservadas de la levadura a los seres humanos, aunque los sitios de escisión y la susceptibilidad a las toxinas no son necesariamente conservados, véase más adelante; véase también Humeau, supra, (2000); Heiner Niemann y col., “Clostridial Neurotoxins: New Tools for Dissecting Exocytosis”, 4(5) Trends Cell Biol. 179-185 (1994); y Rossella Pellizzari y col., “Tetanus and Botulinum Neurotoxins: Mechanism of Action and Therapeutic Uses”, 354(1381) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 259-268 (1999).
La SNAP-25 natural, una proteína de aproximadamente 206 residuos que carece de un segmento transmembrana, está asociada a la superficie citosólica del plasmalema nervioso (véase la FIG. 3). La SNAP-25 es necesaria para el crecimiento axonal durante el desarrollo y puede ser necesaria para la plasticidad terminal nerviosa del sistema nervioso maduro. La SNAP-25 ha sido aislada de una variedad de especies de vertebrados e invertebrados, incluyendo, p. ej., las especies pertenecientes a los géneros Homo, Macaca, Bos, Rattus, Mus, Gallus, Carassius, Danio, Torpedo, Xenopus, Strongylocentrotus, Drosophila, Hirudo, Loligo, Lymnaea y Caenorhabditis (Tabla 2). En seres humanos, se expresan al menos dos isoformas diferencialmente durante el desarrollo; la isoforma a se expresa constitutivamente durante el desarrollo fetal, mientras que la isoforma b aparece en el nacimiento y predomina en la vida adulta. Los análogos de SNAP-25, tales como SNAP-23, también se expresan fuera del sistema nervioso, por ejemplo, en las células pancreáticas.
Tabla 2: Escisión de SNAP-25 y proteínas relacionadas. Primate: residuos de la SNAP-25A humana 163-206 de la SEQ ID NO: 9; residuos de la SNAP-25B humana 163-206 de la SEQ ID NO: 10; residuos de la SNAP-23A humana 169-211 de la SEQ ID NO: 11; residuos de la SNAP-23B humana 116-158 de la SEQ ID NO: 12; residuos de la SNAP-25B de mono 163-206 de la SEQ ID NO: 13; Roedor: residuos de la SNAP-25A de rata 163-206 de la SEQ ID NO: 14; Residuos de la SNAP-25B de rata 163-206 de la SEQ ID NO: 15; residuos de la SNAP-25B de ratón 163-206 de la SEQ ID NO: 16; Residuos de la SNAP-23 de rata 168-210 de la SEQ ID NO: 17; residuos de la SNAP-23 de ratón 168-210 de la SEQ ID NO: 18; Ave: residuos de la SNAP-25B de pollo 163-206 de la SEQ ID NO: 19; Pez: Residuos de la SNAP-25A de pez rojo 161-204 de la SEQ ID NO: 20; residuos de la SNAP-25B de pez rojo 160-203 de la SEQ ID NO: 21; residuos de la SNAP-25A de pez cebra 161-204 de la SEQ ID NO: 22; residuos de la SNAP-25B de pez cebra 160-203 de la SEQ ID NO: 23; residuos de la SNAP-23 de pez cebra 174 214 de la SEQ ID NO: 24; Raya: residuos de la SNAP-25 de raya eléctrica de mármol 170-210 de la SEQ ID NO: 25; Anfibio: residuos de la SNAP-25A de rana 163-206 de la SEQ ID NO: 26; residuos de la SNAP-25B de rana 163-206 de la SEQ ID NO: 27; residuos de la SNAP-23 de rana 163-204 de la SEQ ID NO: 28; residuos de la SNAP-25 de erizo de mar 169-212 de la SEQ ID NO: 29; Insecto: residuos de la SNAP-25 de mosca de la fruta 171-212 de la SEQ ID NO: 30; residuos de la SNAP-24 de mosca de la fruta 170-212 de la SEQ ID NO: 31; Gusano segmentado: residuos de la SNAP-25 de sanguijuela 170-212 de la SEQ ID NO: 32; Cefalópodo: residuos de la SNAP-25 de calamar 245-267 de la SEQ ID NO: 33;. Gastrópodo: residuos de la SNAP-25 de caracol de laguna 244-266 de la SEQ ID NO: 34; Gusano redondo: residuos de la SNAP-25 de gusano nematodo 165-207 de la SEQ ID NO: 35.
La VAMP natural es una proteína de aproximadamente 120 residuos con una longitud exacta que depende de la especie y de la isoforma. Como se muestra en la FIG. 3, la VAMP contiene un segmento carboxi-terminal corto dentro del lumen vesicular, mientras que la mayoría de la molécula está expuesta al citosol. Los treinta residuos amino-terminales ricos en prolina son divergentes entre las especies y las isoformas, mientras que la parte central de la VAMP, que es rica en residuos cargados e hidrófilos e incluye sitios de escisión conocidos, está muy conservada (Tabla 3). La VAMP se ubica junto con la sinaptofisina en las membranas de la vesícula sináptica. La VAMP ha sido aislada de una variedad de especies de vertebrados e invertebrados, incluyendo, p. ej., las especies pertenecientes a los géneros Homo, Macaca, Bos, Rattus, Mus, Gallus, Carassius, Danio, Torpedo, Xenopus, Strongylocentrotus, Drosophila, Hirudo, Loligo, Lymnaea, Aplysia y Caenorhabditis. Además, se han identificado múltiples isoformas de VAMP incluyendo VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina, y se han identificado formas no sensibles a la escisión por toxinas en células no neuronales. La VAMP parece estar presente en todos los tejidos de vertebrados, aunque la distribución de la VAMP-1 y la VAMP-2 varían en diferentes tipos de células. La VAMp- 1 de pollo y de rata no es escindida por la TeNT ni por la BoNT/B. Estos ortólogos de VAMP-1 tienen una valina en lugar de la glutamina presente en la VAMP-1 humana y murina en el sitio de escisión de TeNT o BoNT/B. La sustitución no afecta a BoNT/D, /F o /G, que escinden tanto a VAMP-1 como a VAMP-2 con velocidades similares.
Tabla 3: Escisión de VAMP y proteínas relacionadas. Primate: residuos de la VAMP-1-1 humana 49-92 de la SEQ ID NO: 36; residuos de la VAMP-1-2 humana 49-92 de la SEQ ID NO: 37; residuos de la VAMP-1-3 humana 49-92 de la SEQ ID NO: 38; residuos de la VAMP-2 humana 47-90 de la SEQ ID NO: 39; residuos de la VAMP-2 de mono 47-90 de la SEQ ID NO: 40; residuos de la VAMP- 3/celubrevina humana 30-73 de la SEQ ID NO: 41; Bovino: residuos de la VAMP-2 de vaca 47-90 de la SEQ ID NO: 42; Roedor: residuos de la VAMP-1 de rata 49-92 de la SEQ ID NO: 43; residuos de la VAMP-1-b de rata 49-92 de la SEQ ID NO: 44; residuos de la VAMP-1 de ratón 49-92 de la SEQ ID NO: 45; residuos de la VAMP-2 de rata 47-90 de la SEQ ID NO: 46; residuos de la VAMP-2-b de rata 47-90 de la SEQ ID NO: 47; residuos de la VAMP-2 de ratón 47-90 de la SEQ ID NO: 48; residuos de la VAMP-3/celubrevina de rata 34-77 de la SEQ ID NO: 49; residuos de la VAMP-3/celubrevina de ratón 34-77 de la SEQ ID NO: 50; Ave: residuos de la VAMP-1 de pollo 190-233 de la SEQ ID NO: 51; residuos de la VAMP-2 de pollo 47-88 de la SEQ ID NO: 52; residuos de la VAMP-3/celubrevina de pollo 34-77 de la SEQ ID NO: 53; Pez: residuos de la VAMP-1 de pez cebra 50-93 de la SEQ ID NO: 54; residuos de la VAMP-2 de pez cebra 41-84 de la SEQ ID NO: 55; residuos de la VAMP-3 de pez cebra 33-60 de la SEQ ID NO: 56; Raya: residuos de la VAMP-1 de raya eléctrica de mármol 51-94 de la SEQ ID NO: 57; Anfibio: residuos de la VAMP-2 de rana 45-88 de la SEQ ID NO: 58; residuos de la VAMP-3 de rana 32-75 de la SEQ ID NO: 59; residuos de la VAMP de erizo de mar 31-74 de la SEQ ID NO: 60; Insecto: residuos de la SinA1 de mosca de la fruta 40-83 de la SEQ ID NO: 61; residuos de la SinA2 de mosca de la fruta 63-106 de la SEQ ID NO: 62; residuos de la SinB1 de mosca de la fruta 63-106 de la SEQ ID NO: 63; residuos de la SinB2 de mosca de la fruta 63-106 de la SEQ ID NO: 64; residuos de la SinC de mosca de la fruta 57-100 de la SEQ ID NO: 65; residuos de la SinD de mosca de la fruta 66 109 de la SEQ ID NO: 66; residuos de la SinE mosca de la fruta 57-100 de la SEQ ID NO: 67; Gusano segmentado: residuos de la VAMP de sanguijuela 45-88 de la SEQ ID NO: 68; Cefalópodo: residuos de la VAMP de calamar 56 99 de la SEQ ID NO: 69; Gastrópodo: residuos de la VAMP de caracol de laguna 49-92 de la SEQ ID NO: 70; residuos de la VAMP de babosa de mar 37-80 de la SEQ ID NO: 71; Gusano redondo: residuos de la SNB1 de gusano nematodo 72-115 de la SEQ ID NO: 72; residuos de tipo SNB de gusano nematodo 82-115 de la SEQ ID NO: 73.
La sintaxina natural se ubica en la superficie citosólica del plasmalema nervioso y está anclada a la membrana mediante un segmento carboxi-terminal, estando la mayoría de la proteína expuesta al citosol (véase la FIG. 3). La sintaxina se ubica junto con los canales del calcio en las zonas activas de la membrana presináptica, en la que tiene lugar la liberación de los neurotransmisores. Además, la sintaxina interactúa con la sinaptotagmina, una proteína de la membrana de las vesículas SSV que forma un puente funcional entre el plasmalema y las vesículas. La sintaxina ha sido aislada de una variedad de especies de vertebrados e invertebrados, incluyendo, p. ej., las especies pertenecientes a los géneros Homo, Bos, Rattus, Mus, Gallus, Danio, Strongylocentrotus, Drosophila, Hirudo, Loligo, Lymnaea y Aplysia (Tabla 4). Se han identificado tres isoformas de una longitud ligeramente diferente (285 y 288 residuos) en células nerviosas (isoformas 1A, 1B1 y 1B2), siendo las isoformas 2, 3, 4 y 5 expresadas en otros tejidos. Las diferentes isoformas tienen sensibilidades variables a BoNT/C1, siendo las isoformas de sintaxina 1 A, 1 B1, 1B2, 2 y 3 escindidas por esta toxina.
(continuación)
Tabla 4: Escisión de la sintaxina y proteínas relacionadas. Primate: residuos de la Sintaxina1A humana 242-264 de la SEQ ID NO: 74; residuos de la Sintaxina1B1 humana 241-263 de la SEQ ID NO: 75; residuos de la Sintaxina1B2 humana 241-263 de la SEQ ID NO: 76; residuos de la Sintaxina2-1 humana 241-263 de la SEQ ID NO: 77; residuos de la Sintaxina2-2 humana 241-263 de la SEQ ID NO: 78; residuos de la Sintaxina2-3 humana 241-263 de la SEQ ID NO: 79; residuos de la Sintaxina3 humana 241-263 de la SEQ ID NO: 80; Bovino: residuos de la Sintaxina1A de vaca 242-264 de la SEQ ID NO: 81; residuos de la Sintaxina1B2 de vaca 241-263 de la SEQ ID NO:82; Roedor: residuos de la Sintaxina1A de rata 242-264 de la SEQ ID NO: 83; residuos de la Sintaxina1B2 de rata 241-263 de la SEQ ID NO: 84; residuos de la Sintaxina1A de ratón 242-264 de la SEQ ID NO: 85; residuos de la Sintaxina1B1 de ratón 241-263 de la SEQ ID NO: 86; residuos de la Sintaxina1B2 de ratón 241-263 de la SEQ ID NO: 87; residuos de la Sintaxina2 de rata 243-265 de la SEQ ID NO: 88; residuos de la Sintaxina2 de ratón 242-264 de la SEQ ID NO: 89; residuos de la Sintaxina3A de rata 241-263 de la SEQ ID NO: 90; residuos de la Sintaxina3A de ratón 241-263 de la SEQ ID NO: 91; residuos de la Sintaxina3B de ratón 241-263 de la SEQ ID NO: 92; residuos de la Sintaxina3C de ratón 223-245 de la SEQ ID NO: 93; Ave: residuos de la Sintaxina1B de pollo 235-257 de la SEQ ID NO: 94; residuos de la Sintaxina2 de pollo 240-262 de la SEQ ID NO: 95; Pez: residuos de la Sintaxina1B de pez cebra 241-263 de la SEQ ID NO: 96; residuos de la Sintaxina3 de pez cebra 239-261 de la SEQ ID NO: 97; residuos de la Sintaxina1B de erizo de mar 241-263 de la SEQ ID NO: 98; Insecto: residuos de la Sintaxina1A de mosca de la fruta 245-267 de la SEQ ID NO: 99; Gusano segmentado: residuos de Sintaxina1A de sanguijuela 248 270 de la SEQ ID NO: 100; Cefalópodo: residuos de la Sintaxina1A de calamar 245-267 de la SEQ ID NO: 101; Gastrópodo: residuos de la Sintaxina1A de caracol de laguna 244-266 de la SEQ ID NO: 102; residuos de la Sintaxina1A de babosa de mar 244-266 de la SEQ ID NO: 103.
continuación
Una amplia variedad de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales son útiles en aspectos de la invención siempre que deriven de fragmentos autocatalíticos de las propias toxinas clostridiales y siendo los sitios de escisión específicos y diferenciados para las diferentes toxinas clostridiales conocidos en la técnica. Como ejemplos de referencia no restrictivos, BoNT/A escinde un enlace Gln-Arg y un enlace Lys-His; BoNT/B y TeNT escinden un enlace Gln-Phe; BoNT/C1 escinde un enlace Lys-Ala o Arg-Ala; BoNT/D escinde un enlace Lys-Leu; BoNT/E escinde un enlace Arg-Ile y un enlace Lys-Ile; BoNT/F escinde un enlace Gln-Lys; y BoNT/G escinde un enlace Ala-Ala (véase la Tabla 5). En la nomenclatura estándar, la secuencia que rodea un sitio de escisión de una toxina clostridial se denomina P5-P 4-P 3-P 2-P 1-P 1 -P 2 -P 3 -P 4 -P 5 ', en la que P1-P 1' representa el enlace escindible. Se entiende que un sitio P1 o P1', o ambos, puede ser sustituido por otro aminoácido o mimético de aminoácido en lugar del residuo natural. Como ejemplo, se han preparado sustratos de BoNT/A en los que la posición P1 (Gln) está modificada para que sea una alanina, ácido 2-aminobutírico o un residuo de asparagina; estos sustratos fueron hidrolizados por BoNT/A en el enlace P1-Arg, véase, p. ej.: James J. Schmidt y Karen A. Bostian, “Endoproteinase Activity of Type A Botulinum Neurotoxin: Substrate Requirements and Activation by Serum Albumin”, 16(1) J. Protein Chem. 19-26 (1997). Aunque se reconoce la posibilidad de introducir sustituciones en la posición P1 del enlace escindible, por ejemplo, un enlace escindible por BoNT/A, se reconoce además que la conservación del residuo de P1' puede ser ventajosa, véase, p. ej., Vadakkanchery V. Vaidyanathan y col., “Proteolysis of SNAP-25 Isoforms by Botulinum Neurotoxin Types A, C, and E: Domains and Amino Acid Residues Controlling the Formation of Enzyme-Substrate Complexes and Cleavage”, 72(1) J. Neurochem. 327-337 (1999).
De este modo, en un aspecto de referencia, un sustrato de toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en el que el residuo P1' no está modificado ni sustituido en comparación con el residuo natural de una proteína diana escindida por la toxina clostridial. En aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en el que el residuo P1' no está modificado ni sustituido en comparación con el residuo natural de una proteína diana escindida por la toxina clostridial puede ser, p. ej., un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de sustrato de TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT o un sitio de escisión de sustrato de BuNT.
En otro aspecto de referencia, un sustrato de toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en el que el residuo P1 está modificado o sustituido en comparación con el residuo natural de una proteína diana escindida por la toxina clostridial; tal sustrato de toxina clostridial conserva la susceptibilidad a la escisión del enlace peptídico entre los residuos P1 y P1'. En aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en el que el residuo P1' está modificado o sustituido en comparación con el residuo natural de una proteína diana escindida por la toxina clostridial puede ser, p. ej., un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de sustrato de TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT o un sitio de escisión de sustrato de BuNT.
En un a sp e c to de re fe re nc ia , una to x in a c lo s trid ia l m o d ifica d a c o m p re n d e un s itio de esc is ión de su s tra to de B oN T/A .
Como se usa en la presente memoria, la expresión “sitio de escisión de sustrato de la toxina botulínica de serotipo A” es sinónimo de “sitio de escisión de sustrato de BoNT/A” y significa un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para que una BoNT/A produzca una proteolisis detectable en el enlace escindible en condiciones adecuadas para una actividad proteasa de la toxina clostridial. Un enlace escindible escindido por BoNT/A puede ser, por ejemplo, Gln-Arg o Lys-His. Se prevé que un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de cualquiera y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de referencia con la condición de que el sitio de escisión del sustrato de BoNT/A pueda ser escindido por BoNT/A. De este modo, en aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A puede ser, p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una longitud de al menos 7 aminoácidos, una longitud de al menos 8 aminoácidos, una longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud de al menos 10 aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos, una longitud de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos 25 aminoácidos, una longitud de al menos 30 aminoácidos, una longitud de al menos 40 aminoácidos, una longitud de al menos 50 aminoácidos o una longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A puede ser p. ej., de una longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como máximo 8 aminoácidos, de una longitud de como máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de como máximo 10 aminoácidos, de una longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como máximo 30 aminoácidos, de una longitud de como máximo 40 aminoácidos, de una longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una longitud de como máximo 60 aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/A útiles en los aspectos de referencia pueden corresponder a un segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/A, o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una proteína sensible a BoNT/A. Como se muestra en la Tabla 2, en la técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a la escisión por BoNT/A, e incluyen, por ejemplo, la SNAP-25A y la SNAP-25B humanas, de rata, de ratón, de Danio y de Carassius; y la SNAP-25 de Torpedo. De este modo, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de SNAP-25A o SNAP-25B humana; SNAP-25A o SNAP-25B bovina; SNAP-25A o SNAP-25B de rata; SNAP-25A o SNAP-25B de ratón; SNAP-25A o SNAP-25B de Xenopus; SNAP-25A o SNAP-25B de Danio; SNAP-25A o SNAP-25B de Carassius; SNAP-25 de Torpedo; SNAP-25 de Strongylocentrotus; SNAP-25 de Loligo; SNAP-25 de Lymnaea; SNAP-25 de Aplysia, isoformas de las mismas, u otra proteína natural sensible a la escisión por BoNT/A. Además, la comparación de las secuencias nativas de aminoácidos de la SNAP-25 escindidas por BoNT/A revela que tales secuencias están absolutamente conservadas (Tabla 2). Este descubrimiento indica que se puede tolerar una variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con respecto a una secuencia de SNAP-25 sensible a la BoNT/A natural en un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A útil en los aspectos de referencia. Se entiende que es posible preparar una secuencia de reconocimiento de BoNT/A similar, si se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u ortólogo de SNAP-25 sensible a BoNT/A, tal como, el sitio de escisión de sustrato de BoNT/A contenido en las proteínas SNAP-25 identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 2.
Además, la manipulación experimental de la secuencia de aminoácidos que comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A escindido por BoNT/A revela que tales secuencias están absolutamente conservadas. Estos resultados indican que es posible sustituir una variedad de residuos de un sitio de escisión de sustrato de toxina BoNT/A en comparación con una secuencia sensible a la toxina natural. Como ejemplo no restrictivo, en comparación con un 17-mero correspondiente a los residuos 187 a 203 de la SNAP-25 humana, la sustitución de Aspl93 por asparagina en el sustrato de BoNT/A dio como resultado una velocidad relativa de proteolisis de 0,23; la sustitución de Glu194 por glutamina dio como resultado una velocidad relativa de 2,08; la sustitución de Ala195 por ácido 2-aminobutírico dio como resultado una velocidad relativa de 0,38; y la sustitución de Gln197 por asparagina, ácido 2-aminobutírico o alanina dio como resultado una velocidad relativa de 0,66; 0,25 o 0,19, respectivamente (véase la Tabla 6). Además, la sustitución de Ala199 por ácido 2-aminobutírico dio como resultado una velocidad relativa de 0,79; la sustitución de Thr200 por serina o ácido 2-aminobutírico dio como resultado una velocidad relativa de 0,26 o 1,20, respectivamente; la sustitución de Lys201 por alanina dio como resultado una velocidad relativa de 0,12; y la sustitución de Met202 por alanina o norleucina dio como resultado una velocidad relativa de 0,38 o 1,20, respectivamente; véase, p.ej.: Schmidt y Bostian, supra, (1997). En otro estudio, se pudo sustituir la Gln197 de la SNAP-25 por metionina, serina, treonina, glutamina o lisina, y siguió siendo escindido eficazmente por BoNT/A, véase, p. ej., Vadakkanchery V. Vaidyanathan y col., “Proteolysis of SNAP-25 Isoforms by Botulinum Neurotoxin Types A, C, and E: Domains and Amino Acid Residues Controlling the Formation of Enzyme-Substrate Complexes and Cleavage”, 72 J. Neurochem. 327-337 (1999). Estos resultados indican que los residuos, incluyendo pero no limitándose a Glu194, Ala195, Glen197, Ala199, Thr200 y Met202, Leu203, Gly204, Ser205 y Gly206, así como los residuos más distales del enlace escindible de Gln-Arg, se pueden sustituir o conjugar.
Hay una variedad de sitios de escisión de sustratos de BoNT/A que son conocidos en la técnica y que se pueden definir mediante procedimientos rutinarios. Un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A puede tener, por ejemplo, los residuos 46-206, los residuos 134 a 206, los residuos 137 a 206 o 146-206 de la SnAp- 25 humana, véase, p. ej., Teresa A. Ekong y col., “Recombinant SNAP-25 is an Effective Substrate for Clostridium botulinum Type A Toxin Endopeptidase Activity in vitro’’, 143 (Pt 10) Microbiology 3337-3347 (1997); Clifford C. Shone y col., “Toxin Assays”, patente estadounidense n.° 5.962.637 (5 de octubre de 1999); y Vaidyanathan y col., supra, (1999). Un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A también puede comprender, sin limitación, la secuencia Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ iD NO: 133) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a los residuos 190 a 202 de la SNAP-25 humana; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (SEQ ID NO: 134) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a los residuos 187 a 201 de la SNAP-25 humana; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 135) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a los residuos 187 a 202 de la SNAP-25 humana; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gin-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (SEQ ID NO: 136) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a los residuos 187 a 203 de la SNAP-25 humana; Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 150) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a los residuos 186 a 202 de la SNAP-25 humana; o Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (SEQ ID NO: 151) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a los residuos 186 a 203 de la SNAP-25 humana. Véase, por ejemplo, James J. Schmidt y Karen A Bostian, “Proteolysis of Synthetic Peptides by Type A Botulinum Neurotoxin”, 14(8) J. Protein Chem. 703-708 (1995); Schmidt y Bostian, supra, (1997); James J. Schmidt y col., “Type A Botulinum Neurotoxin Proteolytic Activity: Development of Competitive Inhibitors and Implications For Substrate Specificity at the S1' Binding Subsite”, 435(1) FEBS Lett. 61-64 (1998); y James J. Schmidt y Karen A Bostian, “Assay for the Proteolytic Activity of Serotype a From Clostridium botulinum”, patente estadounidense n.° 5.965.699 (12 de octubre de 1999).
De este modo, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende al menos seis residuos consecutivos de la SNAP-25 incluyendo Gln-Arg. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende al menos seis residuos consecutivos de la SNAP-25 incluyendo Lys-His. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (SEQ ID NO: 104); la secuencia de aminoácidos Glu-Ala-Asn-Lys-His-Ala-Thr-Lys (SEQ ID NO: 105); la secuencia de aminoácidos de Glu-Ala-Asn-Lys-His-Ala-Asn-Lys (SEQ ID NO: 106). En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 106, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID No : 106; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 106. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 106; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 106; una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO:
106 o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 106 , o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende p. ej., la SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO: 151.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 104, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 104, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 104 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 104, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 104, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 104 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 104.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SeQ ID NO: 104.
En un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B. Como se usa en la presente memoria, la expresión “sitio de escisión de sustrato de la toxina botulínica de serotipo B” es sinónimo de “sitio de escisión de sustrato de BoNT/B” y significa un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para que una BoNT/B produzca una proteolisis detectable en el enlace escindible en condiciones adecuadas para una actividad proteasa de la toxina clostridial. Un enlace escindible escindido por BoNT/B puede ser, por ejemplo, Gln-Phe. Se prevé que un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de cualquiera y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de referencia con la condición de que el sitio de escisión del sustrato de BoNT/B pueda ser escindido por BoNT/B. De este modo, en aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B puede ser, p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una longitud de al menos 7 aminoácidos, una longitud de al menos 8 aminoácidos, una longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud de al menos 10 aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos, una longitud de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos 25 aminoácidos, una longitud de al menos 30 aminoácidos, una longitud de al menos 40 aminoácidos, una longitud de al menos 50 aminoácidos o una longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B puede ser p. ej., de una longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como máximo 8 aminoácidos, de una longitud de como máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de como máximo 10 aminoácidos, de una longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como máximo 30 aminoácidos, de una longitud de como máximo 40 aminoácidos, de una longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una longitud de como máximo 60 aminoácidos.
Los s itio s de e sc is ió n de su s tra to s de B o N T /B ú tiles en los a s p e c to s de re fe re n c ia pued en c o rre s p o n d e r a un
segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/B, o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una proteína sensible a BoNT/B. Como se muestra en la Tabla 3, en la técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a la escisión por BoNT/B, e incluyen, por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina humanas y de ratón; VAMP-2 bovina; VAMP-2 y VAMP-3 de rata; vAm P-2 de pollo; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sinA, sinB, sinC, sinD y sinE de Drosophila; VAMP de Hirudo; y el tipo SNB1 de Caenorhabditis. De este modo, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina; Va Mp- 2 o VAMp-3 de rata; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de ratón; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sinA, sinB, sinC, sinD o sinE de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 de Caenorhabditis, isoformas de las mismas, u otra proteína natural sensible a la escisión por BoNT/B. Además, la comparación de las secuencias de aminoácidos nativas de las VAMP escindidas por BoNT/B revela que tales secuencias están absolutamente conservadas (Tabla 3). Este descubrimiento indica que se puede tolerar una variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con respecto a una secuencia de VAMP sensible a la BoNT/B natural en un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B útil en los aspectos de referencia. Se entiende que es posible preparar un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B similar, si se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u ortólogo de VAMP-1 o VAMP-2 sensible a BoNT/B, tal como, el sitio de escisión de sustrato de BoNT/B contenido en las proteínas VAMP-1 y VAMP-2 identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 3.
Hay una variedad de sitios de escisión de sustratos de BoNT/B que son conocidos en la técnica y que se pueden definir mediante procedimientos rutinarios. Tales sitios de escisión de sustratos de BoNT/B pueden incluir, por ejemplo, una secuencia correspondiente a parte o todo el núcleo hidrófilo de una proteína VAMP, tal como la VAMP-1 humana o VAMP-2 humana. Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/B pueden incluir, sin limitación, los residuos 33 a 94, los residuos 45 a 94, los residuos 55 a 94, los residuos 60 a 94, los residuos 65 a 94, los residuos 60 a 88 o los residuos 65 a 88 de la VAMP-2 humana (SEQ ID NO: 39), o los residuos 60 a 94 de la VAMP-1-1 humana (SEQ ID NO: 36), VAMP-1-2 (SEQ ID NO: 37) y VAMP-1-3 (SEQ ID NO: 38), véase, p. ej., Shone y col., Eur. J. Biochem. 217: 965-971 (1993); y Shone y col., supra, (5 de octubre de 1999). Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/B también pueden incluir, sin limitación, la secuencia Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys-Arg-Lys-Tyr-Trp-Trp-Lys-Asn-Leu-Lys (SEQ ID NO: 152) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a los residuos 60 a 94 de la VAMP-2 humana, véase, p. ej., James J. Schmidt y Robert G. Stafford, “High Throughput Assays for the Proteolytic Activities of Clostridial Neurotoxins”, patente estadounidense n.° 6.762.280 (13 de julio de 2004) y la secuencia de reconocimiento de BoNT/B Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys-Arg-Lys-Tyr-Trp-Trp-Lys-Asn-Cys-Lys (SEQ ID NO: 153) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a los residuos 62 a 96 de la VAMP-1 humana.
De este modo, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende al menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo Gln-Phe. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos -Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (SEQ ID NO: 107); secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser (SEQ ID NO: 108); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Asn (SEQ ID NO: 109); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Gln-Gln (SEQ ID NO: 110); la secuencia de aminoácidos -Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ala-Ser (SEQ ID NO: 111); o la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NO: 112). En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de la SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNt /B comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, o cualquier combinación de los mismos.
En o tro s a sp e c to s de re fe re n c ia de esta re a liza c ió n , un s itio de e sc is ió n de su s tra to de B o N T /B c o m p re n d e un
polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 107 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 107 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 107.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107.
En un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1. Como se usa en la presente memoria, la expresión “sitio de escisión de sustrato de la toxina botulínica de serotipo C1” es sinónimo de “sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1” y significa un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para que una BoNT/C1 produzca una proteolisis detectable en el enlace escindible en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/C1 puede ser, por ejemplo, Lys-Ala o Arg-Ala. Se prevé que un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de cualquiera y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de referencia con la condición de que el sitio de escisión del sustrato de BoNT/C1 pueda ser escindido por BoNT/C1. De este modo, en aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 puede ser, p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una longitud de al menos 7 aminoácidos, una longitud de al menos 8 aminoácidos, una longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud de al menos 10 aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos, una longitud de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos 25 aminoácidos, una longitud de al menos 30 aminoácidos, una longitud de al menos 40 aminoácidos, una longitud de al menos 50 aminoácidos o una longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 puede ser p. ej., de una longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como máximo de 8 aminoácidos, de una longitud de como máximo 9 aminoácidos, de una longitud de como máximo 10 aminoácidos, de una longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como máximo 30 aminoácidos, de una longitud de como máximo 40 aminoácidos, una longitud de cómo máximo 50 aminoácidos o de una longitud de como máximo 60 aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/C1 útiles en los aspectos de referencia pueden corresponder a un segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/C1, o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una proteína sensible a BoNT/C1. Como se muestra además en la Tabla 4, en la técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a la escisión por BoNT/C1, e incluyen, por ejemplo, sintaxina 1A, sintaxina 1B1 y sintaxina 1 B2 humanas y de ratón; sintaxina 1 A y sintaxina 1 B2 bovinas y de rata; sintaxina 2 de rata y sintaxina 3 de rata; sintaxina de Strongylocentrotus, sintaxina 1A de Drosophila; sintaxina 1A de Hirudo; sintaxina 1A de Loligo; sintaxina 1A de Aplysia. De este modo, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 puede
corresponder, por ejemplo, a un segmento de sintaxina 1A, sintaxina 1B1, sintaxina 1B2, sintaxina 2-1, sintaxina 2 2, sintaxina 2-3 o sintaxina 3A humana; sintaxina 1A, sintaxina 1B1 o sintaxina 1B2 bovina; sintaxina 1A, sintaxina 1B1, sintaxina 1B2, sintaxina 2 o sintaxina 3A de rata; sintaxina 1 A, sintaxina 1B1, sintaxina 1B2, sintaxina 2, sintaxina 3A, sintaxina 3B o sintaxina 3C de ratón; sintaxina 1A o sintaxina 2 de pollo; sintaxina 1 A o sintaxina 1B de Xenopus; sintaxina, 1 A, sintaxina 1B o sintaxina 3 de Danio; sintaxina 1A o sintaxina 1B de Torpedo; sintaxina 1 A o sintaxina 1B de Strongylocentrotus; sintaxina 1A o sintaxina 1B de Drosophila; sintaxina 1A o sintaxina 1B de Hirudo; sintaxina 1 A o sintaxina 1B de Loligo; sintaxina 1 A o sintaxina 1 B de Lymnaea, isotermas de las mismas, u otra proteína natural sensible a la escisión por BoNT/C1. Además, la comparación de las secuencias nativas de aminoácidos de sintaxina escindidas por BoNT/C1 revela que tales secuencias están absolutamente conservadas (véase la Tabla 4), lo que indica que se puede tolerar una variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de sintaxina sensible a BoNT/C1 natural en un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 útil en los aspectos de referencia. Se entiende que es posible preparar un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 similar, si se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u ortólogo de sintaxina sensible a BoNT/C1, tal como, el sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 contenido en las proteínas de sintaxina identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 4.
Aunque no están ampliamente estudiados, es posible definir una variedad de sitios de escisión de sustratos de BoNT/C1 mediante procedimientos rutinarios. El fragmento óptimo mínimo para los sitios de escisión de sustratos de BoNT/C1 puede incluir, sin limitación, los residuos 93 a 202 de la SNAP-25A humana (SEQ ID NO: 9) o los residuos 93 a 202 de la SNAP-25B humana (SEQ ID NO: 10), véase, p. ej., Vaidyanathan y col., supra, (1999). Sin embargo, como ocurre con los sustratos de otras BoNT, se sospecha que la BoNT/c1 puede escindir eficazmente un fragmento de sustrato mucho más pequeño.
Como se muestra en la Tabla 2, en la técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a la escisión por BoNT/C1, e incluyen, por ejemplo, la SNAP-25A y la SNAP-25B humanas, de rata, de ratón, de Danio y de Carassius; y la SNAP-25 de Drosophila. De este modo, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de SNAP-25A o SNAP-25B humana; SNAP-25A o SNAP-25B bovina; SNAP-25A o SNAP-25B de rata; SNAP-25A o SNAP-25B de ratón; SNAP-25A o SNAP-25B de Xenopus; SNAP-25A o SNAP-25B de Danio; SNAP-25A o SNAP-25B de Carassius; SNAP-25 de Torpedo; SNAP-25 de Strongylocentrotus; SNAP-25 o SNAP-24 de Drosophila; SNAP-25 de Hirudo; SNAP-25 de Loligo; SNAP-25 de Lymnaea, isoformas de las mismas, u otra proteína natural sensible a la escisión por BoNT/C1. Según lo tratado anteriormente con respecto a las variantes de secuencias de sintaxina naturales, la comparación de las secuencias de aminoácidos de la SNAP-25 nativas escindidas por BoNT/C1 revela una variabilidad secuencial relevante (Tabla 2), lo que indica que se puede tolerar una variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de la SNAP-25 sensible a la BoNT/C1 natural en un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 revelado en la presente memoria. Se entiende que es posible preparar un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 similar, si se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u ortólogo de SNAP-25 sensible a BoNT/C1, tal como, el sitio de escisión de sustrato de BoNT/A contenido en las proteínas de la SNAP-25 identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 2.
De este modo, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende al menos seis residuos consecutivos de Sintaxina incluyendo Lys-Ala. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende al menos seis residuos consecutivos de Sintaxina incluyendo Arg-Ala. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 113); la secuencia de aminoácidos Glu-Thr-Lys-Lys-Ala-Ile-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 114); la secuencia de aminoácidos Glu-Ser-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 115); la secuencia de aminoácidos Glu-Thr-Lys-Arg-Ala-Met-Lys-Tyr (s Eq iD NO: 116); la secuencia de aminoácidos Glu-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 117); la secuencia de aminoácidos Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Leu-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 118); o la secuencia de aminoácidos Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Met-Lys-Tyr (SEQ iD NO: 119). En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, una variante no conservadora de sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119, una variante no
conservadora de sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119 o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 113, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 113, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 113 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 113, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 113, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 113 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 113.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 113. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113.
En otro aspecto de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende al menos seis residuos consecutivos de la SNAP-25 incluyendo Arg-Ala. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de toxina BoNT/C1 comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 120) o la secuencia de aminoácidos de Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-His-Gln-Leu (SEQ ID NO: 121). En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato BoNT/C1 comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 121, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 121; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 121. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, una variante no conservadora de sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 121; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 121; una variante no conservadora de sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 121; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 121, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 120, una
identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 120, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 120 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 120, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 120, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 120 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 120.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 120. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNt /C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120.
En un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D. Como se usa en la presente memoria, la expresión “sitio de escisión de sustrato de la toxina botulínica de serotipo D” es sinónimo de “sitio de escisión de sustrato de BoNT/D” y significa un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para que una BoNT/D produzca una proteolisis detectable en el enlace escindible en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/D puede ser, por ejemplo, Lys-Leu. Se prevé que un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de cualquiera y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de referencia con la condición de que el sitio de escisión del sustrato de BoNT/D pueda ser escindido por BoNT/D. De este modo, en aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D puede ser, p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una longitud de al menos 7 aminoácidos, una longitud de al menos 8 aminoácidos, una longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud de al menos 10 aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos, una longitud de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos 25 aminoácidos, una longitud de al menos 30 aminoácidos, una longitud de al menos 40 aminoácidos, una longitud de al menos 50 aminoácidos o una longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D puede ser p. ej., de una longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como máximo 8 aminoácidos, de una longitud de como máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de como máximo 10 aminoácidos, de una longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como máximo 30 aminoácidos, de una longitud de como máximo 40 aminoácidos, de una longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una longitud de como máximo 60 aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/D útiles en los aspectos de referencia pueden corresponder a un segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/D, o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una proteína sensible a BoNT/D. Como se muestra en la Tabla 3, en la técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a la escisión por BoNT/D, e incluyen, por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina humanas, de rata y de ratón; VAMp-2 bovina; VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sinA, sinB, sinC, sinD y sinE de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia y SNB1 de Caenorhabditis. De este modo, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D puede corresponder, por
ejemplo, a un segmento de VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de rata; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de ratón; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sinA, sinB, sinC, sinD o sinE de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 de Caenorhabditis, isoformas de las mismas, u otra proteína natural sensible a la escisión por BoNt /D. Además, la comparación de las secuencias de aminoácidos nativas de las VAMP escindidas por BoNT/D revela que tales secuencias están absolutamente conservadas (Tabla 3). Este descubrimiento indica que se puede tolerar una variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con respecto a una secuencia de la VAMP sensible a la BoNT/D natural en un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D útil en los aspectos de referencia. Se entiende que es posible preparar un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D similar, si se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u ortólogo de VAMP-1 o VAMP-2 sensible a BoNT/D, tal como, el sitio de escisión de sustrato de BoNT/D contenido en las proteínas VAMP-1 y VAMP-2 identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 3.
Hay una variedad de sitios de escisión de sustratos de BoNT/D que son conocidos en la técnica o que se pueden definir mediante procedimientos rutinarios. Un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D puede incluir, por ejemplo, los residuos 27 a 116; residuos 37 a 116; residuos 1 a 86; residuos 1 a 76; o los residuos 1 a 69 de la VAMP-2 de rata (SEQ ID NO: 46), véase, p. ej., Shinji Yamasaki y col., “Cleavage of members of the synaptobrevin/VAMP family by types D and F botulinum neurotoxins and tetanus toxin”, 269(17) J. Biol. Chem. 12764-12772 (1994). De este modo, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D puede incluir, por ejemplo, los residuos 27 a 69 o los residuos 37 a 69 de la VAMP-2 de rata. Un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D también puede incluir, sin limitación, la secuencia Ala-Gln-Val-Asp-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Met-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (SEQ ID NO: 154) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a los residuos 37 a 75 de la VAMP-2 humana, véase, p. ej., Schmidt y Stafford, supra, (13 de julio de 2004) y la secuencia de reconocimiento de BoNT/D Ala-Gln-Val-Glu-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Ile-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (s Eq ID NO: 155) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a los residuos 39 a 77 de las isoformas de la VAMP-1 humana VAMP-1-1, VAMP-1-2 y VAMP-1-3.
De este modo, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende al menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo Lys-Leu. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu (SEQ ID NO: 122); o la secuencia de aminoácidos de Lys-Asp-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Leu (SEQ ID NO: 123). En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123; una variante no conservadora de sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123 , o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 122, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 122, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 122 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 122, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 122, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 122 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 122.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID
NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122 de referencia.
En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122.
En un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E. Como se usa en la presente memoria, la expresión “sitio de escisión de sustrato de la toxina botulínica de serotipo E” es sinónimo de “sitio de escisión de sustrato de BoNT/E” y significa un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para que una BoNT/E produzca una proteolisis detectable en el enlace escindible en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/E puede ser, por ejemplo, Arg-IIe o Lys-lle. Se prevé que un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de cualquiera y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de referencia con la condición de que el sitio de escisión del sustrato de BoNT/E pueda ser escindido por BoNT/E. De este modo, en aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E puede ser, p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una longitud de al menos 7 aminoácidos, una longitud de al menos 8 aminoácidos, una longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud de al menos 10 aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos, una longitud de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos 25 aminoácidos, una longitud de al menos 30 aminoácidos, una longitud de al menos 40 aminoácidos, una longitud de al menos 50 aminoácidos o una longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E puede ser p. ej., de una longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como máximo 8 aminoácidos, de una longitud de como máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de como máximo 10 aminoácidos, de una longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como máximo 30 aminoácidos, de una longitud de como máximo 40 aminoácidos, de una longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una longitud de como máximo 60 aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/E útiles en los aspectos de referencia pueden corresponder a un segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/E, o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una proteína sensible a BoNT/E. Como se muestra en la Tabla 2, en la técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a la escisión por BoNT/E, e incluyen, por ejemplo, SNAP-25A y SNAP-25B humanas, de pollo, de Danio y de Carassius; SNAP-25A, SNAP-25B y SNAP-23 de rata y de ratón; y SNAP-25 de Caenorhabditis. De este modo, un sitio de escisión de sustrato de BoNt /E puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de SNAP-25A o SNAP-25B humana; SNAP-25A o SNAP-25B bovina; SNAP-25A, SNAP-25B o SNAP-23 de rata; SNAP-25A, SNAP-25B o SNAP-23 de ratón; SNAP-25A o SNAP-25B de Xenopus; SNAP-25A o SNAP-25B de Danio; SNAP-25A o SNAP-25B de Carassius; SNAP-25 de Strongylocentrotus; SNAP-24 de Drosophila; SNAP-25 de Hirudo; SNAP-25 de Loligo; SNAP-25 de Lymnaea; SnAp- 25 de Caenorhabditis, isoformas de las mismas, u otra proteína natural sensible a la escisión por BoNT/E. Además, la comparación de las secuencias de aminoácidos nativas de SNAP-23 y SNAP-25 escindidas por BoNT/E revela que tales secuencias están absolutamente conservadas (Tabla 2). Este descubrimiento indica que se puede tolerar una variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con respecto a una secuencia de la SNAP-23 o la SNAP-25 sensible a BoNT/E natural en un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E útil en los aspectos de la presente invención. Se entiende que es posible preparar un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E similar, si se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u ortólogo de la SNAP-25 sensible a BoNT/E, tal como, la secuencia de reconocimiento de BoNT/E contenida en las proteínas SNAP-25 identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 2.
Hay una variedad de sitios de escisión de sustratos de BoNT/E que son conocidos en la técnica o que se pueden definir mediante procedimientos rutinarios. Un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E puede tener, por ejemplo, los residuos 46-206, residuos 92 a 206, residuos 134 a 206, residuos 137 a 206; 146-206, 156-206 o 146-186 de la
SNAP-25A humana (SEQ ID NO: 9) y la SNAP-25B humana (SEQ ID NO: 10), véase, p. ej., Vaidyanathan y col., supra, (1999); y Schmidt y Stafford, supra, (13 de julio de 2004).
De este modo, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende al menos seis residuos consecutivos de la SNAP-25 incluyendo Arg-IIe. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende al menos seis residuos consecutivos de la SNAP-25 incluyendo Lyslle. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys (SEQ ID NO: 124); la secuencia de aminoácidos Gln-Ile-Gln-Lys-Ile-Thr-Glu-Lys (SEQ ID NO: 125); la secuencia de aminoácidos Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Asp-Met (SEQ ID NO: 126); la secuencia de aminoácidos Gln-Val-Asp-Arg-Ile-Gln-Gln-Lys (SeQ ID NO: 127); o la secuencia de aminoácidos Gln-Leu-Asp-Arg-Ile-His-Asp-Lys (s Eq ID NO: 128). En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128; tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de la SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128; una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: XX o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 124, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 124, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 124 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 124, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 124, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 124 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 124.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en
comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SeQ ID NO: 124.
En un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F. Como se usa en la presente memoria, la expresión “sitio de escisión de sustrato de la toxina botulínica de serotipo F” es sinónimo de “sitio de escisión de sustrato de BoNT/F” y significa un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para que una BoNT/F produzca una proteolisis detectable en el enlace escindible en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/F puede ser, por ejemplo, Gln-Lys. Se prevé que un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de cualquiera y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de la presente invención con la condición de que el sitio de escisión del sustrato de BoNT/F pueda ser escindido por BoNT/F. De este modo, en aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F puede ser, p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una longitud de al menos 7 aminoácidos, una longitud de al menos 8 aminoácidos, una longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud de al menos 10 aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos, una longitud de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos 25 aminoácidos, una longitud de al menos 30 aminoácidos, una longitud de al menos 40 aminoácidos, una longitud de al menos 50 aminoácidos o una longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F puede ser p. ej., de una longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como máximo 8 aminoácidos, de una longitud de como máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de como máximo 10 aminoácidos, de una longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como máximo 30 aminoácidos, de una longitud de como máximo 40 aminoácidos, de una longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una longitud de como máximo 60 aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/F útiles en los aspectos de referencia pueden corresponder a un segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/F, o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una proteína sensible a BoNT/F. Como se muestra en la Tabla 3, en la técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a la escisión por BoNT/F, e incluyen, por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina humanas, de rata y de ratón; VAMP-2 bovina; VAMP-1 y VAMP-2 de pollo; VAMP-1 de Torpedo; y sinA y sinB de Drosophila. De este modo, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de rata; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de ratón; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; sinA y sinB de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de Lymnaea; VAMP de Aplysia; SNB1 de Caenorhabditis, isoformas de las mismas, u otra proteína natural sensible a la escisión por BoNT/F. De este modo, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de VAMP-1 o VAMP-2 humana; VAMP-1 o VAMP-2 de ratón; VAMP-1 o VAMP-2 bovina; vAm P -1 o VAMP-2 de rata; celubrevina de rata; VAMP-1 o VAMP-2 de pollo; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Aplysia; sib de Drosophila; VAMP de sanguijuela, u otra proteína natural sensible a la escisión por BoNT/F. Además, la comparación de las secuencias de aminoácidos nativas de las VAMP escindidas por BoNT/F revela que tales secuencias están absolutamente conservadas (Tabla 3). Este descubrimiento indica que se puede tolerar una variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con respecto a una secuencia de la VAMP sensible a la BoNT/E natural en un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E útil en los aspectos de referencia. Se entiende que es posible preparar un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F similar, si se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u ortólogo de VAMP-1 o VAMP-2 sensible a BoNT/F, tal como, el sitio de escisión de sustrato de BoNT/F contenido en las proteínas VAMP-1 y VAMP-2 identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 3.
Hay una variedad de secuencias de reconocimiento de BoNT/F que son conocidas en la técnica o que se pueden definir mediante procedimientos rutinarios. Una secuencia de reconocimiento de BoNT/F puede incluir, por ejemplo, los residuos 27 a 116; los residuos 37 a 116; los residuos 1 a 86; los residuos 1 a 76; o los residuos 1 a 69 de la VAMP-2 de rata (SEQ ID NO: 46), véase, p. ej., Yamasaki y col., supra, (1994). Estas secuencias de reconocimiento de BoNT/F también pueden comprender, por ejemplo, los residuos 27 a 69 o los residuos 37 a 69 de la VAMP-2 de rata. Se entiende que es posible preparar una secuencia de reconocimiento de BoNT/F similar, si se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u ortólogo de VAMP sensible a BoNT/F, tal como, VAMP-1 humana o VAMP-2 humana. Una secuencia de reconocimiento de BoNT/F también puede incluir, sin limitación, la secuencia Ala-Gln-Val-Asp-Glu-Val-Val-Asp-Ile-Met-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (SEQ ID NO: 154) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a los residuos 37 a 75 de la VAMP-2 humana, véase, p. ej., Schmidt y Stafford, supra, (13 de julio de 2004) y la secuencia de reconocimiento de BoNT/F Ala-Gln-Val-Glu-Glu-Val-Val-Asp-ile-Ile-Arg-Val-Asn-Val-Asp-Lys-Val-Leu-Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu-Asp-Asp-Arg-Ala-Asp-Ala-Leu-Gln-Ala-Gly-Ala-Ser (SEQ ID NO: 155) o un peptidomimético de la misma, que corresponde a los residuos 39 a 77 de la VAMP-1 humana.
De este modo, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende al menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo Gln-Lys. En otros aspectos de esta realización, un sitio
de escisión de sustrato de BoNT/F comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu (SEQ ID NO: 129); o la secuencia de aminoácidos de Glu-Lys-Asp-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu (SEQ ID NO: 130). En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130, tal como, p. ej., una isoterma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130; una variante no conservadora de sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 129, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 129, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 129 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 129, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 129, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 129 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 129.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SeQ ID NO: 129.
En un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G. Como se usa en la presente memoria, la expresión “sitio de escisión de sustrato de la toxina botulínica de serotipo G” es sinónimo de “sitio de escisión de sustrato de BoNT/G” y significa un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para que una BoNT/G produzca una proteolisis detectable en el enlace escindible en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por BoNT/G puede ser, por ejemplo, Ala-Ala. Se prevé que un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de cualquiera y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de referencia con la condición de que el sitio de escisión del sustrato de BoNT/G pueda ser escindido por BoNT/G. De este modo, en aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G puede ser, p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una longitud de al menos 7
aminoácidos, una longitud de al menos 8 aminoácidos, una longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud de al menos 10 aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos, una longitud de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos 25 aminoácidos, una longitud de al menos 30 aminoácidos, una longitud de al menos 40 aminoácidos, una longitud de al menos 50 aminoácidos o una longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G puede ser p. ej., de una longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como máximo 8 aminoácidos, de una longitud de como máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de como máximo 10 aminoácidos, de una longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como máximo 30 aminoácidos, de una longitud de como máximo 40 aminoácidos, de una longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una longitud de como máximo 60 aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de BoNT/G útiles en los aspectos de referencia pueden corresponder a un segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por BoNT/G, o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una proteína sensible a BoNT/G. Como se muestra en la Tabla 3, en la técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a la escisión por BoNT/G, e incluyen, por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina humanas, de rata y de ratón; Va Mp- 2 bovina; VAMP-1 y VAMP-2 de pollo; y VAMP-1 de Torpedo. De este modo, una secuencia de reconocimiento de BoNT/G puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de rata; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de ratón; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; SNB1 de Caenorhabditis, isoformas de las mismas, u otra proteína natural sensible a la escisión por BoNT/G. Además, la comparación de las secuencias de aminoácidos nativas de las VAMP escindidas por BoNt /G revela que tales secuencias están absolutamente conservadas (Tabla 3). Este descubrimiento indica que se puede tolerar una variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con respecto a una secuencia de la VAMP sensible a la BoNT/G natural en un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G útil en los aspectos de la presente invención. Se entiende que es posible preparar una secuencia de reconocimiento de BoNT/G similar, si se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u ortólogo de VAMP-1 o VAMP-2 sensible a BoNT/G, tal como, la secuencia de reconocimiento de BoNT/G contenida en la VAMP-1 y la VAMP-2 identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 3.
De este modo, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende al menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo Ala-Ala. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys (SEQ ID NO: 131); o la secuencia de aminoácidos Glu-Ser-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys (SEQ ID NO: 132). En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132; una variante no conservadora de sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 131, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 131, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 131 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 131, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 131, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 131 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 131.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, un
sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G comprende un polipéptido que tiene, p. ej., al menos dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SeQ ID NO: 131.
En un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de TeNT. Como se usa en la presente memoria, la expresión “sitio de escisión de sustrato de la toxina tetánica” es sinónimo de “sitio de escisión de sustrato de TeNT” y significa un enlace escindible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes, o ambos, suficientes para que una TeNT produzca una proteolisis detectable en el enlace escindible en condiciones apropiadas. Un enlace escindible escindido por TeNT puede ser, por ejemplo, Gln-Phe. Se prevé que un sitio de escisión de sustrato de TeNT de cualquiera y todas las longitudes puede ser útil en aspectos de referencia con la condición de que el sitio de escisión del sustrato de TeNT pueda ser escindido por TeNT. De este modo, en aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT puede ser, p. ej., de una longitud de al menos 6 aminoácidos, una longitud de al menos 7 aminoácidos, una longitud de al menos 8 aminoácidos, una longitud de al menos 9 aminoácidos, una longitud de al menos 10 aminoácidos, una longitud de al menos 15 aminoácidos, una longitud de al menos 20 aminoácidos, una longitud de al menos 25 aminoácidos, una longitud de al menos 30 aminoácidos, una longitud de al menos 40 aminoácidos, una longitud de al menos 50 aminoácidos o una longitud de al menos 60 aminoácidos. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT puede ser p. ej., de una longitud de como máximo 6 aminoácidos, de una longitud de como máximo 7 aminoácidos, de una longitud de como máximo 8 aminoácidos, de una longitud de como máximo de 9 aminoácidos, de una longitud de como máximo 10 aminoácidos, de una longitud de como máximo 15 aminoácidos, de una longitud de como máximo 20 aminoácidos, de una longitud de como máximo 25 aminoácidos, de una longitud de como máximo 30 aminoácidos, de una longitud de como máximo 40 aminoácidos, de una longitud de como máximo 50 aminoácidos o de una longitud de como máximo 60 aminoácidos.
Los sitios de escisión de sustratos de TeNT útiles en los aspectos de referencia pueden corresponder a un segmento de una proteína que sea sensible a la escisión por TeNT, o pueden ser sustancialmente similares a un segmento de una proteína sensible a TeNT. Como se muestra en la Tabla 3, en la técnica, se conoce una variedad de proteínas naturales sensibles a la escisión por TeNT, e incluyen, por ejemplo, VAMP-1, VAMP-2 y VAMP-3/celubrevina humanas y de ratón; VAMP-2 bovina; VAMP-2 y VAMP-3 de rata; VAMP-2 de pollo; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sinA, sinB, sinC, sinD y sinE de Drosophila; VAMP de Hirudo; y el tipo SNB1 de Caenorhabditis. De este modo, un sitio de escisión de sustrato de TeNT puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 humana; VAMP-2 bovina; VAMP-2 o VAMP-3 de rata; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de ratón; VAMP-1, VAMP-2 o VAMP-3 de pollo; VAMP-2 o VAMP-3 de Xenopus; VAMP-1 o VAMP-2 de Danio; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Strongylocentrotus; sinA, sinB, sinC, sinD o sinE de Drosophila; VAMP de Hirudo; VAMP de Loligo; VAMP de Lymnaea; Va MP de Aplysia; SNB1 y tipo SNB de Caenorhabditis, isoformas de las mismas, u otra proteína natural sensible a la escisión por TeNT. Además, la comparación de las secuencias de aminoácidos nativas de las VAMP escindidas por TeNT revela que tales secuencias no están absolutamente conservadas (Tabla 3). Este descubrimiento indica que se puede tolerar una variedad de sustituciones y modificaciones de aminoácidos con respecto a una secuencia de la VAMP sensible a la TeNT natural en un sitio de escisión de sustrato de TeNT útil en los aspectos de referencia. Se entiende que es posible preparar un sitio de escisión de sustrato de TeNT similar, si se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma, parálogo u ortólogo de VAMP-1 o VAMP-2 sensible a TeNT, tal como, el sitio de escisión de sustrato de TeNT contenido en la VAMP-1 y VAMP-2 identificadas en los organismos enumerados anteriormente en la Tabla 3.
Hay una variedad de secuencias de reconocimiento de TeNT que son conocidas en la técnica o que se pueden
definir mediante procedimientos rutinarios, e incluyen secuencias correspondientes a parte o todo el núcleo hidrófilo de una proteína VAMP tal como la VAMP-1 humana o la VAMP-2 humana. Una secuencia de reconocimiento de TeNT puede incluir, por ejemplo, los residuos 25 a 93 o los residuos 33 a 94 de la VAMP-2 humana (SEQ ID NO: 39); F. Cornille y col., “Solid-Phase Synthesis, Conformational Analysis and In vitro Cleavage Of Synthetic Human Synaptobrevin II 1-93 by Tetanus Toxin L chain”, 222(1) Eur. J. Biochem. 173-181 (1994); Patrick Foran y col., “Differences in the Protease Activities of Tetanus and Botulinum B Toxins Revealed By the Cleavage of Vesicle-Associated Membrane Protein and Various Sized Fragments”, 33(51) Biochemistry 15365-15374 (1994); los residuos 51 a 93 o los residuos 1 a 86 de la VAMP-2 de rata, véase, p. ej., Yamasaki y col., supra, (1994); o los residuos 33 a 94 de la VAMP-1-1 humana (SEQ ID NO: 36), los residuos 33 a 94 de la VAMP-1-2 humana (SEQ ID NO: 37) y los residuos 33 a 94 de la VAMP-1-3 humana (SEQ ID NO: 38). Una secuencia de reconocimiento de TeNT también puede incluir, por ejemplo, los residuos 25 a 86, los residuos 33 a 86 o los residuos 51 a 86 de la VAMP-2 humana (SEQ ID n O: 39) o la VAMP-2 de rata (SEQ ID NO: 46). Se entiende que es posible preparar una secuencia de reconocimiento de TeNT similar, si se desea, a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma u homólogo de la especie de la VAMP sensible a TeNT, tal como, VAMP-1 humana, o VAMP de erizo de mar o de Aplysia.
De este modo, en un aspecto de referencia, una toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión de sustrato de TeNT. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende al menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo Gln-Phe. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (SEQ ID NO: 107); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser (SEQ ID NO: 108); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Asn (SEQ ID NO: 109); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Gln-Gln (SEQ ID NO: 110); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ala-Ser (SEQ ID NO: 111); o la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NO: 112). En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de TeNT. En otro aspecto de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de TeNT, tal como una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de TeNT, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de TeNT o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de TeNT, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 107 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 107 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 107.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un
sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107.
En otros aspectos de referencia de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión de sustrato de TeNT comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 107.
Los sustratos de las toxinas clostridiales se obtiene de fragmentos autocatalíticos de las propias toxinas clostridiales. Se ha indicado que una toxina clostridial puede sufrir una fragmentación autocatalítica que da como resultado la formación de dos fragmentos de polipéptido principales. Por ejemplo, se han localizado enlaces peptídicos susceptibles a la escisión autocatalítica en dos regiones de la BoNT/A. La primera región comprende los aminoácidos 250-267 de la SEQ ID NO: 1, en la que los enlaces Tyr250-Tyr251 y Phe266-Gly267 son susceptibles a la escisión. La segunda región comprende los residuos 419-439 de la SEQ ID NO: 1, en la que los enlaces Phe419-Thr420, Phe423-Glu424, Leu429-Cys430, Cys430-Val431, Arg432-Gly433 y Lys438-Thr439 son susceptibles a la escisión autocatalítica. La región de BoNT/A correspondiente a los aminoácidos 250-267 de la SEQ ID NO: 1 está muy conservada entre las toxinas clostridiales (Tabla 7).
De este modo, la toxina clostridial modificada comprende un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de una toxina clostridial. En aspectos de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende al menos seis residuos consecutivos de una toxina clostridial que incluyen los residuos de BoNT/A 250Tyr-251Tyr, los residuos de BoNT/B 256Phe-257Phe, los residuos de BoNT/C1 257phe-258Tyr, los residuos de BoNT/D 257phe-258Phe, los residuos de BoNT/E 239Pro-240Leu, los residuos de BoNT/F 254Pro-255Leu, los residuos de BoNT/G 256Phe-257Phe o los residuos de TeNT 259Ile-260Tyr. En un aspecto de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende al menos seis residuos consecutivos de toxina clostridial incluyendo Phe-Gly. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende al menos seis residuos consecutivos de una toxina clostridial que incluyen los residuos de BoNT/A Phe266-Gly267, los residuos de BoNT/B Phe272-Gly273, los residuos de BoNT/c1 Phe273-Gly274, los residuos de BonT/D Phe273-Gly274, los residuos de BoNT/E Phe255-Gly256, los residuos de BoNT/F Phe270-Gly271, los residuos de BoNT/G Phe272-Gly273 o los residuos de TeNT Phe275-Gly276.
En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende p. ej., los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1; los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2; los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3; los residuos BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4; los
residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5; los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6; los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7; o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende, p.
ej., los residuos de BoNT/A 247-254 de la SEQ ID NO: 1; los residuos de BoNT/B 253-260 de la SEQ ID NO: 2; los residuos de BoNT/C1 254-261 de la SEQ ID NO: 3; los residuos de BoNT/D 254-261 de la SEQ ID NO: 4; los residuos de BoNT/E 236-243 de la SEQ ID NO: 5; los residuos de BoNT/F 251-258 de la SEQ ID NO: 6; los residuos de BoNT/G 253-260 de la SEQ ID NO: 7; o los residuos de TeNT 256-263 de la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende, p.
ej., los residuos de BoNT/A 263-270 de la SEQ ID NO: 1; los residuos de BoNT/B 269-276 de la SEQ ID NO: 2; los residuos de BoNT/C1 270-277 de la SEQ ID NO: 3; los residuos de BoNT/D 270-277 de la SEQ ID NO: 4; los residuos de BoNT/E 252-259 de la SEQ ID NO: 5; los residuos de BoNT/F 267-274 de la SEQ ID NO: 6; los residuos de BoNT/G 269-276 de la SEQ ID NO: 7; o los residuos de TeNT 272-279 de la SEQ ID NO: 8.
En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253
278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos de BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ
ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8; una identidad de los aminoácidos como mínimo del
60% con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO:
2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos de BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8; una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos de BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8; una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos de BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4 residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8; una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos de BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8; o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos de BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8.
En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos de BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8; una identidad de los aminoácidos como máximo del 60% con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos de BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT
255-280 de la SEQ ID NO: 8; una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con los residuos de BoNT/A
246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253
278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos de BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ
ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8; una identidad de los aminoácidos como máximo del
80% con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO:
2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos de BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8; una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos de BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8; o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con los
residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos de BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8.
En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8.
En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253 278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8.
En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8.
En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con los residuos de BonT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8.
En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8.
En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión autocatalítica de sustrato de toxina clostridial comprende un polipéptido que tiene p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con los residuos de BoNT/A 246-271 de la SEQ ID NO: 1, los residuos de BoNT/B 252-277 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de BoNT/C1 253-278 de la SEQ ID NO: 3, los residuos BoNT/D 253-278 de la SEQ ID NO: 4, los residuos de BoNT/E 235-260 de la SEQ ID NO: 5, los residuos de BoNT/F 250-275 de la SEQ ID NO: 6, los residuos de BoNT/G 252-277 de la SEQ ID NO: 7 o los residuos de TeNT 255-280 de la SEQ ID NO: 8.
El sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario. Como se usa en la presente memoria, la expresión “región del bucle bicatenario” significa la secuencia de aminoácidos de una toxina clostridial que contiene un sitio de escisión por proteasa usado para convertir la forma monocatenaria de una toxina clostridial en la forma bicatenaria. Como ejemplos no restrictivos, la región del bucle bicatenario de BoNT/A comprende los aminoácidos 430-454 de la s Eq ID NO: 1; la región del bucle bicatenario de BoNT/B comprende los aminoácidos 437-446 de la SEQ ID NO: 2; la región del bucle bicatenario de BoNT/C1 comprende los aminoácidos 437-453 de la SEQ ID NO: 3; la región del bucle bicatenario de BoNT/D comprende los aminoácidos 437-450 de la SEQ ID NO: 4; la región del bucle bicatenario de BoNT/E comprende los aminoácidos 412-426 de la SEQ ID NO: 5; la región del bucle bicatenario de BoNT/F comprende los aminoácidos 429-445 de la SEQ ID NO: 6; la región del bucle bicatenario de BoNT/G comprende los aminoácidos 436-450 de la SEQ ID NO: 7; y la región del bucle bicatenario de TeNT comprende los aminoácidos 439-467 de la SEQ ID NO: 8.
Como se menciona anteriormente, una toxina clostridial se convierte de una forma polipeptídica monocatenaria a una molécula bicatenaria mediante una escisión proteolítica. Aunque actualmente se desconoce la identidad de la proteasa natural, se ha determinado la ubicación del sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario para muchas toxinas clostridiales (Tabla 8). La escisión en el bucle bicatenario no parece estar restringida a un solo enlace peptídico. De este modo, la escisión de una toxina clostridial con una proteasa del bucle bicatenario natural da como resultado la pérdida de varios residuos que giran en torno al sitio de escisión original. Esta pérdida está limitada a unos cuantos aminoácidos ubicados entre los dos residuos de cisteína que forman el enlace de tipo disulfuro. Como ejemplo no restrictivo, la escisión del polipéptido monocatenario de BoNT/A da como resultado en última instancia la pérdida de diez aminoácidos en el bucle bicatenario. Para las BoNT, la escisión en K448-A449 convierte la forma monocatenaria de BoNT/A en la forma bicatenaria; la escisión en K441-A442 convierte la forma monocatenaria de BoNT/B en la forma bicatenaria; la escisión en K449-T450 convierte la forma monocatenaria de BoNT/C1 en la forma bicatenaria; la escisión en R445-D446 convierte la forma monocatenaria de BoNT/D en la forma bicatenaria; la escisión en R422-K423 convierte la forma monocatenaria de BoNT/E en la forma bicatenaria; la escisión de K439-A440 convierte la forma monocatenaria de BoNT/F en la forma bicatenaria; y la escisión en K446-S447 convierte la forma monocatenaria de BoNT/G en la forma bicatenaria. La escisión proteolítica de la forma monocatenaria de TeNT en A457-S458 da como resultado la forma bicatenaria.
Sin embargo, también debería observarse que otros sitios de escisión adicionales del bucle bicatenario también parecen ser escindidos dando como resultado la pérdida de un pequeño fragmento peptídico. Como ejemplo no restrictivo, la escisión del polipéptido monocatenario de BoNT/A da como resultado en última instancia la pérdida de un fragmento de diez aminoácidos en el bucle bicatenario. De este modo, la escisión en S441-L442 convierte la forma polipeptídica monocatenaria de BoNT/A en la forma bicatenaria; la escisión en G444-1445 convierte la forma polipeptídica monocatenaria de BoNT/B en la forma bicatenaria; la escisión en S445-L446 convierte la forma polipeptídica monocatenaria de BoNT/C1 en la forma bicatenaria; la escisión en K442-N443 convierte la forma polipeptídica monocatenaria de BoNT/D en la forma bicatenaria; la escisión en K419-G420 convierte la forma polipeptídica monocatenaria de BoNT/E en la forma bicatenaria; la escisión de K423-S424 convierte la forma polipeptídica monocatenaria de BoNT/E en la forma bicatenaria; la escisión en K436-G437 convierte la forma polipeptídica monocatenaria de BoNT/F en la forma bicatenaria; la escisión en T444-G445 convierte la forma polipeptídica monocatenaria de BoNT/G en la forma bicatenaria; y la escisión en E448-Q449 convierte la forma polipeptídica monocatenaria de BoNT/G en la forma bicatenaria.
Es posible modificar la región del bucle bicatenario para que incluya un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial además del sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural. En este tipo de modificación, ambos sitios de escisión están ligados operativamente en marco a una toxina clostridial modificada como una proteína de fusión y ambos sitios pueden ser escindidos por sus respectivas proteasas. Como ejemplo no restrictivo, una BoNT/A modificada que comprende un bucle bicatenario que contiene tanto el sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural como un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A puede ser escindida bien por la proteasa del bucle bicatenario endógena encontrada en la C. botulinum de serotipo A o por BoNT/A. Como otro ejemplo no restrictivo, una BoNT/A modificada que comprende un bucle bicatenario que contiene tanto el sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural como un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E puede ser escindida bien por la proteasa del bucle bicatenario endógena encontrada en la C. botulinum de serotipo A o por BoNT/E.
También es posible modificar la región del bucle bicatenario para sustituir el sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural con un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial. En este tipo de modificación, el sitio de escisión por proteasa natural se vuelve inviable y, por tanto, no puede ser escindido por su proteasa. Solo el sitio de escisión de sustrato de una toxina clostridial puede ser escindido por su correspondiente toxina. Tal sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial está ligado operativamente en marco a una toxina clostridial modificada en forma de una proteína de fusión. Como ejemplo no restrictivo, una BoNT/A modificada monocatenaria que comprende un bucle bicatenario que solo contiene un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A puede ser BoNT/A escindida, pero no la proteasa del bucle bicatenario endógena encontrada en la C. botulinum de serotipo A. Como otro ejemplo no restrictivo, una BoNT/A modificada monocatenaria que comprende un bucle bicatenario que solo contiene un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E puede ser BoNT/E escindida, pero no la proteasa del bucle bicatenario endógena encontrada en la C. botulinum de serotipo A.
El sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural puede hacerse inviable mediante la modificación de al menos uno de los aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido por la proteasa natural. Se pueden hacer mayores modificaciones con la condición de que los dos residuos de cisteína de la región del bucle bicatenario permanezcan intactos y se pueda seguir formando el enlace de tipo disulfuro. Los ejemplos no restrictivos de una modificación de aminoácidos incluyen la eliminación de un aminoácido o la sustitución del aminoácido original con un aminoácido diferente. Estas modificaciones se pueden realizar usando procedimientos de mutagénesis estándar conocidos por el experto en la técnica. Además, los ejemplos no restrictivos de los procedimientos de mutagénesis, así como los reactivos, las condiciones y los protocolos bien caracterizados se pueden obtener fácilmente de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. Estos protocolos son procedimientos rutinarios al alcance de cualquier experto en la técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la presente memoria.
De este modo, en una realización, un sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural se vuelve inviable mediante la modificación de al menos uno de los aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido por una proteasa natural. En aspectos de esta realización, se modifica el aminoácido P, del sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario o se modifica el aminoácido Pr del sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario. En otros aspectos de esta realización, se modifica bien K448 o A449 de BoNT/A; se modifica bien S441 o L442 de BoNT/A;
se modifica bien K441 o A442 de BoNT/B; se modifica bien G444 o 1445 de BoNT/B; se modifica bien K449 o T450 de BoNT/C1; se modifica bien S445 o L446 de BoNT/C1; se modifica bien R445 o D446 de BoNT/D; se modifica bien K442 o N443 de BoNT/D; se modifica bien R422 o K423 de BoNT/E; se modifica bien K419 o G420 de BoNT/E; se modifica bien K423 o S424 de BoNT/E; se modifica bien K439 o A440 de BoNT/F; se modifica bien K436 o G437 de BoNT/F; se modifica bien K446 o S447 de BoNT/G; se modifica bien T444 o G445 de BoNT/G; se modifica bien
E448 o Q449 de BoNT/G; o se modifica bien A457 o S458 de TeNT.
En otra realización, un sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural se vuelve inviable mediante la modificación de dos aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido por una proteasa natural, i. e., P1 y P1.
En otros aspectos de esta realización, se modifican tanto K448 como A449 de BoNT/A; se modifican tanto S441 como L442 de BoNT/A; se modifican tanto K441 como A442 de BoNT/B; se modifican tanto G444 como 1445 de BoNT/B; se modifican tanto K449 como T450 de BoNT/C1; se modifican tanto S445 como L446 de BoNT/C1; se modifican tanto R445 como D446 de BoNT/D; se modifican tanto K442 como N443 de BoNT/D; se modifican tanto
R422 como K423 de BoNT/E; se modifican tanto K419 como G420 de BoNT/E; se modifican tanto K423 como S424 de BoNT/E; se modifican tanto K439 como A440 de BoNT/F; se modifican tanto K436 como G437 de BoNT/F; se modifican tanto K446 como S447 de BoNT/G; se modifican tanto T444 como G445 de BoNT/G; se modifican tanto
E448 como Q449 de BoNT/G; o se modifican tanto A457 como S458 de TeNT.
En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural se vuelve inviable mediante la modificación de, p. ej., al menos dos aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos tres aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos cuatro aminoácidos de la región del bucle bicatenario;
al menos cinco aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos seis aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos siete aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos ocho aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos nueve aminoácidos de la región del bucle bicatenario; al menos diez aminoácidos de la región del bucle bicatenario; o al menos 15 aminoácidos de la región del bucle bicatenario. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural se vuelve inviable mediante la modificación de uno de los aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido por una proteasa natural y, p.
ej., al menos un aminoácido más de la región del bucle bicatenario; al menos dos aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos tres aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos cuatro aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos cinco aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos seis aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos siete aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos ocho aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos nueve aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos diez aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos 15 aminoácidos más de la región del bucle bicatenario. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural se vuelve inviable mediante la modificación de los dos aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido por una proteasa natural y, p. ej., al menos un aminoácido más de la región del bucle bicatenario; al menos dos aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos tres aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos cuatro aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos cinco aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos seis aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos siete aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos ocho aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos nueve aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos diez aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; al menos 15 aminoácidos más de la región del bucle bicatenario.
En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural se vuelve inviable mediante la modificación de, p. ej., cómo máximo dos aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo tres aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo cuatro aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo cinco aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo seis aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo siete aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo ocho aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo nueve aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo diez aminoácidos de la región del bucle bicatenario; o como máximo 15 aminoácidos de la región del bucle bicatenario. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural se vuelve inviable mediante la modificación de uno de los aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido por una proteasa natural y, p. ej., cómo máximo un aminoácido más de la región del bucle bicatenario; como máximo dos aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo tres aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo cuatro más aminoácidos de la región del bucle bicatenario; como máximo cinco aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo seis aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo siete aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo ocho aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo nueve aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo diez aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo 15 aminoácidos más de la región del bucle bicatenario. En otros aspectos más de esta realización, un sitio de escisión
por proteasa del bucle bicatenario natural se vuelve inviable mediante la modificación de dos aminoácidos que flanquean el enlace peptídico escindido por una proteasa natural y, p. ej., como máximo un aminoácido más de la región del bucle bicatenario; como máximo dos aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo tres aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo cuatro aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo cinco aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo seis aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo siete aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo ocho aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo nueve aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo diez aminoácidos más de la región del bucle bicatenario; como máximo 15 aminoácidos más de la región del bucle bicatenario.
Se prevé la posibilidad de modificar la región del bucle bicatenario de una toxina clostridial para que incluya algún o todos los sitios de escisión del sustrato de la toxina clostridial. En aspectos de referencia, se puede modificar un bucle bicatenario de una toxina clostridial revelada en la presente memoria para que comprenda p. ej., un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de sustrato de TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT o un sitio de escisión de sustrato de BuNT. En otra referencia, se puede modificar un bucle bicatenario de una toxina clostridial, además del sitio de escisión por proteasa natural, para que comprenda p. ej., un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G o un sitio de escisión de sustrato de TeNT. En otros aspectos más de esta realización, se puede modificar un bucle bicatenario de una toxina clostridial para sustituir un sitio de escisión por proteasa natural con p. ej., un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de sustrato de TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT o un sitio de escisión de sustrato de BuNT.
La ubicación del sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial puede ser cualquiera dentro de la toxina clostridial, con la condición de que la escisión del sitio debe tener lugar entre los dos residuos de cisteína que forman el único enlace de tipo disulfuro de la toxina. De este modo, en aspectos de esta realización, la ubicación de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial puede ser, p. ej., cualquiera dentro de la BoNT/A de SEQ ID NO: 1, con la condición de que la escisión tenga lugar entre la cisteína 430 y la cisteína 454; cualquiera dentro de la BoNT/B de
SEQ ID NO: 2, con la condición de que la escisión tenga lugar entre la cisteína 437 y la cisteína 446; cualquiera dentro de la BoNT/C1 de SEQ ID NO: 2, con la condición de que la escisión tenga lugar entre la cisteína 437 y la cisteína 453; cualquiera dentro de la BoNT/D de SEQ ID NO: 4, con la condición de que la escisión tenga lugar entre la cisteína 437 y la cisteína 450; cualquiera dentro de la BoNT/E de SEQ ID NO: 5, con la condición de que la escisión tenga lugar entre la cisteína 412 y la cisteína 426; cualquiera dentro de la BoNT/F de SEQ ID NO: 6, con la condición de que la escisión tenga lugar entre la cisteína 429 y la cisteína 445; cualquiera dentro de la BoNT/G de
SEQ ID NO: 7, con la condición de que la escisión tenga lugar entre la cisteína 436 y la cisteína 450; o cualquiera dentro de la TeNT de SEQ ID NO: 8, con la condición de que la escisión tenga lugar entre la cisteína 439 y la cisteína 467.
Se entiende que una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede incluir opcionalmente uno o más componentes adicionales. Como ejemplo no restrictivo de un componente opcional, una toxina clostridial modificada puede comprender además una región flexible que comprenda un espaciador flexible. Los ejemplos no restrictivos de un espaciador flexible incluyen, p. ej., un espaciador de G GGGGS (SEQ ID NO: 156) o un espaciador de A EAAAK (SEQ ID NO: 157). Se puede usar una región flexible que comprende espaciadores flexibles para ajustar la longitud de una región de polipéptido con el fin de optimizar una característica, un atributo o una propiedad de un polipéptido. Tal región flexible está ligada operativamente en marco a la toxina clostridial modificada en forma de una proteína de fusión. Como ejemplo no restrictivo, se puede usar una región de polipéptido que comprenda uno o más espaciadores flexibles en tándem para poner mejor al descubierto un sitio de escisión por proteasa facilitando así la escisión del sitio por una proteasa. Como otro ejemplo no restrictivo, se puede usar una región de polipéptido que comprenda uno o más espaciadores flexibles en tándem para presentar mejor un dominio de ligando, facilitando así la unión de ese dominio de ligando con su dominio de unión sobre un receptor.
De este modo, en una realización, una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede comprender además una región flexible que comprenda un espaciador flexible. En otra realización, una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede comprender además una región flexible que comprenda una pluralidad de espaciadores flexibles en tándem. En aspectos de esta realización, una región flexible puede comprender en tándem, p. ej., al menos 1 espaciador de G, al menos 2 espaciadores de G, al menos 3 espaciadores de G, al menos 4 espaciadores de G o al menos 5 espaciadores de G. En otros aspectos de esta realización, una región flexible puede comprender en tándem, p. ej., como máximo 1 espaciador de G, como máximo
2 espaciadores de G, como máximo 3 espaciadores de G, como máximo 4 espaciadores de G o como máximo 5 espaciadores de G. En otros aspectos más de esta realización, una región flexible puede comprender en tándem, p.
ej., al menos 1 espaciador de A, al menos 2 espaciadores de A, al menos 3 espaciadores de A, al menos 4 espaciadores de A o al menos 5 espaciadores de A. En otros aspectos más de esta realización, una región flexible
puede comprender en tándem, p. ej., como máximo 1 espaciador de A, como máximo 2 espaciadores de A, como máximo 3 espaciadores de A, como máximo 4 espaciadores de A o como máximo 5 espaciadores de A. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender una región flexible que comprenda una o más copias de los mismos espaciadores flexibles, una o más copias de diferentes regiones de espaciadores flexibles o cualquier combinación de las mismas.
Como otro ejemplo no restrictivo de un componente opcional, una toxina clostridial modificada puede comprender además una región de unión a un epítopo. Una región de unión a un epítopo se puede usar en una amplia variedad de procedimientos que implican, p. ej., la purificación de proteínas y la visualización de proteínas. Tal región de unión a un epítopo está ligada operativamente en marco a una toxina clostridial modificada en forma de una proteína de fusión. Los ejemplos no restrictivos de una región de unión a un epítopo incluyen, p. ej., FLAG, Express™ (SEQ ID NO: 158), hemaglutinina (HA) del virus de la gripe humana (SEQ ID nO: 159), proteína p62c-Myc humana (c-MYC) (SEQ ID nO: 160), glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) (SEQ ID nO: 161), sustancia P (SEQ ID NO: 162), precursor de glicoproteína D del virus del herpes simple (HSV) (SEQ ID NO: 163), V5 (SEQ ID NO: 164), AU1 (SEQ ID NO: 165) y AU5 (SEQ ID NO: 166); unión por afinidad, tal como, p. ej., polihistidina (HIS) (SEQ ID NO: 167), péptido de unión a estreptavidina (strep) y biotina o una secuencia de biotinilación; regiones de unión a péptidos, tales como, p. ej., dominio de unión a glutationa de la glutationa-S-transferasa, el dominio de unión a calmodulina de la proteína de unión a la calmodulina y el dominio de unión a maltosa de la proteína de unión a la maltosa. Los ejemplos no restrictivos de los protocolos específicos para seleccionar, elaborar y usar un péptido de unión apropiado se describen en, p. ej., “Epitope Tagging”, pp. 17.90-17.93 (Sambrook y Russell, ends., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Vol. 3, III ed. 2001); “ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL” (Edward Harlow y David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, II Ed. 1998); y “USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL: PORTABLE PROTOCOL NO. I” (Edward Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998). Además, los ejemplos no restrictivos de los péptidos de unión, así como de los reactivos, las condiciones y los protocolos bien caracterizados se pueden obtener fácilmente de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. Estos protocolos son procedimientos rutinarios al alcance de cualquier experto en la técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la presente memoria.
De este modo, en una realización, una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede comprender además una región de unión a un epítopo. En otra realización, una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede comprender además una pluralidad de regiones de unión epitópica. En aspectos de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender, p. ej., al menos 1 región de unión epitópica, al menos 2 regiones de unión epitópica, al menos 3 regiones de unión epitópica, al menos 4 regiones de unión epitópica o al menos 5 regiones de unión epitópica. En otros aspectos de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender, p. ej., como máximo 1 región de unión epitópica, como máximo 2 regiones de unión epitópica, como máximo 3 regiones de unión epitópica, como máximo 4 regiones de unión epitópica o como máximo 5 regiones de unión epitópica. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender una o más copias de la misma región de unión epitópica, una o más copias de diferentes regiones de unión a epítopos, o cualquier combinación de las mismas.
La ubicación de una región de unión epitópica puede estar en diversas posiciones, incluyendo, sin limitación, en el terminal amino de una toxina clostridial modificada, dentro de una toxina clostridial modificada o en el terminal carboxilo de una toxina clostridial modificada. De este modo, en una realización, una región de unión epitópica se ubica en el terminal amino de una toxina clostridial modificada. En tal ubicación, debería haber una metionina inicial en frente de la región de unión epitópica. Además, en la técnica, se sabe que cuando se añade un polipéptido que está ligado operativamente al terminal amino de otro polipéptido que comprende la metionina inicial, se puede eliminar el resido de metionina original. Esto se debe al hecho de que el polipéptido añadido contendrá una nueva metionina inicial y que la metionina inicial original puede reducir la expresión óptima de la proteína de fusión. En aspectos de esta realización, una región de unión epitópica ubicada en el terminal amino de una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede ser una región de unión al epítopo FLAG, Expres™, una región de unión al epítopo de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe humana, una región de unión al epítopo de la proteína p62c-Myc humana (c-MYC), una región de unión al epítopo de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), una región de unión al epítopo de la sustancia P, una región de unión al epítopo del precursor de la glicoproteína D del virus del herpes simple (HSV), una región de unión al epítopo V5, una región de unión al epítopo AU1, una región de unión al epítopo AU5, una región de unión al epítopo de la polihistidina, una región de unión al epítopo del péptido de unión a estreptavidina, una región de unión al epítopo de la biotina, una región de unión al epítopo de la biotinilación, un dominio de unión a glutationa de la glutationa-S-transferasa, un dominio de unión a calmodulina de la proteína de unión a la calmodulina o un dominio de unión a maltosa de la proteína de unión a la maltosa.
En otra realización, una región de unión epitópica se ubica en el terminal carboxilo de una toxina clostridial modificada. En aspectos de esta realización, una región de unión epitópica ubicada en el terminal carboxilo de una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede ser una región de unión al epítopo FLAG, Expres™, una región de unión al epítopo de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe humana, una región de unión al epítopo de la proteína p62c-Myc humana (c-myc), una región de unión al epítopo de la glicoproteína del virus de la
estomatitis vesicular (VSV-G), una región de unión al epítopo de la sustancia P, una región de unión al epítopo del precursor de la glicoproteína D del virus del herpes simple (HSV), una región de unión al epítopo V5, una región de unión al epítopo AU1, una región de unión al epítopo AU5, una región de unión al epítopo de la polihistidina, una región de unión al epítopo del péptido de unión a estreptavidina, una región de unión al epítopo de la biotina, una región de unión al epítopo de la biotinilación, un dominio de unión a glutationa de la glutationa-S-transferasa, un dominio de unión a calmodulina de la proteína de unión a la calmodulina o un dominio de unión a maltosa de la proteína de unión a la maltosa.
Como otro ejemplo no restrictivo más de un componente opcional, una toxina clostridial modificada puede comprender además un sitio de escisión por proteasa exógena. Un sitio de escisión por proteasa exógena se puede usar en una amplia variedad de procedimientos que implican, p. ej., la eliminación de una región de unión epitópica mediante escisión proteolítica. Tal sitio de escisión por proteasa exógena está ligado operativamente en marco a una toxina clostridial modificada en forma de una proteína de fusión. Los ejemplos no restrictivos de sitios de escisión por proteasa incluyen, p. ej., un sitio de escisión por la enteroquinasa (Tabla 9); un sitio de escisión por la trombina (Tabla 9); un sitio de escisión por el Factor Xa (Tabla 9); un sitio de escisión por la proteasa del rinovirus 3C humano (Tabla 9); un sitio de escisión por la proteasa del virus del tabaco Etch (TEV) (Tabla 9); un sitio de escisión por la dipeptidil-aminopeptidasa y un sitio de escisión por la proteasa del modificador pequeño de tipo ubiquitina (SUMO)/ proteína 1 de tipo ubiquitina (ULP-1), tal como, p. ej., MADSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSS EIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG (SEQ ID NO: 185).
De este modo, en una realización, una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede comprender además un sitio de escisión por proteasa exógena. En otra realización, una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede comprender además una pluralidad de sitios de escisión por proteasa
exógena. En aspectos de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender, p. ej., al menos 1 sitio de escisión por proteasa exógena, al menos 2 sitios de escisión por proteasa exógena, al menos 3 sitios de escisión por proteasa exógena, al menos 4 sitios de escisión por proteasa exógena o al menos 5 sitios de escisión por proteasa exógena. En otros aspectos de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender, p. ej., como máximo 1 sitio de escisión por proteasa exógena, como máximo 2 sitios de escisión por proteasa exógena, como máximo 3 sitios de escisión por proteasa exógena, como máximo 4 sitios de escisión por proteasa exógena o como máximo 5 sitios de escisión por proteasa exógena. En otro aspecto de esta realización, una toxina clostridial modificada puede comprender una o más copias del mismo sitio de escisión por proteasa exógena, una o más copias de diferentes sitios de escisión por proteasa exógena, o cualquier combinación de las mismas.
La ubicación de un sitio de escisión por proteasa exógena puede estar en una variedad de posiciones, incluyendo, sin limitación, entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada con el fin de facilitar la eliminación de la región de unión epitópica mediante escisión proteolítica. Se prevé la posibilidad de usar un sitio de escisión por proteasa exógena para eliminar una región de unión epitópica. Como se menciona anteriormente, las regiones de unión epitópica se pueden usar en procedimientos de purificación de proteínas y, a menudo, es deseable eliminar tales regiones de unión epitópica una vez purificada la proteína. Un modo común de hacerlo consiste en tener un sitio de escisión por proteasa entre la proteína de interés y la región de unión epitópica, mediante lo que la escisión proteolítica del sitio de escisión por proteasa separa la proteína de interés de la región de unión epitópica. Los ejemplos no restrictivos de los sitios de escisión por proteasa usados para eliminar las regiones de unión epitópica, así como las proteasas, los reactivos, las condiciones y los protocolos bien caracterizados se pueden obtener fácilmente de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. La selección, la elaboración y el uso de un sitio de escisión por proteasa apropiado son procedimientos rutinarios al alcance de cualquier experto en la técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la presente memoria.
De este modo, en una realización, un sitio de escisión por proteasa exógena está ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada. En otros aspectos de esta realización, un sitio de escisión por la enteroquinasa bovina está ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada, un sitio de escisión por la proteasa del virus del tabaco Etch está ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada, un sitio de escisión por la proteasa del rinovirus 3C humano está ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada, un sitio de escisión por la proteasa de SUMO/ULP-1 está ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada, un sitio de escisión por la proteasa trombina está ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada o un sitio de escisión por la proteasa del factor de coagulación Xa está ubicado entre una región de unión a un epítopo y una toxina clostridial modificada. En otros aspectos de la realización, el sitio de escisión por la enteroquinasa bovina ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada comprende la SEQ ID NO: 168. En otros aspectos de la realización, el sitio de escisión por proteasa del virus del tabaco Etch ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada comprende la SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ iD NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177 o SEQ ID NO: 178. En otros aspectos más de la realización, el sitio de escisión por la proteasa del rinovirus 3C humano ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada comprende la SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 o SEQ ID NO: 1 8 4. En otros aspectos más de la realización, el sitio de escisión por la proteasa de SUMO/ULP-1 ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada comprende la SEQ ID NO: 185. En otros aspectos más de la realización, el sitio de escisión por la proteasa trombina ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada comprende la SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199 o SEQ ID NO: 200. En otros aspectos de la realización, el sitio de escisión por la proteasa de factor de coagulación Xa ubicado entre una región de unión epitópica y una toxina clostridial modificada comprende la SEQ ID NO: 201 o SEQ ID NO: 202.
Los aspectos de la presente invención proporcionan, en parte, toxinas clostridiales modificadas. Como se usa en la presente memoria, la expresión “toxina clostridial modificada” significa cualquier toxina clostridial natural o toxina clostridial no natural que comprende al menos la sustitución de un sitio de escisión por proteasa bicatenaria natural con un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial según lo revelado en la presente memoria, o la adición de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial según lo revelado en la presente memoria en la región del bucle bicatenario. Los ejemplos no restrictivos de las toxinas clostridiales modificadas reveladas en la presente memoria incluyen, p. ej., una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, en la que el sitio de escisión del sustrato sustituyó al sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural; una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, en la que el sitio de escisión del sustrato está añadido a la región del bucle bicatenario; una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial y un dominio de unión celular que tiene una mayor actividad de unión celular capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial natural, en la que el sitio de escisión del sustrato sustituyó al sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural; una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial y un dominio de unión celular que tiene una mayor
actividad de unión celular capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial natural, en la que el sitio de escisión del sustrato está añadido a la región del bucle bicatenario; una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial y un dominio de unión celular que tiene una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial natural, en la que el sitio de escisión del sustrato sustituyó al sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural; una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial y un dominio de unión celular que tiene una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial natural, en la que el sitio de escisión del sustrato está añadido a la región del bucle bicatenario; una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial y un dominio de unión celular que tiene una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial no natural, en la que el sitio de escisión del sustrato sustituyó al sitio de escisión por proteasa del bucle bicatenario natural; y una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial y un dominio de unión celular que tiene una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial no natural, en la que el sitio de escisión del sustrato está añadido a la región del bucle bicatenario.
Los ejemplos no restrictivos de las modificaciones de las toxinas clostridiales reveladas en la presente memoria incluyen, p. ej., la sustitución de un sitio de escisión por proteasa bicatenaria natural con un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, la adición de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, la adición de un sitio de escisión por proteasa exógena, la sustitución de un dominio de unión celular endógeno con un dominio de unión celular que tiene una mayor actividad de unión celular capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial natural, la adición de un dominio de unión celular que tiene una mayor actividad de unión celular capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial natural, la sustitución de un dominio de unión celular endógeno con un dominio de unión celular que tiene una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial natural, la adición de un dominio de unión celular que tiene una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial natural, la sustitución de un dominio de unión celular endógeno con un dominio de unión celular que tiene una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial no natural, la adición de un dominio de unión celular que tiene una actividad de unión celular alterada capaz de intoxicar a una célula diana de toxina clostridial no natural, la adición de un sitio de escisión por proteasa exógena, la reorganización de los dominios enzimático, de translocalización y de unión, la adición de una región espaciadora y la adición de una región de unión epitópica.
Se entiende que la totalidad de tales modificaciones no afecta sustancialmente a la capacidad de una toxina clostridial para intoxicar a una célula. Como se usa en la presente memoria, la expresión “que no afecta sustancialmente” significa que una toxina clostridial todavía puede ejecutar el mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial entra en una neurona e inhibe la liberación de neurotransmisores, y engloba la unión de una toxina clostridial a un complejo receptor de baja o alta afinidad, la interiorización del complejo de toxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de la toxina clostridial en el citoplasma y la modificación enzimática de un sustrato de toxina clostridial. En aspectos de esta realización, la toxina clostridial modificada es, p. ej., al menos un 10% tan tóxica como una toxina clostridial natural, al menos un 20% tan tóxica como una toxina clostridial natural; al menos un 30% tan tóxica como una toxina clostridial natura, al menos un 40% tan tóxica como una toxina clostridial natural, al menos un 50% tan tóxica como una toxina clostridial natural, al menos un 60% tan tóxica como una toxina clostridial natural, al menos un 70% tan tóxica como una toxina clostridial natural, al menos un 80% tan tóxica como una toxina clostridial natural, al menos un 90% tan tóxica como una toxina clostridial natural o al menos un 95% tan tóxica como una toxina clostridial natural. En aspectos de esta realización, la toxina clostridial modificada es, p. ej., como máximo un 10% tan tóxica como una toxina clostridial natural, como máximo un 20% tan tóxica como una toxina clostridial natural; como máximo un 30% tan tóxica como una toxina clostridial natura, como máximo un 40% tan tóxica como una toxina clostridial natural, como máximo un 50% tan tóxica como una toxina clostridial natural, como máximo un 60% tan tóxica como una toxina clostridial natural, como máximo un 70% tan tóxica como una toxina clostridial natural, como máximo un 80% tan tóxica como una toxina clostridial natural, como máximo un 90% tan tóxica como una toxina clostridial natural o como máximo un 95% tan tóxica como una toxina clostridial natural.
Los aspectos de la presente invención proporcionan, en parte, moléculas de polinucleótido. Como se usa en la presente memoria, la expresión “molécula de polinucleótido” es sinónimo de “molécula de ácido nucleico” y significa una forma polimérica de nucleótidos, tal como, p. ej., ribonucleótidos y desoxirribunucleótidos, de cualquier longitud. Se prevé que cualquiera y todas las moléculas de polinucleótido que puedan codificar una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria pueden ser útiles, incluyendo, sin limitación, moléculas de ADN naturales y no naturales, y moléculas de ARN naturales y no naturales. Los ejemplos no restrictivos de las moléculas de ADN naturales y no naturales incluyen moléculas de ADN monocatenario, moléculas de ADN bicatenario, moléculas de ADN genómico, moléculas de ADNc, constructos vectoriales, tales como, p. ej., constructos de plásmidos, constructos de fagémidos, constructos de bacteriófagos, constructos retrovirales y constructos de cromosomas artificiales. Los ejemplos no restrictivos de las moléculas de ARN naturales y no naturales incluyen moléculas de ARN monocatenario, moléculas de ARN bicatenario y ARNm.
De este modo, en una realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio de translocación de toxina clostridial y un dominio de unión de toxina clostridial. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial que comprende una variante natural de toxina clostridial, tal como, p. ej., una isoforma de toxina clostridial
0 un subtipo de toxina clostridial. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial que comprende una variante no natural de toxina clostridial, tal como, p. ej., una variante conservadora de toxina clostridial, una variante no conservadora de toxina clostridial o un fragmento activo de toxina clostridial, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial que comprende un dominio enzimático de toxina clostridial o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de toxina clostridial o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de toxina clostridial o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos. En otros aspectos de esta realización, una toxina clostridial comprende una BoNT/A, una BoNT/B, una BoNT/C1, una BoNT/D, una BoNT/E, una BoNT/F, una BoNT/G o una TeNT.
En otra realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende una BoNT/A. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un dominio enzimático de BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/A y un dominio de unión de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende una variante natural de BoNT/A, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/A o un subtipo de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende una variante natural de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/A de la SEQ iD NO: 1 o un subtipo de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende una variante no natural de BoNT/A, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/A, una variante no conservadora de BoNT/A o un fragmento activo de BoNT/A, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende una variante no natural de BoNT/A de la SEQ ID NO: 1, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, una variante no conservadora de BoNT/A de SEQ iD nO: 1 o un fragmento activo de BoNT/A de SEQ ID NO: 1, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un dominio enzimático de BoNT/A o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/A o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/A o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/A que comprende un dominio enzimático de BoNT/A de los aminoácidos 1-448 de SEQ ID NO: 1 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/A de los aminoácidos 449-860 de la SEQ ID NO: 1 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/A de los aminoácidos 861-1296 de la SEQ ID NO: 1 o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 1 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ Id NO: 1, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 1, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 1 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 1.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos de
esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 1.
En otra realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende una BoNT/B. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un dominio enzimático de BoNT/B, un dominio de translocación de BoNT/B y un dominio de unión de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende una variante natural de BoNT/B, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/B o un subtipo de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende una variante natural de BoNT/B de la SEQ ID NO: 2, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/B de la SEQ iD NO: 2 o un subtipo de BoNT/B de la SEQ ID NO: 2. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende una variante no natural de BoNT/B, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/B, una variante no conservadora de BoNT/B o un fragmento activo de BoNT/B, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende una variante no natural de BoNT/B de la SEQ ID NO: 2, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/B de SEQ ID NO: 2, una variante no conservadora de BoNT/B de SEQ iD nO: 2 o un fragmento activo de BoNT/B de SEQ ID NO: 2, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/B que comprende un dominio enzimático de BoNT/B o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/B o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/B o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/B que comprende un dominio enzimático de BoNT/B de los aminoácidos 1-441 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/B de los aminoácidos 442-847 de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/B de los aminoácidos 848-1291 de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 2 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ Id NO: 2, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 2, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 2 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 2.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 2.
En otra realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende una BoNT/C1. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un dominio enzimático de BoNT/C1, un dominio de translocación de BoNT/C1 y un dominio de unión de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende la SEQ ID NO: 3. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende una variante natural de BoNT/C1, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/C1 o un subtipo de BoNt /C1. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende una variante natural de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 3, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 3 o un subtipo de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 3. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende una variante no natural de BoNT/C1, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/C1, una variante no conservadora de BoNT/C1 o un fragmento activo de BoNT/C1, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende una variante no natural de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 3, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 3, una variante no conservadora de BoNT/C1 de SeQ ID NO: 3 o un fragmento activo de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 3, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un dominio enzimático de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/C1 o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un dominio enzimático de BoNT/C1 de los aminoácidos 1-449 de la SEQ ID NO: 3 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/C1 de los aminoácidos 450-855 de la SEQ ID NO: 3 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/C1 de los aminoácidos 856-1291 de la SEQ ID NO: 3 o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 3 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 3, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 3 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 3.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 3.
En otra realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende una BoNT/D. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un dominio enzimático de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/D y un dominio de unión de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende la SEQ ID NO: 4. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende una variante natural de BoNT/D, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/D o un subtipo de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende una variante natural de BoNT/D de la SEQ ID NO: 4, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/D de la SEQ iD NO: 4 o un subtipo de BoNT/D de la SEQ ID NO: 4. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende una variante no natural de BoNT/D, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/D, una variante no conservadora de BoNT/D o un fragmento activo de BoNT/D, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende una variante no natural de BoNT/D de la SEQ ID NO: 4, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/D de SEQ ID NO: 4, una variante no conservadora de BoNT/D de SEQ iD nO: 4 o un fragmento activo de BoNT/D de SEQ ID NO: 4, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un dominio enzimático de BoNT/D o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/D o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/D o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/D que comprende un dominio enzimático de BoNT/D de los aminoácidos 1-442 de SEQ ID NO: 4 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/D de los aminoácidos 443-851 de la SEQ ID NO: 4 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/D de los aminoácidos 852-1276 de la SEQ ID NO: 4 o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 4 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 4, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 4 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 4.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p.
ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 1.00, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 4.
En otra realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende una BoNT/E. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un dominio enzimático de BoNT/E, un dominio de translocación de BoNT/E y un dominio de unión de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende la SEQ ID NO: 5. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende una variante natural de BoNT/E, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/E o un subtipo de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende una variante natural de BoNT/E de la SEQ ID NO: 5, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/E de la SEQ iD NO: 5 o un subtipo de BoNT/E de la SEQ ID NO: 5. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende una variante no natural de BoNT/E, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/E, una variante no conservadora de BoNT/E o un fragmento activo de BoNT/E, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende una variante no natural de BoNT/E de la SEQ ID NO: 5, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/E de SEQ ID NO: 5, una variante no conservadora de BoNT/E de SEQ iD NO: 5 o un fragmento activo de BoNT/E de SEQ ID NO: 5, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E que comprende un dominio enzimático de BoNT/E o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/E o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/E o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/E que comprende un dominio enzimático de BoNT/E de los aminoácidos 1-422 de SEQ ID NO: 5 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/E de los aminoácidos 423-834 de la SEQ ID NO: 5 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/E de los aminoácidos 835-1252 de la SEQ ID NO: 5 o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 5 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ Id NO: 5, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 5, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90%
con la SEQ ID NO: 5 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 5.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 5.
En otra realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende una BoNT/F. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un dominio enzimático de BoNT/F, un dominio de translocación de BoNT/F y un dominio de unión de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende una variante natural de BoNT/F, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/F o un subtipo de BoNT/F. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende una variante natural de BoNT/F de la SEQ ID NO: 6, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/F de la SEQ iD NO: 6 o un subtipo de BoNT/F de la SEQ ID NO: 6. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende una variante no natural de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/F, una variante no conservadora de BoNT/F o un fragmento activo de BoNT/F, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende una variante no natural de BoNT/F de la SEQ ID NO: 6, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/F de SEQ ID NO: 6, una variante no conservadora de BoNT/F de SEQ iD n O: 6 o un fragmento activo de BoNT/F de SEQ ID NO: 6, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un dominio enzimático de BoNT/F o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/F o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/F o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un dominio enzimático de BoNT/F de los aminoácidos 1-436 de SEQ ID NO: 6 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/F de los aminoácidos 437-852 de la SEQ ID NO: 6 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/F de los aminoácidos 853-1274 de la SEQ ID NO: 6 o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO:
6, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 6 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 6, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 6 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 6.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 6.
En otra realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende una BoNT/G. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un dominio enzimático de BoNT/G, un dominio de translocación de BoNT/G y un dominio de unión de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende la SEQ ID NO: 7. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende una variante natural de BoNT/G, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/G o un subtipo de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende una variante natural de BoNT/G de la SEQ ID NO: 7, tal como, p. ej., una isoforma de BoNT/G de la SEQ iD NO: 7 o un subtipo de BoNT/G de la SEQ ID NO: 7. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende una variante no natural de BoNT/G, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/G, una variante no conservadora de BoNT/G o un fragmento activo de BoNT/G, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende una variante no natural de BoNT/G de la SEQ ID NO: 7, tal como, p. ej., una variante conservadora de BoNT/G de SEQ ID NO: 7, una variante no conservadora de BoNT/G de SEQ iD nO: 7 o un fragmento activo de BoNT/G de SEQ ID NO: 7, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un dominio enzimático de BoNT/G o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/G o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/G o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una BoNT/G que comprende un dominio enzimático de BoNT/G de los aminoácidos 1-442 de SEQ ID NO: 7 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de BoNT/G de los aminoácidos 443-852 de la SEQ ID NO: 7 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de BoNT/G de los aminoácidos 853-1297 de la SEQ ID NO:
7 o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 7 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 7, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 7 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 7.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 7.
En otra realización, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende una TeNT. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un dominio enzimático de TeNT, un dominio de translocación de TeNT y un dominio de unión de TeNT. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende la SEQ ID NO: 8. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende una variante natural de TeNT, tal como, p. ej., una isoforma de TeNT o un subtipo de TeNT. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende una variante natural de TeNT de la SEQ ID NO: 8, tal como, p. ej., una isoforma de TeNT de la SEQ ID NO: 8 o un subtipo de TeNT de la SEQ ID NO: 8. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende una variante no natural de TeNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de TeNT, una variante no conservadora de TeNT o un fragmento activo de TeNT, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende una variante no natural de TeNT de la SEQ ID NO: 8, tal como, p. ej., una variante conservadora de TeNT de la SEQ ID NO: 8, una variante no conservadora de TeNT de la SEQ ID NO: 8 o un fragmento activo de TeNT de la SEQ ID NO: 8, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una TeNT que comprende un dominio enzimático de TeNT o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de TeNT o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de
TeNT o un fragmento activo del mismo, y cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una TeNT que comprende un dominio enzimático de TeNT de los aminoácidos 1-441 de SEQ ID NO: 8 o un fragmento activo del mismo, un dominio de translocación de TeNT de los aminoácidos 442-870 de la SEQ ID NO: 8 o un fragmento activo del mismo, un dominio de unión de TeNT de los aminoácidos 871-1315 de la SEQ ID NO: 8 o un fragmento activo del mismo, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 70% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 80% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 85% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 90% con la SEQ ID NO: 8 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 95% con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 70% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como máximo del 80% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como máximo del 85% con la SEQ ID NO: 8, una identidad de los aminoácidos como máximo del 90% con la SEQ ID NO: 8 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 95% con la SEQ ID NO: 8.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8.
En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica una TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 o 500 adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 8.
En otra realización más, en la que el sitio de escisión de sustrato de la toxina clostridial deriva de fragmentos autocatalíticos de las propias toxinas clostridiales una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial. En aspectos de referencia, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos más de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sustrato de toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en el que el residuo P-T no está modificado ni sustituido en comparación con el residuo natural de una proteína diana escindida por la toxina clostridial. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en el que el residuo P-T no está modificado ni sustituido en comparación con el residuo natural de una proteína diana escindida por la toxina clostridial que puede ser, p. ej., un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de sustrato de TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT o un sitio de escisión de sustrato de BuNT.
En otros aspectos más de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sustrato de toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en el que el residuo Pi está modificado o sustituido en comparación con el residuo natural de una proteína diana escindida por la toxina clostridial; tal sustrato de toxina clostridial conserva la susceptibilidad a la escisión del enlace peptídico entre los residuos Pi y Pi'. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial en el que el residuo PT está modificado o sustituido en comparación con el residuo natural de una proteína diana escindida por la toxina clostridial que puede ser, p. ej., un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/CI, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, un sitio de escisión de sustrato de TeNT, un sitio de escisión de sustrato de BaNT o un sitio de escisión de sustrato de BuNT.
En otra realización más de referencia, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende al menos seis residuos consecutivos de la SNAP-25 incluyendo Gln-Arg. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (SEQ ID NO: 104); la secuencia de aminoácidos Glu-Ala-Asn-Lys-His-Ala-Thr-Lys (SEQ ID NO: 105); la secuencia de aminoácidos de Glu-Ala-Asn-Lys-His-Ala-Asn-Lys (SEQ ID NO: 106). En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 106, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID nO: 106; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 106. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 106; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 106; una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 106 o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A de SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105 o SEQ ID NO: 106, o cualquier combinación de los mismos. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende p. ej., la SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO: 151.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 104, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 104, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 104 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 104, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 104, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 104 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 104.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido
codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 104.
En otra realización más de referencia, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende al menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo Gln-Phe. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (SEQ ID NO: 107); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser (SEQ ID NO: 108); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Asn (SEQ ID NO: 109); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Gln-Gln (SEQ ID NO: 110); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ala-Ser (SEQ ID NO: 111); o la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NO: 112). En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de la SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 107 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej.,
una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 107 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 107.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107.
En otra realización más de referencia, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende al menos seis residuos consecutivos de sintaxina incluyendo Lys-Ala. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 113); la secuencia de aminoácidos Glu-Thr-Lys-Lys-Ala-Ile-Lys-Tyr (SeQ ID NO: 114); la secuencia de aminoácidos Glu-Ser-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 115); la secuencia de aminoácidos Glu-Thr-Lys-Arg-Ala-Met-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 116); la secuencia de aminoácidos Glu-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 117); la secuencia de aminoácidos Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Leu-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 118); o la secuencia de aminoácidos Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Met-Lys-Tyr (Se Q ID NO: 119). En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, Se Q ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116,
SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119 o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 119, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ iD NO: 113, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 113, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 113 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 113, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 113, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 113 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 113.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 113.
En otro aspecto de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende al menos seis residuos consecutivos de la SNAP-25 incluyendo Arg-Ala. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de toxina BoNT/C1 que comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 120); o la secuencia de aminoácidos de Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-His-Gln-Leu (SEQ ID NO: 121). En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 121, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 121; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 121. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de
BoNT/C1 que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 121; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 99 o SEQ ID NO: XX; una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 121; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 de SEQ ID NO: 120 o SEQ ID NO: 121, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ iD NO: 120, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 120, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 120 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 120, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 120, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 120 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 120.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 120.
En otra realización más de referencia, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende al menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo Lys-Leu. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu (SEQ ID NO: 122); o la secuencia de aminoácidos Lys-Asp-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu-Leu (SEQ ID NO: 123). En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, o cualquier combinación de
los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123; una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D de SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 123 , o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 122, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 122, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 122 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 122, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 122, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 122 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 122.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 122.
En otra realización más de referencia, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende al menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo Arg-lle. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys (SEQ ID NO: 124); la secuencia de aminoácidos Gln-Ile-Gln-Lys-Ile-Thr-Glu-Lys (SEQ ID NO: 125); la secuencia de aminoácidos Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Asp-Met (SEQ ID No : 126); la secuencia de aminoácidos Gln-Val-Asp-Arg-Ile-Gln-Gln-Lys (SEQ ID NO: 127); o la secuencia de aminoácidos Gln-Leu-Asp-Arg-Ile-His-Asp-Lys (SEq ID NO: 128). En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128; tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de la SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEQ ID NO: 124, SEQ ID
NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEQ ID NO: 124, SEQ ID No : 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128; una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E de SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 128, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 124, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 124, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 124 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 124, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 124, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 124 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 124.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 124.
En otra realización más de referencia, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende al menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo Gln-Lys. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu (SEQ ID NO: 129); o la secuencia de aminoácidos Glu-Lys-Asp-Gln-Lys-Leu-Ala-Glu (SEq ID nO: 130). En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F. En otro
aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130; una variante no conservadora de sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 130, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 129, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 129, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 129 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 129, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 129, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 129 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 129.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 129.
En otra realización más de referencia, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende al menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo Ala-Ala. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys (SEQ ID NO: 131); o la secuencia de aminoácidos Glu-Ser-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys (SEQ ID NO: 132). En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión
de sustrato de BoNT/G que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132; una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F de SEQ ID NO: 131 o SEQ ID NO: 132, o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 131, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 131, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 131 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 131, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 131, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 131 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 131.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 131. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SeQ iD NO: 131.
En otra realización más de referencia, una molécula de polinucleótido codifica una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de TeNT. En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende al menos seis residuos consecutivos de la VAMP incluyendo Gln-Phe. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende, p. ej., la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (SEQ ID NO: 107); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ser-Ser (SEQ ID NO:
108); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Asn (SEQ ID NO: 109); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Gln-Gln (SEQ ID NO: 110); la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Ala-Ser (SEQ ID NO: 111); o la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NO: 112). En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de TeNT. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende una variante natural de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; o un subtipo de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de TeNT, tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de TeNT, una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de TeNT o un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de TeNT, o cualquier combinación de los mismos. En otro aspecto más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende una variante no natural de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID nO: 108, Se Q ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; tal como, p. ej., una variante conservadora de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; tal como, p. ej., una variante no conservadora de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, tal como, p. ej., una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; un peptidomimético de un sitio de escisión de sustrato de TeNT de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, tal como, p. ej, una isoforma de un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112; o cualquier combinación de los mismos.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como mínimo del 50% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como mínimo del 62,5% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácido como mínimo del 75% con la SEQ ID NO: 107 o una identidad de los aminoácidos como mínimo del 87,5% con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., una identidad de los aminoácidos como máximo del 50% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como máximo del 62,5% con la SEQ ID NO: 107, una identidad de los aminoácidos como máximo del 75% con la SEQ ID NO: 107 o una identidad de los aminoácidos como máximo del 87,5% con la SEQ ID NO: 107.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo una, dos o tres eliminaciones de aminoácidos no contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107.
En otros aspectos de referencia de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la s Eq ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una
molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nuevo o diez adiciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como máximo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido codifica un sitio de escisión de sustrato de TeNT que comprende un polipéptido que tiene, p. ej., como mínimo dos o tres eliminaciones de aminoácidos contiguos en comparación con la SEQ ID NO: 107.
En otra realización más, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede comprender además una molécula de polinucleótido que codifique una región flexible que comprenda un espaciador flexible. En otra realización, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede comprender además una molécula de polinucleótido que codifique una región flexible que comprenda una pluralidad de espaciadores flexibles en tándem. En aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una región flexible puede comprender en tándem, p. ej., al menos 1 espaciador de G, al menos 2 espaciadores de G, al menos 3 espaciadores de G, al menos 4 espaciadores de G o al menos 5 espaciadores de G. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una región flexible puede comprender en tándem, p. ej., como máximo 1 espaciador de G, como máximo 2 espaciadores de G, como máximo 3 espaciadores de G, como máximo 4 espaciadores de G o como máximo 5 espaciadores de G. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una región flexible puede comprender en tándem, p. ej., al menos 1 espaciador de A, al menos 2 espaciadores de A, al menos 3 espaciadores de A, al menos 4 espaciadores de A o al menos 5 espaciadores de A. En otros aspectos más de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una región flexible puede comprender en tándem, p. ej., como máximo 1 espaciador de A, como máximo 2 espaciadores de A, como máximo 3 espaciadores de A, como máximo 4 espaciadores de A o como máximo 5 espaciadores de A. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada puede comprender una molécula de polinucleótido que codifique una región flexible que comprenda una o más copias de los mismos espaciadores flexibles, una o más copias de diferentes regiones de espaciadores flexibles o cualquier combinación de las mismas.
En otra realización más, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede comprender además una molécula de polinucleótido que codifique una región de unión epitópica. En otra realización, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede comprender además una molécula de polinucleótido que codifique una pluralidad de regiones de unión epitópica. En aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada puede comprender, p. ej., como mínimo 1 molécula de polinucleótido que codifique una región de unión epitópica, como mínimo 2 moléculas de polinucleótido que codifiquen regiones de unión epitópica, como mínimo 3 moléculas de polinucleótido que codifiquen regiones de unión epitópica, como mínimo 4 moléculas de polinucleótido que codifiquen regiones de unión epitópica o como mínimo 5 moléculas de polinucleótido que codifiquen regiones de unión epitópica. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada puede comprender, p. ej., como máximo 1 molécula de polinucleótido que codifique una región de unión epitópica, como máximo 2 moléculas de polinucleótido que codifiquen regiones de unión epitópica, como máximo 3 moléculas de polinucleótido que codifiquen regiones de unión epitópica, como máximo 4 moléculas de polinucleótido que codifiquen regiones de unión epitópica o como máximo 5 moléculas de polinucleótido que codifiquen regiones de unión epitópica. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada puede comprender una o más copias de las mismas moléculas de polinucleótido que codifican una región de unión epitópica, una o más copias de diferentes moléculas de polinucleótido que codifican una región de unión epitópica, o cualquier combinación de las mismas. La ubicación de una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica puede estar en diversas posiciones, incluyendo, sin limitación, en el terminal amino de una toxina clostridial modificada, dentro de una toxina clostridial modificada o en el terminal carboxilo de una toxina clostridial modificada.
En un aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica se ubica en el terminal amino de una toxina clostridial modificada. En aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica ubicada en el terminal amino de una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede ser, p. ej., una región de unión al epítopo FLAG, Expres™, una región de unión al epítopo de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe humana, una región de unión al epítopo de la proteína p62c-Myc humana (c-MYC), una región de unión al epítopo de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), una región de unión al epítopo de la sustancia P, una región de unión al epítopo del precursor de la glicoproteína D del virus del herpes simple (HSV), una región de unión al epítopo V5, una región de unión al epítopo AU1, una región de unión al epítopo AU5, una región de unión al epítopo de la polihistidina, una región de
unión al epítopo del péptido de unión a estreptavidina, una región de unión al epítopo de la biotina, una región de unión al epítopo de la biotinilación, un dominio de unión a glutationa de la glutationa-S-transferasa, un dominio de unión a calmodulina de la proteína de unión a la calmodulina o un dominio de unión a maltosa de la proteína de unión a la maltosa.
En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica está ubicada en el terminal carboxilo de una toxina clostridial modificada. En aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica ubicada en el terminal carboxilo de una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede ser, p. ej., una región de unión al epítopo FLAG, Expres™, una región de unión al epítopo de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe humana, una región de unión al epítopo de la proteína p62c-Myc humana (c-MYC), una región de unión al epítopo de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), una región de unión al epítopo de la sustancia P, una región de unión al epítopo del precursor de la glicoproteína D del virus del herpes simple (HSV), una región de unión al epítopo V5, una región de unión al epítopo AU1, una región de unión al epítopo AU5, una región de unión al epítopo de la polihistidina, una región de unión al epítopo del péptido de unión a estreptavidina, una región de unión al epítopo de la biotina, una región de unión al epítopo de la biotinilación, un dominio de unión a glutationa de la glutationa-S-transferasa, un dominio de unión a calmodulina de la proteína de unión a la calmodulina o un dominio de unión a maltosa de la proteína de unión a la maltosa.
En otra realización más, las moléculas de polinucleótido que codifican una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria pueden comprender además una molécula de polinucleótido que codifique un sitio de escisión por proteasa exógena. En otra realización, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria puede comprender además una pluralidad de moléculas de polinucleótido que codifiquen sitios de escisión por proteasa exógena. En aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada puede comprender, p. ej., como mínimo 1 molécula de polinucleótido que codifique un sitio de escisión por proteasa exógena, como mínimo 2 moléculas de polinucleótido que codifiquen sitios de escisión por proteasa exógena, como mínimo 3 moléculas de polinucleótido que codifiquen sitios de escisión por proteasa exógena, como mínimo 4 moléculas de polinucleótido que codifiquen sitios de escisión por proteasa exógena o como mínimo 5 moléculas de polinucleótido que codifiquen sitios de escisión por proteasa exógena. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada puede comprender, p. ej., como máximo 1 molécula de polinucleótido que codifique un sitio de escisión por proteasa exógena, como máximo 2 moléculas de polinucleótido que codifiquen sitios de escisión por proteasa exógena, como máximo 3 moléculas de polinucleótido que codifiquen sitios de escisión por proteasa exógena, como máximo 4 moléculas de polinucleótido que codifiquen sitios de escisión por proteasa exógena o como máximo 5 moléculas de polinucleótido que codifiquen sitios de escisión por proteasa exógena. En otro aspecto de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada puede comprender una o más copias del mismo sitio de escisión por proteasa exógena, una o más copias de diferentes sitios de escisión por proteasa exógena, o cualquier combinación de las mismas.
En otra realización más, una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión por proteasa exógena está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica un péptido de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión por la enteroquinasa bovina está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada; una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión por la proteasa del virus del tabaco Etch está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada; una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión por la proteasa del rinovirus 3C humano está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada; una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión por la proteasa de SUMO/ULP-1 está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada; una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión por la proteasa trombina está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada; o una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión por la proteasa del factor de coagulación Xa está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada. En otros aspectos de esta realización, una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión por la enteroquinasa bovina de la SEQ ID NO: 168 está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada. En otros aspectos de la realización, una molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión por la proteasa del virus del tabaco Etch de la SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177 o SEQ ID NO: 178 está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada. En otros aspectos más de la realización, una molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión por la proteasa del rinovirus 3C humano de la SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183 o SEQ ID NO: 184 está ubicada entre una molécula de
polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada. En otros aspectos más de la realización, una molécula de polinucleótido que codifica un sitio de escisión por la proteasa de SUMO/ULP-1 de la SEQ ID NO: 185 está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada. En otros aspectos más de la realización, una molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión por la proteasa trombina de la SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199 o SEQ ID NO: 200 está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada. En otros aspectos de la realización, una molécula de polinucleótido que codifica el sitio de escisión por la proteasa del factor de coagulación Xa de la SEQ ID NO: 201 o SEQ ID NO: 202 está ubicada entre una molécula de polinucleótido que codifica una región de unión epitópica y una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada.
Otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial como se define en las reivindicaciones, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario, procedimiento que comprende la etapa de expresar una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada en una célula. Otro aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial como se define en las reivindicaciones, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial está ubicado en la región del bucle bicatenario, procedimiento que comprende las etapas de introducir un constructo de expresión que comprende una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada en una célula y expresar el constructo de expresión en la célula.
Los procedimientos revelados en la presente memoria incluyen, en parte, una toxina clostridial. Se prevé la posibilidad de producir cualquiera y todas las toxinas clostridiales reveladas en la presente memoria usando los procedimientos revelados en la presente memoria. De este modo, los aspectos de esta realización incluyen producir, sin limitación, toxinas clostridiales naturales, variantes naturales de toxinas clostridiales, tales como, p. ej., isoformas de toxinas clostridiales y subtipos de toxinas clostridiales; variantes no naturales de toxinas clostridiales, tales como, p. ej., variantes conservadoras de toxinas clostridiales, variantes no conservadoras de toxinas clostridiales y fragmentos de toxinas clostridiales de las mismas, o cualquier combinación de las mismas.
Los procedimientos revelados en la presente memoria incluyen, en parte, un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial. Se prevé la posibilidad de producir cualquiera y todos los sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales revelados en la presente memoria usando los procedimientos revelados en la presente memoria. De este modo, los aspectos de esta realización incluyen producir, sin limitación, sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales naturales; variantes naturales de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales, tales como, p. ej., isoformas de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales y subtipos de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales; variantes no naturales de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales, tales como, p. ej., variantes conservadoras de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales, variantes no conservadoras de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales y peptidomiméticos de sitios de escisión de sustratos de toxinas clostridiales de las mismas, o cualquier combinación de las mismas.
Los procedimientos revelados en la presente memoria incluyen, en parte, una molécula de polinucleótido. Se prevé la posibilidad de usar cualquiera y todas las moléculas de polinucleótido reveladas en la presente memoria. De este modo, los aspectos de esta realización incluyen, sin limitación, moléculas de polinucleótido que codifican toxinas clostridiales naturales; moléculas de polinucleótido que codifican variantes naturales de toxinas clostridiales, tales como, p. ej., isoformas de toxinas clostridiales y subtipos de toxinas clostridiales; moléculas de polinucleótido que codifican variantes no naturales de toxinas clostridiales, tales como, p. ej., variantes conservadoras de toxinas clostridiales, variantes no conservadoras de toxinas clostridiales y fragmentos de toxinas clostridiales de las mismas, o cualquier combinación de las mismas.
Los procedimientos revelados en la presente memoria incluyen, en parte, un constructo de expresión. Un constructo de expresión comprende una molécula de polinucleótido revelada en la presente memoria ligada operativamente a un vector de expresión útil para la expresión de la molécula de polinucleótido en una célula o un extracto libre de células. Se puede emplear una amplia variedad de vectores de expresión para expresar una molécula de polinucleótido que codifique una toxina clostridial modificada, incluyendo, sin limitación, un vector de expresión viral; vector de expresión procariota; vectores de expresión eucariotas, tales como, p. ej., un vector de expresión en levaduras, un vector de expresión en insectos y un vector de expresión en mamíferos; y un vector de expresión en extracto libre de células. Se entiende además que los vectores de expresión útiles para poner en práctica los aspectos de estos procedimientos pueden incluir aquéllos que expresen una toxina clostridial modificada bajo el control de un elemento promotor constitutivo, de un tejido específico, de una célula específica o inducible, un elemento potenciador, o ambos. Los ejemplos no restrictivos de los vectores de expresión, junto con los reactivos y las condiciones bien establecidos para elaborar y usar un constructo de expresión a partir de tales vectores de expresión se pueden obtener fácilmente de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; EMD
Biosciences-Novagen, Madison, WI; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; y Stratagene, La Jolla, CA. La selección, la elaboración y el uso de un vector de expresión apropiado son procedimientos rutinarios al alcance de cualquier experto en la técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la presente memoria.
De este modo, los aspectos de esta realización incluyen, sin limitación, un vector de expresión viral ligado operativamente a una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada; un vector de expresión procariota ligado operativamente a una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada; un vector de expresión en levaduras ligado operativamente a una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada; un vector de expresión en insectos ligado operativamente a una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada; y un vector de expresión en mamíferos ligado operativamente a una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada. Otros aspectos de esta realización incluyen, sin limitación, constructos de expresión adecuados para expresar una toxina clostridial modificada revelada en la presente memoria usando un extracto libre de células que comprenda un vector de expresión en extracto libre de células ligado operativamente a una molécula de polinucleótido que codifique una toxina clostridial modificada. Otros aspectos de esta realización incluyen, sin limitación, constructos de expresión que comprenden moléculas de polinucleótido que comprenden una cualquiera de la SEQ ID NO: 109 a la SEQ ID No : 132 y de la SEQ ID NO: 136 a la SEQ ID NO: 159. Otros aspectos de esta realización incluyen, sin limitación, constructos de expresión que comprenden moléculas de polinucleótido que codifican una toxina clostridial modificada que comprende una cualquiera de la SEQ ID NO: 85 a la SEQ ID NO: 108.
Los procedimientos revelados en la presente memoria incluyen, en parte, una célula. Se prevé la posibilidad de usar cualquiera y todas las células. De este modo, los aspectos de esta realización incluyen, sin limitación, células procariotas que incluyen, sin limitación, cepas de células bacterianas aeróbicas, microaerófilas, facultativas, anaeróbicas, gram-negativas y gram-negativas, tales como aquéllas derivadas de, p. ej., Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile, Caulobacter crescentus, Lactococcus lactis, Methylobacterium extorquens, Neisseria meningirulls, Neisseria meningitidis, Pseudomonas fluorescens y Salmonella typhimurium; y células eucariotas que incluyen, sin limitación, cepas de levadura, tales como, p. ej., aquéllas derivadas de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica; células de insecto y líneas celulares de insecto, tales como, p. ej., aquéllas derivadas de Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster y Manduca sexta; y células de mamífero y líneas celulares de mamífero, tales como, p. ej., aquéllas derivadas de ratón, rata, hámster, cerdo, oveja, caballo, primate y ser humano. Las líneas celulares se pueden obtener de la Colección Americana de Cultivos Tipo (2004); la Colección Europea de Cultivos Celulares (2004); y la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (2004). Los ejemplos no restrictivos de protocolos específicos para seleccionar, elaborar y usar una línea celular apropiada se describen, p. ej., en “INSECT CELL CULTURE ENGINEERING” (Mattheus F. A. Goosen y col. eds., Marcel Dekker, 1993); “INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS” (J. M. Vlak y col. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison 8 Ian F. Rae, “GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE" (Cambridge University Press, 1997); “CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES” (Alan Doyle y col eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, “CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE” (Wiley-Liss, IV ed. 2000); “ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH” (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, III ed.
2000); “MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL”, supra, (2001); “BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH” (John M. Davis, Oxford Press, II ed. 2002); y “CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY”, supra, (2004). Estos protocolos son procedimientos rutinarios al alcance de cualquier experto en la técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la presente memoria.
Los procedimientos revelados en la presente memoria incluyen, en parte, introducir una molécula de polinucleótido en una célula. Una molécula de polinucleótido introducida en una célula puede ser mantenida transitoria o establemente por esa célula. Las moléculas de polinucleótido mantenidas establemente pueden ser extracromosómicas y replicarse de manera autónoma, o pueden estar integradas en el material cromosómico de la célula y replicarse de manera no autónoma. Se prevé la posibilidad de usar cualquiera y todos los procedimientos para introducir una molécula de polinucleótido revelados en la presente memoria. Los procedimientos útiles para introducir una molécula de ácido nucleico en una célula incluyen, sin limitación, la transfección con mediadores químicos, tal como la mediada por fosfato de calcio, la mediada por dextrano de dietilaminoetilo (DEAE), la mediada por lípidos, la mediada por polietilenimina (PEI), la mediada por polilisina y la mediada por polibreno; la transfección con mediadores físicos, tal como, p. ej., la administración de partículas biolísticas, la microinyección, la fusión de protoplastos y la electroporación; y la transfección con mediadores virales, tal como p. ej., la transfección mediada por retrovirus, véase, p. ej., “Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells”, pp. 16.1-16.62 (Sambrook y Russell, eds., “Molecular Cloning A Laboratory Manual”, Vol. 3, III ed. 2001). Cualquier experto en la técnica entiende que la selección de un procedimiento específico para introducir un constructo de expresión en una célula dependerá, en parte, de si la célula contiene transitoriamente un constructo de expresión o de si la célula contiene establemente un constructo de expresión. Estos protocolos son procedimientos rutinarios al alcance de cualquier experto en la técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la presente memoria.
En un aspecto de esta realización, se usa un procedimiento con mediador químico, denominado transfección, para introducir una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada en una célula. En los procedimientos con mediadores químicos, el reactivo químico forma un complejo con el ácido nucleico que facilita su
absorción en las células. Tales reactivos químicos incluyen, sin limitación, la mediación con fosfato de calcio, véase, p.ej., Martin Jordan y Florian Worm, “Transfection of Adherent and Suspended Cells by Calcium Phosphate”, 33(2) Methods 136-143 (2004); la mediación con dextrano de dietil-aminoetilo (DEAE), la mediación con lípidos, la mediación con polímeros catiónicos como la mediación con polietilenimina (PEI) y la mediación con polilisina, y la mediación con polibreno, véase, p. ej., Chun Zhang y col., “Polyethylenimine Strategies for Plasmid Delivery to Brain-Derived Cells”, 33(2) Methods 144-150 (2004). Tales sistemas de administración con mediadores químicos se pueden preparar mediante procedimientos estándar y se encuentran comercialmente disponibles, véase, p.ej., el equipo de transfección CellPhect (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ); el equipo de transfección en mamíferos, fosfato de calcio y dextrano de DEAE, (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); el reactivo de transfección Lipofectamine™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); el equipo de transfección ExGen 500 (Fermentas, Inc., Hanover, MD) y los equipos de transfección SuperFect y Effectene (Qiagen, Inc., Valencia, CA).
En otro aspecto de esta realización, se usa un procedimiento con mediador físico para introducir una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada en una célula. Las técnicas físicas incluyen, sin limitación, la electroporación, la biolística y la microinyección. Las técnicas de biolística y microinyección perforan la pared celular para introducir la molécula de ácido nucleico en la célula, véase, p. ej., Jeike E. Biewenga y col., “Plasmid-Mediated Gene Transfer in Neurons Using the Biolistics Technique”, 71(1) J. Neurosa. Methods. 67-75 (1997); y John O'Brien y Sarah C. R. Lummis, “Biolistic and Diolistic Transfection: Using the Gene Gun to Deliver DNA and Lipophilic Dyes into Mammalian Cells”, 33(2) Methods 121-125 (2004). La electroporación, también denominada electropermeabilización, usa pulsos eléctricos breves de alto voltaje para crear poros transitorios en la membrana a través de los cuales entran las moléculas de ácido nucleico, y se puede usar eficazmente para realizar transfecciones estables y transitorias de todos los tipos de células, véase, p. ej., M. Golzio y col., “In vitro and in vivo Electric Field-Mediated Permeabilization, Gene Transfer, and Expression”, 33(2) Methods 126-135 (2004); y Oliver Gresch y col., “New Non-Viral Method for Gene Transfer into Primary Cells”, 33(2) Methods 151-163 (2004).
En otro aspecto de esta realización, se usa un procedimiento con mediador viral, denominado transducción, para introducir una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada en una célula. En los procedimientos de transducción transitoria mediados por virus, el proceso mediante el cual las partículas infectan y se replican en una célula huésped ha sido manipulado para usar este mecanismo para introducir una molécula de ácido nucleico en la célula. Se han desarrollado procedimientos mediados por virus de una amplia variedad de virus incluyendo, sin limitación, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, virus del herpes simple, picornavirus, alfavirus y baculovirus; véase, p. ej., Armin Blesch, “Lentiviral and MLV based Retroviral Vectors for ex vivo and in vivo Gene Transfer”, 33(2) Methods 164-172 (2004); y Maurizio Federico, “From Lentiviruses to Lentivirus Vectors”, 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschla, “Non-Primate Lentiviral Vectors”, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther.
529-540 (2003); Karim Benihoud y col, “Adenovirus Vectors for Gene Delivery”, 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440 447 (1999); H. Bueler, “Adeno-Associated Viral Vectors for Gene Transfer and Gene Therapy”, 380(6) Biol. Chem.
613-622 (1999); Chooi M. Lai y col., “Adenovirus and Adeno-Associated Virus Vectors”, 21(12) DNA Cell Biol. 895 913 (2002); Edward A. Burton y col., “Gene Delivery Using Herpes Simplex Virus Vectors”, 21 (12) DNA Cell Biol.
915-936 (2002); Paola Grandi y col., “Targeting HsV Amplicon Vectors”, 33(2) Methods 179-186 (2004); Ilya Frolov y col., “Alphavirus-Based Expression Vectors: Strategies and Applications”, 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU.
11371-11377 (1996); Markus U. Ehrengruber, “Alphaviral Gene Transfer in Neurobiology”, 59(1) Brain Res. Bull., 13-22 (2002); Thomas A. Kost y J. Patrick Condreay, “Recombinant Baculoviruses as Mammalian Cell Gene-Delivery Vectors”, 20(4) Trends Biotechnol, 173-180 (2002); y A. Huser. y C. Hofmann, “Baculovirus Vectors: Novel Mammalian Cell Gene-Delivery Vehicles and Their Applications”, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003).
Los adenovirus, que son virus de ADN bicatenario desnudos, se seleccionan a menudo para la transducción en células de mamífero, porque los adenovirus manejan moléculas de polinucleótido relativamente grandes de aproximadamente 36 kb, se producen a un título elevado y pueden infectar eficientemente una amplia variedad tanto de células que se dividen como de células que no se dividen; véase, p. ej., Wim T. J. M. C. Hermens y col., “Transient Gene Transfer to Neurons and Glia: Analysis of Adenoviral Vector Performance in the CNS and PNS”, 71(1) J. Neurosci. Methods, 85-98 (1997); y Hiroyuki Mizuguchi y col., “Approaches for Generating Recombinant Adenovirus Vectors”, 52(3) Adv. Drug Deliv. Rev. 165-176 (2001). La transducción que usa un sistema basado en adenovirus no soporta una expresión de proteínas prolongada, porque la molécula de ácido nucleico es transportada desde un episoma situado en el núcleo celular, en lugar de estar integrado en el cromosoma de la célula huésped. Por ejemplo, en el sistema de expresión adenoviral ViraPower™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y en el manual de instrucciones del sistema de expresión adenoviral ViraPower™ 25-0543, versión A, Invitrogen, Inc., (15 de julio de 2002); y en el sistema de vectores adenovirales AdEasy™ (Stratagene, Inc., La Jolla, CA) y el manual de instrucciones del sistema de vectores adenovirales AdEasy™ 064004f, Stratagene, Inc., se revelan sistemas de vectores adenovirales y protocolos específicos sobre cómo usar tales vectores.
La administración de moléculas de ácido nucleico también puede usar retrovirus de ARN monocatenario, tales como, p. ej., oncorretrovirus y lentivirus. La transducción mediada por retrovirus a menudo produce eficiencias de transducción cercanas al 100%, puede controlar fácilmente el número de copias de provirus variando la multiplicidad de infección (MdI) y se puede usar para transducir células bien transitoria o establemente, véase, p. ej., Tiziana Tonini y col., “Transient Production Of Retroviral-and Lentiviral-Based Vectors For the Transduction of Mammalian Cells”, 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Armin Blesch, “Lentiviral and MLV Based Retroviral Vectors for ex vivo and in vivo Gene Transfer”, 33(2) Methods 164-172 (2004); Félix Recillas-Targa, “Gene Transfer and
Expression in Mammalian Cell Lines and Transgenic Animals”, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); y Roland Wolkowicz y col., “Lentiviral Vectors for the Delivery of DNA into Mammalian Cells”, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004). Las partículas retrovirales constan de un genoma de ARN empaquetado en una cápside proteica rodeada de una envoltura lipídica. El retrovirus infecta una célula huésped inyectando su ARN en el citoplasma junto con la enzima de transcriptasa inversa. Entonces se transcribe inversamente el molde de ARN en un ADNc bicatenario lineal que se replica integrándose en el genoma de la célula huésped. Las partículas virales se propagan tanto verticalmente (de la célula precursora a las células hijas a través del provirus) como horizontalmente (de célula a célula a través de viriones). Esta estrategia de replicación permite una expresión duradera a largo plazo, pues las moléculas de ácido nucleico de interés son integradas establemente en un cromosoma de la célula huésped, mediante lo que se permite una expresión de la proteína a largo plazo. Por ejemplo, hay estudios con animales que han demostrado que vectores de lentivirus inyectados en una variedad de tejidos produjeron una expresión proteica sostenida durante más de 1 año, véase, p. ej., Luigi Naldini y col., “ In vivo Gene Delivery and Stable Transduction of Non-Dividing Cells By a Lentiviral Vector”, 272(5259) Science 263-267 (1996). Los sistemas de vectores derivados de oncorretrovirus, tales como, p. ej., el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV) son ampliamente usados e infectan muchas células diferentes que no se dividen. Los lentivirus también pueden infectar muchos tipos de células diferentes, incluyendo células que se dividen y células que no se dividen, y poseen cubiertas proteicas complejas, lo que permite dirigirse a células muy específicas.
Los vectores retrovirales y los protocolos específicos sobre cómo usar tales vectores se revelan en, p. ej., la patente estadounidense de Manfred Gossen y Hermann Bujard, “Tight Control of Gene Expression in Eukaryotic Cells By Tetracycline-Responsive Promoters”, patente estadounidense n.° 5.464.758 (7 de noviembre de 1995), y Hermann Bujard y Manfred Gossen, “Methods for Regulating Gene Expression”, patente estadounidense n.° 5.814.618 (29 de septiembre de 1998); David S. Hogness, “Polynucleotides Encoding Insect Steroid Hormone Receptor Polypeptides and Cells Transformed With Same”, patente estadounidense n.° 5.514.578 (7 de mayo de 1996) y David S. Hogness, “Polynucleotide Encoding Insect Ecdysone Receptor”, patente estadounidense n.° 6.245.531 (12 de junio de 2001); Elisabetta Vegeto y col., “Progesterone Receptor Having C. Terminal Hormone Binding Domain Truncations”, patente estadounidense n.° 5.364.791 (15 de noviembre de 1994); Elisabetta Vegeto y col., “Mutated Steroid Hormone Receptors, Methods For Their Use and Molecular Switch For Gene Therapy”, patente estadounidense n.° 5.874.534 (23 de febrero de 1999) y Elisabetta Vegeto y col., “Mutated Steroid Hormone Receptors, Methods For Their Use and Molecular Switch For Gene Therapy”, patente estadounidense n.° 5.935.934 (10 de agosto de 1999). Además, tales sistemas de administración de virus se pueden preparar mediante procedimientos estándar y se encuentran comercialmente disponibles; véanse, p. ej., los sistemas de expresión de genes Tet-Off y Tet-On BDTM (BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) y el manual de usuario de los sistemas de expresión de genes Tet-Off y Tet-On BD™, PT3001-1, BD Biosciences Clonetech, (14 de marzo de 2003), el sistema GeneSwitch™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y el sistema GeneSwitch™ “A Mifepristone- Regulated Expression System for Mammalian Cells”, versión D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (4 de noviembre de 2002); el sistema de expresión lentiviral ViraPower™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y el manual de instrucciones del sistema de expresión lentiviral ViraPower™ 25 0501 versión E, Invitrogen, Inc., (8 de diciembre de 2003); y el sistema de expresión en mamíferos inducible por retrovirus Complete Control® (Stratagene, La Jolla, CA) y el manual de instrucciones del sistema de expresión en mamíferos inducible por retrovirus Complete Control®, 064005e.
Los procedimientos revelados en la presente memoria incluyen, en parte, expresar una toxina clostridial modificada a partir de una molécula de polinucleótido. Se prevé que cualquiera de una variedad de sistemas de expresión puede ser útil para expresar una toxina clostridial modificada a partir de una molécula de polinucleótido revelada en la presente memoria, incluyendo, sin limitación, sistemas basados en células y sistemas de expresión libres de células. Los sistemas basados en células incluyen, sin limitación, sistemas de expresión viral, sistemas de expresión procariotas, sistemas de expresión en levaduras, sistemas de expresión baculoviral, sistemas de expresión en insectos y sistemas de expresión en mamíferos. Los sistemas libres de células incluyen, sin limitación, extractos de germen de trigo, extractos de reticulocitos de conejo y extractos de E. coli, y son generalmente equivalentes al procedimiento revelado en la presente memoria. La expresión de una molécula de polinucleótido usando un sistema de expresión puede incluir cualquiera de una variedad de características incluyendo, sin limitación, la expresión inducible, la expresión no inducible, la expresión constitutiva, la expresión mediada por virus, la expresión integrada establemente y la expresión transitoria. Los sistemas de expresión que incluyen vectores, reactivos, condiciones y células bien caracterizados están ampliamente establecidos y se pueden obtener fácilmente de proveedores comerciales que incluyen, sin limitación, Ambion, Inc. Austin, TX; BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; Roche Applied Science, Indianapolis, IN; y Stratagene, La Jolla, CA. Por ejemplo, en “PROTEIN EXPRESSION. A PRAcT iCAL APPROACH” (S. J. Higgins y B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez y James P. Hoeffler, “GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESIÓN” (Academic Press, 1999); y Meena Rai y Harish Padh, “Expression Systems for Production of Heterologous Proteins”, 80(9) Curr. Sci.
1121-1128, (2001), se describen ejemplos no restrictivos sobre la selección y el uso de sistemas de expresión heterólogos apropiados. Estos protocolos son procedimientos rutinarios al alcance de cualquier experto en la técnica y se pueden extraer de las enseñanzas de la presente memoria.
Hay una variedad de procedimientos de expresión basados en células que son útiles para expresar una toxina clostridial modificada codificada por una molécula de polinucleótido revelada en la presente memoria. Los ejemplos
incluyen, sin limitación, sistemas de expresión viral, sistemas de expresión procariotas, sistemas de expresión en levaduras, sistemas de expresión baculoviral, sistemas de expresión en insectos y sistemas de expresión en mamíferos. Los sistemas de expresión viral incluyen, sin limitación, el sistema de expresión lentiviral ViraPower™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), los sistemas de expresión adenoviral (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el sistema de vectores adenovirales XL AdEasy™ (Stratagene, La Jolla, CA) y el sistema de expresión génica retroviral ViraPort® (Stratagene, La Jolla, CA). Los ejemplos no restrictivos de sistemas de expresión procariotas incluyen el sistema de expresión pET Champion™ (e Md Biosciences-Novagen, Madison, WI), los sistemas de expresión bacteriana TriEx™ (EMD Biosciences-Novagen, Madison. WI), el sistema de expresión QlAexpres® (QIAGEN, Inc.), y el sistema de expresión y purificación de proteínas Affinity® (Stratagene, La Jolla, CA). Los sistemas de expresión en levaduras incluyen, sin limitación, el equipo de expresión en Pichia EasySelect™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), los equipos de vectores de expresión YES-Echo™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y el sistema de expresión en S. pombe SpECTRA™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Los ejemplos no restrictivos de sistemas de expresión baculoviral incluyen el BaculoDirect™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el Bac-to-Bac® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y el BD BaculoGold™ (BD Biosciences-Pharmigen, San Diego, CA). Los sistemas de expresión en insectos incluyen, sin limitación, el sistema de expresión en Drosophila (DES®) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el sistema InsectSelect™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y el sistema InsectDirect™ (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). Los ejemplos no restrictivos de sistemas de expresión en mamíferos incluyen el sistema T-REx™ (Expresión Regulada por Tetraciclina) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), El sistema Flp-In™ T-REx™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el sistema pcDNA™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el sistema pSecTag2 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), el sistema Exchanger®, el sistema TAP de mamíferos InterPlay™ (Stratagene, La Jolla, CA), el sistema de expresión en mamíferos inducible Complete Control (Stratagene, La Jolla, CA) y el sistema de expresión en mamíferos inducible II LacSwitch® (Stratagene, La Jolla, CA).
Otro procedimiento para expresar una toxina clostridial modificada codificada por una molécula de polinucleótido revelada en la presente memoria emplea un sistema de expresión libre de células, tal como, sin limitación, extractos procariotas y extractos eucariotas. Los ejemplos no restrictivos de extractos de células procariotas incluyen el equipo HY de E. coli RTS 100 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN), el equipo de traducción in vitro ActivePro (Ambion, Inc., Austin, TX), el sistema EcoPro™ (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) y el sistema de expresión Plus Expressway™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). El extracto de células eucariotas incluye, sin limitación, el equipo CECF de germen de trigo RTS 100 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN), los sistemas de extractos de germen de trigo acoplados TnT® (Promega Corp., Madison, WI), el equipo de germen de trigo IVT™ (Ambion, Inc., Austin, TX), el equipo de lisados de reticulocitos IVT™ (Ambion, Inc., Austin, TX), el sistema II PROTEINscript® (Ambion, Inc., Austin, TX) y los sistemas de lisados de reticulocitos acoplados TnT® (Promega Corp., Madison, WI).
También se pueden describir los aspectos de la presente invención de la siguiente manera:
1. Una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial ubicado en una región del bucle bicatenario, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial deriva de fragmentos autocatalíticos de las propias toxinas clostridiales.
2. La toxina clostridial modificada según 1, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial es un sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica o un sitio de escisión de sustrato de toxina tetánica.
3. La toxina clostridial modificada según 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica se selecciona del grupo constituido por un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F y un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G.
4. Una molécula de polinculeótido que codifica una toxina clostridial modificada como se define en 1.
5. Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende la etapa de expresar en una célula una molécula de polinucleótido como se define en 4, en el que la expresión a partir de la molécula de polinucleótido produce una toxina clostridial modificada como se define en 1.
6. Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende las etapas de:
a. introducir en una célula una molécula de polinucleótido como se define en 4; y
b. expresar la molecula de polinculeótido, en la que la expresión a partir de la molécula de polinculeótido produce una toxina clostridial modificada como se define en 1.
7. Una toxina clostridial modificada que comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio de translocación de toxina clostridial, un dominio de unión a toxina clostridial y una región de bucle bicatenario; en la que la región de bucle bicatenario interviene entre el dominio enzimático de toxina clostridial y el dominio de translocación de toxina clostridial; y
en la que la modificación comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial ubicado dentro de la región de bucle bicatenario,
en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial deriva de fragmentos autocatalíticos de las propias toxinas clostridiales.
8. La toxina clostridial modificada según 7, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial es un sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica o un sitio de escisión de sustrato de toxina tetánica.
9. La toxina clostridial modificada según 8, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica se selecciona del grupo constituido por un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F y un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G.
10. Una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada como se define en 7.
11. Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende la etapa de expresar en una célula una molécula de polinucleótido como se define en 10, en la que la expresión a partir de la molécula de polinucleótido produce una toxina clostridial modificada como se define en 7.
12. Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende las etapas de:
a. introducir en una célula una molécula de polinucleótido según lo definido en 10; y
b. expresar la molécula de polinucleótido, en la que la expresión a partir de la molécula de polinucleótido produce una toxina clostridial modificada como se define en 7.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos no restrictivos se proporcionan únicamente a efectos ilustrativos con el fin de facilitar una comprensión más completa de las realizaciones reveladas y no están destinados, de ningún modo, a limitar ninguna de las realizaciones reveladas en la presente memoria.
Ejemplo 1
Construcción de toxinas clostridiales modificadas que comprenden un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A Este ejemplo ilustra cómo producir una toxina clostridial modificada que comprenda un sitio de escisión de sustrato de BoNt /A ubicado en la región del bucle bicatenario de la toxina.
Se sintetiza una molécula de polinucleótido (SEQ ID NO: 214) basada en BoNT/A-A17 (SEQ ID NO: 203) usando procedimientos estándar (BlueHeron® Biotechnology, Bothell, WA). La BoNT/A-A17 es una BoNT/A modificada para que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de 17 aminoácidos que pueda ser escindido por BoNT/A. Se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-A17. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye Terminator™, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Si se desea, es posible sintetizar una molécula de polinucleótido de expresión optimizada (SEQ ID NO: 225) basada en BoNT/A-A17 (SEQ ID NO: 203) con el fin de mejorar la expresión en una cepa de Escherichia coli. La molécula de polinucleótido que codifica la BoNT/A-A17 se puede modificar para 1) que contenga codones sinónimos que se encuentran comúnmente presentes en las moléculas de polinucleótido nativas de una cepa de Escherichia coli; 2) que contenga un contenido de G+C que coincida más estrechamente con el contenido de G+C medio de las moléculas de polinucleótido nativas encontradas en una cepa de Escherichia coli; 3) reducir las regiones de polimononucleótidos encontradas en la molécula de polinucleótido; y/o 4) eliminar los sitios reguladores o estructurales internos encontrados en la molécula de polinucleótido; véase, p. ej., Lance E. Steward y col. “Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type “, publicación de patente internacional n.° WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); Lance E. Steward y col. “Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A”, publicación de patente internacional n.° WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006), estando el contenido de todas ellas incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad. Una vez completada la optimización secuencial, se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-A17. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye Terminator™, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Si se desea, se puede hacer la optimización con respecto a un organismo diferente, tal como, p. ej., una cepa
de levadura, una línea celular de insecto o una línea celular de mamífero; véase, p. ej., Steward, supra, publicación de patente internacional n.° WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); y Steward, supra, publicación de patente internacional n.° WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006).
Se usa una estrategia de clonación similar para producir constructos de clonación pUCBHB1 que comprendan la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 215 o SEQ ID NO: 226 que codifica BoNT/A-A8 de SEQ iD NO: 204. BoNT/A-A8 es una BoNT/A modificada para que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de ocho aminoácidos que pueda ser escindido por BoNT/A. Además, cualquier experto en la técnica puede modificar toxinas clostridiales, tales como, p. ej., BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G y TeNT, usando una estrategia de clonación similar descrita anteriormente, tal que estas toxinas posean un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A en la región del bucle bicatenario de la toxina.
Para construir pET29/BoNT/A-A17, se digiere un constructo pUCBHB1/BoNT/A-A17 con endonucleasas de restricción que 1) escindan el inserto que comprende el marco de lectura abierto que codifica BoNT/A-A17, tal como, p. ej., la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 225; y 2) permitan a este inserto ser ligado operativamente a un vector pET29 (EMD Biosciences-Novagen, Madison. WI). Se subclona este inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector pET29 que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas para producir pET29/BoNT/A-A17. Se transforma la mezcla de unión en células DH5a de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50 pg/ml de kanamicina y se colocan en una incubadora a 37°C para que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los constructos de expresión son identificadas como colonias resistentes a la kanamicina. Se aíslan los constructos candidatos usando un procedimiento de mini-preparación de plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produjo un constructo de expresión pET29 que comprendía la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 225 que codificaba la BoNT/A-A17 de SEQ ID NO: 203 ligada operativamente a un péptido de unión por afinidad a la polihistidina carboxi-terminal (Fig. 7).
Se puede usar una estrategia de clonación similar para producir constructos de expresión pET29 que comprendan la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 214 que codifique BoNT/A-A17 de SEQ ID n O: 203; o las moléculas de polinucleótido de SEQ ID NO: 215 o SEQ ID NO: 226 que codifiquen BoNT/A-A8 de SEQ ID NO: 204.
Ejemplo 2
Construcción de toxinas clostridiales modificadas que comprenden un sitio de escisión de sustrato tanto de BoNT/B como de TeNT
Este ejemplo ilustra cómo producir una toxina clostridial modificada que comprenda tanto un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B como un sitio de escisión de sustrato de TeNT ubicados en la región del bucle bicatenario de la toxina.
Se sintetiza una molécula de polinucleótido (SEQ ID NO: 216) basada en BoNT/A-BT35 (SEQ ID NO: 205) usando procedimientos estándar (BIueHeron® Biotechnology, Bothell, WA). La BoNT/A-BT35 es una BoNT/A modificada para que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de 35 aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/B o por TeNT. Se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-BT35. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye Terminator™, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Si se desea, es posible sintetizar una molécula de polinucleótido de expresión optimizada (SEQ ID NO: 227) basada en BoNT/A-BT35 (SEQ ID NO: 205) con el fin de mejorar la expresión en una cepa de Escherichia coli. La molécula de polinucleótido que codifica la BoNT/A-BT35 se puede modificar para 1) que contenga codones sinónimos que se encuentran comúnmente presentes en las moléculas de polinucleótido nativas de una cepa de Escherichia coli; 2) que contenga un contenido de G+C que coincida más estrechamente con el contenido de G+C medio de las moléculas de polinucleótido nativas encontradas en una cepa de Escherichia coli; 3) reducir las regiones de polimononucleótidos encontradas en la molécula de polinucleótido; y/o 4) eliminar los sitios reguladores o estructurales internos encontrados en la molécula de polinucleótido; véase, p. ej., Lance E. Steward y col. “Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type “, publicación de patente internacional n.° WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); Lance E. Steward y col. “Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A”, publicación de patente internacional n.° WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006). Una vez completada la optimización secuencial, se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-BT35. La
molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye Terminator™, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Si se desea, se puede hacer la optimización con respecto a un organismo diferente, tal como, p. ej., una cepa de levadura, una línea celular de insecto o una línea celular de mamífero; véase, p. ej., Steward, supra, publicación de patente internacional n.° WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); y Steward, supra, publicación de patente internacional n.° WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006).
Se puede usar una estrategia de clonación similar para producir constructos de clonación pUCBHB1 que comprendan la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 217 o SEQ ID NO: 228 que codifique BoNT/A-BT8 de SEQ ID NO: 206. BoNT/A-B8 es una BoNT/A modificada para que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/B o por TeNT. Además, cualquier experto en la técnica puede modificar toxinas clostridiales, tales como, p. ej., BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G y TeNT, usando una estrategia de clonación similar descrita anteriormente, tal que estas toxinas posean tanto un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B como un sitio de escisión de sustrato de TeNT en la región del bucle bicatenario de la toxina.
Para construir pET29/BoNT/A-BT35, se digiere un constructo pUCBHB1/BoNT/A-BT35 con endonucleasas de restricción que 1) escindan el inserto que comprende el marco de lectura abierto que codifica BoNT/A-BT35, tal como, p. ej., la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 227; y 2) permitan a este inserto ser ligado operativamente a un vector pET29 (EMD Biosciences-Novagen, Madison. WI). Se subclona este inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector pET29 que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas para producir pET29/BoNT/A-BT35. Se transforma la mezcla de unión en células DH5a de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50 pg/ml de kanamicina y se colocan en una incubadora a 37°C para que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los constructos de expresión son identificadas como colonias resistentes a la kanamicina. Se aíslan los constructos candidatos usando un procedimiento de mini-preparación de plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produjo un constructo de expresión pET29 que comprendía la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 227 que codificaba la BoNT/A-BT35 de SEQ ID NO: 205 ligada operativamente a un péptido de unión por afinidad a la polihistidina carboxi-terminal (Fig. 8).
Se puede usar una estrategia de clonación similar para producir constructos de expresión pET29 que comprendan la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 216 que codifique BoNT/A-BT35 de s Eq ID NO: 205; o las moléculas de polinucleótido de SEQ ID NO: 217 o SEQ ID NO: 228 que codifiquen BoNT/A-BT8 de SEQ ID NO: 206.
Ejemplo 3
Construcción de toxinas clostridiales modificadas que comprenden un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 Este ejemplo ilustra cómo producir una toxina clostridial modificada que comprenda un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 ubicado en la región del bucle bicatenario de la toxina.
Se sintetiza una molécula de polinucleótido (SEQ ID NO: 218) basada en BoNT/A-Csyn8 (SEQ ID NO: 207) usando procedimientos estándar (BIueHeron® Biotechnology, Bothell, WA). BoNT/A-Csyn8 es una BoNT/A modificada para que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/C1. Se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-Csyn8. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye Terminator™, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Si se desea, es posible sintetizar una molécula de polinucleótido de expresión optimizada (SEQ ID NO: 229) basada en BoNT/A-Csyn8 (SEQ ID NO: 207) con el fin de mejorar la expresión en una cepa de Escherichia coli. La molécula de polinucleótido que codifica la BoNT/A-Csyn8 se puede modificar para 1) que contenga codones sinónimos que se encuentran comúnmente presentes en las moléculas de polinucleótido nativas de una cepa de Escherichia coli; 2) que contenga un contenido de G+C que coincida más estrechamente con el contenido de G+C medio de las moléculas de polinucleótido nativas encontradas en una cepa de Escherichia coli; 3) reducir las regiones de polimononucleótidos encontradas en la molécula de polinucleótido; y/o 4) eliminar los sitios reguladores o estructurales internos encontrados en la molécula de polinucleótido; véase, p. ej., Lance E. Steward y col. “Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type “, publicación de patente internacional n.° WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); Lance E. Steward y col. “Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A”, publicación de patente internacional n.° WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006). Una vez completada la optimización secuencial, se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la
molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHBI, en el sitio Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-Csyn8. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye Terminator™, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Si se desea, se puede hacer la optimización con respecto a un organismo diferente, tal como, p. ej., una cepa de levadura, una línea celular de insecto o una línea celular de mamífero; véase, p. ej., Steward, supra, publicación de patente internacional n.° WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); y Steward, supra, publicación de patente internacional n.° WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006).
Se puede usar una estrategia de clonación similar para producir constructos de clonación pUCBHB1 que comprendan la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 219 o SEQ ID NO: 230 que codifique BoNT/A-Csnp8 de SEQ ID NO: 208. BoNT/A-Csyn8 es una BoNT/A modificada para que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/C1. Además, cualquier experto en la técnica puede modificar toxinas clostridiales, tales como, p. ej., BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G y TeNT, usando una estrategia de clonación similar descrita anteriormente, tal que estas toxinas posean un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1 en la región del bucle bicatenario de la toxina.
Para construir pET29/BoNT/A-Csyn8, se digiere un constructo pUCBHB1/BoNT/A-Csyn8 con endonucleasas de restricción que 1) escindan el inserto que comprende el marco de lectura abierto que codifica BoNT/A-Csyn8 , tal como, p. ej., la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 229; y 2) permitan a este inserto ser ligado operativamente a un vector pET29 (EMD Biosciences-Novagen, Madison. WI). Se subclona este inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector pET29 que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas para producir pET29/BoNT/A-Csyn8. Se transforma la mezcla de unión en células DH5a de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50 pg/ml de kanamicina y se colocan en una incubadora a 37°C para que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los constructos de expresión son identificadas como colonias resistentes a la kanamicina. Se aíslan los constructos candidatos usando un procedimiento de mini-preparación de plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produjo un constructo de expresión pET29 que comprendía la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 229 que codificaba la BoNT/A-Csyn8 de SEQ ID NO: 207 ligada operativamente a un péptido de unión por afinidad a la polihistidina carboxi-terminal (Fig. 9).
Se puede usar una estrategia de clonación similar para producir constructos de expresión pET29 que comprendan la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 218 que codifique BoNT/A-A17 de SEQ ID n O: 207; o las moléculas de polinucleótido de SEQ ID NO: 219 o SEQ ID NO: 230 que codifiquen BoNT/A-Csyn8 de SEQ ID NO: 208.
Ejemplo 4
Construcción de toxinas clostridiales modificadas que comprenden un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F o un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D y de BoNT/F
Este ejemplo ilustra cómo producir una toxina clostridial modificada que comprenda un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D ubicado en la región del bucle bicatenario de la toxina, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F ubicado en la región del bucle bicatenario de la toxina o tanto un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D como un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F ubicados en la región del bucle bicatenario de la toxina.
Se sintetiza una molécula de polinucleótido (SEQ ID NO: 220) basada en BoNT/A-DF39 (SEQ ID NO: 209) usando procedimientos estándar (BIueHeron® Biotechnology, Bothell, WA). BoNT/A-DF39 es una BoNT/A modificada para que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de 39 aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/D o por BoNT/F. Se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-DF39. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye Terminator™, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Si se desea, es posible sintetizar una molécula de polinucleótido de expresión optimizada (SEQ ID NO: 231) basada en BoNT/A-DF39 (SEQ ID NO: 209) con el fin de mejorar la expresión en una cepa de Escherichia coli. La molécula de polinucleótido que codifica la BoNT/A-DF39 se puede modificar para 1) que contenga codones sinónimos que se encuentran comúnmente presentes en las moléculas de polinucleótido nativas de una cepa de Escherichia coli; 2) que contenga un contenido de G+C que coincida más estrechamente con el contenido de G+C medio de las moléculas de polinucleótido nativas encontradas en una cepa de Escherichia coli; 3) reducir las regiones de polimononucleótidos encontradas en la molécula de polinucleótido; y/o 4) eliminar los sitios reguladores o estructurales internos encontrados en la molécula de polinucleótido; véase, p. ej., Lance E. Steward y col. “Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type “, publicación de patente internacional n.° WO 2006/011966
(2 de febrero de 2006); Lance E. Steward y col. “Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A”, publicación de patente internacional n.° WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006). Una vez completada la optimización secuencial, se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHBI, en el sitio Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-DF39. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye Terminator™, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Si se desea, se puede hacer la optimización con respecto a un organismo diferente, tal como, p. ej., una cepa de levadura, una línea celular de insecto o una línea celular de mamífero; véase, p. ej., Steward, supra, publicación de patente internacional n.° WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); y Steward, supra, publicación de patente internacional n.° WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006).
Se puede usar una estrategia de clonación similar para producir constructos de clonación pUCBHB1 que comprendan la molécula de polinucleótido de SEQ ID nO: 221 o la SEQ ID NO: 232 que codifique BoNT/A-D8 de SEQ ID NO: 210; o constructos que comprendan la molécula de polinucleótido de Se Q ID NO: 223 o SEQ ID NO: 234 que codifique BoNT/A-F8 de SEQ ID NO: 212. BoNT/A-D8 es una BoNT/A modificada para que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/D. BoNT/A-F8 es una BoNT/A modificada para que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/F. Además, cualquier experto en la técnica puede modificar toxinas clostridiales, tales como, p. ej., BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G y TeNT, usando una estrategia de clonación similar descrita anteriormente, tal que estas toxinas comprendan un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D en la región del bucle bicatenario de la toxina, comprendan un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B en la región del bucle bicatenario de la toxina o comprendan tanto un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D como un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F en la región del bucle bicatenario de la toxina. Para construir pET29/BoNT/A-DF39, se digiere un constructo pUCBHB1/BoNT/A-DF39 con endonucleasas de restricción que 1) escindan el inserto que comprende el marco de lectura abierto que codifica BoNT/A-DF39, tal como, p. ej., la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 231; y 2) permitan a este inserto ser ligado operativamente a un vector pET29 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). Se subclona este inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector pET29 que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas para producir pET29/BoNT/A-DF39. Se transforma la mezcla de unión en células DH5a de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50 pg/ml de kanamicina y se colocan en una incubadora a 37°C para que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los constructos de expresión son identificadas como colonias resistentes a la kanamicina. Se aíslan los constructos candidatos usando un procedimiento de mini-preparación de plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produjo un constructo de expresión pET29 que comprendía la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 231 que codificaba la BoNT/A-DF39 de SEQ ID nO: 209 ligada operativamente a un péptido de unión por afinidad a la polihistidina carboxi-terminal (Fig. 10).
Se puede usar una estrategia de clonación similar para producir constructos de expresión pET29 que comprendan la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 220 que codifique BoNT/A-DF39 de Se Q ID No : 209; las moléculas de polinucleótido de SEQ ID NO: 221 o SEQ ID NO: 232 que codifiquen BoNT/A-D8 de SEQ ID NO: 210; o moléculas de polinucleótido de SEQ ID NO: 223 o SEQ ID NO: 234 que codifiquen BoNT/A-F8 de SEQ ID NO: 212.
Ejemplo 5
Construcción de toxinas clostridiales modificadas que comprenden un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E Este ejemplo ilustra cómo producir una toxina clostridial modificada que comprenda un sitio de escisión de sustrato de BoNt /E ubicado en la región del bucle bicatenario de la toxina.
Se sintetiza una molécula de polinucleótido (SEQ ID NO: 222) basada en BoNT/A-E8 (SEQ ID NO: 211) usando procedimientos estándar (BIueHeron® Biotechnology, Bothell, WA). BoNT/A-E8 es una BoNT/A modificada para que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/E. Se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-E8. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye Terminator™, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Si se desea, es posible sintetizar una molécula de polinucleótido de expresión optimizada (SEQ ID NO: 233) basada en BoNT/A-E8 (SEQ ID NO: 211) con el fin de mejorar la expresión en una cepa de Escherichia coli. La molécula de
polinucleótido que codifica la B0 NT/A-E8 se puede modificar para 1) que contenga codones sinónimos que se encuentran comúnmente presentes en las moléculas de polinucleótido nativas de una cepa de Escherichia coli; 2) que contenga un contenido de G+C que coincida más estrechamente con el contenido de G+C medio de las moléculas de polinucleótido nativas encontradas en una cepa de Escherichia coli; 3) reducir las regiones de polimononucleótidos encontradas en la molécula de polinucleótido; y/o 4) eliminar los sitios reguladores o estructurales internos encontrados en la molécula de polinucleótido; véase, p. ej., Lance E. Steward y col. “Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type “, publicación de patente internacional n.° WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); Lance E. Steward y col. “Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A”, publicación de patente internacional n.° WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006). Una vez completada la optimización secuencial, se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-E8. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye Terminator™, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Si se desea, se puede hacer la optimización con respecto a un organismo diferente, tal como, p. ej., una cepa de levadura, una línea celular de insecto o una línea celular de mamífero; véase, p. ej., Steward, supra, publicación de patente internacional n.° WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); y Steward, supra, publicación de patente internacional n.° WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006).
Cualquier experto en la técnica puede modificar toxinas clostridiales, tales como, p. ej., BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNt /F, BoNT/G y TeNT, usando una estrategia de clonación similar descrita anteriormente, tal que estas toxinas posean un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E en la región del bucle bicatenario de la toxina.
Para construir pET29/BoNT/A-E8, se digiere un constructo pUCBHB1/BoNT/A-E8 con endonucleasas de restricción que 1) escindan el inserto que comprende el marco de lectura abierto que codifica BoNT/A-E8 , tal como, p. ej., la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 233; y 2) permitan a este inserto ser ligado operativamente a un vector pET29 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, Wl). Se subclona este inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector pET29 que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas para producir pET29/BoNT/A-E8. Se transforma la mezcla de unión en células DH5a de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50 pg/ml de kanamicina y se colocan en una incubadora a 37°C para que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los constructos de expresión son identificadas como colonias resistentes a la kanamicina. Se aíslan los constructos candidatos usando un procedimiento de mini preparación de plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produjo un constructo de expresión pET29 que comprendía la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 233 que codificaba la BoNT/A-E8 de SEQ ID NO: 211 ligada operativamente a un péptido de unión por afinidad a la polihistidina carboxi-terminal (Fig. 11).
Ejemplo 6
Construcción de toxinas clostridiales modificadas que comprenden un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G Este ejemplo ilustra cómo producir una toxina clostridial modificada que comprenda un sitio de escisión de sustrato de BoNt /G ubicado en la región del bucle bicatenario de la toxina.
Se sintetiza una molécula de polinucleótido (SEQ ID NO: 224) basada en BoNT/A-G8 (SEQ ID NO: 213) usando procedimientos estándar (BIueHeron® Biotechnology, Bothell, WA). BoNT/A-G8 es una BoNT/A modificada para que comprenda un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial de ocho aminoácidos que pueda ser escindido bien por BoNT/G. Se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHB1, en el sitio Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-G8. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye Terminator™, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Si se desea, es posible sintetizar una molécula de polinucleótido de expresión optimizada (SEQ ID NO: 235) basada en BoNT/A-E8 (SEQ ID NO: 213) con el fin de mejorar la expresión en una cepa de Escherichia coli. La molécula de polinucleótido que codifica la BoNT/A-D8 se puede modificar para 1) que contenga codones sinónimos que se encuentran comúnmente presentes en las moléculas de polinucleótido nativas de una cepa de Escherichia coli; 2) que contenga un contenido de G+C que coincida más estrechamente con el contenido de G+C medio de las moléculas de polinucleótido nativas encontradas en una cepa de Escherichia coli; 3) reducir las regiones de polimononucleótidos encontradas en la molécula de polinucleótido; y/o 4) eliminar los sitios reguladores o estructurales internos encontrados en la molécula de polinucleótido; véase, p. ej., Lance E. Steward y col. “Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type “, publicación de patente internacional n.° WO 2006/011966
(2 de febrero de 2006); Lance E. Steward y col. “Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A”, publicación de patente internacional n.° WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006). Una vez completada la optimización secuencial, se sintetizan oligonucleótidos de una longitud de 20 a 50 bases usando la síntesis estándar de la fosforamidita. Estos oligonucleótidos se hibridan en dúplex bicatenarios que se ligan entre sí para ensamblar la molécula de polinucleótido de longitud completa. Se clona esta molécula de polinucleótido usando procedimientos estándar de Biología Molecular en un vector pUCBHBI, en el sitio Smal, para generar pUCBHB1/BoNT/A-G8. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica mediante secuenciación usando Big Dye Terminator™, versión Chemistry 3.1, (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Si se desea, se puede hacer la optimización con respecto a un organismo diferente, tal como, p. ej., una cepa de levadura, una línea celular de insecto o una línea celular de mamífero; véase, p. ej., Steward, supra, publicación de patente internacional n.° WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); y Steward, supra, publicación de patente internacional n.° WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006).
Cualquier experto en la técnica puede modificar toxinas clostridiales, tales como, p. ej., BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNt /F, BoNT/G y TeNT, usando una estrategia de clonación similar descrita anteriormente, tal que estas toxinas posean un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G en la región del bucle bicatenario de la toxina.
Para construir pET29BoNT/BoNT/A-G8, se digiere un constructo pUCBHB1/BoNT/A-G8 con endonucleasas de restricción que 1) escindan el inserto que comprende el marco de lectura abierto que codifica BoNT/A-E8, tal como, p. ej., la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 235; y 2) permitan a este inserto ser ligado operativamente a un vector pET29 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). Se subclona este inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector pET29 que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas para producir pET29/BoNT/A-G8. Se transforma la mezcla de unión en células DH5a de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50 pg/ml de kanamicina y se colocan en una incubadora a 37°C para que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los constructos de expresión son identificadas como colonias resistentes a la kanamicina. Se aíslan los constructos candidatos usando un procedimiento de mini preparación de plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produjo un constructo de expresión pET29 que comprendía la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 235 que codificaba la BoNT/A-G8 de SEQ ID NO: 213 ligada operativamente a un péptido de unión por afinidad a la polihistidina carboxi-terminal (Fig. 12).
Ejemplo 7
Expresión de toxinas clostridiales modificadas en una célula bacteriana
El siguiente ejemplo ilustra un procedimiento útil para expresar cualquiera de las toxinas clostridiales modificadas reveladas en la presente memoria en una célula bacteriana.
Se introduce un constructo de expresión, tal como, p. ej., pET29/BoNT/A-ED-PAR1Tb, pET29/BoNT/A-TD-PAR1Tb o pET29/BoNT/A-BD-PAR1Tb; véanse, p. ej., los ejemplos 1, 2 y 3, en células BL21 (DE3) de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un protocolo de transformación por choque térmico. Se coloca la reacción de choque térmico en placas de agar de Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 50 pg/ml de kanamicina, y se introduce en una incubadora a 37°C para que se desarrolle durante una noche. Se usan colonias resistentes a la kanamicina de E. coli transformada que contienen el constructo de expresión, tal como, p. ej., pET29/BoNT/A-A17, pET29BoNT/A-BT35, pET29/BoNT/A-Csyn8, pET29/BoNT/A-DF39, pET29/BoNT/A-E8 o pET29/BoNT/A-G8, para inocular un matraz con placas deflectoras que contiene 3,0 ml de medio PA-0.5G que contiene 50 pg/ml de kanamicina que luego es colocado en una incubadora a 37°C, agitando a 250 rpm para su crecimiento durante una noche. El cultivo inicial resultante de una noche se usa a su vez para inocular un matraz con placas deflectoras de 3 l que contiene medio auto-inductor ZYP-5052 que contiene 50 pl/ml de kanamicina a una dilución de 1:1000. Los volúmenes de cultivo variaron de aproximadamente 600 ml (volumen del matraz del 20%) a aproximadamente 750 ml (volumen del matraz del 25%). Se desarrollan estos cultivos en una incubadora a 37°C agitando a 250 rpm durante aproximadamente 5,5 horas y luego se transfieren a una incubadora a 16°C agitando a 250 rpm para que se expresen durante una noche. Se cosechan las células mediante centrifugación (4.000 rpm a 4°C durante 20-30 minutos) y se usan inmediatamente, o se almacenan en seco a -80°C hasta que se necesitan.
Ejemplo 8
Purificación y cuantificación de toxinas clostridiales modificadas
El siguiente ejemplo ilustra procedimientos útiles para la purificación y la cuantificación de cualquiera de las toxinas clostridiales modificadas reveladas en la presente memoria.
Para la purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC), se vuelven a suspender los sedimentos de células BL21 (DE3) de E. coli usados para expresar una toxina clostridial modificada, según lo descrito en el ejemplo 4, en tampón de unión a columnas (ácido W-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2etanosulfónico) 25mM) (HEPES), pH 7,8; cloruro de sodio 500mM; imidazol 10mM; 2 x inhibidor de la proteasa Cocktail Set III (EMD Biosciences-Calbiochem, San Diego CA); 5 unidades/ml de benzonasa (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI); Triton-X® 100 al 0,1% (v/v), 4-octilfenol-polietoxilato; glicerol al 10% (v/v), y luego se transfieren a un tubo de centrifugación Oakridge frío. Se somete la suspensión celular a ultrasonidos sobre hielo (10-12 pulsos de 10 segundos a una amplitud del 40% con intervalos de enfriamiento de 60 segundos sobre un aparato de ultrasonido digital Sonifier de Branson) para lisar las células y luego se centrifuga (16.000 rpm a 4°C durante 20 minutos) para aclarar el lisado. Se prepara una columna de cromatografía de afinidad por metales inmovilizados usando un soporte de columna Econo-Pac de 20 ml (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) empaquetado con 2,5-5,0 ml de resina de afinidad por Co2+ TALON™ SuperFlow (BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA), que luego es equilibrada aclarando con 5 volúmenes de columna de agua destilada desionizada, seguidos por 5 volúmenes de columna de tampón de unión a la columna. Se aplica lentamente el lisado aclarado a la columna equilibrada mediante flujo de gravedad (aproximadamente 0,25-0,3 ml/minuto). Luego se lava la columna con 5 volúmenes de columna de tampón de lavado de columnas (ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES), pH 7,8; cloruro de sodio 500mM; imidazol 10mM; Triton-X® 100 al 0,1% (v/v), 4-octilfenol-polietoxilato; glicerol al 10% (v/v). Se eluye la toxina clostridial con 20-30 ml de tampón de elución de columnas (ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanosulfónico) 25mM (HEPES), pH 7,8; cloruro de sodio 500mM; imidazol 500mM; Triton-X® al 0,1% (v/v), 4-octilfenol-polietoxilato; glicerol al 10% (v/v) y se recoge en aproximadamente doce fracciones de 1 ml. La cantidad de toxina clostridial contenida en cada fracción de elución se determina mediante un análisis de colorantes de Bradford. En este procedimiento, se combinan alícuotas de 20 pl de cada fracción de 1,0 ml con 200 pl de reactivo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), se diluyen de 1 a 4 con agua destilada desionizada y luego se mide la intensidad de la señal colorimétrica usando un espectrofotómetro. Las cinco fracciones con la señal más potente se consideran el máximo de elución, y se combinan entre sí. Se determina la producción de proteínas total estimando la concentración total de proteínas de las fracciones de máximos de elución mezcladas usando gamma-globulina bovina como patrón (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Para la purificación de una toxina clostridial modificada usando una columna de desalinización de FPLC, se pre equilibra una columna de exclusión por tamaños 26/10 HiPrep™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) con 80 ml de tampón para columnas a 4°C (fosfato de sodio 50mM, pH 6,5). Tras equilibrar la columna, se aplica una muestra de toxina clostridial a la columna de exclusión por tamaños con una fase móvil ¡socrática de tampón para columnas a 4°C y a un caudal de 10 ml/minuto usando un sistema de cromatografía BioLogic DuoFlow (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se recoge la muestra de toxina clostridial modificada desalinizada como una sola fracción de aproximadamente 7-12 ml.
Para la purificación de una toxina clostridial modificada usando una columna de intercambio iónico de FPLC, se aplica una muestra de toxina clostridial que ha sido desalinizada tras la elución desde una columna de IMAC a 1 ml de columna de intercambio iónico Q1™ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) usando un sistema de cromatografía BioLogic DuoFlow (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se aplica la muestra a la columna en tampón para columnas a 4°C (fosfato de sodio 50mM, pH 6,5) y se eluye mediante un gradiente lineal con tampón de elución a 4°C (fosfato de sodio 50mM, cloruro de sodio 1M, pH 6,5) como se explica a continuación: etapa 1: 5,0 ml de tampón de elución al 5% a un caudal de 1 ml/minuto; etapa 2: 20,0 ml de tampón de elución al 5-30% a un caudal de 1 ml/minuto; etapa 3: 2,0 ml de tampón de elución al 50% a un caudal de 1,0 ml/minuto; etapa 4: 4,0 ml de tampón de elución al 100% a un caudal de 1,0 ml/minuto; y etapa 5: 5,0 ml de tampón de elución al 0% a un caudal de 1,0 ml/minuto. Se monitoriza la elución de la toxina clostridial desde la columna a 280, 260 y 214 nm, y se recogen los máximos que absorben por encima del umbral mínimo (0,01 ua) a 280 nm. La mayoría de la toxina clostridial se eluirá a una concentración de cloruro de sodio de aproximadamente 100 a 200mM. Las producciones medias totales de toxina clostridial se determinarán mediante un análisis de Bradford.
Se analiza la expresión de una toxina clostridial modificada mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida. Se añaden las muestras purificadas usando el procedimiento descrito anteriormente a 2 x tampón de muestra LDS (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y se separan mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida MOPS usando geles de poliacrilamida prefundidos con Bis-Tris al 4-12% NuPAGE® Novex (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) en condiciones reductoras desnaturalizantes. Se tiñen los geles con Rubí SYPRO® (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se visualizan las imágenes de los polipéptidos separados usando un Multimager Fluor-S MAX (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) para la cuantificación de los niveles de expresión de las toxinas clostridiales. Se determina el tamaño y la cantidad de la toxina clostridial mediante la comparación con patrones de pesos moleculares de proteínas MagicMark™ (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA).
También se analiza la expresión de una toxina clostridial modificada mediante análisis de transferencia Western. Se añaden las muestras de proteínas purificadas usando el procedimiento descrito anteriormente a 2 x tampón de muestra LDS (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y se separan mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida con MOPS usando geles de poliacrilamida prefundidos con Bis-Tris al 4-12% NuPAGE® Novex (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) en condiciones reductoras desnaturalizantes. Se transfieren los polipéptidos separados del gel a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) mediante transferencia Western usando un aparato celular de transferencia electroforética semi-seco SD Trans-Blot® (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se bloquean las membranas de PVDF incubando a temperatura ambiente durante 2 horas en una solución que contiene solución salina tamponada con Tris 25mM (ácido 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanediolclorhídrico 25mM (Tris-HCl) (pH 7,4), cloruro de sodio 137mM, cloruro de potasio 2,7mM), TWEEN-20® al 0,1%,
monolaureato de polioxietileno (20) sorbitán, albúmina de suero bovino al 2%, leche desnatada en polvo al 5%. Se incuban las membranas bloqueadas a 4°C durante una noche en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20® (solución salina tamponada con Tris 25mM, TWEEN-20® al 0,1%, monolaureato de polioxietileno (20) sorbitán) que contiene anticuerpos primarios apropiados como sonda. Se lavan tres veces las transferencias sondadas con anticuerpos primarios durante 15 minutos cada vez en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20®. Se incuban las membranas lavadas a temperatura ambiente durante 2 horas en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20® que contiene un anticuerpo frente a la inmunoglobulina G apropiado conjugado con peroxidasa de rábano picante como anticuerpo secundario. Se lavan tres veces las transferencias sondadas con anticuerpos secundarios durante 15 minutos cada vez en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20®. Las señales de detección de la toxina clostridial marcada se visualizan usando el sistema de detección de transferencia Western ECL Plus™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y las imágenes se visualizan con un visualizador de imágenes de modo variable 9410 Typhoon (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) para la cuantificación de los niveles de expresión de las toxinas clostridiales modificadas.
Ejemplo 9
Expresión de toxinas clostridiales modificadas en una célula de levadura
El siguiente ejemplo ilustra un procedimiento útil para expresar cualquiera de las toxinas clostridiales modificadas reveladas en la presente memoria en una célula de levadura.
Para construir un constructo de expresión en levaduras adecuado que codifique una toxina clostridial modificada, se incorporan sitios de endonucleasas de restricción adecuados para la clonación de una molécula de polinucleótido ligada operativamente a un vector pPIC A (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) en los extremos 5' y 3' de la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 236 que codifica la BoNT/A-A17 de la SeQ ID NO: 203. Se sintetiza esta molécula de polinucleótido y se obtiene un constructo pUCBHB1/BoNT/A-A17 según lo descrito en el ejemplo 1. Se digiere este constructo con enzimas de restricción que 1) escindan el inserto que contiene el marco de lectura abierto de SEQ ID NO: 236 que codifica la BoNT/A-A17; y 2) permitan que este inserto sea ligado operativamente a un vector pPIC A. Se subclona este inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector pPIC A que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas para producir pPIC A/BoNT/A-A17. Se transforma la mezcla de unión en células DH5a de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de Luria-Bertani bajas en sal al 1,5% (pH 7,5) que contienen 25 pg/ml de Zeocin™ y se colocan en una incubadora a 37°C para que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los constructos de expresión son identificadas como colonias resistentes a Zeocin™. Se aíslan los constructos candidatos usando un procedimiento de mini-preparación de plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produjo un constructo de expresión de pPIC A que comprendía la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 236 que codificaba la BoNT/A-A17 de SEQ ID NO: 203 ligada operativamente a péptidos de unión a c-myc y polihistidina carboxi-terminales (Fig. 13).
Se usa una estrategia de clonación similar para producir los constructos de expresión pPIC A que codifican BoNT/A-A8 de SEQ ID NO: 204; BoNT/A-BT35 de SEQ ID NO: 205; BoNT/A-BT8 de SEQ ID NO: 206; BoNT/A-Csyn8 de SEQ ID NO: 207; BoNT/ACsnp8 de SEQ ID NO: 208; BoNT/A-DF39 de SEQ ID NO: 209; BoNT/A-D8 de SEQ ID NO: 210; BoNT/A-E8 de SEQ ID NO: 211; BoNT/A-F8 de SEQ ID NO: 212; o BoNT/A-D8 de SEQ ID NO: 213.
Para construir una línea celular de levadura que exprese una toxina clostridial modificada, se digiere pPlCZ A/BoNT/A-A17 con una endonucleasa de restricción adecuada (i.e., SacI, PmeI o BstXI) y se transforma el constructo de expresión linealizado resultante en una cepa Muts de P. pastoris apropiada Muts KM71H usando un procedimiento de electroporación. Se coloca la mezcla de transformación sobre placas de agar de YPDS al 1,5% (pH 7,5) que contiene 100 pg/ml de Zeocin™ y se meten en una incubadora a 28-30°C durante 1-3 días de crecimiento. La selección de los transformantes que tienen pPICZ A/BoNT/A-A17 integrado en el locus AOX1 de 5' se determina mediante la resistencia de las colonias a Zeocin™. Se analizan las líneas celulares que tienen un constructo pPICZ A/BoNT/A-A17 integrado en cuanto a la expresión de BoNT/A-A17 usando un análisis de expresión a pequeña escala. Las colonias aisladas de las líneas celulares analizadas que tienen pPICZ A/BoNT/A-A17 integrado se usan para inocular matraces con placas deflectoras que contienen 100 ml de medio MGYH y se desarrollan a aproximadamente 28-30°C en una incubadora con agitador (250 rpm) hasta que el cultivo alcanza una DO600 = 2-6 (aproximadamente 16-18 horas). Se cosechan las células mediante centrifugación (3.000 xg a 22°C durante 5 minutos). Para inducir la expresión, se vuelven a suspender los sedimentos celulares en 15 ml de medio MMH y se añade metanol al 100% hasta una concentración final del 0,5%. Se desarrollan los cultivos a aproximadamente 28-30°C en una incubadora con agitador (250 rpm) durante seis días. Se añade más metanol al 100% al cultivo cada 24 horas hasta una concentración final del 0,5%. Se toma una alícuota de 1,0 ml para análisis del cultivo cada 24 horas comenzando en el tiempo cero y acabando en el tiempo de 144 horas. Se recogen las células de las alícuotas mediante microcentrifugación para sedimentar las células, y se lisan usando tres series de congelación-decongelación que constan de -80°C durante 5 minutos, y luego 37°C durante 5 minutos. Se añaden muestras de lisis a 2 x tampón de muestra de LDS (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y se mide la expresión desde las líneas celulares establecidas mediante análisis de transferencia Western (según lo descrito en el ejemplo 8) usando anticuerpos bien frente a BoNT/A, frente a c-myc o frente a His con el fin de identificar las líneas que expresen a
BoNT/A-A17. Se selecciona la línea celular Muts KM71H de P. pastoris que muestra el nivel de expresión más elevado de BoNT/A-A17 para la expresión a gran escala usando procedimientos de fermentación a nivel comercial. Los procedimientos para la expresión a gran escala son como se explica resumidamente con anterioridad, a excepción de que el volumen de cultivo es de aproximadamente 2,5 l de medio MGYH desarrollado en un fermentador BioFlo 3000 de 5 l y las concentraciones de todos los reactivos se aumentarán proporcionalmente para este volumen. Se puede usar un procedimiento similar para expresar un constructo pPICZ A que codifique cualquiera de las toxinas clostridiales modificadas de la SEQ ID NO: 204 a la SEQ ID NO: 213.
Se purifica BoNT/A-A17 usando el procedimiento de IMAC, según lo descrito en el ejemplo 8. Se evalúa la expresión de cada cultivo mediante un análisis con colorantes de Bradford, electroforesis sobre gel de poliacrilamida y análisis de transferencia Western (según lo descrito en el ejemplo 8) con el fin de determinar las cantidades de BoNT/A-A17 producidas.
Ejemplo 10
Expresión de toxinas clostridiales modificadas en una célula de insecto
El siguiente ejemplo ilustra un procedimiento útil para expresar cualquiera de las toxinas clostridiales modificadas reveladas en la presente memoria en una célula de insecto.
Para construir un constructo de expresión en insectos adecuado que codifique una toxina clostridial modificada, se incorporan sitios de endonucleasas de restricción para la clonación de una molécula de polinucleótido ligada operativamente a un vector pBACgus3 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) en los extremos 5' y 3' de la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 237 que codifica la BoNT/A-A17 de SEQ ID NO: 203. Se sintetiza esta molécula de polinucleótido y se obtiene un constructo pUCBHB1/BoNT/A-A17 según lo descrito en el ejemplo 1. Se digiere este constructo con enzimas de restricción que 1) escindan el inserto que contiene el marco de lectura abierto de la SEQ ID NO: 237 que codifica la BoNT/A-A17; y 2) permitan que este inserto sea ligado operativamente a un vector pBACgus3. Se subclona este inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector pBACgus3 que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas para producir pBACgus3/BoNT/A-A17. Se transforma la mezcla de unión en células DH5a de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100 pg/ml de ampicilina y se colocan en una incubadora a 37°C para que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los constructos de expresión son identificadas como colonias resistentes a la ampicilina. Se aíslan los constructos candidatos usando un procedimiento de mini-preparación de plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produjo un constructo de expresión pBACgus3 que comprendía la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 237 que codificaba la BoNT/A-A17 de s Eq ID NO: 203 ligada operativamente a un péptido señal gp64 amino-terminal y a un péptido de unión por afinidad a polihistidina carboxi-terminal escindible mediante trombina (Fig. 14).
Se usa una estrategia de clonación similar para producir los constructos de expresión pBACgus3 que codifican BoNT/A-A8 de SEQ ID NO: 204; BoNT/A-BT35 de SEQ ID NO: 205; BoNT/A-BT8 de SEQ ID NO: 206; BoNT/A-Csyn8 de SEQ ID NO: 207; BoNT/A-Csnp8 de SEQ ID NO: 208; BoNT/A-DF39 de SEQ ID NO: 209; BoNT/A-D8 de SEQ ID NO: 210; BoNT/A-E8 de SEQ ID NO: 211; BoNT/A-F8 de SEQ ID NO: 212; o BoNT/A-D8 de SEQ ID NO: 213.
Para expresar una toxina clostridial modificada usando un sistema de expresión baculoviral, se colocan aproximadamente 2,5 x 106 células Sf9 en cuatro placas de cultivo de 60 mm que contienen 2 ml de medio para insectos BacVector® (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) y se incuban durante aproximadamente 20 minutos en una incubadora a 28°C. Para cada transfección, se prepara una solución de transfección de 50 pl en un tubo de poliestireno de 6 ml añadiendo 25 pl de medio para insectos BacVector® que contiene 100 ng de un constructo pBACgus3 que codifica una toxina clostridial modificada, tal como, p. ej., pBACgus3/BoNT/A-A17, y 500 ng de plásmido de transferencia TlowE a 25 pl de GeneJuice® para insectos diluido que contiene 5 pl de GeneJuice® para insectos (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) y 20 pl de agua libre de nucleasas, y se incuba esta solución durante aproximadamente 15 minutos. Tras la incubación de 15 minutos, se añaden 450 pl de medio BacVector® a la solución de transfección y se mezcla suavemente. Se elaboran otras soluciones de transfección de diluciones de 1/50, 1/250 y 1/1250 usando esta solución de transfección madre a una disolución 1/10. Se añaden 100 pl de una solución de transfección a las células Sf9 de una de las cuatro placas de cultivo de 60 mm, se lavan dos veces con medio para insectos BacVector® libre de antibióticos y libre de suero, y se incuban a 22°C. Tras una hora, se añaden 6 ml de medio para insectos BacVector® con agarosa BacPlaque al 1% que contiene albúmina de suero bovino al 5%. Una vez solidificada la agarosa, se añaden 2 ml de medio para insectos BacVector® que contiene albúmina de suero bovino al 5% a las células transfectadas y se transfieren las células a una incubadora a 28°C durante 3-5 días hasta que se hacen visibles las placas. Tras 3-5 días de la transfección, se teñirán las placas de la monocapa en cuanto a la actividad del gen indicador de la p-glucuronidasa con el fin de analizar la presencia de placas de virus recombinante que contengan pBACgus3BoNT/A-A17 mediante la incubación de la monocapa lavada con 2 ml de medio para insectos BacVector® que contiene 30 pl de 20 mg/ml de solución X-Gluc (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) durante aproximadamente 2 horas en una incubadora a 28°C.
Tras identificar las placas de virus recombinante candidatas, se eluyen varias placas de virus candidatas y se purifican. Para eluir un virus recombinante, se transfiere un tapón que contiene una placa de virus recombinante con una pipeta de Pasteur estéril a 1 ml de medio para insectos BacVector® (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) en un vial de tapón de rosca estéril. Se incuba el vial durante aproximadamente 2 horas a 22°C o durante aproximadamente 16 horas a 4°C. Para cada placa de virus recombinante, se colocan 2,5 x 105 células Sf9 en placas de cultivo de 35 mm que contienen 2 ml de medio para insectos BacVector® (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) y se incuban durante aproximadamente 20 minutos en una incubadora a 28°C. Se retira el medio y se añaden 200 pl de virus recombinante eluido. Tras una hora, se añaden 2 ml de medio para insectos BacVector® con agarosa BacPlaque al 1% que contiene albúmina de suero bovino al 5%. Una vez solidificada la agarosa, se añade 1 ml de medio para insectos BacVector® que contiene albúmina de suero bovino al 5% a las células transfectadas y se transfieren las células a una incubadora a 28°C durante 3-5 días hasta que las placas se hacen visibles. Tras 3-5 días de la transfección, se teñirán las placas de la monocapa en cuanto a la actividad del gen indicador de la pglucuronidasa con el fin de analizar la presencia de placas de virus recombinante que contengan pBACgus3/BoNT/A-A17 mediante la incubación de la monocapa lavada con 2 ml de medio para insectos BacVector® que contiene 30 pl de 20 mg/ml de solución X-Gluc (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) durante aproximadamente 2 horas en una incubadora a 28°C.
Para preparar un cultivo patrón de virus, se eluye un virus recombinante transfiriendo un tapón que contiene una placa de virus recombinante con una pipeta de Pasteur estéril a 1 ml de medio para insectos BacVector® (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) en un vial de tapón de rosca estéril. Se incuba el vial durante aproximadamente 16 horas a 4°C. Se colocan aproximadamente 5 x 105 células Sf9 en un matraz T-25 que contiene 5 ml de medio para insectos BacVector® (e Md Biosciences-Novagen, Madison, WI) y se incuban durante aproximadamente 20 minutos en una incubadora a 28°C. Se retira el medio y se añaden 300 pl de virus recombinante eluido. Tras una hora, se añaden 5 ml de medio para insectos BacVector® que contiene albúmina de suero bovino al 5% a las células transfectadas y se transfieren las células a una incubadora a 28°C durante 3-5 días hasta que la mayoría de las células se sueltan y se vuelven inviables. Se cosecha el virus transfiriendo el medio a tubos de tapa a presión de 15 ml, y se centrifugan los tubos a 1.000 xg durante 5 minutos para eliminar los residuos. Se transfiere el sobrenadante aclarado a tubos de tapa a presión de 15 ml recién preparados y se almacenan a 4°C.
Para preparar un cultivo patrón del virus a un título elevado, se colocan aproximadamente 10 x 107 células Sf9 en un matraz T-75 que contiene 10 ml de medio para insectos BacVector® (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) y se incuban durante aproximadamente 20 minutos en una incubadora a 28°C. Se retira el medio y se añaden 500 pl del cultivo patrón del virus. Tras una hora, se añaden 10 ml de medio para insectos BacVector® que contiene albúmina de suero bovino al 5% a las células transfectadas y se transfieren las células a una incubadora a 28°C durante 3-5 días hasta que la mayoría de las células se sueltan y se vuelven inviables. Se cosecha el virus transfiriendo el medio a tubos de tapa a presión de 15 ml, y se centrifugan los tubos a 1.000 xg durante 5 minutos para eliminar los residuos. Se transfiere el sobrenadante aclarado a tubos de tapa a presión de 15 ml recién preparados y se almacenan a 4°C. Los cultivos patrón del virus a título elevado deberían contener aproximadamente de 2 x 108 a 3 x 109 ufp de baculovirus.
Para expresar gp64-BoNT/A-A17 usando un sistema de expresión baculoviral, se siembran aproximadamente 1,25 x 108 células Sf9 en un matraz de 1 l que contiene 250 ml de medio para insectos BacVector® y se cultivan en un agitador orbital (150 rpm) a una densidad celular de aproximadamente 5 x 108. Se inocula el cultivo con aproximadamente 2,5 x 109 de baculovirus recombinante patrón a título elevado y se incuba durante aproximadamente 48 horas en un agitador orbital a 28°C (150 rpm). Se cosecha el medio transfiriéndolo a tubos y centrifugando los tubos a 500 xg durante 5 minutos para eliminar los residuos. Se añaden muestras de medio a 2 x tampón de muestra de LDS (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y se mide la expresión mediante análisis de transferencia Western (según lo descrito en el ejemplo 8) usando anticuerpos bien frente a BoNT/A o frente a His con el fin de identificar los cultivos patrón baculovirales que expresen a BoNT/A-A17. Se puede usar un procedimiento similar para expresar un constructo pBACgus3 que codifique cualquiera de las toxinas clostridiales modificadas de la SEQ ID NO: 204 a la SEQ ID NO: 213.
Se purifica BoNT/A-A17 usando el procedimiento de IMAC, según lo descrito en el ejemplo 8. Se evalúa la expresión de cada cultivo mediante un análisis con colorantes de Bradford, electroforesis sobre gel de poliacrilamida y análisis de transferencia Western (según lo descrito en el ejemplo 8) con el fin de determinar las cantidades de BoNT/A-A17 producidas.
Ejemplo 11
Expresión de toxinas clostridiales modificadas en una célula de mamífero
El siguiente ejemplo ilustra un procedimiento útil para expresar cualquiera de las toxinas clostridiales modificadas reveladas en la presente memoria en una célula de mamífero.
Para construir un constructo de expresión en mamíferos adecuado que codifique una toxina clostridial modificada, se incorporan sitios de endonucleasas de restricción adecuados para la clonación de una molécula de polinucleótido ligada operativamente a un vector pSecTag2 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) en los extremos 5' y 3' de la molécula
de polinucleótido de SEQ ID NO: 238 que codifica la BoNT/A-A17 de SEQ ID NO: 203. Se sintetiza esta molécula de polinucleótido y se obtiene un constructo pUCBHB1/BoNT/A-A17 según lo descrito en el ejemplo 1. Se digiere este constructo con enzimas de restricción que 1) escindan el inserto que contiene el marco de lectura abierto de la SEQ ID NO: 238 que codifica la BoNT/A-A17; y 2) permitan que este inserto sea ligado operativamente a un vector pSecTag2. Se subclona este inserto usando un procedimiento con ADN ligasa de T4 en un vector pSecTag2 que es digerido con endonucleasas de restricción apropiadas para producir pSecTag2/BoNT/A-A17. Se transforma la mezcla de unión en células DH5a de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) usando un procedimiento de choque térmico, se colocan en placas de agar de Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contienen 100 |jg/ml de ampicilina y se colocan en una incubadora a 37°C para que crezcan durante una noche. Las bacterias que contienen los constructos de expresión son identificadas como colonias resistentes a la ampicilina. Se aíslan los constructos candidatos usando un procedimiento de mini-preparación de plásmidos de lisis alcalina y se analizan mediante un mapeado de fragmentos digeridos por endonucleasas de restricción para determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produjo un constructo de expresión pSecTag2 que comprendía la molécula de polinucleótido de SEQ ID NO: 238 que codificaba la BoNT/A-A17 de SEQ ID No : 203 ligada operativamente a péptidos de unión por afinidad a la polihistidina y a c-myc carboxi-terminales (Fig. 15).
Se usa una estrategia de clonación similar para producir los constructos de expresión pSecTag2 que codifican BoNT/A-A8 de SEQ ID NO: 204; BoNT/A-BT35 de SEQ ID NO: 205; BoNT/A-BT8 de SEQ ID NO: 206; BoNT/A-Csyn8 de SEQ ID NO: 207; BoNT/A-Csnp8 de SEQ ID NO: 208; BoNT/A-DF39 de SEQ ID NO: 209; BoNT/A-D8 de SEQ ID NO: 210; BoNT/A-E8 de SEQ ID NO: 211; BoNT/A-F8 de SEQ ID NO: 212; o BoNT/A-D8 de SEQ ID NO: 213.
Para expresar transitoriamente una toxina clostridial modificada en una línea celular, se colocan aproximadamente 1,5 x 105 células SH-SY5Y en una placa de cultivo tisular de 35 mm que contiene 3 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco completo (DMEM), complementado con suero bovino fetal al 10% (SBF), solución de 1 x penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y se cultivan en una incubadora a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5 x 105 células/ml (6-16 horas). Se prepara una solución de transfección de 500 pl añadiendo 250 pl de medio de suero reducido OPTI-MEM que contiene 15 pl de lipofectAMINE 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos a 250 pl de medio de suero reducido OPTI-MEM que contiene 5 pg de un constructo de expresión pSecTag2 que codifica una toxina clostridial modificada, tal como, p. ej., pSecTag2/BoNT/A-A17. Se incuba esta transfección a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se reemplaza el medio DMEM complementado completo con 2 ml de medio de suero reducido OPTI-MEM y se añaden los 500 pl de solución de transfección a las células SH-SY5Y, y se incuban las células en una incubadora a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 6 a 18 horas. Se reemplaza el medio de transfección con 3 ml de DMEM complementado completo recién preparado, y se incuban las células en una incubadora a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% durante 48 horas. Se recogen tanto el medio como las células para el análisis de la expresión de BoNT/A-A17. Se cosecha el medio transfiriéndolo a tubos de tapa a presión de 15 ml y centrifugando los tubos a 500 xg durante 5 minutos para eliminar los residuos. Se cosechan las células aclarándolas una vez con 3,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 100mM, pH 7,4, y lisándolas con un tampón que contiene ácido 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanediol-clorhídrico 62,6mM (Tris-HCl), pH 6,8, y lauril-sulfato de sodio al 2% (SDS). Se añaden tanto el medio como las muestras celulares a 2 x tampón de muestra de LDS (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y se mide la expresión mediante análisis de transferencia Western (según lo descrito en el ejemplo 5) usando anticuerpos bien frente a BoNT/A, frente a c-myc o frente a His con el fin de identificar los constructos pSecTag2 que expresen a BoNT/A-A17. Se puede usar un procedimiento similar para expresar transitoriamente un constructo pSecTag2 que codifique cualquiera de las toxinas clostridiales modificadas de la SEQ ID NO: 204 a la SEQ ID NO: 213.
Para generar una línea celular integrada establemente que exprese una toxina clostridial modificada, se colocan aproximadamente 1,5 x 105 células SHSY5Y en una placa de cultivo tisular de 35 mm que contiene 3 ml de DMEM completo complementado con SBF al 10%, 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), y se cultivan en una incubadora a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5 x 105 células/ml (6-16 horas). Se prepara una solución de transfección de 500 j l añadiendo 250 j l de medio de suero reducido OPTI-MEM, que contiene 15 j l de lipofectAMINE 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos, a 250 j l de medio de suero reducido OPTI-MEM que contiene 5 jg de un constructo de expresión pSecTag2 que codifica una toxina clostridial modificada, tal como, p. ej., pSecTag2/BoNT/A-A17. Se incuba esta solución de transfección a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Se reemplaza el medio DMEM complementado completo con 2 ml de medio de suero reducido OPTI-MEM y se añaden los 500 j l de solución de transfección a las células SH-SY5Y, y se incuban las células en una incubadora a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 6 a 18 horas. Se reemplaza el medio de transfección con 3 ml de DMEM complementado completo recién preparado, y se incuban las células en una incubadora a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% durante 48 horas. Se reemplaza el medio con 3 ml de DMEM completo recién preparado que contiene aproximadamente 5 pg/ml de Zeocin™, SBF al 10%, 1 x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y 1 x solución de aminoácidos no esenciales MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Se incuban las células en una incubadora a 37°C bajo dióxido de carbono al 5% durante aproximadamente 3-4 semanas,
Claims (12)
1. Una toxina clostridial modificada que comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial ubicado en una región del bucle bicatenario, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial deriva de fragmentos autocatalíticos de las propias toxinas clostridiales.
2. La toxina clostridial modificada según la reivindicación 1, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial es un sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica o un sitio de escisión de sustrato de toxina tetánica.
3. La toxina clostridial modificada según la reivindicación 2, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica se selecciona del grupo constituido por un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F y un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G.
4. Una molécula de polinculeótido que codifica una toxina clostridial modificada como se define en la reivindicación
1.
5. Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende la etapa de expresar en una célula una molécula de polinucleótido como se define en la reivindicación 4, en el que la expresión a partir de la molécula de polinucleótido produce una toxina clostridial modificada como se define en la reivindicación 1.
6. Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende las etapas de:
a. introducir en una célula una molécula de polinucleótido como se define en la reivindicación 4; y
b. expresar la molecula de polinculeótido, en la que la expresión a partir de la molécula de polinculeótido produce una toxina clostridial modificada como se define en la reivindicación 1.
7. Una toxina clostridial modificada que comprende un dominio enzimático de toxina clostridial, un dominio de translocación de toxina clostridial, un dominio de unión a toxina clostridial y una región de bucle bicatenario;
en la que la región de bucle bicatenario interviene entre el dominio enzimático de toxina clostridial y el dominio de translocación de toxina clostridial; y
en la que la modificación comprende un sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial ubicado dentro de la región de bucle bicatenario,
en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial deriva de fragmentos autocatalíticos de las propias toxinas clostridiales.
8. La toxina clostridial modificada según la reivindicación 7, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina clostridial es un sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica o un sitio de escisión de sustrato de toxina tetán
9. La toxina clostridial modificada según la reivindicación 8, en la que el sitio de escisión de sustrato de toxina botulínica se selecciona del grupo constituido por un sitio de escisión de sustrato de BoNT/A, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/B, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/C1, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/D, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/E, un sitio de escisión de sustrato de BoNT/F y un sitio de escisión de sustrato de BoNT/G.
10. Una molécula de polinucleótido que codifica una toxina clostridial modificada como se define en la reivindicación
7.
11. Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende la etapa de expresar en una célula una molécula de polinucleótido como se define en la reivindicación 10, en la que la expresión a partir de la molécula de polinucleótido produce una toxina clostridial modificada como se define en la reivindicación 7.
12. Un procedimiento para producir una toxina clostridial modificada que comprende las etapas de:
a. introducir en una célula una molécula de polinucleótido según lo definido en la reivindicación 10; y
b. expresar la molécula de polinucleótido, en la que la expresión a partir de la molécula de polinucleótido produce una toxina clostridial modificada como se define en la reivindicación 7.
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