ES2341924T3 - Preparacion y utilizacion de oligosacaridos sulfatados. - Google Patents

Abstract

OLIGOSACARIDOS SULFATADOS, EN LOS QUE EL OLIGOSACARIDO TIENE LA FORMULA GENERAL (I): R SUB,1} - (R SUB,X}) SUB,N} - R SUB,2}, EN DONDE R SUB,1} Y R SUB,2} Y CADA R SUB,X} REPRESENTA UNA UNIDAD DE MONOSACARIDO, TODOS LOS CUALES PUEDEN SER IGUALES O DIFERENTES, Y EN LOS QUE LAS UNIDADES COLINDANTES DE MONOSACARIDOS ESTAN UNIDAS POR ENLACES GLUCOSIDICOS 1->2, 1->3, 1->4 Y/O L->6 Y N ES UN ENTERO DE 1 A 6, Y EL USO DE ESTOS COMO AGENTES ANTIANGIOGENICOS, ANTIMETASTASICOS Y/O ANTIINFLAMATORIOS.

Description

Preparación y utilización de oligosacáridos sulfatados.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a oligosacáridos sulfatados, a su preparación y a su utilización como agentes antiangiogénicos, antimetastásicos y/o antiinflamatorios.

Antecedentes de la invención

Los heparán sulfatos pertenecen a la familia de polisacáridos glucosaminoglucanos. Están presentes en la mayoría de los animales multicelulares y tienen una distribución ubicua, siendo expresados en la superficie celular y en las matrices extracelulares (MEC) de la mayoría de los tejidos (1, 2). Los heparán sulfatos existen normalmente como proteoglucanos y ha habido un progreso considerable en la secuenciación y clonaje de los polipéptidos centrales de la molécula. Hasta ahora, por ejemplo, se han identificado en la superficie celular al menos ocho polipéptidos centrales de proteoglucanos heparán sulfato (HSPG) diferentes (3).

Inicialmente, se consideró que los HSPGs desempeñaban en su mayor parte una función estructural en la superficie celular y en la MEC. Sin embargo, las cadenas de heparán sulfato presentan una notable diversidad estructural (2, 4), lo cual sugiere que pueden proporcionar una información importante para la generación de señales en muchos procesos biológicos. Así, aunque las cadenas de heparán sulfato son inicialmente sintetizadas como una repetición alternante sencilla de residuos de glucuronosilo y N-acetilglucusaminilo unidos por enlaces \beta1-4 y \alpha1-4, hay muchas modificaciones posteriores. El polisacárido es N-desacetilado y N-sulfatado y posteriormente experimenta epimerización C5 de las unidades de glucuronosilo para dar unidades de iduronosilo, y varias O-sulfataciones de los residuos uronosilo y glucosaminilo. La variabilidad de estas modificaciones permite treinta secuencias disacarídicas diferentes que, cuando se disponen en diferentes órdenes a lo largo de la cadena del heparán sulfato, pueden tener como resultado, teóricamente, un gran número de estructuras de heparán sulfato diferentes. A este respecto, el polisacárido anticoagulante heparina, presente únicamente en los gránulos de los mastocitos, representa una forma extrema de heparán sulfato en la cual se han maximizado la epimerización y la sulfatación. La mayoría de los heparán sulfatos contienen tramos cortos de residuos altamente sulfatados unidos por tramos relativamente largos de unidades no sulfatadas.

Existe actualmente una clara evidencia de que los heparán sulfatos desempeñan una función crítica en un amplio rango de procesos biológicos (2-4). En particular, pueden actuar como ligandos para las moléculas de adhesión implicadas en las interacciones célula-célula (5, 6), participan en las interacciones célula-MEC (5, 6) y actúan como receptores esenciales en la superficie celular para factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (7, 8) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (9). Los HSPGs son también un componente clave de las membranas basales, que representan una barrera fundamental para la migración celular (10). Las barreras de la membrana basal pueden ser rotas únicamente cuando las células despliegan una variedad de enzimas degradantes (11), incluyendo una endoglucosidasa denominada heparanasa, que corta las cadenas de los heparán sulfatos (12, 13).

Se ha demostrado que muchos de los procesos biológicos en los cuales participan los heparán sulfatos implican el reconocimiento de estructuras únicas de heparán sulfatos, siendo de importancia crítica la posición de los sulfatos en la cadena polisacarídica (3). Por ejemplo, se ha demostrado que secuencias definidas de los heparán sulfatos son reconocidas por los FGF ácido y básico (14-16) y cortadas por heparanasas. Sobre la base de estas observaciones, ha sido un objetivo de los presentes inventores sintetizar oligosacáridos sulfatados que bloqueen el reconocimiento de los heparán sulfatos por los factores de crecimiento e inhiban el corte de los heparán sulfatos por las heparanasas. En el caso del bloqueo de los factores de crecimiento, se consideró que miméticos de bajo peso molecular de heparán sulfato serían particularmente eficaces, ya que se cree actualmente que los heparán sulfatos de la superficie celular median el entrecruzamiento de factores de crecimiento unidos a sus receptores (17). Además, los oligosacáridos sulfatados serán inhibidores eficaces de las heparanasas actuando como sustratos no cortables de este enzima.

Los oligosacáridos sulfatados con actividad inhibidora de factores de crecimiento tienen varios usos clínicos. Los factores de crecimiento que se unen a heparina/heparán sulfatos, tales como bFGF y VEGF, son potentes inductores de angiogénesis (18). En adultos, la angiogénesis es un hecho relativamente raro excepto durante la cicatrización de heridas. Sin embargo, existen varias "enfermedades dependientes de angiogénesis" en los adultos en las cuales la angiogénesis es críticamente importante (18-20). La más importante de éstas es la angiogénesis asociada con el crecimiento de tumores sólidos, con las retinopatías proliferativas y con la artritis reumatoide. Oligosacáridos sulfatados que bloquearan la acción de factores de crecimiento angiogénicos claves, tales como bFGF y VEGF, serían particularmente útiles para el tratamiento de estas enfermedades dependientes de angiogénesis.

De manera similar, los oligosacáridos sulfatados que inhiben la acción de las heparanasas tienen varias aplicaciones clínicas. La membrana basal subendotelial representa una barrera física fundamental para el paso de las células endoteliales, de las células tumorales y de los leucocitos a través de la pared de los vasos sanguíneos. El enzima heparanasa, combinado con una variedad de enzimas proteolíticos (por ejemplo, plasmina, metaloproteinasas de la matriz), desempeña una parte esencial en la degradación de la membrana basal por células invasoras (11-13, 21). De este modo, al prevenir la degradación de la membrana basal, los oligosacáridos sulfatados con actividad inhibidora de heparanasas presentarán actividad antimetastásica y antiinflamatoria y, además, pueden inhibir etapas tempranas de la angiogénesis. La utilización de oligosacáridos sulfatados que inhiban simultáneamente la acción de los factores de crecimiento angiogénicos y del enzima heparanasa sería preferida en muchas situaciones clínicas, por ejemplo para el tratamiento de tumores sólidos altamente metastásicos y de la artritis reumatoide.

La Solicitud de Patente Internacional Previa Nº PCT/AU88/00017 (Publicación Nº WO 88/05301) describe la utilización de polisacáridos sulfatados tales como heparina y heparina modificada, fucoidina, pentosán sulfato, dextrán sulfato y carragenina lambda, que bloquean o inhiben la actividad heparanasa, en el tratamiento antimetastásico y/o antiinflamatorio de un paciente animal o humano. WO 95/09637 se refiere a una clase de maltooligosacáridos altamente sulfatados con actividad similar a la de heparina.

En el trabajo que dio lugar a la presente invención, los inventores han preparado oligosacáridos sulfatados utilizando oligosacáridos existentes en la naturaleza u oligosacáridos totalmente sintéticos que comprenden homopolímeros que contienen hexosas. Algunos de estos compuestos han demostrado ser potentes inhibidores de la angiogénesis humana, de metástasis tumorales y de la inflamación. Los datos obtenidos son consistentes con el hecho de que los oligosacáridos sulfatados muestran sus efectos biológicos inhibiendo la acción de los factores de crecimiento angiogénicos y/o la función de las heparanasas, y se han obtenido ciertos oligosacáridos sulfatados que son potentes inhibidores de ambas, la angiogénesis y la actividad heparanasa.

Resumen de la invención

Los oligosacáridos sulfatados de acuerdo con esta invención están basados en polímeros de unidades monosacarídicas que pueden estar unidas por enlaces glucosídicos 1\rightarrow3, 1\rightarrow4 y/o 1\rightarrow6 y que pueden constar de 3 a 8 unidades monosacarídicas. Preferiblemente, los oligosacáridos constan de 3 a 6 unidades monosacarídicas (esto es, n es de 1 a 4), más preferiblemente de 5 a 6 unidades monosacarídicas (n es de 3 a 4). Los polímeros son homopolímeros que contienen solamente un tipo de unidad monosacarídica.

Las unidades monosacarídicas que estás ligadas entre sí para formar los oligosacáridos son hexosas, y son piranosas, en concreto manosa o galactosa. Las hexosas pueden estar en la configuración D o L.

En un aspecto particular de la presente invención, se proporcionan nuevos oligosacáridos sulfatados, en los cuales el oligosacárido tiene la fórmula general II:

(II)R_{y}-(R_{y})_{n}-R_{y}

en la cual cada grupo R_{y} es el mismo y representa cada uno de ellos una unidad monosacarídica que es manosa o galactosa, estando unidas las unidades monosacarídicas adyacentes por enlaces glucosídicos 1\rightarrow3, 1\rightarrow4 y/o 1\rightarrow6; y

n es un número entero de 1 a 6.

Preferiblemente, en estos oligosacáridos n es de 1 a 4, más preferiblemente de 3 a 4.

En general, los oligosacáridos sulfatados de esta invención pueden ser preparados mediante sulfatación de los oligosacáridos por métodos conocidos per se en la técnica para dar lugar a sus derivados O-sulfatados correspondientes. Los métodos de sulfatación adecuados están ejemplificados más adelante. Los oligosacáridos que van a ser sulfatados pueden ser productos existentes en la naturaleza, incluyendo oligosacáridos existentes en la naturaleza como tales, así como oligosacáridos preparados mediante degradación enzimática o química de polisacáridos existentes en la naturaleza (por ejemplo manopentaosa fosfato de la levadura Pichia holstii). La invención proporciona por tanto un proceso para producir un oligosacárido sulfatado según se describió anteriormente, proceso que comprende la degradación enzimática o química de un polisacárido existente en la naturaleza.

Según se describió previamente, se ha demostrado que los oligosacáridos sulfatados que están dentro del ámbito de esta invención presentan actividad inhibidora de heparanasas y/o de factores de crecimiento y, por consiguiente, el oligosacárido sulfatado según se describió anteriormente puede ser utilizado como agente antiangiogénico, antimetastásico y/o antiinflamatorio en el tratamiento de un paciente animal de sangre caliente (incluyendo humanos). Por consiguiente, la presente invención proporciona al menos un oligosacárido sulfatado según se describió anteriormente para ser utilizado en un método de tratamiento del organismo humano o animal.

La presente invención se extiende a al menos un oligosacárido sulfatado como el descrito anteriormente para utilización en un tratamiento antiangiogénico, antimetastásico y/o antiinflamatorio de un paciente humano o de otro animal de sangre caliente con necesidad de tal tratamiento.

El componente activo ha de ser administrado en cantidades terapéuticamente eficaces. Una cantidad terapéuticamente eficaz significa aquella cantidad necesaria al menos en parte para conseguir el efecto deseado, o para retrasar la aparición de, inhibir la progresión de, o detener por completo, la aparición o la progresión de la condición particular que esté siendo tratada. Tales cantidades dependerán, por supuesto, de la condición particular que esté siendo tratada. Tales cantidades dependerán, por supuesto, de la condición particular que esté siendo tratada, de la gravedad de la condición y de parámetros del paciente individual incluyendo la edad, la condición física, el tamaño, el peso y el tratamiento simultáneo. Estos factores son bien conocidos por las personas con experiencia habitual en la técnica y pueden ser manejados con no más que experimentación rutinaria. Se prefiere generalmente la utilización de una dosis máxima, esto es, la dosis segura más elevada de acuerdo con el criterio médico bien fundado. Será comprendido por las personas con experiencia habitual en la técnica, sin embargo, que una dosis más baja o una dosis tolerable puede ser administrada por razones médicas, razones psicológicas o, prácticamente, por cualquier otra razón.

La invención se extiende también a la utilización en la fabricación de un medicamento para el tratamiento antiangiogénico, antimetastásico y/o antiinflamatorio de un paciente humano o de otro animal de sangre caliente, de al menos un oligosacárido sulfatado como el descrito anteriormente.

Además, esta invención proporciona también una composición farmacéutica o veterinaria que contiene al menos un oligosacárido sulfatado como el descrito anteriormente y un vehículo o diluyente para el mismo farmacéuticamente y veterinariamente aceptable.

La formulación de tales composiciones terapéuticas es bien conocida por las personas expertas en este campo. Vehículos y/o diluyentes adecuados farmacéuticamente o veterinariamente aceptables incluyen cualquiera y todos los solventes convencionales, medios de dispersión, agentes de carga, vehículos sólidos, soluciones acuosas, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, etcétera. La utilización de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente y veterinariamente activas es bien conocida en la técnica y está descrita, a manera de ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Edición, Mack Publishing Company, Pennsylvania, EE.UU. Excepto en el caso de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla la utilización de los mismos en las composiciones farmacéuticas y veterinarias de la presente invención. Pueden incorporarse también a las composiciones ingredientes activos suplementarios.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones en forma de unidad de dosificación por cuestiones de facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de unidad dosificación, según se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto humano o animal que va a ser tratado; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de ingrediente activo calculada para que produzca el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo y/o diluyente farmacéutico o veterinario requerido. Las especificaciones para las nuevas formas de unidad de dosificación de la invención están dictadas por, y dependen directamente de, (a) las características únicas del ingrediente activo y del efecto terapéutico particular que va a ser conseguido, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de confección de tal ingrediente activo para el tratamiento particular.

Los oligosacáridos sulfatados de esta invención pueden ser utilizados en el tratamiento de enfermedades dependientes de angiogénesis, incluyendo la angiogénesis asociada con el crecimiento de tumores sólidos, retinopatías proliferativas y artritis reumatoide, así como en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y condiciones en las cuales la actividad inhibidora de heparanasas de los oligosacáridos sulfatados sería particularmente útil para inhibir la infiltración de leucocitos, incluyendo enfermedades inflamatorias crónicas en las cuales la infiltración de leucocitos es un elemento clave tal como la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple, la diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedades inflamatorias intestinales tales como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Chron, el rechazo de aloinjertos y el asma crónico.

A lo largo de esta especificación, a no ser que el contexto lo requiera de otro modo, se entenderá que la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", implican la inclusión de un número entero o un grupo de números enteros indicados pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.

Descripción detallada de la invención

Según se describió anteriormente en términos generales, la presente invención se refiere a oligosacáridos sulfatados y a su utilización como agentes antiangiogénicos, antimetastásicos y/o antiinflamatorios.

Algunos oligosacáridos pueden ser obtenidos de fuentes naturales para una sulfatación posterior, sin embargo, es altamente deseable un procedimiento sencillo para sintetizar oligosacáridos de longitud de cadena y estereoquímica definidas. Se proporciona por tanto en la presente un método mejorado para sintetizar y aislar oligómeros de azúcares hexosa a partir de materiales de partida sencillos con buenos rendimientos, donde los monómeros de azúcar de estos oligómeros están unidos con un enlace 1\rightarrow3, 1\rightarrow4 y/o 1\rightarrow6. Este método para producir oligómeros de azúcares hexosa contrasta enormemente con la manera en la cual tales oligómeros de azúcares han sido producidos previamente en cuanto a que se obtienen buenos rendimientos, el grado de oligomerización es fácilmente controlado y los productos derivados de este método son oligómeros lineales homólogos que son fácilmente aislados y purificados utilizando técnicas cromatográficas sencillas.

Pueden encontrarse muchos ejemplos que describen métodos para preparar polímeros y oligómeros de azúcares en la literatura científica y de patentes. Por ejemplo, en un procedimiento comúnmente utilizado, un monómero de azúcar sin modificar, solo o en presencia de un solvente, puede ser calentado en presencia de un catalizador para dar lugar a productos poliméricos ramificados y lineales con varios, y a veces mal definidos, enlaces químicos (22, 23). Otro método en el cual el azúcar es fundido en presencia de resinas intercambiadoras de cationes (24) produce también polímeros muy ramificados de alto peso molecular. En estos dos ejemplos, los polímeros se forman con la pérdida concomitante de una molécula de agua por cada enlace polimérico formado. Otro ejemplo de un método conocido de polimerización gradual implica la utilización de la reacción de Koenigs-Knorr, en la cual azúcares que poseen grupos no hidroxílicos (tal como un átomo de bromo o de cloro) en posición 1 y grupos protectores (tales como acetilo) en otros grupos hidroxilo de los azúcares se hacen reaccionar en posición 1 con un grupo hidroxilo de otro azúcar (24). En estos métodos se pierde una molécula distinta de agua, por ejemplo HBr, durante la formación de los enlaces poliméricos. Este método para preparar oligosacáridos es tedioso, requiere la preparación de materiales de partida complejos y produce malos rendimientos totales (25).

De manera similar, se sabe que un azúcar hexosa conteniendo un grupo alcohol primario en el carbono 6 y grupos protectores de O (tales como acetilo) en las posiciones 2, 3 y 4 y un grupo saliente tal como bromo en posición 1, experimentará autocondensación, especialmente en presencia de un catalizador tal como óxido de plata, para dar polímeros unidos en 1,6; se ha preparado de esta forma una serie de gentiodextrinas a partir de 1-bromo-2,3,4-tri-O-acetil-\alpha-D-glucosa: sin embargo, los rendimientos de oligosacáridos fueron bajos debido a la formación de 1,6-anhidro-\beta-D-glucosa derivada de condensación intramolecular. Los rendimientos del dímero (14%) y del trímero (22%) no fueron buenos y los rendimientos del tetrámetro y del pentámero fueron peores (\leq5%) y el hexámero fue aislado con un rendimiento de solamente el 1% (26).

Publicaciones más recientes describen la síntesis química de polímeros de unidades de \beta-piranosilo unidas en 1,6 (27) y D-dextrano (28), producidos mediante la reacción de polimerización con apertura del anillo de derivados anhidroazucarados. Este método está dificultado por el considerable esfuerzo necesario para preparar el material de partida anhidroazucarado y no hay evidencia de que puedan ser preparados fácilmente mediante este método oligosacáridos, incluso aunque las reacciones se lleven a cabo a, por ejemplo, -60ºC. Otro método ha empleado la polimerización mediante fusión catalizada por un ácido de 1,2,3,4-tetra-O-acetil-\beta-D-glucosa para preparar una mezcla de acetatos de oligosacáridos unidos en 1,6' que, después de la desacetilación y el sometimiento a examen cromatográfico, se demostró que contenía en su mayoría mono y disacáridos, a saber glucosa (15%), levoglucosano (4%) y gentiobiosa (16%), mientras que el rendimiento de oligosacáridos era inaceptablemente bajo, específicamente gentiotriosa (4%) y gentiotetraosa (0,6%) (29). Este método fue descrito posteriormente con mayor detalle (30) y aunque se mejoró el rendimiento de los productos polimerizados ligeramente, tuvo como resultado únicamente rendimientos muy bajos de los oligómeros esperados.

Parece por tanto a partir de la literatura que, aunque existen ya varios procedimientos para preparar diferentes oligosacáridos, no se han descrito hasta la fecha métodos para sintetizar homo-oligosacáridos con buen rendimiento a partir de un material de partida fácilmente disponible y barato.

En el trabajo que dio lugar a esta invención, los inventores han descubierto un proceso mediante el cual pueden sintetizarse hexopirano-oligosacáridos específicos con buen rendimiento a partir de materiales de partida fácilmente disponibles y baratos. Éste es un proceso para la preparación de hexopirano-oligosacáridos que comprende la censura de un acetil éster o de otro derivado éster de una hexosa en un solvente inerte bajo presión reducida y en presencia de un ácido de Lewis u otro catalizador.

De acuerdo con este proceso, que no forma parte de la presente invención, puede hacerse que tenga lugar la oligomerización de azúcares hexosa derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, 1,2,3,4-tetra-O-acetil derivados de glucosa, manosa, galactosa, altrosa, talosa, gulosa, idosa y alosa de manera controlada para dar lugar a oligosacáridos de hexosas O-acetiladas. En este proceso, el grado de oligomerización (longitud de la cadena) puede ser fácilmente controlado mediante manipulación de la temperatura a la cual tiene lugar la reacción de oligomerización y mediante la variación del tiempo a lo largo del cual se deja proceder la reacción. Después de la reacción de oligomerización, la mezcla de productos brutos puede ser sometida a una acetilación adicional con el fin de acetilar los grupos hidroxilo libres restantes de los oligosacáridos. Los oligosacáridos acetilados pueden ser luego fácilmente separados mediante cromatografía de adsorción. Los grupos acetilo tienen absorbancia de luz ultravioleta, facilitando la utilización de espectrofotometría para identificar los oligosacáridos acetilados a medida que son eluidos secuencialmente de la columna. Los grupos protectores acetilo pueden ser también eliminados de la mezcla de oligosacáridos y los oligosacáridos resultante separados según el tamaño mediante cromatografía de filtración en gel (exclusión de tamaños).

En los Ejemplos y en los Ejemplos de Referencia descritos en la presente, los oligosacáridos sulfatados son aislados y utilizados como sus sales de sodio respectivas. Se comprenderá que pueden aislarse y utilizarse de la manera correspondiente otras sales farmacéuticamente aceptables, tales como sales de calcio o sales de amina farmacéuticamente aceptables. Por consiguiente, debe comprenderse que las referencias en la presente a un "oligosacárido sulfatado" incluyen tales sales de sodio u otras sales farmacéuticamente aceptables del oligosacárido sulfatado.

Características adicionales de la presente invención están descritas más en profundidad en el(los) Ejemplo(s) siguiente(s). Debe comprenderse, sin embargo, que esta descripción detallada está incluida únicamente con el fin de ejemplificar la presente invención, y no debe entenderse de ninguna manera como una restricción de la descripción general de la invención según se presentó anteriormente.

Los Ejemplos 1 y 2 y el Ejemplo de Referencia 1 ejemplifican la preparación de oligosacáridos sintéticos mediante el nuevo proceso descrito en la presente, los Ejemplos 3 y 4 y el Ejemplo de Referencia 2 ejemplifican procesos para la sulfatación de oligosacáridos y el Ejemplo 5 ejemplifica la utilización de oligosacáridos sulfatados como agentes antiangiogénicos, antimetastásicos y/o antiinflamatorios. (En el Ejemplo 1 y en el Ejemplo de Referencia 1, "ND" representa "no determinado").

En las figuras acompañantes:

La Figura 1 muestra el efecto de maltohexaosa sulfato sobre la angiogénesis humana in vitro. La figura superior es una imagen digital de la angiogénesis control 14 días después del inicio del cultivo. La figura inferior representa la angiogénesis en presencia de 20 \mug/ml de maltohexaosa sulfato.

La Figura 2 muestra el efecto de diferentes concentraciones de maltosa sulfato (\Box), maltotetraosa sulfato (\medcirc) y maltohexaosa sulfato (\blacksquare) sobre la angiogénesis humana in vitro. Datos obtenidos de imágenes digitales de la respuesta angiogénica 14 días después del inicio del cultivo. Cada valor es la media \pm error estándar (n=4).

La Figura 3 muestra el efecto de diferentes concentraciones (\mug/ml) de manopentaosa fosfato sulfatado de Pichia holstii sobre la angiogénesis humana in vitro. Datos obtenidos de imágenes digitales de la respuesta angiogénica 19 días después del inicio del cultivo. Cada valor es la media \pm error estándar (n=4).

La Figura 4 muestra el efecto de oligosacáridos de maltosa sulfatados de diferente longitud de la cadena sobre la metástasis del adenocarcinoma mamario de rata 13762 MAT. Los animales control recibieron células 13762 MAT en ausencia de oligosacárido. En el panel A, los animales tratados recibieron 2 mg, i.v., de cada compuesto en el momento de la inyección de las células tumorales. En el panel B, los animales tratados recibieron 4 mg, subcutáneamente, de cada compuesto en el momento de la inyección de las células tumorales. Las barras verticales representan los errores estándar de las medias.

La Figura 5 es la determinación de la capacidad de oligosacáridos de maltosa sulfatados de diferente longitud de la cadena para inhibir la unión de heparán sulfatos en la superficie celular de células BALB/c 3T3 a aFGF inmovilizado. Las células 3T3 unidas fueron cuantificadas mediante tinción con Rosa de Bengala y midiendo la absorbancia del colorante a 540 nm. El grado de sulfatación de los diferentes oligosacáridos de maltosa está listado en la Tabla 2.

La Figura 6 muestra el efecto del grado de sulfatación de maltohexaosa sulfato sobre su capacidad para inhibir metástasis del adenocarcinoma mamario de rata 13762 MAT. Los números a lo largo del eje x se refieren al número de grupos sulfato/molécula de maltohexaosa. Los animales control recibieron células tumorales en ausencia de compuestos. Los oligosacáridos fueron administrados a una dosis de 2 mg/rata, i.v., en el momento de la inyección de las células tumorales. Las barras verticales representan los errores estándar de las medias.

La Figura 7 muestra el efecto de maltohexaosa con números diferentes de grupos sulfato/molécula sobre la angiogénesis humana in vitro. Los oligosacáridos fueron añadidos a 200 \mug/ml y el ensayo se llevó a cabo en medio sin suero. Se observó una respuesta angiogénica similar en este experimento cuando el ensayo fue realizado en medio que contenía suero (20% de FCS) y cuando el ensayo se realizó en medio sin suero (sin FCS). La maltohexaosa con 20 sulfatos/molécula representa la molécula máximamente sulfatada. Los datos son la media \pm error estándar de cuatro determinaciones.

La Figura 8 muestra el efecto de diferentes oligosacáridos sulfatados conteniendo manosa sobre la angiogénesis humana in vitro. Los valores entre paréntesis representan el % de sulfatación de los oligosacáridos. Los oligosacáridos fueron añadidos a 200 \mug/ml y el ensayo se llevó a cabo en medio que contenía suero. Los datos son la media \pm error estándar de cuatro determinaciones.

La Figura 9 muestra el efecto de oligosacáridos de manosa sulfatados de diferente longitud de la cadena sobre la metástasis del adenocarcinoma mamario de rata 13762 MAT. Los valores entre paréntesis representan el % de sulfatación de los oligosacáridos. Los animales control recibieron células 13762 MAT en ausencia de oligosacárido. Los animales tratados recibieron 2 mg (A) o 4 mg (B), subcutáneamente, de cada compuesto inmediatamente después de la inyección i.v. de las células tumorales. Las barras verticales representan los errores estándar de las medias.

La Figura 10 muestra el efecto de oligosacáridos de galactosa y glucosa sulfatados de diferente longitud de la cadena sobre la metástasis del adenocarcinoma mamario de rata 13762 MAT. Los valores entre paréntesis representan el % de sulfatación de los oligosacáridos. Los animales control recibieron células 13762 MAT en ausencia de oligosacárido. Los animales tratados recibieron 2 mg subcutáneamente de cada compuesto inmediatamente después de la inyección i.v. de las células tumorales. Las barras verticales representan los errores estándar de las medias.

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Ejemplo 1

Se obtuvieron oligosacáridos de manosa de la manera siguiente: se mezclaron bien 1,2,3,4-tetra-O-acetilmanosa (31) (15,0 g, 43 mmoles) y cloruro de zinc (1,5 g) en tetrametilén sulfona (7 ml); esta mezcla se calentó bajo presión reducida con agitación a 110ºC aproximadamente durante 6 horas; en este punto la masa de reacción se había endurecido y había cesado la generación de vapor (ácido acético). A lo largo del tiempo de reacción se colocó un tubo de cal sodada entre el vaso de reacción y la fuente de vacío. Se dejó enfriar la mezcla de reacción y una porción
(11,0 g) de la mezcla de productos se disolvió en piridina anhidra (20 ml) y a esta solución se añadió anhídrido acético (2 ml); esta mezcla se protegió de la humedad atmosférica y se calentó a 50ºC aproximadamente con agitación durante 2 horas. Después de enfriar, se añadió etanol (10 ml) y la mezcla se dejó reposar durante 2 horas. La piridina, el etanol y cualquier acetato de etilo formados fueron eliminados por evaporación bajo presión reducida y el residuo se lavó extensamente con agua para eliminar el cloruro de zinc, la tetrametilén sulfona y la piridina. El residuo fue disuelto en diclorometano, se lavó con agua y la capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Los oligosacáridos derivatizados fueron inicialmente separados en dos fracciones mediante la aplicación de la solución en diclorometano a una columna corta (4 x 40 cm) de gel de sílice 60 (130 g) que fue primero eluida con cloroformo y luego con acetona. La elución con cloroformo produjo una mezcla del monosacárido totalmente acetilado y oligómeros que contenían de 3 a 5 unidades de manosa (Mezcla A). La elución posterior con acetona produjo una mezcla de oligómeros totalmente O-acetilados que contenían principalmente de 6 a 12 unidades de manosa por molécula (Mezcla B).

La Mezcla A (4 g) fue aplicada a una columna (3,3 x 135 cm) rellena de gel de sílice de grado tlc (H). La columna fue eluida con acetona/petróleo ligero (punto de ebullición 60-80º) con un gradiente que comenzaba a 1:5 y se fue incrementando el porcentaje de acetona hasta que se alcanzó una proporción final de 1:1. La velocidad de flujo fue de \leq0,5 ml/minuto. Recogiendo y agrupando las fracciones apropiadas (determinada mediante análisis de tlc en gel de sílice) y eliminando el solvente bajo presión reducida, se obtuvieron los oligosacáridos de manosa 1a - 1d totalmente O-acetilados según sigue (n = número de residuos de manosa; rendimiento, rotación molecular (c=2,CHCl_{3})): 1a, (3; 0,7 g, 4,2%, [\alpha]^{27}_{D}=+ND); 1b, (4; 4,1 g, 8,4%, [\alpha]^{27}_{D}=+50); 1c, (5; 1,2 g, 7,9%, [\alpha]^{27}_{D}=+47,3); 1d, (6; 0,8 g, 5,2%, [\alpha]^{27}_{D}=+36,0). La Mezcla B (7,0 g) fue cromatografiada de manera similar a la de la Mezcla A, pero el gradiente de elución comenzó con acetona/petróleo ligero (punto de fusión 60-80º) 4:5 y el porcentaje de acetona se incrementó hasta que fue del 100%. De esta manera se obtuvieron los oligosacáridos de manosa 1d - 1j totalmente O-acetilados, según sigue (n = número de residuos de manosa; rendimiento, rotación molecular (c=1,CHCl_{3})): 1d, (6; 1,6 g, 10,4%, [\alpha]^{27}_{D}=+ND); 1e, (7; 3,2 g, 21,2%, [\alpha]^{27}_{D}=+50,0); 1f, (8; 0,5 g, 3,4%, [\alpha]^{27}_{D}=+47,0); 1g, (9; 0,7 g, 4,7%, [\alpha]^{27}_{D}=+59); 1h, (10; 0,9 g, 5,7%, [\alpha]^{27}_{D}=+54); 1i, (11; 0,02 g, 0,1%, [\alpha]^{27}_{D}=+ND); 1j, (12; 0,03 g, 0,2%, [\alpha]^{27}_{D}=+ND).

El compuesto 1a (1,55 g) fue disuelto en metanol anhidro (40 ml) y se añadió metóxido de sodio metanólico 1 M (8,6 ml) con agitación a temperatura ambiente. El precipitado resultante fue recogido por filtración, lavado exhaustivamente con metanol y secado. El producto (2a; 0,61 g, 70% [\alpha]^{27}_{D}=+72º) fue identificado como manotriosa por análisis elemental (los valores de CHN fueron \pm4% de lo esperado), espectrometría de masas por electropulverización (M^{+}504) y espectroscopía de RMN. Los oligómeros 1b - 1j fueron tratados de manera similar para dar los oligosacáridos de manosa siguientes (n = número de residuos de manosa; % de rendimiento de los derivados acetilados, rotación molecular (c=1, H_{2}O)): 2b, (4; 75%, [\alpha]^{27}_{D}=+78º); 2c, (5; 85%, [\alpha]^{27}_{D}=+80º); 2d, (6; 98%, [\alpha]^{27}_{D}=84º); 2e, (7; 98%, [\alpha]^{27}_{D}=86,3º); 2f, (8; 99%, [\alpha]^{27}_{D}=+98,0º); 2g, (9; 99%, [\alpha]^{27}_{D}=+106º); 2h, (10; 99%, [\alpha]^{27}_{D}=+100º); 2i, (11; 98%,
[\alpha]^{27}_{D}=ND); 2j, (12; 98%, [\alpha]^{27}_{D}=ND).

Alternativamente, estos oligosacáridos de manosa pueden ser aislados mediante cromatografía de filtración en gel (exclusión de tamaños). De este modo, se obtuvo una mezcla de oligosacáridos de manosa acetilados calentando una mezcla bien agitada de 1,2,3,4-tetra-O-acetilmanosa (15,0 g, 43 mmoles) y cloruro de zinc (1,5 g) en tetrametilén sulfona (7 ml), bajo presión reducida a 110ºC aproximadamente durante 6 horas según se describió anteriormente. La mezcla de reacción se dejó enfriar, se añadió agua (50 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se desechó la capa acuosa. Se repitió este procedimiento de lavado y la masa fue disuelta posteriormente en cloroformo, se lavó con agua y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Después de filtrar, se eliminó el cloroformo bajo presión reducida para dar lugar a la mezcla de oligosacáridos acetilados brutos (11,3 g). Esta mezcla fue disuelta en isopropanol (20 ml) y metanol (60 ml) y posteriormente se añadió metóxido de sodio 1 M en metanol (8 ml) y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. El precipitado resultante fue separado por filtración y lavado dos veces con metanol (30 ml). Después de secar, esta mezcla de productos (6,5 g) fue aplicada a la parte superior de una columna (con camisa exterior; 5 x 90 cm) para filtración en gel con gel P2 de grado fino (BioRad) que había sido estabilizada haciendo pasar por la misma agua durante dos días (velocidad de flujo, 0,5 ml por minuto) a 60ºC. La columna fue eluida con agua a una velocidad de flujo de 0,5 ml por minuto. Los productos que eluían de la columna fueron identificados como picos mediante refractometría diferencial y las fracciones se recogieron de acuerdo con ello. De esta manera se recogieron las fracciones correspondientes a las áreas bajo 11 picos separados. Cada una de estas fracciones se volvió a cromatografiar en una columna idéntica de gel P2 mantenida a 60ºC y eluida con agua a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto. Así, a manera de ejemplo, la fracción identificada como correspondiente a manopentaosa (0,9 g) procedente de la primera ronda de filtración en gel fue cromatografiada de nuevo para dar un pico central principal con un hombro en cada lado. El producto que eluía en el pico central fue aislado eliminando el agua bajo presión reducida para dar 0,5 g de material que fue sometido a cromatografía de nuevo en una columna idéntica de gel P2 a 60ºC a una velocidad de flujo de 0,3 ml/minuto. De esta manera se obtuvo manopentaosa (0,3 g) idéntica a la 2c anterior. Encontrado: C, 38,4; H, 6,7; C_{30}H_{52}O_{26}\cdot6 H_{2}O requiere C, 38,5; H, 6,8%. El valor de nitrógeno fue 0% encontrado y 0% esperado.

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Se encontró que el compuesto era sustancialmente puro mediante HPLC. Esto fue determinado en un sistema de HPLC Dionex configurado según sigue:

1

La espectrometría de masas por electropulverización mostró que este compuesto tenía una masa M^{+} de 828, el peso molecular correcto de manopentaosa. De manera similar se aislaron manotriosa, manotetraosa, manohexaosa y manoheptaosa idénticas a 2a, 2b, 2d y 2e anteriores.

Ejemplo de referencia 1

Este ejemplo muestra el efecto de llevar a cabo la reacción de polimerización a una temperatura más baja que en el Ejemplo 1. Los oligosacáridos de glucosa fueron obtenidos mediante polimerización de 1,2,3,4-tetra-O-acetilglucosa de la misma manera que los oligosacáridos de manosa producidos mediante el método descrito en el Ejemplo 1 anterior, excepto en que en este caso la reacción de polimerización se llevó a cabo a 90ºC durante 8 horas. La mezcla de reacción fue tratada igual que en el Ejemplo 1 y los productos fueron aislados mediante cromatografía en columna, donde la columna (7 cm x 155 cm) estaba rellena de gel de sílice de grado tlc (H). Utilizando métodos de elución similares a los descritos en el Ejemplo 1, se obtuvieron los oligosacáridos de glucosa totalmente O-acetilados 3a - 3e, según sigue (n = número de residuos de glucosa; rendimiento, rotación molecular (c=2, CHCl_{3})): 3a, (3; 4,14 g, 29,9%, [\alpha]^{27}_{D}=+37,5º); 3b, (4; 2,92 g, 18,4%, [\alpha]^{27}_{D}=+44º); 3c, (5; 2,99 g, 19,1%, [\alpha]^{27}_{D}=+37,5º); 3d, (6; 1,37 g, 8,9%,
[\alpha]^{27}_{D}=+36º); 3e, (7; 0,18 g, 1,2%, [\alpha]^{27}_{D}=+39º).

El compuesto 3a (1,0 g) fue disuelto en metanol anhidro (30 ml) y se añadió metóxido de sodio metanólico 1 M (5,5 ml) con agitación a temperatura ambiente. El precipitado resultante fue recogido por filtración, lavado exhaustivamente con metanol y secado. El producto (4a; [\alpha]^{27}_{D}=+68,5º) fue identificado como glucotriosa mediante análisis elemental, espectrometrometría de masas por electropulverización (M^{+} = 504) y espectroscopía de RMN. Los oligómeros 4b - 4e fueron tratados de manera similar para dar los siguientes oligosacáridos de glucosa (n = número de residuos de glucosa; % de rendimiento, rotación molecular (c=2, H_{2}O)): 4b, (4; 85%, [\alpha]^{27}_{D}=+83º); 4c, (5; 90%, [\alpha]^{27}_{D}=+84º); 4d, (6; 90%, [\alpha]^{27}_{D}=+86º); 4e, (7; 89%, [\alpha]^{27}_{D}=+92,5º).

Alternativamente, estos oligosacáridos de glucosa pueden ser aislados mediante cromatografía de filtración en gel (exclusión de tamaños). De este modo, una mezcla de oligosacáridos de glucosa acetilados fue obtenida después de calentar una mezcla bien agitada de 1,2,3,4-tetra-O-acetilglucosa (15,0 g, 43 mmoles) y cloruro de zinc (1,5 g) en tetrametilén sulfona (7 ml), bajo presión reducida a 110ºC aproximadamente durante 6 horas según se describió anteriormente. La masa de reacción fue disuelta en diclorometano, lavada con agua y secada sobre sulfato de sodio anhidro. El diclorometano fue eliminado bajo presión reducida y el producto fue pesado y disuelto en isopropanol (20 ml) y metanol (60 ml), posteriormente se añadió metóxido de sodio 1 M en metanol (9 ml) y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. El precipitado resultante fue recogido por filtración y lavado dos veces con metanol (30 ml). Una porción (7,6 g) de esta mezcla fue disuelta en agua (10 ml) y aplicada a una columna de cromatografía de 5 x 90 cm con una camisa exterior de agua rellena de gel de exclusión de tamaños P2 de grado fino (BioRad). La columna había sido rellenada, precalentada y corrida a 60ºC durante dos días antes de su utilización. Después de la adición de la mezcla de oligosacáridos de glucosa, la columna fue mantenida a 60ºC y eluida con agua (1 ml/minuto). Los productos que eluían de la columna fueron identificados como picos mediante refractometría diferencial y las fracciones se recogieron de acuerdo con ello. De esta manera se recogieron las fracciones correspondientes a las áreas bajo 10 picos separados. Cada una de estas fracciones fue cromatografiada de nuevo en una columna idéntica de gel P2 a 60ºC y eluida con agua a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto. Así, a manera de ejemplo, la fracción identificada como correspondiente a glucopentaosa (0,59 g) fue cromatografiada de nuevo para dar un pico central principal con un hombro a cada lado. El producto que eluía en el pico central fue aislado eliminando el agua bajo presión reducida para dar 0,3 g de material que fue cromatografiado de nuevo en una columna idéntica de gel P2 a 60ºC a una velocidad de flujo de 0,3 ml/minuto. De esta manera, se obtuvo glucopentaosa (0,2 g) idéntica a 4c anterior. De manera similar se aislaron glucotriosa, glucotetraosa, glucohexaosa y glucoheptaosa idénticas a 4a, 4b, 4d y 4e anteriores.

Ejemplo 2

Oligosacáridos de otros azúcares hexosa incluyendo galactosa, altrosa, talosa, glulosa, idosa y alosa pueden ser obtenidos siguiendo los métodos descritos en el Ejemplo 1 y en el Ejemplo de Referencia 1.

Por ejemplo, oligosacáridos de galactosa fueron obtenidos de la manera siguiente: se mezclaron exhaustivamente 1,2,3,4-tetra-O-acetilgalactosa (21,0 g) y cloruro de zinc (2,1 g) en tetrametilén sulfona (10 ml); esta mezcla fue calentada bajo presión reducida con agitación a 90ºC aproximadamente durante 17 horas; en este punto la masa de reacción se había endurecido y había cesado la generación de vapor (ácido acético). A lo largo de todo el tiempo de reacción se colocó un tubo de cal sodada entre el vaso de reacción y la fuente de vacío. La mezcla de reacción se dejó enfriar, la masa de reacción fue posteriormente disuelta en diclorometano, lavada con agua y secada sobre sulfato de sodio anhidro. El diclorometano fue eliminado bajo presión reducida y el producto fue pesado y disuelto en isopropanol (30 ml) y metanol (70 ml) y posteriormente se añadió metóxido de sodio 1 M en metanol (10 ml) y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. El precipitado resultante fue recogido por filtración y lavado dos veces con metanol (30 ml). Esta mezcla fue separada mediante cromatografía de filtración en gel según se describió para los polímeros de manosa y glucosa en los Ejemplos 1 y 2 anteriores. Los productos que eluían de la columna fueron identificados como picos mediante refractometría diferencial y las fracciones se recogieron de acuerdo con ello. De esta manera se recogieron 8 fracciones. Siete de estas fracciones fueron cromatografiadas de nuevo dos veces en una columna idéntica de gel P2 a 60ºC y eluidas con agua a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto durante el primer procesamiento y de 0,3 ml/minuto en el segundo. De esta manera se obtuvieron los siguientes oligosacáridos de galactosa: galactotriosa, 1,03 g, 5,3%; galactotetraosa, 1,15 g, 6,0%; galactopentaosa, 1,21 g, 6,3%; galactohexaosa, 4,26 g, 22,1%; galactoheptaosa, 2,11 g, 11%; galactooctaosa, 1,91 g, 9,9% y galactononaosa, 0,08 g, 0,4%.

Ejemplo 3

A una solución del complejo trióxido de azufre-piridina (0,8 g) (Aldrich) en DMF recién destilada (1 ml) a 80ºC, se añadió gota a gota una solución de manopentaosa (2c) (0,11 g) en piridina anhidra (3 ml), y todo ello se calentó a 80ºC durante 90 minutos adicionales. El sobrenadante fue decantado mientras estaba todavía templado y el residuo pegajoso fue lavado exhaustivamente con metanol (2 ml) tres veces. Después de decantar el metanol residual, el producto fue disuelto en agua (5 ml) y neutralizado (hasta pH-6) con acetato de bario (0,4 g aproximadamente en 2 ml de agua) con agitación vigorosa. Después de centrifugar (3.000 x g), el líquido superior fue decantado y retenido y la pella de sulfato de bario precipitado fue lavada exhaustivamente con agua (3 x 10 ml). El líquido superior retenido y los lavados fueron combinados y puestos sobre una columna (1,0 x 14 cm) de resina de intercambio catiónico DOWEX 50W-X8-400 (forma H^{+}). La columna fue eluida con agua hasta que el eluato era neutro. El eluato (\sim50 ml) fue agitado y neutralizado (hasta pH-7) con acetato de sodio (0,7 g). La solución fue diluida con acetona (200 ml) y centrifugada (1.750 x g) para separar el producto. La pella fue pulverizada finamente mediante trituración bajo metanol y posteriormente agitada mientras estaba todavía bajo metanol y luego recogida por filtración. El sólido fue lavado varias veces con metanol para dar el compuesto puro (sin sales inorgánicas) (0,2 g, 66%). El producto no estaba contaminado con iones de bario (mediante microanálisis e ionización por llama) ni con nitrógeno (microanálisis).

Se encontró que el producto, manopentaosa sulfatada, tenía 11 de 17 posiciones posibles sulfatadas. Encontrado C, 14,2; H, 3,0; S, 14,1; Na, 7,3. C_{30}H_{60}O_{59}S_{11}Na_{8} \cdot 36 H_{2}O requiere C, 14,1; H, 5,2; S, 13,8; Na, 7,2%. Los valores de nitrógeno y bario fueron un 0% encontrado y un 0% esperado.

Ejemplo de referencia 2

A una mezcla del complejo trióxido de azufre-piridina (Aldrich Chemical Company) (4 g) en DMF anhidra (5 ml) se añadió piridina anhidra (10 ml) bajo una atmósfera de nitrógeno anhidro. Esta mezcla fue calentada a 50ºC y agitada rápidamente mientras se añadía en una única adición glucohexaosa (4d) (0,5 g), aislada mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1 anterior. Se añadió piridina adicional (5 ml) y la mezcla fue posteriormente calentada con agitación continua a 80ºC durante 90 minutos. La mezcla de reacción fue luego mantenida a 4ºC durante una noche. El líquido fue decantado del recipiente de reacción, se añadió metanol (3 ml) y la masa semisólida fue troceada y mezclada a fondo con el metanol. Después de sedimentar, el metanol fue decantado y se repitió este procedimiento. Se añadió agua (5 ml) al sólido remanente y la solución resultante se colocó en un tubo de ensayo de 50 ml. El recipiente de reacción fue lavado con agua adicional (5 ml) que fue combinada con la primera solución. La solución resultante fue ajustada a pH 7-8 aproximadamente con NaOH al 40%, después de lo cual se añadió metanol (40 ml). La solución turbia resultante fue centrifugada (3.000 x g) durante 25 minutos y la solución transparente decantada del precipitado. El sólido remanente fue de nuevo disuelto en agua (10 ml), se añadió metanol (40 ml) y se centrifugó el tubo igual que antes. Después de decantar el solvente transparente de la parte superior, el sólido fue disuelto en agua (10 ml) y pasado a través de una columna de desalación de gel P2 (2,5 cm x 250 cm; gel P2 de grado fino - BioRad) para dar la sal de sodio esperada del derivado sulfatado de 1,6-glucohexaosa.

Ejemplo 4

Aunque la síntesis de homopolímeros de hexosa está descrita en los Ejemplos 1 y 2 y en el Ejemplo de Referencia 1, es normalmente extremadamente difícil sintetizar la mayoría de las estructuras oligosacarídicas. Así, un procedimiento más sencillo es sulfatar oligosacáridos de estructura definida procedentes de fuentes naturales. Los oligosacáridos de productos naturales utilizados en este ejemplo eran de dos clases. La primera clase contenía oligosacáridos que no requerían degradación ni fraccionamiento posteriores. Ejemplos de esta clase son maltosa, rafinosa y estaquiosa (por referencia únicamente). La segunda clase constaba de oligosacáridos obtenidos a partir de polisacáridos existentes en la naturaleza que fueron parcialmente degradados enzimáticamente o químicamente y fraccionados por tamaño. Ejemplos de esta clase son los oligosacáridos derivados de amilosa, condroitina y dextrano (por referencia únicamente) y manopentaosa fosfato de la levadura Pichia holstii.

La maltosa, la rafinosa y la estaquiosa fueron adquiridas a Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Maltotriosa, maltotetraosa, maltopentaosa, maltohexaosa y maltoheptaosa se obtuvieron de Seikagaku, Tokyo, Japón y representan oligosacáridos purificados a partir de digestos limitados de amilasa del homopolímero de glucosa unido en \alpha1-4, amilosa. Los tetra, hexa y octasacáridos de condroitina fueron purificados mediante fraccionamiento por filtración en gel de un digesto de hialuronidasa testicular bovina de condroitín-6-sulfato según se ha descrito previamente (32). Las ciclohexa, hepta y octaamilosas se obtuvieron de Sigma. Estos oligosacáridos pueden ser sulfatados según se describió en el Ejemplo de Referencia 2.

A manera de ejemplo de referencia, se preparó maltohexaosa sulfato de la siguiente manera. A una solución del complejo trióxido de azufre-piridina (4,0 g) (Aldrich) en DMF recién destilada (5 ml) a 80ºC, se añadió gota a gota una solución de maltohexaosa (0,5 g) en piridina anhidra (15 ml) y todo ello fue calentado a 80ºC durante 90 minutos adicionales. El sobrenadante fue decantado mientras estaba todavía templado y el residuo pegajoso fue lavado exhaustivamente con metanol (10 ml) tres veces. Después de decantar el metanol residual, el producto fue disuelto en agua (15 ml) y neutralizado (hasta pH \sim6) con acetato de bario (2,0 g aproximadamente en 10 ml de agua) con agitación vigorosa. Después de centrifugar (3.000 x g) el líquido de la parte superior fue decantado y retenido y la pella de sulfato de bario precipitado fue lavada exhaustivamente con agua (3 x 10 ml). El líquido superior retenido y los lavados fueron combinados y colocados sobre una columna (2,5 x 14 cm) de resina de intercambio catiónico DOWEX 50W-X8-400 (forma H^{+}). La columna fue eluida con agua hasta que el eluato fue neutro. El eluato (\sim250 ml) fue agitado y neutralizado (hasta pH \sim7) con acetato de sodio (3,5 g). La solución fue diluida con acetona (1 l) y centrifugada (1750 x g) para separar el producto. La pella fue pulverizada finamente mediante trituración bajo metanol y posteriormente agitada mientras estaba todavía bajo metanol y separada luego por filtración. El filtrado fue lavado varias veces con metanol para dar lugar al compuesto puro (libre de sales inorgánicas) (0,88 g; 55%). El producto no estaba contaminado con ión bario (determinado mediante microanálisis e ionización por llama) ni con nitrógeno (microanálisis).

Se encontró que este producto tenía 14 de 20 posiciones posibles sulfatadas. Encontrado C, 13,9; H, 2,2; S, 14,3; Na, 6,7. C_{36}H_{71}O_{73}S_{14}Na_{9} \cdot 45 H_{2}O requiere C, 13,6; H, 5,1; S, 14,3; Na, 6,6%. Los valores de nitrógeno y bario fueron 0,32% y 0% encontrados, respectivamente, y 0% esperados para cada uno de ellos.

Los datos de ^{1}H RMN (300 MHz - Gemini 300; referenciado a partir de acetona 2,25 ppm campo abajo de TMS) para el maltohexaosa sulfato anterior indicaron que 14 de 20 posiciones posibles estaban sulfatadas. Esto se determinó a partir de los desplazamientos químicos de los hidrógenos centrados alrededor de 4,15 ppm (integrando para 20 H) frente a los centrados alrededor de 4,4 ppm (integrando para 16 H). Puede asumirse que todos los grupos OH primarios, esto es aquellos en posición 6, estarán sulfatados, ya que ésta es la posición con menor impedimento estérico. Se asume además que en los residuos de azúcar internos solamente otra posición estará sulfatada. Los residuos de azúcar terminales, además del residuo en posición 6, tendrán cada uno de ellos otras dos posiciones sulfatadas.

Se preparó manopentaosa fosfato a partir del exopolisacárido producido por la levadura diploide Pichia holstii (cepa NRRL Y-2448, anteriormente Hansenula holstii). El método para el crecimiento de P. holstii y el aislamiento de manopentaosa fosfato estaba basado en el descrito previamente (33, 34). Brevemente, el exopolisacárido bruto fue aislado de los sobrenadantes del cultivo de la levadura crecida aeróbicamente como sal de potasio mediante precipitación con etanol. Se utilizó posteriormente hidrólisis ácida para liberar manopentaosa fosfato del núcleo central de fosfomanán monoéster (PPME) del exopolisacárido. PPME y manopentaosa fosfato fueron luego separados entre sí como sales de bario mediante precipitación diferencial con etanol y posteriormente mediante filtración en gel. El oligosacárido tiene la estructura P-6-Man-\alpha-(1\rightarrow3)-Man-\alpha-(1\rightarrow3)-Man-\alpha-(1\rightarrow3)-Man-\alpha-(1\rightarrow2)-Man (34).

El sulfato de manopentaosa fosfato de levadura (33, 34) aislado del exopolisacárido de la levadura fue preparado de la siguiente manera. Una suspensión de manopentaosa fosfato de la levadura (0,09 g) en DMF (2 ml) y piridina (3 ml) fue añadida a una solución del complejo trióxido de azufre-piridina (0,8 g) (Aldrich) en DMF (1 ml). La mezcla fue calentada a 80ºC durante 2 horas. El sobrenadante fue decantado mientras estaba todavía templado y el residuo pegajoso fue lavado exhaustivamente con metanol (2 ml) tres veces. Después de decantar el metanol residual, el producto fue disuelto en agua (5 ml) y neutralizado (hasta pH 6) con acetato de bario (0,7 g aproximadamente en 5 ml de agua) con agitación vigorosa. Después de centrifugar (3.000 x g) el líquido de la parte superior fue decantado y la pella de sulfato de bario precipitado fue lavada exhaustivamente con agua (3 x 10 ml). El líquido de la parte superior y los lavados fueron combinados y colocados sobre una columna (2,5 x 14 cm) de resina de intercambio catiónico DOWEX 50W-X8-400 (forma H^{+}). La columna fue eluida con agua hasta que el eluato fue neutro. El eluato (50 ml aproximadamente) fue agitado y neutralizado (hasta pH 7) con acetato de sodio (0,4 g aproximadamente). La solución fue diluida con acetona (150 ml) y centrifugada (1.750 x g) para separar el producto. La pella fue pulverizada finamente mediante trituración bajo metanol y agitada mientras estaba todavía bajo metanol y posteriormente separada por filtración. El sólido fue lavado varias veces con metanol para dar manopentaosa fosfato de levadura sulfatado (0,18 g). El producto no estaba contaminado con ión bario (determinado mediante microanálisis e ionización por llama) ni con nitrógeno (microanálisis).

Se encontró que este producto tenía 10 de 16 posiciones posibles sulfatadas. Encontrado C, 15,35; H, 2,7; P, 1,2; S, 13,7; Na, 8,5. C_{30}H_{41}O_{59}PS_{10}Na_{9} \cdot 25 H_{2}O requiere C, 15,3; H, 3,5; P, 1,3; S, 13,6; Na, 8,8%. Los valores de nitrógeno y bario fueron 0,16 y 0% encontrados, respectivamente, y un 0% esperado para cada uno de ellos.

Se prepararon oligosacáridos de 1,6-\alpha-glucosa mediante hidrólisis ácida de dextrano (peso molecular medio 71.000; Sigma Chemical Co.). Así, se disolvió dextrano (5 g) en agua destilada (100 ml) y se ajustó el pH de esta solución a 1,8 con ácido clorhídrico 1 M. La mezcla fue sometida a reflujo (100ºC) durante 48 horas. La mezcla fue secada bajo presión reducida y se llevó a 100 ml con agua destilada y se secó una segunda vez bajo presión reducida. Al residuo se añadió etanol absoluto (100 ml) y se evaporó bajo presión reducida. El residuo se llevó a 4 ml con agua destilada y se aplicó a una columna de 5 x 90 cm de cromatografía con camisa de agua rellena de gel de exclusión de tamaños P2 de grado fino (BioRad). La columna había sido rellenada, precalentada y corrida a 60ºC durante 2 días antes de su utilización. Después de la adición de la mezcla de oligosacáridos de 1,6-\alpha-glucosa, la columna fue mantenida a 60ºC y eluida con agua (1 ml/minuto). Los productos que eluían de la columna fueron identificados como picos mediante refractometría diferencial y se recogieron las fracciones de acuerdo con ello. De esta manera se recogieron las fracciones correspondientes a las áreas bajo picos separados. Cada una de estas fracciones fue cromatografiada de nuevo en una columna idéntica de gel P2 a 60ºC y eluida con agua a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto. De este modo, a manera de ejemplo, la fracción identificada como correspondiente a 1,6-\alpha-glucohexaosa (0,19 g) fue cromatografiada de nuevo para dar un pico central principal con un hombro a cada lado. El producto que eluía en el pico central fue aislado eliminando el agua bajo presión reducida para dar 0,16 g de material que fue cromatografiado de nuevo una vez más en una columna idéntica de gel P2 a 60ºC a una velocidad de flujo de 0,3 ml/minuto. De esta forma se obtuvo glucohexaosa (0,14 g) (electropulverización, M^{+} = 990). De manera similar se aislaron 1,6-\alpha-glucotriosa, 1,6-\alpha-glucotetraosa (0,25 g) y 1,6-\alpha-glucopentaosa (0,17 g).

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Ejemplo 5 A. Materiales y métodos Actividad Anticoagulante de los Oligosacáridos Sulfatados

La actividad anticoagulante de cada oligosacárido sulfatado fue determinada según se describió previamente (35), utilizando el procedimiento del tiempo de trombina y el procedimiento del tiempo de tromboplastina parcial activada. La actividad de cada preparación fue comparada con la de un control heparina y la actividad anticoagulante expresada como porcentaje de la actividad de la heparina.

Ensayo de Angiogénesis Humana

El método de ensayo utilizado está descrito en la Solicitud de Patente Internacional Nº PCT/AU95/00105, cuya descripción se incorpora a la presente por referencia. Vasos sanguíneos de 1-2 mm de diámetro y 2-5 cm de longitud aproximadamente, fueron escindidos de la superficie de placentas humanas dentro de las 6 horas posteriores al nacimiento. Los vasos fueron colocados en BSS de Hank que contenía 2,5 mg/ml de fungizona y cortados en fragmentos de 1-2 mm de longitud utilizando pinzas de disección finas y tijeras de iridectomía. Los fragmentos de los vasos fueron liberados de coágulos residuales y lavados en BSS de Hank antes de su utilización. La disección y el seccionamiento de los vasos se realizó con la ayuda de una lámpara con lupa (Maggylamp, Newbound, Balmain, NSW, Australia). Se obtuvieron respuestas angiogénicas similares de vasos sanguíneos de origen venular y arterial pero, para cada ensayo, se utilizaron fragmentos de vasos procedentes solamente de un vaso.

Los ensayos de angiogénesis se llevaron a cabo en placas de cultivo de 24 ó 48 pocillos (Costar, Cambridge, MA). En el formato de 24 pocillos, se añadieron a cada pocillo 30 \mul de trombina bovina (50 unidades NIH/ml) en NaCl 0,15 M; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) seguido por 1,0 ml/pocillo de fibrinógeno bovino (Sigma) 3 mg/ml en Medio 199. La trombina y el fibrinógeno se mezclaron rápidamente y un fragmento de vaso se colocó rápidamente en el centro del pocillo antes de la formación del coágulo. Normalmente, la formación del gel de fibrina tenía lugar en 30 segundos y el fragmento del vaso se dejó suspendido en el gel. Después de la formación del gel, se añadieron 1,0 ml/pocillo de Medio 199 suplementado con un 20% de suero de ternera fetal (FCS), 0,2 mg de ácido e-amino caproico, L-glutamina y antibióticos (gentamicina y fungizona). En el formato de 48 pocillos los volúmenes de todos los reactivos se redujeron a la mitad. Los vasos fueron cultivados a 37ºC en un entorno humidificado durante 14-21 días, siendo cambiado el medio dos veces a la semana. La angiogénesis fue cuantificada mediante análisis de imagen con ordenador, utilizando el programa NIH Image, de imágenes digitales de los cultivos obtenidas con una cámara digital Dycam montada en un microscopio invertido (Olympus, Tokyo, Japón).

Ensayo de Heparanasa

El ensayo de heparanasa está basado en la observación de que la proteína sérica glucoproteína rica en histidina (HRG) se une a las cadenas de heparán sulfato y enmascara el sitio de corte de las heparanasas. Sobre la base del hallazgo de que el heparán sulfato cortado por heparanasa es incapaz de unirse a HRG, se ha desarrollado un ensayo de heparanasa que implica la digestión de cadenas de heparán sulfato marcadas con ^{3}H con heparanasa, la unión del heparán sulfato digerido a esferas con HRG acoplada y la medida de la marca ^{3}H no unida. Al incrementar la digestión del sustrato, una cantidad creciente de marca ^{3}H es incapaz de unirse a las esferas con HRG. Por tanto, este método representa un procedimiento sencillo y rápido para medir la actividad heparanasa en extractos de tejido y para determinar la inhibición de las heparanasas por varios compuestos.

Inicialmente, heparán sulfato intestinal bovino (Mr medio 32 kDa) fue des-N-acetilado parcialmente por calentamiento en hidrato de hidrazina (36) y reacetilado con ^{3}H-anhídrido acético. HRG de pollo, purificada mediante el método de Rylatt y col. (1981) (37), fue acoplada a Sepharosa 4B (Pharmacia) activada con CNBr según las instrucciones del fabricante.

La actividad heparanasa de plaquetas humanas fue determinada mediante incubación (37ºC, 30 minutos) de heparanasa plaquetaria humana purificada (que había demostrado tener la misma actividad hacia heparán sulfato que la actividad heparanasa presente en las líneas celulares cultivadas altamente metastásicas HCT 116 de carcinoma humano, 13762 MAT de adenocarcinoma de rata y B16 de melanoma de ratón) con 60 pmoles de heparán sulfato intestinal bovino radiomarcado con ^{3}H. La actividad fue determinada por la tasa de producción de fragmentos de heparán sulfato más pequeños (5 kDa aproximadamente) que no se unieron después de pasar la mezcla de incubación (100 \mul) a través de minicolumnas de HRG-Sepharosa (200 \mul de esferas empaquetadas) que retenían el sustrato sin cortar y parcialmente cortado más grande.

En los ensayos de inhibición de heparanasa, se añadieron al enzima diferentes concentraciones de inhibidor antes de la adición del sustrato radiomarcado, siendo retenido el inhibidor en la mezcla de reacción a lo largo de todo del periodo de incubación.

Ensayo de Metástasis

La actividad antimetastásica de los diferentes oligosacáridos sulfatados fue determinada utilizando el adenocarcinoma mamario de rata 13762 MAT altamente metastásico (35). Las células tumorales fueron mantenidas in vitro según se ha descrito previamente (35). Ratas Fisher 344 hembra (10-13 semanas de edad) fueron inyectadas i.v. con 2 x 10^{5} células 13762 MAT en 0,6 ml de medio RPMI 1640 que contenía un 10% de FCS. En el momento de la inyección de las células tumorales los animales fueron inyectados también con 2 mg de oligosacárido sulfatado, obteniéndose resultados similares cuando el oligosacárido fue inyectado i.v., i.p. o subcutáneamente. Se extrajeron los pulmones de las ratas 13 días después de la inyección de las células tumorales, se colocaron en solución de Bouin durante al menos 24 horas y posteriormente se determinaron las metástasis en el pulmón bajo un microscopio de disección. El número de metástasis pulmonares en las ratas tratadas con el oligosacárido sulfatado se comparó con el observado en los animales control, siendo incluidos un mínimo de cuatro animales en cada grupo.

Efecto de los Oligosacáridos Sulfatados sobre la Interacción FGF-Heparina/Heparán Sulfato

Se utilizó un ensayo de unión, que está descrito con detalle en otro lugar (38), para medir la unión de aFGF y de bFGF a heparina y determinar la capacidad de los diferentes oligosacáridos sulfatados para inhibir esta interacción. Brevemente, FGFs fueron inmovilizados en los pocillos de placas de PVC de 96 pocillos y se determinó la unión de heparina radiomarcada a los FGFs inmovilizados. En los ensayos de inhibición se examinaron diluciones seriadas de los oligosacáridos sulfatados con el fin de determinar su capacidad para inhibir la interacción FGF-heparina. Los resultados de la inhibición fueron expresados como la concentración de oligosacárido sulfatado requerida para inhibir la unión de heparina a los FGFs inmovilizados en un 20% o en un 50%. Heparina no marcada fue incluida como control en todos los experimentos de inhibición de la unión.

La interacción FGF-heparán sulfato fue determinada, según se informó anteriormente (39), midiendo la unión de fibroblastos BALB/c 3T3 a FGFs inmovilizados en PVC, detectándose la unión de las células mediante tinción con Rosa de Bengala de las células adherentes. Los oligosacáridos sulfatados fueron examinados para determinar su capacidad para inhibir este proceso de adhesión celular, que es totalmente dependiente de las estructuras de heparán sulfato sobre la superficie de las células BALB/c 3T3 (39). Los datos fueron expresados como la concentración de oligosacárido sulfatado que inhibía la adhesión celular en un 50% (CI50).

Modelo de Inflamación de la Bolsa de Aire

El ensayo está basado en un procedimiento previamente descrito (40). Se formaron bolsas de aire subcutáneas en los lomos de ratones mediante la inyección de 5 ml de aire estéril debajo de la piel de un área afeitada entre las escápulas de un ratón anestesiado el día 1. El día 3, se volvió a inflar la bolsa mediante la inyección de 2,5 ml de aire. La inflamación fue inducida el día 6 inyectando directamente en la bolsa 1,0 ml de tioglicolato 56 mg/ml o 1,0 ml de solución salina como control. Aproximadamente 17-20 horas después de la inyección de tioglicolato, los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y se recuperó el contenido celular de la bolsa mediante la inyección de 2,5 ml de PBS/5% de FCS enfriado en hielo. Los oligosacáridos sulfatados fueron analizados con el fin de determinar su capacidad para inhibir la reacción inflamatoria, siendo inyectados subcutáneamente (50 \mul en PBS) en un lugar separado inmediatamente después de la administración del tioglicolato. Se utilizó Prednisolona como fármaco antiinflamatorio control, siendo inyectada subcutáneamente en aceite a 25 mg/kg. Se determinó el contenido celular total de cada bolsa utilizando un Contador Coulter y se determinaron las diferentes subpoblaciones leucocitarias mediante citometría de flujo inmunofluorescente.

Modelo de Asma en Ratón

Se utilizó un modelo de asma en ratón previamente descrito (41) con el fin de analizar la capacidad de los oligosacáridos sulfatados para inhibir la infiltración de eosinófilos en los pulmones inducida por un aeroalergeno (ovoalbúmina, OVA). Se sensibilizaron ratones (C57BL/6, 6-10 semanas de edad) mediante inyección i.p. de 50 mg de OVA/1 mg de Alhidrogel (CSL Ltd., Parkville, Australia) en solución salina al 0,9% estéril los días 0 y 12. El día 24, los ratones fueron expuestos a un aerosol de OVA (10 mg/ml) en solución salina al 0,9% durante 30 minutos, tres veces (a intervalos de 1 hora) y posteriormente fueron expuestos a un desafío similar los días 26 y 28. El aerosol fue generado a 6 litros/minuto por un nebulizador que producía un diámetro medio de partícula de 39 \mum en una cámara cerrada de 800 cm^{3}. El día 29 los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Se canuló la tráquea y la luz de las vías respiratorias fue lavada con 4 x 1 ml de solución salina al 0,9% que contenía BSA (0,1% peso/volumen) a 37ºC. Se recuperaron 0,8 ml aproximadamente del fluido instilado por lavado. Los fluidos procedentes de los lavados bronqueoalveolares (BALF) obtenidos de un animal fueron agrupados y se determinó el número de células utilizando un hemocitómetro estándar. Las células del BALF fueron también citocentrifugadas y teñidas diferencialmente con solución de May-Grunwald-Giemsa, siendo identificados los eosinófilos utilizando criterios morfológicos. Los datos fueron calculados como el número de eosinófilos/ml de BALF. Los oligosacáridos sulfatados fueron administrados a los animales sistémicamente mediante bombas miniosmóticas Alzet insertadas i.p. o bien a través de los pulmones como un aerosol. Las bombas miniosmóticas fueron insertadas el día 23, 24 horas antes del desafío con OVA y administraron el fármaco continuamente hasta que los animales fueron sacrificados el día 29. En el caso de la administración en aerosol, los ratones fueron expuestos a un aerosol de oligosacáridos sulfatados en solución salina al 0,9% durante 30 minutos, tres veces (a intervalos de 1 hora) los días 23, 25 y 27.

Modelo de Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE)

Se prepararon células esplénicas para la transferencia adoptiva de EAE según se ha descrito previamente (43). Brevemente, ratas Lewis fueron sensibilizadas a la proteína básica de la mielina, las células esplénicas inmunes activadas por ConA in vitro y 30 x 10^{6} células efectoras de EAE activadas con ConA transferidas i.v. a cada receptor. Se implantaron subcutáneamente bombas miniosmóticas (Alzet) que contenían oligosacáridos sulfatados en el momento de la transferencia de células y suministraron una dosis de 70 mg/kg/día durante 14 días. La EAE clínica fue calificada de acuerdo con el esquema siguiente: 0, asintomática; 1, mitad distal de la cola flácida; 2, cola completa flácida; 3, ataxia, dificultad para enderezarse; 4, debilidad de los miembros traseros y 5, parálisis de los miembros traseros.

Modelo de Enfermedad Inflamatoria Intestinal

Se indujo enfermedad inflamatoria intestinal en ratones suplementando el agua de bebida con un 5% (p/v) de sulfato de dextrano sódico (DSS) según es suministrado por TdB Consultancy, Uppsala, Suecia. La solución fue ajustada a pH 8,0 y filtrada a través de una membrana de 0,45 \mum. Las soluciones de DSS fueron recogidas diariamente, se filtraron de nuevo y se ajustaron los volúmenes con solución madre de DSS nueva. Ratones BALB/c macho de 6-7 semanas de edad fueron seleccionados por el peso corporal y aquellos que pesaban entre 20-23 g fueron agrupados en jaulas de 5 ratones/jaula.

Los ratones fueron inyectados con manopentaosa fosfato sulfatado (20 mg/kg/día) o vehículo (agua estéril) a intervalos de 8 horas desde el día 0 hasta el día 10. El volumen de inyección fue estandarizado a 100 \mul e inyectado subcutáneamente en la nuca.

La tasa de consumo de DSS, el peso corporal y los síntomas fueron valorados diariamente para todos los ratones. Los síntomas de diarrea y sangrado rectal fueron valorados cada uno de ellos como ligero o fuerte y se les dieron valores numéricos de 1 y 4, respectivamente. Se indicó también la presencia de mucus y se incluyó como puntuación de diarrea ligera. La suma de las puntuaciones de diarrea y sangrado rectal fue posteriormente dividida por el número de animales supervivientes en ese grupo ese día. La puntuación total es la suma de las puntuaciones de diarrea y sangrado rectal.

B. Resultados Actividad Antiangiogénica y Antimetastásica de Oligosacáridos Existentes en la Naturaleza Sulfatados

Una vez que se hubo sintetizado una variedad de oligosacáridos existentes en la naturaleza sulfatados, fueron examinados en una variedad de ensayos biológicos. La Tabla 1 resume los resultados obtenidos con las formas sulfatadas de 12 oligosacáridos existentes en la naturaleza. En la Tabla 1 se incluyen también para comparación las actividades biológicas de suramina (un compuesto que tiene una moderada actividad antiangiogénica e inhibidora de heparanasas) (42) y de heparina.

Inicialmente, se demostró que todos los oligosacáridos sulfatados analizados tenían una actividad anticoagulante despreciable, esto es, <2% de la actividad de la heparina (Tabla 1). Ésta era una propiedad importante, ya que la heparina, un potente compuesto antimetastásico, tiene utilidad clínica limitada para esta indicación debido a su potente actividad anticoagulante.

Tres de los oligosacáridos existentes en la naturaleza sulfatados eran inhibidores bastante potentes de la angiogénesis humana, en concreto manopentaosa fosfato sulfatado (derivado de P. holstii), maltotetraosa sulfato (referencia únicamente) y maltohexaosa sulfato (referencia únicamente). Manopentaosa fosfato y maltohexaosa eran los más potentes de estos compuestos, con una concentración inhibidora del 50% de 2 \mug/ml, mientras que maltotretaosa produjo un 50% de inhibición a 20 \mug/ml. Un ejemplo de la inhibición pronunciada de la angiogénesis inducida por 20 \mug/ml de maltohexaosa sulfato está representado en la Figura 1 (referencia únicamente). Es interesante indicar que la heparina tenía poca actividad antiangiogénica. Por tanto, parece probable que se requieran oligosacáridos sulfatados con una longitud de la cadena relativamente corta para este tipo de actividad. Una titulación más completa de la inhibición de la angiogénesis por la serie de maltosa únicamente de referencia está representada en la Figura 2 y por manopentaosa fosfato sulfatado en la Figura 3. Puede verse que, con la serie de maltosa, la maltosa sulfato tenía poca actividad inhibidora, mientras que maltotetraosa y maltohexaosa sulfato eran inhibidores bastante potentes (Figura 2).

Todos los experimentos de angiogénesis presentados en la Tabla 1 implicaban la adición del oligosacárido al medio de cultivo en el momento del comienzo del ensayo de angiogénesis. Sin embargo, estudios preliminares (datos no mostrados) indican que la adición de maltohexaosa sulfato después del comienzo de la respuesta de angiogénesis, puede inhibir también el crecimiento adicional de vasos, aunque la inhibición más eficaz tiene lugar cuando el compuesto es añadido al comienzo del cultivo.

Los oligosacáridos sulfatados diferían también notablemente en su actividad inhibidora de heparanasas, siendo los inhibidores más potentes manopentaosa fosfato sulfatado y maltohexaosa sulfato, semejándose la actividad de estos dos compuestos a la de la heparina (Tabla 1). Y lo que es más interesante, estos dos compuestos son también compuestos antiangiogénicos eficaces. Sin embargo, la inhibición de la angiogénesis no se correlacionaba con la actividad inhibidora de heparanasas de muchos compuestos. Por ejemplo, las cicloamilosas sulfatadas eran inhibidores de heparanasas bastante potentes pero malos inhibidores de la angiogénesis. La serie de maltosa de referencia únicamente fue también muy informativa respecto a la longitud de la cadena y la inhibición de heparanasas. La Tabla 3 presenta la actividad inhibidora de heparanasas para la serie completa de maltosa, variando desde el disacárido (maltosa) hasta el heptasacárido (maltoheptaosa). La maltosa no era inhibidora, la maltotriosa era débilmente inhibidora, la maltotetraosa presentaba una modesta actividad inhibidora, mientras que los penta-, hexa- y hepta-sacáridos presentaban una elevada actividad inhibidora. Por tanto, se requiere un pentasacárido sulfatado, o mayor, para una inhibición óptima de heparanasas.

Muchos de los azúcares sulfatados han sido también analizados in vivo para determinar su actividad antimetastásica (Tabla 1). En general, existe una correlación razonablemente buena entre la inhibición de heparanasas y la actividad antimetastásica. Así, manopentaosa fosfato sulfatado y maltohexaosa sulfato, los dos compuestos con la actividad inhibidora de heparanasas más elevada, presentan la mayor actividad antimetastásica, de hecho, no difieren significativamente de la heparina en su capacidad para prevenir metástasis (Tabla 1). Otros dos compuestos de referencia únicamente, ciclo-octa-amilosa sulfato y estaquiosa sulfato eran también antimetastásicos razonablemente eficaces, una propiedad consistente con su modesta actividad inhibidora de heparanasas. Colectivamente, estos datos sugieren que manopentaosa fosfato sulfatado y maltohexaosa sulfato poseen simultáneamente una considerable actividad antiangiogénica, antimetastásica e inhibidora de heparanasas.

La actividad antimetastásica de la serie de oligosacáridos sulfatados de maltosa de referencia únicamente está representada con mayor detalle en la Figura 4. Al incrementar la longitud de la cadena había un incremento uniforme de la actividad antimetastásica, siendo los más activos los penta-, hexa- y hepta-sacáridos. Cuando se administró intravenosamente a una dosis de 2 mg/rata, la maltosa sulfato no tuvo efecto sobre las metástasis (Figura 4A), pero cuando se administró subcutáneamente a 4 mg/rata se observó una inhibición significativa de las metástasis (Figura 4B). Experimentos posteriores revelaron que, independientemente de la vía de inyección (esto es, i.v., subcutánea o i.p.), los oligosacáridos sulfatados presentaban una actividad antimetastásica comparable (datos no mostrados). De hecho, la actividad antimetastásica de la maltosa sulfato fue observada únicamente cuando se administraron a los animales dosis elevadas. Como la maltosa sulfato es un inhibidor de heparanasas muy malo, este resultado sugiere que la inhibición de heparanasas puede no ser la única forma por la cual los oligosacáridos sulfatados inhiben las metástasis tumorales, particularmente cuando se utilizan dosis elevadas de los oligosacáridos.

Se sulfataron cicloamilosas y se incluyeron en el estudio como Ejemplos de Referencia, ya que representan oligosacáridos no lineales. Es interesante indicar que estos compuestos fueron sólo modestamente activos (Tabla 1), lo cual implica que pueden requerirse oligosacáridos lineales para una actividad óptima. Además, los oligosacáridos sulfatados más activos eran inhibidores de la angiogénesis, las metástasis y la actividad heparanasa mucho más eficaces que la suramina (Tabla 1), un fármaco sometido actualmente a ensayos clínicos como compuesto antiangiogénico (42).

Como la actividad antiangiogénica de los compuestos no se correlacionaba siempre directamente con su actividad inhibidora de heparanasas, parecía probable que los oligosacáridos sulfatados pudieran inhibir la angiogénesis mediante algún otro mecanismo. Según se mencionó anteriormente, es muy probable que algunos oligosacáridos sulfatados puedan perturbar la acción de factores de crecimiento angiogénicos mediante la alteración de las interacciones factor de crecimiento-heparán sulfato. Análisis previos (ver la Solicitud de Patente Internacional Nº PCT/AU95/00105) han demostrado que el ensayo de angiogénesis humana utilizado en este ejemplo es en gran parte dependiente de bFGF endógeno, y en menor grado de la acción de aFGF y VEGF. Por tanto, los diferentes oligosacáridos sulfatados fueron examinados con el fin de determinar su capacidad para actuar como competidores de la interacción de bFGF, aFGF y VEGF con heparina o heparán sulfato.

Se encontró que, al incrementar la longitud de la cadena, la serie de oligosacáridos sulfatados de maltosa de referencia únicamente se convertían en inhibidores más eficaces de la interacción de bFGF y aFGF con los heparán sulfatos de la superficie celular (Tabla 2), esto es, la maltosa era débilmente inhibidora, mientras que los penta-, hexa- y hepta-sacáridos eran los más activos. Manopentaosa fosfato sulfatado presentaba también una actividad inhibidora considerable en este sistema (Tabla 2). En la Figura 5 se presentan las curvas de inhibición completas para la inhibición de la interacción aFGF-heparán sulfato por la serie de oligosacáridos sulfatados de maltosa. Estudios adicionales mostraron que maltohexaosa sulfato era también un potente inhibidor de la unión de heparina radiomarcada a bFGF y aFGF (datos no mostrados).

Como maltohexaosa sulfato era uno de los compuestos antiangiogénicos y antimetastásicos más activos, se examinó con cierto detalle la influencia del grado de sulfatación sobre su actividad biológica. Inicialmente, se observó que aunque se detectaba cierta actividad anticoagulante con la maltohexaosa más sulfatada, esta actividad era todavía extremadamente baja cuando se comparaba con la de la heparina (Tabla 2). Al incrementar la sulfatación, sin embargo, había un incremento constante de la capacidad de la maltohexaosa para inhibir la actividad heparanasa y la unión de FGF a heparán sulfato (Tabla 2). Sin embargo, la actividad inhibidora alcanzaba una meseta en ambos sistemas cuando la sulfatación era del 85% o mayor.

Los estudios de inhibición de metástasis (Figura 6) demostraron también que al aumentar los grados de sulfatación la maltohexaosa sulfato se convertía en un fármaco antimetastásico más eficaz. En contraste, había una sugerencia de que maltohexaosa muy sulfatada (90-100% sulfatada) era un inhibidor menos eficaz de la angiogénesis (Figura 7). Estos datos sugieren que existen diferencias sutiles en la estructura óptima del oligosacárido sulfatado requerida para inhibir la angiogénesis y las metástasis. No obstante, se han identificado varios oligosacáridos sulfatados, derivados de oligosacáridos existentes en la naturaleza, que muestran simultáneamente una potente actividad antimetastásica y una potente actividad antiangiogénica. Estos compuestos son manopentaosa fosfato sulfatado de P. holstii y (referencia únicamente) maltopentaosa, -hexaosa y -heptaosa sulfato.

Actividad Antiangiogénica y Antimetastásica de Oligosacáridos Sintéticos Sulfatados

Los oligosacáridos sintéticos sulfatados descritos en los Ejemplos 1-5 fueron también analizados para determinar su actividad biológica. La Tabla 3 resume la capacidad de oligosacáridos sintéticos sulfatados que contenían manosa, galactosa o glucosa (de referencia únicamente) para inhibir la coagulación, la acción de las heparanasas y la unión de factores de crecimiento-heparán sulfato. Todos los oligosacáridos sulfatados sintéticos analizados presentaban una actividad anticoagulante despreciable. Sin embargo, con la excepción de los trisacáridos de manosa y glucosa, todos los demás oligosacáridos sulfatados eran inhibidores razonablemente eficaces de la actividad heparanasa y de la unión factores de crecimiento-heparán sulfato. De hecho, la conclusión global es que los oligosacáridos sintéticos sulfatados que contienen 4-6 unidades de hexosa (esto es, D-manosa, D-galactosa o D-galactosa) son muy activos en estos ensayos. Una excepción es galactotriosa sulfato, que era esencialmente tan activo como los demás miembros de la serie de galactosa.

Cuando se analizaron en el ensayo de angiogénesis humana, los oligosacáridos de manosa sulfatados eran inhibidores, aunque los penta- y hexa-sacáridos eran más activos que el tetrasacárido (Figura 8), asemejándose a manopentaosa fosfato sulfatado en su eficacia. De manera similar, los tetra-, penta- y hexa-sacáridos de manosa sulfatados eran tan eficaces como manopentaosa fosfato sulfatado como fármacos antimetastásicos (Figura 9). Los oligosacáridos sulfatados que contenían galactosa y la glucohexaosa sulfato inhibían también las metástasis (Figura 10), aunque tendían a ser ligeramente menos activos que los compuestos que contenían manosa.

Actividad Antiinflamatoria de los Oligosacáridos sulfatados

Según se mencionó anteriormente, una barrera clave para la entrada de los leucocitos a los lugares inflamatorios es la membrana basal subendotelial. Para atravesar esta membrana, los leucocitos deben emplear una batería de enzimas degradantes (11). De particular relevancia es la endoglucosidasa heparanasa, que corta las cadenas de heparán sulfato asociadas a la membrana basal y es esencial para la extravasación de los leucocitos (12, 13). De hecho, igual que con los estudios de inhibición de metástasis (35), los polisacáridos sulfatados que inhiben la actividad heparanasa son potentes inhibidores de la inflamación (43, 44). Sobre la base de estas observaciones, los expertos en la técnica esperarían que los oligosacáridos sulfatados que eran potentes agentes antiangiogénicos y antimetastásicos serían compuestos antiinflamatorios muy eficaces. De particular importancia a este respecto son maltohexaosa sulfato y manopentaosa sulfato. Además, como la angiogénesis está asociada con enfermedades inflamatorias crónicas tales como la artritis reumatoide (18), la actividad angiogénica de estos compuestos tendría un valor adicional en el tratamiento de la inflamación.

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Se han obtenido pruebas en favor de esta predicción en varios modelos animales de inflamación. En primer lugar, maltohexaosa sulfato, manopentaosa sulfato y manopentaosa fosfato sulfatado eran capaces de inhibir significativamente la inflamación en la bolsa de aire inducida por tioglicolato (Tabla 4). De hecho, en un experimento una única inyección de manopentaosa sulfato era tan eficaz como la Prednisolona para inhibir la infiltración de leucocitos, que eran predominantemente neutrófilos, mientras que maltohexaosa sulfato era algo menos eficaz. Se observó incluso una mayor inhibición de la respuesta inflamatoria cuando los oligosacáridos sulfatados eran inyectados en dos dosis iguales separadas 6 horas.

En segundo lugar, los oligosacáridos sulfatados fueron analizados con el fin de determinar su capacidad para inhibir un modelo de asma crónica en ratón. Este modelo se caracteriza por una afluencia masiva de eosinófilos en los pulmones de los ratones que es inducida mediante desafío con un aeroalergeno (41). Tal respuesta inflamatoria es característica del asma crónico en humanos. Cuando se administraron a través de bombas miniosmóticas, maltohexaosa sulfato y manopentaosa sulfato inhibían significativamente la acumulación de eosinófilos en los pulmones de los ratones (Tabla 5). Maltohexaosa sulfato presentó también cierta actividad antiinflamatoria cuando se administró como aerosol (solución de 40 mg/ml).

En tercer lugar, manopentaosa sulfato y manopentaosa fosfato sulfatado inhibían ambos significativamente la EAE en un modelo de la enfermedad en rata (Tabla 6). De hecho, algunos animales tratados con los oligosacáridos sulfatados no desarrollaron síntomas de la enfermedad. Estos datos son consistentes con estudios anteriores que mostraban que polisacáridos sulfatados que inhibían la actividad heparanasa podían reducir la gravedad de la EAE (43).

Finalmente, se examinó manopentaosa fosfato con el fin de determinar su capacidad para inhibir un modelo de enfermedad inflamatoria intestinal en ratones. Este modelo, que es inducido por dextrán sulfato en el agua de bebida, induce una colitis que se asemeja a la colitis ulcerosa y, en menor grado, a la enfermedad de Chron. Se encontró que a 20 mg/kg/día manopentaosa fosfato sulfatado producía una notable atenuación de la colitis aguda y prevenía también la pérdida de peso corporal causada por la enfermedad (Tabla 7). Los controles de este experimento recibieron las inyecciones de oligosacárido sulfatado pero no el dextrán sulfato en su agua de bebida.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Inhibición de la angiogénesis humana, de la actividad heparanasa y de las metástasis por formas sulfatadas de diferentes oligosacáridos existentes en la naturaleza

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TABLA 2 Inhibición de la actividad heparanasa y de la unión de factores de crecimiento a heparán sulfatos por manopentaosa sulfato sulfatado y la serie de oligosacáridos sulfatados de maltosa

3

TABLA 3 Inhibición de la actividad heparanasa, de la unión de factores de crecimiento a heparán sulfatos por formas sulfatadas de diferentes oligosacáridos sintéticos

4

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TABLA 4 Efecto de oligosacáridos sulfatados sobre la inflamación de la bolsa de Aire^{a}

5

TABLA 5 Efecto de los oligosacáridos sulfatados sobre la acumulación de eosinófilos en pulmones de ratón inducida por ovoalbúmina (OVA)^{a}

6

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TABLA 6 Efecto de los oligosacáridos sulfatados sobre la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) transferida de manera adoptiva^{a}

7

TABLA 7 Efecto de manopentaosa fosfato sulfatado sobre la enfermedad inflamatoria intestinal en ratones^{a}

8

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Referencias

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Claims (11)

1. Un oligosacárido sulfatado, donde el oligosacárido tiene la fórmula general II:

(II)R_{y}-(R_{y})_{n}-R_{y}

en la cual cada grupo R_{y} es el mismo y representa cada uno de ellos una unidad monosacarídica que es manosa o galactosa, estando unidas las unidades monosacarídicas adyacentes por enlaces glucosídicos 1\rightarrow3, 1\rightarrow4 y/o 1\rightarrow6; y

n es un número entero de 1 a 6.

2. Un oligosacárido sulfatado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que n es de 1 a 4, preferiblemente 3 ó 4.

3. Un oligosacárido sulfatado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el oligosacárido es un oligosacárido existente en la naturaleza.

4. Un oligosacárido sulfatado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el oligosacárido es preparado mediante degradación enzimática o química de un polisacárido existente en la naturaleza.

5. Una composición farmacéutica o veterinaria, que contiene al menos un oligosacárido sulfatado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo o diluyente del mismo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable.

6. Al menos un oligosacárido sulfatado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para ser utilizado en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal.

7. Al menos un oligosacárido sulfatado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para ser utilizado en el tratamiento antiangiogénico, antimetastásico y/o antiinflamatorio de un paciente humano o de otro paciente animal de sangre caliente con necesidad de tal tratamiento.

8. Al menos un oligosacárido sulfatado de acuerdo con la reivindicación 7, donde el tratamiento comprende el tratamiento de una enfermedad dependiente de angiogénesis, incluyendo la angiogénesis asociada con el crecimiento de tumores sólidos, con retinopatías proliferativas y con artritis reumatoide.

9. Al menos un oligosacárido sulfatado de acuerdo con la reivindicación 7, donde el tratamiento comprende el tratamiento de enfermedades y condiciones inflamatorias en las cuales la actividad inhibidora de heparanasas inhibe la infiltración de leucocitos, incluyendo enfermedades inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedades tales como colitis ulcerosa y la enfermedad inflamatoria intestinal de Crohn, el rechazo de aloinjertos y el asma crónico.

10. Utilización en la fabricación de un medicamento para el tratamiento antiangiogénico, antimetastásico y/o antiinflamatorio de un paciente humano o de otro paciente animal de sangre caliente de al menos un oligosacárido sulfatado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

11. Un proceso para producir un oligosacárido sulfatado como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, proceso que comprende la degradación enzimática o química de un polisacárido existente en la naturaleza.