ES2342146T3 - Complejo de enzima y proteina. - Google Patents
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Abstract
Complejo de enzima, proteína y portador, que comprende: (1) un portador, (2) un enzima, encontrándose conjugadas covalentemente dos o más moléculas del enzima con el portador en (1), y (3) una proteína con una potencia de unión específica para una o más sustancias adicionales, encontrándose conjugada la proteína sola con por lo menos una molécula de entre las dos o más moléculas del enzima en (2).
Description
Complejo de enzima y proteína.
La presente invención se refiere a un complejo
de enzima, proteína y portador preparado mediante la conjugación de
una proteína con una potencia de unión específica para otra
sustancia o sustancias a un enzima conjugado covalentemente con un
portador, y el complejo se utiliza para el inmunoensayo, tal como
inmunohistoquímica e inmunoensayo enzimático.
Debido a los recientes avances en la
inmunoquímica, se ha utilizado ampliamente un inmunoensayo capaz de
detectar una cantidad traza de una sustancia a una sensibilidad
elevada mediante la utilización de una reacción de
antígeno-anticuerpo. En la actualidad, dos campos de
tipos generales de inmunoensayo son la inmunohistotinción y el
inmunoensayo enzimático.
La inmunohistotinción es un medio para detectar
un antígeno específico sobre un tejido con un anticuerpo que
reconoce específicamente el antígeno. Generalmente se somete un
anticuerpo que reconoce un antígeno específico a una reacción sobre
una sección delgada obtenida de un bloque preparado mediante
fijación de un tejido y la posterior inclusión del tejido en
parafina; mediante el examen de la presencia o ausencia del
anticuerpo reaccionado puede determinarse la presencia del
antígeno. El anticuerpo que se deja reaccionar en primer lugar con
el antígeno generalmente se denomina anticuerpo primario. Al
conjugar una sustancia que emite una señal detectable visualmente o
con un aparato, con el anticuerpo primario, la intensidad de la
señal indica la cantidad del anticuerpo primario, que corresponde,
a su vez, a la cantidad del antígeno en la sección. A modo de
sustancia que emite la señal para alcanzar el fin, puede
mencionarse una sustancia fluorescente y un enzima. En una etapa
temprana del desarrollo de la inmunohistotinción, se utilizaba una
sustancia fluorescente como sustancia que emitía dicha señal. En
este caso, resultaba necesario un microscopio de fluorescencia para
detectar la fluorescencia.
Posteriormente, un método de anticuerpo marcado
enzimáticamente fue desarrollado por Nakane et al., que
permitió el análisis de la imagen teñida con un microscopio óptico.
En la actualidad generalmente se utiliza un enzima como sustancia
emisora de señal. Para llevar a cabo la inmunohistotinción, puede
llevarse a cabo una reacción de color correspondiente a la
actividad de un enzima en caso de encontrarse conjugado con un
anticuerpo primario, mediante la adición de una sustancia
cromogénica al enzima, y la reacción de color corresponde a la
cantidad del anticuerpo, es decir la cantidad de antígeno presente
en el tejido. Sin embargo, generalmente, en ningún caso puede
recuperarse una sensibilidad suficiente mediante la utilización de
dicho método.
El método utilizado más comúnmente en la
actualidad se denomina método de
estreptavidina-biotina (método SAB), es decir un
medio para amplificar la señal de un anticuerpo primario unido a un
antígeno, detectando de esta manera la señal. El método comprende
en primer lugar someter un anticuerpo primario que reconoce una
sustancia específica en una sección de tejido a reacción con el
mismo. A continuación, un anticuerpo secundario que se une al
anticuerpo primario se somete a reacción con el mismo. Generalmente,
el anticuerpo secundario es un anticuerpo policlonal que reconoce y
se une al anticuerpo primario. DE acuerdo con lo anterior, se une
una pluralidad de moléculas del anticuerpo secundario al anticuerpo
primario. Preliminarmente se conjuga una pluralidad de moléculas de
biotina a cada molécula de anticuerpo secundario. Se permite que
reaccione estreptavidina conjugada con enzima (reactivo enzimático)
con el complejo de anticuerpo primario-anticuerpo
secundario conjugado con biotina. Es conocido que la estreptavidina
puede unirse fuertemente a la biotina. Por lo tanto, se forma un
complejo de anticuerpo primario-anticuerpo
secundario conjugado con biotina-estreptavidina
conjugada con enzima. Debido a que la pluralidad de moléculas del
conjugado de anticuerpo secundario con biotina se han unido a cada
molécula de anticuerpo primario y una pluralidad de moléculas del
conjugado de estreptavidina con enzima se han unido a cada molécula
del conjugado de anticuerpo secundario con biotina según el método,
en consecuencia la cantidad de enzima unida indirectamente al
anticuerpo primario puede incrementarse marcadamente. Como
resultado, el antígeno en la sección de tejido puede detectarse con
una sensibilidad elevada.
Tal como se ha indicado anteriormente, el método
SAB es un método excelente capaz de producir una señal más intensa
debido a que un número muy elevado de moléculas de un enzima se unen
finalmente al anticuerpo primario unido al antígeno. Sin embargo,
desde otro punto de vista de los procedimientos, resulta necesario
llevar a cabo tres etapas de procedimiento: la reacción del
anticuerpo primario, la reacción del anticuerpo secundario y la
reacción del reactivo enzimático. Tal como se ha indicado
anteriormente, el método SAB incluye muchas etapas y no puede
evaluarse si resulta satisfactorio en los aspectos de la práctica
clínica y similares, que exigen rapidez y simplicidad conjuntamente
con exactitud. De esta manera, se espera que se mejore el método
SAB.
Como otro medio de inmunoensayo general, es
conocido el inmunoensayo enzimático (EIA). El principio y
procedimiento típicos del EIA son los siguientes. En primer lugar,
un anticuerpo que reconoce una sustancia que se desea someter a
ensayo se inmoviliza en un portador, tal como una perla de
poliestireno o una microplaca. Tras bloquear seguidamente el
portador con proteína, tal como albúmina, a continuación se añade
una solución (muestra) que contiene una sustancia (antígeno) como
el objeto de ensayo pretendido. A continuación, se añade un
anticuerpo que reconoce un antígeno, conjugado con un enzima
(anticuerpo marcado con enzima). En otras palabras, el antígeno
queda interpuesto entre dos anticuerpos. Seguidamente, se lava el
exceso de anticuerpo marcado con enzima; se añade un sustrato
cromogénico del enzima para el desarrollo de color. Debido a que la
cantidad del antígeno depende de la actividad del enzima, puede
determinarse la concentración del antígeno en la muestra mediante
comparación con el desarrollo de color de una muestra que contiene
antígeno a una concentración preliminarmente conocida. Varios
factores son responsables de la sensibilidad del inmunoensayo
enzimático, y la calidad del anticuerpo marcado con enzima es uno
de los factores significativos. Más específicamente, se cree que
puede obtenerse una señal más intensa en el caso de que el
anticuerpo marcado con enzima presente muchas moléculas del enzima,
de manera que el antígeno puede someterse a ensayo a una
sensibilidad elevada.
Tal como se ha indicado anteriormente, la
calidad del anticuerpo marcado con enzima resulta muy importante
para el inmunoensayo e influye marcadamente sobre la sensibilidad
del sistema de ensayo o sobre el número de etapas incluidas en el
procedimiento. Tal como se ilustra posteriormente, se han realizado
muchos intentos para obtener un anticuerpo marcado con enzima que
consiga una elevada sensibilidad. Muchos de ellos comprenden
conjugar muchas moléculas de un enzima y un anticuerpo con un
portador.
En la solicitud de patente japonesa publicada nº
JP-A 63-503138 (1988), se conjuga un
anticuerpo con un portador conjugado con un derivado de un marcaje
detectable, tal como un fármaco, toxina, quelante o compuesto de
boro. A modo de portador se utiliza aminodextrano; en primer lugar
se conjuga un fármaco, tal como metotrexato, con el aminodextrano.
A continuación, el grupo aldehído generado a partir de la oxidación
de la cadena sacárida del anticuerpo con peryodato sódico se deja
reaccionar con el grupo amino del aminodextrano, seguido de la
reducción con cianoborohidruro sódico para conseguir un enlace
covalente, con el fin de preparar un complejo de fármaco, anticuerpo
y aminodextrano.
En la solicitud de patente japonesa publicada nº
JP-A 3-158758 (1991), se oxida
dextrano con peryodato sódico; el grupo aldehído resultante se deja
reaccionar con el grupo amino de la fosfatasa alcalina y anticuerpo,
seguido de la reducción con borohidruro sódico, con el fin de
preparar un complejo de enzima, anticuerpo y dextrano.
En la solicitud de patente japonesa publicada nº
6-509167 (1994), se hace reaccionar divinilsulfona
con un polímero, tal como dextrano para introducir el grupo vinilo
en el mismo, seguido de la reacción con un enzima y un anticuerpo,
preparando de esta manera un complejo de enzima, anticuerpo y
dextrano.
Todos los complejos preparados mediante dichos
métodos eran complejos formados mediante la conjugación directa de
dos sustancias a un polímero. Todos los complejos preparados
mediante dichos métodos se afirma que presentan un mejor
rendimiento en comparación con la conjugación directa de las dos
sustancias sin utilizar ningún portador. Sin embargo, dichos
métodos presentan la desventaja siguiente. Más específicamente,
debido a que la cantidad de sustancias capaces de conjugarse con un
portador en el caso de que dos sustancias deban conjugarse con el
portador, es finita, cuanto mayor sea la cantidad de una sustancia
que se conjuga, menor será la cantidad de la otra sustancia que se
conjuga. En el caso de que se supere la desventaja, resulta posible
obtener un complejo de mejor rendimiento.
El documento EP nº A-0 992 794,
un documento según el art. 54(3) EPC, da a conocer un
complejo de enzima-anticuerpo en el que el enzima se
conjuga con el anticuerpo mediante un portador.
En el documento EP nº A-0 123
300, se une una fosfatasa alcalina a un sustrato sólido, por ejemplo
dextrano, preferentemente mediante un ligando, por ejemplo
p-ABPA. Posteriormente, se biotinila la fosfatasa
alcalina y se eluye o se separa del sustrato.
De esta manera, es un propósito de la invención
proporcionar un nuevo complejo de alta calidad de enzima, proteína y
portador con el que puede superarse la desventaja anteriormente
mencionada.
La fig. 1 muestra gráficos que ilustran los
resultados del Ejemplo 9.
Los inventores han realizado investigaciones
sobre un método para producir un complejo de enzima, proteína y
portador para obtener un complejo de alta calidad de enzima,
proteína y portador. Los inventores han encontrado que el propósito
puede conseguirse mediante la conjugación de un enzima con un
portador, y conjugando demás una proteína con el enzima. Tras
investigaciones adicionales, finalmente se ha conseguido la
invención.
En otras palabras, la invención se refiere a un
complejo de enzima, proteína y portador según la reivindicación 1,
preparado mediante la conjugación covalente de dos o más moléculas
de un enzima con un portador, y la conjugación de una proteína que
presenta una potencia de unión específica para la otra sustancia o
sustancias, sola o con por lo menos una molécula del enzima.
Además, la invención se refiere a un complejo de enzima, proteína y
portador preparado mediante la conjugación directa, y además a dicha
proteína que presenta una potencia de unión específica para otra
sustancia o sustancias en el portador del complejo anteriormente
preparado de enzima, proteína y portador, anteriormente mencionada.
Por lo tanto, en el complejo de enzima, proteína y portador de la
presente invención, cada uno de entre un enzima y dicho enzima
conjugado con una proteína que presenta una potencia de unión
específica para otra sustancia o sustancias, se conjuga
covalentemente numerosamente a un portador; o un enzima, estando el
mismo enzima conjugado covalentemente con una proteína que presenta
una potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias, y
también dicha proteína que presenta una potencia de unión
específica para otra sustancia, se conjugan numerosamente con un
portador. A continuación se describe en detalle la invención.
La invención se ha llevado a cabo durante el
examen de los complejos de enzima-proteína
utilizables en el campo de la inmunohistoquímica y del inmunoensayo
enzimático. Sin embargo, la aplicación de la invención a otros
campos no se encuentra limitada en modo alguno.
El portador al que se hace referencia según la
invención se refiere a proteínas y polisacáridos, aunque sin
limitación específica. Sin embargo, resulta preferible que se
conjugue un gran número de moléculas de un enzima con el portador,
de manera que se incremente la sensibilidad del inmunoensayo. Por lo
tanto, resulta esencial: (1) que el peso molecular sea grande en
cierta medida, y (2) la presencia de un grupo funcional reactivo
para la conjugación con un enzima, o la posibilidad o potencia de
la introducción de dicho grupo funcional reactivo. Entre los
ejemplos del portador para conseguir dicho propósito se incluyen los
polímeros peptídicos y/o los polisacáridos, apropiadamente con
pesos moleculares medios de entre 5.000 y 500.000 Da, más
preferentemente de entre 10.000 y 300.000 Da, determinados mediante
cromatografía de filtración en gel. En la presente memoria dichos
intervalos de peso molecular meramente son simples objetivos; pueden
utilizarse pesos moleculares mayores que el intervalo anteriormente
indicado sin que se produzca precipitación ni sedimentación en un
líquido, y también pueden utilizarse presos moleculares menores que
el intervalo anteriormente indicado, con la condición de que pueda
conseguirse el propósito de la
invención.
invención.
Según la invención, por ejemplo, se utiliza
apropiadamente como el portador un péptido que contiene dos o más
grupos amino que presentan potencia de unión. Uno de los ejemplos
incluye un péptido con grupo amino, tal como un péptido que
comprende por lo menos un tipo de aminoácido seleccionado de entre
el grupo que consiste de lisina, arginina, ornitina, glutamina y
otros aminoácidos básicos, presentando estos aminoácidos por lo
menos un tipo de grupo amino seleccionado de entre el grupo que
consiste de grupo \alpha-amino, grupo
\varepsilon-amino y otros grupos amino. Además,
entre los ejemplos específicos de los mismos se incluye polilisina,
que es un polímero de lisina con un grupo
\varepsilon-amino e incluye diversos péptidos que
comprenden lisina y uno o más aminoácidos adicionales. Entre los
ejemplos de este último polímero peptídico se incluyen copolímero
aleatorio de lisina y glicina, copolímero aleatorio de lisina y
serina y copolímero aleatorio de lisina y ácido glutámico, que se
encuentran comercialmente disponibles como copolímeros aleatorios
con diversos pesos moleculares.
Alternativamente, también pueden utilizarse
polisacáridos con grupos aldehído, grupos amino u otros grupos
activo introducidos en los mismos como el portador de la invención.
Son ejemplos de los polisacáridos, dextrano, agarosa, dextrina y
almidón soluble. Pueden prepararse fácilmente polisacáridos con
grupos aldehído dejando que los polisacáridos reaccionen con
peryodato sódico. Pueden introducirse grupos amino en los
polisacáridos mediante métodos conocidos. Por ejemplo, puede
prepararse dextrano con grupos amino mediante tratamiento de
dextrano con peryodato sódico, generando grupos aldehído, que se
deja reaccionar con diamina y después se reduce con borohidruro
sódico. La introducción de grupos activos en polisacáridos puede
llevarse a cabo mediante métodos conocidos. Por ejemplo, puede
obtenerse dextrano con grupos vinilo dejando que divinilsulfona
reaccione con dextrano.
Cualquiera de entre los enzimas que presentan
dos o más grupos amino puede utilizarse como el enzima que debe
utilizarse según la invención, y apropiadamente se utilizan enzimas
para el uso general en el inmunoensayo. Aunque sin limitación, son
ejemplos de los mismos, la peroxidasa de rábano picante, la
fosfatasa alcalina, la \beta-galactosidasa y la
glucosa oxidasa.
La proteína con una potencia de unión específica
a una o más sustancias adicionales según la invención incluye: (1)
una proteína, (2) uno o más fragmentos de una proteína, y (3) una
mezcla de una proteína y el fragmento o fragmentos de la proteína,
y más prácticamente incluye un anticuerpo capaz de unirse a un
antígeno específico y un receptor capaz de unirse a un ligando
específico, tal como un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo
policlonal; avidina y estreptavidina, que se unen específicamente a
la biotina; proteína A y proteína G, que se unen específicamente a
anticuerpos; lectina, que se une específicamente a una cadena
sacárida; y proteína de unión a ácido hialurónico, que se une
específicamente a ácido hialurónico. Además, la proteína en la
invención incluye fragmentos de proteína capaces de unirse
específicamente a una o más sustancias específicas. Por ejemplo, los
fragmentos de proteína son los fragmentos de anticuerpo
F(ab')_{2}, Fab' y Fabc'.
La proteína con una potencia de unión específica
a otra sustancia o sustancias en la presente invención incluye unas
con una potencia de unión específica a otra sustancia individual, y
unas con una potencia de unión específica a otra pluralidad de
sustancias.
Según la invención, en primer lugar se prepara
un complejo de un portador y un enzima. Por ejemplo, un método para
lo anterior comprende modificar grupos amino de un portador para
formar grupos tiol y mezclar el portador resultante con un enzima
con uno o más grupos maleimida modificados a partir de uno o más
grupos amino. Debido a que el grupo tiol y el grupo maleimida
reaccionan rápidamente entre sí y forman un enlace covalente, puede
prepararse el portador conjugado con el enzima.
Para introducir un grupo tiol en el grupo amino
del portador, son conocidos métodos que utilizan anhídrido
S-acetilmercaptosuccínico,
N-succinimidilo,
3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y
N-hidroxisuccinimida de ácido
S-acetiltioglicólico (SATA). Estos reactivos
reaccionan con un grupo amino, de manera que se introduce un grupo
tiol bloqueado. A continuación, el grupo protector que bloquea el
grupo tiol se elimina mediante tratamiento con hidroxilamina en el
caso de que se utilice anhídrido
S-aceitlmercaptosuccínico o SATA, o con
ditiotreitol (DTT) en el caso de que se utilice SPDP, para generar
un grupo tiol.
Para introducir un grupo maleimida en el grupo
amino del enzima, se utiliza un compuesto con un grupo maleimida y
un grupo éster de succinimida dentro de una sola molécula. Por
ejemplo, se utiliza satisfactoriamente un reactivo entrecruzante
divalente con un grupo maleimida en un extremo y un grupo
N-hidroxisuccinimida en el otro extremo. Son
ejemplos de los mismos,
N-(6-maleimidocaproiloxi)succinimida (EMCS) y
N-(4-maleimidobutiriloxi)succinimida
(GMBS).
Aparte de EMCS y GMBS, indicados anteriormente,
entre los compuestos que presentan un grupo maleimida y un grupo
succinimida dentro de una sola molécula se incluyen aquellos
indicados a continuación, aunque sin limitación:
N-succinimidil-N-maleimidoacetato,
N-succinimidil-4-(N-maleimido)butirato,
N-succinimidil-6-(N-maleimido)hexanoato,
N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato,
N-succinimidil-m-(N-maleimido)benzoato,
N-succinimidil-p-(N-maleimidofenil)-4-butirato,
N-sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato,
N-succinimidil-m-(N-maleimido)benzoato,
N-sulfosuccinimidil-p-(N-maleimidofenil)-4-butirato
y similares.
Debido a que el portador no resulta necesario
para conjugarse adicionalmente con otra sustancia o sustancias en
la invención, resulta preferible preparar un complejo de enzima y
portador en el que el máximo número posible de moléculas del enzima
se conjugue con el mismo. A continuación se describe un ejemplo del
medio para conseguir este propósito. Se añade un gran exceso de un
reactivo de maleimidación y se deja que reaccione con el complejo
de enzima y portador con el fin de introducir grupos maleimida en
prácticamente la totalidad de los grupos amino restantes en el
complejo. El mismo enzima que el utilizado para la producción del
complejo se tiola bajo condiciones que permitan que quede uno o más
grupos amino en el enzima. Esto permite conjugar posteriormente una
proteína con una potencia de unión específica con una o más
sustancias adicionales mediante la utilización del grupo o grupos
amino que quedan en el enzima. El enzima que se ha tiolado de esta
manera y el complejo de enzima y portador en el que se han
introducido grupos maleimida reaccionan entre sí.
A continuación, los grupos maleimida restantes
se bloquean con una sustancia que presenta grupos tiol. Son
ejemplos de la sustancia con grupos tiol para la utilización en el
bloqueo: mercaptoetanol, hidrocloruro de cisteamina y cisteína. Al
utilizar mercaptoetanol para el bloqueo, uno o más grupos amino se
encuentran presentes únicamente en el enzima tiolado del complejo
de enzima y portador. En el caso de que se utilice para el bloqueo
hidrocloruro de cisteamina o cisteína, se encuentran presentes
grupos amino en el enzima tiolado del complejo de enzima y portador
y en el reactivo utilizado para bloquear el grupo o grupos maleimida
restantes.
Para conjugar la proteína que presenta una
potencia de unión específica para otra sustancia, tal como se ha
explicado anteriormente, con el complejo de enzima y portador, se
utiliza satisfactoriamente la reacción de grupo tiol y grupo
maleimida de la misma manera que durante la preparación del complejo
de enzima y portador. Por ejemplo, el reactivo anteriormente
indicado para introducir grupos maleimida se deja que reaccione con
los grupos amino presentes en el complejo de enzima y portador. Por
otra parte, el reactivo anteriormente indicado para introducir
grupos tiol se deja reaccionar con la proteína que presenta una
potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias. Al
mezclar ambas entre sí, puede prepararse un complejo de enzima,
proteína con una potencia de unión específica para otra sustancia o
sustancias, y portador. En el caso de que se encuentre presente en
la proteína un enlace S-S no implicado en ningún
caso en la unión con la otra sustancia o sustancias, el enlace
S-S se reduce con hidrocloruro de cisteamina o DTT,
en lugar de la tiolación, de manera que pueden generarse grupos
tiol.
En el caso de que la proteína con una potencia
de unión específica para otra sustancia o sustancias presente una
cadena sacárida, ésta puede utilizarse satisfactoriamente. Por
ejemplo, resulta posible que el grupo o grupos aldehído generados
mediante oxidación de la cadena sacárida de la proteína con una
potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias con
peryodato sódico se dejó reaccionar con el grupo o grupos amino en
el complejo de enzima y portador, seguido de la reducción para
conjugar ambos entre sí.
El complejo completamente preparado es un
complejo en el que la proteína con una potencia de unión específica
a otra sustancia o sustancias se encuentra conjugada con el enzima
solo, tras bloquear finalmente con mercaptoetanol el grupo o grupos
maleimido restantes en el portador durante la preparación del
complejo de enzima y portador. El otro ejemplo de complejo
completamente preparado es un complejo en el que la proteína con una
potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias se
conjuga tanto con el enzima como con el portador tras bloquear
finalmente con hidrocloruro de cisteamina o con cisteína el grupo o
grupos maleimida restantes en el portador, durante la preparación
del complejo de enzima y portador.
A modo de realización de la invención se
describe a continuación el método para producir el complejo de
enzima, proteína y portador utilizando
poli-L-lisina como el portador,
peroxidasa como el enzima y un fragmento de anticuerpo
F(ab')_{2} como la proteína con una potencia de unión
específica para otra sustancia.
Se añade anhídrido
S-acetilmercaptosuccínico y se deja reaccionar con
una solución que contiene
poli-L-lisina; después, se deja
reaccionar hidroxilamina con la mezcla de reacción resultante, para
introducir grupos tiol en el portador (preparación de
portador-SH). En la presente memoria, el portador no
se tiola por completo en ningún caso, sino que se dejan libres
algunos de los grupos amino del portador.
Se deja que EMCS reaccione con peroxidasa de
rábano picante (POD) con el fin de preparar peroxidasa conjugada
con grupo maleimida (M-POD).
Mediante la mezcla de portador conjugado con
grupo tiol y M-POD y dejando que reaccionen entre
sí, se prepara un complejo
(portador-S-M-POD).
Tras la reacción, los grupos maleimida restantes se bloquean con
mercaptoetanol. Mediante la reacción puede obtenerse un portador
(complejo) con una pluralidad de grupos
S-M-POD y SH introducidos en el
mismo y que presenta grupos amino libres.
Se añade un gran exceso de una solución de EMCS
y se deja reaccionar con el complejo obtenido en 3, para introducir
grupos maleimida en la totalidad de los grupos amino del complejo.
Mediante la reacción puede obtenerse un portador (complejo), en el
que se ha introducido una pluralidad de
S-M-POD, grupos maleimida y grupos
COOH generados mediante hidrólisis del éster de
N-hidroxisuccinimida de EMCS tras la unión de EMCS a
los grupos SH.
Se introduce uno o más grupos tiol en POD
dejando que reaccione N-hidroxisuccinimida éster de
ácido S-acetiltioglicólico con POD y dejando
después que reaccione hidroxilamina con la mezcla de reacción
resultante. En este caso, las reacciones se llevan a cabo bajo
condiciones que permitan la existencia de uno o más grupos amino
libres en POD (SH-POD-NH_{2}).
Mediante la reacción de
SH-POD-NH_{2} con el complejo
obtenido en 4, se introduce peroxidasa tiolada en grupos maleimida
conjugados con el portador. A continuación, los grupos maleimida
restantes se tratan con mercaptoetanol, para convertir los grupos
maleimida restantes en grupos OH. Mediante la reacción, puede
obtenerse un portador (complejo enzimático) en el que se ha
introducido una pluralidad de
S-M-POD, una pluralidad de
M-S-POD-NH_{2},
grupos COOH y grupos OH.
Mediante la reacción de una solución de EMCS con
el complejo enzimático obtenido en 6, se maleimidan el grupo o
grupos amino de POD en el complejo. Se prepara un complejo con una
pluralidad de S-M-POD, una
pluralidad de
M-S-POD-M, grupos
COOH y grupos OH.
Se trata IgG de cabra antiratón con pepsina para
obtener su fragmento F(ab')_{2} y se deja reaccionar
hidrocloruro de cisteamina con el fragmento F(ab')_{2}
para obtener un fragmento de anticuerpo reducido
(SH-Fab').
Mediante la mezcla del fragmento de anticuerpo
reducido y el complejo obtenido en 7, se conjuga el fragmento de
anticuerpo con el grupo o grupos maleimida de POD. Mediante la
reacción, puede obtenerse un portador (complejo de
enzima-anticuerpo) conjugado con una pluralidad de
S-M-POD, una pluralidad de
M-S-POD-M-S-Fab',
una pluralidad de
M-S-POD-M, grupos
COOH y grupos OH. En caso necesario, el portador resultante puede,
además, tratarse con mercaptoetanol para convertir el grupo o
grupos maleimida no modificados de
M-S-POD-M en uno o
más grupos OH, bloqueando de esta manera el grupo o grupos
maleimida.
El complejo de enzima, proteína y portador de la
invención es un primer éxito de la realización de la estructura
anteriormente mencionada, y debido a la cantidad extremadamente
grande de enzima en el portador, puede llevarse a cabo una reacción
fuerte de color al someter el enzima a una reacción de color.
Además, debido a que la proteína con una potencia de unión
específica para otra sustancia o sustancias puede conjugarse con un
enzima, aunque muchas moléculas del enzima ocupan la superficie del
portador, en consecuencia, muchas moléculas de proteína con una
potencia de unión específica para otra sustancia o sustancias pueden
conjugarse con el complejo y, de esta manera, se escala
extremadamente la capacidad de unión de la misma a la otra
sustancia.
Debido a que muchas moléculas de la proteína con
una potencia de unión específica a otra sustancia o sustancias se
encuentran presentes en el complejo de enzima, proteína y portador
de la invención, puede capturarse incluso una cantidad traza de
sustancia de ensayo y unirse al complejo de enzima, proteína y
portador. Al conjugar la sustancia de ensayo a cualquier molécula o
uno o más fragmentos moleculares de la proteína, puede llevarse a
cabo una reacción de color muy fuerte debido a que muchas moléculas
del enzima se encuentran conjugadas con el complejo de enzima,
proteína y portador. Según la invención, en otras palabras, puede
detectarse incluso una cantidad traza de una sustancia y someterse
a ensayo a una sensibilidad muy elevada. De esta manera, la
invención proporciona un ensayo exacto. Por consiguiente, puede
formarse un excelente kit de ensayo mediante la utilización del
complejo.
Además, para la creación del complejo de enzima,
proteína y portador según la invención, la polilisina no se trata
en primer lugar con EMCS (la incidencia de precipitación provoca que
la polilisina quede inutilizable), sino que se trata en primer
lugar con anhídrido S-acetilmercaptosuccínico para
modificar una parte de los grupos amino del portador, formando
grupos tiol a los que se conjuga un enzima maleimidado, seguido del
tratamiento con un gran exceso de EMCS para la maleimidación y
carboxilación, y la reacción posterior con un enzima conjugado con
grupos tiol, de manera que se consigue que muchas moléculas del
enzima puedan conjugarse con el portador, finalmente incluso en el
caso de que el número de moléculas de enzima conjugadas inicialmente
sea pequeño, sin que se produzca precipitación ni sedimentación.
Puede producirse un efecto marcado, de manera que pueden conjugarse
muchas moléculas del enzima con el portador en estado de
solución.
Por consiguiente, la invención proporciona un
efecto excelente de manera que una sustancia puede someterse a
ensayo con exactitud en una cantidad traza de una muestra, o en una
muestra extremadamente diluida.
Con el fin de describir la invención en mayor
detalle, se proporcionan ejemplos. Sin embargo, la invención no se
encuentra limitada a dichos ejemplos.
Se preparó peroxidasa conjugada con un grupo
maleimida de la manera siguiente: se añadieron 20 mg de EMCS
diluidos en 0,6 ml de dimetilformamida (DMF), a 100 mg de peroxidasa
de rábano picante disueltos en 2,4 ml de tampón fosfato sódico 0,1
M, pH 7,5, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante
30 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a
filtración en gel en una columna Sephadex G25 (fabricada por
Pharmacia Co.) y el filtrado obtenido se sometió a ensayo de la
absorbancia a 403 nm, se recogió una fracción del filtrado que
contenía el pico de absorbancia, y se concentró mediante
ultrafiltración.
A continuación, se preparó la polilisina
conjugada con el grupo tiol de la manera siguiente. Se añadieron 6
mg de anhídrido S-acetilmercaptosuccínico disueltos
en 20 \mul de DMF a 5 mg de hidrobromuro de
poli-L-lisina (fabricado por Sigma
Co.; peso molecular medio: 37.600 Da) disueltos en 1 ml de tampón
fosfato sódico 0,1 M, pH 6,5 y se hicieron reaccionar a 30ºC
durante 20 minutos. A continuación, se añadieron 100 \mul de
tampón Tris-HCl 0,1 M, pH 7, 10 \mul de EDTA 0,1
M, pH 7 y 100 \mul de hidroxilamina 1 M, pH 7, a la mezcla de
reacción resultante, y se hicieron reaccionar a 30ºC durante 5
minutos. Seguidamente, la solución de reacción se sometió a
filtración en gel en una columna Sephadex G25, se recogió una
fracción del filtrado que contenía el pico de absorbancia a 230 nm,
y se concentró mediante ultrafiltración. En este caso no se modificó
la totalidad de los grupos amino para formar grupos tiol.
La peroxidasa conjugada con grupo maleimida y la
poli-L-lisina conjugada con grupo
tiol se mezclaron entre sí y se hicieron reaccionar a 4ºC durante
18 horas. Se añadió un volumen de 1/10 veces de mercaptoetanol 0,1
M a la mezcla de reacción resultante y se hizo reaccionar a 30ºC
durante 20 minutos; a continuación, la mezcla de reacción se
sometió a filtración en gel en una columna de Ultrogel AcA44
(fabricada por Biosepla, Co.) y se midió la absorbancia de cada
fracción a 403 nm. Se encontraba un complejo de peroxidasa de rábano
picante y poli-L-lisina en una
fracción del filtrado de elevado peso molecular. Se concentró la
fracción mediante ultrafiltración hasta 3 ml tras cambiar el tampón
por tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5. La cantidad de peroxidasa
de rábano picante en el complejo era de 20 mg. Lo resultante se
denominó complejo 1 de enzima y portador.
Se añadieron 50 mg de EMCS disueltos en 0,75 ml
de DMF al complejo y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente
durante 30 minutos. El producto resultante se sometió a filtración
en gel en una columna Sephadex G25, se recogió una fracción del
filtrado que contenía el pico de absorbancia a 403 nm, y se
concentró mediante ultrafiltración. Lo resultante se denominó
complejo 1 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador. En
este caso, todos los grupos amino se habían modificado en grupos
maleimida, mientras que los grupos tiol se habían convertido en
grupos carboxilo.
A continuación, se preparó peroxidasa de rábano
picante conjugada con grupo tiol de la manera siguiente.
Se añadieron 2,5 mg de
N-hidroxisuccinimida éster de ácido
S-acetilmercaptotioglicólico (SATA) en 0,5 ml de
DMF a 100 mg de peroxidasa de rábano picante disueltos en 2,5 ml de
tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5, y se hicieron reaccionar a
temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, se
añadieron 100 \mul de EDTA 0,1 M, pH 7, y 0,5 ml de hidroxilamina
1 M, pH 7, a la mezcla de reacción y se hicieron reaccionar a
temperatura ambiente durante 5 minutos. La mezcla de reacción se
sometió a filtración en gel en una columna Sephadex G25, se
recogieron las fracciones con absorbancia a 403 nm y se
concentraron. Se sometió a ensayo el número de grupos tiol de la
peroxidasa de rábano picante conjugada con grupo tiol mediante el
método conocido, descrito en Journal of Immunoassay
4(3):209-327. Después, se calculó que el
número de grupos tiol presente en una molécula de peroxidasa de
rábano picante era de 1,3. Se encuentran presentes tres o más grupos
amino en una molécula de peroxidasa de rábano picante. De esta
manera se confirmó que quedaba por lo menos un grupo amino en la
peroxidasa de rábano picante conjugada con grupo tiol preparada de
esta manera bajo las condiciones anteriormente indicadas.
El complejo 1 conjugado con grupo maleimida de
enzima y portador y la peroxidasa de rábano picante conjugada con
grupo tiol se mezclaron entre sí y se hicieron reaccionar a 4ºC
durante 18 horas. Al producto resultante se añadió un volumen de
1/10 veces de mercaptoetanol 0,1 M, llevando a cabo la reacción a
30ºC durante 20 minutos; a continuación, la mezcla de reacción
resultante se sometió a filtración en gel en una columna de
Ultrogel AcA44, seguido de la medición de la absorbancia a 403 nm.
El complejo eluyó en una fracción de elevado peso molecular del
filtrado. Se denominó complejo 2 de enzima y portador.
Separadamente se mezclaron el complejo 1
conjugado con grupo maleimida de enzima y portador, y la peroxidasa
de rábano picante conjugada con grupo tiol, y se hicieron reaccionar
a 4ºC durante 18 horas; a continuación, se añadió un volumen de
1/10 veces de hidrocloruro de cisteamina 0,1 M a la mezcla de
reacción resultante, seguido de purificación de la manera indicada
anteriormente. El complejo resultante se denominó complejo 3 de
enzima y portador. Las cantidades de peroxidasa de rábano picante
conjugada en el complejo 2 de enzima y portador, y en el complejo 3
de enzima y portador eran de 40 mg en ambos casos.
Se preparó el fragmento F(ab')_{2} de
IgG de cabra antiratón mediante un método conocido. Se disolvieron
55 \mul de hidrocloruro de cisteamina 0,1 M en tampón fosfato
sódico 0,1 M, pH 6, que contenía EDTA 5 mM de F(ab')_{2}
de IgG de cabra antiratón disuelto en 0,5 ml de tampón fosfato
sódico 0,1 M, pH 6, y se llevó a cabo la reacción a 37ºC durante
1,5 horas. La mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en
una columna Sephadex G25; se recogió una fracción del filtrado que
contenía el pico de absorbancia a 280 nm y se concentró mediante
ultrafiltración.
Se preparó complejo 2 conjugado con grupo
maleimida de enzima y portador de la manera siguiente. Se añadieron
10 mg de EMCS disueltos en 375 \mul de DMF a 5 mg del complejo 2
de enzima y portador disueltos en 1,5 ml de tampón fosfato sódico
0,1 M, pH 7,5, y se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente
durante 30 minutos. La mezcla de reacción se sometió a filtración
en gel en una columna Sephadex G25, y se recogió una fracción del
filtrado que contenía el pico de absorbancia a 403 nm y se concentró
mediante ultrafiltración.
Se mezcló el complejo 2 conjugado con grupo
maleimida de enzima y portador y el Fab' de IgG de cabra antiratón
y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 18 horas. Tras la reacción,
se añadió mercaptoetanol 0,1 M a un volumen de 1/10 veces el
volumen de la solución de reacción, y se llevó a cabo la reacción a
30ºC durante 20 minutos; a continuación, se sometió la mezcla de
reacción resultante a filtración en gel en una columna de Ultrogel
AcA44. Se midió la absorbancia a 280 nm y a 403 nm. Una fracción de
elevado peso molecular del filtrado que contenía ambos picos era el
complejo de enzima, Fab' y portador.
Se preparó el complejo 3 conjugado con grupo
maleimida de enzima y portador de la manera siguiente. Se añadieron
10 mg de EMCS disueltos en 375 \mul de DMF a 5 mg del complejo 3
de enzima y portador disueltos en 1,5 ml
de tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex G25, y se recogió una fracción del filtrado que contenía el pico de absorbancia a 403 nm y se concentró mediante ultrafiltración.
de tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, la mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex G25, y se recogió una fracción del filtrado que contenía el pico de absorbancia a 403 nm y se concentró mediante ultrafiltración.
El Fab' de IgG de cabra antiratón preparado
mediante el método indicado anteriormente se mezcló con el complejo
3 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador, y se hizo
reaccionar a 4ºC durante 18 horas. Tras la reacción, se añadió
mercaptoetanol 0,1 M a un volumen de 1/10 veces el volumen de la
solución de reacción, y se hizo reaccionar a 30ºC durante 20
minutos; a continuación, la mezcla de reacción se sometió a
filtración en gel en una columna Ultrogel AcA44. Se midió la
absorbancia a 280 nm y a 403 nm y se identificó una fracción de
elevado peso molecular del filtrado que contenía ambos picos como un
complejo de enzima, Fab' y portador.
Mediante un método conocido, se digirió
anticuerpo anti-fragmento F(ab')_{2} del
producto génico de p53 de conejo. Se preparó el fragmento Fab'
anti-producto génico de p53 de conejo mediante el
método siguiente. Se añadieron
55 \mul de hidrocloruro de cisteamina 0,1 M disueltos en tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 6, que contenían EDTA 5 mM, a 5 mg de F(ab')_{2} anti-producto génico de p53 de conejo disueltos en 0,5 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 6, y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1,5 horas. La reacción se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex G25, recogiendo una fracción del filtrado que contenía el pico de absorbancia a 280 nm, y después se concentró la fracción mediante ultrafiltración. El fragmento Fab' anti-producto génico de p53 de conejo preparado de esta manera y el complejo 3 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador obtenido mediante el mismo método que en el Ejemplo 3 se mezclaron y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 18 horas. Tras la reacción, se añadió mercaptoetanol 0,1 M a un volumen de 1/10 veces el volumen de la solución de reacción resultante, seguido de la reacción a 30ºC durante 20 minutos; a continuación, la mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna de Ultrogel AcA44. Se midió la absorbancia a 280 nm y a 403 nm, y se identificó una fracción de elevado peso molecular del filtrado que contenía ambos picos como un complejo de enzima, Fab' y portador.
55 \mul de hidrocloruro de cisteamina 0,1 M disueltos en tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 6, que contenían EDTA 5 mM, a 5 mg de F(ab')_{2} anti-producto génico de p53 de conejo disueltos en 0,5 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 6, y se hicieron reaccionar a 37ºC durante 1,5 horas. La reacción se sometió a filtración en gel en una columna Sephadex G25, recogiendo una fracción del filtrado que contenía el pico de absorbancia a 280 nm, y después se concentró la fracción mediante ultrafiltración. El fragmento Fab' anti-producto génico de p53 de conejo preparado de esta manera y el complejo 3 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador obtenido mediante el mismo método que en el Ejemplo 3 se mezclaron y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 18 horas. Tras la reacción, se añadió mercaptoetanol 0,1 M a un volumen de 1/10 veces el volumen de la solución de reacción resultante, seguido de la reacción a 30ºC durante 20 minutos; a continuación, la mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna de Ultrogel AcA44. Se midió la absorbancia a 280 nm y a 403 nm, y se identificó una fracción de elevado peso molecular del filtrado que contenía ambos picos como un complejo de enzima, Fab' y portador.
El anticuerpo monoclonal
anti-CD34 conjugado con grupo tiol (fabricado por
Nichirei Corp.) se preparó de la manera siguiente. Se añadieron 0,1
mg de SATA disueltos en 50 \mul de DMF a 5 mg de anticuerpo
monoclonal anti-CD34 disueltos en 1 ml de PBS, y se
hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A
continuación, se añadieron 10 \mul de EDTA 0,1 M, pH 7, y 100
\mul de hidroxilamina 1 M, pH 7, a la mezcla de reacción
resultante, y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante
5 minutos. El producto resultante se purificó mediante filtración
en gel en una columna Sephadex G25. Se mezcló el anticuerpo
monoclonal anti-CD34 conjugado con grupo tiol
preparado de esta manera y el complejo 3 conjugado con grupo
maleimida de enzima y portador obtenido mediante el mismo método
que en el Ejemplo 3, y se llevó a cabo la reacción a 4ºC durante 18
horas. Tras la reacción, se añadió mercaptoetanol 0,1 M a un volumen
de 1/10 veces el volumen de la solución de reacción resultante,
seguido de la reacción a 30ºC durante 20 minutos; posteriormente, la
mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna de
Ultrogel AcA44. Se midió la absorbancia a 280 nm y a 403 nm, y se
identificó una fracción del filtrado de elevado peso molecular que
contenía ambos picos como un complejo de enzima, anticuerpo
monoclonal y portador.
Se preparó estreptavidina conjugada con grupo
tiol de la manera siguiente. Se añadieron 0,25 mg de SATA disueltos
en 250 \mul de DMF a 25 mg de estreptavidina disueltos en 2,5 ml
de tampón fosfato sódico 0,1 M, pH 7,5, llevando a cabo la reacción
a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, se
añadieron 50 \mul de EDTA
0,1 M, pH 7, y 200 \mul de hidroxilamina 1 M, pH 7, a la mezcla de reacción resultante, llevando a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 5 minutos. El producto resultante se purificó mediante filtración en gel en una columna Sephadex G25. La estreptavidina conjugada con grupo tiol preparada de esta manera y el complejo 3 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador obtenido mediante el mismo método que en el Ejemplo 3 se mezclaron entre sí y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 18 horas. Tras la reacción, se añadió mercaptoetanol 0,1 M a un volumen de 1/10 veces el volumen de la solución de reacción resultante, seguido de la reacción a 30ºC durante 20 minutos; a continuación, la mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna de Ultrogel AcA44. Se midió la absorbancia a 280 nm y a 403 nm, y se identificó una fracción de elevado peso molecular del filtrado que contenía ambos picos como un complejo de enzima, estreptavidina y portador.
0,1 M, pH 7, y 200 \mul de hidroxilamina 1 M, pH 7, a la mezcla de reacción resultante, llevando a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 5 minutos. El producto resultante se purificó mediante filtración en gel en una columna Sephadex G25. La estreptavidina conjugada con grupo tiol preparada de esta manera y el complejo 3 conjugado con grupo maleimida de enzima y portador obtenido mediante el mismo método que en el Ejemplo 3 se mezclaron entre sí y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 18 horas. Tras la reacción, se añadió mercaptoetanol 0,1 M a un volumen de 1/10 veces el volumen de la solución de reacción resultante, seguido de la reacción a 30ºC durante 20 minutos; a continuación, la mezcla de reacción se sometió a filtración en gel en una columna de Ultrogel AcA44. Se midió la absorbancia a 280 nm y a 403 nm, y se identificó una fracción de elevado peso molecular del filtrado que contenía ambos picos como un complejo de enzima, estreptavidina y portador.
Mediante la utilización de anticuerpo monoclonal
anti-LCA (fabricado por Nichirei Corp.) como
anticuerpo primario, se tiñó una sección de tejido intestinal. En
primer lugar, se realizó una sección delgada de tejido incluido en
parafina, que se depositó en un portaobjetos de vidrio. A
continuación, se llevó a cabo el tratamiento para eliminar la
parafina y el tratamiento para eliminar la peroxidasa, y se dejó que
el espécimen preparado de esta manera reaccionase con el anticuerpo
primario a temperatura ambiente durante una hora, seguido de un
enjuague exhaustivo en PBS, preparando de esta manera el espécimen
con unión del anticuerpo primario. Se añadió gota a gota un
anticuerpo secundario a dicho espécimen. Como anticuerpo secundario
se utilizó el complejo de enzima, Fab' y portador preparado en el
Ejemplo 3, a una concentración de 6 \mug/ml (concentración de
Fab'). Separadamente, como anticuerpo secundario, se utilizó el
fragmento Fab' directamente marcado con peroxidasa mediante un
método convencional, a la misma concentración. El método de marcaje
mediante el método convencional se realizó según la referencia
Journal of Immunoassay 4(3):209-327, en la
que los materiales y reactivos eran todos idénticos a los del
Ejemplo 3. Se dejó que el anticuerpo primario del espécimen unido a
anticuerpo primario reaccionase con el anticuerpo secundario a
temperatura ambiente durante 30 minutos en cada uno de los dos casos
indicados anteriormente.
En el método SAB, se utilizó un anticuerpo
policlonal antiratón marcado con biotina (fabricado por Nichirei
Corp.) como el anticuerpo secundario. En este caso, se hizo
reaccionar el anticuerpo primario del espécimen unido a anticuerpo
primario con el anticuerpo secundario durante 10 minutos, seguido de
enjuague, y después se añadió gota a gota estreptavidina marcada
con peroxidasa (fabricada por Nichirei Corp.), llevando a cabo la
reacción durante 5 minutos.
A continuación, se llevó a cabo un enjuague
exhaustivo en cada uno de los tres casos anteriormente indicados;
los especimenes resultantes recibieron la adición gota a gota de una
solución de sustrato (diaminobencidina, peróxido de hidrógeno) para
la reacción, y después se enjuagaron en agua destilada, se sellaron
y se observaron al microscopio.
Se muestran los resultados en la Tabla 1, a
continuación. El complejo de enzima, anticuerpo secundario y
portador preparado en el Ejemplo 3 era especialmente excelente, en
comparación con el anticuerpo marcado con enzima preparado mediante
el método convencional. Además, el complejo de enzima, anticuerpo
secundario y portador preparado en el Ejemplo 3 era excelente en
comparación con el procedimiento de amplificación que comprendía el
método
SAB.
SAB.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como anticuerpo primario para el método SAB se
utilizó anticuerpo policlonal anti-p53 de conejo
(fabricado por Nichirei Corp.) al igual que el material utilizado
en el Ejemplo 4. En primer lugar, se realizó una sección delgada de
tejido de cáncer gástrico incluido en parafina y se depositó sobre
un portaobjetos de vidrio. A continuación, se llevó a cabo el
tratamiento para eliminar la parafina y el tratamiento para
eliminar la peroxidasa, y el espécimen preparado de esta manera se
dejó reaccionar con el anticuerpo primario a temperatura ambiente
durante una hora. Tras el enjuague exhaustivo en PBS, el espécimen
unido al anticuerpo primario se dejó reaccionar con anticuerpo
policlonal anticonejo marcado con biotina (fabricado por Nichirei
Corp.) a temperatura ambiente durante 10 minutos. Tras el enjuague,
se añadió gota a gota a dicho espécimen estreptavidina marcada con
peroxidasa, llevan a cabo la reacción durante 5 minutos.
Separadamente, el complejo de enzima, anticuerpo
primario y portador (complejo de enzima, Fab' y portador) preparado
en el Ejemplo 4 se sometió a reacción con el espécimen preparado de
esta manera, tal como se ha indicado anteriormente, a temperatura
ambiente durante una hora. La concentración del complejo de
enzima-anticuerpo era de 2 \mug/ml (concentración
de Fab').
Tras llevar a cabo un enjuague exhaustivo en
cada uno de los dos casos anteriormente indicados, los especimenes
resultantes recibieron la adición gota a gota de una solución de
sustrato (diaminobencidina, peróxido de hidrógeno) para la reacción
de color, y después se enjuagaron en agua destilada, se sellaron y
se observaron con un microscopio.
Como resultado, la intensidad de tinción
obtenida al utilizar el complejo de enzima, anticuerpo primario y
portador era igual a la intensidad obtenida mediante el método SAB
que comprendía el procedimiento de amplificación.
Se añadieron 100 \mul de IgG de cabra
antiratón a una concentración de 10 \mug/ml a una placa de
microtitulación de 96 pocillos, para la incubación a temperatura
ambiente durante 2 horas. Se enjuagó la placa de microtitulación en
solución salina fisiológica, seguido de la adición de 200 \mul de
albúmina de suero bovino al 1%, para la incubación durante 2 horas.
Se añadieron 100 \mul de IgG de ratón a concentraciones
determinadas (entre 0 y 1.000 pg/ml) para la incubación durante 2
horas y se enjuagaron en solución salina fisiológica. A
continuación, a la placa de microtitulación preparada de esta
manera se añadieron 100 \mul del complejo de enzima, anticuerpo
secundario y portador preparado en el Ejemplo 3 a una concentración
de 0,5 \mug/ml basada en la cantidad de anticuerpo (es decir,
como concentración de anticuerpo), o 100 \mul del anticuerpo
marcado con enzima preparado mediante el método convencional a una
concentración de 2 \mug/ml basada en la cantidad de anticuerpo,
para la incubación durante 30 minutos. La placa de microtitulación
resultante se enjuagó adicionalmente en solución salina
fisiológica, seguido de la adición de 100 \mul de una solución de
sustrato (tetrametilbencidina, peróxido de hidrógeno) para la
reacción durante 15 minutos. Se terminó la reacción mediante la
adición de 50 \mul de ácido sulfúrico 1 N. Se midió el grado de
reacción de color con un lector de microplacas. Tal como se muestra
en la fig. 1, los resultados indican que la reacción de color
obtenida a partir de un volumen menor del complejo de enzima,
anticuerpo secundario y portador preparado en el Ejemplo 3, era más
intensa que la reacción de color del anticuerpo marcado con enzima
preparado mediante el método convencional.
La fig. 1 muestra los resultados anteriormente
indicados. En la figura, el eje de abscisas expresa la concentración
de IgG de ratón, y el eje de ordenadas expresa la absorbancia a 450
nm. Los círculos negros representan el complejo de enzima,
anticuerpo y portador preparado en el Ejemplo 3, mientras que los
círculos blancos representan el anticuerpo marcado con enzima
preparado mediante el método convencional.
El complejo inventivo de enzima, proteína y
portador resulta útil particularmente como anticuerpo marcado con
enzima (a modo de anticuerpo primario o secundario), para la
inmunohistoquímica e inmunoensayo enzimático, y permite llevar a
cabo inmunoensayos de elevada sensibilidad.
Claims (14)
1. Complejo de enzima, proteína y portador, que
comprende:
- (1)
- un portador,
- (2)
- un enzima, encontrándose conjugadas covalentemente dos o más moléculas del enzima con el portador en (1), y
- (3)
- una proteína con una potencia de unión específica para una o más sustancias adicionales, encontrándose conjugada la proteína sola con por lo menos una molécula de entre las dos o más moléculas del enzima en (2).
2. Complejo de enzima, proteína y portador, que
comprende:
- (1)
- un portador,
- (2)
- un enzima, en el que se conjuga covalentemente dos o más moléculas del enzima con el portador en (1),
- (3)
- una proteína con una potencia de unión específica para una o más sustancias adicionales, en la que la proteína se encuentra conjugada con por lo menos una molécula de entre las dos o más moléculas del enzima en (2), y
- (4)
- la misma proteína que en (3), conjugada directamente con el portador en (1).
3. Complejo de enzima, proteína y portador
según la reivindicación 1 ó 2, en el que el portador presenta un
peso molecular medio de entre 5.000 y 500.000 Da, determinado
mediante cromatografía de filtración en gel.
4. Complejo de enzima, proteína y portador
según la reivindicación 3, en el que el portador presenta un peso
molecular medio de entre 10.000 y 300.000 Da, determinado mediante
cromatografía de filtración en gel.
5. Complejo de enzima, proteína y portador
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el
portador presenta dos o más grupos amino.
6. Complejo de enzima, proteína y portador
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el
portador se selecciona de entre el grupo que consiste de: (a) un
polímero peptídico que presenta dos o más grupos amino básicos, y
(b) un polisacárido en el que se han introducido grupos activos,
siendo el tipo de grupos activos por lo menos un tipo seleccionado
de entre el grupo que consiste de grupo amino, grupo aldehído y
grupo vinilo.
7. Complejo de enzima, proteína y portador
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el
portador es polilisina.
8. Complejo de enzima, proteína y portador
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el enzima
se selecciona de entre el grupo que consiste de peroxidasa de rábano
picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa
y glucosa oxidasa.
9. Complejo de enzima, proteína y portador
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la
proteína con una potencia de unión específica para una o más
sustancias adicionales es por lo menos una seleccionada de entre el
grupo que consiste de un anticuerpo y uno o más fragmentos del
mismo.
10. Complejo de enzima, proteína y portador
según la reivindicación 9, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
policlonal o un anticuerpo monoclonal.
11. Complejo de enzima, proteína y portador
según la reivindicación 9, en el que el fragmento o fragmentos se
refieren a por lo menos uno seleccionado de entre el grupo que
consiste de F(ab')_{2}, Fab' y Fabc'.
12. Complejo de enzima, proteína y portador
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la
proteína con una potencia de unión específica para una o más
sustancias adicionales es avidina o estreptavidina.
13. Kit de inmunoensayo que comprende el
complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Kit de inmunoensayo según la reivindicación
13, en el que el inmunoensayo es una inmunohistotinción o un
inmunoensayo enzimático.
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