ES2342397T3

ES2342397T3 - Vector virico para su uso en terapia genica in vivo de la enfermedad de parkinson.

Info

Publication number: ES2342397T3
Application number: ES04791259T
Authority: ES
Inventors: Jens Tornoe; Carl Rosenblad; Lars Wahlberg
Original assignee: NsGene AS
Current assignee: NsGene AS
Priority date: 2003-10-20
Filing date: 2004-10-20
Publication date: 2010-07-06
Anticipated expiration: 2024-10-20
Also published as: DE602004025959D1; WO2005039643A2; WO2005039643A3; JP2007509109A; BRPI0415563A; RU2006117304A; ATE460183T1; MXPA06004329A; KR20060095568A; EP1677833B1; NZ547185A; CA2543189A1; DK1677833T3; AU2004283053A1; EP2210617A1; EP1677833A2

Abstract

Un vector vírico de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión de un polipéptido codificado, dicho polipéptido comprende un péptido señal capaz de funcionar en una célula de mamífero y una neurturina bioactiva seleccionada del grupo que consiste en neurturina madura y una variante de secuencia bioactiva que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia a la neurturina truncada N-terminalmente de SEQ ID NO 9; en donde la secuencia de polinucleótido no codifica un región pro de neurturina.

Description

Vector vírico para su uso en terapia génica in vivo de la enfermedad de Parkinson.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para terapia génica, en particular a terapia génica in vivo para la distribución de neurturina bioactiva para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. En otro aspecto, la invención se refiere a construcciones víricas de expresión que comprenden un péptido señal de mamífero unido a neurturina madura o truncada N-terminalmente sin una región pro funcional entre el péptido señal y la neurturina. Estas construcciones víricas de expresión se requieren para la secreción eficaz de neurturina bioactiva en terapia génica in vivo. La invención también se refiere a células de mamífero capaces de producir neurturina en cantidades aumentadas así como el uso de estas células para la producción recombinante de neurturina bioactiva y para uso terapéutico.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo devastador que afecta a entre 1 y 1,5 millones de americanos. Cada año se diagnostican más de 35.000 casos nuevos. La incidencia de la enfermedad de Parkinson es mayor en el grupo de más de 50 años de edad, aunque se han descrito un número alarmante de casos nuevos en pacientes más jóvenes.

Las características principales de la enfermedad de Parkinson son la lentitud de movimientos (bradicinesia), un temblor o estremecimiento en las manos, brazos, piernas, mandíbula y cara, rigidez de las extremidades y el tronco, e inestabilidad postural. Según progresan estos síntomas, los pacientes pueden experimentar dificultad al andar, hablar o completar otras tareas sencillas de la vida diaria. Estas deficiencias de comportamiento están unidas a la degeneración de sistema nigroestriado en el cerebro, que es responsable de la producción de movimientos suaves, intencionados. Específicamente, las células nerviosas localizadas en la sustancia negra degeneran y hay una pérdida concomitante de dopamina que producen estas células. Las células nerviosas de la sustancia negra extienden axones o prolongaciones al cuerpo estriado, donde se secreta y utiliza la dopamina. Se ha estimado que es necesario que se produzca una pérdida del 80% de dopamina en el cuerpo estriado antes de que emerjan los síntomas de la EP.

Actualmente, levodopa (nombre comercial Sinemet) es el tratamiento principal para la enfermedad de Parkinson. En el cerebro, la levodopa se convierte en dopamina, que corrige la deficiencia en dopamina en los cerebros de los pacientes con enfermedad de Parkinson. Cuando se administra levodopa en combinación con el inhibidor periférico de la descarboxilasa, carbidopa, los pacientes de la EP experimentan beneficios drásticos. Sin embargo, el problema es que mientras que la terapia de levodopa disminuye los síntomas de la EP, no reemplaza las células nerviosas perdidas y no detiene la progresión de la enfermedad. Al progresar la EP, los pacientes requieren dosis crecientes de levodopa y pueden surgir efectos secundarios, lo más notablemente movimientos incapacitantes involuntarios y rigidez. De hecho, los especialistas en trastornos de movimiento con frecuencia retrasan el uso de levodopa e inicialmente usan otros fármacos dopaminérgicos para guardar el uso de levodopa para después en el proceso de la enfermedad cuando los pacientes más lo necesitan.

De esta manera, la levodopa tiene sus limitaciones y se necesita establecer estrategias terapéuticas adicionales para la enfermedad de Parkinson. A este respecto, se ha reavivado el interés en los tratamientos quirúrgicos para la EP. Recientemente, un procedimiento denominado estimulación cerebral profunda ha ganado considerable atención. En este procedimiento, se colocan electrodos en regiones cerebrales hiperactivas en la EP de modo que la estimulación eléctrica de estas regiones cerebrales corrige la hiperactividad. En algunos pacientes se pueden alcanzar beneficios drásticos. Otras intervenciones quirúrgicas tienen como fin mejorar la función del sistema nigroestriado. Los trasplantes de células dopaminérgicas han tenido éxito en mejorar las deficiencias motoras en modelos animales de la enfermedad de Parkinson. Los ensayos clínicos iniciales del trasplante de células dopaminérgicas en seres humanos han tenido éxito, mientras que un único ensayo clínico doble enmascarado reveló beneficios en pacientes más jóvenes, pero no en los más viejos. Sin embargo, algunos de los pacientes que recibieron injertos desarrollaron movimientos involuntarios incapacitantes. De esta manera, actualmente, los trasplantes celulares todavía se deben considerar un planteamiento experimental.

Otro planteamiento tiene como fin distribuir factores de crecimiento en el sistema nigroestriado en un intento de prevenir la degeneración de las neuronas de la sustancia negra y la pérdida concomitante del neurotransmisor dopamina.

Muchos laboratorios en todo el mundo han demostrado que el factor neurotrófico derivado de línea celular glial (GDNF) puede prevenir las consecuencias estructurales y funcionales de la degeneración del sistema nigroestriado en estudios realizados en ratas y primates. La distribución de GDNF al SNC se ha alcanzado en estudios preclínicos usando inyecciones de proteína, distribución a través de bombas y mediante terapia génica in vivo. Numerosos estudios describen la transducción de células del SNC usando AAV o lentivirus que expresan GDNF (Kordower, Ann Neurol, 2003 53 (supl 3), s120-s134; WO 03/018821, Ozawa et al; US 2002187951, Aebischer et al; Georgievska et al 2002, Exp Nerol 117(2), 461-474; Georgievska et al 2002, NeuroReport 13(1), 75-82; Wang et al., 2002, Gene Therapy, 9(6), 381-389; US 2002031493, Rohne-Poulenc Rorer SA; US 6180613 Roeckefeller University; Kozlowski et al 2000, Exp Neurol, 166(1), 1,15; Bensadoun 2000, Exp Neurol, 164(1), 15-24; Connor et al 1999, Gene Therapy, 6(12), 1936-1951; Mandel et al 1997, PNAS, 94(25), 14083-88; Lapchak et al 1997, Brain Research, 777 (1,2), 153-160; Bilang-Bleuel et al 1997, PNAS 94(16), 8818-8823).

Otros planteamientos de terapia génica in vivo para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson incluyen la transducción con virus que expresan L-aminoácido aromático descarboxilasa (AADC), ácido glutámico descarboxilasa (GAD) sutalámica (Marutso, Nippon Naika Gakkai Zasshi, 2003, 92 (8), 1461-1466; Howard, Nature Biotechnology, 2003, 21 (10), 1117-18).

Aunque GDNF parece ser un candidato prometedor para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en seres humanos, se describe que el tratamiento con GDNF produce ciertos efectos secundarios, principalmente pérdida de peso y alodinia (Hoane et al 1999, 160(1):235-43). Por tanto, existe una necesidad en la técnica para desarrollar estrategias alternativas para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en particular estrategias cuyo fin es prevenir la degeneración de las neuronas de la sustancia negra.

La neurturina es un miembro de la familia de GDNF de receptores de crecimiento y señaliza principalmente a través del receptor GFR\alpha2. Los receptores para NTN y GDNF se expresan diferencialmente tanto espacial como temporalmente. Por tanto se debe esperar que el efecto terapéutico de NTN y GDNF sean diferentes. Esto se confirma en una comparación de GDNF y NTN distribuidos mediante minibombas osmóticas (Hoane et al 1999, 160(1):235-43). En una comparación de GDNF y NTN en un estudio de terapia génica ex vivo con degeneración de neuronas dopaminérgicas adultas inducida por 6-hidroxidopamina (el mismo modelo animal usado por los presentes inventores), los autores advirtieron que tanto GDNF como NTN prevenían la muerte de neuronas dopaminérgicas nígricas, pero sólo GDNF inducía intensidad aumentada de tinción de tirosina hidroxilasa y brotes masivos (\ring{A}kerud et al, J Neurochemistry, 73, 1:70-78).

La distribución de neurturina como formulación proteica o trasplantando células que sobreexpresan NTN al SNC en modelos de EP no ha producido resultados comparables a los resultados obtenidos con GDNF. En los estudios de tratamiento proteico, esto podría se debido a problemas con la estabilidad de las formulaciones de proteína neurturina (precipitación y semivida corta).

Hasta la fecha no hay informes sobre la terapia génica in vivo de la enfermedad de Parkinson usando neurturina. Un estudio de terapia génica usando AAV que expresa neurturina se enfocó en el tratamiento de trastornos retinianos (Jomary et al 2000, Molecular Vision 7:36-41). Sin embargo, los autores concluyeron que el tratamiento terapéutico del modelo rd de la degradación retiniana no parecía estar afectado por la simple modulación de la expresión de NTN o GFR\alpha-2. Por lo tanto hasta hoy la terapia génica in vivo usando neurturina ha permanecido especulativa.

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Compendio de la invención

La presente invención se refiere a un vector vírico de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión de un polipéptido codificado, dicho polipéptido comprende un péptido señal capaz de funcionar en una célula de mamífero y una neurturina bioactiva seleccionada del grupo que consiste en neurturina madura y una variante de secuencia bioactiva que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia a neurturina truncada N-terminalmente de SEQ ID NO: 9, en donde la secuencia de polinucleótido no codifica una región pro de neurturina.

Los presentes inventores han realizado una serie de estudios animales preclínicos basados en distribución por transducción de virus de factores de crecimiento de la familia GDNF al cuerpo estriado en un modelo de lesión por 6-OHDA. El modelo de lesión por 6-OHDA es un modelo animal bien conocido de enfermedad de Parkinson. Estos experimentos han mostrado -sorprendentemente- que la transducción con un virus que codifica neurturina produce un efecto terapéutico que es al menos tan bueno como el efecto obtenido mediante la transducción con GDNF. Estos datos representan la primera evidencia preclínica del efecto de distribución por terapia génica in vivo de neurturina en un modelo de enfermedad de Parkinson.

La especificidad de neurturina como factor neurotrófico preferido para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson se confirma mediante la ausencia de cualquier efecto de otro factor neurotrófico, neublastina (artemina), en el modelo de lesión por 6-OHDA.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, dicho método comprende administrar al sistema nervioso central de un individuo en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector vírico de expresión, dicho vector comprende una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión de un polipéptido operativamente unido, dicho polipéptido comprende un péptido señal capaz de funcionar en una célula de mamífero y una neurturina (NTN) humana, murina o de rata seleccionada del grupo que consiste en NTN madura, NTN madura truncada N-terminalmente y una variante de secuencia de cualquiera de tales NTN.

Los presentes inventores también han determinado que en ciertos casos puede haber un problema con la secreción de neurturina cuando se usa una construcción que codifica una pre-pro-neurturina. Tanto la transfección y transducción in vitro como la transducción in vivo con pre-pro-neurturina humana o de ratón como se describe en los ejemplos adjuntos produce secreción muy limitada de neurturina. En las mismas condiciones, usando los mismos vectores y las mismas células para la transducción o transfección, GDNF se secretó en cantidades significativas.

Los presentes inventores han contemplado una forma de obtener niveles de secreción significativamente mayores. Esta forma incluye la deleción de esa parte del gen de neurturina que codifica el pro-péptido. La construcción de expresión según esta forma de realización incluye un péptido señal fusionado directamente a la forma madura o truncada de neurturina o a una variante de secuencia de neurturina madura o truncada. El péptido señal puede ser el péptido señal nativo de neurturina o un péptido señal heterólogo.

Otra forma de obtener niveles de secreción suficientemente altos incluye el cambio del péptido señal nativo de neurturina por un péptido señal heterólogo, incluyendo pero no limitado al péptido señal de la cadena pesada de la inmunoglobulina (IgSP). En una forma de realización particularmente preferida, el péptido señal heterólogo se fusiona a una deltapro-NTN. Mediante deltapro-NTN se quiere decir un polipéptido neurturina sin una región pro funcional.

En contraste a los descubrimientos con neurturina, una deleción de la parte pro de GDNF y el cambio del péptido señal de GDNF por el péptido señal IgSP produjo una reducción significativa en la secreción de GDNF comparada con la secreción de pre-pro-GDNF.

También se observó que el cambio de la parte pre-pro de NTN por la parte pre-pro de GDNF no produjo ningún aumento significativo en la secreción de NTN. De esta manera, la diferencia entre NTN y GDNF no se puede atribuir solamente a diferencias en la parte pre-pro de los dos factores neurotróficos.

Tanto en el caso de pre-pro-NTN como en la construcción de expresión con la parte pre-pro de GDNF se observó que se secretó de las células de mamífero una proteína que correspondía en peso molecular a una pro-NTN sin procesar. También se observó que esta pro-NTN no era capaz de unirse a GFR\alpha1 o GFR\alpha2. Cuando se usaron construcciones de expresión "sin pro", se secretó una proteína correspondiente en peso molecular a neurturina madura. Esta proteína era bioactiva como se evidenció mediante los experimentos in vivo y era capaz de unirse tanto a GFR\alpha1 como a GFR\alpha2.

Una ventaja importante de usar las construcciones de expresión de alta eficacia descritas en la presente invención es que la cantidad de composición de virus administrada al paciente se puede disminuir. Así para los mismos efectos terapéuticos, se necesita producir menos composición de virus y mediante la administración de menos volumen de composición, se pueden esperar menos efectos secundarios. Además, las inyecciones se pueden hacer de forma más precisa.

En otro aspecto la invención se refiere al uso de un vector vírico de expresión, dicho vector comprende una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión de un polipéptido operativamente unido, dicho polipéptido comprende un péptido señal capaz de funcionar en una célula de mamífero y una neurturina (NTN) humana, murina o de rata seleccionada del grupo que consiste en NTN madura, NTN madura truncada N-terminalmente y una variante de secuencia de cualquiera de tales NTN para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de
Parkinson.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector vírico de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión de un polipéptido operativamente unido, dicho polipéptido comprende un péptido señal capaz de funcionar en una célula de mamífero y una neurturina seleccionada del grupo que consiste en NTN madura, NTN madura truncada N-terminalmente y una variante de secuencia de NTN madura o truncada N-terminalmente. Tal vector vírico de expresión se caracteriza por la ausencia de una región pro funcional de neurturina.

Este vector vírico de expresión es especialmente útil para terapia génica in vivo porque produce la expresión y secreción de cantidades terapéuticamente relevantes de neurturina. El vector vírico de expresión también se puede usar para generar células de mamífero que secreten grandes cantidades de neurturina bioactiva.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el vector según la invención y uno o más adyuvantes, excipientes, soportes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica se puede usar para terapia génica in vivo y ex vivo.

En un aspecto adicional la invención se refiere a una célula huésped aislada, diferente de una célula embrionaria humana y diferente de una célula germinal humana, dicha célula huésped transducida con el vector según la invención.

Ha resultado que tales células huésped transducidas producen inesperadamente grandes cantidades de neurturina comparadas con células productoras de NTN conocidas y comparadas con células transducidas con vectores víricos que codifican neurturina con un polipéptido intacto. Las células huésped transducidas de la presente invención constituyen por lo tanto una fuente prometedora de células para la producción a escala industrial de neurturina.

En un aspecto adicional la invención se refiere a una línea celular empaquetadora capaz de producir una partícula de vector infectiva, dicha partícula de vector comprende un genoma derivado de retrovirus que comprende una LTR 5' retrovírica, un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un promotor operativamente unido a una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende neurturina y un péptido señal heterólogo, un origen de síntesis de la segunda hebra de ADN y una LTR 3' retrovírica. La proteína de fusión no comprende una región pro de neurturina funcional.

Estas líneas celulares empaquetadoras se pueden usar para producir los vectores víricos según la invención. También se pueden usar para terapia génica in vivo cuando se encapsulan y trasplantan al SNC.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un mamífero no humano que comprende al menos una célula que se ha transducido con el vector según la invención. Tales animales que sobreexpresan neurturina se pueden usar para determinar el perfil genético y en el cribado y desarrollo de fármacos.

Preferiblemente, la célula transducida tiene el genotipo del animal individual, es decir, no es un trasplante alogénico o xenogénico.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un dispositivo implantable de cultivo celular, el dispositivo comprende:

: una membrana semipermeable que permite la difusión de neurturina a través de ella y

: al menos una célula huésped aislada según la invención.

Estas cápsulas se pueden usar para la distribución local de neurturina tras el trasplante en el sistema nervioso central. La distribución localizada y prolongada de un factor de crecimiento es un método de administración preferido para el tratamiento de ciertos trastornos del SNC, incluyendo pero no limitados a, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, ictus y esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

En un aspecto adicional la invención se refiere a una cápsula biocompatible que comprende: un núcleo que comprende células empaquetadoras vivas que secretan un vector vírico para la infección de una célula diana, en donde el vector vírico es un vector según la invención; y un recubrimiento externo que rodea dicho núcleo, dicho recubrimiento comprende un material biocompatible permeable, dicho material tiene una porosidad seleccionada para permitir el paso de vectores retrovíricos de aproximadamente 100 nm de diámetro a través del mismo, lo que permite la liberación de dicho vector vírico de dicha cápsula.

Las cápsulas de esta invención proporcionan la distribución de partículas víricas a un sitio deseado en un paciente usando un planteamiento capsular. La encapsulación de líneas celulares que producen vector permite la distribución continua de la partícula vírica en el sitio diana, en oposición a una infusión única. Además, es posible la terapia repetida, con posibilidad reducida de un ataque inmune. Las cápsulas tienen poros lo suficientemente grandes para permitir el paso de las partículas víricas liberadas de las células empaquetadoras, y aún prevenir el paso de células huésped a la cápsula.

Este planteamiento capsular aumenta la seguridad y control de la terapia porque los dispositivos se pueden recuperar fácilmente (al terminar el tratamiento) o explantar y reimplantar (modificando el tratamiento). Además, se reduce la posibilidad de infección porque el dispositivo capsular no se abre o externaliza.

Por último, puesto que la encapsulación previene que las células empaquetadoras migren dentro del paciente y prolonga la viabilidad de las células empaquetadoras tras el implante, probablemente se necesiten menos células para esta terapia. Esto puede ser ventajoso en disminuir más una reacción inmune en el paciente.

En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso del vector vírico según la invención como un medicamento.

En un aspecto aún adicional, la invención se refiere al uso del vector vírico según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso del vector según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del SNC.

Además, la invención se refiere a un método para tratar una enfermedad del sistema nervioso, dicho método comprende administrar a un individuo en necesidad del mismo:

: una cantidad terapéuticamente eficaz del vector de la invención o

: una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la invención o

: un dispositivo biocompatible que comprende una línea celular empaquetadora según la invención.

Según este aspecto de la invención se proporcionan métodos mejorados de terapia génica in vivo para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso. Como evidencian los ejemplos adjuntos, la transducción in vivo con los vectores víricos de la presente invención produce una secreción y una distribución tisular de los factores terapéuticos codificados, por ejemplo, neurturina, no vistos hasta ahora y como consecuencia un efecto terapéutico mejorado.

En un aspecto aún adicional, la invención se refiere a un método de tratar una enfermedad del sistema nervioso, dicho método comprende trasplantar a un individuo en necesidad del mismo:

i.: una cantidad terapéuticamente eficaz de las células transducidas de la invención; o

ii.: un dispositivo implantable según la invención.

Este aspecto proporciona otra forma de tratar trastornos del sistema nervioso basado en terapia génica ex vivo e implante de células terapéuticas capaces de secretar cantidades aumentadas de neurturina.

En una forma de realización, la invención se refiere a una célula de mamífero de la invención capaz de secretar neurturina o un equivalente funcional de la misma en cantidades que superan los 500 ng/10^{6} células/24 horas.

Las células productoras de neurturina descritas en la presente invención producen neurturina en cantidades que superan las vistas en células de mamífero de la técnica anterior en al menos un orden de magnitud. Las células productoras de neurturina de la presente invención hacen posible producir la proteína en fermentadores usando células de mamífero con la ventaja de que la proteína se procesa, glicosila y pliega correctamente y se puede recuperar fácilmente del medio de cultivo.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Alineamiento de secuencias de IgSP de varios mamíferos. IgSP humana (SEQ ID NO. 1; Genbank # AASC18285); IgSP de mono Rhesus (SEQ ID NO. 2; Genbank # ACC02637); IgSP de tití (SEQ ID NO. 3; Genbank #AAM89745); IgSP de ratón (SEQ ID NO. 4; Genbank # AAA38502); IgSP de cerdo (SEQ ID NO 5; Genbank # AAA79743); IgSP de rata (SEQ ID NO. 6; Genbank # AAA51349).

Figura 2: Una tabla de secuencias señal de varios factores neurotróficos. Factor de crecimiento nervioso humano (hNGF, Genbank # NP_002497; SEQ ID NO. 40); factor de crecimiento nervioso de ratón (mNGF, Genbank # P01139; SEQ ID NO 41) GDNF humano (hGDNF, Genbank # NP_000505; SEQ ID NO 42), GDNF de ratón (mGDNF, SEQ ID NO, 43; número de acceso en Genbank U36449); una secuencia señal putativa de GDNF de ratón (SEQ ID NO 44; 19 aminoácidos N-terminal de Genbank NM_010275; el codón de iniciación parece que se predijo incorrectamente comparado con U36449); neublastina humana (hNBN, Genbank # NP_476501; SEQ ID NO 45); persefina humana (hPSF Genbank # NP_004149; SEQ ID NO. 46); neurturina humana (SEQ ID NO. 37); neurturina de ratón (SEQ ID NO. 38); neurturina de rata (SEQ ID NO. 39).

Figura 3: Mapa del plásmido pNS1nIgSP NTN.

Figura 4: ELISA sándwich de neurturina producida in vitro de células transfectadas con construcciones que codifican NTN de tipo salvaje (SEQ ID NO. 12), NTN con pre-pro-péptido de GDNF (SEQ ID NO. 51) y NTN con IgSP (SEQ ID NO. 18).

Figura 5: Un ensayo ELISA funcional RetL2 de neurturina producida in vitro de células transfectadas con construcciones que codifican NTN de tipo salvaje (SEQ ID NO. 12), NTN con pre-pro-péptido de GDNF (SEQ ID NO. 51) y NTN con IgSP (SEQ ID NO. 18).

Figura 6: Inmunotransferencias de preparaciones de neurturina de lisados de células transfectadas con construcciones que codifican NTN de tipo salvaje (SEQ ID NO. 12), NTN con pre-pro-péptido de GDNF (SEQ ID NO. 51) y NTN con IgSP (SEQ ID NO. 18).

Figura 7: Cuantificación de la cantidad de neurturina producida por células ARPE-19 que expresan neurturina de forma estable.

Figura 8: Mapa del vector pHR'-sC.IgSP-hgNTN.W, el vector de lentivirus usado para los estudios de terapia génica in vivo.

Figura 9: Dibujo esquemático de la inyección intraestriatial del vector de lentivirus o 6-OHDA.

Figura 10: Secciones coronales a través del cuerpo estriado de ratas transducidas con vectores de lentivirus y procesadas posteriormente para inmunohistoquímica usando anticuerpos para NTN humana o GDNF humano. El panel superior izquierdo muestra un cuerpo estriado intacto sin operar procesado para hNTN. No se puede detectar señal. De forma similar al lado intacto, no se detecta señal en el cuerpo estriado transducido con rLV-wtNTN (panel superior derecho). Por el contrario, se ve una tinción marcada específica para hNTN en el cuerpo estriado transducido con rLV-IgSP (panel inferior derecho) y el patrón de tinción difusa recuerda mucho al observado en animales transducidos con rLV-GDNF teñidos con inmunohistoquímica para GDNF (panel inferior izquierdo).

Figura 11: Neuroprotección de las neuronas nígricas de dopamina por rLV-IgSPNTN. En el lado intacto se pueden ver muchas células inmunorreactivas para TH en la sustancia negra (indicativo de células dopaminérgicas) (panel izquierdo, fila superior). En el lado sometido a una lesión con 6-OHDA el número de perfiles neuronales inmunorreactivos para TH restantes se reduce significativamente en animales tratados con wtNTN (panel medio, fila superior). Por el contrario, permanecen muchas más neuronas inmunorreactivas a TH en los animales que recibieron tratamiento con IgSP-NTN (panel derecho, fila superior)). La cuantificación (gráfico de barras) muestra que IgSP-NTN induce un rescate significativo de la lesión tóxica similar al efecto visto por el tratamiento con GDNF. NBN, previamente mostrado que no recataba las neuronas nígricas de dopamina in vivo no protege cuando se fusiona a un IgSP.

Figura 12: Inserto de ADN (SEQ ID NO. 15) y polipéptido codificado (SEQ ID NO. 16) de los ejemplos 1 y 3 que muestra la construcción de expresión deltaproNeurturina.

Figura 13: Inserto de ADN (SEQ ID NO. 17) y polipéptido codificado (SEQ ID NO. 18) de los ejemplos 1 y 3 que muestra la construcción de expresión IgSP-Neurturina.

Figura 14: Inserto de ADN (SEQ ID NO. 50) y polipéptido codificado (SEQ ID NO. 51) de los ejemplos 1 y 3 que muestra la construcción de expresión preproGDNF-Neurturina.

Figura 15: (A) Construcciones de expresión de NTN incluyendo pre-pro NTN wt, NTN con la parte pre-pro de GDNF (ppG-NTN, SEQ ID NO. 50), dpro-NTN (SEQ ID NO. 15) y IgSP-NTN (SEQ ID NO. 17). La última secuencia de ADN contiene un intrón. Véase el texto para más detalles. (B) Inmunotransferencia de NTN de lisados y medio condicionado de células HEK293 transfectadas. Las flechas indican bandas con el tamaño de pro-NTN wt, pro(GDNF)-NTN y NTN madura, respectivamente. Nótese que el estándar es NTN-His que tiene un peso molecular ligeramente mayor que NTN wt. (C) Actividad de unión a GFR\alpha2 de NTN en medio condicionado de cuatro líneas celulares diferentes transfectadas con las construcciones de NTN. (D) Inmunotransferencia de NTN de lisados (no unidos a GFR\alpha2) y de NTN de medio condicionado unido a GFR\alpha2. (E) ELISA sándwich de NTN en medio condicionado de las cuatro líneas celulares transfectadas con las construcciones de NTN. Los datos se expresan como media \pm EEM (n = 3) de un experimento representativo y * indica una diferencia significativa de células transfectadas con la construcción wt (P<0,05, análisis Krustkal-Wallis unidireccional en orden seguido por el método de Student-Newman-Keuls).

Figura 16: Expresión in vivo del transgén después de las inyecciones intraestratiales de construcciones de lentivirus. Secciones coronales a través del cuerpo estriado de ratas transducidas con vectores de lentivirus y posteriormente procesadas para inmunohistoquímica usando anticuerpos para GFP (A), NTN humana (B, D, E, F, G) o GDNF (C). En el grupo control de GFP se vio un patrón de tinción intracelular distinto después de la inmunohistoquímica usando un anticuerpo contra GFP (A). Se observa una inmunorreactividad intracelular débil (flechas), pero sin señal extracelular de NTN en el cuerpo estriado transducido con rLV-NTN (B, E). Por el contrario, se ve un patrón de tinción intracelular (flechas) y también uno extracelular marcado específico para NTN en el cuerpo estriado transducido con rLV-IgSP (D, F). (C) La inmunotinción de GDNF en animales transducidos con rLV-GDNF muestra de tinción difuso similar debido a la secreción de la proteína. (G) Fibras inmunorreactivas a NTN en la SN pars reticulata, que muestra que NTN se transporta de forma anterógrada de las células transducidas con IgSP-NTN en el cuerpo estriado. Barra 1 mm (A-D, G) ó 62,5 \mum (E-F).

Figura 17: Neuroprotección de neuronas nígricas de dopamina por rLV-IgSP-NTN. (A) Número de neuronas nígricas que expresan TH en el lado de la lesión comparado con el lado intacto en los cuatro grupos diferentes de tratamiento. (B) Número de neuronas nígricas inmunorreactivas para VMAT en el lado de la lesión. Los datos se expresan como media \pm EEM (n = 5-7) y * indica una diferencia significativa del grupo de GFP (P<0,005, ANOVA unidireccional, Método de Dunnett).

Figura 18: Secciones coronales a través de la sustancia negra de animales tratados con GFP, NTN, IgSP-NTN y GDNF. En el lado intacto se pueden ver muchas células inmunorreactivas para TH (A). En el lado sometido a lesión con 6-OHDA el número de perfiles neuronales inmunorreactivos para TH restantes se reduce significativamente en animales tratados con NTN wt o GFP (B, D). Por el contrario, permanecen más neuronas inmunorreactivas para TH en animales que recibieron tratamiento con GDNF (H) o IgSP-NTN (C). Nótese la intensidad reducida de la tinción de TH en animales tratados con GDNF y IgSP-NTN. Mayor aumento de las células IR para TH en el lado intacto (E), lado de la lesión de animales tratados con IgSP-NTN (G) y lado de la lesión de animales tratados con NTN wt (F). Las flechas negras señalan a neuronas con expresión disminuida de TH y la flecha blanca señala a la neurona con expresión normal de TH. Barra 1 mm (A-E, H) o 25 \mum (E-G).

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Definiciones

Una región pro funcional de neurturina es un péptido localizado entre el péptido señal y el péptido maduro, péptido pro que se puede cortar del péptido maduro por furina después del corte del péptido señal. "Región pro de neurturina" significa una región que comprende por ejemplo, al menos los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos -76 a -3 de SEQ ID NO. 12, a los aminoácidos -72 a -3 de SEQ ID NO. 13, a los aminoácidos -72 a -3 de SEQ ID NO. 14. Como estás pre-pro-neurturinas contienen más de un posible sitio pro (motivo RXXR) y como el corte real por la peptidasa señal puede variar, la longitud exacta de una región pro funcional puede variar según esto.

Péptido señal - péptido señal eucariota. Un péptido señal eucariota es un péptido presente en proteínas que están destinadas a ser secretadas o a ser componentes de la membrana. Normalmente está en el N-terminal de la proteína. En el presente contexto, se consideran péptido señal todos los péptidos señal identificados en SignalP (versión 2.0 o preferiblemente versión 3.0) como péptidos señal.

Un péptido señal de mamífero es un péptido señal derivado de una proteína de mamífero secretada a través del retículo endoplásmico.

Péptido señal heterólogo - un péptido señal que no está operativamente unido de forma natural a un polipéptido neurturina.

Polipéptido neurturina humano maduro, como se usa aquí, significa los 102 aminoácidos C-terminal de la pre-pro-neurturina humana nativa, es decir, los aminoácidos 1-102 de SEQ ID NO. 12.

Polipéptido neurturina maduro de ratón, como se usa aquí, significa los 100 aminoácidos C-terminal de la pre-pro-neurturina de ratón nativa, es decir, los aminoácidos 1-100 de SEQ ID NO. 13.

Polipéptido neurturina maduro de rata, como se usa aquí, significa los 100 aminoácidos C-terminal de la pre-pro-neurturina nativa de rata, es decir, los aminoácidos 1-100 de SEQ ID NO. 14.

Polipéptido neurturina: como se usa aquí significa un polipéptido que comprende los aminoácidos 8-101 de la neurturina nativa humana (SEQ ID NO. 12), aminoácidos 6-99 de neurturina nativa de ratón (SEQ ID NO. 13) o los aminoácidos 6-99 de la neurturina nativa de rata (SEQ ID NO. 14) cada una con hasta 15 sustituciones de aminoácidos en la secuencia nativa. En ciertos contextos se entenderá que "polipéptido neurturina secretada" significa un polipéptido a ser secretado en oposición a uno que ya se ha secretado.

Bioactividad: la capacidad de unirse cuando se dimeriza junto con GFR\alpha2 a RET e inducir la dimerización y autofosforilación de RET. La bioactividad se puede medir con el ensayo ELISA RET L2 como se describe en los ejemplos. La bioactividad también puede ser la capacidad de unirse cuando se dimeriza junto con GFR\alpha1 a RET e inducir la dimerización y autofosforilación de RET. La bioactividad se puede medir con el ensayo ELISA RET L1 como se describe en los ejemplos.

Identidad de secuencia: la identidad de secuencia entre una secuencia de aminoácidos de referencia y una secuencia variante de aminoácidos se realiza alineando las secuencias usando los ajustes por defecto de Clustal W (1.82). Se cuenta el número de residuos completamente conservados y se divide por el número de residuos en la secuencia de referencia.

Descripción detallada de la invención I. Secuencias señal

El direccionamiento de secretados y proteínas a la vía secretora se logra a través de la unión de una secuencia amino-terminal corta, conocida como péptido señal o secuencia señal (von Heijne, G. (1985) J. Mol. Biol. 184, 99-105; Kaiser, C. A. & Botstein, D. (1986) Mol. Cell. Biol. 6, 2382-2391). El péptido señal mismo contiene varios elementos necesarios para la función óptima, el más importante de los cuales es un componente hidrofóbico. Precediendo inmediatamente a la secuencia hidrofóbica con frecuencia está un aminoácido básico o ácidos, mientras que en el extremo carboxi-terminal del péptido señal hay un par de aminoácidos pequeños no cargados separados por un único aminoácido intermedio que define el sitio de corte de la peptidasa señal.

Un péptido señal de mamífero preferido tiene de 15 a 30 aminoácidos de longitud (la media para eucariotas es de 23 aminoácidos). La estructura común de los péptidos señal de varias proteínas se describe normalmente como una región n cargada positivamente, seguida por una región h hidrofóbica y una región c neutra pero polar. La regla (-3, -1) dice que los residuos en las posiciones -3 y -1 (relativos al sitio de corte) deben ser pequeños y neutros para que el corte se produzca correctamente.

La región n de las secuencias señal eucariotas es solo ligeramente rica en Arg. La región h es corta y muy hidrofóbica. La región c es corta y no tiene patrón observable. Como se ha descrito las posiciones -3 y -1 consisten en residuos pequeños y neutros. Los residuos de aminoácidos C-terminal al sitio de corte son de menor importancia en eucariotas.

En la región C los residuos en las posiciones -1 y -3 son los más importantes. Estos son aminoácidos pequeños, sin carga. En la posición -1 el residuo es preferiblemente A, G, S, I, T o C. Más preferiblemente, la posición -1 es A, G o S. En la posición -3 el residuo es preferiblemente A, V, S, T, G, C, I o D. Más preferiblemente, la posición -3 es A, V, S o T.

La región hidrofóbica prevalentemente consiste en residuos hidrofóbicos. Estos incluyen A, I, L, F, V y M. Preferiblemente, en las posiciones -6 a -13. De los 8 aminoácidos que constituyen esta región, al menos 4 residuos deben ser hidrofóbicos, más preferiblemente al menos 5, más preferiblemente al menos 6, tal como 7 u 8.

Se pueden usar varios péptidos señal diferentes en las construcciones de neurturina según la presente invención. El péptido señal puede ser cualquier péptido señal funcional, tal como un péptido señal heterólogo tal como un péptido señal de inmunoglobulina (IgSP). El péptido señal puede ser de cualquier especie adecuada tal como ser humano, ratón, rata, mono, cerdo. Preferiblemente es de un ser humano.

Como se evidencia en los ejemplos adjuntos, el uso del IgSP sin el pro-péptido de neurturina en general produce una secreción mejorada de neurturina bioactiva tanto in vitro como in vivo. Los resultados fueron reproducibles tanto con células transducidas con lentivirus como con células transfectadas con plásmidos. Las células secretan la proteína madura como una proteína biológicamente activa, cuando la secuencia codificante de IgSP se fusiona directamente al gen que codifica la proteína madura, excluyendo la parte pre-pro nativa de neurturina.

En otra forma de realización, el péptido señal es un péptido señal nativo de neurturina tal como un péptido señal nativo de neurturina humana. En este contexto la última construcción de péptido señal nativo de neurturina y un polipéptido neurturina se llama deltaproneurturina. Simplemente eliminar la secuencia que codifica la parte pro de neurturina produce un aumento inesperado en la secreción de neurturina bioactiva comparada con la expresión de pre-pro-neurturina.

Las observaciones combinadas de que la secreción de neurturina bioactiva aumenta fuertemente usando construcciones de expresión sin pro comparadas con construcciones de expresión que codifican un propéptido funcional de neurturina o GDNF y que la presencia de una región pro funcional produce la secreción de neurturina no bioactiva ha llevado a los presentes inventores a la conclusión de que la ausencia de un propéptido funcional es un pre-requisito para la secreción de neurturina bioactiva. La ausencia de la región pro también aumenta fuertemente el nivel de secreción de neurturina. Seleccionar un péptido señal fuerte, tal como IgSP, puede aumentar la secreción incluso más.

En una forma de realización de la invención, el péptido señal codificado se selecciona del grupo que consiste en el péptido señal de NGF (SEQ ID NO. 40 ó 41), péptido señal de GDNF (SEQ ID NO. 42 ó 43), péptido señal de persefina (SEQ ID NO. 46) y péptido señal de neublastina (SEQ ID NO. 45). Preferiblemente estos péptidos señal son murinos o humanos, más preferiblemente humanos.

Las predicciones de péptido señal en el ejemplo 6 muestran que la neurturina madura con péptidos señal de NGF y GDNF son péptidos señal tan fuertes como IgSP. El péptido señal de persefina unido a neurturina madura también se predice que sea un péptido señal fuerte. Las construcciones de expresión deltapro (péptido señal de NTN unido a NTN madura truncada N-terminalmente) se evalúan como péptidos señal menos fuertes. Esto se confirma por los datos cuantitativos mostrados en los ejemplos.

Cada uno de los péptidos señal especificado se puede combinar individualmente con una NTN madura de ratón, rata o humana (SEQ ID NO. 10, 11 u 8) o con una forma truncada N-terminalmente de cualquiera de estas como se ilustra en el ejemplo 6 y en la lista de secuencias para IgSP NTN (SEQ ID NO. 18-24) y para deltaproNTN (SEQ ID NO: 16 y 25-30).

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Corte del péptido señal

Antes de decidir en una forma específica de neurturina para incorporar a una construcción de expresión, se puede comprobar la probabilidad de corte del péptido señal (SP) usando herramientas de predicción del estado de la técnica. Una de tales herramientas de predicción preferida es el software SignalP que está disponible en el servidor WWW SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SiqnalP-2.0/) o preferiblemente con la versión más nueva 3.0 disponible del mismo servidor (http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP/).

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El servidor WWW SignalP devolverá tres puntuaciones entre 0 y 1 para cada posición en la secuencia:

Puntuación C (puntuación cruda de sitio de corte)

La puntuación de salida de las redes entrenadas para reconocer sitios de corte contra otras posiciones de secuencia. Entrenada para ser:

alta: en la posición +1 (inmediatamente después del sitio de corte)

baja: en el resto de las posiciones.

Puntuación S (puntuación de péptido señal)

La puntuación de salida de las redes entrenadas para reconocer péptidos señal contra no péptidos señal. Entrenadas para ser:

alta: en todas las posiciones antes del sitio de corte

baja: en 30 posiciones después del sitio de corte y en el N-terminal de proteínas no secretoras

Puntuación Y (puntuación combinada de sitio de corte)

La predicción de localización de sitio de corte se optimiza observando donde la puntuación C es alta y la puntuación S cambia de un valor alto a uno bajo. La puntuación Y formaliza esto combinando la altura de la puntuación C con la pendiente de la puntuación S.

Específicamente, la puntuación Y es una media geométrica entre la puntuación C y una derivada suavizada de la puntuación S (es decir, la diferencia entre la media de la puntuación S en las posiciones d antes y las posiciones d después de la posición actual, donde d varía con el conjunto de redes elegido).

Las tres puntuaciones son medias de cinco redes entrenadas en diferentes repartos de los datos.

Para cada secuencia, SignalP describirá las puntuaciones máximas de C, S e Y, y la puntuación S media entre el N-terminal y el sitio de corte predicho. Estos valores se usan para distinguir entre péptidos señal y péptidos no señal. Si se predice que la secuencia tenga un péptido señal, se predice que el sitio de corte estará inmediatamente antes de la posición con la puntuación Y máxima.

Para un péptido señal típico, las puntuaciones C e Y serán altas en la posición +1, mientras que la puntuación S será alta antes del sitio de corte y baja después del mismo.

Por comparación, la predicción se puede comparar al corte predicho del péptido señal de neurturina salvaje (corte entre los aminoácidos no. 19 y 20 de pre-pro-NTN (SEQ ID NO. 12). Para pre-pro-neurturina de ratón y rata, la predicción de corte es menos cierta. Se predice que el corte se produzca entre los aminoácidos 23 y 24 pero también hay una probabilidad de corte en la misma posición que en la pre-pro-NTN humana.

La mejor predicción de localización de sitio de corte está proporcionada por la posición del máximo de la puntuación Y. La mejor predicción de tipo de secuencia (péptido señal o proteína no secretora) está dada por la puntuación S media (la media de la puntuación S en la región entre la posición 1 y la posición inmediatamente antes del máximo de la puntuación Y): si la puntuación S media es mayor de 0,5, se predice que la secuencia sea un péptido señal. Según esto, en una forma de realización preferida, la puntuación S media es mayor que 0,5.

La versión más nueva de SignalP (v. 3.0) también incluye una nueva puntuación D o Dmax (puntuación de discriminación), que describe la "cualidad de péptido señal". Se encuentra que la puntuación D se correlaciona con el nivel de secreción usando dicho péptido señal con la proteína en cuestión. Se prefiere usar una construcción de expresión de neurturina que codifique una proteína péptido señal-neurturina que muestre un valor Dmax de al menos 0,5, tal como al menos 0,6, por ejemplo al menos 0,7, tal como al menos 0,8.

Las construcciones péptido señal-neurturina preferidas son las que tienen un sitio de corte predicho entre el SP y la neurturina bien en el programa SignalP-NN o SignalP-HMM. Particularmente preferidas son las construcciones de neurturina que tienen un péptido señal predicho en esta posición tanto en SignalP-NN como en SignalP-HMM.

Cuando el péptido señal es IgSP, la parte neurturina de la construcción puede incluir cualquier neurturina humana desde 102 a 96 aminoácidos de longitud o cualquier neurturina de ratón o rata desde 100 a 96 aminoácidos de longitud. En todos estos casos tanto SignalP-NN como SignalP-HMM predicen el corte del péptido señal después de los 19 aminoácidos del péptido señal.

Otros péptidos señal preferidos incluyen los péptidos señal de GDNF y NFG así como péptidos señal de persefina.

En otra forma de realización preferida, la construcción de expresión codifica una proteína péptido señal-neurturina, en la que el corte como predice SignalP versión 2.0 o preferiblemente SignalP versión 3.0 sucede antes de la primera cisteína canónica en la neurturina madura.

Referencias: Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Søren Brunak y Gunnar von Heijne: Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering, 10, 1-6 (1997). Para el modelo de salida SignalP-HMM: Henrik Nielsen y Anders Krogh: Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model. En Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, pp. 122-130 (1998).

Predicción mejorada de péptidos señal: SignalP 3.0. Jannick Dyrløv Bendtsen, Henrik Nielsen, Gunnar von Heijne y Søren Brunak. J. Mol. Biol., 340:783-795, 2004.

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IgSP

Según una forma de realización particularmente preferida, el péptido señal es el péptido señal de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Como se evidencia en los ejemplos adjuntos el uso de estos péptidos señal en general produce una secreción mejorada de la neurturina codificada tanto in vitro como in vivo. Los resultados fueron reproducibles tanto en células transducidas con lentivirus (in vivo e in vitro) como con células transfectadas con plásmidos (in vitro). Las células producen la proteína madura en el tamaño correcto incluso cuando el gen IgSP se fusiona directamente al gen que codifica la proteína madura (es decir, excluyendo la parte pro).

El péptido señal de la inmunoglobulina es un péptido pequeño de 19 aminoácidos conocido de un gran grupo de mamíferos. Las secuencias de ser humano, mono Rhesus, tití, rata, ratón y cerdo se alinean en la figura 1. El porcentaje de identidad de secuencia comparado con IgSP humano varía de 21 (cerdo) a 68 (tití) por ciento. Esta variación relativamente grande indica que la secuencia específica se puede cambiar en un gran grado sin cambiar sustancialmente la función biológica del péptido señal. También se observa que hay reactividad entre especies como se evidencia en los ejemplos adjuntos. Estos se llevaron a cabo con el IgSP de ratón, que era funcional en rata (experimentos in vivo) y en células humanas (células ARPE 19) así como en células de hámster chino (CHO) y células de rata
(HiB5).

Preferiblemente el IgSP es de origen murino o humano porque se sabe que el IgSP murino es funcional en ratón, rata y seres humanos. Para uso en seres humanos, el IgSP preferiblemente es de origen humano para reducir el riesgo de efectos secundarios entre especies.

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II. Neurturina

Neurturina es uno de los cuatro miembros del GDNF (factor neurotrófico derivado de línea celular glial). Señaliza a través de los co-receptores GFR\alpha2 y GFR\alpha1. Neurturina se ha sugerido como un candidato terapéutico para tratar ciertas enfermedades neurodegenerativas. Donde la degeneración celular implica degeneración neuronal, las enfermedades incluyen, pero no están limitadas a, neuropatía periférica, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, ictus isquémico, lesión cerebral aguda, lesión de la médula espinal aguda, tumores del sistema nervioso, esclerosis múltiple, traumatismo o lesión a nervios periféricos, exposición a neurotoxinas, enfermedades metabólicas tales como diabetes o disfunciones renales y daño causado por agentes infecciosos. Donde la degeneración celular implica degeneración de células de la médula ósea, las enfermedades incluyen, pero no está limitadas a, trastornos de células sanguíneas insuficientes tales como, por ejemplo, leucopenias, incluyendo eosinopenia y/o basopenia, linfopenia, monocitopenia, neutropenia, anemias, trombocitopenia así como una insuficiencia de células troncales de cualquiera de las anteriores. En particular, se puede usar la neurturina administrada con las construcciones y métodos de la presente invención para tratar la enfermedad de
Parkinson.

La neurturina se describió por primera vez en WO 97/08196 (Universidad de Washington). La forma pre-pro de la neurturina humana se muestra en SEQ ID NO 12, la forma pre-pro de la neurturina de ratón se muestra en SEQ ID NO 13 y la forma pre-pro de la neurturina de rata se muestra en SEQ ID NO 14. La forma madura de neurturina incluye los aminoácidos no. 1-102 de SEQ ID NO. 12 (NTN madura humana mostrada en SEQ ID NO 8), 1-100 de SEQ ID NO. 13 (NTN madura de ratón mostrada en SEQ ID NO 10) y 1-100 de SEQ ID NO. 14 (madura de rata mostrada en SEQ ID NO 8).

La secuencia de nucleótidos que codifica la neurturina madura humana se muestra en SEQ ID NO 7 de la presente solicitud. La proteína codificada tiene 102 aminoácidos de longitud y se muestra en SEQ ID NO: 8. La neurturina madura de ratón se muestra en SEQ ID NO: 10. La secuencia de neurturina madura de rata se muestra en SEQ ID NO 11. Los ejemplos 1 y 3 describen métodos para clonar la neurturina madura humana. Preferiblemente, la neurturina usada en el contexto de la presente invención es neurturina madura humana, pero se contempla igualmente que se puedan usar las secuencias correspondientes de ratón y rata.

Las variantes de secuencia de la presente invención se definen adecuadamente con referencia a la neurturina codificada biológicamente activa. El porcentaje de identidad de secuencia entre factores de crecimiento de la familia GDNF está aproximadamente en el intervalo del 50% cuando se determina en la parte madura de los factores de crecimiento. Con tales diferencias entre factores de crecimiento muy relacionados, se contempla que la secuencia de la neurturina se pueda cambiar sin cambiar la actividad biológica del factor de crecimiento. En una forma de realización de la presente invención, una variante de secuencia de neurturina es una secuencia que codifica un factor de crecimiento, que comparte al menos el 70% de identidad de secuencia con los 96 aminoácidos C-terminal de la neurturina humana, de ratón o rata (SEQ ID NO 9 y 10 y 11). Más preferiblemente, la variante de secuencia comparte al menos el 75% de identidad de secuencia con dicha neurturina, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el 97%, más preferiblemente al menos el 99%. En una forma de realización particularmente preferida, la identidad de secuencia se determina mediante comparación con los 96 aminoácidos C-terminal de neurturina humana (SEQ ID NO. 9).

Se sabe en la técnica que no se pueden hacer libremente cambios en la secuencia de aminoácidos sin afectar a la función biológica de la proteína. Los residuos de aminoácidos que más probablemente no se pueden cambiar sin afectar seriamente a la función biológica de la neurturina incluyen ante todo los siete residuos de cisteína canónicos conservados de la parte madura (residuos no. 8, 35, 39, 69, 70, 99 y 101 de SEQ ID NO 8).

Un alineamiento de neurturina contra los otros factores neurotróficos de la familia del GDNF proporciona información al experto en la materia sobre qué residuos de aminoácidos son los más importantes para conservar la función biológica de una variante de secuencia de neurturina. En una forma de realización preferida, la variante de secuencia de neurturina comprende los residuos completamente conservados en las posiciones correspondientes a NTN humana (hNTN) salvaje. En una forma de realización preferida, la variante de secuencia comprende los residuos completamente conservados y los fuertemente conservados en las posiciones correspondientes a hNTN salvaje. En una forma de realización aún más preferida, la variante de secuencia de NTN comprende los residuos completamente, fuertemente y débilmente conservados en las posiciones correspondientes a hNTN salvaje.

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TABLA 3A Comparación de la secuencia de aminoácidos de la familia de GDNF de factores neurotróficos. Los alineamientos muestran preproNeublastina (NBN, SEQ ID NO 47), preproPersefina (PSP, SEQ ID NO 48), preproNeurturina (NTN, SEQ ID NO 12) y GDNF (SEQ OD no 49)

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1

TABLA 3B Alineamiento múltiple de secuencia Clustal W (1.82) de NTN madura de ratón (SEQ ID NO. 10), rata (SEQ ID NO. 11) y humana (SEQ ID NO. 8)

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3

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Las mutaciones se pueden introducir en neurturina mediante técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida o mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se hacen sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos predichos de aminoácidos no esenciales. Una "sustitución conservadora de aminoácido" es una en la que el residuo de aminoácido se cambia por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De esta manera, un residuo de aminoácido predicho no esencial en la proteína NTN se cambia por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral.

La relación de las familias de aminoácidos también se puede determinar basada en las interacciones de las cadenas laterales. Los aminoácidos sustituidos pueden ser residuos completamente conservados "fuertes" o residuos completamente conservados "débiles". El grupo "fuerte" de residuos de aminoácidos conservados puede ser cualquiera de los siguientes grupos: STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW, en donde los códigos de una letra de aminoácidos se agrupan por los aminoácidos que se pueden sustituir entre sí. Asimismo, el grupo "débil" de residuos conservados puede ser cualquiera de los siguientes: CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY, en donde las letras en cada grupo representan el código de aminoácidos de una letra.

Se sabe que los factores de crecimiento de la familia de GDNF son biológicamente activos en forma truncada N-terminalmente (US 6184200 que describe GDNF truncado; WO 02/072826 que describe neublastina truncada). También se cree que la neurturina es bioactiva en la forma truncada N-terminalmente. Los presentes inventores han contemplado el uso de una secuencia de ADN que codifica neurturina N-terminalmente truncada que consiste en los 101, 100, 99, 98, 97 ó 96 aminoácidos C-terminales de neurturina madura humana y las correspondientes proteínas truncadas de rata y ratón. La forma humana más corta, que se cree que es tan bioactiva como la proteína madura, consiste en los 96 aminoácidos mostrados en SEQ ID NO: 9. De forma similar, las proteínas de ratón y rata pueden estar N-terminalmente truncadas hasta los 96 aminoácidos C-terminales. Actualmente se cree que debe quedar un residuo de aminoácido N-terminal del primer residuo canónico de cisteína.

El C-terminal también puede estar truncado por la eliminación del/de los residuo(s) de aminoácido(s) C-terminal al último residuo canónico de cisteína. En seres humanos, ratón y rata esto equivale a la deleción de un aminoácido C-terminal. En una forma de realización preferida de la invención, este aminoácido C-terminal no se deleciona.

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III. Tejidos diana para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos

Los métodos de tratar o prevenir o mejorar la enfermedad de Parkinson usando vectores víricos que comprenden las secuencias que codifican el factor de crecimiento derivado de línea celular glial (GDNF) son bien conocidas. Se ha alcanzado la distribución de GDNF al SNC en estudios preclínicos usando inyecciones de proteína, distribución a través de bombas y mediante terapia génica in vivo. Numerosos estudios describen la transducción de células del SNC usando AAV o lentivirus que expresan GDNF (Kordower, Ann Neurol, 2003 53 (supl 3), s120-s134; WO 03/018821, Ozawa et al; US 2002187951, Aebischer et al; Georgievska et al 2002, Exp Nerol 117(2), 461-474; Georgievska et al 2002, NeuroReport 13(1), 75-82; Wang et al, 2002, Gene Therapy, 9(6), 381-389; US 2002031493, Rohne-Poulenc Rorer SA; US 6180613 Roeckefeller University; Kozlowski et al 2000, Exp Neurol, 166(1), 1,15; Bensadoun 2000, Exp Neurol, 164(1), 15-24; Connor et al 1999, Gene Therapy, 6(12), 1936-1951; Mandel et al 1997, PNAS, 94(25), 14083-88; Lapchak et al 1997, Brain Research, 777 (1,2), 153-160; Bilang-Bleuel et al 1997, PNAS 94(16), 8818-8823). Estos métodos se pueden usar en la distribución de neurturina al sistema nervioso central usando los vectores víricos de la presente invención.

Un parámetro importante para la terapia génica in vivo es la selección de un tejido diana adecuado. Se selecciona una región del cerebro por su sensibilidad retenida a factores neurotróficos en particular a neurturina. En seres humanos, las neuronas del SNC que mantienen la sensibilidad a factores neurotróficos en la edad adulta incluyen las neuronas colinérgicas basales del prosencéfalo, las neuronas entorrinales corticales, las neuronas talámicas, las neuronas del locus cerúleo, las neuronas sensoriales espinales y las neuronas motoras espinales. Una característica adicional de células con sensibilidad retenida a neurturina es la expresión de Ret y uno de los dos co-receptores GFR\alpha1 y GFR\alpha2.

Se han implicado anormalidades en el compartimento colinérgico de esta compleja red de neuronas en ciertos trastornos neurodegenerativos, incluyendo EA, enfermedad de Parkinson y esclerosis lateral amiotrófica (ELA, también conocida como enfermedad de Lou Gehrig). El prosencéfalo colinérgico basal (particularmente, la región Ch4 del prosencéfalo basal) es un tejido diana particularmente adecuado.

En el prosencéfalo primate, las neuronas magnocelulares Chl-Ch4 proporcionan inervación colinérgica a la corteza cerebral, tálamo y núcleo basolateral de la amígdala. En sujetos con enfermedades neurodegenerativas tal como EA, las neuronas en la región Ch4 (núcleo basal de Meynert) que tienen receptores del factor de crecimiento nervioso (NGF) experimentan una marcada atrofia comparadas con controles normales (véase, por ejemplo, Kobayashi, et al., Mol. Chem. Neuropathol., 15: 193-206 (1991)).

En sujetos normales, las neurotrofinas previenen la muerte neuronal simpática y sensorial durante el desarrollo y previenen la degeneración neuronal colinérgica en ratas y primates adultos (Tuszynski, et al., Gene Therapy, 3: 305314 (1996)). Se cree que la pérdida resultante de neuronas funcionales en esta región del prosencéfalo basal está causativamente unida al empeoramiento cognitivo que experimentan los sujetos que padecen afecciones neurodegenerativas tal como EA (Tuszynski, et al., supra y Lehericy, et al., J. Comp. Neurol., 330: 15-31 (1993)).

En EA humana, la pérdida neuronal en el prosencéfalo basal sucede a lo largo de un área intraparenquimatosa de aproximadamente 1 cm de diámetro. Para tratar las neuronas afectadas en una región tan grande, es deseable el tratamiento con una composición de vector en hasta 10 sitios separados de distribución de vector génico. Sin embargo, al tratar lesiones localizadas en el prosencéfalo basal, las áreas afectadas del cerebro probablemente sean menores de modo que será suficiente la selección de menos sitios de distribución (por ejemplo, 5 o menos) para restaurar un número clínicamente significativo de neuronas colinérgicas.

De forma importante, los sitios específicos de distribución génica in vivo se seleccionan de modo que se agrupen en un área de pérdida neuronal. Se pueden identificar tales áreas clínicamente usando un número de técnicas conocidas, incluyendo diagnóstico por imágenes de resonancia magnética (RM) y biopsia. En seres humanos, los métodos de diagnóstico por imágenes in vivo no agresivos tal como RM serán preferidos. Una vez identificadas las áreas de pérdida neuronal, se seleccionan los sitios de distribución para la distribución estereotáxica de modo que cada dosis unitaria de NTN se administre al cerebro en, o a 500 \mum de, una célula diana y a no más de alrededor de 10 mm de otro sitio de administración.

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IV. Requerimientos de dosis y protocolo de distribución

Un parámetro importante adicional es la dosis de neurturina a ser administrada en el tejido diana. A este respecto, "dosis unitaria" se refiere en general a la concentración de neurturina/ml de composición de neurturina. Para vectores víricos, la concentración de neurturina se puede definir mediante el número de partículas víricas/ml de composición neurotrópica. Óptimamente, para la administración de neurturina usando un vector vírico de expresión, cada dosis unitaria de neurturina comprenderá de 2,5 a 25 \muL de una composición de neurturina, en donde la composición incluye un vector vírico de expresión en un líquido farmacéuticamente aceptable y proporciona de 10^{10} hasta 10^{15} partículas víricas que expresan neurturina por ml de composición de neurturina. Tales títulos altos son particularmente útiles para virus adenoasociados. Para lentivirus, el título es normalmente menor, tal como desde 10^{8} hasta 10^{10} unidades de transducción por ml (UT/ml) determinado como se describe en los ejemplos.

Se pueden encontrar directrices respecto a la dosis de virus de neurturina en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en las numerosas referencias citadas respecto a la administración de GDNF usando terapia génica in vivo.

En una forma de realización preferida, el sitio de administración es el cuerpo estriado del cerebro, en particular el núcleo caudado y/o putamen. La inyección en el putamen puede marcar los sitios diana localizados en varias regiones distantes del cerebro, por ejemplo, el globo pálido, amígdala, núcleo subtalámico o la sustancia negra. La transducción de células en el globo pálido normalmente causa marcaje retrógrado de células en el tálamo. En una forma de realización preferida el (o uno de los) sitio(s) diana es la sustancia negra. La inyección también puede ser tanto en el cuerpo estriado como en la sustancia negra.

Dentro de un sitio diana determinado, el sistema de vector puede transducir una célula diana. La célula diana puede ser una célula encontrada en un tejido nervioso, tal como una neurona, astrocito, ologodendrocito, célula de microglía o ependimal. En una forma de realización preferida, la célula diana es una neurona, en particular una neurona positiva para TH.

El sistema de vector se administra preferiblemente mediante inyección directa. Los métodos para inyección en el cerebro (en particular el cuerpo estriado) son bien conocidos en la técnica (Bilang-Bleuel et al (1997) Proc. Acad. Natl. Sci. USA 94:8818-8823; Choi-Lundberg et al (1998) Exp. Neurol.154:261-275; Choi-Lundberg et al (1997) Science 275:838-841; y Mandel et al (1997)) Proc. Acad. Natl. Sci. USA 94:14083-14088). Se pueden dar inyecciones estereotáxicas.

Como se ha mencionado anteriormente, para la transducción en tejidos tales como el cerebro es necesario usar volúmenes muy pequeños, de modo que la preparación vírica se concentra por ultracentrifugación. La preparación resultante debe tener al menos 10^{8} u.t/ml, preferiblemente de 10^{8} a 10^{10} u.t/ml, más preferiblemente al menos 10^{9} u.t/ml. (El título se expresa en unidades de transducción por ml (u.t/ml) como se describe en el ejemplo 2). Se ha encontrado que se puede obtener la dispersión mejorada de la expresión transgénica aumentando el número de sitios de inyección y disminuyendo la velocidad de inyección (Horellou y Mallet (1997) como antes). Normalmente se usan entre 1 y 10 sitios de inyección, más normalmente entre 2 y 6. Para una dosis que comprende 1-5x10^{9} u.t/ml, la velocidad de inyección es normalmente entre 0,1 y 10 \mul/min, normalmente alrededor de 1 \mul/min.

Debido a la alta eficacia de secreción de los vectores mejorados proporcionados por la presente invención, se necesita inyectar volúmenes menores de composición de virus para obtener un efecto clínico que si se usan vectores que codifican pre-pro-NTN.

La composición de neurturina se administra en cada sitio celular de administración en el tejido diana mediante microinyección, infusión, carga por raspadura, electroporación u otros medios adecuados para administrar directamente la composición en el sitio de administración mediante una incisión quirúrgica. La administración se logra lentamente, tal como durante un periodo de alrededor de 5-10 minutos (dependiendo del volumen total de composición de neurturina a ser administrado).

Los expertos en la materia apreciarán que el método de administración directa empleado por la invención obvia un factor de riesgo limitante asociado con la terapia génica in vivo; esto es, el potencial de transducción de células no diana con el vector que contiene el transgén que codifica la neurturina. En la invención, la administración es directa y los sitios de administración se eligen de modo que la difusión de la neurturina secretada tenga lugar sobre una región controlada y predeterminada del cerebro para optimizar el contacto con las neuronas diana, mientras que se minimiza el contacto con células no diana.

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V. Vectores víricos

En general, la terapia génica busca transferir material genético nuevo a las células de un paciente con beneficio terapéutico resultante para el paciente. Tales beneficios incluyen el tratamiento o profilaxis de una amplia gama de enfermedades, trastornos y otras afecciones.

Los planteamientos de terapia génica ex vivo implican la modificación de células aisladas, que después se infusionan, injertan o trasplantan de otra manera en el paciente. Véase por ejemplo, las patentes de EE. UU. Nos. 4868116, 5399346 y 5460959. La terapia génica in vivo busca dirigirse directamente al tejido del paciente in vivo.

Los virus útiles como vectores de transferencia génica incluyen, papovirus, adenovirus, virus vaccinia, virus adenoasociados, herpesvirus y retrovirus. Los retrovirus adecuados incluyen el grupo que consiste en VIH, SIV, FIV, EIAV, MoMLV.

Los virus preferidos para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central son lentivirus y virus adenoasociados. Ambos tipos de virus se pueden integrar en el genoma sin divisiones celulares, y ambos tipos se han probado en estudios animales preclínicos para indicaciones en el sistema nervioso, en particular en el sistema nervioso central.

Se describen métodos para la preparación de AAV en la técnica, por ejemplo US 5677158, US 6309634 y US 6451306 describen ejemplos de distribución de AVV al sistema nervioso central.

Un tipo especial y preferido de retrovirus incluye los lentivirus que pueden transducir una célula e integrarse en su genoma sin división celular. Así preferiblemente el vector es una partícula de lentivirus deficiente en replicación. Tal partícula de lentivirus se puede producir de un vector de lentivirus que comprende una LTR 5' de lentivirus, un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un promotor operativamente unido a una señal polinucleótido que codifica dicha proteína de fusión, un origen de síntesis de la segunda hebra de ADN y una LTR 3' de lentivirus. Los métodos para la preparación y administración in vivo de lentivirus de células neurales se describen en US 20020037281 (Métodos para transducir células neurales usando vectores de lentivirus) y US 20020187951 (Terapia génica de factores de crecimiento mediada por lentivirus para enfermedades neurodegenerativas).

Los vectores retrovíricos son los vectores más normalmente usados en ensayos clínicos en seres humanos, puesto que contienen 7-8 kb y puesto que tienen la capacidad de infectar células e integrar su material genético de forma estable en la célula huésped con gran eficacia. Véase, por ejemplo, WO 95/30761; WO 95/24929. Los Oncovirinae requieren al menos una ronda de proliferación de la célula diana para la transferencia e integración de secuencias exógenas de ácido nucleico en el paciente. Los vectores retrovíricos se integran al azar en el genoma del paciente.

Se han descrito tres clases de partículas retrovíricas: ecotrópicas, que pueden infectar células murinas eficazmente, y anfotrópicas, que pueden infectar células de muchas especies. Una tercera clase incluye retrovirus xenotróficos que pueden infectar células de otra especie que la especie que produjo el virus. Su capacidad para integrarse sólo en el genoma de células en división ha hecho a los retrovirus atractivos para marcar linajes celulares en estudios de desarrollo y para la distribución de genes terapéuticos o suicidas a cánceres o tumores. Estos vectores pueden ser particularmente útiles en el sistema nervioso central para el tratamiento del cáncer, donde hay falta relativa de división celular en pacientes adultos.

Para su uso en pacientes humanos, los vectores retrovíricos deben ser deficientes en replicación. Esto previene la generación adicional de partículas retrovíricas infecciosas en el tejido diana -en su lugar el vector deficiente en replicación se vuelve un transgén "cautivo" estable incorporado en el genoma de la células diana. Típicamente, en vectores deficientes en replicación, los genes gag, env y pol se han delecionado (junto con la mayor parte del resto del genoma vírico). El ADN heterólogo se inserta en el lugar de los genes víricos delecionados. Los genes heterólogos pueden estar bajo el control del promotor heterólogo endógeno, otro promotor heterólogo activo en la célula diana o la LTR 5' retrovírica (la LTR vírica es activa en diversos tejidos). Típicamente los vectores retrovíricos tienen una capacidad de transgén de alrededor de 7-8 kb.

Los vectores retrovíricos deficientes en replicación requieren el suministro de proteínas víricas necesarias para la replicación y ensamblaje en trans, por ejemplo, de líneas celulares empaquetadoras manipuladas. Es importante que las células empaquetadoras no liberen virus competentes en replicación y/o virus auxiliares. Esto se ha alcanzado expresando las proteínas víricas de ARN que carecen de la señal \Psi y expresan los genes gag/pol y el gen env de unidades transcripcionales separadas. Además, en algunos virus de 2ª y 3ª generación, las LTR 5' se han cambiado por promotores no víricos que controlan la expresión de estos genes y el promotor 3' se ha minimizado para que contenga sólo el promotor proximal. Estos diseños minimizan la posibilidad de recombinación que lleva a la producción de vectores competentes en replicación o virus auxiliares. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 4861719.

VI. Vectores de expresión

La construcción de vectores para la expresión recombinante de neurturina para su uso en la invención se puede lograr usando técnicas convencionales que no requieren explicación detallada al experto en la materia. Sin embargo, para una revisión, los expertos en la materia pueden consultar Maniatis et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982).

Las construcciones quiméricas de expresión usadas en la presente invención se pueden crear como se describe en los ejemplos, por ejemplo amplificando los fragmentos deseados (una secuencia señal y una secuencia codificante de neurturina) mediante PCR y fusionando éstas en PCR solapante. Como varias de las secuencias señales preferidas son relativamente cortas, el cebador 5' de PCR usado para amplificar la secuencia codificante de la neurturina puede incluir la secuencia que codifica la secuencia señal así como una caja TATA y otros elementos reguladores.

Brevemente, la construcción de vectores recombinantes de expresión emplea técnicas estándar de ligación. Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los vectores construidos, los genes se secuencian usando, por ejemplo, el método de Messing, et al., (Nucleic Acids Res., 9: 309-, 1981), el método de Maxam, et al., (Methods in Enzymology, 65: 499, 1980) u otros métodos adecuados que conoce el experto en la materia.

Se realiza la separación por tamaño de los fragmentos cortados usando electroforesis en gel convencional como se describe, por ejemplo en Maniatis, et al., (Molecular Cloning, pp. 133-134,1982).

La expresión de un gen se controla a nivel de transcripción, traducción o postraducción. El inicio de la transcripción es un hecho temprano y crítico en la expresión génica. Esto depende de las secuencias promotora y potenciadora y está influido por factores celulares específicos que interaccionan con estas secuencias. La unidad transcripcional de muchos genes consiste en el promotor y en algunos casos elementos potenciadores o reguladores (Banerji et al., Cell 27: 299 (1981); Corden et al., Science 209: 1406 (1980); y Breathnach y Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50: 349 (1981)). Para retrovirus, los elementos de control implicados en la replicación del genoma retrovírico residen en la repetición terminal larga (LTR) (Weiss et al., eds., The molecular biology of tumor viruses: RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982)). Las LTR del virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) y el virus del sarcoma de Rous (RSV) contienen secuencias promotoras y potenciadoras (Jolly et al., Nucleic Acids Res. 11: 1855 (1983); Capecchi et al., En: Enhancer and eukaryotic gene expression, Gulzman y Shenk, eds., pp. 101-102, Cold Spring Harbor Laboratories (NY 1991). Otros promotores potentes incluyen los derivados de citomegalovirus (CMV) y otros promotores víricos salvajes.

También se han descrito las regiones del promotor y potenciador de un número de promotores no víricos (Schmidt et al.; Nature 314: 285 (1985); Rossi y deCrombrugghe, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5590-5594 (1987)). Los métodos para mantener y aumentar la expression de transgenes en células quiescentes incluyen el uso de promotores incluyendo el promotor de colágeno de tipo I (1 y 2) (Prockop y Kivirikko, N. Eng. J. Med. 311: 376 (1984); Smith y Niles, Biochem. 19: 1820 (1980); de Wet et al., J. Biol Chem: 258: 14385 (1963)), SV40 y LTR.

Según una forma de realización de la invención, el promotor es un promotor constitutivo seleccionado del grupo que consiste en: promotor de ubiquitina, promotor de CMV, promotor JeT (US 6555674), promotor de SV40 y promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1-alfa).

Los ejemplos de promotores inducibles/represibles incluyen: Tet-On, Tet-Off, promotor inducible por rapamicina, Mx1.

Además de usar promotores víricos y no víricos para dirigir la expresión del transgén, se puede usar una secuencia potenciadora para aumentar el nivel de expresión del transgén. Los potenciadores pueden aumentar la actividad transcripcional no sólo de su gen nativo sino también de algunos genes exógenos (Armelor, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 70: 2702 (1973)). Por ejemplo, en la presente invención se pueden usar las secuencias potenciadoras del colágeno con el promotor del colágeno 2 (I) para aumentar la expresión del transgén. Además, se puede usar el elemento potenciador encontrado en los virus SV40 para aumentar la expresión del transgén. Esta secuencia potenciadora consiste en una repetición de 72 pares de bases como describen Gruss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 943 (1981); Benoist y Chambon, Nature 290: 304 (1981) y Fromm y Berg. J. Mol. Appl. Genetics, 1: 457 (1982). Esta secuencia repetida puede aumentar la transcripción de muchos genes víricos y celulares diferentes cuando está presente en serie con varios promotores (Moreau et al., Nucleic Acids Res. 9: 6047 (1981).

Las secuencias potenciadoras de expresión adicionales incluyen pero no están limitadas al elemento de regulación postranscripcional del virus de la hepatitis de marmota, WPRE, SP163, intrón de insulina de rata u otros intrones, el potenciador de CMV y el aislador de la [beta]-globina de pollo u otros aisladores.

También se puede aumentar la expresión del transgén para expresión estable a largo plazo usando citoquinas para modular la actividad del promotor. Se ha descrito que varias citoquinas modulan la expresión del transgén de promotores de colágeno 2 (I) y LTR (Chua et al., connective Tissue Res., 25: 161-170 (1990); Elias et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 580: 233-244 (1990)); Seliger et al., J. Immunol. 141: 2138-2144 (1988) y Seliger et al., J. Virology 62: 619-621 (1988)). Por ejemplo, el factor de crecimiento transformante (TGF), interleuquina (IL)-I e interferón (IFN) disminuyen la expresión de transgenes dirigidos por varios promotores tales como LTR. El factor de necrosis tumoral (TNF) y TGF 1 aumentan, y se pueden usar para controlar, la expresión de transgenes dirigidos por un promotor. Otras citoquinas que se pueden demostrar útiles incluyen el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF).

También se puede usar el promotor del colágeno con la secuencia potenciadora de colágeno (Coll (E)) para aumentar la expresión del transgén suprimiendo además cualquier respuesta inmune al vector que se pueda generar en un cerebro tratado a pesar de su estado inmuno-protegido. Además, se pueden administrar agentes antiinflamatorios incluyendo esteroides, por ejemplo dexametasona, al huésped tratado inmediatamente después de la distribución de la composición de vector y continuar, preferiblemente, hasta que remita cualquier respuesta inflamatoria mediada por citoquinas. También se puede administrar un agente inmunosupresor tal como ciclosporina para reducir la producción de interferones, que regulan por descenso el promotor LTR y el promotor-potenciador Coll (E) y reducen la expresión del transgén.

El vector puede comprender secuencias adicionales tal como una secuencia que codifique la proteína recombinasa Cre y secuencias LoxP. Una manera adicional de asegurar la expresión temporal de neublastina es mediante el uso del sistema Cre-LoxP que produce la escisión de parte de la secuencia insertada de ADN bien tras la administración de la recombinasa Cre a las células (Daewoong et al, Nature Biotechnology 19:929-933) o incorporando un gen que codifica la recombinasa en la construcción vírica (Plück, Int J Exp Path, 77:269-278). Incorporar un gen para la recombinasa en la construcción vírica junto con los sitios LoxP y un gen estructural (neublastina en el caso presente) con frecuencia produce expresión del gen estructural durante un periodo de aproximadamente cinco días.

VII. Preparaciones farmacéuticas

Para formar una composición de neurturina para su uso en la invención, los vectores víricos de expresión que codifican neurturina se pueden colocar en una suspensión, solución o emulsión farmacéuticamente aceptable. Los medios adecuados incluyen solución salina y preparaciones liposomales.

Más específicamente, los soportes farmacéuticamente aceptables pueden incluir soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tal como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Los soportes acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer con lacto o aceites no volátiles.

Los vehículos intravenosos incluyen regeneradores de líquido y nutrientes, regeneradores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer) y similares.

También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Además, una composición de transgenes de neurturina se puede liofilizar usando medios bien conocidos en la técnica, para la posterior reconstitución y uso según la invención.

También se puede usar un sistema de dispersión coloidal para la distribución génica dirigida.

Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, bolas y sistemas basados en lípidos incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Los liposomas son vesículas artificiales de membrana que son útiles como vehículos de distribución in vitro e in vivo. Se ha mostrado que las vesículas unilamelares grandes (LUV), que varían en tamaño de 0,2-4,0 \mum pueden encapsular un porcentaje sustancial de un tampón acuoso que contenga macromoléculas grandes. Se pueden encapsular ARN, ADN y viriones intactos en el interior acuoso y distribuir a células en una forma biológicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6: 77,1981). Además de células de mamífero, los liposomas se han usado para la distribución de transgenes operativamente codificantes en células vegetales, de levadura y bacterianas. Para que un liposoma sea un vehículo eficaz de transferencia génica, deben estar presentes las siguientes características: (1) encapsulación de los genes que codifican neurturina con alta eficacia al tiempo que no se compromete su actividad biológica; (2) unión preferente y sustancial a una célula diana en comparación a células no diana; (3) distribución del contenido acuoso de la vesícula al citoplasma de la célula diana con alta eficacia; y (4) expresión precisa y eficaz de la información genética (Mannino, et al., Biotechniques, 6: 682,1988).

La composición del liposoma normalmente es una combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos de alta temperatura de transición, normalmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También se pueden usar otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes.

Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gnagliósidos. Particularmente útiles son los diacilfosfatidilgliceroles, donde el grupo lipídico contiene de 14-18 átomos de carbono, particularmente de 16-18 átomos de carbono y está saturado. Fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina.

El direccionamiento de los liposomas se puede clasificar basado en factores anatómicos y mecanísticos. La clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo, específico de órgano, específico de célula y específico de orgánulo. El direccionamiento mecanístico se puede distinguir en base a si es pasivo o activo. El direccionamiento pasivo utiliza la tendencia natural de los liposomas a distribuirse a células del sistema reticuloendotelial (RES) en órganos que contiene capilares sinusoidales.

El direccionamiento activo, por otra parte, implica la alteración del liposoma acoplando el liposoma a un ligando específico tales como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glicolípido o proteína o cambiando la composición o tamaño del liposoma para lograr el direccionamiento a órganos y tipos celulares diferentes de los sitios naturales de localización.

La superficie del sistema de distribución de gen dirigido se puede modificar de varias maneras. En el caso de un sistema de distribución liposomal dirigido, se pueden incorporar grupo lipídicos en la bicapa lipídica del liposoma para mantener el ligando de direccionamiento en asociación estable con la bicapa liposomal. Se pueden usar varios grupos enlazadores para unir las cadenas lipídicas al ligando de direccionamiento.

Un ejemplo adicional de un sistema de distribución incluye el trasplante en el área terapéutica de una composición terapéutica de células empaquetadoras capaces de producir partículas de vector como se describe en la presente invención. Los métodos para encapsulación y trasplante de tales células se conocen en la técnica, en particular de WO 97/44065 (Cytotherapeutics). Al seleccionar una línea celular empaquetadora capaz de producir partículas de lentivirus, se obtiene la transducción de células que no se dividen en el área terapéutica. Al usar partículas retrovíricas capaces de transducir solo célula en división, la transducción se restringe a las células diferenciadas de novo en al área terapéutica.

VIII. Encapsulación de células

La terapia de células encapsuladas se basa en el concepto de aislar células del sistema inmune del huésped receptor rodeando las células con un material biocompatible semipermeable antes de implantar en el huésped. La invención incluye un dispositivo en el que se encapsulan células que secretan neurturina en una cápsula inmunoaislante. Una "capsula inmunoaislante" significa que la cápsula, tras implantarla en un huésped receptor, minimiza los efectos perjudiciales del sistema inmune del huésped sobre las células en el núcleo del dispositivo. Las células se inmunoaislan del huésped encerrándolas en cápsulas poliméricas implantables formadas por una membrana microporosa. Este planteamiento previene el contacto célula a célula entre tejidos del huésped e implantado, eliminando el reconocimiento antigénico a través de la presentación directa. Las membranas usadas también se pueden ajustar para controlar la difusión de moléculas, tales como anticuerpo y complemento, basado en su peso molecular (Lysaght et al., 56 J. Cell Biochem. 196 (1996), Colton 14 Trends Biotechnol. 158 (1996)). Al usar técnicas de encapsulación, las células se pueden trasplantar a un huésped sin rechazo inmune con o sin el uso de fármacos inmunosupresores. Las cápsulas poliméricas biocompatibles útiles normalmente contienen un núcleo que contiene células, suspendidas en un medio líquido o inmovilizadas en una matriz de inmovilización, y una región circundante o periférica de matriz o membrana permoselectiva ("recubrimiento") que no contiene células aisladas, que es biocompatible y que es suficiente para proteger las células en el núcleo de un ataque inmune perjudicial. La encapsulación evita que los elementos del sistema inmune entren en la cápsula, protegiendo por ello las células encapsuladas de la destrucción inmune. La naturaleza semipermeable de la membrana de la cápsula también permite que la molécula biológicamente activa de interés difunda fácilmente de la cápsula al tejido huésped circundante.

La cápsula se puede hacer de un material biocompatible. Un "material biocompatible" es un material que, después de la implantación en un huésped, no provoca una respuesta perjudicial del huésped suficiente para producir el rechazo de la cápsula o para hacerla inoperable, por ejemplo mediante degradación. El material biocompatible es relativamente impermeable a moléculas grandes, tales como los componentes del sistema inmune del huésped, pero es permeable a moléculas pequeñas, tales como insulina, factores de crecimiento y nutrientes, al tiempo que permite que se eliminen los restos metabólicos. Varios materiales biocompatibles son adecuados para la distribución de factores de crecimiento por la composición de la invención. Se conocen numerosos materiales biocompatibles, que tienen varias morfologías superficiales externas y otras características mecánicas y estructurales. Preferiblemente, la cápsula de esta invención será similar a las descritas en las solicitudes internacionales de patente PCT WO 92/19195 o WO 95/05452 o las patentes de EE. UU. Nos. 5639275; 5653975; 4892538; 5156844; 5283187; o la patente de EE. UU. No. 5550050. Tales cápsulas permiten el paso de metabolitos, nutrientes y sustancias terapéuticas al tiempo que minimizan los efectos perjudiciales del sistema inmune del huésped. Los componentes del material biocompatible pueden incluir una membrana circundante semipermeable y el andamiaje interno de soporte de las células. Preferiblemente, las células transformadas se siembran en el andamiaje que se encapsula con la membrana permoselectiva. El andamiaje filamentoso de soporte para las células se puede hacer de cualquier material biocompatible seleccionado del grupo que consiste en acrílico, poliéster, polietileno, polipropileno, poliacetonitrilo, tereftalato de polietileno, nailon, poliamidas, poliuretanos, polibutéster, seda, algodón, quitina, carbono o metales biocompatibles. Además, se pueden usar estructuras de fibra unida para la implantación de células (Patente de EE. UU. No. 5512600). Los polímeros biodegradables incluyen los compuestos de poli(ácido láctico) PLA, poli(ácido láctico-coglicólico) PLGA y poli(ácido glicólico) PGA y sus equivalentes. Se han usado andamiajes de espuma para proporcionar superficies en las que las células trasplantadas se puedan adherir (solicitud internacional de patente PCT No. de serie 98/05304). Se han usado tubos de mallas tejidas como injertos vasculares (solicitud internacional de patente PCT WO 99/52573). Además, el núcleo puede estar compuesto de una matriz inmovilizadora formada por un hidrogel, que estabiliza la posición de las células. Un hidrogel es una red tridimensional de polímeros hidrofílicos entrecruzados en forma de gel, sustancialmente compuestos de agua.

Se pueden usar varios polímeros y mezclas de polímeros para fabricar la membrana semipermeable circundante, incluyendo poliacrilatos (incluyendo copolímeros acrílicos), polivilidenos, copolímeros de cloruro de polivinilo, poliuretanos, poliestirenos, poliamidas, acetatos de celulosa, nitratos de celulosa, polisulfonas (incluyendo, polietersulfonas), polifosfazenos, poliacrilonitrilos, poli(acrilnitrilo/co-cloruro de vinilo), así como derivados copolímeros y mezclas de los mismos. Preferiblemente, la membrana semipermeable circundante es una membrana de fibra hueca semipermeable biocompatible. Tales membranas, y los métodos de hacerlas, se divulgan en las patentes de EE. UU. Nos. 5284761 y 5158881. La membrana semipermeable circundante se forma de una fibra hueca de polietersulfona, tales como las descritas por la patente de EE. UU. No. 4976859 o la patente de EE. UU. No. 4968733. Un material de membrana semipermeable circundante alternativo es poli(acrilnitrilo/co-cloruro de vinilo).

La cápsula puede estar en cualquier configuración apropiada para mantener la actividad biológica y proporcionar acceso para la distribución del producto o función, incluyendo, por ejemplo, cilíndrica, rectangular, en forma de disco, en forma de parche, ovoide, estrellada o esférica. Además, la cápsula puede estar enrollada o envuelta en una estructura de malla o anidada. Si la cápsula se va a recuperar después de ser implantada, no se prefieren las configuraciones que tienden a producir migración de las cápsulas desde el sitio de implantación, tal como cápsulas esféricas lo suficientemente pequeñas para viajar por los vasos sanguíneos del huésped receptor. Ciertas formas, como rectángulos, parches, discos, cilindros y hojas planas ofrecen mayor integridad estructural y se prefieren donde se desea la recuperación.

Cuando se usan macrocápsulas, preferiblemente se encapsulan entre 10^{3} y 10^{8} células, más preferiblemente se encapsulan entre 10^{5} y 10^{7} células en cada dispositivo. La dosis se puede controlar implantando un número menor o mayor de cápsulas, preferiblemente entre 1 y 10 cápsulas por paciente.

El andamiaje puede estar recubierto con moléculas de la matriz extracelular (MEC). Los ejemplos adecuados de moléculas de la matriz extracelular incluyen, por ejemplo, colágeno, laminina y fibronectina. La superficie del andamiaje también se puede modificar tratando con irradiación de plasma para dar carga para aumentar la adhesión de las células.

Se puede usar cualquier método adecuado de sellado de cápsulas, incluyendo el uso de adhesivos poliméricos o corrugado, anudado y sellado por calor. Además, también se puede usar cualquier método adecuado de sellado "seco", como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. No. 5653687.

Los dispositivos de células encapsuladas se implantan según técnicas conocidas. Se contemplan muchos sitios de implantación para los dispositivos y métodos de esta invención. Estos sitios de implantación incluyen, pero no están limitados a, el sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, la médula espinal (véase, las patentes de EE. UU. Nos. 5106627, 5156844 y 5554148) y los humores vítreo y acuoso del ojo (véase, solicitud internacional de patente PCT WO 97/34586).

La línea celular ARPE-19 es una línea celular plataforma superior para tecnología de distribución basada en células encapsuladas y también es útil para la tecnología de distribución basada en células sin encapsular. La línea celular ARPE-19 es resistente (es decir, la línea celular es viable en condiciones rigurosas, tales como implantación en el sistema nervioso central o el medio intraocular). Las células ARPE-19 se pueden modificar genéticamente para que secreten una sustancia de interés terapéutico. Las células ARPE-19 tienen una vida relativamente larga. Las células ARPE-19 son de origen humano. Además, las células ARPE-19 encapsuladas tienen una buena viabilidad in vivo en dispositivo. Las células ARPE-19 pueden distribuir una cantidad eficaz de factor de crecimiento. Las células ARPE-19 provocan una reacción inmune en el huésped insignificante. Además, las células ARPE-19 no son tumorigénicas.

Los métodos y aparatos para implantar cápsulas en el SNC se describen en US 5487739.

En un aspecto la invención se refiere a una cápsula biocompatible que comprende: un núcleo que comprende células empaquetadoras vivas que secretan un vector vírico para la infección de una célula diana, en donde el vector vírico es un vector según la invención; y un recubrimiento externo que rodea dicho núcleo, dicho recubrimiento comprende un material biocompatible permeable, dicho material tiene una porosidad seleccionada para permitir el paso de vectores retrovíricos de aproximadamente 100 nm de diámetro a través del mismo, lo que permite la liberación de dicho vector vírico de dicha cápsula.

Preferiblemente, el núcleo comprende además una matriz, las células empaquetadoras están inmovilizadas por la matriz. Según una forma de realización, el recubrimiento comprende un hidrogel o material termoplástico.

Se divulgan métodos y dispositivos para la encapsulación de células empaquetadoras en US 6027721.

IX. Uso médico y métodos de tratamiento

En un aspecto la invención se refiere al uso del vector según la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso. El trastorno del sistema nervioso puede ser un trastorno del sistema nervioso periférico o del sistema nervioso central.

Mediante tratamiento no sólo se quiere decir tratamiento curativo sino también tratamiento preventivo (no prevención absoluta) o profiláctico. El tratamiento también puede ser de mejora o sintomático.

Preferiblemente, el trastorno del SNC es una enfermedad neurodegenerativa o neurológica. La enfermedad neurodegenerativa o neurológica puede ser una enfermedad que implique neuronas lesionadas y traumáticas, tales como lesiones traumáticas de los nervios periféricos, el bulbo raquídeo, la médula espinal, daño neuronal cerebral isquémico, neuropatía, neuropatía periférica, dolor neuropático, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, deficiencia de memoria relacionada con demencia. El componente neurodegenerativo de la esclerosis múltiple también es tratable según la presente invención.

Según una forma de realización preferida de la invención la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson (véase en los ejemplos).

En otra forma de realización preferida, la enfermedad es esclerosis lateral amiotrófica o lesión de la médula espinal.

También se pueden usar los vectores de la presente invención para el tratamiento de enfermedades oculares, tales como retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma, retinopatía diabética.

Se pueden tratar las enfermedades del sistema nervioso administrando a un individuo en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz del vector vírico de la invención o una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica de la invención.

Para la enfermedad de Parkinson, la distribución de cápsulas y vector vírico se describe anteriormente en "Requerimientos de dosis y protocolo de distribución". Para ELA y lesión de la médula espinal, las cápsulas con células secretoras de neurturina o vector vírico se pueden administrar al espacio intratecal, por vía intraventricular o intralumbar. Para la lesión de médula espinal, la distribución también puede ser en el área con neuronas lesionadas y/o traumáticas. La distribución de cápsulas o vector vírico puede ser en la dilatación cervical/lumbar en proximidad a las neuronas motoras inferiores. En particular para ELA, se puede inyectar un virus de la rabia modificado que codifica una construcción de expresión de la presente invención en el tejido muscular afectado, mediante lo cual se logra el transporte retrógrado de las neuronas motoras afectadas.

Aunque la presente invención se enfoca en la terapia génica in vivo, también se contempla que, se puedan tratar enfermedades del sistema nervioso trasplantando a un individuo en necesidad de la misma:

i.: una cantidad terapéuticamente eficaz de las células transducidas según la invención,

ii.: un dispositivo implantable que comprende células transducidas, o

iii.: un dispositivo biocompatible que comprende una línea celular empaquetadora.

Dicho trasplante puede comprende un trasplante autólogo, un trasplante alógeno o un trasplante xenógeno.

La mayoría de, si no todas, las enfermedades y trastornos oftálmicos están asociadas con una o más de tres tipos de indicaciones: (1) angiogénesis, (2) inflamación y (3) degeneración. Para tratar estos trastornos, los vectores víricos, células terapéuticas y células encapsuladas de la presente invención permiten la distribución de neurturina al ojo.

La distribución del vector vírico según la presente invención se puede hacer usando inyecciones subretinianas, inyección intravítrea o inyección transesclerótica.

La retinopatía diabética, por ejemplo, se caracteriza por angiogénesis y degeneración retiniana. Esta invención contempla tratar la retinopatía diabética implantando dispositivos que distribuyen NTN por vía intraocular, preferiblemente en el vítreo, o por vía periocular, preferiblemente en la región sub-Tenon. Se prefiere principalmente la distribución de cápsulas, células desnudas o vector vírico en el vítreo para esta indicación. La retinopatía incluye, pero no está limitada a, retinopatía diabética, vitreoretinopatía proliferativa y retinopatía tóxica.

La uveítis implica inflamación y degeneración secundaria. Esta invención contempla tratar la uveítis mediante implantación intraocular, preferiblemente vítrea o en la cámara anterior, de cápsulas o células desnudas que secretan NTN o mediante administración de vector vírico según la invención al vítreo.

La retinitis pigmentosa, en comparación, se caracteriza por degeneración retiniana primaria. Esta invención contempla tratar la retinitis pigmentosa mediante colocación intraocular, preferiblemente vítrea, de dispositivos o células desnudas que secretan NTN o mediante administración de vector vírico según la invención al vítreo.

La degeneración macular relacionada con la edad implica tanto angiogénesis como degeneración retiniana. Esta invención contempla tratar este trastorno usando las cápsulas o células desnudas de la invención para distribuir NTN por vía intraocular, preferiblemente al vítreo, o usando el vector vírico según la invención para distribuir NTN por vía intraocular, preferiblemente al vítreo. La degeneración macular relacionada con la edad incluye, pero no está limitada a, degeneración macular seca relacionada con la edad, degeneración macular exudativa relacionada con la edad y degeneración miope.

El glaucoma se caracteriza por una presión ocular aumentada y pérdida de células ganglionares retinianas. Los tratamientos para el glaucoma contemplados en este invención incluyen distribución de NTN que proteja las células retinianas del daño asociado al glaucoma, administrada por vía intraocular, preferiblemente intravítrea mediante cápsulas, vector vírico o células desnudas.

Se contempla la distribución por vía intraocular, preferiblemente en el vítreo, de neurturina en un intervalo de dosis de 50 pg a 500 ng, preferiblemente de 100 pg a 100 ng y lo más preferiblemente de 1 ng a 50 ng por ojo por paciente por día. Para la distribución periocular, preferiblemente en el espacio o región sub-Tenon, se contemplan intervalos de dosis ligeramente superiores de hasta 1 \mug por paciente por día.

La presente invención puede ser útil para el tratamiento de neovascularización ocular, una afección asociada con muchas enfermedades y trastornos oculares y que representa una gran parte de la pérdida visual grave. Por ejemplo, se contempla el tratamiento de la neovascularización ocular asociada con isquemia retiniana, una causa principal de ceguera en diabetes y muchas otras enfermedades; neovascularización corneal, que predispone a los paciente a fallo de injerto de córnea; y neovascularización asociada con retinopatía diabética, oclusión venosa retiniana central y posiblemente degeneración macular relacionada con la edad.

En una forma de realización de la presente invención, se encapsulan células vivas que secretan neurturina y se insertan quirúrgicamente (con anestesia retrobulbar) en el vítreo del ojo. Para la colocación vítrea, el dispositivo se puede implantar a través de la esclerótica, con una parte del dispositivo o atadura que sobresale a través de la esclerótica. Lo más preferiblemente, el cuerpo entero del dispositivo se implanta en el vítreo sin que parte del dispositivo sobresalga de o través de la esclerótica. Preferiblemente el dispositivo está unido a la esclerótica (u otra estructura ocular adecuada). La atadura puede comprender una sutura ocular o cualquier otro medio de anclaje adecuado (véase, por ejemplo US 6436427). El dispositivo puede permanecer en el vítreo tanto como sea necesario para alcanzar la profilaxis o terapia deseada. Tales terapias incluyen, por ejemplo, fomento de la supervivencia o reparación de neuronas o fotorreceptores, o inhibición y/o inversión de neovascularización retiniana o coroidea, así como inhibición de inflamación uveal, retiniana o del nervio óptico. Esta forma de realización es preferible para distribuir NTN a la retina.

Con la localización vítrea, se puede distribuir NTN a la retina o RPE.

En otra forma de realización, se implantan dispositivos cargados de células por vía periocular dentro o debajo del espacio conocido como cápsula de Tenon. Esta forma de realización es menos agresiva que el implante en el vítreo y por tanto es en general preferida. Esta vía de administración también permite la distribución de NTN al RPE o la retina. Esta forma de realización es especialmente preferida para tratar neovascularización coroidea e inflamación del nervio óptico y la úvea. En general, la distribución desde este sitio de implantación permitirá la circulación de NTN a la vasculatura coroidea, la vasculatura retiniana y el nervio óptico.

Según esta forma de realización se prefiere la distribución periocular (implantar debajo de la cápsula de Tenon) de NTN a la vasculatura coroidea para tratar la degeneración macular (neovascularización coroidea).

La distribución de NTN directamente a la vasculatura coroidea (vía periocular) o al vítreo (vía intraocular) usando los dispositivos y métodos de esta invención pueden permitir el tratamiento de la neovascularización coroidea poco definida u oculta. También puede proporcionar una manera de reducir o prevenir la neovascularización coroidea recurrente mediante terapia adyuvante o de mantenimiento.

La dosis se puede variar mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Esto incluye cambiar (1) el número de células por dispositivo, (2) el número de dispositivos por ojo, o (3) el nivel de producción de NTN por célula. Se prefiere usar de 10^{3} a 10^{8} células por dispositivo, más preferiblemente de 5*10^{4} a 5*10^{6} células por dispositivo.

X. Células huésped

En un aspecto la invención se refiere a las células huésped aisladas transducidas con el vector según la invención. Estas células preferiblemente son células huésped de mamífero porque estas son capaces de secretar y procesar la neurturina codificada correctamente.

Las especies preferidas incluyen el grupo que consiste en roedores (ratón, rata), conejo, pero, gato, cerdo, mono, ser humano.

Los ejemplos de cultivos primarios y líneas celulares que son buenos candidatos para la transducción con los vectores de la presente invención incluyen el grupo que consiste en CHO, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, células neuronales, células fetales, ARPE-19, MDX12, C2C12, HeLa, HepG2, células estriatales, neuronas, astrocitos, interneuronas.

La invención también se refiere a células adecuadas para la biodistribución de NTN a través de células desnudas o encapsuladas, que están genéticamente modificadas para sobreexpresar NTN y que se pueden trasplantar al paciente para distribuir polipéptido NTN bioactivo localmente. Tales células se pueden denominar ampliamente células terapéuticas.

En una forma de realización preferida de la invención, una línea celular terapéutica no se ha inmortalizado con la inserción de un gen heterólogo de inmortalización. Como la invención se refiere a las células que son particularmente adecuadas para el trasplante celular, ya sea como células desnudas o -preferiblemente como células encapsuladas, tales líneas celulares inmortalizadas son menos preferidas ya que hay un riesgo inherente de que empiecen a proliferar de una manera incontrolada dentro del cuerpo humano y potencialmente formen tumores.

Preferiblemente, la línea celular terapéutica es una línea celular inhibida por contacto. Mediante una línea celular inhibida por contacto se quiere decir una línea celular que cuando se cultiva en placas petri crece hasta confluencia y después sustancialmente deja de dividirse. Esto no excluye la posibilidad de que un número limitado de células escape de la monocapa. Las células inhibidas por contacto también se pueden hacer crecer en 3D, por ejemplo, en el interior de una cápsula. También dentro de las cápsulas las células crecen hasta confluencia y después frenan significativamente la velocidad de proliferación o paran completamente de dividirse. Un tipo de células particularmente preferido incluye células epiteliales que por su naturaleza están inhibidas por contacto y que forman monocapas estables en cultivo.

Incluso más preferidas son las células epiteliales pigmentosas retinianas (células RPE). La fuente de células RPE es mediante aislamiento de células primarias de la retina de mamífero. Los protocolos para recoger células RPE están bien definidos (Li y Turner, 1988, Exp. Eye Res. 47:911-917; Lopez et al., 1989, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30:586-588) y se consideran una metodología rutinaria. En la mayoría de los artículos publicados de cotrasplante de células RPE, las células derivan de rata (Li y Turner, 1988; Lopez et al., 1989). Según la presente invención las células RPE derivan de seres humanos. Además de células RPE primarias aisladas, se pueden usar líneas de células RPE humanas cultivadas en la práctica de la invención.

En otra forma de realización la línea celular terapéutica se selecciona del grupo que consiste en: líneas celulares de fibroblastos humanos, líneas celulares de astrocitos humanos, líneas celulares mesencefálicas humanas y líneas celulares endoteliales humanas, preferiblemente inmortalizadas con TERT, SV40T o vmyc.

El método para generar una línea celular inmortalizada de astrocitos humanos se ha descrito previamente (Price TN, Burke JF, Mayne LV. A novel human astrocyte cell line (A735) with astrocyte-specific neurotransmitter function. In Vitro Cell Dev Biol Anim. Mayo 1999; 35(5):279-88). Se puede usar este protocolo para generar líneas celulares de astrocitos.

Preferiblemente se hacen las tres siguientes modificaciones de ese protocolo para generar líneas celulares de astrocitos humanos adicionales.

Se puede usar tejido cerebral fetal humano disecado de fetos de 5-12 semanas de edad en lugar de tejido de 12-16 semanas de edad.

Se puede usar el gen de inmortalización vmyc o TERT (telomerasa) en lugar del antígeno SV40T.

Se puede usar transferencia génica retrovírica en lugar de transfección con plásmidos mediante la técnica de precipitación con fosfato de calcio.

XI. Matiz soporte para células productoras de neurturina

La presente invención comprende además cultivar células productoras de neurturina in vitro en una matriz soporte antes de la implantación en el sistema nervioso o el ojo de mamífero. Se diseña la preadhesión de las células a microsoportes antes de la implantación para aumentar la viabilidad a largo plazo de las células trasplantadas y proporcionar beneficio funcional a largo plazo.

Para aumentar la viabilidad a largo plazo de las células trasplantadas, es decir, de las células secretoras de NTN trasplantadas, las células a ser trasplantadas se puede unir in vitro a una matriz soporte antes del trasplante. Los materiales que puede comprender la matriz soporte incluyen aquellos materiales a los que se adhieren las células después de incubación in vitro y sobre los que las células pueden crecer y que se pueden implantar en el cuerpo de un mamífero sin producir una reacción tóxica o una reacción de inflamación que destruiría las células implantadas o interferir de otra manera con su actividad biológica o terapéutica. Tales materiales pueden ser sustancias químicas sintéticas o naturales o sustancias de origen biológico.

Los materiales de la matriz incluyen, pero no están limitados a, vidrio u otros óxidos de silicio, poliestireno, polipropileno, polietileno, fluoruro de polivilideno, poliuretano, polialginato, polisulfona, alcohol polivinílico, polímeros de acrilonitrilo, poliacrilamida, policarbonato, polipentent, nailon, amilasas, gelatina natural y modificada y colágeno natural y codificado, polisacáridos naturales y modificados, incluyendo dextranos y celulosas (por ejemplo, nitrocelulosa), agar y magnetita. Se pueden usar materiales resorbibles o no resorbibles. También se pretenden materiales de la matriz extracelular, que se conocen bien en la técnica. Los materiales de la matriz extracelular se pueden obtener comercialmente o preparar haciendo crecer células que secretan tal matriz, eliminando las células secretoras y dejando que las células que se van a trasplantar interaccionen y se adhieran a la matriz. El material de matriz en el que crecen las células que se van a implantar o con el que se mezclan las células, puede ser un producto propio de células RPE. De esta manera, por ejemplo, el material de matriz puede se material de matriz extracelular o membrana basal que está producido y secretado por las células RPE a ser implantadas.

Para mejorar la adhesión, supervivencia y función celular, la matriz sólida se puede recubrir opcionalmente en su superficie externa con factores que se sabe en la técnica que fomentan la adhesión, crecimiento o supervivencia celular. Tales factores incluyen moléculas de adhesión celular, matriz extracelular, tales como, por ejemplo, fibronectina, laminina, colágeno, elastina, glicosaminoglicanos o proteoglicanos o factores de crecimiento.

De forma alternativa, si la matriz sólida a la que se unen las células implantadas se construye de material poroso, el factor que fomenta el crecimiento o supervivencia se puede incorporar en el material de matriz, del que se liberarán lentamente después de la implantación in vivo.

Cuando están unidas al soporte según la presente invención, las células usadas para el trasplante en general están en la "superficie externa" del soporte. El soporte puede ser sólido o poroso. Sin embargo, incluso en un soporte poroso, las células están en contacto directo con el medio externo sin una membrana intermedia u otra barrera. De esta manera, según la presente invención, se considera que las células están en la "superficie externa" del soporte incluso aunque la superficie a la que se adhieren puede estar en forma de pliegues o circunvoluciones internos del material poroso de soporte que no están en el exterior de la partícula o bola misma.

La configuración del soporte es preferiblemente esférica, como en una bola, pero puede ser cilíndrica, elíptica, una hoja plana o tira, en forma de aguja o alfiler, y similares. Una forma preferida de la matriz soporte es una bola de vidrio. Otra bola preferida es una bola de poliestireno.

El tamaño de las bolas puede variar desde alrededor de 10 \mum hasta 1 mm de diámetro, preferiblemente desde alrededor de 90 \mum hasta alrededor de 150 \mum. Para una descripción de varias bolas de microsoportes, véase, por ejemplo, Fisher Biotech Source 8746, Fisher Scientific Co, 1987, pp. 72-75 Sigma Cell Culture Catalog, Sigma Chemical Co., St. Louis, 1991, pp. 162-163; Ventrex Product Catalog, Ventrex Laboratories 1989. El límite superior del tamaño de las bolas puede estar dictado por la estimulación de las bolas de reacciones no deseadas en el huésped, que pueden interferir con la función de las células trasplantadas o causar daño al tejido circundante. El límite superior del tamaño de las bolas también puede estar dictado por el método de administración. Tales limitaciones las determina fácilmente el experto en la materia.

XII. Producción in vitro de neurturina

En otra forma de realización, la invención se refiere a una célula de mamífero de la invención que es capaz de secretar neurturina o un equivalente funcional de la misma en cantidades que superan los 500 ng/10^{6} células/24 horas. Preferiblemente, las células son capaces de secretar al menos 1000 ng/10^{8} células/24 horas, más preferiblemente al menos 5000, más preferiblemente al menos 10.000, más preferiblemente al menos 15.000, más preferiblemente al menos 20.000, más preferiblemente al menos 25.000, más preferiblemente al menos 30.000, más preferiblemente al menos 35.000. Como se muestra en el ejemplo comparativo 1, las mejores células ARPE-19 transfectadas con plásmidos producen más de 20.000 ng/10^{6} células/24 horas. La expresión se puede aumentar incluso más mediante la inclusión de elementos potenciadores tales como WPRE (US 6136597). Comparadas con las células BHK de la técnica anterior (Hoane et al 2000, Experimental Neurology 162:189-193), estas cantidades son muy altas.

Tales células de alta producción se pueden seleccionar del grupo que consiste en células ARPE-19, células CHO, células BHK, células R1.1, células COS, células citolíticas, células T auxiliares, linfocitos T citotóxicos y macrófagos. Las células HEK293 y las células HiB5 también son células productoras adecuadas.

De esta manera, se puede producir neurturina o un forma truncada o mutada de la misma o un variante de secuencia bioactiva en cantidades significativas cultivando estas células y recuperando la neurturina del medio de cultivo. La neurturina producida en mamífero no necesita ser replegada para ser bioactiva. Una ventaja adicional es que la neurturina se secreta como péptido maduro y no incluye pro-péptido. Los presentes inventores han mostrado que expresar neurturina como pre-pro-neurturina produce secreción de pro-neurturina, que no se une a GFR\alpha1 o GFR\alpha2 y por tanto no es bioactiva.

Estas células productoras de neurturina se pueden usar asimismo para fines terapéuticos e implantar como células desnudas (con soporte o sin soporte) o encapsuladas para distribución localizada de neurturina bioactiva.

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Ejemplos

Ejemplo comparativo 1

Transfección in vitro con construcciones de neurturina Materiales y métodos Clonación de la secuencia genómica de NTN

Se clonó NTN genómica humana de ADN genómico purificado de la línea celular HEK293 (ATCC, EE. UU.) usando el kit PureGene (Gentra, Biotech Line, Dinamarca). Se llevó a cabo una PCR con los cebadores NTNgenom 1s +BamHI (5'-TATAGGATCCGGAGGACACCAGCATGTAG-3', SEQ ID NO. 52) y NTNgenom, 1as (5'-TCGCC
GAGGATGAATCACCA-3' SEQ ID NO. 53) usando ADNg de HEK293 como molde. Se usó la polimerasa pfx (Invitrogen, Dinamarca) en su tampón correspondiente suplementado con DMSO al 5% (Sigma-Aldrich, Dinamarca). El fragmento de PCR obtenido se clonó en pNS1n (NeuroSearch), un derivado de pcDNA3neo (Invitrogen) diseñado por encargo, usando los sitios de restricción BamHI y XhoI, produciendo el vector pNS1n.hNTNgenom. Esto produjo la clonación de la secuencia que codifica NTN madura (SEQ ID NO: 7).

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Construcción de vectores

Clonación del vector de expresión IgSP-NTN pNS1n.IgSP.NTN: Se amplificó el fragmento maduro de NTN mediante PCR a partir del vector pNS1n.hNTNgenom usando los cebadores NTNs-IgSP.Flap (5'-GGTGAATTCGGCGC
GGTTGGGGGCGCGGCCT-3', SEQ ID NO 54) y NTN- 594as+XhoI (5'-TATACTCGAGTCACACGCAGGCG
CACTCGC-3' SEQ ID NO 55). En una segunda reacción de PCR, se amplificó la secuencia IgSP del vector pNUT-IgSP-CNTF (US 6361771) usando los cebadores IgSPKozak1s+BamHI (5'-TATAGGATCCGCCACCATGAAATG
CAGCTGGGTTATC-3', SEQ ID NO. 56) y IgSPas-NTN.Flap (5'-CCAACCGCGCCGAATTCACCCCTGTAGAA
AG-3'; SEQ ID NO. 57). En la tercera reacción de PCR, se fusionaron los dos fragmentos mediante solapamiento. Se usaron cantidades iguales de los dos productos como molde con los cebadores IgSPKozak1a+BamHI y NTN-594as+XhoI.

Para generar un vector de expresión basado en plásmido el fragmento resultante se clonó en pNS1n digerido con BamHI/XhoI. En este vector, la secuencia IgSP se coloca bajo el control transcripcional del promotor de CMV (véase la figura 3). Además, el vector contiene el gen Neo que confiere resistencia a G418 cuando se expresa en células de mamífero. La secuencia de nucleótidos del fragmento que codifica IgSP-NTN se muestra en la figura 13.

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Cultivo de células

ARPE-19, una línea celular epitelial pigmentosa retiniana humana que surge espontáneamente (Dunn et al., 1996), se hizo crecer a 37ºC en CO2 al 5%. El medio de cultivo consistía en DMEM/mezcla de nutriente F-12 con Glutamax (Invitrogen, Dinamarca) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Sigma-Aldrich, Dinamarca). Las células se pasaron aproximadamente dos veces a la semana en una relación 1:5.

Estudios de transfección transitoria

Las células ARPE-19 se transfectaron con una serie de vectores de expresión de NTN. Brevemente, las células se sembraron en placas de 6 pocillos (Corning Costar, Biotech Line, Dinamarca) a una densidad de 10^{5} células/pocillo. Al día siguiente, las células se transfectaron con plásmidos de expresión de NTN en pocillos duplicados usando Fugene6 (Roche, Alemania) según las especificaciones del fabricante. 72 horas después de la transfección, se cogieron alícuotas de muestra de los sobrenadantes celulares para ELISA de RetL2 y NTN. Las células se recogieron para análisis de inmunotransferencia.

Transfecciones estables

Se sembraron células ARPE-19 en botellas T150 "pelables" (TPP, Suiza) a una densidad de 2,4*10^{6} células/botella. Las células se transfectaron con 10 \mug de ADN/botella usando Fugene6. 72 horas después de la transfección, se añadieron 800 \mug/ml de G418 (Sigma-Aldrich, Dinamarca) al medio de cultivo para seleccionar clones estables. Después de la formación de distintos clones, se expandieron clones individuales para análisis adicional.

ELISA de NTN

En este inmunoensayo convencional, NTN se une y detecta de muestras usando anticuerpos específicos para NTN. Brevemente, se recubrieron placas Maxisorp (Nunc, Dinamarca) mediante incubación con anticuerpo monoclonal anti-NTN humana (#MAB387, R&D Systems, TriChem, Dinamarca) 1 \mug/ml en solución de recubrimiento (Na_{2}CO_{3} 0,0025 M/NaHCO_{3} 0,0025 M, pH = 8,2) durante 16 horas a 4ºC. Después de lavar en PBST (Tween-20 al 0,05% (Sigma-Aldrich, Dinamarca) en PBS (Invitrogen, Dinamarca)), los pocillos se bloquearon en tampón de bloqueo (seroalbúmina bovina al 1% (Sigma-Aldrich, Dinamarca) y sacarosa al 5% en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar en PBST, los pocillos se incubaron con diluciones en medio de crecimiento de ARPE-19 de muestras de medio de las células productoras de NTN y NTN recombinante (#387-NE, R&D Systems, TriChem, Dinamarca) como estándar durante 3 horas a temperatura ambiente. Se añadió anticuerpo policlonal anti-NTN humana (#AF387, R&D Systems, TriChem, Dinamarca) 1 \mug/ml en tampón de bloqueo a los pocillos y se incubó durante 16 horas a 4ºC. Después de lavar en PBST, los pocillos se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en anti-cabra-HRP (DAKO, Dinamarca) al 0,02% en tampón de bloqueo suplementado con suero normal de ratón (DAKO, Dinamarca) al 1%. Después de lavar en PBST, se añadió solución sustrato TMB (Promega, Ramcon, Dinamarca) y la incubación se llevó a cabo durante 15 minutos a temperatura ambiente. La formación de color se paró mediante adición de HCl 1 N a los pocillos y se midió la A_{450} usando un lector de placas ELX-800 (Cambrex, Dinamarca).

ELISA de RetL2

El ELISA de RetL2 detecta la unión de un conjugado Ret-AP a un complejo de NTN unido al receptor específico de NTN GFR\alpha2. Brevemente, se recubrió una placa Opti-plate (Packard Instruments, Perkin Elmer, Dinamarca) con 100 \mul de anti-Fc humana de cabra (Jackson Immunoresearch Labaratories, TriChem, Dinamarca) 1 \mug/ml en NaHCO_{3} 50 mM (pH = 9,6) durante 16 horas a 4ºC. Después de lavar en PBST, los pocillos se bloquearon en I-Block (Tropix, Roche, Dinamarca) al 0,2% en PBST durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por un breve lavado en PBST. Posteriormente las muestras de células productoras de NTN y diluciones de estándar de NTN recombinante en medio de crecimiento de ARPE-19 se incubaron en los pocillos con proteína de fusión GFR\alpha2/Fc (R&D Systems, TriChem, Dinamarca) 1 \mug/ml en medio condicionado RET-AP (Biogen, EE. UU.) durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron después primero en PBST y después en tampón AP (Tris 200 mM (pH = 9,8), MgCl_{2} 10 mM) seguido por 30 minutos de incubación con Sapphire Enhancer (Tropix, Roche, Dinamarca) al 10% y CSPD (Tropix, Roche, Dinamarca) al 2% en tampón AP. Se cuantificó la luminiscencia.

Inmunotransferencia

Las células se lavaron en PBS y se lisaron en tampón de carga (SDS al 2%, Tris 0,4 M (pH = 8,0), ditiotreitol 10 mM y Na_{3}VO_{4} 0,25) a 96ºC. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE desnaturalizante usando un sistema MultiPhor II según las recomendaciones del fabricante (Amersham Pharmacia, Dinamarca) y se transfirieron a membranas de PVDF (BioRad, Dinamarca). Para la inmunotinción de las membranas, se emplearon técnicas estándar de inmunotransferencia (Maniatis, XX). Se usó el anticuerpo policlonal contra NTN #AF477 (R&D Systems, TriChem, Dinamarca) como anticuerpo detector. Las membranas se desarrollaron usando el sistema de ECL (Amersham Pharmacia, Dinamarca) y se sometieron a exposición a película.

Resultados El elemento IgSP media un aumento significativo en la liberación de NTN de células cultivadas

De las células transitoriamente transfectadas, el vector de expresión IgSP produjo una secreción fuertemente aumentada de NTN al sobrenadante del cultivo celular comparado con los plásmidos wtNTN y pp(GDNF)-NTN. El uso del péptido señal y propéptido de GDNF también mejoró la secreción comparado con el péptido señal nativo de NTN aunque no al mismo grado que el elemento IgSP. El efecto positivo de IgSP en la secreción de NTN se pudo detectar mediante técnicas estándar de ELISA usando anticuerpos producidos contra NTN (figura 4) así como mediante ensayos funcionales de ELISA RetL2 (figura 5), donde se detecta la unión de NTN a su receptor, GFR\alpha2, mediante la formación de un complejo ternario con el co-receptor de GFR Ret. Notablemente, el cambio del péptido pre-pro de NTN salvaje por el de GDNF, un factor que se sabe que se expresa de forma abundante de células recombinantes, no produjo un aumento evidente en la expresión de la proteína NTN, medido mediante ambos ELISA.

La ausencia de un elemento pro-péptido parece afectar el procesamiento intracelular de la proteína NTN

Se separaron las proteínas de los lisados de células transfectadas mediante electroforesis en gel desnaturalizante con neurturina recombinante como control. Sólo en el carril cargado con lisado de células transfectadas con IgSP-NTN, se pudo observar una banda de tamaño similar a la neurturina recombinante (figura 6, la banda localizada entre los marcadores de 6,4 y 21,3 kDa). Para las células transfectadas tanto con wtNTN como con pp(GDNF)-NTN, la proteína prominente detectada por el anticuerpo de NTN tenía un peso molecular significativamente mayor que NTN recombinante y IgSP de células. Esto, combinado con la observación de que IgSP-NTN se expresa significativamente mejor in vitro, indica que IgSP-NTN, pero no wtNTN y pp(GDNF)-NTN, se procesa correctamente para secreción mediante mecanismos intracelulares.

Alta expresión de NTN de clones aislados

Se aislaron células ARPE-19 que expresaban NTN de forma estable mediante transfección con pNS1n.IgSP.NTN seguido por selección de clones con G418. Se observó un intervalo de niveles de expresión de NTN de los clones aislados (figura 7). El mayor productor, ARPE-19/pNS1n.IgSP.NTN #24 produjo hasta 2000 ng de NTN/10^{5} células/24 horas.

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Ejemplo 2

Transducción de ratas in vivo con neurturina Materiales y métodos Generación de una construcción de lentivirus IgSP-NTN y soluciones madre de virus

Para generar una construcción de lentivirus, el fragmento IgSP-NTN (ejemplo 1) se clonó en pHR'-CMV-GFP-W-SIN cortando GFP con BamHI y XhoI e insertando IgSP-NTN como un fragmento BamHI/XhoI en su lugar (véase la figura 8). pHR'-CMV-GFP-W-SIN es un derivado de una construcción de transferencia de lentivirus autoinactivante, pHR'-SIN_{-18} que incluye un elemento WPRE (Dull et al., J. Virol., 72(11):8463-71(1998); Zufferey et al., J. Virol., 72(12):9873-80(1998): Zufferey et al. J. virol., 73 (4):2886-92 (1999)).

Las partículas víricas LV-sC.IgSP.NTN.W deficientes en replicación se generan mediante cotransfección de
pHsC.IgSP.NTN.W con pMD.G (vector VSV-G de pseudotipado) y pBR8.91 (vector de empaquetamiento) (Zufferey et al., Nat. Biotech., 15:871-75(1997)) en células 293T proporcionando las proteínas víricas requeridas en trans. Brevemente, se siembran células 293T cultivadas en DMEM con glucosa 4,5 g/l y glutamax (Life Technologies, 32430-027) suplementado con SFT (Life Technologies, 10099-141) al 10% en botellas T75 (2x106 células/botella) el día antes de la transfección. Para cada botella T75 las células se transfectan con 5 \mug de pMD.G, 15 \mug de pBR8.91 y 20 \mug de vector de transferencia usando Lipofectamina+ siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recoge el sobrenadante celular que contiene virus 2-3 días después de la transfección, se esterilizan por filtración a través de un filtro de 0,45 \mum de acetato de celulosa o polisulfónico y se concentran mediante ultracentrifugación a 50.000xg durante 90 minutos a 4ºC. Después de una segunda ronda de ultracentrifugación, el precipitado de virus concentrado se resuspende en DMEM, se hacen alícuotas y se almacena a -80ºC. Para determinar el título del virus, se ensaya la actividad transcriptasa inversa (RT) (Cepko y Pear, Current Protocols in Molecular Biology, 9.13.5-6, suplemento 36) y se calculan las unidades de transducción (UT)/ml a partir de la actividad RT determinada usando como referencia un lentivirus con EGFP con actividad de transducción conocida.

Se hacen lotes similares de virus con pre-pro-NTN humana y murina, pre-pro-GDNF y GFP.

Procedimientos quirúrgicos

Se usaron un total de 21 ratas hembras jóvenes adultas Sprague-Dawley (B&K Universal, Estocolmo, Suecia) y se enjaularon en un ciclo de 12 horas de luz:oscuridad con libre acceso a pienso de rata y agua. Las inyecciones de virus y lesión por 6-OHDA se realizaron según Rosenblad et al (2000). El procedimiento de inyección se ilustra en la figura 9. Brevemente, con anestesia de isofluorano (del 1,5-2%) se inyecto a los animales un vector rLV que contenía el ADNc de GFP, hNTN, mNTN, IgSP-hNTN o GDNF (n = 6/grupo). Se hicieron cuatro depósitos (0,5 \mul/depósito de 1x10^{8} u.t/mL) en el cuerpo estriado a lo largo de los tramos de dos agujas en las siguientes coordenadas AP = 1,0 mm, ML = 2,6 mm, DV_{1} = 5,0 mm DV_{2} = 4,5 mm y AP = 0,0 mm, ML = 3,7 mm, DV_{1} = 5,0 mm, DV_{2} = 4,5 mm. La barra dentada se ajustó a -3,3 mm. 14 días después de las inyecciones con rLV los animales se volvieron a anestesiar y se inyectó con una jeringuilla Hamilton de 10 \mul un único depósito de 20 \mug de 6-OHDA (Sigma; calculado como base libre y disuelta en 3 \mul de solución salina helada suplementada con ácido ascórbico al 0,02%) en el cuerpo estriado derecho en las siguientes coordenadas AP = 1,0 mm; ML = 3,0 mm relativo al bregma; DV = 5,0 mm relativo a la duramadre y la barra incisiva ajustada a 0,0 mm.

Histología

21 días después de la inyección de 6-OHDA los animales se anestesiaron profundamente con pentobartital de sodio y se perfundieron transcardiacamente con solución salina durante un minuto seguido por 200 ml de PFA helado al 4% en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4). Los cerebros se disecaron y posfijaron en el mismo fijador durante 3-4 horas y después se transfirieron a sacarosa al 25%/tampón fosfato 0,1 M durante 48 horas. Se cortaron cinco series de secciones de 40 \mum en un microtomo de congelación. Se realizó la inmunohistoquímica para hNTN y hGDNF incubando las secciones con anticuerpo primarios anti-hNTN de cabra o anti-hGDNF de cabra (R&D Systems; 1:2000 en solución salina tamponada con fosfato que contenía suero normal de caballo al 2% y Triton X-100 al 0,25%) seguido por incubación con anti-ratón de caballo biotinilado (Jackson Immunoresearch, EE. UU.) durante 2 horas, y kit del complejo avidina-biotina (ABC) según las instrucciones del fabricante (Vector Laboratories, EE.UU.). Por último, la reacción de color se desarrolló usando 3',3'-diaminobencidina como cromógeno.

Resultados Localización inmunohistoquímica de hNTN

La inspección de las secciones teñidas para hNTN muestra que en el cuerpo estriado de animales que recibieron inyecciones de vector de lentivirus que codifican hNTN salvaje (rLV-hNTN) no se encontró inmunorreactividad extracelular en la vecindad de las células estriatales transducidas (figura 10). Por el contrario, los animales que recibieron inyecciones de rLV-IgSPhNTN tenían un patrón de tinción marcado con material inmunorreactivo extendido de forma difusa (extracelularmente) en el cuerpo estriado alrededor del sitio de transducción (figura 10).

Funcionalidad de hNTN

El efecto neuroprotector de hNTN se evaluó contando las neuronas nígricas TH+ (dopaminérgicas). Comparado con el lado intacto, los animales que recibieron una lesión por 6-OHDA y virus rLV-GFP tenían claramente menos neuronas TH+ restantes en la sustancia negra (23+/-3,4%). Los animales que recibieron rLV-hNTN también mostraron una marcada reducción inducida por la lesión en neuronas TH+ (30+/-7,7% restante). Por el contrario, en el grupo tratado con rLV-IgSPNTN el número de neuronas TH+ en el lado lesionado fue 91+/-1,2% de ese en el intacto, que era similar a lo que se observó en el grupo que recibió tratamiento con GDNF (86+/-3,2%).

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Ejemplo 3

Preparación de construcciones de expresión de NTN

Construcciones vectores. pHR'-CMV.SIN.hNTN.WPRE: Se clonó preproNTN humana salvaje en
pHR'-CMV.SIN.PLT7.WPRE como sigue: pHR'-CMV.SIN.PLT7.WPRE, que es un derivado de pHR'-CMV.SIN-18 que contiene el elemento posregulador de marmota (WPRE) como (Zufferey et al. 1998; Zufferey et al. 1999) mediante adición de un sitio poliligador entre los sitios BamHI y XhoI (resultados no publicados) se digirió con BamHI y XhoI. Se cortó preproNTN humana del vector pJDM2174 (=preproNTN humana en pBluescript) (un amable regalo de Jeff Milbrandt) como un fragmento BamHI, XhoI y se ligó en el vector de transferencia de lentivirus digerido con BamHI/XhoI. Se usó preproNTN humana como control.

pNS1n.hNTN: se preparó como se describe en el ejemplo 1.

pNS1n.ppGDNF.hNTN: la región pre-pro de GDNF se amplificó por PCR de un clon de longitud total de GDNF humano usando los siguientes cebadores: cebador 5': 5'-TATAGAATTCGCCACCATGAAGTTATGGGATGTCG-3' (SEQ ID NO. 58) y cebador 3': 5'-CCAACCGCGCCCTTTTCAGTCTTTTAATGG-3' (SEQ ID NO. 59). El cebador 3' contiene 10 bases del extremo 5' de NTN madura en el extremo 3'. La NTN madura humana se amplificó por PCR de una NTN humana de longitud total (pJDM2174) usando los siguientes cebadores: cebador 5': 5'-ACTGAAAAGGGCGCGGTTGGGGGCGCGGCCT-3' (SEQ ID NO. 60) y cebador 3': 5'-TAGACTCGAGGTC
GACGGTATC-3' (SEQ ID NO. 61). El cebador 5' contiene 10 bases del extremo 3' de la región pro de GDNF humano. Se fusionó preproGDNF a NTN madura mediante PCR solapante usando los siguientes cebadores: cebador 5': 5'-TATAGAATTCGCCACCATGAAGTTATGGGATGTCG-3' (SEQ ID NO. 58) y cebador 3': 5'-TAGACTCGAGGT
CGACGGTATC-3' (SEQ ID NO. 61). El fragmento preproGDNF-NTN madura resultante se digirió con EcoRI y XhoI y se insertó entre los sitios EcoRI y XhoI del vector de expresión pNS1n (descrito anteriormente). La secuencia de nucleótidos y el polipéptido codificado se muestran en la figura 14.

pHR'-CMV.SIN.IgSP.NTN.WPRE y pNS1n.IgSP.NTN: el péptido señal de la región V del gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón (número de acceso de GenBank M18950) (IgSP) se amplificó por PCR de pNUT-IgSP-hCNTF (ref. US 6361741) usando los siguientes cebadores: cebador 5': 5'-TATAGGATCCGCCAC
CATGAAATGCAGCTGGGTTATC-3' (SEQ ID NO 56), cebador 3': 5'-CCAACCGCGCCGAATTCACCCCTGTA
GAAAG-3' (SEQ ID NO. 57). El cebador 3' contiene 10 bases del extremo 5' de la secuencia de NTN madura humana. NTN madura humana se amplificó por PCR de un clon genómico de NTN humana que contenía NTN madura de longitud total (pNS1n.NTNgenoma, véase el ejemplo 1) usando los siguientes cebadores: cebador 5': 5'-GGTGAATTCGGCGCGGTTGGGGGCGCGGCCT-3' (SEQ ID. No. 54) y cebador 3': 5'-TATACTCGAGTCA
CACGCAGGCGCACTCGC-3' (SEQ ID NO. 55). El cebador 5' contiene 10 bases del extremo 3' de la secuencia IgSP. La secuencia IgSP-NTN madura humana se generó mediante PCR solapante usando los fragmentos de PCR de IgSP y NTN madura humana (descritos anteriormente) como moldes y los siguientes cebadores: cavador 5': 5'-TA
TAGGATCCGCCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATC-3' (SEQ ID NO 56) y cebador 3': 5'-TATACTCGAGTCA
CACGCAGGCGCACTCGC-3' (SEQ ID NO. 55). El fragmento final de PCR que contiene IgSP fusionado a NTN madura humana se digirió con BamHI y XhoI y se clonó entre los sitios BamHI y XhoI de pHR'-CMV.SIN.PLT7.WPRE (descrito anteriormente) y pSN1n (descrito anteriormente). La secuencia de nucleótidos y el polipéptido codificado se muestran en la figura 13.

pNS1n-dpro-NTN: Se generó la secuencia de ADN delta-pro-NTN humana en una reacción de PCR usando un clon genómico de NTN humana que contenía NTN madura de longitud total (pNS1n.NTNgenoma, véase el ejemplo 1) como molde y los siguientes cebadores: cebador 5': 5'-TATAGGATCCGCCACCATGCAGCGCTGGAAGGCGGCGG
CCTTGGCCTCAGTGCTCTGCAGCTCCGTGCTGTCCGCGCGGTTGGGGGCGCGG-3' (SEQ ID NO. 62) y cebador 3': 5'-TATACTCGAGTCACACGCAGGCGCACTCGC-3' (SEQ ID NO. 55). El fragmento de PCR delta-pro-NTN se digirió con BamHI y XhoI y se clonó entre los sitios BamHI y XhoI de pSN1n (descrito anteriormente). La secuencia de nucleótidos y el polipéptido codificado de deltaproNTN se muestran en la figura 14.

Producción de vectores de lentivirus. Se generaron partículas de virus deficientes en replicación de cada uno de las diferentes construcciones de vectores de transferencia con pMD.G (vector VSV-G de pseudotipado) y pBR8.91 (vector de empaquetamiento) (Zufferey et al., 1997) en células 293T proporcionando las proteínas víricas requeridas en trans. Brevemente, se siembran células 293T cultivadas en DMEM con glucosa 4,5 g/l y Glutamax^{TM} (Invitrogen) suplementado con SFT (Life Technologies) al 10% en 20 botellas T75 (2x10^{6} células/botella) el día antes de la transfección. Para cada botella T75 las células se transfectaron con 5 \mug de pMD.G, 15 \mug de pBR8.91 y 20 \mug de vector de transferencia usando Lipofectamina+^{TM} (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recoge el sobrenadante celular que contiene virus 2-3 días después de la transfección, se esterilizan por filtración a través de un filtro de 0,45 \mum de acetato de celulosa o polisulfónico y se concentran mediante ultracentrifugación a 50.000xg durante 90 minutos a 4ºC. Después de una segunda ronda de ultracentrifugación, el precipitado de virus concentrado se resuspende en DMEM, se hacen alícuotas y se almacena a -80ºC. Para determinar el título del virus, se ensaya la actividad transcriptasa inversa (RT) (Cepko y Pear, Current Protocols in Molecular Biology, 9.13.5-6, suplemento 36) y se calculan las unidades de transducción (UT)/ml a partir de la actividad RT determinada usando como referencia un lentivirus con EGFP con actividad de transducción conocida.

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Ejemplo 4

Análisis de proteínas NTN expresadas

Cultivo de células. ARPE-19, una línea celular epitelial pigmentosa retiniana humana que surge espontáneamente (Dunn et al., 1996), se hizo crecer en medio que consistía en DMEM/mezcla nutriente F-12 con Glutamax (Invitrogen, Dinamarca) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Sigma-Aldrich, Dinamarca). Las células HiB5 (Renfranz et al. 1991), HEK293 y CHO se hicieron crecer en DMEM (Invitrogen, Dinamarca) con suero bovino fetal al 10% (Sigma-Aldrich, Dinamarca) y el medio para las células CHO estaba suplementado además con L-prolina 20 mg/l. Las células ARPE están disponibles de la ATCC (número de acceso CRL-2302). Las células ARPE-19, HEK293 y CHO se hicieron crecer a 37ºC y las células HiB5 a 33ºC en CO_{2} al 5%.

Estudios de transfección transitoria. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (Corning Costar, Biotech Line, Dinamarca) a una densidad de aproximadamente 10^{5} células/pocillo. Al día siguiente, las células se transfectaron en pocillos triplicados con los diferentes plásmidos de expresión. Las células ARPE-19 se transfectaron usando Fugene6 y 3 \mug de plásmido/pocillo, mientras que las otras tres líneas celulares se transfectaron en pocillos triplicados usando 2 \mug de plásmido/pocillo y Lipofectamina Plus (Invitrogen, Dinamarca) según las especificaciones del fabricante. Al día siguiente se añadió medio fresco a los pocillos y las células se incubaron durante 24 horas más antes de coger el medio condicionado y recoger las células. Se aseguró una eficacia de transfección suficiente mediante evaluación de la expresión de EGFP en pocillos transfectados en paralelo con el mismo vector que contenía el ADNc para EFGP.

Inmunotransferencia de NTN. Las células se lavaron en PBS y se lisaron en tampón de carga (SDS al 2%, DTT 100 mM, Tris 60 mM, pH 7,5, azul de bromofenol) caliente a 96ºC. Se añadió tampón de carga concentrado 5X a los medios condicionados. En algunos experimentos, se capturó NTN por GFR\alpha2 de medio condicionado. Esto se hizo incubando las muestras durante 3 horas en placas de ELISA que se habían recubierto con anti-Fc humana de cabra (Jackson ImmunoResearch, EE. UU.) en Na2CO3/NaHCO3 50 mM, pH 9 durante la noche seguido por bloquear durante 1 hora en BSA al 1% en PBS y posteriormente incubar con proteína de fusión GFR\alpha2-Fc (R&D Systems, RU) en PBS con HSA al 0,1% durante 1 hora. Después de incubar con las muestras, los pocillos se lavaron en PBST y se añadió tampón de carga a 96ºC. Las muestras se hirvieron durante 5 minutos y después se sometieron a electroforesis en geles de SDS en gradiente del 8-18%, que se electrotransfirieron a membranas de PVDF. NTN se detectó usando anticuerpo policlonal de NTN (#AF477, R&D Systems, RU) diluido 1:5000 seguido por anticuerpo anti-cabra unido a HRP. Las bandas se detectaron mediante quimioluminiscencia usando el sistema ECL+ (Amersham Life
Science).

ELISA de GFR\alpha1/GFR\alpha2. El ELISA de GFR\alpha2 detecta la unión de un conjugado Ret-fosfatasa alcalina (Ret-AP) (Sanicola et al. 1997) a un complejo de NTN unido al receptor GFR\alpha2. Brevemente, se recubrió una placa Opti-plate (Packard Instruments, Perkin Elmer, Dinamarca) con 100 \mul de anti-Fc humana de cabra (Jackson Immunoresearch Labaratories, TriChem, Dinamarca) 1 \mug/ml en NaHCO_{3} 50 mM (pH = 9,6) durante 16 horas a 4ºC. Después de lavar en PBST, los pocillos se bloquearon en I-Block (Tropix, Roche, Dinamarca) al 0,2% en PBST durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por un breve lavado en PBST. Posteriormente las muestras de células productoras de NTN y diluciones del estándar de NTN recombinante (R&D Systems, RU) en medio de crecimiento de ARPE-19 se incubaron en los pocillos con proteína de fusión GFR\alpha2/Fc (R&D Systems, RU) 1 \mug/ml en medio condicionado de células EBNA 293 que expresan la proteína de fusión Ret-AP (un amable regalo de Biogen Idec, EE. UU.) durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron después primero en PBST y después en tampón AP (Tris 200 mM (pH = 9,8), MgCl_{2} 10 mM) seguido por 30 minutos de incubación con Sapphire Enhancer (Tropix, Roche, Dinamarca) al 10% y CSPD (Tropix, Roche, Dinamarca) al 2% en tampón AP. Se cuantificó la luminiscencia usando un contador Microbeta Trilux (Perkin Elmer, Dinamarca). Se midió la actividad de unión de GFR\alpha1 en medio condicionada de forma similar, pero con proteína de fusión GFR\alpha1/Fc (R&D Systems, RU) 1 \mug/ml añadida en lugar de GFR\alpha2/Fc. Se calculó la actividad relativa de unión a GFR\alpha2/Fc en muestras usando una curva patrón de NTN recombinante y con valores de células transfectadas con la construcción wt ajustado a 1.

ELISA de NTN. Se recubrieron placas Maxisorp (Nunc, Dinamarca) mediante incubación con anticuerpo monoclonal anti-NTN humana (#MAB387, R&D Systems, RU) 1 \mug/ml en solución de recubrimiento (Na_{2}CO_{3} 2,5 mM/NaHCO_{3} 2,5 mM, pH 8,2) durante 16 horas a 4ºC. Después de lavar en PBST (Tween-20 (Sigma-Aldrich, Dinamarca) al 0,05% en PBS), los pocillos se bloquearon en tampón de bloqueo (seroalbúmina bovina (Sigma-Aldrich, Dinamarca) al 1% y sacarosa al 5% en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar en PBST, los pocillos se incubaron con muestras diluidas de medio de las células productoras de NTN durante 3 horas a temperatura ambiente. Se usó NTN recombinante (#387-NE, R&D Systems, RU) como estándar. Se añadió anticuerpo policlonal anti-NTN humano (#AF387, R&D Systems, RU) 1 \mug/ml en tampón de bloqueo a los pocillos y se incubó durante 16 horas a 4ºC. Después de lavar en PBST, los pocillos se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en anti-cabra-HRP (DAKO, Dinamarca) al 0,02% en tampón de bloqueo suplementado con suero normal de ratón (DAKO, Dinamarca) al 1%. Después de lavar en PBST, se añadió solución sustrato TMB (Promega, Ramcon, Dinamarca) y la formación de color se paró mediante adición de HCl 1 N después de 15 minutos. Se midió la A_{450} usando un lector de placas ELX-800 (Cambrex, Dinamarca).

Expresión de NTN in vitro . NTN humana codifica una prepro-proteína de 197 aminoácidos (aa) con un putativo péptido señal de 19 aa, seguido por una región pro de 76 aa. Pro-NTN se corta proteolíticamente en la secuencia RXXR para generar la NTN madura de 102 aa. Para caracterizar la influencia de la parte pre-pro en la secreción de NTN activa, se hicieron diferentes construcciones (figura 15A). Como el GDNF biológicamente activo se secreta fácilmente de varios tipo celulares después de transfección, se hizo una construcción de NTN con la parte pre-pro de GDNF (ppG-NTN). Además se establecieron dos construcciones sin la parte pro, una con el péptido señal de NTN wt (dpro-NTN) y uno con IgSP (IgSP-NTN). Las construcciones de ADN se subclonaron en el vector de expresión de mamíferos pNS1n y se transfectaron de forma transitoria en células HEK293, células CHO, la línea celular de hipocampo de rata HiB5 o la línea celular epitelial retiniana humana ARPE-19. Se realizó inmunotransferencia usando un anticuerpo contra NTN en lisados celulares y medio condicionado. La figura 15B muestra los resultados de las células HEK293. Se obtuvieron resultados similares en las otras tres líneas celulares (datos no mostrados). En células transfectadas con wt NTN, se detectó una banda que corresponde en tamaño a pro-NTN monomérica (\sim22 kDa) en lisados celulares así como en medio condicionado. Una banda de menor tamaño que corresponde a NTN con la región pro de GDNF (\sim19,6 kDa) se vio en lisado celular y medio condicionado de células transfectadas con ppG-NTN. De esta manera, las formas pro de NTN se expresan y secretan pero no se procesan a un nivel detectable en las líneas celulares probadas. En células transfectadas con dpro-NTN o IgSP-NTN se vio una banda que corresponde en tamaño con NTN monomérica madura (\sim12,5 kDa) en lisados y medio condicionado. El nivel de NTN era aparentemente mayor cuando se usó la construcción con IgSP que con wt NTN SP.

Después se probó el nivel de NTN en medio condicionado usando un ensayo funcional donde se detecta la unión de NTN a su receptor, GFR\alpha2, mediante la formación un complejo ternario con el correceptor de GFR\alpha Ret (Figura 15C). El medio condicionado de células transfectadas con wt NTN o ppG-NTN mostró niveles bajos de NTN activa (7,5\pm0,6 ng/ml, 1,5\pm0,9 ng/ml, 38,6\pm3,3 ng/ml y 18,3\pm1,7 ng/ml en células HEK293, ARPE-19, HiB5 y CHO, respectivamente). Sin embargo, la actividad de unión a GFR\alpha2 en muestras aumentó cuando se usó la construcción dpro-NTN (90\pm19, 117\pm13, 7,5\pm1,7 y 4,1\pm0,9 más veces de unión de NTN para células HEK293, ARPE-19, HiB5 y CHO, respectivamente). Según los resultados de la inmunotransferencia, la actividad de NTN aumentó más cuando se usó la construcción IgSP-NTN (278\pm13, 771\pm50, 162\pm29 y 66\pm18 más veces de unión de NTN para células HEK293, ARPE-19, HiB5 y CHO, respectivamente). Se obtuvieron resultados similares cuando se realizó el ensayo con el correceptor GFR\alpha1 (datos no mostrados). Los sobrenadantes de las células transfectadas transitoriamente con pNS1n-EGFP mostraron actividad indetectable de NTN confirmando la especificidad de los ensayos (datos no mostrados). También se realizaron inmunotransferencias de NTN en muestras donde NTN de medio condicionado se había unido a placas de ELISA recubiertas con GFR\alpha2-Ig. Cuando se añadió este paso de unión, no se detectaron formas pro de NTN, mientras que se observaron bandas del tamaño de NTN madura en muestras de células transfectadas con la construcción IgSP-NTN y en un menor grado cuando se usó el vector dpro-NTN (figura 15D). Además, se llevó a cabo un ELISA sándwich de NTN en medio condicionado de células transfectadas con las diferentes construcciones de NTN. Se usó un anticuerpo monoclonal de NTN para capturar NTN en placas de ELISA y posteriormente se usó un anticuerpo policlonal de NTN para detectar la NTN capturada. Ambos anticuerpos reconocieron las formas pro de NTN cuando se usaron para inmunotransferencia, pero como se muestra en la figura 15E, las formas pro de NTN no se detectaron en el ELISA de NTN. Este descubrimiento sugiere que la parte pro de NTN previene la unión del anticuerpo a la NTN nativa plegada, pero no a NTN desnaturalizada. El ELISA sándwich de NTN confirmó que intercambiar el SP de NTN wt con IgSP aumenta el nivel de NTN en medio condicionado (2-8 veces, dependiendo de la línea celular).

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Ejemplo 5

Terapia génica in vivo en un modelo de enfermedad de Parkinson

Procedimientos quirúrgicos. Se usaron un total de 24 ratas hembras jóvenes adultas Sprague-Dawley (Møllegaarden, Dinamarca) y se enjaularon en un ciclo de 12 horas de luz:oscuridad con acceso libre a pienso de rata y agua. Las inyecciones de virus y lesión por 6-OHDA se realizaron según Rosenblad et al (2000) con ligeras modificaciones. Brevemente, con anestesia de isofluorano (del 1,5-2%) se inyecto a los animales vector rLV (3x10^{5} UT/animal) que contenía el ADNc de GFP, hNTN, mNTN, IgSP-hNTN o GDNF (n = 5-7/grupo). Se hicieron cuatro depósitos (0,75 \mul/depósito) en el cuerpo estriado a lo largo de los tramos de dos agujas en las siguientes coordenadas AP = 1,0 mm, ML = -2,6 mm, DV_{1} = -5,0 mm DV_{2} = -4,5 mm y AP = 0,0 mm, ML = -3,7 mm, DV_{1} = -5,0 mm, DV_{2} = -4,5 mm. La barra dentada se ajustó a -2,3 mm. 14 días después de las inyecciones con rLV los animales se volvieron a anestesiar y se inyectó con una jeringuilla Hamilton de 10 \mul un único depósito de 20 \mug de 6-OHDA (Sigma; calculado como base libre y disuelta en 3 \mul de solución salina helada suplementada con ácido ascórbico al 0,02%) en el cuerpo estriado derecho en las siguientes coordenadas AP = 0,5 mm; ML = -3,4 mm; DV = -5,0 mm relativo a la duramadre y la barra dentada se ajustó a 0,0 mm. La velocidad de inyección fue de 1 \mul/min y la pipeta de vidrio se dejó en el lugar durante 3 minutos más antes de retirarla.

Rotación inducida por anfetamina. 10 días después de las inyecciones de rLV y de nuevo 4 semanas después de las inyecciones de 6-OHDA, se inyectó anfetamina (2,5 mg/kg, Mecobenzon, DK) a las ratas y se controlaron para respuesta de giro en recipientes rotómeros automatizados durante 90 minutos. Las puntuaciones de asimetría rotacional se expresan como giros netos de 90º por min y las rotaciones ipsilaterales (es decir, hacia el sitio inyectado) se asignaron como valor positivo.

Histología. 28 días después de la inyección de 6-OHDA los animales se anestesiaron profundamente con pentobartital de sodio y se perfundieron transcardiacamente con solución salina durante un minuto seguido por 200 ml de PFA helado al 4% en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4). Los cerebros se disecaron y posfijaron en el mismo fijador durante 3-4 horas y después se transfirieron a sacarosa al 25%/tampón fosfato 0,1 M durante 48 horas. Se cortaron seis series de secciones de 40 \mum en un microtomo de congelación. Se realizó la inmunohistoquímica como se ha descrito previamente (Rosenblad et al. 2003). Brevemente, se incubaron las secciones con anticuerpo primarios anti-hNTN de cabra o anti-hGDNF de cabra diluidos 1:2000 (R&D Systems, RU), anti-GFP de pollo, anti-TH de ratón o anti-VMAT de conejo diluidos 1:2000 (Chemicon) en solución salina tamponada con fosfato que contenía suero normal de caballo o cerdo al 2% y Triton X-100 al 0,25% seguido por incubación con anticuerpo secundario biotinilado apropiado (Jackson Immunoresearch, EE. UU.) durante 2 horas, y kit del complejo avidina-biotina (ABC) según las instrucciones del fabricante (Vector Laboratories, EE.UU.). Por último, la reacción de color se desarrolló usando 3',3'-diaminobencidina como cromógeno.

Análisis morfométrico. Cuantificación del número de células inmunorreativas con TH o VMAT en el SN. Un observador sin conocer el estudio evaluó el número de neuronas inmunorreactivas en la SN pars compacta, como se ha descrito previamente (Sauer y Oertel, 1994). Brevemente, se usaron tres secciones consecutivas centradas en el nivel del núcleo terminal medial de la vía óptica (MTN, -5,3 en el atlas de Paxinos y Watson, 1997) y se contaron todas las neuronas teñidas laterales al MTN a 40x aumentos. Los números de células se expresan como la media \pm EEM del porcentaje del número en el lado intacto.

Medidas de la densidad de fibra estriatal. Se evaluó la inervación DA estriatal midiendo la densidad óptica (DO) del cuerpo estriado a tres niveles rostrocaudales en secciones teñidas para TH. Se recogieron imágenes digitalizadas usando una cámara digital Olympus DP50 y una mesa de iluminación constante. Se midió la DO en el lado intacto y lesionado usando software ScanImage v. 4.02. Se usó el cuerpo calloso en cada sección como referencia para la tinción de fondo.

Neuroprotección in vivo en el modelo de lesión por 6-OHDA en rata. Después, se quiso investigar hasta qué punto la construcción IgSP-NTN también podría dar secreción sostenida de NTN activa in vivo. Por lo tanto, se generaron vectores de lentivirus recombinantes que codificaban pre-pro-NTN wt (rLV-wtNTN) y IgSP-NTN (rLV-IgSPNTN) y se probó si eran capaces de proporcionar neuroprotección en un modelo animal de EP donde previamente se había mostrado que las inyecciones de proteína NTN prevenían la pérdida de neuronas DA (Horger et al., 1998; Rosenblad et al., 1999). Se usaron vectores que codifican proteína fluorescente verde (GFP; rLV-GFP) o GDNF (rLV-GDNF) como vectores de control negativo y positivo, respectivamente.

Localización inmunohistoquímica de la expresión del transgén

La inspección de secciones de animales tratados con rLV-GFP mostró una columna de células transducidas, aproximadamente 2 x 0,5 mm, en la cabeza central del putamen caudado (Fig. 16A). La mayoría de las células transducidas tenían morfologías de neuronas estriatales de proyección espinosa y tamaño medio. En un menor grado se vieron células con morfología astroglial en el cuerpo estriado y oligodendroglía en el cuerpo calloso suprayacente. Las células que expresan GFP mostraron un patrón de expresión intracelular distinto. Al contrario, las secciones a través del cuerpo estriado y sustancia negra de animales tratados con rLV-GDNF y procesadas para inmunohistoquímica de GDNF mostraron una tinción difusa en el cuerpo estriado, consiste con la secreción de GDNF de las células transducidas (Fig. 16C). En animales que recibieron inyecciones de rLV-wtNTN, la inmunohistoquímica de NTN no mostró inmunorreactividad extracelular en la vecindad de células estriatales transducidas con rLV-wtNTN (Fig. 16B). A más aumentos se observaron unas pocas células inmunorreactivas para NTN con tinción citoplásmica puntuada junto con la vía de inyección (Fig. 16E). Por el contrario, los animales que recibieron inyecciones de rLV-IgSP-NTN tenían tinción difusa prominente (extracelular) en el cuerpo estriado (Fig. 16D), similar a la vista en animales tratados con GDNF y consistente con la secreción. También se observaron perfiles celulares inmunorreactivos a NTN en animales inyectados con rLV-IgSP-NTN, pero la mayoría del material inmunorreactivo estaba localizado extracelularmente (Fig. 16F). En animales que recibieron rLV-GDNF así como rLV-IgSP-NTN hubo un marcaje prominente con los respectivos anticuerpos en la sustancia negra pars reticulata (datos no mostrados y Fig. 16G). La densa red de fibras inmunorreactivas aparentemente se originó de las proyecciones estriatonígricas ya que se pudieron seguir rostralmente al cuerpo estriado. Este resultado sugiere que NTN se puede transportar anterógradamente en la vía nigroestriada desde el cuerpo estriado, como ya se ha descrito para GDNF (Rosenblad et al., 1999).

4 semanas después de la lesión intraestriatal con 6-OHDA, se evaluó el número de neuronas nígricas dopaminérgicas restantes contando las neuronas que expresan TH (figura 17A y figura 18). En animales control tratados con rLV-GFP claramente se vieron menos neuronas inmunorreactivas (IR) a TH en la sustancia negra en el lado de la lesión (23\pm3,4%) comparado con el lado contralateral intacto (Fig. 17A y 18D). De forma similar, los animales que recibieron rLV-NTN (Fig. 17A y 18B) mostró una marcada reducción inducida por la lesión en las neuronas IR-TH (30\pm7,7% restantes). Por el contrario, el grupo tratado con rLV-IgSP-NTN tenía un porcentaje significativamente mayor de neuronas IR-TH en el lado de lesión (91\pm1,2%; p<0,01) (Fig. 17A y 18C), que era indistinguible de la observada en el grupo que recibió el tratamiento de GDNF (86\pm3,2%; p<0,01) (Fig. 17A y 18H).

Para confirmar que las diferencias en el número de neuronas nígricas IR-TH no era debido a la regulación de la enzima TH se cuantificó en secciones adyacentes el número de neuronas IR-VMAT, que se ha mostrado que es menos propensa a regulación por estos factores neurotróficos (Rosenblad et al. 2003; Georgievska et al, 2002; Kink et al, 2001). Como se muestra en la figura 17B, la transducción con rLV-IgSPNTN o rLVGDNF conservó significativamente el número de neuronas IR-VMAT en la sustancia negra en el lado de la lesión (75,2\pm6,8% y 59,9\pm4,2% de ese en el lado intacto, respectivamente) comparado con animales tratados con rLV-GFP o rLV-NTN (15,5\pm2,4% y 24,9\pm6,4%, respectivamente), corroborando los resultados vistos con la tinción de TH.

Además de la protección a las neuronas IR-TH e IR-VMAT en la sustancia negra, fue evidente que en muestras de animales tratados con rLV-IgSPNTN, la intensidad de la tinción de TH se reducía en muchas neuronas restantes de la sustancia negra (Fig. 18G) comparada con las neuronas IR-TH en el lado intacto (Fig. 18E) o el lado lesionado de animales tratados con rLV-GFP o rLV-wtNTN (Fig. 18F). También se vio intensidad de tinción de TH reducida después de tratamiento con GDNF, consistente con artículos previos (Georgievska et al, 2002) y un observador familiar con los signos de este fenómeno pero sin conocer las muestras fue incapaz de distinguir la reducción "como de GDNF" en los animales tratados con IgSPNTN de la vista después de la administración de GDNF.

La inspección de secciones a través del cuerpo estriado procesado para inmunohistoquímica de TH mostró que en todos los grupos el caudado-putamen central y lateral carecía de fibras IR-TH en el lado inyectado con 6-OHDA. La cuantificación densitométrica de la inervación IR-TH en el lado lesionado mostró que el 15-25% permanecía a las 4 semanas. Esto está de acuerdo con estudios anteriores en el modelo de lesión intraestriatal por 6-OHDA (Rosenblad et al. 1999; Georgievska et al, 2002) que muestra que la recuperación de inervación estriatal IR-TH necesita más de cuatro semanas después de la lesión para desarrollarse. Consecuentemente, la rotación inducida por anfetamina, que se puede usar como una medida sensible de la denervación de dopamina en el cuerpo estriado (Kirik et al., 1998), no mostró diferencia significativa en el número de giros ipsilaterales entre ninguno de los grupos de tratamiento 4 semanas después de la lesión (que variaba desde 4,5\pm1,5 hasta 13,4\pm3,3 giros ipsilaterales netos/minuto; p>0,05 ANOVA bidireccional de medidas repetidas). Los giros inducidos por anfetamina evaluados 10 días después de la transducción vírica pero antes de la lesión con 6-OHDA mostraron un sesgo ligero pero no significativo del giro contralateral en el grupo IgSPNTN (3,3\pm1,5) y de GDNF (1,9\pm1,3), comparado con los grupos rLV-GFP o rLV-NTN (0,1\pm0,9 y -0,1\pm1,6, respectivamente), consistente con un aumento de la función de DA en el lado transducido con IgSP-NTN similar a lo que previamente se ha descrito que sucede después del tratamiento con GDNF (Georgievska et al, 2002; Georgievska et al, 2003).

En conjunto estos resultados indican que la secreción de NTN de un vector de lentivirus puede aumentar significativamente mediante eliminación de la región pro y sustitución del péptido señal salvaje por uno heterólogo. La secreción aumentada de NTN también se vio in vivo en células estriatales transducidas y permitió por primera vez la neuroprotección eficaz de neuronas nígricas de dopamina lesionadas in vivo usando un planteamiento de distribución de lentivirus, similar a lo que se ha descrito previamente para GDNF.

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Lista de referencias (ejemplos 3-5)

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Ejemplo 6

Predicciones de procesamiento de péptido señal usando SignalP 3.0 Predicciones de posiciones para corte de péptido señal usando SignalP versión 3.0. Las predicciones se llevaron a cabo usando deltaproNTN, IgSP-NTN y NTN con péptidos señal de varios factores de crecimiento Moléculas quiméricas con péptido señal de NTN (deltaproNTN)

4

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Moléculas quiméricas con péptido señal de inmunoglobulina (IgSP-deltaproNTN):

5

6

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Moléculas quiméricas factor de crecimiento-NTN (factor de crecimiento SP-deltaproNTN)

7

8

9

10

200

201

<110> NsGene A/S

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Tornøe, Jens

\hskip1cm

Rosenblad, Carl

\hskip1cm

Wahlberg, Lars

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<120> Terapia génica in vivo de la enfermedad de Parkinson

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<130> 513-204-WO

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<150> DK PA 2003 01543

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<151> 20/10/2003

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<150> US 06/512.918

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<151> 22/10/2003

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<160> 62

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

11

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<210> 2

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Macaca mulatta

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<400> 2

12

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<210> 3

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Callithrix jacchus

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<400> 3

13

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<210> 4

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 4

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14

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<210> 5

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Sus scrofa

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<400> 5

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15

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<210> 6

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Rattus norvegicus

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<400> 6

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16

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<210> 7

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<211> 309

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(309)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> PROPEP

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..(95)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96)..(96)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> A -> S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<223> (96)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

26

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (96)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 392

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(379)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(73)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (74)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

32

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 484

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IgSP (ratón) - NTN madura (ser humano)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(57)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (137)..(453)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)..(147)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (148)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

33

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> IgSP (ratón) - NTN madura (ser humano)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mIgSP-hNTN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mIgSP-hNTN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mIgSP-hNTN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mIgSP-hNTN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mIgSP-hNTN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> mIgSP-hNTN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

42

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

48

\hskip1.5cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> señal mNGF, hNTN madura

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> señal mGDNF, hNTN madura

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(39)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (40)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> SEÑAL

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

72

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 602

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(571)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido señal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(91)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido señal de GDNF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (92)..(265)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región pro de GDNF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido maduro

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (266)..()

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido NTN maduro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

74

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (92)..(265)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región pro de GDNF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

76

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\hskip1cm

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip1cm

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\hskip1cm

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\hskip1cm

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\hskip1cm

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\hskip1cm

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\hskip1cm

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\hskip1cm

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\hskip1cm

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\hskip1cm

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador de PCR

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Claims

1. Un vector vírico de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión de un polipéptido codificado, dicho polipéptido comprende un péptido señal capaz de funcionar en una célula de mamífero y una neurturina bioactiva seleccionada del grupo que consiste en neurturina madura y una variante de secuencia bioactiva que tiene al menos el 70% de identidad de secuencia a la neurturina truncada N-terminalmente de SEQ ID NO 9; en donde la secuencia de polinucleótido no codifica un región pro de neurturina.

2. El vector de la reivindicación 1, en donde el péptido señal es el péptido señal de NGF.

3. El vector de la reivindicación 1, en donde el péptido señal es el péptido señal de GDNF.

4. El vector de la reivindicación 1, en donde el péptido señal es el péptido señal de persefina.

5. El vector de la reivindicación 1, en donde el péptido señal es el péptido señal de neublastina.

6. El vector de la reivindicación 1, en donde el péptido señal se selecciona del grupo que consiste en: péptido señal de NGF humano de SEQ ID NO. 40, péptido señal de NGF murino de SEQ ID NO. 41, péptido señal de GDNF humano de SEQ ID NO. 42, péptido de GDNF murino de SEQ ID NO. 43.

7. El vector de la reivindicación 1, en donde el péptido señal es un péptido señal de la inmunoglobulina (IgSP).

8. El vector según la reivindicación 6, en donde el IgSP se selecciona del grupo que consiste en IgSP murino de SEQ ID NO 4, IgSP de rata de SEQ ID NO 6, IgSP porcino de SEQ ID NO 5, IgSP de mono de SEQ ID NO 2 ó 3, IgSP humano de SEQ ID NO 1.

9. El vector de la reivindicación 8, en donde el IgSP es IgSP murino de SEQ ID NO 4.

10. El vector de la reivindicación 8, en donde el IgSP es IgSP humano de SEQ ID NO 1.

11. El vector según la reivindicación 1, el vector se selecciona del grupo que consiste en VIH, SIV, FIV, EIAV, AAV, adenovirus, retrovirus, herpesvirus.

12. El vector según la reivindicación 1, en donde el vector es una partícula de lentivirus deficiente en replicación.

13. El vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 12, en donde el promotor capaz de dirigir la expresión de dicho polipéptido se selecciona del grupo que consiste en: promotor de ubiquitina, promotor de CMV, promotor JeT, promotor de SV40, promotor del factor de elongación alfa 1 (EF1-alfa).

14. El vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 13, en donde el promotor es un promotor inducible/represible, tales como: Tet-On, Tet-Off, promotor inducible por rapamicina, Mx1.

15. El vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 14, que comprende además una secuencia potenciadora de expresión, tal como el elemento de regulación postranscripcional de virus de la hepatitis de marmota, WPRE, SP163, intrón de insulina II de rata u otros intrones, potenciador de CMV y aislador de [beta]-globina de pollo u otros aisladores.

16. El vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 15, que comprende además una secuencia que codifica para la proteína recombinasa Cre y secuencias LoxP.

17. Una composición farmacéutica que comprende el vector según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 16 y uno o más adyuvantes, excipientes, soportes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

18. Una célula huésped aislada diferente de una célula embrionaria humana y diferente de una célula germinal humana, dicha células huésped transducida con el vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 16.

19. La célula huésped de la reivindicación 18, que es una célula huésped de mamífero.

20. La célula huésped de la reivindicación 19, en donde dicho mamífero se selecciona del grupo que consiste en roedor (ratón, rata), conejo, pero, gato, cerdo, mono, ser humano.

21. La célula huésped de la reivindicación 19, que se selecciona del grupo que consiste en CHO, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, células neuronales, células fetales, ARPE-19, C2C12, HeLa, HepG2, células estriatales, neuronas, astrocitos, interneuronas.

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22. Una línea celular empaquetadora que produce una partícula infectiva de vector que comprende la secuencia de polinucleótido como se define en la reivindicación 1, dicha partícula de vector comprende un genoma derivado de retrovirus que comprende una LTR 5' retrovírica, un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento y una LTR 3' retrovírica.

23. La línea celular empaquetadora según la reivindicación 22, en donde la partícula de vector es deficiente en replicación.

24. La línea celular empaquetadora según la reivindicación 23, en donde el genoma deriva de lentivirus y las LTR son de lentivirus.

25. Un mamífero no humano que comprende al menos una célula transducida con el vector de cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 16.

26. El mamífero de la reivindicación 25, en donde la al menos una célula transducida comprende el genoma del mamífero.

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27. Un dispositivo implantable de cultivo celular, el dispositivo comprende:

i.: una membrana semipermeable que permite la difusión de un factor de crecimiento a través de la misma y

ii.: al menos una célula huésped aislada como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes 18 a 21.

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28. El dispositivo de la reivindicación 27, en donde la membrana semipermeable es inmunoaislante.

29. El dispositivo de la reivindicación 27, en donde la membrana semipermeable es microporosa.

30. El dispositivo de la reivindicación 27, en donde el dispositivo comprende además una matriz dispuesta dentro de la membrana semipermeable.

31. El dispositivo de la reivindicación 27, en donde el dispositivo es capaz de secretar más de 10 ng de neurturina biológicamente activa cada 24 horas.

32. El dispositivo de la reivindicación 27, en donde el dispositivo comprende además un anclaje atadura.

33. Una cápsula biocompatible que comprende: un núcleo que comprende células empaquetadoras vivas que secretan un vector vírico para la infección de una célula diana, en donde el vector vírico es un vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16; y un recubrimiento externo que rodea dicho núcleo, dicho recubrimiento comprende un material biocompatible permeable, dicho material tiene una porosidad seleccionada para permitir el paso de vectores retrovíricos de aproximadamente 100 nm de diámetro a través del mismo, lo que permite la liberación de dicho vector vírico de dicha cápsula.

34. La cápsula de la reivindicación 33, en donde el núcleo comprende además una matriz, estando las células empaquetadoras inmovilizadas por la matriz.

35. La cápsula de la reivindicación 33, en donde el recubrimiento comprende un hidrogel o material termoplástico.

36. El vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para su uso como un medicamento.

37. Uso del vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso.

38. El uso de la reivindicación 37, en donde el trastorno del sistema nervioso es un trastorno del SNC.

39. El uso de la reivindicación 37, en donde el trastorno del SNC es una enfermedad neurodegenerativa.

40. El uso de la reivindicación 39, en donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad neurodegenerativa que implica neuronas lesionadas y traumáticas, tales como lesiones traumáticas de nervios periféricos, el bulbo, la médula espinal, daño neuronal isquémico cerebral, neuropatía, neuropatía periférica, dolor neuropático, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, deficiencia de memoria relacionado con demencia.

41. El uso de la reivindicación 39, en donde la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson.

42. El uso de la reivindicación 39, en donde la enfermedad neurodegenerativa es lesión de la médula espinal.

43. El uso de la reivindicación 39, en donde la enfermedad neurodegenerativa es esclerosis lateral amiotrófica.

44. El uso de la reivindicación 39, en donde la enfermedad es una enfermedad ocular, tal como retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma, retinopatía diabética.