ES2342625T3 - Mezcla de oligosacaridos. - Google Patents
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Abstract
Una mezcla de oligosacáridos que comprende un 5-70% en peso de al menos un oligosacárido N-acetilado seleccionado de entre el grupo que comprende GalNAcα1,3Galβ1,4Glc y Galβ1,6GalNAcαl,3Galβ1,4Glc, 20-90% en peso de al menos un oligosacárido neutral seleccionado de entre el grupo que comprende Galβ1,6Gal, Galβ1,6Galβ1,4Glc Galβ1,6Galβ1,6Glc, Galβ1,3Galβ1,3Glc, Galβ1,3Galβ1,4Glc, Galβ1,6Galβ1,6Galβ1,4Glc, Galβ1,6Galβ1,3Galβ1,4 Glc Galβ1,3Galβ1,6Galβ1,4Glc y Galβ1,3Galβ1,3Galβ1,4Glc y 5-50% en peso de al menos un oligosacárido sialilado seleccionado de entre el grupo que comprende NeuAcα2,3Galβ1,4Glc y NeuAcα2,6Galβ1,4Glc.
Description
Mezcla de oligosacáridos.
La invención está relacionada con una mezcla de
oligosacáridos, productos alimenticios que comprenden dicha mezcla
de oligosacáridos y los procesos para producir dicha mezcla de
oligosacáridos.
El colon humano está colonizado con un amplio
rango de bacterias que poseen efectos positivos y negativos sobre
la fisiología del intestino así como otras influencias sistémicas.
Los grupos predominantes de bacterias encontrados en el colon
incluye los bacteroides, bifidobacterias, eubacterias, clostridia y
lactobacilos. Las bacterias presentes presentas actividades
fluctuantes en respuesta a la disponibilidad de sustrato, potencial
redox, pH, tensión de O_{2} y distribución en el colon. En general
las bacterias intestinales pueden dividirse en especies que ejercen
tanto un potencial dañino como efectos beneficiosos sobre el
huésped. Los efectos patogénicos (que pueden estar provocados por
clostridia o bacteroides, por ejemplo) incluye diarrea, infecciones,
daño hepático, carcinogénesis y putrefacción intestinal. Los
efectos saludables pueden estar provocados por la inhibición del
crecimiento de bacterias dañinas, estimulación de las funciones
inmunitarias, mejora de la digestión y absorción de nutrientes
esenciales y síntesis de vitaminas. Es deseable un aumento en el
número y/o actividad de los grupos de bacterias (como
Bifidobacterium y Lactobacillus) que pueden tener
propiedades saludables.
En particular, respecto a los bebés,
inmediatamente antes del nacimiento, el tracto gastrointestinal de
un bebé se cree que es estéril. Durante el parto, comienza la
colonización al encontrar bacterias del tracto digestivo y de la
piel de la madre. Existen grandes diferencias respecto a la
composición de la microbiota de los intestinos en respuesta a la
alimentación del niño. La flora fecal de los lactantes incluye
poblaciones apreciables de Bifidobacterias con algunas especies de
Lactobacillus, mientras que los bebés alimentados con
preparados poseen una microbiota más compleja, con
Bifidobacterias, Bacteroides, Clostridia y Streptococcos
presentes. Después del destete, se establece un patrón de microbiota
intestinal similar al patrón en el adulto.
Se recomienda la leche materna para todos los
bebés. No obstante, en algunos casos la lactancia maternal es
inadecuada o sin éxito por razones médicas o porque la madre decide
no amamantar. Los preparados infantiles se han desarrollado para
estas situaciones.
Una aproximación para promover el número y/o
actividad de las bacterias beneficiosas en el colon es la adición
de prebióticos a los productos alimenticios. Un prebiótico es un
ingrediente alimenticio no digerible que afecta de forma
beneficiosa al huésped mediante la estimulación selectiva del
crecimiento y/o actividad de uno o un número limitado de bacterias
en el colon, y mejora de esta manera la salud del huésped. Tales
ingredientes no son digeribles en el sentido que no se hidrolizan
ni se absorben en el estómago o el intestino delgado y pasan de
esta manera intactos al colon en el que se fermenta de forma
selectiva por las bacterias beneficiosas. Ejemplos de prebióticos
incluye ciertos oligosacáridos, como los fructooligosacáridos (FOS)
y los galactooligosacáridos (GOS).
La leche humana se conoce por contener una gran
cantidad de oligosacáridos indigeribles que la mayoría de leches de
otros animales. De hecho, los oligosacáridos indigeribles
representan el tercer mayor componente sólido (tras la lactosa y
los lípidos) en la leche materna, y aparecen en una concentración de
12-15 g/l en calostro y 5-8 g/l en
la leche madura. Los oligosacáridos de la leche humana son muy
resistentes a la hidrólisis enzimática, lo que indica que estos
oligosacáridos pueden presentar funciones esenciales que no están
relacionadas directamente con su valor calorífico.
Como la composición de la leche humana se
entiende mejor, también se ha propuesto añadir prebióticos a los
preparados para lactantes. Están disponibles en el mercado varios
preparados para lactantes suplementados con prebióticos como
mezclas, de por ejemplo, fructooligosacáridos y
galactooligosacáridos. No obstante, dichas mezclas solo se
aproximan a las mezclas de oligosacáridos en la leche humana. Se han
detectado alrededor de 100 componentes diferentes de oligosacáridos
en la leche humana algunos de los cuales no se han detectado en
absoluto en otras leches animales como la leche de vaca o sólo en
pequeñas cantidades. Ejemplos de clases de oligosacáridos de leche
humana que solo están presentes en la leche de vaca y en el calostro
en muy pequeñas cantidades o nada son los oligosacáridos sialilados
y fucosilados.
La solicitud de patente Estadounidense Nº
2003/0129278 describe una mezcla de oligosacáridos basada en los
oligosacáridos producidos a partir de una o varias leches animales
que se caracterizan en que comprende al menos dos fracciones
de oligosacáridos que están compuestas cada una de al menos dos
oligosacáridos diferentes, sin pertenecer a ellos la lactosa libre.
El espectro total de los oligosacáridos presentes en la mezcla de
oligosacáridos difiere de la presente en la leche animal o leches
animales de las que se extraen las fracciones de oligosacáridos.
Además a) si dichos oligosacáridos se extraen de solo una leche
animal, la proporción de oligosacáridos neutrales respecto a
oligosacáridos acídicos (sialilados) es 90-60:
10-40% peso, o b) si dichos oligosacáridos se
extraen de al menos dos leches animales, los oligosacáridos
extraídos de dos leches animales diferentes representan hasta el
10% en peso de la cantidad total de oligosacáridos presentes en la
mezcla de oligosacáridos.
Un objeto de la invención es proporcionar una
mezcla de oligosacáridos que es efectiva como prebiótico, en
particular en el intestino humano.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto, la invención está relacionada con
una mezcla de oligosacáridos que comprende 5-70% en
peso de al menos un oligosacárido N-acetilado
seleccionado de entre el grupo que comprende
GalNAc\alpha1,3Gal\beta1,4Glc y
Gal\beta1,6GalNAc\alpha1,3Gal\beta1,4Glc,
20-90% en peso de al menos un oligosacárido neutral
seleccionado de entre el grupo que comprende Gal\beta1,6Gal,
Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc Gal\beta1,6Gal\beta1,6Glc,
Gal\beta1,3Gal\beta1,3Glc, Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc,
Gal\beta1,6Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc,
Gal\beta1,6Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc,
Gal\betal,3Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc y
Gal\beta1,3Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc y 5-50%
en peso de al menos un oligosacárido sialilado seleccionado de entre
el grupo que comprende NeuAc\alpha2,3Gal\beta1,
4Glc y NeuAc\alpha2,6Gal\beta1,4Glc.
4Glc y NeuAc\alpha2,6Gal\beta1,4Glc.
Este ingrediente es un nuevo ingrediente
protector e inmunomodulador que es particularmente efectivo como
prebiótico. La mezcla es estructuralmente próxima a los
oligosacáridos de la leche materna humana que los ingredientes
prebióticos disponibles comercialmente, como FOS y GOS, por ejemplo
en los que se incluye una mezcla de oligosacáridos acídicos y
neutrales.
En una realización, la mezcla de oligosacáridos
puede derivar de leche animal, como una o más leche de vaca, cabra
o búfala.
En otro aspecto, la invención está relacionada
con un producto alimenticio que comprende una mezcla de
oligosacáridos como se ha descrito antes. Opcionalmente el producto
alimenticio es un preparado para lactantes, pero el producto puede
ser cualquier comida o bebida consumida por los bebés, niños o
adultos. El consumo de un producto alimenticio que contiene dicha
mezcla de oligosacáridos como prebiótico promoverá de forma
selectiva el crecimiento y/o actividad de una o un número limitado
de bacterias beneficiosas en el colon, y mejorar así la salud
del
huésped.
huésped.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 muestra contajes de colonias de
Bifidobacterium breve, (A, B) B. longum (C, D) y C.
perfringens (E, F) en el intestino delgado (yeyuno) y heces a
las 2 semanas de la intervención descrita en el Ejemplo 3. La
mediana del contaje de bacterias expresada como valores log con una
desviación estándar robusta se representan para el grupo control y
el grupo con la mezcla OS de acuerdo con la invención. Las
probabilidades para un efecto están indicadas en base a un ANOVA
robusto. (N = 9 a 10). (NA, no aplicable debido a valores por debajo
del límite de detec-
ción.
ción.
Figura 2 muestra la actividad total relativa
metabólica de C. perfringens durante el tiempo de
alimentación de la intervención descrita en el Ejemplo 3. Los datos
se representan como una caja y representación whisker con mediana y
rango intercuartil del grupo control (cajas grises) y el grupo con
la mezcla OS (cajas blancas). (N=9 a 10). El efecto del prebiótico
fue significativo para el día 0 y el día 14 evaluado mediante el
test de la mediana que implica el test exacto de Fisher (p
<0,005).
Figura 3 muestra contajes de colonias de
Bifidobacterium breve, B. longum y C.
perfringens en el intestino delgado (yeyuno) (A,C, E) y en
heces (B,D,F) a las 2 semanas de la intervención. La mediana del
contaje de bacterias expresada como valores log con rango
intercuartil se representan para el grupo control, el grupo con
galactooligosacáridos neutrales solo y el grupo con la mezcla de
oligosacáridos de acuerdo con la invención. ND, no detectado.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente especificación, las siguientes
palabras se proporcionan como una definición que debe tenerse en
cuenta cuando se lee e interpreta la descripción, ejemplos y
reivindicaciones. "Preparado para lactantes": producto
alimenticio destinado para la nutrición completa de los lactantes
durante los primeros cuatro a seis meses de vida. (Artículo 1.2 de
la Directiva de la Comisión Europea 91/321/EEC del 14 de Mayo de
1991 sobre los preparados para lactantes y preparados de
continuación).
Se debe entender que los lactantes pueden
alimentarse con tan solo preparados para lactantes, o que un
preparado para lactante puede proporcionarse por la madre u otro
cuidador como complemento a la leche humana. El término
"preparado para lactante" tal como se utiliza aquí es sinónimo
de la expresión ampliamente utilizada "fórmula de inicio".
Oligosacáridos N-acetilados:
oligosacáridos que poseen un residuo N-acetilo.
Oligosacáridos neutrales: aquellos
oligosacáridos sin carga ni residuo N-acetilo.
"Prebiótico": un ingrediente alimenticio no
digerible que afecta de forma beneficiosa al huésped mediante la
estimulación selectiva del crecimiento y/o actividad de una o un
número limitado de bacterias en el colon y mejora de esta manera la
salud del huésped. (Gibson y Roberfroid "Dietary Modulation of the
Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics"
J. Nutr 125:1401-1412).
"Oligosacárido": carbohidrato que posee un
grado de polimerización (DP) entre 2 y 20 inclusive, pero que no
incluye a la lactosa.
Oligosacáridos sialilados: oligosacáridos que
poseen un residuo de ácido siálico con carga asociada.
La invención proporciona una mezcla de
oligosacáridos que comprende 5-70% en peso de al
menos un oligosacárido N-acetilado seleccionado de
entre el grupo que comprende GalNAc\alpha1,3Gal\beta1,4Glc y
Gal\beta1,6GalNAc\alpha1,3Gal\beta1,
4Glc, 20-90% en peso de al menos un oligosacárido neutral seleccionado de entre el grupo que comprende Gal\beta1,6Gal, Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc, Gal\beta1,6Gal\beta1,6Glc, Gal\beta1,3Gal\beta1,3Glc, Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc, Gal\beta1,6Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc, Gal\beta
1,6Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc, Gal\beta1,3Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc y Gal\beta,3Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc y 5-50% en peso de al menos un oligosacárido sialilado seleccionado de entre el grupo que comprende NeuAc\alpha2,3Gal\beta1,4Glc y NeuAc\alpha2,6Gal\beta1,4Glc y productos alimenticios o comida de lactantes o adultos que comprende una mezcla de dichos oligosacáridos.
4Glc, 20-90% en peso de al menos un oligosacárido neutral seleccionado de entre el grupo que comprende Gal\beta1,6Gal, Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc, Gal\beta1,6Gal\beta1,6Glc, Gal\beta1,3Gal\beta1,3Glc, Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc, Gal\beta1,6Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc, Gal\beta
1,6Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc, Gal\beta1,3Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc y Gal\beta,3Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc y 5-50% en peso de al menos un oligosacárido sialilado seleccionado de entre el grupo que comprende NeuAc\alpha2,3Gal\beta1,4Glc y NeuAc\alpha2,6Gal\beta1,4Glc y productos alimenticios o comida de lactantes o adultos que comprende una mezcla de dichos oligosacáridos.
Preferiblemente la mezcla comprende
10-70% en peso del oligosacárido(s)
N-acetilado especificado, 20-80% en
peso del oligosacárido(s) neutral especificado y
10-50% en peso del oligosacárido(s) sialilado
especificado. Más preferiblemente la mezcla comprende
15-40% en peso del oligosacárido(s)
N-acetilado, 40-60% en peso del
otro oligosacárido(s) neutral y 15-30% en
peso del oligosacárido(s) sialilado. Una mezcla
particularmente preferible es 30% en peso del
oligosacárido(s) N-acetilado, 50% en peso del
oligosacárido(s) neutral y 20% en peso del
oligosacárido(s) sialilado.
Alternativamente, la mezcla comprende de forma
adecuada un 5-20% en peso del
oligosacárido(s) N-acetilado especificado,
60-90% en peso del oligosacárido(s) neutral
especificado y 5-30% en peso del
oligosacárido(s) sialilado especificado
La mezcla de oligosacáridos de la invención
puede prepararse a partir de una o más leches de animal. La leche
puede obtenerse de cualquier mamífero, en particular a partir de
vacas, cabras, búfalos, yeguas, elefantas, camellas u ovejas.
Alternativamente la mezcla de oligosacáridos
puede prepararse mediante la compra y mezclado de componentes
individuales. Por ejemplo, galactooligosacáridos sintetizados como
Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc Gal\beta1,6Gal\beta1,6Glc,
Gal\beta1,3Gal
\beta1,4Glc, Gal\beta1,6Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc, Gal\beta1,6Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc y Gal\beta1,3Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc y mezclas de los mismos están disponibles comercialmente bajo las marcas comerciales Vivinal ® y Elix'or ®. Otros proveedores de oligosacáridos son Dextra Laboratories, Sigma-Aldrich Chemie GmbH y Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Alternativamente, pueden utilizarse glicosiltransferasas específicas, como las galactosiltransferasas para producir oligosacáridos neutrales.
\beta1,4Glc, Gal\beta1,6Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc, Gal\beta1,6Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc y Gal\beta1,3Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc y mezclas de los mismos están disponibles comercialmente bajo las marcas comerciales Vivinal ® y Elix'or ®. Otros proveedores de oligosacáridos son Dextra Laboratories, Sigma-Aldrich Chemie GmbH y Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Alternativamente, pueden utilizarse glicosiltransferasas específicas, como las galactosiltransferasas para producir oligosacáridos neutrales.
Los oligosacáridos N-acetilados
pueden prepararse mediante la acción de glucosaminidasa y/o
galactosaminidasa sobre la
N-acetil-glucosa y/o
N-acetil-galactosa. Igualmente,
pueden utilizarse las
N-acetil-galactosil transferasas
y/o N-acetil-glicosil transferasas
para este propósito. Los oligosacáridos N-acetilados
pueden también producirse mediante tecnología de fermentación
utilizando las enzimas respectivas (recombinantes o naturales) y/ o
fermentación microbiana. En este ultimo caso los microbios pueden
expresar sus enzimas y sustratos naturales o pueden diseñarse para
producir los correspondientes sustratos y enzimas. Pueden utilizarse
los cultivos microbianos únicos o cultivos mixtos. La formación de
oligosacárido N-acetilado puede iniciarse comenzando
a partir de sustratos aceptores de cualquier grado de
polimerización (GP) a partir de GP=1 hacia adelante. Otra opción es
la conversión química de las ceto-hexosas (por
ejemplo, fructosa) libre o unida a un oligosacárido (por ejemplo,
lactulosa) en N-acetilohexosamina o una
N-acetilohexosamina que contiene oligosacáridos como
se describe en Wrodnigg, T.M.; Stutz, A.E. (1999) Angew. Chem. Int.
Ed. 38:827-828.
Los oligosacáridos sialilados
3'sialil-lactosa y 6'sialil-lactosa
pueden aislarse mediante tecnología cromatográfica o filtración a
partir de una fuente natural como la leche animal. Alternativamente,
pueden también producirse mediante biotecnología utilizando
sialiltransferasas específicas mediante tecnología de fermentación
basada en enzimas (enzimas recombinantes o naturales) o mediante
tecnología de fermentación microbiana: En este último caso los
microbios pueden expresar sus enzimas y sustratos naturales o pueden
diseñarse para producir los correspondientes sustratos y enzimas.
Pueden utilizarse los cultivos microbianos únicos o cultivos mixtos.
La formación de sialil-oligosacárido puede
iniciarse mediante sustratos aceptores comenzando a partir de
cualquier grado de polimerización (GP) a partir de GP=1 en
adelante.
En un aspecto preferible de la invención, la
mezcla de oligosacáridos descrita anteriormente se incorpora en un
producto alimenticio. En el contexto de la presente invención, el
término "producto alimenticio" pretende abarcar cualquier
materia consumible. Por lo tanto, puede ser un producto para consumo
por humanos, en particular preparados para lactantes, preparados de
continuación, comida para bebés como cereales infantiles y
similares. En particular, la mezcla de oligosacáridoss de la
invención puede incorporarse en preparados para lactantes, leche en
polvo o mezclas de cereales.
El producto alimenticio puede prepararse de
cualquier forma adecuada conocida en la técnica de acuerdo con el
tipo de producto y la mezcla de oligosacáridos de la invención puede
añadirse al producto en una etapa apropiada durante el proceso de
fabricación. Por ejemplo, un preparado para lactantes puede
prepararse mediante la mezcla conjunta de la fuente de proteínas,
cualquier carbohidrato diferente de la lactosa y la fuente de
grasas en proporciones apropiadas. Los emulsificantes pueden
añadirse si se desea. Las vitaminas y minerales pueden añadirse en
este punto pero se añaden normalmente después para evitar la
degradación térmica. Cualquier vitamina lipofílica, emulsificante y
similar puede añadirse en la fuente de grasas antes de mezclar. El
agua, preferiblemente agua que se ha sometido a una ósmosis
reversa, puede mezclarse entonces para formar una mezcla
líquida.
La mezcla líquida puede entonces tratarse
térmicamente para reducir la carga bacteriana. Por ejemplo, la
mezcla líquida puede calentarse rápidamente a una temperatura en el
rango de alrededor de 80ºC a alrededor de 110ºC durante alrededor de
5 segundos a alrededor de 5 minutos. Esto se puede llevar a cabo
mediante inyección de vapor o mediante intercambio de calor, por
ejemplo, una placa intercambiadora de calor.
La mezcla líquida puede enfriarse entonces a
alrededor de 60ºC hasta alrededor de 85ºC, por ejemplo mediante
enfriamiento rápido. la mezcla líquida puede entonces homogenizarse,
por ejemplo en dos etapas a alrededor de 7 MPa hasta alrededor de
40 MPa en la primera etapa y a alrededor de 2 MPa hasta alrededor de
14 MPa en la segunda etapa. La mezcla homogenizada puede enfriarse
entonces más para añadir cualquier componente sensible al calor
como vitaminas y minerales. El pH y el contenido de sólidos de la
mezcla homogenizada se estandariza convenientemente en este
punto.
La mezcla homogenizada se transfiere a un
liofilizador adecuado, como un liofilizador por aspersión o por
congelación, y se convierte en polvo. El polvo deberá tener una
humedad de un 5% o menos en peso.
La mezcla de oligosacáridos de la invención se
añade preferiblemente directamente al preparado para lactantes
mediante mezclado en seco. No obstante, si se ha preparado a partir
de una leche animal, por ejemplo como se describe más adelante,
puede ser conveniente añadir la mezcla de oligosacáridos sin
eliminar primero toda la lactosa. Como el preparado para lactantes
contiene un componente de carbohidratos que a menudo está
constituido total o parcialmente por lactosa, es evidente a un
experto en la materia que la cantidad de carbohidratos en el
preparado para lactantes necesitará ajustarse para tener en cuenta
el carbohidrato adicional que proporciona la mezcla de
oligosacáridos. La concentración final de la mezcla de
oligosacáridos en el producto alimenticio infantil o preparado para
lactantes es preferiblemente entre 0,3 y 4%, preferiblemente 0,75 a
1,54% en peso de materia seca. Esto corresponde a una concentración
de entre 0,2 y 5 gramos por litro de preparado reconstituido,
preferiblemente de 1 a 2 g/l. No obstante, estas cantidades no debe
considerarse como limitativa y debe adaptarse a la población diana,
por ejemplo en base al peso y edad o salud del bebé o infante.
Preferiblemente, el preparado o alimento que contiene la mezcla de
oligosacáridos de la invención se administra al bebé en cada
comida.
Alternativamente, la mezcla de oligosacáridos
puede añadirse a productos alimenticios húmedos para niños o
adultos mediante mezclado húmedo. La mezcla puede añadirse al
preparado para lactantes a concentraciones entre alrededor de 0,2 y
5 gramos de oligosacáridos por litro de producto. No obstante, estas
cantidades no deberán considerarse como limitantes y deberán
adaptarse a la población diana, por ejemplo en al peso y edad del
bebé o infante, o salud de la población específica.
Aunque es preferible suplementar los productos
alimenticios especialmente indicados hacia la nutrición infantil o
del lactante, será beneficioso suplementar los productos
alimenticios que no están dirigidos específicamente, o dirigidos a
la población adulta. Por ejemplo, la mezcla de oligosacáridos de la
invención puede incorporarse en productos de nutrición de cuidado
de la salud y productos de nutrición para los ancianos. Dichos
productos alimenticios puede incluir leche, yogur, cuajada, queso,
leches fermentadas, productos fermentados basados en la leche,
helados, productos basados en cereales fermentados, o productos
basados en la leche, entre otros.
Además de la mezcla de oligosacáridos de la
invención, un producto alimenticio como un preparado para lactantes
puede comprender uno o más oligosacáridos adicionales que se añaden
de forma separada.
La invención se ilustrará ahora mediante
referencia a los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe a modo de ejemplo un método para
preparar una mezcla de oligosacáridos de acuerdo con la
invención.
200.000 litros de un permedado de
ultrafiltración de suero preconcentrado a 22% (p/p) sólidos totales
(ST), se pasteurizó a alrededor de 75ºC durante alrededor de 30
segundos y después se concentró mediante evaporación a 60ºC para
alcanzar unos ST del 59% (p/p). El líquido se enfrió en un
cristalizador a una tasa de 2ºC por hora durante un periodo de 24
horas para cristalizar la lactosa. La lactosa cristalizada se lavó y
después se eliminó mediante un escurridor. El líquido restante
(líquido madre) se aclaró a través de un decantador. Los 77000
litros a 17,7% de ST obtenidos a partir de la aclaración se
reconcentraron mediante evaporación a 60ºC para alcanzar unos ST de
55% (p/p) y se sometieron a un segundo paso de cristalización de la
lactosa bajo las mismas condiciones de antes. Los 29000 litros a
20,55 de ST del licor madre obtenidos de esta manera se
desmineralizaron mediante una combinación de electrodiálisis e
intercambio de iones de una forma conocida per se proporcionando
28500 litros de un licor desmineralizado al 90% a 17,3% de ST. Este
licor, que contiene aproximadamente 1,5 gramos por litro de una
mezcla de alrededor del 30% en peso de
GalNAc\alpha1,3Gal\beta1,4Glc y
Gal\beta1,6GalNAc\alpha1,3Gal\beta1,4Glc, 50% en peso de
Gal\beta1,6Gal\beta1,6Glc, Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc y
Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc y 20% en peso de
NeuAc\alpha2,3Gal\beta1,4Glc y NeuAc\alpha2,6Gal\beta1,4Glc,
dependiendo del material de partida, pueden añadirse directamente a
un producto alimenticio como un preparado para lactantes o pueden
concentrarse de una forma conocida per se por un experto en la
materia.
Por ejemplo, la lactosa restante en el licor
puede hidrolizarse en glucosa y galactosa y estos monosacáridos
pueden eliminarse mediante nanofiltración o, si se desea, la
galactosa puede polimerizarse al menos parcialmente por ejemplo
mediante la acción de la \beta-galactosidasa para
producir galactooligosacáridos que también pueden retenerse en la
membrana de nanofiltración.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se proporciona un ejemplo de la
composición de un preparado para lactantes que contiene una
preparación de acuerdo con la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se investigó el efecto de una mezcla de
oligosacáridos de acuerdo con la invención en el establecimiento y
composición de la microbiota intestinal en ratones libres de
gérmenes.
Ratones C3H se mantuvieron libres de gérmenes
hasta las 8 semanas de edad y se alimentaron con una dieta semi
sintética AIN. Al día -1 de la intervención, se proporcionó una
dosis única de mezcla de microbiota de bebé humano a cada ratón
mediante el uso de sonda. Los ratones se dividieron en 2 grupos y su
dieta se cambió a una dieta AIN que contiene para un grupo 1,2%
(p/p) de lactosa como carbohidrato adicional y para el otro grupo
1,2% (p/p) de lactosa y 2,5% (p/p) de una mezcla de oligosacáridos
de acuerdo con la invención compuestos de 5% (p/p) de
sialil-oligosacáridos, 5% (p/p) de oligosacáridos
N-acetilados y 90% (p/p) de oligosacáridos
neutrales.
Se evaluó el establecimiento de la microbiota en
el intestino delgado y en las heces a los 14 días de la intervención
mediante el contaje en placa de Bifidobacterium breve, B.
longum, y Clostridium perfringens. Se puede observar en la
Figura 1 que ambas Bifidobacteria residentes muestran un
aumento de cuentas en el intestino delgado y especialmente en las
heces. Por otro lado las cuentas de C. perfringens se
redujeron en el intestino delgado y especialmente en las heces.
Durante el tiempo de alimentación la actividad
metabólica relativa de C. perfringens se monitorizó mediante
la medición de los niveles de 16S RNA. Brevemente, el RNA se extrajo
de muestras de heces recién recogidas y el RNA se sometió a una
reacción de RT-PCR para amplificar específicamente
16S rRNA. Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis
en gel en gradiente desnaturalizante y se cuantificó el 16S rRNA de
C. perfringens y se normalizó a la señal del 16S rRNA de
E. coli que se mantuvo constante durante el tiempo de la
alimentación. Como se puede apreciar en la Figura 2 sólo un día tras
la intervención (Día 0 en la Figura 2) la actividad metabólica de
C. perfringens se redujo considerablemente y
significativamente mediante la mezcla OS de acuerdo con la
invención en comparación con el grupo control y se mantuvo baja
mientras duró la intervención.
\vskip1.000000\baselineskip
Comparación del efecto de una mezcla de
oligosacáridos de acuerdo con la invención en el establecimiento y
composición de la microbiota intestinal con el efecto de los
oligosacáridos neutrales solos en ratones gnotobióticos.
Ratones C3H se mantuvieron libres de gérmenes
hasta las 6 semanas de edad y se alimentaron con una dieta semi
sintética AIN. Se proporcionó una dosis única de mezcla de
microbiota de bebé humano a cada ratón mediante el uso de sonda y
se dejó establecer la microbiota por sí misma durante dos semanas.
Los ratones se dividieron en 3 grupos y su dieta se cambió a una
dieta AIN que contiene para el primer grupo 1,2% (p/p) de lactosa
como carbohidrato adicional, para el segundo grupo 1,2% (p/p) de
lactosa y 2,5% (p/p) de galactooligosacáridos y para el tercer
grupo 1,2% (p/p) de lactosa y 2,5% (p/p) de una mezcla de
oligosacáridos de acuerdo con la invención compuestos de 5% (p/p)
de sialil-oligosacáridos, 5% (p/p) de oligosacáridos
N-acetilados y 90% (p/p) de oligosacáridos
neutrales.
Se evaluó el establecimiento de la microbiota en
el intestino delgado y en las heces a los 14 días de la intervención
mediante el contaje en placa de Bifidobacterium breve, B.
longum, y Clostridium perfringens. A partir de la Figura 3, se
puede observar que ambas Bifidobacteria residentes muestran
un aumento de cuentas en el intestino delgado y especialmente en
las heces en presencia de la mezcla OS en la dieta. En presencia de
los galactooligosacáridos neutrales, la B. longum residente
no mostró un aumento de cuentas en el intestino delgado ni en las
heces. Las cuentas de C. perfringens se redujeron en el
intestino delgado y también en las heces en presencia de la mezcla
OS de acuerdo con la invención. No obstante, en presencia de sólo
los galactooligosacáridos neutrales, se encontraron un aumento de
los niveles de C. perfringens en las heces. En conjunto,
estos hallazgos sugieren fuertemente que la mezcla de oligosacáridos
de acuerdo con la invención posee un efecto sobre el equilibrio de
la microbiota superior al efecto de los oligosacáridos neutrales
solos.
Claims (11)
1. Una mezcla de oligosacáridos que comprende un
5-70% en peso de al menos un oligosacárido
N-acetilado seleccionado de entre el grupo que
comprende GalNAc\alpha1,3Gal\beta1,4Glc y
Gal\beta1,6GalNAc\alphal,3Gal\beta1,4Glc,
20-90% en peso de al menos un oligosacárido neutral
seleccionado de entre el grupo que comprende Gal\beta1,6Gal,
Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc Gal\beta1,6Gal\beta1,6Glc,
Gal\beta1,3Gal\beta1,3Glc, Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc,
Gal\beta1,6Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc,
Gal\beta1,6Gal\beta1,3Gal\beta1,4
Glc Gal\beta1,3Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc y Gal\beta1,3Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc y 5-50% en peso de al menos un oligosacárido sialilado seleccionado de entre el grupo que comprende NeuAc\alpha2,3Gal\beta1,4Glc y NeuAc\alpha2,6Gal\beta1,4Glc.
Glc Gal\beta1,3Gal\beta1,6Gal\beta1,4Glc y Gal\beta1,3Gal\beta1,3Gal\beta1,4Glc y 5-50% en peso de al menos un oligosacárido sialilado seleccionado de entre el grupo que comprende NeuAc\alpha2,3Gal\beta1,4Glc y NeuAc\alpha2,6Gal\beta1,4Glc.
2. Una mezcla de oligosacáridos como se
reivindica en la reivindicación 1 que comprende un
10-70% en peso de oligosacáridos
N-acetilados, 20-80% en peso de
oligosacáridos neutrales y 10-50% en peso de
oligosacáridos sialilados.
3. Una mezcla de oligosacáridos como se
reivindica en la reivindicación 1 o 2 que comprende un
15-40% en peso de oligosacáridos
N-acetilados, 40-60% en peso de
oligosacáridos neutrales y 15-30% en peso de
oligosacáridos sialilados.
4. Una mezcla de oligosacáridos como se
reivindica en la reivindicación precedente que comprende un 30% en
peso de oligosacáridos N-acetilados, 50% en peso de
oligosacáridos neutrales y 20% en peso de oligosacáridos
sialilados.
5. Una mezcla de oligosacáridos como se
reivindica en la Reivindicación 1 que comprende un
5-20% en peso de oligosacáridos
N-acetilados, 60-90% en peso de
oligosacáridos neutrales y 5-30% en peso de
oligosacáridos sialilados
6. Una mezcla de oligosacáridos como se
reivindica en cualquier reivindicación precedente que deriva de una
leche animal.
7. Una mezcla de oligosacáridos como se
reivindica en la reivindicación 6 que deriva de una o más leches de
vaca, cabra o búfala.
8. Una mezcla de oligosacáridos como se
reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que está
producida de forma sintética.
9. Un producto alimenticio que comprende una
mezcla de oligosacáridos como se reivindica en cualquier
reivindicación precedente.
10. Un producto alimenticio como se reivindica
en la reivindicación 9 que es un preparado para lactante.
11. Un producto alimenticio como se reivindica
en la reivindicación 9 o 10 que comprende entre el 0,3 y el 4% en
peso de la materia seca de la mezcla de oligosacáridos.
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