ES2343105T3 - URATO OXIDASA WITHOUT AGGREGATES FOR THE PREPARATION OF IMMUNOGENIC POLYMERIC CONJUGATES. - Google Patents
URATO OXIDASA WITHOUT AGGREGATES FOR THE PREPARATION OF IMMUNOGENIC POLYMERIC CONJUGATES. Download PDFInfo
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Abstract
Un conjugado de uricasa que comprende una urato oxidasa purificada (uricasa) conjugada con poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido), en el que dicha uricasa contiene formas tetraméricas y octaméricas purificadas de la uricasa que se pueden preparar por eliminación de los agregados mayores que octámeros, en el que dicha uricasa no contiene más de aproximadamente 2% de agregados mayores que octámeros.A uricase conjugate comprising a purified urate oxidase (uricase) conjugated with poly (ethylene glycol) or poly (ethylene oxide), wherein said uricase contains purified tetrameric and octameric forms of uricase that can be prepared by removing aggregates greater than octamers, in which said uricase does not contain more than about 2% of aggregates greater than octamers.
Description
Urato oxidasa sin agregados para la preparación de conjugados poliméricos inmunogénicos.Urato oxidase without aggregates for preparation of immunogenic polymer conjugates.
Una parte de la investigación descrita en esta solicitud se hizo con el apoyo de la U.S.-Israel Binational Industrial Research and Development Foundation. De acuerdo con esto, el Gobierno de EEUU puede tener determinados derechos en la invención.A part of the research described in this request was made with the support of the U.S.-Israel Binational Industrial Research and Development Foundation. Agree with this, the US Government may have certain rights in the invention.
La presente invención se refiere a la purificación y modificación química de proteínas para prolongar sus vidas medias circulantes y reducir su inmunogenicidad. Más específicamente, la invención se refiere a la eliminación de agregados mayores que octámeros de urato oxidasas (uricasas) antes de la conjugación con poli(etilen glicoles) o poli(etilen óxidos). Esto elimina sustancialmente la inmunogenicidad de la uricasa sin comprometer su actividad uricolítica.The present invention relates to the chemical purification and modification of proteins to prolong their circulating half-lives and reduce their immunogenicity. Plus specifically, the invention relates to the elimination of aggregates larger than urate oxidases (uricases) octamers before of conjugation with poly (ethylene glycols) or poly (ethylene oxides). This substantially eliminates the immunogenicity of uricase without compromising its activity uricolytic
Las declaraciones contenidas en esta sección de antecedentes no constituyen una admisión de la técnica anterior, en lugar de esto reflejan los comentarios subjetivos del propio inventor sobre el estado de la técnica y las interpretaciones del estado de la técnica en el momento en el que se hizo la invención. Estas interpretaciones pueden incluir la visión personal, no descrita hasta este momento, de los inventores, cuyas visiones no eran parte en sí mismas de la técnica anterior.The statements contained in this section of antecedents do not constitute an admission of the prior art, in instead reflect their own subjective comments inventor on the state of the art and interpretations of state of the art at the time the invention was made. These interpretations may include personal insight, not described so far, of the inventors, whose visions are not They were part of the prior art themselves.
Las urato oxidasas (uricasas; E.C. 1.7.3.3) son enzimas que catalizan la oxidación del ácido úrico a un producto más soluble, alantoína, un metabolito de purina que se excreta más fácilmente. Los seres humanos no producen uricasa enzimáticamente activa, como resultado de varias mutaciones en el gen de la uricasa adquiridas durante la evolución de los primates superiores. Wu, X, et al., (1992) J Mol Evol 34:78-84. Consecuentemente, en individuos susceptibles, concentraciones excesivas de ácido úrico en la sangre (hiperuricemia) y en la orina (hiperuricosuria) pueden dar lugar a artritis dolorosa (gota), depósitos de urato desfigurantes (tofos) y fallo renal. En algunos individuos afectados, los fármacos disponibles tales como allopurinol (un inhibidor de la síntesis del ácido úrico) producen efectos adversos que limitan el tratamiento o no alivian estas condiciones adecuadamente. Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76:47-56; Farn, AG, (1990) Baillière's Clin Rheumatol 4:177-192. Las inyecciones de uricasa pueden disminuir la hiperuricemia y la hiperuricosuria, al menos temporalmente. Como la uricasa es una proteína extraña para los seres humanos, sin embargo, incluso la primera inyección de la proteína no modificada de Aspergillus flavus indujo reacciones anafilácticas en un cierto porcentaje de pacientes tratados (Pui, C-H, et al., (1997) Leukemia 11:1813-1816), y las respuestas inmunológicas limitan su utilidad para el tratamiento crónico o intermitente. Donadio, D, et al., (1981) Nouv Presse Méd 10:711-712; Leaustic, M, et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554.Uurate oxidases (uricases; EC 1.7.3.3) are enzymes that catalyze the oxidation of uric acid to a more soluble product, allantoin, a purine metabolite that is more easily excreted. Humans do not produce enzymatically active uricase, as a result of several mutations in the uricase gene acquired during the evolution of higher primates. Wu, X, et al ., (1992) J Mol Evol 34 : 78-84. Consequently, in susceptible individuals, excessive concentrations of uric acid in the blood (hyperuricemia) and in the urine (hyperuricosuria) can lead to painful arthritis (gout), disfiguring urate deposits (tophos) and renal failure. In some affected individuals, available drugs such as allopurinol (an inhibitor of uric acid synthesis) produce adverse effects that limit treatment or do not adequately relieve these conditions. Hande, KR, et al ., (1984) Am J Med 76 : 47-56; Farn, AG, (1990) Baillière's Clin Rheumatol 4 : 177-192. Uricase injections may decrease hyperuricemia and hyperuricosuria, at least temporarily. Since uricase is a foreign protein for humans, however, even the first injection of the unmodified Aspergillus flavus protein induced anaphylactic reactions in a certain percentage of treated patients (Pui, CH, et al ., (1997) Leukemia 11 : 1813-1816), and immune responses limit its usefulness for chronic or intermittent treatment. Donadio, D, et al ., (1981) Nouv Presse Méd 10 : 711-712; Leaustic, M, et al ., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50 : 553-554.
La Solicitud de Patente de EEUU No. de Serie
09/370.084 y la Solicitud Internacional publicada No.
PCT/US99/
17514, describen poli(etilen
glicol)-urato oxidasa (PEG-uricasa)
que retiene al menos aproximadamente 75% de la actividad
uricolítica de la uricasa no conjugada y tiene una inmunogenicidad
sustancialmente reducida. En dicha uricasa purificada, cada
subunidad está unida covalentemente a una media de 2 a 10 cadenas de
PEG, en la que cada molécula de PEG puede tener un peso molecular
de aproximadamente 5 kDa y 100 kDa.US Patent Application Serial No. 09 / 370,084 and published International Application No. PCT / US99 /
17514, describe poly (ethylene glycol) -urate oxidase (PEG-uricase) that retains at least about 75% of the urolithic activity of unconjugated uricase and has substantially reduced immunogenicity. In said purified uricase, each subunit is covalently bound to an average of 2 to 10 PEG chains, in which each PEG molecule can have a molecular weight of approximately 5 kDa and 100 kDa.
Se sabe que la agregación de proteínas incrementa su inmunogenicidad. Este conocimiento ha contribuido al desarrollo de métodos para agregar proteínas intencionadamente por tratamientos tales como desnaturalización térmica y entrecruzamiento por exposición a glutaraldehído antes de usarse en la preparación de vacunas o para la inmunización de animales para producir antisueros.It is known that protein aggregation Increase your immunogenicity. This knowledge has contributed to development of methods to intentionally add proteins by treatments such as thermal denaturation and crosslinking by exposure to glutaraldehyde before being used in vaccine preparation or for immunization of animals for produce antisera.
También se ha admitido que la agregación no intencionada de proteínas contribuye a la inmunización o sensibilización durante el uso clínico de proteínas terapéuticas, p. ej. para la gamma globulina humana (Henney et al. (1988) N. Engl. J. Med. 278:2244-2248) y para la hormona del crecimiento humana (Moore et al. (1980) J. Clin. Endocrinol. Metab. 51:691-697). La contribución de los agregados a la inmunogenicidad del interferón alfa humano se ha demostrado en ratones BALB/c (Braun et al. (1997) Pharm. Res. 14:1472-1478) y se ha desarrollado un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) para su medida (Braun et al. (1997) Pharm. Res. 14:1394-1400).It has also been admitted that unintentional aggregation of proteins contributes to immunization or sensitization during clinical use of therapeutic proteins, e.g. ex . for human gamma globulin (Henney et al . (1988) N. Engl. J. Med . 278 : 2244-2248) and for human growth hormone (Moore et al . (1980) J. Clin. Endocrinol. Metab . 51 : 691-697). The contribution of aggregates to the immunogenicity of human alpha interferon has been demonstrated in BALB / c mice (Braun et al . (1997) Pharm. Res . 14 : 1472-1478) and an enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) has been developed ) for its measurement (Braun et al . (1997) Pharm. Res . 14 : 1394-1400).
En contraste con los efectos conocidos de la agregación en la inmunogenicidad de proteínas, no hay publicaciones del efecto de la agregación en la inmunogenicidad de proteínas conjugadas con poli(alquilen glicoles) tales como PEG. Existe una necesidad de conjugados de poli(alquilen glicol)-uricasa que eliminen sustancialmente la inmunogenicidad de la uricasa sin comprometer su actividad uricolítica. La presente invención proporciona dichas composiciones.In contrast to the known effects of the aggregation in protein immunogenicity, no publications of the effect of aggregation on protein immunogenicity conjugated with poly (alkylene glycols) such as PEG. There is a need for poly (alkylene conjugates) glycol) -uricase that substantially eliminate the immunogenicity of uricase without compromising its activity uricolytic The present invention provides such compositions
La conjugación de proteínas con poli(alquilen glicoles), especialmente PEG, produce conjugados con una inmunogenicidad reducida y una persistencia incrementada en la corriente sanguínea. En un intento de producir conjugados de uricasa sustancialmente no inmunogénicos que retienen sustancialmente toda la actividad uricolítica de la preparación de uricasa no modificada, se descubrió que trazas de agregados grandes de uricasa en el material de partida eran sorprendentemente eficaces para provocar tanto la formación de anticuerpos como el aclaramiento acelerado de la circulación, siendo ambos perjudiciales, después de inyecciones repetidas de los conjugados con PEG preparados a partir de uricasa que contiene dichos agregados. Sorprendentemente, los presentes inventores encontraron que la inmunogenicidad incrementada y el aclaramiento acelerado no eran debidos a la presencia de agregados bien definidos, de tamaño moderado de la subunidad de la uricasa que son mayores que el tetrámero nativo, p. ej. agregados que contienen ocho subunidades (octámeros). La forma octamérica de la uricasa está presente en concentraciones suficientemente altas en la mayoría de las preparaciones de uricasa como para ser detectable por su absorbancia de luz UV, p. ej. a 214 nm ó 276 nm, o por su contribución al índice de refracción u otras medidas de la concentración de proteínas. No obstante, se encontró que los octámeros en sí mismos contribuyen mínimamente a la inmunogenicidad y aclaramiento acelerado de los conjugados PEG-uricasa, en contraste con las cantidades mucho menores de los agregados mucho mayores que no son detectables por absorbancia de UV en las condiciones ensayadas pero que se detectan fácilmente por dispersión de la luz estática (Raleigh) o dinámica. Por lo tanto, se encontró que la eliminación de dichas trazas de agregados muy grandes antes de la conjugación con PEG disminuía la inmunogenicidad y el aclaramiento acelerado de los conjugados PEG-uricasa resultantes en un grado sorprendente.The conjugation of proteins with poly (alkylene glycols), especially PEG, produces conjugates with reduced immunogenicity and increased persistence in the bloodstream. In an attempt to produce substantially non-immunogenic uricase conjugates that retain substantially all of the uricolytic activity of the unmodified uricase preparation, it was discovered that traces of large uricase aggregates in the starting material were surprisingly effective in causing both antibody formation. as the accelerated clearance of the circulation, both being harmful, after repeated injections of the PEG conjugates prepared from uricase containing said aggregates. Surprisingly, the present inventors found that the increased immunogenicity and accelerated clearance were not due to the presence of well-defined, moderately sized aggregates of the uricase subunit that are larger than the native tetramer, e.g. ex . aggregates containing eight subunits (octamers). The octameric form of uricase is present in concentrations high enough in most uricase preparations to be detectable by its absorbance of UV light, e.g. ex . at 214 nm or 276 nm, or for its contribution to the refractive index or other measures of protein concentration. However, the octamers themselves were found to contribute minimally to the immunogenicity and accelerated clearance of the PEG-uricase conjugates, in contrast to the much smaller amounts of the much larger aggregates that are not detectable by UV absorbance under the conditions tested. but that are easily detected by scattering of static (Raleigh) or dynamic light. Therefore, it was found that the removal of such traces from very large aggregates before conjugation with PEG decreased the immunogenicity and accelerated clearance of the resulting PEG-uricase conjugates to a surprising degree.
Una realización de la presente invención es un conjugado de uricasa que comprende una urato oxidasa (uricasa) purificada conjugada con poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido), en el que dicha uricasa contiene formas tetraméricas y octaméricas de la uricasa purificadas que se pueden preparar por eliminación de los agregados mayores que octámeros, en el que dicha uricasa no contiene más de aproximadamente 2% de agregados mayores que octámeros. Preferiblemente, la uricasa es una uricasa de mamíferos. Más preferiblemente, la uricasa es uricasa de hígado porcino, hígado bovino o hígado ovino. En un aspecto de esta realización preferida, la uricasa es recombinante. En otro aspecto de esta realización preferida, la uricasa tiene sustancialmente la secuencia de uricasa de hígado porcino, bovino, ovino o de babuino. Ventajosamente, la uricasa es quimérica. Preferiblemente, la uricasa es uricasa PKS. En otro aspecto de esta realización preferida, la uricasa tiene sustancialmente la secuencia de la uricasa de hígado de babuino en la que la tirosina 97 se ha reemplazado por histidina. Preferiblemente, la uricasa comprende un extremo amino terminal y un extremo carboxi terminal, y en la que la uricasa está truncada en un extremo o ambos extremos. Ventajosamente, la uricasa es una uricasa fúngica o microbiana. Preferiblemente, la uricasa fúngica o microbiana se aísla de Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis, Bacillus sp. o Candida utilis, o es una enzima recombinante que tiene sustancialmente la secuencia de una de dichas uricasas. Alternativamente, la uricasa es una uricasa de invertebrados. Preferiblemente, la uricasa de invertebrados se aísla de Drosophila melanogaster o Drosophila pseudoobscura, o es una enzima recombinante que tiene sustancialmente la secuencia de una de dichas uricasas. En otro aspecto de esta realización preferida, la uricasa es una uricasa de plantas. Preferiblemente, la uricasa de plantas se aísla a partir de los nódulos radiculares de Glycine max o es una enzima recombinante que tiene sustancialmente la secuencia de la uricasa.An embodiment of the present invention is a uricase conjugate comprising a purified urate oxidase (uricase) conjugated with poly (ethylene glycol) or poly (ethylene oxide), wherein said uricase contains purified tetrameric and octameric forms of uricase which they can be prepared by removing aggregates greater than octamers, in which said uricase does not contain more than about 2% of aggregates greater than octamers. Preferably, the uricase is a mammalian uricase. More preferably, the uricase is porcine liver, bovine liver or sheep liver uricase. In one aspect of this preferred embodiment, the uricase is recombinant. In another aspect of this preferred embodiment, the uricase has substantially the sequence of porcine, bovine, sheep or baboon liver uricase. Advantageously, the uricase is chimeric. Preferably, the uricase is PKS uricase. In another aspect of this preferred embodiment, the uricase has substantially the sequence of baboon liver uricase in which tyrosine 97 has been replaced by histidine. Preferably, the uricase comprises an amino terminal end and a carboxy terminal end, and in which the uricase is truncated at one end or both ends. Advantageously, the uricase is a fungal or microbial uricase. Preferably, fungal or microbial uricase is isolated from Aspergillus flavus , Arthrobacter globiformis , Bacillus sp . or Candida utilis , or is a recombinant enzyme that has substantially the sequence of one of said uricases. Alternatively, uricase is an invertebrate uricase. Preferably, the invertebrate uricase is isolated from Drosophila melanogaster or Drosophila pseudoobscura , or is a recombinant enzyme that has substantially the sequence of one of said uricases. In another aspect of this preferred embodiment, the uricase is a plant uricase. Preferably, the plant uricase is isolated from the root nodules of Glycine max or is a recombinant enzyme that has substantially the uricase sequence.
En un aspecto de esta realización preferida, la uricasa descrita anteriormente se conjuga con poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido) en condiciones tales que la uricasa en el conjugado no tiene sustancialmente agregados mayores que octámeros. Preferiblemente, la uricasa se conjuga con poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido) mediante una unión uretano (carbamato), amina secundaria o amida. En un aspecto de esta realización preferida, el poli(etilen glicol) es monometoxi poli(etilen glicol). En otro aspecto de esta realización preferida, el poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido) tiene un peso molecular entre aproximadamente 5 kDa y 30 kDa. Preferiblemente, el poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido) tiene un peso molecular entre aproximadamente 10 kDa y 20 kDa. Ventajosamente, el número medio de cadenas de dicho poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido) es entre aproximadamente 2 y 12 cadenas por subunidad de uricasa. Más ventajosamente, el número medio de cadenas de dicho poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido) es entre aproximadamente 6 y 10 por subunidad de uricasa. Lo más ventajosamente, el número medio de cadenas de dicho poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido) es entre aproximadamente 7 y 9 por subunidad de uricasa. Preferiblemente, el poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido) es lineal. Alternativamente, el poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido) es ramificado.In one aspect of this preferred embodiment, the uricase described above is conjugated with poly (ethylene glycol) or poly (ethylene oxide) under conditions such that the uricase in the conjugate has substantially no major aggregates What octame. Preferably, the uricase is conjugated with poly (ethylene glycol) or poly (ethylene oxide) by a urethane (carbamate), secondary amine or amide binding. In one aspect of this preferred embodiment, the poly (ethylene glycol) is monomethoxy poly (ethylene glycol). In another aspect of this preferred embodiment, the poly (ethylene glycol) or poly (ethylene oxide) has a molecular weight between approximately 5 kDa and 30 kDa. Preferably, the poly (ethylene glycol) or poly (ethylene oxide) has a weight molecular between approximately 10 kDa and 20 kDa. Advantageously, the average number of chains of said poly (ethylene glycol) or poly (ethylene oxide) is between about 2 and 12 chains by subunit of uricase. More advantageously, the average number of chains of said poly (ethylene glycol) or poly (ethylene oxide) is between about 6 and 10 per uricase subunit. The more advantageously, the average number of chains of said poly (ethylene glycol) or poly (ethylene oxide) is between approximately 7 and 9 per uricase subunit. Preferably, the Poly (ethylene glycol) or poly (ethylene oxide) is linear. Alternatively, poly (ethylene glycol) or poly (ethylene oxide) is branched.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para disminuir los niveles de ácido úrico en un fluido o tejido corporal, que comprende el conjugado de uricasa descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la composición se estabiliza por liofilización y se disuelve después de la reconstitución para proporcionar disoluciones adecuadas para la administración parenteral.The present invention also provides a pharmaceutical composition to decrease uric acid levels in a fluid or body tissue, which comprises the conjugate of uricase described above and a pharmaceutically carrier acceptable. Preferably, the composition is stabilized by lyophilization and dissolves after reconstitution to provide adequate solutions for administration parenteral
Otra realización de la invención es un método para purificar uricasa que tiene una inmunogenicidad reducida, que comprende la etapa de separar los agregados de uricasa mayores que octámeros en fracciones de uricasa, y excluir dichos agregados de la uricasa purificada. Preferiblemente, la etapa de separación comprende la etapa de detectar los agregados mayores que octámeros de al menos una parte de las fracciones de uricasa y excluir las fracciones que contienen los agregados. Ventajosamente, la etapa de detección comprende la medida de la dispersión de la luz.Another embodiment of the invention is a method. to purify uricase that has a reduced immunogenicity, which comprises the step of separating uricase aggregates greater than octamers in uricase fractions, and exclude such aggregates from purified uricase Preferably, the separation stage includes the stage of detecting aggregates greater than octamers of at least part of the uricase fractions and exclude the fractions containing aggregates. Advantageously, the stage of detection includes the measure of light scattering.
La presente invención también proporciona uricasa aislada preparada por el método descrito anteriormente.The present invention also provides Isolated uricase prepared by the method described above.
La Figura 1 ilustra la actividad uricasa, concentraciones totales de proteína y sal en fracciones de una columna de intercambio aniónico Pharmacia Biotech Mono Q (1 x 10 cm). La actividad uricasa se midió a temperatura ambiente monitorizando la disminución de la absorbancia a 292 nm de 100 \muM de ácido úrico en 200 nM de borato sódico, pH 9,2. La proteína total se determinó a partir del área bajo la curva del pico de absorbancia de uricasa en análisis de exclusión por tamaño en HPLC.Figure 1 illustrates uricase activity, total protein and salt concentrations in fractions of one anion exchange column Pharmacia Biotech Mono Q (1 x 10 cm). The uricase activity was measured at room temperature monitoring the decrease in absorbance at 292 nm of 100 µM uric acid in 200 nM sodium borate, pH 9.2. The Total protein was determined from the area under the peak curve of uricase absorbance in size exclusion analysis in HPLC
La Figura 2 ilustra el análisis de exclusión por tamaño en HPLC en una columna Pharmacia Superdex 200 (1 x 30 cm) de la carga y fracciones seleccionadas de una cromatografía preparativa Mono Q de uricasa porcina que contiene las mutaciones R291K y T301S (uricasa PKS) que muestra datos obtenidos por un detector de dispersión de la luz a 90ºC (curvas superiores) y por absorbancia a 276 nm (curvas inferiores). Las diferentes intensidades de la señal de las formas tetraméricas, octaméricas y más altamente agregadas de uricasa en la muestra no fraccionada (carga) y las diferentes fracciones son evidentes. La carga se diluyó 1/5 con tampón de la columna Mono Q, la fracción 5 se diluyó 1/3 y la fracción 6 se diluyó 1/9. Las fracciones 5 y 6 se combinaron para formar el "conjunto bajo en sal".Figure 2 illustrates the exclusion analysis by HPLC size on a Pharmacia Superdex 200 column (1 x 30 cm) of the load and selected fractions of a preparative chromatography Porcine uricase mono Q containing R291K and T301S mutations (PKS uricase) that shows data obtained by a detector light scattering at 90 ° C (upper curves) and by absorbance at 276 nm (lower curves). The different signal intensities of the tetrameric, octameric and more highly aggregated forms of uricase in the unfractionated sample (load) and the different Fractions are obvious. The load was diluted 1/5 with buffer of the Mono Q column, fraction 5 was diluted 1/3 and fraction 6 was diluted 1/9. Fractions 5 and 6 combined to form the "low salt set".
La Figura 3 ilustra el análisis de exclusión por tamaño de las fracciones de la columna Mono Q de la Figura 1, que muestra los datos obtenidos por un detector de dispersión de la luz a 90º y por absorbancia a 276 nm, como en la Figura 2. Las fracciones mostradas en esta figura se usaron para formar el "conjunto alto en sal", a partir del cual se prepararon los conjugados con PEG y se inyectaron en ratones BALB/c. Las actividades en suero resultantes y las respuestas inmunológicas de los ratones BALB/c se muestran en las Figuras 5 y 6.Figure 3 illustrates the exclusion analysis by size of the fractions of the Mono Q column of Figure 1, which shows the data obtained by a light scattering detector at 90 ° and by absorbance at 276 nm, as in Figure 2. The fractions shown in this figure were used to form the "set high in salt", from which the conjugated to PEG and injected into BALB / c mice. The resulting serum activities and immune responses of BALB / c mice are shown in Figures 5 and 6.
La Figura 4 ilustra el contenido en octámero, determinado por absorbancia a 276 nm y por dispersión de la luz a 90º, calculado a partir de los datos de las Figuras 2 y 3, de uricasa PKS sin fraccionar y de fracciones seleccionadas de la cromatografía en columna preparativa MonoQ de uricasa PKS (Figura 1).Figure 4 illustrates the octamer content, determined by absorbance at 276 nm and by light scattering at 90º, calculated from the data in Figures 2 and 3, of unfractionated PKS uricase and selected fractions of the MonoQ preparative column chromatography of PKS uricase (Figure one).
La Figura 5 ilustra los ensayos UV, como en la Figura 1, de la actividad uricasa después de una incubación de 4 horas a 37ºC, en sueros recogidos 24 horas después de cada una de las seis inyecciones semanales de conjugados de 6 x 10-kDa PEG de uricasa PKS o de conjuntos de fracciones de la columna Mono Q.Figure 5 illustrates the UV tests, as in the Figure 1, of the uricase activity after an incubation of 4 hours at 37 ° C, in sera collected 24 hours after each of the six weekly injections of 6 x conjugates 10-kDa PEG of PKS uricase or sets of fractions of the Mono Q column.
La Figura 6 ilustra el análisis ELISA de la formación de anticuerpo IgG frente a conjugados de PEG de uricasa PKS y frente a conjugados de PEG de los conjuntos de fracciones de la columna Mono Q mostrados en la Figura 1, en sueros recogidos 24 horas después de cada una de las seis inyecciones semanales de ratones hembra BALB/c con 0,2 mg de proteína uricasa por 20 gramos de peso corporal. Para cada ratón, se muestran los datos de sangrados 24 horas después de la primera de seis inyecciones de izquierda a derecha. Las condiciones del ensayo se describen en el Ejemplo 6. Los datos para los ocho ratones de cada grupo se organizaron en orden creciente de respuesta inmune, de izquierda a derecha.Figure 6 illustrates the ELISA analysis of the IgG antibody formation against PEG uricase conjugates PKS and PEG conjugates of the fraction sets of Mono Q column shown in Figure 1, in collected sera 24 hours after each of the six weekly injections of BALB / c female mice with 0.2 mg uricase protein per 20 grams body weight For each mouse, the data of bleeding 24 hours after the first of six injections of left to right. The test conditions are described in the Example 6. The data for the eight mice in each group is organized in increasing order of immune response, from left to right.
Los estudios previos han mostrado que cuando se consigue una reducción significativa de la inmunogenicidad y/o antigenicidad de la uricasa por conjugación con PEG (PEGilación), está invariablemente asociada con una pérdida sustancial de la actividad uricolítica. La presente invención incluye la observación de que trazas de agregados de urato oxidasas mayores que octámeros contribuyen sustancialmente a la inmunogenicidad y a la inducción de aclaramiento acelerado de los conjugados PEG-uricasa. Lo más probable es que este descubrimiento sea aplicable a proteínas distintas de las uricasas, incluyendo interferones y factores de crecimiento.Previous studies have shown that when achieves a significant reduction in immunogenicity and / or antigenicity of uricase by conjugation with PEG (PEGylation), is invariably associated with a substantial loss of the uricolytic activity The present invention includes observation of which traces of urate oxidases aggregates greater than octamers contribute substantially to immunogenicity and induction accelerated clearance of conjugates PEG-uricase Most likely, this discovery is applicable to proteins other than uricases, including interferons and growth factors.
La seguridad, conveniencia y rentabilidad de los compuestos biofarmacéuticos se ven influidas adversamente por las disminuciones en sus potencias y la necesidad resultante de incrementar la dosis administrada. Así, existe una necesidad de un medio alternativo seguro y eficaz para disminuir los niveles elevados de ácido úrico en los fluidos corporales, incluyendo la sangre y la orina. La presente invención proporciona un método para producir uricasa que excluye los agregados de uricasa mayores que octámeros para usarse en la síntesis de PEG-uricasa. Esta PEG-uricasa retiene toda o casi toda la actividad uricolítica de la enzima no modificada. La presente invención también proporciona uricasa purificada sustancialmente sin agregados mayores que octámeros. El término "sustancialmente sin" indica que la uricasa purificada no comprende más de aproximadamente 2%, y preferiblemente no más de aproximadamente 1% de agregados mayores que octámeros.The safety, convenience and profitability of biopharmaceutical compounds are adversely influenced by the decreases in their powers and the resulting need for Increase the dose administered. Thus, there is a need for a safe and effective alternative means to lower levels elevated uric acid in body fluids, including blood and urine The present invention provides a method for produce uricase that excludes uricase aggregates greater than octamers for use in the synthesis of PEG-uricase This PEG-uricase retains all or almost all the uricolytic activity of the enzyme not modified The present invention also provides uricase. substantially purified without aggregates greater than octamers. He term "substantially without" indicates that purified uricase does not comprise more than about 2%, and preferably not more than approximately 1% of aggregates greater than octamers.
La presente invención proporciona un método para purificar uricasa de manera que los agregados mayores que octámeros se excluyen de la preparación purificada. Debido a que estos agregados grandes son altamente inmunogénicos, su presencia en la preparación de uricasa purificada no es deseable. El método implica la monitorización de las fracciones de la columna por dispersión de la luz en lugar de o además de absorbancia ultravioleta a 280 nm, ya que los agregados pueden estar demasiado diluidos para ser detectados por absorbancia ultravioleta. La uricasa purificada se conjuga entonces con polímeros solubles en agua, preferiblemente poli(etilen glicoles) o poli(etilen óxidos) como se describe en la Solicitud de EEUU No. de Serie 09/370.084 en tramitación con la presente.The present invention provides a method for purify uricase so that aggregates larger than octamers They are excluded from the purified preparation. Because these large aggregates are highly immunogenic, their presence in the Preparation of purified uricase is not desirable. The method implies the monitoring of column fractions by dispersion of light instead of or in addition to ultraviolet absorbance at 280 nm, since the aggregates may be too diluted to be detected by ultraviolet absorbance. The purified uricase is then conjugates with water soluble polymers, preferably poly (ethylene glycols) or poly (ethylene oxides) as described in US Application Serial No. 09 / 370,084 in Processing with this.
La eliminación de la uricasa agregada de una preparación que consiste predominantemente en uricasa tetramérica puede conseguirse por cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, ultrafiltración a través de una membrana microporosa y centrifugación, incluyendo ultracentrifugación. El método de separación puede incluir la separación y análisis de fracciones y el rechazo o exclusión de aquellas fracciones que contienen cantidades excesivas de agregados grandes. La preparación de uricasa resultante es más adecuada para la síntesis de conjugados sustancialmente no inmunogénicos de uricasa que la uricasa no fraccionada. Para la administración crónica, es importante que los conjugados PEG de proteínas, p. ej. PEG-uricasa, tengan una baja inmunogenicidad y que no provoquen progresivamente un aclaramiento más rápido de la corriente sanguínea después de dosis repetidas.The removal of aggregate uricase from a preparation consisting predominantly of tetrameric uricase can be achieved by any of the methods known to those skilled in the art, including size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, ultrafiltration through a microporous membrane and centrifugation, including ultracentrifugation. The method of separation may include the separation and analysis of fractions and the rejection or exclusion of those fractions that contain excessive amounts of large aggregates. The resulting uricase preparation is more suitable for the synthesis of substantially non-immunogenic uricase conjugates than unfractionated uricase. For chronic administration, it is important that PEG protein conjugates, e.g. ex . PEG-uricase, have a low immunogenicity and do not progressively cause a faster clearance of the bloodstream after repeated doses.
La invención también proporciona composiciones farmacéuticas de los conjugados polímero-uricasa. Estos conjugados son sustancialmente no inmunogénicos y retienen al menos 75%, preferiblemente 85% y más preferiblemente 95% o más de la actividad uricolítica de la enzima no modificada. Las uricasas adecuadas para conjugación con polímeros solubles en agua incluyen las urato oxidasas naturales aisladas de bacterias, hongos y tejidos de plantas y animales, tanto vertebrados como invertebrados, así como formas recombinantes de uricasa, incluyendo variantes de uricasa mutadas, híbridas y/o truncadas enzimáticamente activas. Los polímeros solubles en agua adecuados para usarse en la presente invención incluyen poli(etilen glicoles) o poli(etilen óxidos) lineales y ramificados, conocidos todos comúnmente como PEG. Los ejemplos de PEG ramificados son el tema de la Patente de EEUU 5.643.575. Un ejemplo preferido de PEG lineal es monometoxiPEG, que tiene la estructura general CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}H, en la que n varía de aproximadamente 100 a aproximadamente 2.300.The invention also provides pharmaceutical compositions of the polymer-uricase conjugates. These conjugates are substantially non-immunogenic and retain at least 75%, preferably 85% and more preferably 95% or more of the uricolytic activity of the unmodified enzyme. Suitable uricases for conjugation with water soluble polymers include natural urate oxidases isolated from bacteria, fungi and tissues of plants and animals, both vertebrates and invertebrates, as well as recombinant forms of uricase, including mutated, hybrid and / or truncated uricase variants enzymatically active. Water soluble polymers suitable for use in the present invention include linear and branched poly (ethylene glycols) or poly (ethylene oxides), all commonly known as PEG. Examples of branched PEGs are the subject of US Patent 5,643,575. A preferred example of linear PEG is monomethoxyPEG, which has the general structure CH 3 O- (CH 2 CH 2 O) n H, in which n ranges from about 100 to about 2,300.
Una realización de la presente invención es un conjugado de urato oxidasa (uricasa) que retiene al menos aproximadamente 75% de la actividad uricolítica de la uricasa no conjugada y tiene una inmunogenicidad sustancialmente reducida. La uricasa de este aspecto de la invención puede ser recombinante. Ya sea recombinante o no, la uricasa puede ser de origen mamífero. En un aspecto de esta realización, la uricasa puede ser uricasa de hígado porcino, bovino u ovino. En otro aspecto de esta realización, la uricasa puede ser quimérica. La uricasa quimérica puede contener partes de uricasa de hígado porcino y/o de hígado de babuino. Por ejemplo, la uricasa quimérica puede ser uricasa porcina que contiene las mutaciones R291K y T301S (uricasa PKS). Alternativamente, la uricasa puede ser uricasa de hígado de babuino en la que la tirosina 97 se ha reemplazado por histidina, por lo cual la actividad específica de la uricasa puede incrementarse al menos aproximadamente 60%. La uricasa de la invención, independientemente del origen, también puede estar en una forma que está truncada, bien en el extremo amino terminal o en el extremo carboxilo terminal o en ambos extremos. Asimismo, la uricasa puede ser uricasa fúngica o microbiana. En un aspecto de esta realización, la uricasa fúngica o microbiana puede ser una forma de uricasa natural o recombinante de Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis, Bacillus sp. o Candida utilis. Alternativamente, la uricasa puede ser una uricasa de invertebrados, tal como, por ejemplo, una forma de uricasa natural o recombinante de Drosophila melanogaster o Drosophila pseudoobscura. La uricasa de la invención también puede ser una uricasa de plantas, por ejemplo, una forma de uricasa natural o recombinante de nódulo radicular de soja (Glycine max). El PEG puede tener un peso molecular medio entre aproximadamente 5 kDa y 100 kDa; preferiblemente el PEG puede tener un peso molecular medio entre aproximadamente 8 kDa y 60 kDa; más preferiblemente, el PEG puede tener un peso molecular medio entre aproximadamente 10 kDa y 40 kDa, tal como, por ejemplo, 10 a 20 kDa. El número medio de cadenas de PEG covalentemente acopladas puede ser 2 a 12 cadenas por subunidad de uricasa; preferiblemente, el número medio de cadenas covalentemente acopladas puede ser 6 a 10 por subunidad; más preferiblemente, el número medio de cadenas de PEG puede ser 7 a 9 por subunidad. En un aspecto de esta realización, la uricasa puede ser tetramérica. Las cadenas de PEG pueden estar unidas covalentemente a la uricasa mediante uniones uretano (carbamato), uniones de amina secundaria y/o uniones amida. Cuando la uricasa es una forma recombinante de cualquiera de las uricasas mencionadas en la presente memoria, la forma recombinante puede tener sustancialmente la secuencia de la forma natural.An embodiment of the present invention is a urate oxidase (uricase) conjugate that retains at least about 75% of the urolithic activity of unconjugated uricase and has a substantially reduced immunogenicity. The uricase of this aspect of the invention can be recombinant. Whether recombinant or not, uricase can be of mammalian origin. In one aspect of this embodiment, the uricase can be porcine, bovine or sheep liver uricase. In another aspect of this embodiment, the uricase may be chimeric. The chimeric uricase may contain parts of porcine liver and / or baboon liver uricase. For example, the chimeric uricase may be swine uricase containing the R291K and T301S mutations (PKS uricase). Alternatively, the uricase can be baboon liver uricase in which tyrosine 97 has been replaced by histidine, whereby the specific activity of the uricase can be increased by at least about 60%. The uricase of the invention, regardless of origin, may also be in a form that is truncated, either at the amino terminal end or at the carboxyl end or at both ends. Also, the uricase can be fungal or microbial uricase. In one aspect of this embodiment, the fungal or microbial uricase may be a form of natural or recombinant uricase of Aspergillus flavus , Arthrobacter globiformis , Bacillus sp . or Candida utilis . Alternatively, the uricase may be an invertebrate uricase, such as, for example, a form of natural or recombinant uricase from Drosophila melanogaster or Drosophila pseudoobscura . The uricase of the invention can also be a plant uricase, for example, a natural or recombinant form of soybean root nodule ( Glycine max ). The PEG can have an average molecular weight between about 5 kDa and 100 kDa; preferably the PEG can have an average molecular weight between about 8 kDa and 60 kDa; more preferably, the PEG may have an average molecular weight between about 10 kDa and 40 kDa, such as, for example, 10 to 20 kDa. The average number of covalently coupled PEG chains can be 2 to 12 chains per uricase subunit; preferably, the average number of covalently coupled chains may be 6 to 10 per subunit; more preferably, the average number of PEG chains can be 7 to 9 per subunit. In one aspect of this embodiment, the uricase may be tetrameric. PEG chains can be covalently linked to uricase by urethane (carbamate) bonds, secondary amine bonds and / or amide bonds. When the uricase is a recombinant form of any of the uricases mentioned herein, the recombinant form can have substantially the sequence of the natural form.
Una uricasa de mamíferos preferida es uricasa quimérica de cerdo-babuino recombinante, compuesta por partes de las secuencia de uricasa de hígado de cerdo y de hígado de babuino, habiéndose determinado las dos en primer lugar por Wu, et al. (1989). Un ejemplo de dicha uricasa quimérica contiene los primeros 288 aminoácidos de la secuencia porcina (SEQ ID NO: 1) y los últimos 16 aminoácidos de la secuencia de babuino (SEQ ID NO: 2). Hershfield et al., Publicación Internacional WO 00/08196, Urato Oxidasa, publicado el 17 de febrero, 2000. Como la última secuencia se diferencia de la secuencia porcina sólo en dos posiciones, que tienen una lisina (K) en lugar de arginina en el resto 291 y una serina (S) en lugar de treonina en el resto 301, este mutante se refiere como uricasa de cerdo K-S o PKS (SEQ ID NO: 3). La uricasa PKS tiene un resto más de lisina y, por lo tanto, un sitio potencial más de PEGilación respecto a la secuencia porcina y de babuino. Las secuencias se muestran en la Tabla A.A preferred mammalian uricase is recombinant pig-baboon chimeric uricase, composed of parts of the pig liver and baboon liver uricase sequence, both of which have been determined first by Wu, et al . (1989). An example of said chimeric uricase contains the first 288 amino acids of the porcine sequence (SEQ ID NO: 1) and the last 16 amino acids of the baboon sequence (SEQ ID NO: 2). Hershfield et al ., International Publication WO 00/08196, Urato Oxidase, published on February 17, 2000. As the last sequence differs from the porcine sequence only in two positions, they have a lysine (K) instead of arginine in the remainder 291 and a serine (S) instead of threonine in the remainder 301, this mutant is referred to as pig uricase KS or PKS (SEQ ID NO: 3). The PKS uricase has one more lysine residue and, therefore, one more potential PEGylation site with respect to the swine and baboon sequence. The sequences are shown in Table A.
Los ADNc de varias uricasas de mamíferos, incluyendo uricasa PKS, se subclonaron y se determinaron las condiciones óptimas para la expresión en E. coli, usando métodos estándar. Véanse Erlich, HA, (Ed.) (1989) PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification. Nueva York: Stockton Press; Sambrook, J, et al., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Segunda Edición. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Las uricasas recombinantes se extrajeron, se purificaron y se evaluó su estabilidad y actividad usando una modificación de ensayos estándar. Véanse Fridovich, I, (1965) J Biol Chem 240:2491-2494; Nishimura, et al., (1979), y los Ejemplos 1 y 5.The cDNAs of several mammalian uricases, including PKS uricase, were subcloned and optimal conditions for expression in E. coli were determined , using standard methods. See Erlich, HA, (Ed.) (1989) PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification . New York: Stockton Press; Sambrook, J, et al ., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition . Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Recombinant uricases were extracted, purified and their stability and activity evaluated using a modification of standard assays. See Fridovich, I, (1965) J Biol Chem 240 : 2491-2494; Nishimura, et al ., (1979), and Examples 1 and 5.
En una realización de la invención, la uricasa puede conjugarse mediante una unión biológicamente estable, no tóxica, covalente a un número de cadenas de PEG relativamente pequeño. Dichas uniones pueden incluir uniones uretano (carbamato), uniones amina secundaria, y uniones amida. Varios PEG activados adecuados para dicha conjugación están disponibles comercialmente en Shearwater Polymers, Huntsville, AL.In one embodiment of the invention, uricase it can be conjugated by a biologically stable bond, not toxic, covalent to a number of relatively PEG chains small. Such joints may include urethane (carbamate) bonds, secondary amine junctions, and amide junctions. Several PEGs activated suitable for such conjugation are commercially available in Shearwater Polymers, Huntsville, AL.
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Por ejemplo, las uniones uretano con la uricasa pueden formarse incubando la uricasa en presencia del derivado carbonato de succinimidilo (SC) o carbonato de p-nitrofenilo (NPC) de PEG. SC-PEG puede sintetizarse usando el procedimiento descrito en la Patente de EEUU 5.612.460. NPC-PEG puede sintetizarse haciendo reaccionar PEG con cloroformato de p-nitrofenilo según los métodos descritos en Veronese, FM, et al., (1985) Appl Biochem Biotechnol 11:141-152, y en la Patente de EEUU 5.286.637. Los métodos descritos en la patente '637 se adaptan a los PEG de alto peso molecular ajustando las concentraciones de los reactantes para mantener una estequiometría similar. Un método alternativo de síntesis de NPC-PEG se describe en Büttner, W, et al., Especificación de Patente de Alemania del Este DD 279 486 A1.For example, urethane and uricase junctions can be formed by incubating the uricase in the presence of the derivative succinimidyl carbonate (SC) or P- nitrophenyl carbonate (NPC) of PEG. SC-PEG can be synthesized using the procedure described in US Patent 5,612,460. NPC-PEG can be synthesized by reacting PEG with p- nitrophenyl chloroformate according to the methods described in Veronese, FM, et al ., (1985) Appl Biochem Biotechnol 11 : 141-152, and in US Patent 5,286,637. The methods described in the '637 patent are adapted to high molecular weight PEGs by adjusting the concentrations of the reactants to maintain a similar stoichiometry. An alternative method of NPC-PEG synthesis is described in Büttner, W, et al ., East German Patent Specification DD 279 486 A1.
Las uniones amida con la uricasa pueden obtenerse usando un éster de N-hidroxisuccinimida de un derivado de ácido carboxílico de PEG (Shearwater Polymers). Las uniones de amina secundaria pueden formarse usando 2,2,2-trifluoroetanosulfonil PEG (tresil PEG; Shearwater Polymers) o por alquilación reductora usando PEG aldehído (Shearwater Polymers) y cianoborohidruro de sodio.Amide bonds with uricase can be obtained using an N- hydroxysuccinimide ester of a carboxylic acid derivative of PEG (Shearwater Polymers). Secondary amine bonds can be formed using 2,2,2-trifluoroethanesulfonyl PEG (tresyl PEG; Shearwater Polymers) or by reductive alkylation using PEG aldehyde (Shearwater Polymers) and sodium cyanoborohydride.
En los conjugados que contienen PEG con un peso molecular de 10 kDa, el número máximo de cadenas de PEG que estaban acopladas por subunidad, que retenían al menos 75% de la actividad uricolítica de la enzima no modificada, fue aproximadamente 12 cadenas para las uricasas de mamíferos (p. ej. uricasa PKS, una muteína de uricasa porcina; véanse las condiciones de ensayo en el Ejemplo 5). El último grado de PEGilación corresponde a aproximadamente 40% de los grupos amino totales. En una realización de la invención, el número medio de cadenas de PEG acopladas por subunidad de uricasa es aproximadamente entre 2 y 12. En una realización preferida, el número medio de cadenas de PEG acopladas por subunidad de uricasa es aproximadamente entre 6 y 10. En una realización más preferida, el número medio de cadenas de PEG unidas covalentemente por subunidad de uricasa es aproximadamente entre 7 y 9. En otra realización, el peso molecular del PEG usado para la reacción de acoplamiento es aproximadamente entre 5 kDa y 30 kDa, preferiblemente aproximadamente entre 10 kDa y 20 kDa.In conjugates containing PEG with a molecular weight of 10 kDa, the maximum number of PEG chains that were coupled by subunit, which retained at least 75% of the uricolytic activity of the unmodified enzyme, was approximately 12 chains for uricases of mammals ( eg PKS uricase, a porcine uricase mutein; see test conditions in Example 5). The last degree of PEGylation corresponds to approximately 40% of the total amino groups. In one embodiment of the invention, the average number of PEG chains coupled per uricase subunit is approximately between 2 and 12. In a preferred embodiment, the average number of PEG chains coupled per uricase subunit is approximately between 6 and 10. In a more preferred embodiment, the average number of PEG chains covalently linked by uricase subunit is approximately between 7 and 9. In another embodiment, the molecular weight of the PEG used for the coupling reaction is approximately between 5 kDa and 30 kDa, preferably about 10 kDa to 20 kDa.
Hay varios factores que pueden influir en la elección del peso molecular y número de cadenas de PEG óptimos para el acoplamiento a una forma dada de la uricasa. En general, La reducción o eliminación de la inmunogenicidad sin pérdida sustancial de actividad uricolítica puede requerir el acoplamiento de relativamente más cadenas de PEG con un peso molecular menor, comparado con relativamente menos cadenas de PEG con un peso molecular mayor. Asimismo, cada forma diferente de uricasa puede tener un óptimo diferente tanto respecto al tamaño como al número de cadenas. El número óptimo de cadenas de PEG y el peso molecular de PEG pueden determinarse fácilmente usando los métodos descritos en la presente memoria.There are several factors that can influence the choice of molecular weight and number of optimal PEG chains for the coupling to a given form of uricase. In general, The reduction or elimination of lossless immunogenicity substantial uricolytic activity may require coupling of relatively more PEG chains with a lower molecular weight, compared to relatively less PEG chains with a weight major molecular. Also, each different form of uricase can have a different optimum both in size and number of chains. The optimal number of PEG chains and molecular weight of PEG can be easily determined using the methods described In the present memory.
Cuando los conjugados de PEG de uricasa de mamíferos se prepararon a partir de las formas tetraméricas y octaméricas de la enzima (que contienen cuatro u ocho subunidades de aproximadamente 35 kDa), muestran una inmunogenicidad en ratones profundamente disminuida, en contraste con la inmunogenicidad moderada de los conjugados de PEG de preparaciones de uricasa que contienen agregados grandes (véase la Figura 6) y la muy alta inmunogenicidad de la enzima no modificada.When PEG conjugates of uricase from mammals were prepared from tetrameric forms and enzyme octamers (containing four or eight subunits of approximately 35 kDa), show an immunogenicity in mice profoundly decreased, in contrast to immunogenicity moderate PEG conjugates of uricase preparations that they contain large aggregates (see Figure 6) and the very high Immunogenicity of the unmodified enzyme.
Las preparaciones purificadas de uricasas naturales y recombinantes contienen habitualmente una mezcla de agregados muy grandes de la enzima, además de las formas tetraméricas (140 kDa) y octaméricas (280 kDa). El porcentaje de cada preparación de uricasa que está en forma tetramérica u octamérica varía generalmente de aproximadamente 20% a 95% (véanse las Figuras 2-4). A pesar de la evidencia de que los agregados no PEGilados de otras muchas proteínas son altamente inmunogénicos (véanse, p. ej., Moore, WV, et al., (1980) J Clin Endocrinol Metab 51:691-697), estudios previos de PEG-uricasa no describen esfuerzos para limitar el contenido de agregados, lo que sugiere que no se consideró la inmunogenicidad potencial de los agregados de PEG modificados. Tomando como base las observaciones de los presentes inventores, parece probable que dichos agregados estaban presentes en las preparaciones de enzima usadas para las síntesis previas de PEG-uricasa. Su presencia puede haber hecho más difícil la tarea de preparar conjugados no inmunogénicos. También parece que las grandes pérdidas de actividad uricolítica observadas en esfuerzos previos para PEGilar uricasa estaban relacionados con el gran número de cadenas de bajo peso molecular de PEG que se acoplaron. Por otra parte, los métodos para purificar y PEGilar uricasa descritos en la presente memoria permiten la unión covalente de tantas como 12 cadenas de PEG por subunidad mientras que se retiene más del 75% de la actividad uricolítica, al menos para determinadas uricasas, p. ej., uricasa PKS (una muteína de uricasa porcina) y la enzima de Bacillus sp. termofílicas.Purified preparations of natural and recombinant uricases usually contain a mixture of very large aggregates of the enzyme, in addition to the tetrameric (140 kDa) and octameric (280 kDa) forms. The percentage of each uricase preparation that is in tetrameric or octameric form generally ranges from about 20% to 95% (see Figures 2-4). Despite the evidence that the non-PEGylated aggregates of many other proteins are highly immunogenic (see, e.g. , Moore, WV, et al ., (1980) J Clin Endocrinol Metab 51 : 691-697), previous studies of PEG-uricase do not describe efforts to limit the content of aggregates, suggesting that the potential immunogenicity of modified PEG aggregates was not considered. Based on the observations of the present inventors, it seems likely that such aggregates were present in the enzyme preparations used for previous PEG-uricase syntheses. Its presence may have made the task of preparing non-immunogenic conjugates more difficult. It also seems that the large losses of uricolytic activity observed in previous efforts for PEGilar uricasa were related to the large number of low molecular weight PEG chains that were coupled. On the other hand, the methods for purifying and PEGilar uricase described herein allow the covalent attachment of as many as 12 PEG chains per subunit while retaining more than 75% of the uricolytic activity, at least for certain uricases, e.g. eg , PKS uricase (a porcine uricase mutein) and Bacillus sp . thermophilic
En otra realización preferida, pueden eliminarse sustancialmente todos los agregados grandes de la enzima por cromatografía de intercambio iónico (Figuras 1-3) o cromatografía de exclusión por tamaño a un pH entre aproximadamente 9 y 10,5, preferiblemente 10,2, antes de la conjugación con PEG de la preparación de uricasa resultante sustancialmente sin agregados. El peso molecular de la uricasa en cada fracción de la columna preparativa puede monitorizarse por cualquier técnica analítica dependiente de tamaño, incluyendo, por ejemplo, HPLC, cromatografía de exclusión por tamaño convencional, centrifugación, dispersión de la luz, electroforesis capilar o electroforesis en gel en un tampón no desnaturalizante. En el caso de la uricasa sin agregados aislada usando cromatografía de exclusión por tamaño, las fracciones que contienen sólo las formas de 140 kDa y 280 kDa de la enzima pueden juntarse y usarse para conjugación con PEG. En el caso de la uricasa tetramérica más octamérica aislada usando cromatografía de intercambio iónico, las fracciones de la columna de intercambio iónico pueden analizarse respecto al tamaño para determinar qué fracciones contienen cantidades sustanciales de las formas tetraméricas y octaméricas sin los agregados grandes detectados por dispersión de la luz. En el producto purificado, los agregados grandes no deseados pueden constituir así tan poco como aproximadamente 1% o menos de la uricasa total.In another preferred embodiment, they can be removed substantially all large aggregates of the enzyme by ion exchange chromatography (Figures 1-3) or size exclusion chromatography at a pH between approximately 9 and 10.5, preferably 10.2, before conjugation with PEG of the resulting uricase preparation substantially without aggregates. The molecular weight of uricase in each fraction of the column Preparative can be monitored by any analytical technique size dependent, including, for example, HPLC, chromatography of exclusion by conventional size, centrifugation, dispersion of light, capillary electrophoresis or gel electrophoresis in a buffer non-denaturing In the case of uricase without aggregates isolated using size exclusion chromatography, the fractions that contain only the 140 kDa and 280 kDa forms of the enzyme can combined and used for conjugation with PEG. In the case of uricase tetrameric plus octameric isolated using chromatography of ion exchange, exchange column fractions ionic can be analyzed for size to determine what fractions contain substantial amounts of the forms tetrameric and octameric without the large aggregates detected by light scattering In the purified product, the aggregates large unwanted can constitute as little as approximately 1% or less of total uricase.
Los resultados presentados en la presente memoria indican que, incluso cuando están muy PEGiladas, las formas de uricasa PKS más grandes de octámero provocan aclaramiento acelerado (Figura 5) y son en algún grado inmunogénicas en ratones (Figura 6). Por el contrario, los conjugados preparados a partir de uricasa que no tiene esencialmente agregados grandes (detectables por dispersión de la luz) podrían reinyectarse al menos seis veces en intervalos semanales con mucha menos evidencia de tasas de aclaramiento acelerado (Figura 5) y sin la formación detectable de anticuerpos, según se mide por un inmunoensayo ligado a enzima sensible (Figura 6). El uso de uricasa tetramérica u octamérica altamente purificada distingue más los conjugados mejorados de la presente invención de las preparaciones PEG-uricasa descritas previamente. Por el contrario, la presencia de un contenido significativo de agregados grandes en las preparaciones de uricasa usadas por algunos investigadores previos pueden haberles hecho acoplar números altos de cadenas de PEG con la intención de suprimir la inmunogenicidad. Consecuentemente, la actividad enzimática de los conjugados resultantes disminuyó sustancialmente.The results presented here memory indicate that, even when very PEGylated, the forms of larger octamer PKS uricase cause clearance accelerated (Figure 5) and are to some extent immunogenic in mice (Figure 6). On the contrary, conjugates prepared from uricase that has essentially no large aggregates (detectable by light scattering) could be reinjected at least six times at weekly intervals with much less evidence of rates of accelerated clearance (Figure 5) and without the detectable formation of antibodies, as measured by an enzyme linked immunoassay sensitive (Figure 6). The use of tetrameric or octameric uricase highly purified distinguishes more improved conjugates from the present invention of PEG-uricase preparations previously described. On the contrary, the presence of a significant content of large aggregates in preparations of uricase used by some previous researchers may have coupled high numbers of PEG chains with the intention of suppress immunogenicity. Consequently, the activity Enzyme of the resulting conjugates decreased substantially.
Los conjugados PEG-uricasa de la presente invención son útiles para disminuir los niveles de ácido úrico en los fluidos y tejidos corporales de mamíferos, preferiblemente seres humanos, y pueden usarse así para el tratamiento de los niveles elevados de ácido úrico asociados con condiciones que incluyen gota, tofo, insuficiencia renal, transplante de órganos y enfermedades malignas. Los conjugados PEG-uricasa pueden inyectarse en un mamífero que tiene niveles excesivos de ácido úrico por cualquiera de varias vías, incluyendo las vías intravenosa, subcutánea, intradérmica, intramuscular e intraperitoneal. Alternativamente, pueden aerosolizarse e inhalarse. Véanse Patton, JS, (1996) Adv Drug Delivery Rev 19:3-36 y la Patente de EEUU 5.458.135. La dosis eficaz de PEG-uricasa de la presente invención dependerá del nivel de ácido úrico y del tamaño del individuo. En una realización de este aspecto de la invención, la PEG-uricasa se administra en un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad que va de aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 1 g. En una realización preferida, la cantidad administrada está entre aproximadamente 100 \mug y 500 mg. Más preferiblemente, la uricasa conjugada se administra en una cantidad entre 1 mg y 100 mg, tal como, por ejemplo, 5 mg, 20 mg ó 50 mg. Las masas proporcionadas para las cantidades de dosificación de las realizaciones se refieren a la cantidad de proteína en el conjugado.The PEG-uricase conjugates of the present invention are useful for lowering uric acid levels in mammalian body fluids and tissues, preferably humans, and can thus be used for the treatment of elevated uric acid levels associated with conditions that include gout, tofo, kidney failure, organ transplantation and malignant diseases. PEG-uricase conjugates can be injected into a mammal that has excessive levels of uric acid by any of several routes, including intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular and intraperitoneal. Alternatively, they can be aerosolized and inhaled. See Patton, JS, (1996) Adv Drug Delivery Rev 19 : 3-36 and US Patent 5,458,135. The effective dose of PEG-uricase of the present invention will depend on the level of uric acid and the size of the individual. In an embodiment of this aspect of the invention, PEG-uricase is administered in a pharmaceutically acceptable excipient or diluent in an amount ranging from about 10 µg to about 1 g. In a preferred embodiment, the amount administered is between about 100 µg and 500 mg. More preferably, the conjugated uricase is administered in an amount between 1 mg and 100 mg, such as, for example, 5 mg, 20 mg or 50 mg. The masses provided for the dosage amounts of the embodiments refer to the amount of protein in the conjugate.
Las formulaciones farmacéuticas que contienen PEG-uricasa pueden prepararse por técnicas convencionales, p. ej., como se describe en Gennaro, AR (Ed.) (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Edición, Easton, PA; Mack Publishing Co. Los excipientes adecuados para la preparación de disoluciones inyectables incluyen, por ejemplo, disolución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer con lactato, agua, polioles y glicerol. Las composiciones farmacéuticas para inyección parenteral comprenden líquidos estériles acuosos o no acuosos, dispersiones, suspensiones o emulsiones farmacéuticamente aceptables así como polvos estériles para reconstitución en disoluciones o dispersiones estériles inyectables justo antes de su uso. Estas formulaciones pueden contener componentes adicionales, tales como, por ejemplo, conservantes, solubilizantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, tampones, antioxidantes y diluyentes.Pharmaceutical formulations containing PEG uricase can be prepared by conventional techniques, e.g. eg , as described in Gennaro, AR (Ed.) (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences , 18th Edition, Easton, PA; Mack Publishing Co. Suitable excipients for the preparation of injectable solutions include, for example, phosphate buffered saline, Ringer's solution with lactate, water, polyols and glycerol. Pharmaceutical compositions for parenteral injection comprise sterile aqueous or non-aqueous liquids, dispersions, suspensions or pharmaceutically acceptable emulsions as well as sterile powders for reconstitution into sterile injectable solutions or dispersions just prior to use. These formulations may contain additional components, such as, for example, preservatives, solubilizers, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, buffers, antioxidants and diluents.
La PEG-uricasa también puede proporcionarse como composiciones de liberación controlada para implante en un individuo para controlar continuamente los niveles elevados de ácido úrico en los fluidos corporales. Por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, colágeno regenerado, poli-L-lisina, alginato sódico, goma gellan, quitosán, agarosa, liposomas multilamelares y muchas otras formulaciones de liberación lenta convencionales comprenden materiales bioerodibles o biodegradables que pueden formularse con las composiciones biológicamente activas. Estos materiales, cuando se implantan o inyectan, se degradan gradualmente y liberan el material activo en el tejido circundante. Por ejemplo, un método para encapsular PEG-uricasa comprende el método descrito en la Patente de EEUU 5.653.974. El uso de formulaciones bioerodibles, biodegradables y otras de formulación lenta se contempla expresamente en la presente invención. El uso de bombas de infusión y sistemas de atrapamiento en una matriz para la administración de PEG-uricasa también está en el alcance de la presente invención. PEG-uricasa puede estar incluida ventajosamente en micelas o liposomas. La tecnología de encapsulación en liposomas es muy conocida en la técnica. Véase, p, ej., Lasic, D, et al., (Eds.) (1995) Stealth Liposomes. Boca Raton, FL; CRC Press.PEG-uricase can also be provided as controlled release compositions for implantation in an individual to continuously monitor elevated uric acid levels in body fluids. For example, polylactic acid, polyglycolic acid, regenerated collagen, poly-L-lysine, sodium alginate, gellan gum, chitosan, agarose, multilamellar liposomes and many other conventional slow release formulations comprise bioerodible or biodegradable materials that can be formulated with biologically compositions. active. These materials, when implanted or injected, gradually degrade and release the active material in the surrounding tissue. For example, a method of encapsulating PEG-uricase comprises the method described in US Patent 5,653,974. The use of bioerodible, biodegradable and other slow formulation formulations is expressly contemplated in the present invention. The use of infusion pumps and entrapment systems in a matrix for the administration of PEG-uricase is also within the scope of the present invention. PEG-uricase may be advantageously included in micelles or liposomes. Liposome encapsulation technology is well known in the art. See , e.g., Lasic, D, et al ., (Eds.) (1995) Stealth Liposomes . Boca Raton, FL; CRC Press
Las composiciones farmacéuticas de PEG-uricasa de la invención disminuirán la necesidad de hemodiálisis en pacientes con alto riesgo de fallo renal inducido por urato, p. ej., receptores de transplante de órganos (véase Venkataseshan, VS, et al., (1990) Nephron 56:317-321) y pacientes con algunas enfermedades malignas. En pacientes con grandes acumulaciones de urato cristalino (tofo), dichas composiciones farmacéuticas mejorarán la calidad de vida más rápidamente que los tratamientos que están disponibles actualmente.PEG-uricase pharmaceutical compositions of the invention will decrease the need for hemodialysis in patients at high risk of urate-induced renal failure, e.g. eg , organ transplant recipients ( see Venkataseshan, VS, et al ., (1990) Nephron 56 : 317-321) and patients with some malignant diseases. In patients with large accumulations of crystalline urate (tofo), these pharmaceutical compositions will improve the quality of life faster than the treatments that are currently available.
Los ejemplos siguientes, que no deben considerarse limitativos de la invención de ninguna forma, ilustran los diferentes aspectos descritos anteriormente. Estos ejemplos describen PEG-uricasas preparadas acoplando PEG activado (p. ej., el derivado carbonato de p-nitrofenilo) con una muteína de uricasas porcinas. Estos ejemplos proporcionan una guía para un experto en la técnica para producir conjugados de uricasa sustancialmente no inmunogénicos que retienen al menos aproximadamente 75% de la actividad uricolítica de la enzima no modificada y que son idóneos para la administración crónica.The following examples, which should not be construed as limiting the invention in any way, illustrate the different aspects described above. These examples describe PEG-uricases prepared by coupling activated PEG ( e.g. , the p- nitrophenyl carbonate derivative) with a porcine uricases mutein. These examples provide a guide for one skilled in the art to produce substantially non-immunogenic uricase conjugates that retain at least about 75% of the unmodified enzyme uricolytic activity and that are suitable for chronic administration.
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La cromatografía de intercambio iónico preparativa se realizó en un equipo de Cromatografía Líquida de Proteína Rápida (FPLC) (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). La columna Mono Q (1 x 10 cm, Amersham Pharmacia) se eluyó con un gradiente de 50 mM carbonato de sodio, pH 10,3, 0,1 M NaCl (Tampón A) a 50 mM carbonato de sodio, pH 10,3, 0,6 M NaCl (Tampón B) con una velocidad de flujo de 0,5 ml/min, excepto que la muestra se cargó a una velocidad de flujo menor. Esta técnica se usó para fraccionar 25 mL de una disolución de uricasa PKS (pH 10,3). La uricasa PKS se obtuvo de Bio-Technology General Limited (Rehovot, Israel). La última es una uricasa porcina recombinante en la que un resto de lisina (K) y un resto de serina (S) se han reemplazado por un resto de arginina y un resto de treonina, respectivamente, en la secuencia porcina parental (Lee et al. (1988) Science 239:1288-1291; Wu et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:9412-9416). Después de cargar la muestra, la columna se lavó con 100 mL de Tampón A. El pico de uricasa empezó a eluir al final de un gradiente lineal de 31 mL de 0 a 28% de Tampón B. La mayor parte de la uricasa se eluyó isocráticamente con 7 mL de tampón que contenía 26% de Tampón B. El resto de la uricasa recuperada se eluyó con un gradiente lineal de 89 mL de 26% a 100% de tampón B. Se recogieron fracciones de 4 mL ó 6 mL. Se ensayaron alicuotas de las Fracciones #4-11 para uricasa y proteína total (Figura 1) y se analizaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de exclusión por tamaño como se describe en el Ejemplo 2 (Figuras 2 y 3). El resto de las partes de las Fracciones #5-10 se acoplaron a PEG, como se describe en el Ejemplo 3. Tomando como base los resultados de los análisis del Ejemplo 2, los conjugados PEG de las Fracciones #5 y 6 se combinaron como el "Conjunto Bajo en Sal" y los conjugados PEG de las Fracciones #7-10 se combinaron como el "Conjunto Alto en Sal", como se indica en la Figura 1.Preparative ion exchange chromatography was performed on a Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) kit (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). Mono Q column (1 x 10 cm, Amersham Pharmacia) was eluted with a gradient of 50 mM sodium carbonate, pH 10.3, 0.1 M NaCl (Buffer A) at 50 mM sodium carbonate, pH 10.3 0.6 M NaCl (Buffer B) with a flow rate of 0.5 ml / min, except that the sample was loaded at a lower flow rate. This technique was used to fractionate 25 mL of a PKS uricase solution (pH 10.3). PKS uricase was obtained from Bio-Technology General Limited (Rehovot, Israel). The latter is a recombinant swine uricase in which a lysine (K) residue and a serine (S) residue have been replaced by an arginine residue and a threonine residue, respectively, in the parental porcine sequence (Lee et al . (1988) Science 239 : 1288-1291; Wu et al . (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 86 : 9412-9416). After loading the sample, the column was washed with 100 mL of Buffer A. The uricase peak began to elute at the end of a linear gradient of 31 mL of 0 to 28% Buffer B. Most of the uricase was eluted. isocratically with 7 mL of buffer containing 26% Buffer B. The rest of the recovered uricase was eluted with a linear gradient of 89 mL of 26% to 100% buffer B. Fractions of 4 mL or 6 mL were collected. Aliquots of Fractions # 4-11 were tested for uricase and total protein (Figure 1) and analyzed by high resolution liquid chromatography (HPLC) by size exclusion as described in Example 2 (Figures 2 and 3). The remaining parts of Fractions # 5-10 were coupled to PEG, as described in Example 3. Based on the results of the analyzes of Example 2, the PEG conjugates of Fractions # 5 and 6 were combined as the "Low Salt Assembly" and the PEG conjugates of Fractions # 7-10 were combined as the "High Salt Assembly", as indicated in Figure 1.
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La HPLC de exclusión por tamaño se realizó a temperatura ambiente en una columna Superdex 200 (1 x 30 cm, Amersham Pharmacia Biotech) en uricasa PKS no fraccionada y en fracciones seleccionadas de la cromatografía preparativa Mono Q de la uricasa PKS del Ejemplo 1. El eluato del monitor de absorbancia (UV 2000) de HPLC de Thermo Separations (Sunnyvale, CA) se analizó por dispersión de la luz a 90º de la luz incidente, usando un detector MiniDawn de Wyatt Technologies (Santa Barbara, CA).HPLC by size exclusion was performed at ambient temperature on a Superdex 200 column (1 x 30 cm, Amersham Pharmacia Biotech) in unfractionated PKS uricase and in Selected fractions of Mono Q preparative chromatography of PKS uricase from Example 1. The eluate of the absorbance monitor (UV 2000) from HPLC from Thermo Separations (Sunnyvale, CA) was analyzed by scattering the light at 90 ° of the incident light, using a MiniDawn detector from Wyatt Technologies (Santa Barbara, CA).
Los resultados mostrados en las Figuras 2-4 ilustran la resolución entre el tetrámero, octámero y los agregados mayores de la subunidad de uricasa y las diferentes proporciones de las señales detectadas de estas formas de uricasa en las diferentes muestras. A diferencia de la señal de absorbancia, que es directamente proporcional a la concentración, la señal de dispersión de la luz es proporcional al producto de la concentración por el tamaño de la unidad de dispersión de la luz. La sensibilidad resultante del detector de dispersión de la luz respecto a cantidades muy pequeñas de uricasa muy agregada reveló la presencia de los agregados mayores, que eluyeron a o cerca del volumen vacío (aproximadamente 7 mL).The results shown in the Figures 2-4 illustrate the resolution between the tetramer, octamer and the major aggregates of the uricase subunit and the different proportions of the signals detected in these ways of uricase in the different samples. Unlike the signal of absorbance, which is directly proportional to the concentration, the light scattering signal is proportional to the product of the concentration by the size of the light scattering unit. The resulting sensitivity of the light scattering detector regarding very small amounts of very added uricase revealed the presence of major aggregates, which eluted at or near the empty volume (approximately 7 mL).
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La uricasa PKS no fraccionada (de Bio-Technology General Limited) y la uricasa de las fracciones de la columna Mono Q del Ejemplo 1 se acoplaron a PEG de 10 kDa usando el derivado carbonato de p-nitrofenilo de PEG (NPC-PEG) obtenido de Shearwater Polymers (Huntsville, AL). La preparación de NPC-PEG a partir de PEG usando fenilcloroformatos se ha descrito en varias publicaciones (p. ej. Veronese, FM, et al., (1985) Appl Biochem Biotechnol 11:141-152; Kito, M, et al., (1996) J Clin Biochem Nutr 21:101-111) y NPC-PEG se ha usado para la síntesis de conjugados PEG-proteína por investigadores previos incluyendo los presentes inventores (p. ej. Veronese et al., supra; Sherman, MR, et al., en JM Harris, et al., (Eds.) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (p. 155-176) Washington, DC: American Chemical Society). Se determinó que el número de cadenas de PEG de 10 kDa acopladas a cada subunidad de uricasa era seis por el método descrito por Kumitani, M, et al., (1991) J Chromatogr 588:125-137.The unfractionated PKS uricase (from Bio-Technology General Limited) and the uricase from the Mono Q column fractions of Example 1 were coupled to 10 kDa PEG using the PEG p- nitrophenyl carbonate derivative (NPC-PEG) obtained from Shearwater Polymers (Huntsville, AL). The preparation of NPC-PEG from PEG using phenylchloroformates has been described in several publications ( eg Veronese, FM, et al ., (1985) Appl Biochem Biotechnol 11 : 141-152; Kito, M, et al . , (1996) J Clin Biochem Nutr 21 : 101-111) and NPC-PEG has been used for the synthesis of PEG-protein conjugates by previous researchers including the present inventors ( eg Veronese et al ., Supra ; Sherman, MR, et al ., In JM Harris, et al ., (Eds.) Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (p. 155-176) Washington, DC: American Chemical Society). The number of 10 kDa PEG chains coupled to each uricase subunit was determined to be six by the method described by Kumitani, M, et al ., (1991) J Chromatogr 588 : 125-137.
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Los conjugados PEG de uricasas de mamíferos recombinantes, preparados según el método del Ejemplo 3, se ajustaron a 1 mg de proteína/mL en disolución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, para inyección. Las muestras se congelaron y se almacenaron hasta que se analizaron o inyectaron. Las muestras se calentaron hasta 37ºC durante hasta 1 hora antes de la inyección en grupos de ocho ratones hembra BALB/c. Los grupos de ratones tenían pesos medios en el intervalo de 18-22 g al comienzo de los estudios.PEG conjugates of mammalian uricases recombinants, prepared according to the method of Example 3, are adjusted to 1 mg protein / mL in saline buffered with phosphate (PBS), pH 7.4, for injection. The samples were frozen and They were stored until analyzed or injected. The samples are heated to 37 ° C for up to 1 hour before injection in groups of eight female BALB / c mice. The groups of mice had average weights in the range of 18-22 g at the beginning of the studies.
Los pesos de todos los ratones se monitorizaron y se registraron las evidencias de reacciones adversas de las inyecciones u otras evidencias de mala salud. Veinticuatro horas después de cada una de seis inyecciones semanales, los animales se anestesiaron con ketamina y se obtuvieron 100-200 \muL de sangre retro-orbitalmente, excepto en el sacrificio (exsanguinación) en el que se recogió un volumen mayor. El suero se preparó a partir de sangre que había coagulado durante entre 4 y 32 horas a 2-8ºC. Los sueros se almacenaron a -20ºC. Los sueros se analizaron para actividad uricolítica como se describe en el Ejemplo 5 y se analizaron para anticuerpos frente a uricasas como se describe en el Ejemplo 6.The weights of all mice were monitored and evidence of adverse reactions of the injections or other evidence of poor health. Twenty four hours after each of six weekly injections, the animals will anesthetized with ketamine and 100-200 were obtained µL of blood retro-orbitally, except in the sacrifice (exsanguination) in which a larger volume was collected. The serum was prepared from blood that had clotted during between 4 and 32 hours at 2-8ºC. The sera are stored at -20 ° C. Serums were analyzed for activity. uricolytic as described in Example 5 and analyzed for antibodies against uricases as described in Example 6.
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Se realizó un ensayo de actividad basado en absorbancia de luz ultravioleta (ensayo UV) con 100 \muM ácido úrico como sustrato en 200 mM borato sódico, pH 9,2, en una adaptación a microplacas del método de I. Fridovich (J Biol Chem. (1965) 240:2491-2494). La disminución de la absorbancia a 292 nm se monitorizó durante 15 minutos a temperatura ambiente en una placa de 96 pocillos con un fondo transparente a UV (Costar, Corning, NY) usando un lector de microplacas SpectraMAX 250 de Molecular Devices (Sunnyvala, CA). Los datos se analizaron encontrando la pendiente máxima (en unidades de mili-absorbancia por minuto) de medidas de absorbancia hechas durante el intervalo durante el cual se oxidó entre 10 y 40% del sustrato. Los resultados obtenidos con este ensayo se ilustran en las Figuras 1 y 5.An activity test based on ultraviolet light absorbance (UV test) was performed with 100 µM uric acid as a substrate in 200 mM sodium borate, pH 9.2, in a microplate adaptation of the method of I. Fridovich ( J Biol Chem . (1965) 240 : 2491-2494). The decrease in absorbance at 292 nm was monitored for 15 minutes at room temperature in a 96-well plate with a transparent background at UV (Costar, Corning, NY) using a SpectraMAX 250 microplate reader from Molecular Devices (Sunnyvala, CA) . The data was analyzed by finding the maximum slope (in milli-absorbance units per minute) of absorbance measurements made during the interval during which 10 to 40% of the substrate was oxidized. The results obtained with this test are illustrated in Figures 1 and 5.
El valor medio de la vida media en suero de ratones a los que se inyectó por primera vez uricasa PKS acoplada a seis cadenas de PEG 10kDa por subunidad (6 x PEG 10 kDa PKS) fue 29 \pm 4 horas, tomando como base los datos de suero obtenidos 24 y 72 horas después de la inyección.The average serum half-life value of mice injected for the first time PKS uricase coupled to six PEG 10kDa chains per subunit (6 x PEG 10 kDa PKS) was 29 ± 4 hours, based on serum data obtained 24 and 72 hours after injection.
En experimentos independientes, se estableció que la actividad uricolítica detectable en los sueros de los ratones a los que se inyectó PEG-uricasa disminuía durante el almacenamiento a -20ºC y que la recuperación máxima de esta actividad se obtiene por una incubación de 4 horas a 37º antes del ensayo. La Figura 5 muestra que la recuperación de la actividad uricolítica después de inyecciones semanales repetidas de 6 x PEG 10 kDa uricasa PKS fue mayor cuando la enzima se purificó por cromatografía en columna Mono Q, como en el Ejemplo 1, antes de la PEGilación según el método del Ejemplo 3. La recuperación fue mayor después de la inyección de conjugados preparados a partir del conjunto de eluato alto en sal del Ejemplo 1 (véase la Figura 1), que tiene el menor contenido de los agregados muy grandes (véanse los perfiles de dispersión de la luz de las Fracciones 7-10 en la Figura 3). Se obtuvo una recuperación inmediata con los conjugados preparados a partir del conjunto de eluato bajo en sal a partir de la columna Mono Q del Ejemplo 1, y la recuperación más baja se obtuvo con los conjugados hechos a partir de uricasa PKS no fraccionada, que tiene el mayor contenido de agregados muy grandes (véase la Figura 2). Se observó el mismo orden de actividades relativas recuperadas en sueros después de inyecciones repetidas (conjunto alto en sal > conjunto bajo en sal > uricasa no fraccionada) independientemente de si se usó el ensayo UV descrito anteriormente o un ensayo colorimétrico adaptado de P. Fossati et al. (J. Clin Chem (1980) 26:227-231), e independientemente de si los sueros se incubaron a 37ºC antes de ensayarlos.In independent experiments, it was established that the detectable uricolytic activity in the sera of the mice in which PEG-uricase was injected decreased during storage at -20 ° C and that the maximum recovery of this activity is obtained by a 4-hour incubation at 37 ° before rehearsal Figure 5 shows that the recovery of uricolytic activity after repeated weekly injections of 6 x PEG 10 kDa PKS uricase was greater when the enzyme was purified by Mono Q column chromatography, as in Example 1, before PEGylation according to method of Example 3. Recovery was greater after injection of conjugates prepared from the high salt eluate assembly of Example 1 (see Figure 1), which has the lowest content of very large aggregates (see the profiles of light scattering of Fractions 7-10 in Figure 3). An immediate recovery was obtained with the conjugates prepared from the low salt eluate assembly from the Mono Q column of Example 1, and the lowest recovery was obtained with the conjugates made from unfractionated PKS uricase, which has the highest content of very large aggregates (see Figure 2). The same order of relative activities recovered in sera was observed after repeated injections (high salt set> low salt set> unfractionated uricase) regardless of whether the UV test described above or an adapted colorimetric test of P. Fossati et al . ( J. Clin Chem (1980) 26 : 227-231), and regardless of whether the sera were incubated at 37 ° C before testing.
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Se realizaron análisis ELISA no competitivos con uricasa porcina unida a placas de 96 pocillos Immulon 2 (Dynex Technologies, de VWR Scientific, San Francisco, CA). Los anticuerpos primarios fueron de ratones a los que se inyectó uricasa o conjugados 6 x PEG 10 kDa preparados según el método del Ejemplo 3. El anticuerpo secundario fue IgG anti-ratón de cabra acoplada con peroxidasa de rábano (Calbiochem-Novabiochem #401 253, La Jolla, CA) y el sustrato fue dihidrocloruro de \alpha-fenilendiamina (Sigma P-9187, St. Louis, MO), como describen B. Porstmann et al. (J Clin. Chem. Clin. Biochem. (1981) 19:435-440).Non-competitive ELISA analyzes were performed with swine uricase attached to Immulon 2 96-well plates (Dynex Technologies, of VWR Scientific, San Francisco, CA). The primary antibodies were from mice injected with uricase or 6 x PEG 10 kDa conjugates prepared according to the method of Example 3. The secondary antibody was goat anti-mouse IgG coupled with horseradish peroxidase (Calbiochem-Novabiochem # 401 253, La Jolla, CA) and the substrate was α-phenylenediamine dihydrochloride (Sigma P-9187, St. Louis, MO), as described by B. Porstmann et al . ( J Clin. Chem. Clin. Biochem . (1981) 19 : 435-440).
La Figura 6 ilustra los resultados de los análisis ELISA no competitivos. Los resultados demuestran que 6 x PEG 10 kDa uricasa PKS sintetizado según el método del Ejemplo 3 a partir del eluato alto en sal de la columna Mono Q del Ejemplo 1 (mostrado en la Figura 1) no produjo respuestas inmunes detectables en ninguno de los ocho ratones que recibieron inyecciones semanales durante seis semanas. Unos pocos de los ratones a los que se inyectó conjugados preparados a partir de uricasa PKS no fraccionada según el método del Ejemplo 3 mostraron respuestas inmunes bajas pero detectables. La incidencia más alta de respuestas inmunes fue en ratones a los que se inyectó conjugados preparados según el método del Ejemplo 3 a partir del conjunto de eluato bajo en sal de la columna Mono Q del Ejemplo 1.Figure 6 illustrates the results of the non-competitive ELISA analysis. The results show that 6 x PEG 10 kDa uricase PKS synthesized according to the method of Example 3 a starting from the high salt eluate of the Mono Q column of Example 1 (shown in Figure 1) did not produce detectable immune responses in none of the eight mice that received weekly injections for six weeks A few of the mice that were injected conjugates prepared from unfractionated PKS uricase according to the method of Example 3 showed low immune responses but detectable The highest incidence of immune responses was in mice injected with conjugates prepared according to the method of Example 3 from the low salt eluate assembly of Mono Q column of Example 1.
Sin la ventaja del detector de dispersión de la luz para los análisis de exclusión por tamaño en HPLC, como se describe en el Ejemplo 2, no hubiera sido evidente que la presencia de los agregados mayores, no de la forma octamérica de la uricasa, está asociada con la recuperación progresivamente disminuida de los conjugados PEG-uricasa después de inyecciones repetidas, como se observa en el Ejemplo 5 (Figura 5) y con una inmunogenicidad incrementada en ratones BALB/c, como se observa en el Ejemplo 6 (Figura 6). Estos resultados tienen implicaciones importantes para las especificaciones de la uricasa usada como material de partida para la producción de PEG-uricasa para uso clínico.Without the advantage of the dispersion detector of the light for size exclusion analyzes in HPLC, as described in Example 2, it would not have been evident that the presence of the major aggregates, not the octameric form of uricase, is associated with the progressively diminished recovery of PEG-uricase conjugates after injections repeated, as seen in Example 5 (Figure 5) and with a increased immunogenicity in BALB / c mice, as observed in Example 6 (Figure 6). These results have implications. important for the uricase specifications used as starting material for the production of PEG-uricase for clinical use.
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