ES2343105T3 - Urato oxidasa sin agregados para la preparacion de conjugados polimericos inmunogenicos. - Google Patents
Urato oxidasa sin agregados para la preparacion de conjugados polimericos inmunogenicos. Download PDFInfo
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Abstract
Un conjugado de uricasa que comprende una urato oxidasa purificada (uricasa) conjugada con poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido), en el que dicha uricasa contiene formas tetraméricas y octaméricas purificadas de la uricasa que se pueden preparar por eliminación de los agregados mayores que octámeros, en el que dicha uricasa no contiene más de aproximadamente 2% de agregados mayores que octámeros.
Description
Urato oxidasa sin agregados para la preparación
de conjugados poliméricos inmunogénicos.
Una parte de la investigación descrita en esta
solicitud se hizo con el apoyo de la U.S.-Israel Binational
Industrial Research and Development Foundation. De acuerdo con esto,
el Gobierno de EEUU puede tener determinados derechos en la
invención.
La presente invención se refiere a la
purificación y modificación química de proteínas para prolongar sus
vidas medias circulantes y reducir su inmunogenicidad. Más
específicamente, la invención se refiere a la eliminación de
agregados mayores que octámeros de urato oxidasas (uricasas) antes
de la conjugación con poli(etilen glicoles) o
poli(etilen óxidos). Esto elimina sustancialmente la
inmunogenicidad de la uricasa sin comprometer su actividad
uricolítica.
Las declaraciones contenidas en esta sección de
antecedentes no constituyen una admisión de la técnica anterior, en
lugar de esto reflejan los comentarios subjetivos del propio
inventor sobre el estado de la técnica y las interpretaciones del
estado de la técnica en el momento en el que se hizo la invención.
Estas interpretaciones pueden incluir la visión personal, no
descrita hasta este momento, de los inventores, cuyas visiones no
eran parte en sí mismas de la técnica anterior.
Las urato oxidasas (uricasas; E.C. 1.7.3.3) son
enzimas que catalizan la oxidación del ácido úrico a un producto
más soluble, alantoína, un metabolito de purina que se excreta más
fácilmente. Los seres humanos no producen uricasa enzimáticamente
activa, como resultado de varias mutaciones en el gen de la uricasa
adquiridas durante la evolución de los primates superiores. Wu, X,
et al., (1992) J Mol Evol
34:78-84. Consecuentemente, en individuos
susceptibles, concentraciones excesivas de ácido úrico en la sangre
(hiperuricemia) y en la orina (hiperuricosuria) pueden dar lugar a
artritis dolorosa (gota), depósitos de urato desfigurantes (tofos)
y fallo renal. En algunos individuos afectados, los fármacos
disponibles tales como allopurinol (un inhibidor de la síntesis del
ácido úrico) producen efectos adversos que limitan el tratamiento o
no alivian estas condiciones adecuadamente. Hande, KR, et
al., (1984) Am J Med 76:47-56;
Farn, AG, (1990) Baillière's Clin Rheumatol
4:177-192. Las inyecciones de uricasa pueden
disminuir la hiperuricemia y la hiperuricosuria, al menos
temporalmente. Como la uricasa es una proteína extraña para los
seres humanos, sin embargo, incluso la primera inyección de la
proteína no modificada de Aspergillus flavus indujo
reacciones anafilácticas en un cierto porcentaje de pacientes
tratados (Pui, C-H, et al., (1997)
Leukemia 11:1813-1816), y las
respuestas inmunológicas limitan su utilidad para el tratamiento
crónico o intermitente. Donadio, D, et al., (1981) Nouv
Presse Méd 10:711-712; Leaustic, M,
et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic
50:553-554.
La Solicitud de Patente de EEUU No. de Serie
09/370.084 y la Solicitud Internacional publicada No.
PCT/US99/
17514, describen poli(etilen glicol)-urato oxidasa (PEG-uricasa) que retiene al menos aproximadamente 75% de la actividad uricolítica de la uricasa no conjugada y tiene una inmunogenicidad sustancialmente reducida. En dicha uricasa purificada, cada subunidad está unida covalentemente a una media de 2 a 10 cadenas de PEG, en la que cada molécula de PEG puede tener un peso molecular de aproximadamente 5 kDa y 100 kDa.
17514, describen poli(etilen glicol)-urato oxidasa (PEG-uricasa) que retiene al menos aproximadamente 75% de la actividad uricolítica de la uricasa no conjugada y tiene una inmunogenicidad sustancialmente reducida. En dicha uricasa purificada, cada subunidad está unida covalentemente a una media de 2 a 10 cadenas de PEG, en la que cada molécula de PEG puede tener un peso molecular de aproximadamente 5 kDa y 100 kDa.
Se sabe que la agregación de proteínas
incrementa su inmunogenicidad. Este conocimiento ha contribuido al
desarrollo de métodos para agregar proteínas intencionadamente por
tratamientos tales como desnaturalización térmica y
entrecruzamiento por exposición a glutaraldehído antes de usarse en
la preparación de vacunas o para la inmunización de animales para
producir antisueros.
También se ha admitido que la agregación no
intencionada de proteínas contribuye a la inmunización o
sensibilización durante el uso clínico de proteínas terapéuticas,
p. ej. para la gamma globulina humana (Henney et al.
(1988) N. Engl. J. Med. 278:2244-2248)
y para la hormona del crecimiento humana (Moore et al. (1980)
J. Clin. Endocrinol. Metab.
51:691-697). La contribución de los agregados
a la inmunogenicidad del interferón alfa humano se ha demostrado en
ratones BALB/c (Braun et al. (1997) Pharm. Res.
14:1472-1478) y se ha desarrollado un ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) para su medida (Braun et
al. (1997) Pharm. Res.
14:1394-1400).
En contraste con los efectos conocidos de la
agregación en la inmunogenicidad de proteínas, no hay publicaciones
del efecto de la agregación en la inmunogenicidad de proteínas
conjugadas con poli(alquilen glicoles) tales como PEG.
Existe una necesidad de conjugados de poli(alquilen
glicol)-uricasa que eliminen sustancialmente la
inmunogenicidad de la uricasa sin comprometer su actividad
uricolítica. La presente invención proporciona dichas
composiciones.
La conjugación de proteínas con
poli(alquilen glicoles), especialmente PEG, produce
conjugados con una inmunogenicidad reducida y una persistencia
incrementada en la corriente sanguínea. En un intento de producir
conjugados de uricasa sustancialmente no inmunogénicos que retienen
sustancialmente toda la actividad uricolítica de la preparación de
uricasa no modificada, se descubrió que trazas de agregados grandes
de uricasa en el material de partida eran sorprendentemente
eficaces para provocar tanto la formación de anticuerpos como el
aclaramiento acelerado de la circulación, siendo ambos
perjudiciales, después de inyecciones repetidas de los conjugados
con PEG preparados a partir de uricasa que contiene dichos
agregados. Sorprendentemente, los presentes inventores encontraron
que la inmunogenicidad incrementada y el aclaramiento acelerado
no eran debidos a la presencia de agregados bien definidos,
de tamaño moderado de la subunidad de la uricasa que son mayores que
el tetrámero nativo, p. ej. agregados que contienen ocho
subunidades (octámeros). La forma octamérica de la uricasa está
presente en concentraciones suficientemente altas en la mayoría de
las preparaciones de uricasa como para ser detectable por su
absorbancia de luz UV, p. ej. a 214 nm ó 276 nm, o por su
contribución al índice de refracción u otras medidas de la
concentración de proteínas. No obstante, se encontró que los
octámeros en sí mismos contribuyen mínimamente a la inmunogenicidad
y aclaramiento acelerado de los conjugados
PEG-uricasa, en contraste con las cantidades mucho
menores de los agregados mucho mayores que no son detectables por
absorbancia de UV en las condiciones ensayadas pero que se detectan
fácilmente por dispersión de la luz estática (Raleigh) o dinámica.
Por lo tanto, se encontró que la eliminación de dichas trazas de
agregados muy grandes antes de la conjugación con PEG disminuía la
inmunogenicidad y el aclaramiento acelerado de los conjugados
PEG-uricasa resultantes en un grado
sorprendente.
Una realización de la presente invención es un
conjugado de uricasa que comprende una urato oxidasa (uricasa)
purificada conjugada con poli(etilen glicol) o
poli(etilen óxido), en el que dicha uricasa contiene formas
tetraméricas y octaméricas de la uricasa purificadas que se pueden
preparar por eliminación de los agregados mayores que octámeros, en
el que dicha uricasa no contiene más de aproximadamente 2% de
agregados mayores que octámeros. Preferiblemente, la uricasa es una
uricasa de mamíferos. Más preferiblemente, la uricasa es uricasa de
hígado porcino, hígado bovino o hígado ovino. En un aspecto de esta
realización preferida, la uricasa es recombinante. En otro aspecto
de esta realización preferida, la uricasa tiene sustancialmente la
secuencia de uricasa de hígado porcino, bovino, ovino o de babuino.
Ventajosamente, la uricasa es quimérica. Preferiblemente, la
uricasa es uricasa PKS. En otro aspecto de esta realización
preferida, la uricasa tiene sustancialmente la secuencia de la
uricasa de hígado de babuino en la que la tirosina 97 se ha
reemplazado por histidina. Preferiblemente, la uricasa comprende un
extremo amino terminal y un extremo carboxi terminal, y en la que
la uricasa está truncada en un extremo o ambos extremos.
Ventajosamente, la uricasa es una uricasa fúngica o microbiana.
Preferiblemente, la uricasa fúngica o microbiana se aísla de
Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis,
Bacillus sp. o Candida utilis, o es una enzima
recombinante que tiene sustancialmente la secuencia de una de
dichas uricasas. Alternativamente, la uricasa es una uricasa de
invertebrados. Preferiblemente, la uricasa de invertebrados se
aísla de Drosophila melanogaster o Drosophila
pseudoobscura, o es una enzima recombinante que tiene
sustancialmente la secuencia de una de dichas uricasas. En otro
aspecto de esta realización preferida, la uricasa es una uricasa de
plantas. Preferiblemente, la uricasa de plantas se aísla a partir
de los nódulos radiculares de Glycine max o es una enzima
recombinante que tiene sustancialmente la secuencia de la
uricasa.
En un aspecto de esta realización preferida, la
uricasa descrita anteriormente se conjuga con poli(etilen
glicol) o poli(etilen óxido) en condiciones tales que la
uricasa en el conjugado no tiene sustancialmente agregados mayores
que octámeros. Preferiblemente, la uricasa se conjuga con
poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido) mediante una
unión uretano (carbamato), amina secundaria o amida. En un aspecto
de esta realización preferida, el poli(etilen glicol) es
monometoxi poli(etilen glicol). En otro aspecto de esta
realización preferida, el poli(etilen glicol) o
poli(etilen óxido) tiene un peso molecular entre
aproximadamente 5 kDa y 30 kDa. Preferiblemente, el
poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido) tiene un peso
molecular entre aproximadamente 10 kDa y 20 kDa. Ventajosamente, el
número medio de cadenas de dicho poli(etilen glicol) o
poli(etilen óxido) es entre aproximadamente 2 y 12 cadenas
por subunidad de uricasa. Más ventajosamente, el número medio de
cadenas de dicho poli(etilen glicol) o poli(etilen
óxido) es entre aproximadamente 6 y 10 por subunidad de uricasa. Lo
más ventajosamente, el número medio de cadenas de dicho
poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido) es entre
aproximadamente 7 y 9 por subunidad de uricasa. Preferiblemente, el
poli(etilen glicol) o poli(etilen óxido) es lineal.
Alternativamente, el poli(etilen glicol) o poli(etilen
óxido) es ramificado.
La presente invención también proporciona una
composición farmacéutica para disminuir los niveles de ácido úrico
en un fluido o tejido corporal, que comprende el conjugado de
uricasa descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Preferiblemente, la composición se estabiliza por
liofilización y se disuelve después de la reconstitución para
proporcionar disoluciones adecuadas para la administración
parenteral.
Otra realización de la invención es un método
para purificar uricasa que tiene una inmunogenicidad reducida, que
comprende la etapa de separar los agregados de uricasa mayores que
octámeros en fracciones de uricasa, y excluir dichos agregados de
la uricasa purificada. Preferiblemente, la etapa de separación
comprende la etapa de detectar los agregados mayores que octámeros
de al menos una parte de las fracciones de uricasa y excluir las
fracciones que contienen los agregados. Ventajosamente, la etapa de
detección comprende la medida de la dispersión de la luz.
La presente invención también proporciona
uricasa aislada preparada por el método descrito anteriormente.
La Figura 1 ilustra la actividad uricasa,
concentraciones totales de proteína y sal en fracciones de una
columna de intercambio aniónico Pharmacia Biotech Mono Q (1 x 10
cm). La actividad uricasa se midió a temperatura ambiente
monitorizando la disminución de la absorbancia a 292 nm de 100
\muM de ácido úrico en 200 nM de borato sódico, pH 9,2. La
proteína total se determinó a partir del área bajo la curva del pico
de absorbancia de uricasa en análisis de exclusión por tamaño en
HPLC.
La Figura 2 ilustra el análisis de exclusión por
tamaño en HPLC en una columna Pharmacia Superdex 200 (1 x 30 cm) de
la carga y fracciones seleccionadas de una cromatografía preparativa
Mono Q de uricasa porcina que contiene las mutaciones R291K y T301S
(uricasa PKS) que muestra datos obtenidos por un detector de
dispersión de la luz a 90ºC (curvas superiores) y por absorbancia a
276 nm (curvas inferiores). Las diferentes intensidades de la señal
de las formas tetraméricas, octaméricas y más altamente agregadas de
uricasa en la muestra no fraccionada (carga) y las diferentes
fracciones son evidentes. La carga se diluyó 1/5 con tampón de la
columna Mono Q, la fracción 5 se diluyó 1/3 y la fracción 6 se
diluyó 1/9. Las fracciones 5 y 6 se combinaron para formar el
"conjunto bajo en sal".
La Figura 3 ilustra el análisis de exclusión por
tamaño de las fracciones de la columna Mono Q de la Figura 1, que
muestra los datos obtenidos por un detector de dispersión de la luz
a 90º y por absorbancia a 276 nm, como en la Figura 2. Las
fracciones mostradas en esta figura se usaron para formar el
"conjunto alto en sal", a partir del cual se prepararon los
conjugados con PEG y se inyectaron en ratones BALB/c. Las
actividades en suero resultantes y las respuestas inmunológicas de
los ratones BALB/c se muestran en las Figuras 5 y 6.
La Figura 4 ilustra el contenido en octámero,
determinado por absorbancia a 276 nm y por dispersión de la luz a
90º, calculado a partir de los datos de las Figuras 2 y 3, de
uricasa PKS sin fraccionar y de fracciones seleccionadas de la
cromatografía en columna preparativa MonoQ de uricasa PKS (Figura
1).
La Figura 5 ilustra los ensayos UV, como en la
Figura 1, de la actividad uricasa después de una incubación de 4
horas a 37ºC, en sueros recogidos 24 horas después de cada una de
las seis inyecciones semanales de conjugados de 6 x
10-kDa PEG de uricasa PKS o de conjuntos de
fracciones de la columna Mono Q.
La Figura 6 ilustra el análisis ELISA de la
formación de anticuerpo IgG frente a conjugados de PEG de uricasa
PKS y frente a conjugados de PEG de los conjuntos de fracciones de
la columna Mono Q mostrados en la Figura 1, en sueros recogidos 24
horas después de cada una de las seis inyecciones semanales de
ratones hembra BALB/c con 0,2 mg de proteína uricasa por 20 gramos
de peso corporal. Para cada ratón, se muestran los datos de
sangrados 24 horas después de la primera de seis inyecciones de
izquierda a derecha. Las condiciones del ensayo se describen en el
Ejemplo 6. Los datos para los ocho ratones de cada grupo se
organizaron en orden creciente de respuesta inmune, de izquierda a
derecha.
Los estudios previos han mostrado que cuando se
consigue una reducción significativa de la inmunogenicidad y/o
antigenicidad de la uricasa por conjugación con PEG (PEGilación),
está invariablemente asociada con una pérdida sustancial de la
actividad uricolítica. La presente invención incluye la observación
de que trazas de agregados de urato oxidasas mayores que octámeros
contribuyen sustancialmente a la inmunogenicidad y a la inducción
de aclaramiento acelerado de los conjugados
PEG-uricasa. Lo más probable es que este
descubrimiento sea aplicable a proteínas distintas de las uricasas,
incluyendo interferones y factores de crecimiento.
La seguridad, conveniencia y rentabilidad de los
compuestos biofarmacéuticos se ven influidas adversamente por las
disminuciones en sus potencias y la necesidad resultante de
incrementar la dosis administrada. Así, existe una necesidad de un
medio alternativo seguro y eficaz para disminuir los niveles
elevados de ácido úrico en los fluidos corporales, incluyendo la
sangre y la orina. La presente invención proporciona un método para
producir uricasa que excluye los agregados de uricasa mayores que
octámeros para usarse en la síntesis de
PEG-uricasa. Esta PEG-uricasa
retiene toda o casi toda la actividad uricolítica de la enzima no
modificada. La presente invención también proporciona uricasa
purificada sustancialmente sin agregados mayores que octámeros. El
término "sustancialmente sin" indica que la uricasa purificada
no comprende más de aproximadamente 2%, y preferiblemente no más de
aproximadamente 1% de agregados mayores que octámeros.
La presente invención proporciona un método para
purificar uricasa de manera que los agregados mayores que octámeros
se excluyen de la preparación purificada. Debido a que estos
agregados grandes son altamente inmunogénicos, su presencia en la
preparación de uricasa purificada no es deseable. El método implica
la monitorización de las fracciones de la columna por dispersión de
la luz en lugar de o además de absorbancia ultravioleta a 280 nm,
ya que los agregados pueden estar demasiado diluidos para ser
detectados por absorbancia ultravioleta. La uricasa purificada se
conjuga entonces con polímeros solubles en agua, preferiblemente
poli(etilen glicoles) o poli(etilen óxidos) como se
describe en la Solicitud de EEUU No. de Serie 09/370.084 en
tramitación con la presente.
La eliminación de la uricasa agregada de una
preparación que consiste predominantemente en uricasa tetramérica
puede conseguirse por cualquiera de los métodos conocidos por los
expertos en la técnica, incluyendo cromatografía de exclusión por
tamaño, cromatografía de intercambio iónico, ultrafiltración a
través de una membrana microporosa y centrifugación, incluyendo
ultracentrifugación. El método de separación puede incluir la
separación y análisis de fracciones y el rechazo o exclusión de
aquellas fracciones que contienen cantidades excesivas de agregados
grandes. La preparación de uricasa resultante es más adecuada para
la síntesis de conjugados sustancialmente no inmunogénicos de
uricasa que la uricasa no fraccionada. Para la administración
crónica, es importante que los conjugados PEG de proteínas, p.
ej. PEG-uricasa, tengan una baja inmunogenicidad
y que no provoquen progresivamente un aclaramiento más rápido de la
corriente sanguínea después de dosis repetidas.
La invención también proporciona composiciones
farmacéuticas de los conjugados polímero-uricasa.
Estos conjugados son sustancialmente no inmunogénicos y retienen al
menos 75%, preferiblemente 85% y más preferiblemente 95% o más de
la actividad uricolítica de la enzima no modificada. Las uricasas
adecuadas para conjugación con polímeros solubles en agua incluyen
las urato oxidasas naturales aisladas de bacterias, hongos y tejidos
de plantas y animales, tanto vertebrados como invertebrados, así
como formas recombinantes de uricasa, incluyendo variantes de
uricasa mutadas, híbridas y/o truncadas enzimáticamente activas. Los
polímeros solubles en agua adecuados para usarse en la presente
invención incluyen poli(etilen glicoles) o poli(etilen
óxidos) lineales y ramificados, conocidos todos comúnmente como
PEG. Los ejemplos de PEG ramificados son el tema de la Patente de
EEUU 5.643.575. Un ejemplo preferido de PEG lineal es monometoxiPEG,
que tiene la estructura general
CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}H, en la que n
varía de aproximadamente 100 a aproximadamente 2.300.
Una realización de la presente invención es un
conjugado de urato oxidasa (uricasa) que retiene al menos
aproximadamente 75% de la actividad uricolítica de la uricasa no
conjugada y tiene una inmunogenicidad sustancialmente reducida. La
uricasa de este aspecto de la invención puede ser recombinante. Ya
sea recombinante o no, la uricasa puede ser de origen mamífero. En
un aspecto de esta realización, la uricasa puede ser uricasa de
hígado porcino, bovino u ovino. En otro aspecto de esta
realización, la uricasa puede ser quimérica. La uricasa quimérica
puede contener partes de uricasa de hígado porcino y/o de hígado de
babuino. Por ejemplo, la uricasa quimérica puede ser uricasa
porcina que contiene las mutaciones R291K y T301S (uricasa PKS).
Alternativamente, la uricasa puede ser uricasa de hígado de babuino
en la que la tirosina 97 se ha reemplazado por histidina, por lo
cual la actividad específica de la uricasa puede incrementarse al
menos aproximadamente 60%. La uricasa de la invención,
independientemente del origen, también puede estar en una forma que
está truncada, bien en el extremo amino terminal o en el extremo
carboxilo terminal o en ambos extremos. Asimismo, la uricasa puede
ser uricasa fúngica o microbiana. En un aspecto de esta
realización, la uricasa fúngica o microbiana puede ser una forma de
uricasa natural o recombinante de Aspergillus flavus,
Arthrobacter globiformis, Bacillus sp. o Candida
utilis. Alternativamente, la uricasa puede ser una uricasa de
invertebrados, tal como, por ejemplo, una forma de uricasa natural
o recombinante de Drosophila melanogaster o Drosophila
pseudoobscura. La uricasa de la invención también puede ser una
uricasa de plantas, por ejemplo, una forma de uricasa natural o
recombinante de nódulo radicular de soja (Glycine max). El
PEG puede tener un peso molecular medio entre aproximadamente 5 kDa
y 100 kDa; preferiblemente el PEG puede tener un peso molecular
medio entre aproximadamente 8 kDa y 60 kDa; más preferiblemente, el
PEG puede tener un peso molecular medio entre aproximadamente 10 kDa
y 40 kDa, tal como, por ejemplo, 10 a 20 kDa. El número medio de
cadenas de PEG covalentemente acopladas puede ser 2 a 12 cadenas
por subunidad de uricasa; preferiblemente, el número medio de
cadenas covalentemente acopladas puede ser 6 a 10 por subunidad;
más preferiblemente, el número medio de cadenas de PEG puede ser 7 a
9 por subunidad. En un aspecto de esta realización, la uricasa
puede ser tetramérica. Las cadenas de PEG pueden estar unidas
covalentemente a la uricasa mediante uniones uretano (carbamato),
uniones de amina secundaria y/o uniones amida. Cuando la uricasa es
una forma recombinante de cualquiera de las uricasas mencionadas en
la presente memoria, la forma recombinante puede tener
sustancialmente la secuencia de la forma natural.
Una uricasa de mamíferos preferida es uricasa
quimérica de cerdo-babuino recombinante, compuesta
por partes de las secuencia de uricasa de hígado de cerdo y de
hígado de babuino, habiéndose determinado las dos en primer lugar
por Wu, et al. (1989). Un ejemplo de dicha uricasa quimérica
contiene los primeros 288 aminoácidos de la secuencia porcina (SEQ
ID NO: 1) y los últimos 16 aminoácidos de la secuencia de babuino
(SEQ ID NO: 2). Hershfield et al., Publicación Internacional
WO 00/08196, Urato Oxidasa, publicado el 17 de febrero, 2000. Como
la última secuencia se diferencia de la secuencia porcina sólo en
dos posiciones, que tienen una lisina (K) en lugar de arginina en
el resto 291 y una serina (S) en lugar de treonina en el resto 301,
este mutante se refiere como uricasa de cerdo K-S o
PKS (SEQ ID NO: 3). La uricasa PKS tiene un resto más de lisina y,
por lo tanto, un sitio potencial más de PEGilación respecto a la
secuencia porcina y de babuino. Las secuencias se muestran en la
Tabla A.
Los ADNc de varias uricasas de mamíferos,
incluyendo uricasa PKS, se subclonaron y se determinaron las
condiciones óptimas para la expresión en E. coli, usando
métodos estándar. Véanse Erlich, HA, (Ed.) (1989) PCR Technology.
Principles and Applications for DNA Amplification. Nueva York:
Stockton Press; Sambrook, J, et al., (1989) Molecular
Cloning. A Laboratory Manual, Segunda Edición. Cold Spring
Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Las uricasas
recombinantes se extrajeron, se purificaron y se evaluó su
estabilidad y actividad usando una modificación de ensayos
estándar. Véanse Fridovich, I, (1965) J Biol Chem
240:2491-2494; Nishimura, et al.,
(1979), y los Ejemplos 1 y 5.
En una realización de la invención, la uricasa
puede conjugarse mediante una unión biológicamente estable, no
tóxica, covalente a un número de cadenas de PEG relativamente
pequeño. Dichas uniones pueden incluir uniones uretano (carbamato),
uniones amina secundaria, y uniones amida. Varios PEG activados
adecuados para dicha conjugación están disponibles comercialmente
en Shearwater Polymers, Huntsville, AL.
\newpage
Por ejemplo, las uniones uretano con la uricasa
pueden formarse incubando la uricasa en presencia del derivado
carbonato de succinimidilo (SC) o carbonato de p-nitrofenilo
(NPC) de PEG. SC-PEG puede sintetizarse usando el
procedimiento descrito en la Patente de EEUU 5.612.460.
NPC-PEG puede sintetizarse haciendo reaccionar PEG
con cloroformato de p-nitrofenilo según los métodos descritos
en Veronese, FM, et al., (1985) Appl Biochem
Biotechnol 11:141-152, y en la Patente de
EEUU 5.286.637. Los métodos descritos en la patente '637 se adaptan
a los PEG de alto peso molecular ajustando las concentraciones de
los reactantes para mantener una estequiometría similar. Un método
alternativo de síntesis de NPC-PEG se describe en
Büttner, W, et al., Especificación de Patente de Alemania
del Este DD 279 486 A1.
Las uniones amida con la uricasa pueden
obtenerse usando un éster de N-hidroxisuccinimida de un
derivado de ácido carboxílico de PEG (Shearwater Polymers). Las
uniones de amina secundaria pueden formarse usando
2,2,2-trifluoroetanosulfonil PEG (tresil PEG;
Shearwater Polymers) o por alquilación reductora usando PEG
aldehído (Shearwater Polymers) y cianoborohidruro de sodio.
En los conjugados que contienen PEG con un peso
molecular de 10 kDa, el número máximo de cadenas de PEG que estaban
acopladas por subunidad, que retenían al menos 75% de la actividad
uricolítica de la enzima no modificada, fue aproximadamente 12
cadenas para las uricasas de mamíferos (p. ej. uricasa PKS,
una muteína de uricasa porcina; véanse las condiciones de ensayo en
el Ejemplo 5). El último grado de PEGilación corresponde a
aproximadamente 40% de los grupos amino totales. En una realización
de la invención, el número medio de cadenas de PEG acopladas por
subunidad de uricasa es aproximadamente entre 2 y 12. En una
realización preferida, el número medio de cadenas de PEG acopladas
por subunidad de uricasa es aproximadamente entre 6 y 10. En una
realización más preferida, el número medio de cadenas de PEG unidas
covalentemente por subunidad de uricasa es aproximadamente entre 7
y 9. En otra realización, el peso molecular del PEG usado para la
reacción de acoplamiento es aproximadamente entre 5 kDa y 30 kDa,
preferiblemente aproximadamente entre 10 kDa y 20 kDa.
Hay varios factores que pueden influir en la
elección del peso molecular y número de cadenas de PEG óptimos para
el acoplamiento a una forma dada de la uricasa. En general, La
reducción o eliminación de la inmunogenicidad sin pérdida
sustancial de actividad uricolítica puede requerir el acoplamiento
de relativamente más cadenas de PEG con un peso molecular menor,
comparado con relativamente menos cadenas de PEG con un peso
molecular mayor. Asimismo, cada forma diferente de uricasa puede
tener un óptimo diferente tanto respecto al tamaño como al número
de cadenas. El número óptimo de cadenas de PEG y el peso molecular
de PEG pueden determinarse fácilmente usando los métodos descritos
en la presente memoria.
Cuando los conjugados de PEG de uricasa de
mamíferos se prepararon a partir de las formas tetraméricas y
octaméricas de la enzima (que contienen cuatro u ocho subunidades
de aproximadamente 35 kDa), muestran una inmunogenicidad en ratones
profundamente disminuida, en contraste con la inmunogenicidad
moderada de los conjugados de PEG de preparaciones de uricasa que
contienen agregados grandes (véase la Figura 6) y la muy alta
inmunogenicidad de la enzima no modificada.
Las preparaciones purificadas de uricasas
naturales y recombinantes contienen habitualmente una mezcla de
agregados muy grandes de la enzima, además de las formas
tetraméricas (140 kDa) y octaméricas (280 kDa). El porcentaje de
cada preparación de uricasa que está en forma tetramérica u
octamérica varía generalmente de aproximadamente 20% a 95% (véanse
las Figuras 2-4). A pesar de la evidencia de que los
agregados no PEGilados de otras muchas proteínas son altamente
inmunogénicos (véanse, p. ej., Moore, WV, et al.,
(1980) J Clin Endocrinol Metab
51:691-697), estudios previos de
PEG-uricasa no describen esfuerzos para limitar el
contenido de agregados, lo que sugiere que no se consideró la
inmunogenicidad potencial de los agregados de PEG modificados.
Tomando como base las observaciones de los presentes inventores,
parece probable que dichos agregados estaban presentes en las
preparaciones de enzima usadas para las síntesis previas de
PEG-uricasa. Su presencia puede haber hecho más
difícil la tarea de preparar conjugados no inmunogénicos. También
parece que las grandes pérdidas de actividad uricolítica observadas
en esfuerzos previos para PEGilar uricasa estaban relacionados con
el gran número de cadenas de bajo peso molecular de PEG que se
acoplaron. Por otra parte, los métodos para purificar y PEGilar
uricasa descritos en la presente memoria permiten la unión covalente
de tantas como 12 cadenas de PEG por subunidad mientras que se
retiene más del 75% de la actividad uricolítica, al menos para
determinadas uricasas, p. ej., uricasa PKS (una muteína de
uricasa porcina) y la enzima de Bacillus sp.
termofílicas.
En otra realización preferida, pueden eliminarse
sustancialmente todos los agregados grandes de la enzima por
cromatografía de intercambio iónico (Figuras 1-3) o
cromatografía de exclusión por tamaño a un pH entre aproximadamente
9 y 10,5, preferiblemente 10,2, antes de la conjugación con PEG de
la preparación de uricasa resultante sustancialmente sin agregados.
El peso molecular de la uricasa en cada fracción de la columna
preparativa puede monitorizarse por cualquier técnica analítica
dependiente de tamaño, incluyendo, por ejemplo, HPLC, cromatografía
de exclusión por tamaño convencional, centrifugación, dispersión de
la luz, electroforesis capilar o electroforesis en gel en un tampón
no desnaturalizante. En el caso de la uricasa sin agregados aislada
usando cromatografía de exclusión por tamaño, las fracciones que
contienen sólo las formas de 140 kDa y 280 kDa de la enzima pueden
juntarse y usarse para conjugación con PEG. En el caso de la uricasa
tetramérica más octamérica aislada usando cromatografía de
intercambio iónico, las fracciones de la columna de intercambio
iónico pueden analizarse respecto al tamaño para determinar qué
fracciones contienen cantidades sustanciales de las formas
tetraméricas y octaméricas sin los agregados grandes detectados por
dispersión de la luz. En el producto purificado, los agregados
grandes no deseados pueden constituir así tan poco como
aproximadamente 1% o menos de la uricasa total.
Los resultados presentados en la presente
memoria indican que, incluso cuando están muy PEGiladas, las formas
de uricasa PKS más grandes de octámero provocan aclaramiento
acelerado (Figura 5) y son en algún grado inmunogénicas en ratones
(Figura 6). Por el contrario, los conjugados preparados a partir de
uricasa que no tiene esencialmente agregados grandes (detectables
por dispersión de la luz) podrían reinyectarse al menos seis veces
en intervalos semanales con mucha menos evidencia de tasas de
aclaramiento acelerado (Figura 5) y sin la formación detectable de
anticuerpos, según se mide por un inmunoensayo ligado a enzima
sensible (Figura 6). El uso de uricasa tetramérica u octamérica
altamente purificada distingue más los conjugados mejorados de la
presente invención de las preparaciones PEG-uricasa
descritas previamente. Por el contrario, la presencia de un
contenido significativo de agregados grandes en las preparaciones
de uricasa usadas por algunos investigadores previos pueden haberles
hecho acoplar números altos de cadenas de PEG con la intención de
suprimir la inmunogenicidad. Consecuentemente, la actividad
enzimática de los conjugados resultantes disminuyó
sustancialmente.
Los conjugados PEG-uricasa de la
presente invención son útiles para disminuir los niveles de ácido
úrico en los fluidos y tejidos corporales de mamíferos,
preferiblemente seres humanos, y pueden usarse así para el
tratamiento de los niveles elevados de ácido úrico asociados con
condiciones que incluyen gota, tofo, insuficiencia renal,
transplante de órganos y enfermedades malignas. Los conjugados
PEG-uricasa pueden inyectarse en un mamífero que
tiene niveles excesivos de ácido úrico por cualquiera de varias
vías, incluyendo las vías intravenosa, subcutánea, intradérmica,
intramuscular e intraperitoneal. Alternativamente, pueden
aerosolizarse e inhalarse. Véanse Patton, JS, (1996) Adv
Drug Delivery Rev 19:3-36 y la Patente de
EEUU 5.458.135. La dosis eficaz de PEG-uricasa de
la presente invención dependerá del nivel de ácido úrico y del
tamaño del individuo. En una realización de este aspecto de la
invención, la PEG-uricasa se administra en un
excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad
que va de aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 1 g. En una
realización preferida, la cantidad administrada está entre
aproximadamente 100 \mug y 500 mg. Más preferiblemente, la
uricasa conjugada se administra en una cantidad entre 1 mg y 100 mg,
tal como, por ejemplo, 5 mg, 20 mg ó 50 mg. Las masas
proporcionadas para las cantidades de dosificación de las
realizaciones se refieren a la cantidad de proteína en el
conjugado.
Las formulaciones farmacéuticas que contienen
PEG-uricasa pueden prepararse por técnicas
convencionales, p. ej., como se describe en Gennaro, AR
(Ed.) (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª
Edición, Easton, PA; Mack Publishing Co. Los excipientes adecuados
para la preparación de disoluciones inyectables incluyen, por
ejemplo, disolución salina tamponada con fosfato, disolución de
Ringer con lactato, agua, polioles y glicerol. Las composiciones
farmacéuticas para inyección parenteral comprenden líquidos
estériles acuosos o no acuosos, dispersiones, suspensiones o
emulsiones farmacéuticamente aceptables así como polvos estériles
para reconstitución en disoluciones o dispersiones estériles
inyectables justo antes de su uso. Estas formulaciones pueden
contener componentes adicionales, tales como, por ejemplo,
conservantes, solubilizantes, estabilizantes, agentes humectantes,
emulsionantes, tampones, antioxidantes y diluyentes.
La PEG-uricasa también puede
proporcionarse como composiciones de liberación controlada para
implante en un individuo para controlar continuamente los niveles
elevados de ácido úrico en los fluidos corporales. Por ejemplo,
ácido poliláctico, ácido poliglicólico, colágeno regenerado,
poli-L-lisina, alginato sódico, goma
gellan, quitosán, agarosa, liposomas multilamelares y muchas otras
formulaciones de liberación lenta convencionales comprenden
materiales bioerodibles o biodegradables que pueden formularse con
las composiciones biológicamente activas. Estos materiales, cuando
se implantan o inyectan, se degradan gradualmente y liberan el
material activo en el tejido circundante. Por ejemplo, un método
para encapsular PEG-uricasa comprende el método
descrito en la Patente de EEUU 5.653.974. El uso de formulaciones
bioerodibles, biodegradables y otras de formulación lenta se
contempla expresamente en la presente invención. El uso de bombas de
infusión y sistemas de atrapamiento en una matriz para la
administración de PEG-uricasa también está en el
alcance de la presente invención. PEG-uricasa puede
estar incluida ventajosamente en micelas o liposomas. La tecnología
de encapsulación en liposomas es muy conocida en la técnica.
Véase, p, ej., Lasic, D, et al., (Eds.) (1995)
Stealth Liposomes. Boca Raton, FL; CRC Press.
Las composiciones farmacéuticas de
PEG-uricasa de la invención disminuirán la necesidad
de hemodiálisis en pacientes con alto riesgo de fallo renal
inducido por urato, p. ej., receptores de transplante de
órganos (véase Venkataseshan, VS, et al., (1990)
Nephron 56:317-321) y pacientes con
algunas enfermedades malignas. En pacientes con grandes
acumulaciones de urato cristalino (tofo), dichas composiciones
farmacéuticas mejorarán la calidad de vida más rápidamente que los
tratamientos que están disponibles actualmente.
Los ejemplos siguientes, que no deben
considerarse limitativos de la invención de ninguna forma, ilustran
los diferentes aspectos descritos anteriormente. Estos ejemplos
describen PEG-uricasas preparadas acoplando PEG
activado (p. ej., el derivado carbonato de
p-nitrofenilo) con una muteína de uricasas porcinas. Estos
ejemplos proporcionan una guía para un experto en la técnica para
producir conjugados de uricasa sustancialmente no inmunogénicos que
retienen al menos aproximadamente 75% de la actividad uricolítica de
la enzima no modificada y que son idóneos para la administración
crónica.
\newpage
La cromatografía de intercambio iónico
preparativa se realizó en un equipo de Cromatografía Líquida de
Proteína Rápida (FPLC) (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ). La
columna Mono Q (1 x 10 cm, Amersham Pharmacia) se eluyó con un
gradiente de 50 mM carbonato de sodio, pH 10,3, 0,1 M NaCl (Tampón
A) a 50 mM carbonato de sodio, pH 10,3, 0,6 M NaCl (Tampón B) con
una velocidad de flujo de 0,5 ml/min, excepto que la muestra se
cargó a una velocidad de flujo menor. Esta técnica se usó para
fraccionar 25 mL de una disolución de uricasa PKS (pH 10,3). La
uricasa PKS se obtuvo de Bio-Technology General
Limited (Rehovot, Israel). La última es una uricasa porcina
recombinante en la que un resto de lisina (K) y un resto de serina
(S) se han reemplazado por un resto de arginina y un resto de
treonina, respectivamente, en la secuencia porcina parental (Lee
et al. (1988) Science
239:1288-1291; Wu et al. (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
86:9412-9416). Después de cargar la muestra,
la columna se lavó con 100 mL de Tampón A. El pico de uricasa empezó
a eluir al final de un gradiente lineal de 31 mL de 0 a 28% de
Tampón B. La mayor parte de la uricasa se eluyó isocráticamente con
7 mL de tampón que contenía 26% de Tampón B. El resto de la uricasa
recuperada se eluyó con un gradiente lineal de 89 mL de 26% a 100%
de tampón B. Se recogieron fracciones de 4 mL ó 6 mL. Se ensayaron
alicuotas de las Fracciones #4-11 para uricasa y
proteína total (Figura 1) y se analizaron por cromatografía líquida
de alta resolución (HPLC) de exclusión por tamaño como se describe
en el Ejemplo 2 (Figuras 2 y 3). El resto de las partes de las
Fracciones #5-10 se acoplaron a PEG, como se
describe en el Ejemplo 3. Tomando como base los resultados de los
análisis del Ejemplo 2, los conjugados PEG de las Fracciones #5 y 6
se combinaron como el "Conjunto Bajo en Sal" y los conjugados
PEG de las Fracciones #7-10 se combinaron como el
"Conjunto Alto en Sal", como se indica en la Figura 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La HPLC de exclusión por tamaño se realizó a
temperatura ambiente en una columna Superdex 200 (1 x 30 cm,
Amersham Pharmacia Biotech) en uricasa PKS no fraccionada y en
fracciones seleccionadas de la cromatografía preparativa Mono Q de
la uricasa PKS del Ejemplo 1. El eluato del monitor de absorbancia
(UV 2000) de HPLC de Thermo Separations (Sunnyvale, CA) se analizó
por dispersión de la luz a 90º de la luz incidente, usando un
detector MiniDawn de Wyatt Technologies (Santa Barbara, CA).
Los resultados mostrados en las Figuras
2-4 ilustran la resolución entre el tetrámero,
octámero y los agregados mayores de la subunidad de uricasa y las
diferentes proporciones de las señales detectadas de estas formas
de uricasa en las diferentes muestras. A diferencia de la señal de
absorbancia, que es directamente proporcional a la concentración,
la señal de dispersión de la luz es proporcional al producto de la
concentración por el tamaño de la unidad de dispersión de la luz.
La sensibilidad resultante del detector de dispersión de la luz
respecto a cantidades muy pequeñas de uricasa muy agregada reveló la
presencia de los agregados mayores, que eluyeron a o cerca del
volumen vacío (aproximadamente 7 mL).
\vskip1.000000\baselineskip
La uricasa PKS no fraccionada (de
Bio-Technology General Limited) y la uricasa de las
fracciones de la columna Mono Q del Ejemplo 1 se acoplaron a PEG de
10 kDa usando el derivado carbonato de p-nitrofenilo de PEG
(NPC-PEG) obtenido de Shearwater Polymers
(Huntsville, AL). La preparación de NPC-PEG a partir
de PEG usando fenilcloroformatos se ha descrito en varias
publicaciones (p. ej. Veronese, FM, et al., (1985)
Appl Biochem Biotechnol 11:141-152;
Kito, M, et al., (1996) J Clin Biochem Nutr
21:101-111) y NPC-PEG se ha
usado para la síntesis de conjugados PEG-proteína
por investigadores previos incluyendo los presentes inventores
(p. ej. Veronese et al., supra; Sherman, MR,
et al., en JM Harris, et al., (Eds.)
Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological
Applications. ACS Symposium Series 680 (p.
155-176) Washington, DC: American Chemical
Society). Se determinó que el número de cadenas de PEG de 10 kDa
acopladas a cada subunidad de uricasa era seis por el método
descrito por Kumitani, M, et al., (1991) J Chromatogr
588:125-137.
\vskip1.000000\baselineskip
Los conjugados PEG de uricasas de mamíferos
recombinantes, preparados según el método del Ejemplo 3, se
ajustaron a 1 mg de proteína/mL en disolución salina tamponada con
fosfato (PBS), pH 7,4, para inyección. Las muestras se congelaron y
se almacenaron hasta que se analizaron o inyectaron. Las muestras se
calentaron hasta 37ºC durante hasta 1 hora antes de la inyección en
grupos de ocho ratones hembra BALB/c. Los grupos de ratones tenían
pesos medios en el intervalo de 18-22 g al comienzo
de los estudios.
Los pesos de todos los ratones se monitorizaron
y se registraron las evidencias de reacciones adversas de las
inyecciones u otras evidencias de mala salud. Veinticuatro horas
después de cada una de seis inyecciones semanales, los animales se
anestesiaron con ketamina y se obtuvieron 100-200
\muL de sangre retro-orbitalmente, excepto en el
sacrificio (exsanguinación) en el que se recogió un volumen mayor.
El suero se preparó a partir de sangre que había coagulado durante
entre 4 y 32 horas a 2-8ºC. Los sueros se
almacenaron a -20ºC. Los sueros se analizaron para actividad
uricolítica como se describe en el Ejemplo 5 y se analizaron para
anticuerpos frente a uricasas como se describe en el Ejemplo 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un ensayo de actividad basado en
absorbancia de luz ultravioleta (ensayo UV) con 100 \muM ácido
úrico como sustrato en 200 mM borato sódico, pH 9,2, en una
adaptación a microplacas del método de I. Fridovich (J Biol
Chem. (1965) 240:2491-2494). La
disminución de la absorbancia a 292 nm se monitorizó durante 15
minutos a temperatura ambiente en una placa de 96 pocillos con un
fondo transparente a UV (Costar, Corning, NY) usando un lector de
microplacas SpectraMAX 250 de Molecular Devices (Sunnyvala, CA). Los
datos se analizaron encontrando la pendiente máxima (en unidades de
mili-absorbancia por minuto) de medidas de
absorbancia hechas durante el intervalo durante el cual se oxidó
entre 10 y 40% del sustrato. Los resultados obtenidos con este
ensayo se ilustran en las Figuras 1 y 5.
El valor medio de la vida media en suero de
ratones a los que se inyectó por primera vez uricasa PKS acoplada a
seis cadenas de PEG 10kDa por subunidad (6 x PEG 10 kDa PKS) fue 29
\pm 4 horas, tomando como base los datos de suero obtenidos 24 y
72 horas después de la inyección.
En experimentos independientes, se estableció
que la actividad uricolítica detectable en los sueros de los
ratones a los que se inyectó PEG-uricasa disminuía
durante el almacenamiento a -20ºC y que la recuperación máxima de
esta actividad se obtiene por una incubación de 4 horas a 37º antes
del ensayo. La Figura 5 muestra que la recuperación de la actividad
uricolítica después de inyecciones semanales repetidas de 6 x PEG
10 kDa uricasa PKS fue mayor cuando la enzima se purificó por
cromatografía en columna Mono Q, como en el Ejemplo 1, antes de la
PEGilación según el método del Ejemplo 3. La recuperación fue mayor
después de la inyección de conjugados preparados a partir del
conjunto de eluato alto en sal del Ejemplo 1 (véase la Figura 1),
que tiene el menor contenido de los agregados muy grandes (véanse
los perfiles de dispersión de la luz de las Fracciones
7-10 en la Figura 3). Se obtuvo una recuperación
inmediata con los conjugados preparados a partir del conjunto de
eluato bajo en sal a partir de la columna Mono Q del Ejemplo 1, y la
recuperación más baja se obtuvo con los conjugados hechos a partir
de uricasa PKS no fraccionada, que tiene el mayor contenido de
agregados muy grandes (véase la Figura 2). Se observó el mismo orden
de actividades relativas recuperadas en sueros después de
inyecciones repetidas (conjunto alto en sal > conjunto bajo en
sal > uricasa no fraccionada) independientemente de si se usó el
ensayo UV descrito anteriormente o un ensayo colorimétrico adaptado
de P. Fossati et al. (J. Clin Chem (1980)
26:227-231), e independientemente de si los
sueros se incubaron a 37ºC antes de ensayarlos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron análisis ELISA no competitivos con
uricasa porcina unida a placas de 96 pocillos Immulon 2 (Dynex
Technologies, de VWR Scientific, San Francisco, CA). Los anticuerpos
primarios fueron de ratones a los que se inyectó uricasa o
conjugados 6 x PEG 10 kDa preparados según el método del Ejemplo 3.
El anticuerpo secundario fue IgG anti-ratón de
cabra acoplada con peroxidasa de rábano
(Calbiochem-Novabiochem #401 253, La Jolla, CA) y
el sustrato fue dihidrocloruro de
\alpha-fenilendiamina (Sigma
P-9187, St. Louis, MO), como describen B. Porstmann
et al. (J Clin. Chem. Clin. Biochem. (1981)
19:435-440).
La Figura 6 ilustra los resultados de los
análisis ELISA no competitivos. Los resultados demuestran que 6 x
PEG 10 kDa uricasa PKS sintetizado según el método del Ejemplo 3 a
partir del eluato alto en sal de la columna Mono Q del Ejemplo 1
(mostrado en la Figura 1) no produjo respuestas inmunes detectables
en ninguno de los ocho ratones que recibieron inyecciones semanales
durante seis semanas. Unos pocos de los ratones a los que se
inyectó conjugados preparados a partir de uricasa PKS no fraccionada
según el método del Ejemplo 3 mostraron respuestas inmunes bajas
pero detectables. La incidencia más alta de respuestas inmunes fue
en ratones a los que se inyectó conjugados preparados según el
método del Ejemplo 3 a partir del conjunto de eluato bajo en sal de
la columna Mono Q del Ejemplo 1.
Sin la ventaja del detector de dispersión de la
luz para los análisis de exclusión por tamaño en HPLC, como se
describe en el Ejemplo 2, no hubiera sido evidente que la presencia
de los agregados mayores, no de la forma octamérica de la uricasa,
está asociada con la recuperación progresivamente disminuida de los
conjugados PEG-uricasa después de inyecciones
repetidas, como se observa en el Ejemplo 5 (Figura 5) y con una
inmunogenicidad incrementada en ratones BALB/c, como se observa en
el Ejemplo 6 (Figura 6). Estos resultados tienen implicaciones
importantes para las especificaciones de la uricasa usada como
material de partida para la producción de
PEG-uricasa para uso clínico.
Claims (39)
1. Un conjugado de uricasa que comprende una
urato oxidasa purificada (uricasa) conjugada con poli(etilen
glicol) o poli(etilen óxido), en el que dicha uricasa
contiene formas tetraméricas y octaméricas purificadas de la
uricasa que se pueden preparar por eliminación de los agregados
mayores que octámeros, en el que dicha uricasa no contiene más de
aproximadamente 2% de agregados mayores que octámeros.
2. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
1, en el que la uricasa es uricasa de mamíferos.
3. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
2, en el que la uricasa es uricasa de hígado porcino, de hígado
bovino o de hígado ovino.
4. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
1, en el que la uricasa es recombinante.
5. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
4, en el que la uricasa tiene sustancialmente la secuencia de
uricasa de hígado porcino, bovino, ovino o de babuino.
6. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
1, en el que la uricasa es quimérica.
7. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
6, en el que la uricasa quimérica contiene partes de uricasa de
hígado porcino y de hígado de babuino.
8. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
6, en el que la uricasa quimérica es uricasa porcina en la que el
resto de arginina 291 de SEQ ID NO:1 se ha reemplazado por lisina
(R291 K) y el resto de treonina 301 de SEQ ID NO:1 se ha
reemplazado por serina (T301 S) (uricasa PKS).
9. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
4, en el que la uricasa tiene la secuencia de uricasa de hígado de
babuino que tiene SEQ ID NO:2 en la que el resto de tirosina 97 de
SEQ ID NO:2 se ha reemplazado por histidina.
10. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
4, en el que la uricasa comprende un extremo amino terminal y un
extremo carboxilo terminal, y en el que la uricasa está truncada en
un extremo o en ambos extremos.
11. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
1, en el que la uricasa es una uricasa fúngica o microbiana.
12. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
11, en el que la uricasa fúngica o microbiana se aísla de
Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis,
Bacillus sp. o Candida utilis, o es una enzima
recombinante que tiene sustancialmente la secuencia de una de dichas
uricasas.
13. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
1, en el que la uricasa es una uricasa de invertebrados.
14. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
13, en el que la uricasa de invertebrados se aísla de Drosophila
melanogaster o Drosophila pseudoobscura, o es una enzima
recombinante que tiene sustancialmente la secuencia de una de
dichas uricasas.
15. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
1, en el que la uricasa es una uricasa de plantas.
16. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
15, en el que la uricasa de plantas se aísla de nódulos radiculares
de Glycine max o es una enzima recombinante que tiene
sustancialmente la secuencia de dicha uricasa.
17. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
1, en el que dicho poli(etilen glicol) es monometoxi
poli(etilen glicol).
18. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
1, en el que dicha uricasa se conjuga con dicho poli(etilen
glicol) o poli(etilen óxido) mediante una unión seleccionada
del grupo que consiste en uretano (carbamato), amina secundaria y
amida.
19. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
1, en el que dicho poli(etilen glicol) o poli(etilen
óxido) tiene un peso molecular entre aproximadamente 5 kDa y 30
kDa.
20. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
19, en el que dicho poli(etilen glicol) o poli(etilen
óxido) tiene un peso molecular entre aproximadamente 10 kDa y 20
kDa.
21. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
1, en el que el número medio de cadenas de dicho poli(etilen
glicol) o poli(etilen óxido) es entre aproximadamente 2 y 12
por subunidad de uricasa.
22. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
21, en el que el número medio de cadenas de dicho poli(etilen
glicol) o poli(etilen óxido) es entre aproximadamente 6 y 10
por subunidad de uricasa.
23. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
22, en el que el número medio de cadenas de poli(etilen
glicol) o poli(etilen óxido) es entre aproximadamente 7 y 9
por subunidad de uricasa.
24. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
1, en el que el poli(etilen glicol) o poli(etilen
óxido) es lineal.
25. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
1, en el que el poli(etilen glicol) o poli(etilen
óxido) es ramificado.
26. Una composición farmacéutica para disminuir
los niveles de ácido úrico en un fluido o tejido corporal, que
comprende el conjugado de la Reivindicación 1 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
27. La composición farmacéutica de la
Reivindicación 26, en la que dicha composición se estabiliza por
liofilización y se disuelve después de reconstitución para
proporcionar disoluciones adecuadas para la administración
parenteral.
28. Un método para purificar uricasa que tiene
una inmunogenicidad reducida, que comprende la etapa de separar los
agregados de uricasa mayores que octámeros en fracciones de uricasa,
y excluir dichos agregados de la uricasa purificada, en el que la
uricasa purificada contiene formas tetraméricas y octaméricas
purificadas de la uricasa que se pueden preparar por eliminación de
los agregados mayores que octámeros, en el que dicha uricasa no
contiene más de aproximadamente 2% de agregados mayores que
octámeros.
29. El método de la Reivindicación 28, en el que
dicha etapa de separación se selecciona del grupo que consiste en
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por
tamaño, y ultrafiltración.
30. El método de la Reivindicación 28, en el que
dicha etapa de separación comprende la etapa de detectar los
agregados mayores que octámeros en las fracciones de uricasa y
excluir dichas fracciones que contienen dichos agregados.
31. Uricasa aislada preparada por el método de
la reivindicación 28.
32. Un método para obtener un conjugado de
uricasa, comprendiendo dicho método las etapas de:
aplicar una disolución de uricasa que comprende
uricasa tetramérica, uricasa octamérica, y agregados de uricasa
mayores que octámeros en al menos una columna de separación;
recuperar de dicha columna una o más fracciones
que contienen uricasa tetramérica y octamérica aislada que se puede
preparar por eliminación de los agregados mayores que octámeros, en
el que dicha uricasa no contiene más de aproximadamente 2% de
agregados mayores que octámeros; y
PEGilar dicha uricasa.
33. El método de la Reivindicación 32, en el que
dicha columna de separación se selecciona del grupo que consiste en
columna de intercambio iónico y columna de exclusión por tamaño.
34. El método de la Reivindicación 33, en el que
dicha disolución de dicha uricasa se aplica en dicha columna a un
pH de 10,2.
35. El método de la Reivindicación 33, que
comprende además la etapa de analizar dichas fracciones para
determinar al menos una propiedad seleccionada del grupo que
consiste en presencia de dicha uricasa octamérica y ausencia de
agregados de uricasa que son mayores que octámeros.
36. El método de la Reivindicación 35, en el que
dicha etapa de análisis comprende al menos una técnica de análisis
seleccionada del grupo que consiste en cromatografía,
centrifugación, dispersión de la luz y electroforesis.
37. El método de la Reivindicación 36, en el que
dicha cromatografía es cromatografía líquida de alta resolución.
38. Un método para purificar uricasa que tiene
una inmunogenicidad reducida, que comprende: separar los agregados
de uricasa mayores que octámeros en fracciones de uricasa; y
recuperar una fracción, en el que dicha fracción contiene uricasa
octamérica pero no contiene agregados de uricasa mayores que
octámeros.
39. El conjugado de uricasa de la Reivindicación
1, en el que al menos 2,5% de dicha uricasa está en la forma
octamérica.
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