ES2343193T3 - Composicion medicinal para tratar el cancer o la diabetes. - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento del cáncer o la diabetes, que comprende un RNA de doble hebra mostrado en (A) o (B): (A)un RNA de doble hebra que consiste en una secuencia representada por el Nº ID SEC: 2, el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC: 8; (B) un RNA de doble hebra que consiste en una secuencia de 19 a 23 nucleótidos que es idéntica a una secuencia parcial de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3) y contiene la secuencia representada por el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4, o un RNA de doble hebra que consiste en una secuencia de 25 a 30 nucleótidos que es idéntica a una secuencia parcial de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3) y contiene la secuencia representada por el Nº ID SEC: 8, y el RNA de doble hebra inhibe la expresión de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3).
Description
Composición medicinal para tratar el cáncer o la
diabetes.
La presente invención se refiere a una
composición farmacéutica para tratar el cáncer o la diabetes.
Los inventores de la presente solicitud han
aislado satisfactoriamente un gen de sialidasa humana asociada con
la membrana plasmática (NEU3) (véase el Documento de Patente 1).
Mientras tanto, descubrieron que la expresión del gen está
potenciada en diversos cánceres humanos incluyendo el cáncer de
colon (véase el Documento No de Patente 1), el cáncer de próstata,
el cáncer de cabeza y cuello, etc., con pocas excepciones. Por otra
parte, se encontró que un ratón transgénico en el que se introducía
el gen desarrollaba diabetes (véase el Documento No de Patente 2),
y se descubrió y se encontró que el polimorfismo en el gen NEU3 en
pacientes con diabetes estaba profundamente implicado en el comienzo
de la diabetes Tipo 2.
Según se describe anteriormente, se ha sugerido
que la potenciación del nivel de expresión de sialidasa humana
asociada con la membrana plasmática está profundamente implicada en
la canceración de células y el comienzo de la diabetes. Basándose
en este hallazgo, los inventores de la presente invención han
proporcionado un método para diagnosticar el cáncer usando un
anticuerpo que reconoce específicamente una sialidasa humana
asociada con la membrana plasmática (véase el Documento de Patente
2).
Por otra parte, en los últimos años, como un
método para inhibir específicamente la expresión de un gen
particular, ha atraído la atención un método que usa interferencia
de RNA (RNAi) provocada por un RNA de doble hebra que tiene una
secuencia complementaria del gen. El mecanismo del método se
considera como sigue.
Cuando un RNA de doble hebra que tiene una
secuencia complementaria de un gen elegido para la inhibición de la
expresión se incorpora en las células, el RNA de doble hebra se
escinde con enzima de Dicer que pertenece a la familia III de
RNAasas y se procesa en fragmentos cortos de RNA de doble hebra de
aproximadamente 21 a 23 nucleótidos. Las hebras antisentido de los
fragmentos de RNA se unen separadamente a proteínas que tienen
actividades de ribonucleasa para formar complejos denominados RISC
(complejo silenciador inducido por RNA). Se considera que cuando
una hebra antisentido en el RISC se une a mRNA de un gen diana, el
mRNA se escinde para inhibir la expresión del gen diana (véase el
Documento No de Patente 3).
Se sabe generalmente que, cuando se usa RNA de
doble hebra de cadena larga (de al menos cientos de nucleótidos)
para inhibir la expresión de un gen de un nematodo, un hongo,
Drosophila, una planta, o similares, puede alcanzarse un efecto
superior de inhibición de la expresión. Sin embargo, en un sistema
celular de mamífero, la introducción de un RNA de doble hebra de
cadena larga activa una ruta de señal de interferón para provocar
citotoxicidad, así se considera que el método es difícil de aplicar
a células de mamífero. Sin embargo, posteriormente, se ha
desarrollado un método para evitar respuestas de interferón
introduciendo un RNA de doble hebra corto (por ejemplo, de
aproximadamente 21 a 23 nucleótidos) por adelantado, y se ha hecho
aplicable a células de mamífero (véase el Documento No de Patente
4). Tal RNA de doble hebra corto se denomina siRNA (RNA interferente
pequeño) y se espera que se aplique a un análisis de la función
génica o una terapia génica que usa virus (por ejemplo, véase el
Documento No de Patente 5). Sin embargo, no se ha conocido un siRNA
que inhibe la expresión de un gen de sialidasa humana asociada con
la membrana plasmática (NEU3) y no se ha conocido una composición
farmacéutica para tratar el cáncer o la diabetes usando tal
siRNA.
Documento de Patente 1: JP 3088681 B
Documento de Patente 2: JP
2003-55399 A
Documento No de Patente 1: Proc. Natl. Acad.
Sci., 99, 10718-10723, 2002
Documento No de Patente 2: J. Biol. Chem., 278,
27896-27902, 2003
Documento No de Patente 3: Molecular Medicine,
41(1), 10-29, 2004
Documento No de Patente 4: Nature, 411,
494-498, 2001
Documento No de Patente 5: Virus, 53(1),
p7-14, 2003
La presente invención se ha realizado desde el
punto de vista descrito anteriormente, y un objetivo de la presente
invención es proporcionar una composición farmacéutica para tratar
el cáncer o la diabetes que contiene un siRNA que inhibe
eficazmente la expresión de un gen de sialidasa humana asociada con
la membrana plasmática (NEU3).
Los inventores de la presente invención han
realizado estudios intensivos para alcanzar el objetivo descrito
anteriormente y, como resultado, han descubierto que un siRNA que
tiene una secuencia particular inhibe eficazmente la expresión de
un gen de sialidasa humana asociada con la membrana plasmática
(NEU3), completando de ese modo la presente invención.
Esto es, el resumen de la presente invención es
como sigue.
- (1)
- Una composición farmacéutica para tratar el cáncer o la diabetes, que comprende un RNA de doble hebra mostrado en (A) o (B):
- (A)
- un RNA de doble hebra que consiste en una secuencia representada por el Nº ID SEC: 2, el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC: 8;
- (B)
- un RNA de doble hebra que consiste en una secuencia de 19 a 23 nucleótidos que es idéntica a una secuencia parcial de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3) y contiene la secuencia representada por el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4, o un RNA de doble hebra que consiste en una secuencia de 25 a 30 nucleótidos que es idéntica a una secuencia parcial de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3) y contiene la secuencia representada por el Nº ID SEC: 8, y el RNA de doble hebra inhibe la expresión de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3).
- \quad
- También se describe una composición farmacéutica de acuerdo con (1), en la que el RNA de doble hebra tiene de 20 a 27 nucleótidos.
- (2)
- La composición farmacéutica de acuerdo con (1), en la que el RNA de doble hebra comprende además un extremo saliente 3' de 1 a 4 nucleótidos.
- (3)
- La composición farmacéutica para tratar el cáncer o la diabetes, que comprende un vector que tiene una secuencia de nucleótidos capaz de expresar el RNA de doble hebra de acuerdo con (1) o (2) en células humanas.
- (4)
- La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de (1) a (3), en donde el cáncer o la diabetes provoca un incremento en la expresión de un gen de sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3).
Posteriormente, en la presente memoria, se
describirán con detalle realizaciones preferidas de la presente
invención. Sin embargo, la presente invención no está limitada a las
siguientes realizaciones preferidas y puede modificarse libremente
dentro del alcance de la presente invención. Nótese que, en la
presente descripción, porcentaje indica en masa a no ser que se
especifique otra cosa.
Una composición farmacéutica para tratar el
cáncer o la diabetes de la presente invención (posteriormente, en
la presente memoria, denominada a veces meramente "la composición
farmacéutica de la presente invención") comprende el siguiente
RNA de doble hebra (A) o (B):
- (A)
- un RNA de doble hebra que consiste en una secuencia representada por el Nº ID SEC: 2, el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC: 8.
- (B)
- un RNA de doble hebra que consiste en una secuencia de 19 a 23 nucleótidos que es idéntica a una secuencia parcial de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3) y contiene la secuencia representada por el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4; o un RNA de doble hebra que consiste en una secuencia de 25 a 30 nucleótidos que es idéntica a una secuencia parcial de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3) y contiene la secuencia representada por el Nº ID SEC: 8, y el RNA de doble hebra inhibe la expresión de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3).
El RNA de doble hebra que ha de usarse en la
presente invención es un siRNA según se describe anteriormente e
inhibe la expresión de un gen que codifica sialidasa humana asociada
con la membrana plasmática (NEU3). La secuencia del gen se conoce y
divulga como el Nº de registro de GenBank/DDBJ AB008185 (JP 3088681
B).
El RNA de doble hebra que ha de usarse en la
presente invención incluye: (A) un RNA de doble hebra que consiste
en una secuencia representada por el Nº ID SEC: 2, el Nº ID SEC: 4 o
el Nº ID SEC: 8; o (B) un RNA de doble hebra que consiste en una
secuencia de 19 a 23 nucleótidos que es idéntica a una secuencia
parcial de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la
membrana plasmática (NEU3) y contiene la secuencia representada por
un Nº ID SEC: 2 o un Nº ID SEC: 4; o un RNA de doble hebra que
consiste en una secuencia de 25 a 30 nucleótidos que es idéntica a
una secuencia parcial de un gen que codifica sialidasa humana
asociada con la membrana plasmática (NEU3) y contiene la secuencia
representada por el Nº ID SEC: 8, y el RNA de doble hebra inhibe la
expresión de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la
membrana plasmática (NEU3).
En la presente memoria, el "RNA de doble hebra
que consiste en una secuencia idéntica a" una secuencia parcial
de un gen significa una doble hebra que comprende un RNA o DNA que
tiene una secuencia idéntica a una secuencia parcial del gen (hebra
antisentido) y un RNA que tiene una secuencia complementaria de la
misma (hebra de sentido). Nótese que un RNA que tiene una secuencia
"idéntica a" una secuencia de un DNA significa un RNA que
tiene la misma secuencia de nucleótidos que el DNA, excepto que la
timina se ha reemplazado por uracilo, mientras que un DNA que tiene
una secuencia "idéntica a" una secuencia de un RNA significa un
DNA que tiene la misma secuencia de nucleótidos que el RNA, excepto
que el uracilo se ha reemplazado por timina.
Mientras tanto, el "un RNA de doble hebra que
consiste en una secuencia de 19 a 23 ó 25 a 30 nucleótidos que es
idéntica a una secuencia parcial de un gen que codifica sialidasa
humana asociada con la membrana plasmática (NEU3) y contiene la
secuencia representada por el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4 o el Nº
ID SEC: 8" significa: una doble hebra que comprende un RNA o DNA
que es idéntico a una hebra antisentido de un gen que codifica NEU3
y tiene una secuencia de 19 a 23 nucleótidos que comprende el Nº ID
SEC: 2 o una secuencia idéntica a la misma (hebra antisentido) y un
RNA que tiene una secuencia complementaria de la misma (secuencia
sentido); una doble hebra que comprende un RNA o DNA que es
idéntico a una hebra antisentido de un gen que codifica NEU3 y
tiene una secuencia de 19 a 23 nucleótidos que comprende el Nº ID
SEC: 4 o una secuencia idéntica a la misma (hebra antisentido) y un
RNA que tiene una secuencia complementaria de la misma (hebra
sentido); una doble hebra que comprende un RNA o DNA que es
idéntico a una hebra antisentido de un gen que codifica NEU3 y
tiene una secuencia de 25 a 30 nucleótidos que comprende el Nº ID
SEC: 8 o una secuencia idéntica a la misma (hebra antisentido) y un
RNA que tiene una secuencia complementaria de la misma (hebra
sentido). Mientras tanto, el "RNA de doble hebra que consiste en
la secuencia representada por el Nº ID SEC: 2, el Nº ID SEC: 4 o el
Nº ID SEC: 8" significa: una doble hebra que consiste en un RNA o
DNA que consiste en una secuencia de 19 nucleótidos representada
por el Nº ID SEC: 2 o una secuencia idéntica a la misma (hebra
antisentido) y un RNA complementario de la misma (hebra sentido);
una doble hebra que consiste en un RNA o DNA que consiste en una
secuencia de 19 nucleótidos representada por el Nº ID SEC: 4 o una
secuencia idéntica a la misma (hebra antisentido) y un RNA
complementario de la misma (hebra sentido); o una doble hebra que
consiste en un RNA o DNA que consiste en una secuencia de 25
nucleótidos representada por el Nº ID SEC: 8 o una secuencia
idéntica a la misma -5a-(hebra antisentido) y un RNA complementario
de la misma (hebra sentido).
El Nº ID SEC: 2 representa una secuencia de RNA
idéntica a un DNA que incluye los nucleótidos
704-722 del Nº de registro del
Gen-Bank/DDBJ AB008185; el Nº ID SEC: 4 representa
una secuencia de RNA idéntica a un DNA que incluye los nucleótidos
1009-1027 del Nº de registro del GenBank/DDBJ
AB008185; y el Nº ID SEC: 8 representa una secuencia de RNA
idéntica a un DNA que incluye los nucleótidos
833-857 del Nº de registro del GenBank/DDBJ
AB008185. El térmico "complementario" o "idéntico" no
siempre significa una secuencia completamente complementaria o
idéntica y puede incluir una secuencia con una, dos o tres
discordancias de nucleótidos con tal de que el mRNA de un gen diana
pueda escindirse con un complejo RISC al que se ha incorporado un
RNA de doble hebra.
La secuencia de la hebra sentido en un RNA de
doble hebra puede ser un RNA o un DNA, pero preferiblemente es un
RNA. La inhibición de la expresión de un gen por un híbrido de
RNA-DNA se describe en JP
2003-219893 A. En la presente descripción, la
secuencia de un RNA de doble hebra se representa como una secuencia
de RNA o DNA de la hebra antisentido.
Mientras tanto, la locución "inhibir la
expresión de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la
membrana plasmática (NEU3)", según se usa en la presente memoria,
significa que cuando un RNA de doble hebra de la presente invención
se introduce en células humanas, se forma un complejo RISC en el que
se ha incorporado la hebra antisentido del RNA de doble hebra y el
complejo RISC escinde mRNA de un gen que codifica sialidasa humana
asociada con la membrana plasmática (NEU3). Que se inhiba la
expresión del gen que codifica sialidasa humana asociada con la
membrana plasmática (NEU3) puede confirmarse, por ejemplo:
preparando células en las que se introduce un RNA de doble hebra de
la presente invención y células en las que no se introduce el RNA
bajo la misma condición, excepto por la introducción del DNA de
doble hebra de la presente invención; midiendo el nivel de mRNA de
toda la longitud del gen, el nivel de proteína de sialidasa humana
asociada con la membrana plasmática (NEU3), que es un producto del
gen, el valor de actividad de sialidasa, etc., en ambas células; y
confirmando que el nivel de mRNA, el nivel de proteína o la
actividad de sialidasa se reducen en las células en las que se
introduce el RNA de doble hebra de la presente invención en
comparación con aquellas en las que no se introduce el RNA de doble
hebra de la presente invención. El nivel de mRNA puede medirse
mediante un método conocido tal como el método de transferencia
Northern o el método de RT-PCR, según se describe en
los Ejemplos posteriores. Mientras tanto, el nivel de proteína
puede medirse mediante un método conocido tal como el método de RIA
o el método de ELISA. Además, la actividad de sialidasa puede
medirse llevando a cabo una prueba usando gangliósido como un
sustrato según se describe en los Ejemplos posteriores.
El RNA de doble hebra que ha de usarse en la
presente invención es preferiblemente un RNA de doble hebra que
consiste en la secuencia representada por el Nº ID SEC: 2, el Nº ID
SEC: 4 o el Nº ID SEC: 8. Sin embargo, puede usarse un RNA de doble
hebra que consiste en una secuencia de 19 a 23 nucleótidos que es
idéntica a una secuencia parcial de un gen que codifica sialidasa
humana asociada con la membrana plasmática (NEU3) y contiene la
secuencia representada por el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4; o un
RNA de doble hebra que consiste en una secuencia de 25 a 30
nucleótidos que es idéntica a una secuencia parcial de un gen que
codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática
(NEU3) y contiene la secuencia representada por el Nº ID SEC: 8, en
donde el RNA de doble hebra inhibe la expresión de un gen que
codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática
(NEU3), con tal de que tenga el efecto de inhibir la expresión de un
gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana
plasmática (NEU3), como es el caso con el RNA de doble hebra
descrito anteriormente. En los Ejemplos siguientes, se ha
confirmado que un RNA de doble hebra que consiste en una secuencia
representada por el Nº ID SEC: 2, el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC: 8
tiene el efecto de inhibir la expresión de un gen que codifica
sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3), pero
puede usarse un RNA de doble hebra que consiste en una secuencia de
19 a 23 nucleótidos que es idéntica a una secuencia parcial de un
gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana
plasmática (NEU3) y contiene la secuencia representada por el Nº ID
SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4; o un RNA de doble hebra que consiste en
una secuencia de 25 a 30 nucleótidos que es idéntica a una
secuencia parcial de un gen que codifica sialidasa humana asociada
con la membrana plasmática (NEU3) y contiene la secuencia
representada por el Nº ID SEC: 8, en donde el RNA de doble hebra
inhibe la expresión de un gen que codifica sialidasa humana asociada
con la membrana plasmática (NEU3), con tal de que tenga el efecto
de inhibir la expresión de un gen que codifica sialidasa humana
asociada con la membrana plasmática (NEU3) como es el caso con el
RNA de doble hebra descrito anteriormente. Se ha presentado que los
RNA de doble hebra de como mucho aproximadamente 27 nucleótidos
tienen casi las mismas actividades en algunos casos (véase J. Biol.
Chem., 278, 15991-15997, 2003) y, también en los
Ejemplos posteriores, se confirma que un RNA de doble hebra que
tiene una secuencia de 25 nucleótidos es eficaz. Por lo tanto, se
considera que el RNA de doble hebra de aproximadamente 20 a 30
nucleótidos y contiene la secuencia representada por el Nº ID SEC:
2, el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC: 8 tiene el mismo efecto.
Un RNA de doble hebra que ha de usarse en la
presente invención tiene de 19 a 23 nucleótidos, preferiblemente de
19 a 21 nucleótidos, o de 25 a 30 nucleótidos. Los números de los
nucleótidos, según se describe en la presente memoria, se refiere a
los números de nucleótidos en una porción de doble hebra, y no
incluye los números de nucleótidos en los extremos salientes 3'
según se describe posteriormente.
Mientras tanto, en un RNA de doble hebra que ha
de usarse en la presente invención, las secuencias de la hebra
sentido y la hebra antisentido pueden tener la misma longitud, pero
cualquiera o ambas secuencias pueden tener además un extremo
saliente 3' (proyectado) de 1 a 4 nucleótidos. Esto se debe a que el
RNA de doble hebra de la presente invención se hace más estable en
caso de que el RNA tenga además tal extremo saliente 3'. Mientras
tanto, se sabe que tal extremo saliente 3' de 4 nucleótidos o menos
no tiene influencia sobre el efecto de inhibición de la expresión de
un gen diana (véase Nat. Biotechnol., 20, 497-500,
2002).
El RNA de doble hebra que ha de usarse en la
presente invención puede prepararse, por ejemplo: preparando un RNA
de doble hebra que tiene una secuencia idéntica a un gen que
codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática
(NEU3) o una de sus partes; y escindiendo el RNA con enzima de
Dicer. Puede usarse enzima de Dicer, que está disponible
comercialmente. El RNA de doble hebra puede prepararse mediante una
reacción de RNA polimerasa que usa, como una plantilla, un DNA de
doble hebra que tiene una secuencia de 19 a 23 nucleótidos que es
idéntica a una secuencia parcial de un gen que codifica sialidasa
humana asociada con la membrana plasmática (NEU3) y contiene la
secuencia representada por el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4; o un
RNA de doble hebra que consiste en una secuencia de 25 a 30
nucleótidos que es idéntica a una secuencia parcial de un gen que
codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3)
y contiene la secuencia representada por el Nº ID SEC: 8; o una
reacción de RNA polimerasa que usa, como una plantilla, un DNA de
doble hebra idéntico a la secuencia representada por el Nº ID SEC:
2, el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC: 8. Tales DNA de doble hebra
pueden prepararse mediante amplificación usando cebadores diseñados
basándose en la secuencia del gen.
Cuando el RNA de doble hebra obtenido como
anteriormente se escinde con enzima de Dicer, puede obtenerse un
RNA de doble hebra (siRNA) que ha de usarse en la presente
invención. El siRNA así obtenido es una mezcla de diversos tipos de
moléculas de RNA incluyendo un siRNA que ha de usarse en la presente
invención. El RNA de doble hebra que ha de usarse en la presente
invención (siRNA) puede ser tal mezcla o moléculas de RNA uniformes
obtenidas purificando la mezcla.
El RNA de doble hebra que ha de usarse en la
presente invención (siRNA) también puede producirse mediante
síntesis química. Esto es, el RNA de doble hebra que ha de usarse en
la presente invención (siRNA) puede obtenerse: sintetizando una
hebra sentido correspondiente a una secuencia diana y una hebra
antisentido; y reasociando las hebras. Por otra parte, el RNA de
doble hebra que ha de usarse en la presente invención (siRNA) puede
obtenerse: insertando un DNA sintético diseñado basándose en la
secuencia de un gen diana en un vector de expresión de siRNA
disponible comercialmente; y expresándolo en un huésped
apropiado.
Mientras tanto, una composición farmacéutica de
la presente invención puede incluir un RNA de doble hebra que se
convierte en un RNA de doble hebra (siRNA) de interés mediante
enzima de Dicer endógena en una célula diana.
Además, en otra realización de la composición
farmacéutica de la presente invención, la composición farmacéutica
de la presente invención puede comprender un vector que tiene una
secuencia de nucleótidos que permite que el RNA de doble hebra se
exprese en células diana humanas, en vez del propio RNA de doble
hebra. Ejemplos del vector incluyen un vector de expresión de siRNA
en tándem y un vector de expresión de siRNA tipo horquilla. Tales
vectores no están particularmente limitados y pueden estar
disponibles comercialmente con tal de que sean capaces de expresar
un gen en células humanas.
En el caso del vector de expresión de siRNA en
tándem, las hebras sentido y antisentido de un siRNA de interés se
transcriben separadamente mediante una RNA polimerasa en una célula,
y a continuación ambas hebras se reasocian para generar un siRNA de
interés. Por otra parte, en el caso del vector de expresión de siRNA
tipo horquilla, un RNA que incluye las hebras sentido y antisentido
de un siRNA de interés se transcribe mediante una RNA polimerasa en
una célula como una unidad, y a continuación ambas hebras se curvan
en una región entre las hebras sentido y antisentido y se reasocian
para formar un RNA precursor tipo horquilla (shRNA; RNA tipo
horquilla corto), seguido por la retirada de una región de una
hebra simple no reasociada con RNAasa en una célula para generar un
siRNA de interés en una célula. Métodos específicos de esto se
describen en, por ejemplo, JP 2004-261002 A,
"RNAi Experiment Protocol, edición revisada, publicada por Yodosya
Co., Ltd., publicada el 1 de octubre de 2004", o similares. En
la presente memoria descriptiva, el "RNA de doble hebra que ha de
usarse en la presente invención" puede incluir un RNA de doble
hebra (siRNA) producido mediante un RNA que se expresa a partir del
vector descrito anteriormente en una célula humana en la que se
introduce un vector que tiene una secuencia de nucleótidos, que
permite que el RNA de doble hebra de la presente invención descrito
anteriormente se exprese en una célula humana.
El RNA de doble hebra que ha de usarse en la
presente invención tiene un efecto de inhibición de la expresión de
un gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana
plasmática (NEU3). La definición y el método de medida del efecto se
describen anteriormente.
El RNA de doble hebra que ha de usarse en la
presente invención tiene además un efecto de inhibición de la
proliferación de células cancerosas e inducción de la apoptosis de
células cancerosas. El grado de inhibición de la proliferación de
células cancerosas puede medirse, por ejemplo, midiendo el número de
células, el nivel de DNA total, el nivel de proteína total, etc., o
mediante un método tal como un ensayo de MTT. La locución "tiene
un efecto de inhibición de la proliferación de células
cancerosas", según se usa en la presente memoria, significa que,
en el caso en el que las células en las que se introduce el DNA de
doble hebra de la presente invención y las células en las que no se
introduce el DNA de doble hebra de la presente invención se cultivan
bajo las mismas condiciones excepto por la introducción del DNA de
doble hebra de la presente invención, el grado de proliferación de
células cancerosas es inferior, o el grado de reducción en células
cancerosas es superior, en las células en las se introduce el DNA
de doble hebra de
la presente invención que en las células en las que no se introduce el DNA de doble hebra de la presente invención.
la presente invención que en las células en las que no se introduce el DNA de doble hebra de la presente invención.
El grado de inducción de la apoptosis puede
medirse mediante un método conocido tal como el método de TUNEL, un
ensayo de fragmentación de DNA, el método de análisis de FACS, el
método de Annexin o el método de medida de actividad de caspasa. La
locución "tiene un efecto de inducción de la apoptosis"
significa que, en el caso en el que el grado de apoptosis se mida
usando células en las que se introduce el RNA de doble hebra de la
presente invención y células en las que no se introduce el RNA de
doble hebra de la presente invención bajo las mismas condiciones,
excepto por la introducción del RNA de doble hebra de la presente
invención, el grado de apoptosis es superior en las células en la
que se introduce el RNA de doble hebra de la presente invención que
en las células en las que no se introduce el RNA de doble hebra de
la presente invención.
El RNA de doble hebra que ha de usarse en la
presente invención puede usarse como un ingrediente activo de una
composición farmacéutica para tratar el cáncer o la diabetes. La
composición farmacéutica inhibe la expresión de un gen que codifica
sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3).
La introducción del RNA de doble hebra en la
composición farmacéutica de la presente invención en células
humanas inhibe eficazmente la expresión de un gen de sialidasa
humana asociada con la membrana plasmática (NEU3), que se sugiere
intensivamente que está implicada en el cáncer o la diabetes.
Mientras tanto, el RNA de doble hebra en la composición
farmacéutica de la presente invención inhibe la expresión del gen,
dando como resultado la inhibición de la proliferación de células
cancerosas y la inducción de la apoptosis. A partir de estos
hechos, se considera que la composición farmacéutica de la presente
invención es eficaz para una terapia génica del cáncer o la
diabetes.
La locución "cáncer o diabetes", según se
usa en la presente memoria, no está particularmente limitada con
tal de que provoque el incremento en la expresión de un gen de
sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3), e
incluye cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y
cuello, por ejemplo.
Esto es, una realización de la presente
invención es un uso de un RNA de doble hebra que inhibe la expresión
de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana
plasmática (NEU3) en la fabricación de una composición farmacéutica
para tratar el cáncer o la diabetes. Mientras tanto, otra
realización de la presente invención es un método para tratar el
cáncer o la diabetes, que comprende administrar la composición
farmacéutica de la presente invención a un ser humano.
En general, la composición farmacéutica de la
presente invención puede administrarse oralmente o parenteralmente
a un ser humano en combinación con un portador farmacéutico
farmacéuticamente aceptable. La forma de dosificación de la
composición farmacéutica de la presente invención no está
particularmente limitada y puede seleccionarse apropiadamente
dependiendo de los propósitos terapéuticos. Ejemplos específicos de
la misma incluyen un comprimido, una píldora, un polvo, un líquido,
una suspensión, una emulsión, un gránulo, una cápsula, un jarabe, un
supositorio, una inyección, una pomada, un parche, una solución
oftálmica y una gota nasal. Para preparar una formulación, puede
usarse un aditivo tal como un vehículo, un aglutinante, un
desintegrante, un lubricante, un estabilizante, un saborizante, un
diluyente, un tensioactivo o un disolvente para inyección, que se
usan ampliamente en un fármaco general como un portador
farmacéutico.
La cantidad del RNA de doble hebra en la
composición farmacéutica de la presente invención no está
particularmente limitada y puede seleccionarse apropiadamente. Por
ejemplo, el siRNA está contenido en la composición preferiblemente
dentro del intervalo de 50 \mug/ml a 300 \mug/ml. La forma de
administración de la composición farmacéutica de la presente
invención no está particularmente limitada y se determina
apropiadamente dependiendo de la forma de dosificación, la zona de
enfermedad de un paciente, el sexo y la edad de un paciente, otras
condiciones y el grado del síntoma de la enfermedad, etc. La
dosificación de un RNA de doble hebra en la composición farmacéutica
de la presente invención se selecciona apropiadamente dependiendo
de la utilización, la edad y el sexo del paciente, el grado de la
enfermedad, otras condiciones, etc. Mientras tanto, el RNA de doble
hebra en la composición farmacéutica de la presente invención puede
administrarse una vez o varias veces al día.
Se considera que la composición farmacéutica de
la presente invención es eficaz para el tratamiento del cáncer o la
diabetes. La composición farmacéutica de la presente invención puede
usarse junto con un agente preventivo/terapéutico conocido para el
cáncer o la diabetes o puede usarse separadamente antes o después
del tratamiento con el agente preventivo/terapéutico. Si la
composición se usa como anteriormente, puede potenciarse el efecto
preventivo/terapéutico sobre el cáncer o la diabetes. La
composición farmacéutica de la presente invención puede contener
además el agente preventivo/terapéutico para el cáncer o la
diabetes descrito anteriormente como un ingrediente activo, o
alternativamente el agente preventivo/terapéutico para el cáncer o
la diabetes descrito anteriormente y la composición farmacéutica de
la presente invención pueden comercializarse separadamente y
combinarse cuando se usan.
En lo sucesivo, la presente invención se
describirá con más detalle por medio de ejemplos, pero la presente
invención no está limitada a los siguientes ejemplos.
Basándose en la secuencia de un gen de sialidasa
humana asociada con la membrana plasmática (véase el Nº de registro
del GenBank/DDBJ AB008185), cinco secuencias de 19 nucleótidos se
seleccionaron como candidatos para un RNA de doble hebra que inhibe
la expresión del gen. Estas secuencias tienen contenidos de GC de
aproximadamente 50% y están menos afectadas por sus estructuras
secundarias, y no corresponden a ninguna secuencia por encima de 17
nucleótidos de ningún gen distinto al gen de sialidasa humana
asociada con la membrana plasmática, según se clarifica mediante
búsqueda por BLAST para todos los genes humanos.
Las secuencias de RNA (hebras antisentido) que
tienen secuencias idénticas a las cinco secuencias descritas
anteriormente están representadas por los Nº ID SEC: 1 a 5 y 8,
respectivamente.
El Nº ID SEC: 1 representa una secuencia de RNA
idéntica a un DNA que comprende los nucleótidos
218-236 del Nº de registro del GenBank/DDBJ
AB008185; el Nº ID SEC: 2 representa una secuencia de RNA idéntica a
un DNA que comprende los nucleótidos 704-722 del Nº
de registro del GenBank/DDBJ AB008185; el Nº ID SEC: 3 representa
una secuencia de RNA idéntica a un DNA que comprende los nucleótidos
949-967 del Nº de registro del GenBank/DDBJ
AB008185; el Nº ID SEC: 4 representa una secuencia de RNA idéntica a
un DNA que comprende los nucleótidos 1009-1027 del
Nº de registro del GenBank/DDBJ AB008185; el Nº ID SEC: 5 representa
una secuencia de RNA idéntica a un DNA que comprende los
nucleótidos 1321-1339 del Nº de registro del
GenBank/DDBJ AB008185; y el Nº ID SEC: 8 representa una secuencia
de RNA idéntica a un DNA que comprende los nucleótidos
833-857 del Nº de registro del GenBank/DDBJ
AB008185.
Se produjo un RNA de doble hebra que ha de estar
contenido en la composición farmacéutica de la presente
invención.
Esto es, RNA de doble hebra que tenían cada uno
las cinco secuencias descritas anteriormente (siRNA) se prepararon
usando el estuche Silencer siRNA Construction (fabricado por Ambion,
Inc.). La preparación se llevó a cabo de acuerdo con el método
descrito en las instrucciones adjuntas al estuche. Específicamente,
la preparación se llevó a cabo como sigue.
En primer lugar, se sintetizaron dos tipos de
oligonucleótidos que incluyen una secuencia de un siRNA de interés
y una secuencia líder para una hebra sentido y una hebra
antisentido, respectivamente. Se dejó que ambos oligonucleótidos se
hibridaran con cebadores de promotor T7 (secuencias idénticas a una
secuencia promotora de RNA T7 y una secuencia líder). Un DNA de
plantilla para la transcripción de siRNA se sintetizó usando DNA
polimerasa Exo-Klenow. La reacción de transcripción
in vitro se llevó a cabo con RNA polimerasa T7 para
sintetizar separadamente un RNA de la hebra sentido y un RNA de la
hebra antisentido. Se dejó que ambas hebras se hibridaran para
preparar un RNA de doble hebra. La secuencia líder no hibridada de
ocho nucleótidos se descompuso mediante un tratamiento con RNasa
específica para una sola hebra. Se llevó a cabo un tratamiento con
DNasa para descomponer el DNA de la plantilla. Posteriormente, los
siRNA se purificaron.
Los siRNA que tenían una secuencia representada
por los Nº ID SEC: 1 a 5 se producían separadamente mediante
biosíntesis basada en tal reacción de transcripción in vitro
y se usaron como muestras de prueba 1 a 5, respectivamente. Las
concentraciones de los siRNA en las muestras de prueba 1 a 5 eran 75
\muM, 63 \muM, 61 \muM, 65 \muM y 74 \muM,
respectivamente. Mientras tanto, los mismos cinco siRNA se
prepararon mediante síntesis química (encargado a Dharmacon Inc.).
Por otra parte, como un control, una secuencia de control
"revuelta", modificada intercambiando nucleótidos en la
secuencia de nucleótidos representada por el Nº ID SEC: 1
aleatoriamente de modo que la secuencia no pueda reconocer un sitio
diana, se produjo mediante síntesis química y se usó como una
muestra de prueba 6. Mientras tanto, para las secuencias de
nucleótidos representadas por los Nº ID SEC: 2 a 5, se produjeron
separadamente secuencias de control "revueltas" mediante
síntesis química del mismo modo que anteriormente y se usaron como
muestras de prueba 7 a 10, respectivamente.
Para las nuestras de prueba 1 a 10 respectivas,
se prepararon muestras para la introducción en células.
Específicamente, la preparación se llevó a cabo mediante el
siguiente procedimiento.
Para las muestras 1 a 10 respectivas, se
prepararon la solución A (una solución mixta de 10 \mul de
Lipofectamine TM 2000 (fabricada por Invitrogen Corporation) y 250
\mul de Opti-MEM I (marca comercial registrada,
fabricada por GIBCO)) y la solución B (una solución mixta de 4
\mug de una muestra de prueba y 250 \mul de
Opti-MEM I (fabricado por GIBCO Inc.)). La solución
A y la solución B se dejaron reposar separadamente a temperatura
ambiente durante 5 minutos y a continuación se mezclaron entre sí, y
la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20
minutos, con lo que las muestras de prueba 1 a 10 para la
introducción en células se prepararon para las muestras de prueba 1
a 6 respectivas.
Las muestras de prueba 1 a 10 para la
introducción en células se introdujeron transitoriamente en células
HeLa de cáncer de cuello uterino humano y células
DLD-1 de cáncer de colon, respectivamente.
Específicamente, la introducción se llevó a cabo mediante el
siguiente método.
Células HeLa de cáncer de cuello uterino humano
y células DLD-1 de cáncer de colon se suspendieron
en medio DMEM y se cultivaron en una placa hasta que la densidad
celular llegaba a 70 a 80% de confluencia. Las muestras de prueba 1
a 10 para la introducción en células se añadieron separadamente a
las soluciones de cultivo de las células descritas anteriormente,
para transfectar las células de ese modo.
Los efectos de los siRNA descritos anteriormente
sobre la expresión de un gen de sialidasa asociada con la membrana
plasmática se examinaron cuantificando los niveles de mRNA del gen
usando las células transfectadas que se preparaban en el Ejemplo
4.
Los RNA totales se extrajeron de las células
HeLa de cáncer de cuello uterino (cultivadas durante 48 horas
después de la transfección) transfectadas con las muestras de prueba
1 a 10 para la introducción en células, y sus cDNA se sintetizaron
usando una transcriptasa inversa. Se llevó a cabo PCR en tiempo real
usando los cDNA, y se cuantificó el nivel de mRNA del gen de
sialidasa asociada con la membrana plasmática. El mRNA de interés
se detectó usando cebadores preparados basándose en la secuencia del
gen de interés. Las secuencias de los cebadores se muestras en los
Nº ID SEC: 6 y 7.
Para corregir la diferencia en la preparación
entre las muestras, el nivel de mRNA de un gen doméstico,
porfobilinógeno desaminasa (PBGD), se cuantificó del mismo modo que
anteriormente.
Los resultados de las pruebas revelaban que los
siRNA procedentes de las muestras de prueba 1 a 5 inhibían la
expresión del gen de sialidasa asociada con la membrana plasmática,
en comparación con las muestras de prueba 6 a 10 (controles
"revueltos" para las muestras respectivas) según se describe
posteriormente.
Muestra de prueba 4: la expresión se inhibía en
94%
Muestra de prueba 2: la expresión se inhibía en
45%
Muestras de prueba 1, 3 y 5: la expresión se
inhibía en de 0 a 15%
Según se describió anteriormente, las muestras
de prueba 2 y 4 inhibían la expresión, mientras que las muestras de
prueba 1, 3 y 5 no inhibían significativamente la expresión.
Además, en el caso de usar el siRNA producido
mediante síntesis química en lugar de los siRNA producidos mediante
biosíntesis basada en reacciones de transcripción in vitro,
se obtenían casi los mismos resultados. Además, en un experimento
similar que usa las células DLD-1 de cáncer de colon
en lugar de las células HeLa de cáncer de cuello uterino humano, se
obtenían casi los mismos resultados.
Los efectos de los siRNA sobre la expresión de
un gen de sialidasa asociada con la membrana plasmática se
examinaron midiendo la actividad de sialidasa usando las células
transfectadas que se prepararon en el Ejemplo 4. La actividad de
sialidasa se midió como sigue. Las células HeLa de cáncer de cuello
uterino humano transfectadas con las muestras de prueba 3 y 4 para
la introducción en células se cultivaron en medio DMEM durante 48
horas. Las células se recogieron y se lavaron con solución salina
fisiológica enfriada con hielo, seguido por sonicación durante 10
segundos, para preparar de ese modo soluciones de extracto celular
en bruto.
Para las soluciones de extracto celular así
obtenidas, la actividad de sialidasa se midió usando gangliósido
como un sustrato. El sistema de reacción que contenía 10 \mul de
acetato sódico 0,5 M (pH 4,6), 5 \mul de Triton
X-100 al 1%, 10 nmol de gangliósido y 10 \mul de
las soluciones de extracto celular en bruto se ajustó hasta un
volumen total de 50 \mul con agua destilada. Las soluciones de 50
\mul se incubaron a 37ºC durante de 30 a 60 minutos, y a
continuación 10 \mul de las soluciones se usaron para marcar ácido
siálico libre con fluorescencia usando DMB
(1,2-diamino-4,5-metilendioxibenceno),
seguido por análisis cuantitativo mediante cromatografía líquida de
alta resolución. El ácido siálico se analizó de acuerdo con J.
Chromatogr. 377, 111-119 (1986).
Mientras tanto, para una solución de extracto
celular en bruto obtenida a partir de células no transfectadas, la
actividad de sialidasa se midió como un control.
Los resultados revelaban que la actividad de
sialidasa de las células transfectadas con la muestra de prueba 3
para la introducción en células, que se encontró que tenía poco
efecto de inhibición de la expresión del mRNA del gen de sialidasa
asociada con la membrana plasmática en el Ejemplo 5, era una
actividad específica aproximadamente igual a la del control (5,6
unidades/mg de proteína). Por otra parte, la actividad específica
de sialidasa de las células transfectadas con la muestra de prueba 4
para la introducción en células, que se encontró que inhibía la
expresión del mRNA de la sialidasa asociada con la membrana
plasmática en 94% en el Ejemplo 5, se inhibía hasta 1,0 unidades/mg
de proteína.
Esto mostraba que el siRNA que tenía la
secuencia representada por el Nº ID SEC: 4 tenía el efecto de
inhibir la expresión del gen de sialidasa asociada con la membrana
plasmática a nivel proteínico así como a nivel del mRNA. A partir
de este resultado, se predijo que el siRNA que tenía la secuencia
representada por el Nº ID SEC: 2 tenía el efecto de inhibir la
expresión del gen de sialidasa asociada con la membrana plasmática
a nivel proteínico así como a nivel del mRNA. En un experimento
similar que usa las células DLD-1 de cáncer de colon
en lugar de las células HeLa de cáncer de cuello uterino humano, se
obtenían casi los mismos resultados.
Para examinar el efecto de la inhibición de la
expresión de un gen de sialidasa asociada con la membrana plasmática
por los siRNA que han de usarse en la presente invención sobre la
proliferación celular de células cancerosas, se llevó a cabo el
ensayo de MTT usando Premix WST-1 Cell Proliferation
Assay System (Takara Bio Inc.).
El ensayo de MTT se basa en el hecho de que el
MTT (una de las sales de tetrazolio) se descompone en colorante de
formazano mediante succinato-tetrazolio reductasa
que está presente en la mitocondria de célula vivas. Los niveles de
células vivas en las muestras pueden compararse al comparar las
absorbancias de soluciones de muestra teñidas con colorante de
formazano.
Células transfectadas con las muestras de prueba
2, 3, 4 y 9 para la introducción en células se cultivaron
separadamente a de 1 x 10^{4} a 7 x 10^{4} células/pocillo en
una placa de 96 pocillos, y el muestreo se realizó 12, 24 y 48
horas después del inicio del cultivo. Se añadieron a las muestras
respectivas 10 \mul de una solución que contenía una sal de
tetrazolio y un reactivo de acoplamiento de electrones, y las
muestras se incubaron durante 30 minutos, seguido por la medida de
las absorbancias a 450 nm del producto de formazano usando un lector
de microplacas.
Los resultados se muestran en la Fig. 1
posteriormente.
Según se muestra en la Fig. 1, se encontró que
las células transfectadas con la muestra de prueba 2 para la
introducción en células y las células transfectadas con la muestra
de prueba 4 para la introducción en células tenían más efectos de
inhibición de la proliferación celular, en comparación con las
células transfectadas con la muestra de prueba 9 (control) para la
introducción en células. En particular, se encontró que las células
transfectadas con la muestra de prueba 4 para la introducción en
células tenían el efecto más óptimo de inhibición de la
proliferación celular. Mientras tanto, las células transfectadas con
la muestra de prueba 3 para la introducción en células proliferaban
en el mismo grado que el control y se encontró que tenían poco
efecto de inhibición de la proliferación
celular.
celular.
Estos resultados revelaban que el siRNA que
tenía la secuencia representada por el Nº ID SEC: 2 ó 4 tenía más
efectos de inhibición de la proliferación de las células HeLa de
cáncer de cuello uterino humano en comparación con el control (la
secuencia de control "revuelta" para el Nº ID SEC: 4). En
particular, se encontró que el siRNA que tiene la secuencia
representada por el Nº ID SEC: 4 tenía un efecto excelente de
inhibición de la proliferación celular. Mientras tanto, se encontró
que el siRNA que teína la secuencia representada por el Nº ID SEC:
3, que no inhibía la expresión del gen de sialidasa asociada con la
membrana plasmática a niveles de mRNA y proteína, no tenía efecto de
inhibición de la proliferación de células cancerosas.
En un experimento similar que usa las células
DLD-1 de cáncer de colon en lugar de las células
HeLa de cáncer de cuello uterino humano, se obtenían casi los mismos
resultados.
Para examinar el efecto de inhibición de la
expresión de un gen de sialidasa humana asociada con la membrana
plasmática por los siRNA que han de usarse en la presente invención
sobre la apoptosis de células cancerosas, el nivel de apoptosis se
midió mediante el método de TUNEL usando In Situ Cell Death
Detection Kit, Fluorescein (fabricado por Roche Corp.).
Específicamente, la medida se llevó a cabo mediante el siguiente
método de acuerdo con las instrucciones del estuche.
En primer lugar, células transfectadas con la
muestra de prueba 4 para la introducción en células (1 x 10^{6}
células) se fijaron con paraformaldehído a temperatura ambiente
durante 30 minutos. La muestra se lavó con agua destilada y se
sometió a un tratamiento de permeación en membrana con una solución
de penetración durante dos minutos con enfriamiento con hielo.
Subsiguientemente, la muestra se lavó de nuevo, y se añadió a la
misma la mezcla de reacción de TUNEL (que contenía TdT y dUTP) que
contenía una enzima y un marcador, y la muestra se incubó a 37ºC
durante 60 minutos.
Mientras tanto, el mismo tratamiento que se
describe anteriormente se llevó a cabo usando células transfectadas
con la muestra de prueba 3 para la introducción en células en lugar
de las células transfectadas con la muestra de prueba 4 para la
introducción en células.
Posteriormente, el número de colorante
fluorescente dUTP (FITC) conectado a fragmentos de DNA mediante TdT
(desoxinucleotidil transferasa terminal) en ambas muestras se
detectó usando un citómetro de flujo (fabricado por Becton
Dickinson). En este procedimiento, fluorescencia que tenía una
longitud de onda de FL1 (530 nm \pm 15 nm) se detectó usando una
luz de excitación que tenía una longitud de onda de 488 nm.
Los resultados se muestran en la Fig. 2.
Los resultados de la Fig. 2 revelaban que, en el
caso se las células transfectadas con la muestra de prueba 4 para
la introducción en células, se inducía apoptosis en 91,3% de las
células. Esto es, se encontró que el RNA de doble hebra de la
presente invención (el siRNA que tiene la secuencia representada por
el Nº ID SEC: 4) inducía la apoptosis de células cancerosas.
En un experimento similar que usa las células
DLD-1 de cáncer de colon en lugar de las células
HeLa de cáncer de cuello uterino humano, se obtenían casi los mismos
resultados.
Se sintetizó el siRNA que tiene la secuencia
representada por el Nº ID SEC: 8 (encargado a iGENE Therapeutics,
Inc.).
Del mismo modo que en los Ejemplos 3 y 4, el
siRNA descrito anteriormente se introdujo transitoriamente en las
células HeLa. A continuación, del mismo modo que el Ejemplo 5, se
cuantificó el nivel de mRNA de NEU3. Además, del mismo modo que en
el Ejemplo 8, se midió el grado de apoptosis mediante el método de
TUNEL. Un RNA de doble hebra que tenía la secuencia de nucleótidos
representada por el Nº ID SEC: 9 se usó como un control
"revuelto". Los resultados revelaban que la expresión del mRNA
de NEU3 estaba inhibida en 94%. Mientras tanto, se inducía apoptosis
en 85% de las células.
El RNA de doble hebra en la composición
farmacéutica de la presente invención inhibe eficazmente la
expresión de un gen de sialidasa humana asociada con la membrana
plasmática (NEU3), que se sugiere intensivamente que está implicado
en el cáncer o la diabetes. Mientras tanto, el RNA de doble hebra en
la composición farmacéutica de la presente invención inhibe la
expresión del gen, dando como resultado la inhibición de la
proliferación de células cancerosas y la inducción de la apoptosis.
Los resultados revelaban que la composición farmacéutica de la
presente invención es eficaz para una terapia génica del cáncer o la
diabetes.
La Fig. 1 es una gráfica que muestra los efectos
de la inhibición de la proliferación de células cancerosas mediante
la introducción de los siRNA.
La Fig. 2 es una gráfica que muestra los efectos
de los siRNA sobre la muerte celular.
<110> Miyagi ken
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA PARA TRATAR
EL CÁNCER O LA DIABETES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
0P-C5224-PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP2004-335774
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-11-19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> RNA sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaagaugac agagggauu
\hfill19
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<210> 2
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<211> 19
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<212> RNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> RNA sintético
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipguauaccuac uacaucccu
\hfill19
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<210> 3
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<211> 19
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<212> RNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> RNA sintético
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<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgugaaggcuu ucagagacu
\hfill19
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<210> 4
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<211> 19
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<212> RNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> RNA sintético
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<400> 4
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\hfill19
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<210> 5
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<211> 19
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<212> RNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> RNA sintético
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipguuuguuuga augugggac
\hfill19
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<210> 6
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipgactggtcat ccctgcgtat
\hfill20
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<210> 7
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipgagccatgat tctgacggtgt t
\hfill22
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<210> 8
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<212> RNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipgguuacagua gaaugugaag uggca
\hfill25
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<210> 9
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<212> RNA
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<220>
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<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgauuaaug uagguucga
\hfill19
Claims (4)
1. Una composición farmacéutica para el uso en
el tratamiento del cáncer o la diabetes, que comprende un RNA de
doble hebra mostrado en (A) o (B):
- (A)
- un RNA de doble hebra que consiste en una secuencia representada por el Nº ID SEC: 2, el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC: 8;
- (B)
- un RNA de doble hebra que consiste en una secuencia de 19 a 23 nucleótidos que es idéntica a una secuencia parcial de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3) y contiene la secuencia representada por el Nº ID SEC: 2 o el Nº ID SEC: 4, o
un RNA de doble hebra que consiste en una
secuencia de 25 a 30 nucleótidos que es idéntica a una secuencia
parcial de un gen que codifica sialidasa humana asociada con la
membrana plasmática (NEU3) y contiene la secuencia representada por
el Nº ID SEC: 8, y
el RNA de doble hebra inhibe la expresión de un
gen que codifica sialidasa humana asociada con la membrana
plasmática (NEU3).
2. La composición farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el RNA de doble hebra comprende además
un extremo saliente 3' de 1 a 4 nucleótidos.
3. La composición farmacéutica para el uso en el
tratamiento del cáncer o la diabetes, que comprende un vector que
tiene una secuencia de nucleótidos capaz de expresar el RNA de doble
hebra de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en células humanas.
4. La composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el cáncer o
la diabetes provoca un incremento en la expresión de un gen de
sialidasa humana asociada con la membrana plasmática (NEU3).
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