ES2343200T3 - Composicion para aumentar la permeabilidad de las paredes de microorganismos y metodo para detectar dichos microorganismos en una membrana. - Google Patents

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Abstract

Composición para permeabilizar paredes de microorganismos, que comprende entre 5 y 95% en peso de etanol y entre 100 y 900 μg/ml de polietilenimina (PEI).

Description

Composición para aumentar la permeabilidad de las paredes de microorganismos y método para detectar dichos microorganismos en una membrana.
La presente invención se refiere a una nueva composición para permeabilizar paredes de microorganismos y a los usos de aquélla y, en particular, al uso de aquélla en un método para el recuento y/o identificación programada de los microorganismos en un medio líquido o gaseoso.
La invención se aplica al control de la calidad microbiológica de los medios líquidos y gaseosos implicados en líneas de producción de productos alimenticios o farmacéuticos.
En este campo, frecuentemente los microorganismos a detectar están presentes en un número muy pequeño y es aconsejable diferenciar la naturaleza de los microbios para determinar si presentan un riesgo para la salud humana. El control realizado debe avisar, en un período de tiempo corto, de cualquier contaminación del producto fabricado posibilitando, cuando fuera apropiado, detener su fabricación y realizar etapas de descontaminación.
Se han desarrollado muchos métodos para minimizar el tiempo de cultivo de microorganismos y posibilitar al mismo tiempo investigar ciertos microbios.
Este es el objeto en particular del método para detectar microorganismos realizado después de filtrar el líquido a través de una membrana y descrito en la solicitud WO 01/59157. De acuerdo con este método, los microorganismos contenidos en una muestra líquida se retienen en la superficie de una membrana al pasar el líquido a través de la citada membrana. Los microorganismos se cultivan en la superficie de la membrana en contacto con agar como medio de cultivo durante el tiempo necesario para formar una microcolonia no visible a simple vista. Las células que forman la microcolonia se lisan después para liberar su contenido de adenosina trifosfato (ATP) y ácido nucleico. El ATP se usa como marcador para identificar y cuantificar las células vivas por bioluminiscencia producida por la oxidación enzimática del ATP (abreviadamente bioluminiscencia-ATP). La detección se califica como universal porque el ATP es un marcador que está presente en todos los microorganismos vivos. La lectura del resultado se obtiene por medio de una reacción de quimioluminiscencia que implica la conversión del ATP en fotones por una enzima específica del citado ATP. La señal luminosa se detecta usando una videointerfaz apropiada (por ejemplo, una cámara LCD). La imagen obtenida posibilita visualizar in situ el lugar de la membrana donde se ha desarrollado el microbio, de una manera similar al recuento convencional realizado en una placa de Petri con agar.
El sistema Milliflex Rapid®, comercializado por la compañía Millipore, funciona basándose en el principio antes descrito. Este sistema se diseñó para realizar las etapas de filtración y detección al mismo tiempo y en la misma membrana, que está montada en un soporte de plástico. Este soporte se diseña para ajustarse a los diversos dispositivos que se usan para la filtración, cultivo de los microorganismos, impregnación de la membrana con reactivos de detección y toma de imágenes con una cámara de vídeo.
Este sistema miniaturizado permite un ahorro apreciable de tiempo en comparación con los ensayos convencionales en placas de Petri. Además, posibilita almacenar en un soporte digital las imágenes obtenidas, lo cual posibilita seguir las contaminaciones (aptitud de detectar cantidades traza).
Sin embargo, este sistema tiene ciertas limitaciones debido al hecho de que, en la práctica, el recuento de los microorganismos presentes en la superficie de la membrana se realiza después de la lisis de las células. En consecuencia, es difícil reutilizar la misma membrana con vistas a identificar con exactitud los microorganismos detectados.
Sin embargo, para demostrar la presencia de ciertos microorganismos es posible realizar una hibridación específica usando sondas marcadas, ya sean de nucleótidos o del tipo de PNA (péptido-ácido nucleico).
Las sondas de PNA tienen la ventaja de ser de naturaleza peptídica, lo cual posibilita en ciertas aplicaciones sustituir ventajosamente a sondas de oligonucleótidos.
En general, la hibridación in situ con sondas requiere accesibilidad completa a los ácidos nucleicos de la célula; de lo contrario esta manipulación genera negativos falsos.
La solicitud WO 2004/050902 describe un sistema de detección en una membrana que posibilita detectar la presencia de microorganismos que contaminan muestras de sangre.
La particularidad de este sistema reside en el hecho de que los microorganismos se detectan por la penetración de agentes marcadores en los microorganismos a través de su pared. Los agentes marcadores usados son moléculas pequeñas, en particular compuestos que intercalan ácidos nucleicos (DNA, RNA), como derivados de cianina, yoduro de propidio, naranja de acridina o bromuro de etidio, y que tienen menos dificultad de penetrar en los microorganismos que sondas de oligonucleótidos.
La muestra líquida a ensayar se diluye en una solución de permeabilización que comprende el agente marcador y un reactivo de permeabilización de las células. Las células se incuban en esta solución de permeabilización, cuya finalidad es incrementar la porosidad de la pared de las células y facilitar así la penetración del producto marcador en los microorganismos presentes. Posteriormente la solución de permeabilización se filtra, con los posibles microorganismos que contiene, a través de una membrana. Los microorganismos presentes quedan retenidos sobre la membrana y después se detectan por reacción del agente marcador con un compuesto y/o un foco de luz que permite la emisión de una señal fluorescente. Este sistema tiene la ventaja de no lisar los microorganismos o, por lo menos, limitar lo máximo posible su destrucción antes de su detección.
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Esto origina una detección que ofrece mejor resolución.
Sin embargo, como los marcadores no son específicos, este sistema no posibilita determinar la naturaleza de los microorganismos detectados.
Además, en dicho sistema, la manipulación de los microorganismos tiene lugar en solución, lo cual requiere precauciones específicas y equipo más complejo. Se debe indicar que la incubación de las células vivas en solución antes de la filtración tiene el inconveniente de que las células pueden continuar desarrollándose y dividiéndose antes de ser fijadas sobre la membrana, lo cual genera dudas sobre el resultado final del ensayo.
También es difícil dosificar adecuadamente el reactivo de penetración en la solución de permeabilización de acuerdo con el método descrito en la solicitud WO 2004/050902, en particular cuando se busca detectar simultáneamente bacterias gram-positivas, que generalmente son más sensibles a agentes permeabilizantes, y bacterias gram-negativas más resistentes.
Los agentes de permeabilización que pueden constituir la composición de la solución de permeabilización son típicamente ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), polietilenglicol (PEG), digitonina, nonensina, hexametafosfato sódico o cloruro de benzalconio.
También es posible usar polietilenimina (PEI), que es un polímero alifático policatiónico y ligeramente básico, conocido por hacer a las paredes bacterianas permeables a solutos, como antibióticos, que normalmente no penetran en el citoplasma de las bacterias [I. M. Helander et al., Polyethyleneimine is an effective permeabilizer of gram-negative bacteria, Microbiology (1997), 143: 3.193-3.199].
La concentración de polietilenimina en las soluciones de permeabilización como las descritas en la solicitud WO 2004/050902 está limitada a concentraciones generalmente inferiores a 100 \mug/ml. La concentración más adecuada para bacterias gram-negativas, como Escherichia coli, es aproximadamente 20-30 \mug/ml.
El objetivo de la presente invención es encontrar respuesta a las limitaciones de los sistemas existentes antes mencionados de detección de membranas.
Sorprendentemente, los presentes inventores han observado que el uso de polietilenimina (PEI) combinada con por lo menos un alcohol, particularmente un alcohol primario y más particularmente etanol, produce una composición más eficaz para permeabilizar paredes de microorganismos. Dicha composición posibilita en particular que ciertas macromoléculas, opcionalmente marcadas, como sondas de nucleótidos, penetren en microorganismos.
En particular ha resultado evidente que los microorganismos incubados en una composición que comprende PEI y un alcohol primario, en particular etanol, toleran concentraciones mayores de PEI que en composiciones de la técnica anterior. La combinación con un alcohol primario posibilita, en particular, usar PEI hasta una concentración entre 100 y 1.000 \mug/ml sin causar efecto alguno de lisis de células marcadas.
El término "microorganismo" indica, en la presente invención, cualquier célula viva (eucariótica o procariótica), organismo unicelular, gameto o virus que comprende una herencia genética contenida en una envoltura formada por una pared simple o múltiple.
Una composición como la definida anteriormente permite que ciertas macromoléculas penetren en microorganismos, limitando al mismo tiempo la destrucción de sus paredes.
"Macromolécula" se define como molécula que resulta de la combinación de un gran número de moléculas simples, como polipéptidos, proteínas, glucoproteínas, oligonucleótidos, polisacáridos, ácidos nucleicos (DNA, RNA), anticuerpos o derivados de los mismos.
La polietilenimina (PEI) es un producto soluble disponible en varias formas. La forma monomérica polimerizada, que tiene una masa molecular de aproximadamente 750 kDa, es una forma preferida de acuerdo con la presente invención (número CAS 9002-98-6). La PEI se usa en muchos campos, en particular como agente de floculación de proteínas y ácidos nucleicos en solución en diversos métodos de purificación. También se usa como agente permeabilizante debido al hecho de que tiene la propiedad de desestructurar reversiblemente los fosfolípidos presentes en paredes celulares, haciendo así a estas paredes permeables a agentes que normalmente no pueden penetrar en las células.
Un primer objeto descrito es, por lo tanto, una composición para permeabilizar paredes de microorganismos, composición que comprende una combinación de polietilenimina (PEI) con por lo menos un alcohol, particularmente un alcohol primario, más particularmente etanol.
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Preferiblemente, esta composición no comprende detergentes.
La concentración de PEI en la composición permeabilizante puede ser entre 100 y 1.000 \mug/ml, generalmente entre 100 y 900 \mug/ml, preferiblemente entre 150 y 900 \mug/ml y más preferiblemente entre 200 y 800 \mug/ml.
De acuerdo con la invención, el alcohol primario está presente en la composición permeabilizante a una concentración entre 5 y 95%, preferiblemente entre 5 y 50% y más preferiblemente entre 10 y 50%.
Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de una composición de acuerdo con la invención y, más particularmente, a un método para detectar microorganismos sobre una membrana, método que comprende una etapa que consiste en la penetración de macromoléculas marcadas en los microorganismos.
Por razones que todavía no son bien conocidas, la mezcla de PEI con un alcohol primario, en particular etanol, facilita la penetración de macromoléculas, como sondas de nucleótidos, en microorganismos.
Las sondas de nucleótidos aquí descritas permiten la hibridación específica de los RNA ribosómicos de microorganismos, en particular el RNA 16S o el RNA 23S de Pseudomonas aeruginosa. Dichas sondas pueden comprender en particular una secuencia correspondiente a las secuencias SEQ ID nº 1, SEQ ID nº 2 ó SEQ ID nº 3.
Como estas sondas son capaces de hibridarse con ciertos ácidos nucleicos presentes en los microorganismos, el método citado posibilita detectar específicamente los tipos de microorganismos presentes en el medio líquido o gaseoso. El método origina una fotografía más precisa de la población microbiana detectada obtenida.
También es posible concebir que las macromoléculas consisten en antígenos o anticuerpos y que participan en una detección de tipo inmunológico.
La figura 1 indica el modo en el que se pueden ensayar muestras gaseosas de acuerdo con el método de la presente invención, burbujeando un gas o una mezcla de gases en un líquido, como agua con 1% de peptona. Tras el contacto con el líquido, los microorganismos contenidos en el gas quedan atrapados en el líquido. El líquido se puede filtrar después como se indica en la presente solicitud.
La figura 2 ilustra las diversas etapas del método para detectar y contar microorganismos de acuerdo con la presente invención realizadas en el ejemplo 1. La detección, realizada por medio de una sonda de oligonucleótidos marcados, es específica de P. aeruginosa.
La figura 3 representa el resultado del ensayo descrito en el ejemplo 1. Es una representación de la membrana como imagen sintética obtenida después del registro y procesamiento digital de las señales luminosas emitidas por las sondas.
La figura 4 es una representación tridimensional de la imagen presentada en la figura 3.
La figura 5 ilustra las diversas etapas del método para detectar y contar microorganismos de acuerdo con la presente invención realizadas en el ejemplo 2. La detección, realizada por medio de una sonda del tipo de PNA marcado, es específica de P. aeruginosa.
La figura 6 representa el resultado del ensayo descrito en el ejemplo 2. Es una representación de la membrana como imagen sintética obtenida después del registro y procesamiento digital de las señales luminosas emitidas por las sondas.
La figura 7 es una representación tridimensional de la imagen presentada en la figura 6.
La figura 8 ilustra las diversas etapas del método para detectar microorganismos por bioluminiscencia-ATP realizadas en el ejemplo 3.
La figura 9 representa el resultado del ensayo realizado en el ejemplo 3b comparando diversas soluciones permeabilizantes (PEI 200 \mug/ml, PEI 500 \mug/ml y etanol 10% + PEI 500 \mug/ml). Estas son las imágenes sintéticas obtenidas después del registro y procesamiento digital de las señales luminosas emitidas por bioluminiscencia-ATP.
La figura 10 representa lo mismo que la figura 9 para otras soluciones permeabilizantes (etanol 90% y etanol 25% + PEI 500 \mug/ml).
La figura 11 es un diagrama que indica la intensidad de la luz medida para cada solución permeabilizante ensayada en el contexto del protocolo de bioluminiscencia-ATP ilustrado en la figura 8.
Un objeto de la invención es más particularmente el uso de la composición permeabilizante antes descrita en un método para contar e identificar, sobre una membrana, los microorganismos inicialmente presentes en un medio líquido o gaseoso.
De acuerdo con una forma específica de la invención, el método se caracteriza porque comprende las etapas siguientes:
(a)
filtrar el medio líquido o gaseoso a través de una membrana para retener en o sobre la membrana los microorganismos presentes en ese medio,
(b)
poner en contacto la membrana y los microorganismos con una composición permeabilizante como la descrita anteriormente que comprende polietilenimina y por lo menos un alcohol,
(c)
fijar las células a la membrana por medio de un agente reticulante,
(d)
poner en contacto los microorganismos con una más macromoléculas, opcionalmente marcadas, capaces de reticularse a la pared de los microorganismos, y
(e)
realizar la detección de las moléculas que han penetrado en los microorganismos.
Los microorganismos a detectar por el método de la invención se eligen más particularmente de bacterias patógenas gram-positivas o gram-negativas de los géneros Pseudomonas, Escherichia, Legionella, Salmonella, Listeria, Bacillus, Streptococcus, Vibrio, Yersinia, Staphylococcus, Mycobacterium, Shigella, Clostridium, Campylobacter o Aeromonas, protozoos de los géneros Giardia, Entamoeba, Cryptosporidium o Cyclospora, micoplasmas de los géneros Mycoplasma o Ureaplasma, hongos de los géneros Aspergillus, Candida o Penicillium y los virus de la hepatitis A y E, que son microorganismos patógenos que se encuentran frecuentemente en el medio ambiente.
Este método también es aplicable, en principio, a la detección de algas unicelulares, como cianobacterias, a formas unicelulares de organismos parásitos, como amebas y huevos de nematodos, trematodos y ascáridos, y a gametos de plantas y animales, como polen y espermatozoos.
El objetivo de este método es contar los microorganismos presentes en un medio líquido, como agua, o en medio gaseoso, como aire, determinando al mismo tiempo, en la medida de lo posible, su identidad (familia, género, especie, etc.). La expresión "medio líquido o gaseoso" significa cualquier fluido que puede ser filtrado aplicando una diferencia de presión a través de una membrana que tiene poros con un diámetro generalmente entre 0,1 y 1,5 micrómetros, preferiblemente entre 0,15 y 0,8 micrómetros y más preferiblemente entre 0,2 y 0,6 micrómetros. Dicho fluido puede consistir en soluciones puras implicadas en la producción de productos estériles, pero también soluciones complejas (agua potable, suero, orina, fluido amniótico, etc.) o alternativamente mezclas gaseosas, como aire atmosférico.
El presente método puede tener, además, aplicaciones en los campos de diagnosis para el análisis de muestras procedentes de animales o pacientes.
El término "membrana" indica, en la presente solicitud, un soporte sintético que tiene dos caras y cuyos poros tienen un diámetro medio conocido.
La membrana usada en el contexto de la presente invención presenta generalmente una relación superficie/volumen alta y un espesor constante, preferiblemente entre 90 y 200 micrómetros.
Dicha membrana puede ser una membrana de una sola capa o de varias capas. En general, consiste en uno o más materiales elegidos de politetrafluoroetileno, (PTFE), poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF), policarbonato, poliamida, poliéster, poli(éter sulfona) (PES), acetilcelulosa y nitrocelulosa.
Preferiblemente los materiales se eligen de modo que sean compatibles con los disolventes usados, en particular con los alcoholes y aldehídos que se pueden usar en las diversas etapas del método.
Las membranas sobre las que se detectan los microorganismos son principalmente de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) o de nailon®. Más preferiblemente, es una membrana filtrante de PVDF, del tipo como la comercializada por la compañía Millipore bajo el nombre comercial Milliflex y las referencias HVWP® o HVMFX®.
La etapa (a) del método de acuerdo con la invención consiste en la filtración, a través de una membrana como la descrita anteriormente, del medio líquido o gaseoso a analizar, para retener en la superficie de esta membrana los microorganismos contenidos en el medio citado.
Una vez filtrados y retenidos sobre la membrana los microorganismos, entre las etapas (a) y (b) del método se puede incluir una etapa opcional consistente en el cultivo de los microorganismos en contacto con un medio de cultivo apropiado. Este medio de cultivo es preferiblemente agar, sobre el que se coloca la membrana después de la filtración. Esta etapa, que es opcional, posibilita obtener colonias de cada uno de los microorganismos filtrados inicialmente, para poder detectarlos más fácilmente.
De acuerdo con la invención, posteriormente los microorganismos se incuban en la etapa (b) en una composición permeabilizante de acuerdo con la invención.
Esta etapa de incubación se realiza en un volumen pequeño de solución que forma una película en la superficie de la membrana. Ventajosamente, la composición permeabilizante puede estar contenida en un soporte sólido sobre el que se puede colocar la membrana, como por ejemplo una almohadilla impregnada, que limita posibles movimientos del líquido en la superficie de la membrana y, por lo tanto, el mezclado de los microorganismos. Se realiza a una temperatura entre 20 y 35ºC durante un período de 5 a 20 minutos.
El método de acuerdo con la invención es con mucho el más eficaz puesto que comprende una etapa (c) por medio de la cual las células se fijan sobre la membrana por medio de un agente que actúa como agente reticulante.
Esta etapa posibilita fijar las células sobre el soporte constituido por la membrana. El agente reticulante preferido de acuerdo con la invención se elige de glutaraldehído, formaldehído y paraformaldehído, definiéndose "paraformaldehído" como molécula compuesta de por lo menos seis unidades de formaldehído. Ventajosamente, la composición de fijación puede estar contenida en un soporte sólido sobre el que se coloca la membrana como, por ejemplo, una almohadilla impregnada, que limita posibles movimientos de líquido en la superficie de la membrana y, por lo tanto, el mezclado de los microorganismos. Preferiblemente, de acuerdo con la invención, la etapa de fijación se realiza a una temperatura entre 20 y 35ºC durante un período de 5 a 20 minutos.
Esta etapa de fijación también se puede realizar por irradiación de los microorganismos retenidos sobre la membrana, por medio de radiación ultravioleta. Entonces la membrana es preferiblemente de nailon®.
La etapa (d), que consiste en poner los microorganismos en contacto con una o más macromoléculas, opcionalmente marcadas, que penetran en los citados microorganismos a través de sus paredes, se realiza preferiblemente al término de las respectivas etapas (b) y (c) de incubación y fijación, puesto que es en este preciso momento cuando se ha observado que las paredes de los microorganismos son más permeables a macromoléculas.
De acuerdo con una forma preferida de la invención, las macromoléculas se marcan y usan como sondas.
El término "sonda", en la presente invención, significa macromoléculas capaces de reconocer y asociarse con un elemento biológico específico del microorganismo, permitiendo así que éste sea visualizado.
De acuerdo con otra forma preferida de la invención, la sonda puede ser una macromolécula capaz de hibridarse con secuencias de DNA o RNA presentes en el microorganismo y que presenta cierto grado de especificidad con respecto a los citados ácidos nucleicos. En el presente texto, se hace referencia a sondas de ácidos nucleicos. La invención comprende cualquier tipo de sonda de ácidos nucleicos conocida por los expertos que pueda originar una hibridación con ácidos nucleicos como, por ejemplo, oligonucleótidos simples, oligonucleótidos del tipo de 2'-O-metil-RNA o sondas del tipo de PNA (sondas que consisten en una cadena polipeptídica sustituida con bases purina y pirimidina) [P. E. Nielsen et al., Science (1991), 254: 1.497-1.500] o del tipo de LNA (oligonucleótidos que comprenden uno o más monómeros de 2'-O-4'-C-metileno-\beta-D-ribofuranosilo] como se describe en la patente EP 1 013
661).
De acuerdo con un aspecto preferido de la invención, las sondas usadas para la detección programada de microorganismos como Pseudomonas aeruginosa comprenden una o varias de las secuencias indicadas a continuación:
(SEQ ID nº 1)5'-TCTACCGCGTCACTTACGTGACACC-3'
(SEQ ID nº 2)5'-CGACCAGCCAGAGCTTACGGAGTA-3'
(SEQ ID nº 3)5'-CCCGAGGTGCTGGTAACT-3'
Las secuencias SEQ ID nos. 1, 2 y 3 tienen la particularidad de hibridarse específica y selectivamente al RNA 16S ó RNA 23S de Pseudomonas aeruginosa. En realidad los presentes inventores han observado que las sondas capaces de hibridarse a los RNA ribosómicos de microorganismos son particularmente útiles para realizar la inven-
ción.
Un aspecto de la discusión consiste, por lo tanto, en sondas que comprenden una secuencia correspondiente a la SEQ ID nº 1 o a la SEQ ID nº 2, esto es, una secuencia que presenta por lo menos 80%, preferiblemente 90% y más preferiblemente 95% de identidad con las secuencias antes indicadas. Dichas sondas están indicadas particularmente para realizar un método de recuento y/o identificación de acuerdo con la invención.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, las macromoléculas que se hacen para penetrar en los microorganismos y que pueden ser de la misma naturaleza que las sondas antes descritas se usan como cebadores para realizar una etapa adicional que consiste en la amplificación específica de los ácidos nucleicos contenidos en los microorganismos. Si se usan dichas moléculas en el método de acuerdo con la invención, entonces se introduce entre las etapas (d) y (e) del método una etapa adicional, aunque opcional.
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Dicha etapa de amplificación ha demostrado ser útil para la detección óptima de los microorganismos por incrementar la cantidad de ácidos nucleicos disponibles para la detección. Si esta etapa de amplificación es muy específica, también posibilita identificar con mayor selectividad los microorganismos y, por lo tanto, disminuir el número de positivos falsos. Preferiblemente la amplificación es una amplificación del tipo NASBA [J. Compton, Nature (1991), 350: 91-92] o del tipo LAMP-PCR [T. Notomi, Nucleic Acids Research (2000), 28(12): 63].
Las sondas o los cebadores antes descritos se pueden diseñar para detectar uno o varios tipos de microorganismos. A este respecto, pueden presentar un grado variable de especificidad con respecto a los elementos biológicos presentes en los microorganismos. Por ejemplo, si los cebadores o las sondas son ácidos nucleicos elegidos para hibridarse con ácidos nucleicos cuya secuencia se conserva en numerosas especies de microorganismos, la identificación no será muy específica. Si, por el contrario, su secuencia se elige para reconocer sólo secuencias específicas de un número pequeño de especies, la especificidad será mayor.
Ventajosamente y de acuerdo con otra forma específica de la invención, se puede realizar después de la etapa (d) y antes de la etapa posterior de detección (e) una etapa que consiste en la hibridación específica de las sondas de ácidos nucleicos o de los cebadores con los ácidos nucleicos de los citados microorganismos.
Esta etapa que consiste en la hibridación de las sondas o de los cebadores de ácidos nucleicos se realiza bajo condiciones estándar de hibridación conocidas por los expertos en la materia. También puede comprender una etapa de lavado para eliminar las sondas o los cebadores de ácidos nucleicos que pueden originar hibridaciones no específicas.
Para la detección, preferiblemente las sondas o los cebadores de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención se marcan por fluorescencia o alternativamente se acoplan a enzimas para realizar una reacción de quimioluminiscencia.
La etapa (e) de detección de microorganismos se realiza detectando la señal luminosa originada por la reacción de quimioluminiscencia o la emisión obtenida por fluorescencia, correspondientes al marcaje de la sonda o del cebador, por medio de una interfaz apropiada.
De acuerdo con un aspecto más preferido de la invención, las sondas de ácidos nucleicos, como oligonucleótidos, se acoplan a una peroxidasa. Cuando una peroxidasa se pone en contacto con luminol (sustrato de peroxidasas), este último se degrada y el producto de la degradación emite fotones que son detectados por la vídeointerfaz (cámara LCD) del sistema Milliflex.
De acuerdo con otro aspecto, se describe el uso de una composición permeabilizante como la descrita anteriormente para la realizar in vitro un ensayo de diagnóstico.
En realidad es posible usar las propiedades específicas de una composición permeabilizante de acuerdo con la invención para hacer que sondas de nucleótidos o cualquier otro complejo molecular penetren en células tomadas de seres humanos o de animales, o mantenidas en cultivo, para realizar in situ la detección.
La composición permeabilizante de acuerdo con la invención también se puede aplicar en el campo de la medicina, por ejemplo, como fármaco adyuvante para incrementar la permeabilidad de paredes de células o de microorganismos para, por ejemplo, sensibilizar las citadas células o los citados microorganismos a ingredientes activos, como agentes antibióticos o antivirales.
Más particularmente, una composición de acuerdo con la invención es útil para hacer que ácidos nucleicos antisentido, particularmente RNA antisentido (RNAi), penetren en células en las que se pretende inhibir la expresión de ciertos genes, en particular, en el tratamiento de enfermedades genéticas o de ciertos cánceres.
La presente invención también comprende un estuche para detectar o contar los microorganismos presentes en un medio líquido o gaseoso, estuche que comprende por lo menos:
- una membrana para filtrar el medio líquido o gaseoso y
- una composición permeabilizante como la descrita en la presente invención.
Preferiblemente la membrana contenida en este estuche es principalmente de PVDF o de nailon®.
Ventajosamente dicho estuche comprende también una composición que comprende un agente reticulante elegido de glutaraldehído, formaldehído y paraformaldehído. Esta segunda composición posibilita fijar el microorganismo sobre la membrana, lo cual se hace realizando el método de acuerdo con la invención, para obtener una mejor resolución de la detección.
Un estuche de acuerdo con la invención puede comprender también una sonda para la detección específica del microorganismo que se busca, en particular una sonda como la definida anteriormente que comprende una secuencia que presenta por lo menos 80% de identidad con las secuencias SEQ ID nº 1, SEQ ID nº 2 ó SEQ ID nº 3.
El objetivo de los ejemplos siguientes es ilustrar la invención.
Ejemplo 1
Detección específica de P. aeruginosa por medio de una sonda de oligonucleótidos
Las etapas del método que se realizan se ilustran en la figura 2.
La implementación de este método consiste primero en filtrar 100 ml de una disolución usando el dispositivo comercializado bajo el nombre Milliflex® con las referencias HVWP® o HVMFX®. Este dispositivo comprende una membrana filtrante de PVDF montada en una estructura circular de plástico.
Después de la filtración, se coloca la membrana en una casete con agar como medio de cultivo y se incuba a 35ºC durante 5 horas y media para que se puedan desarrollar las microcolonias bacterianas sobre la superficie de la membrana.
La membrana se separa de la casete con agar y se pone en contacto con una almohadilla de celulosa impregnada con solución permeabilizante (etanol 20%, PEI 200 \mug/ml) durante 10 minutos a temperatura ambiente.
La membrana se coloca después sobre una almohadilla de celulosa impregnada con la solución de fijación (metanol 80%, formaldehído 1%, NaN_{3} 5 mM, H_{2}O_{2}-urea 0,01%) durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente la estructura de plástico en la que está montada la membrana se fija sobre una casete de hibridación cuya parte inferior está sellada herméticamente. La membrana se incuba en la casete de hibridación durante 30 minutos a 45ºC en contacto con 2 ml de una primera solución de prehibridación [PEG 10%, NaCl 300 mM, formamida 30%, pirofosfato sódico 0,1%, PVP 0,2%, Ficoll 0,2%, EDTA 5 mM, Triton X-100 1%, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5)]. Una vez eliminada esta primera solución, la membrana se pone en contacto con el mismo volumen de una solución de hibridación que contiene 100 nM de una sonda de oligonucleótidos acoplada a peroxidasa de soja, durante 60 minutos a 45ºC.
La sonda de oligonucleótidos usada, que es específica del RNA 16S de P. aeruginosa, tiene la siguiente secuencia:
(SEQ ID nº 2)5'-CGACCAGCCAGAGCTTACGGAGTA-3'
Posteriormente la membrana se separa de la casete de hibridación y se pone en un recipiente de lavado en contacto con 100 ml de una solución de lavado (CAPSO 10 mM, Tween-20 0,02%). Se realizan tres lavados a 45ºC de 10 minutos cada uno.
La membrana se seca y después se rocía el reactivo bioluminiscente (Millipore, número de catálogo WBKLS0100), después de reconstituirlo, sobre la superficie de la membrana. Se coloca el dispositivo en el sistema Milliflex Rapid y se registran las señales luminosas.
El resultado de la detección de P. aeruginosa en la superficie de la membrana se muestra en la figura 3. Una vista tridimensional del mismo análisis se muestra en la figura 4 en la que se distingue claramente la localización de cada una de las microcolonias de P. aeruginosa en la membrana.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2
Detección específica de P. aeruginosa por medio de una sonda del tipo de PNA (a) Uso de la solución permeabilizante (etanol 20%, PEI 200 \mug/ml)
Las etapas del método que se realizan se ilustran en la figura 5.
Después de una filtración realizada de acuerdo con el protocolo del ejemplo 1, la membrana se coloca en una casete con agar como medio de cultivo y se incuba a 35ºC durante 6 horas.
La membrana se separa de la casete con agar y se coloca sobre una almohadilla de celulosa impregnada con la solución permeabilizante (etanol 20%, PEI 200 \mug/ml) durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente el dispositivo se coloca sobre una almohadilla de celulosa impregnada con una solución de fijación (metanol 80%, formaldehído 1%, NaN_{3} 5 mM, H_{2}O_{2}-urea 0,01%) durante 10 minutos a temperatura ambiente.
La membrana se coloca, como en el ejemplo 1, en una casete de hibridación en contacto con 2 ml de una solución de hibridación [PEG 10%, NaCl 10 mM, formamida 30%, pirofosfato sódico 0,1%, PVP 0,2%, Ficoll 0,2%, EDTA 5 mM, Triton X-100 1%, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5)] que comprende 100 nM de una sonda de PNA acoplada a peroxidasa de soja. El conjunto se mantiene a 50ºC durante 60 minutos.
La sonda de PNA usada es capaz de hibridarse con la misma secuencia del RNA 16S de P. aeruginosa que la sonda de oligonucleótidos del ejemplo 1 de secuencia SEQ ID nº 3.
La membrana con su soporte se separa de la casete de hibridación y se coloca después en un recipiente de lavado en contacto con 100 ml de una solución de lavado (CAPSO 10 mM, Tween-20 0,02%). Se realizan tres lavados a 50ºC de 10 minutos cada uno.
La membrana se seca y después se rocía el reactivo bioluminiscente (Millipore, número de catálogo WBKLS0100), después de reconstituirlo, sobre su superficie. Finalmente se coloca la membrana en el analizador de imágenes del sistema Milliflex Rapid y se registran las señales luminosas.
La imagen obtenida se muestra en la figura 6. Una vista tridimensional del mismo análisis se muestra en la figura 7.
Este método posibilita detectar específicamente la presencia de P. aeruginosa en la superficie de una membrana filtrante.
(b) Uso de una solución de permeabilización que comprende 200 \mug/ml de PEI solo, 500 \mug/ml de PEI solo o una mezcla compuesta de 10% de etanol y PEI a una concentración de 500 \mug/ml (EtOH 10%-PET 500)
Se realizó el mismo protocolo descrito anteriormente con una solución permeabilizante que comprendía sólo PEI y después con una mezcla compuesta de 10% de etanol y PEI a una concentración de 500 \mug/ml (EtOH 10%-PEI 500).
Después de la filtración, la membrana se colocó en una casete con agar como medio de cultivo y se incubó a 35ºC durante 15 horas.
La membrana se colocó posteriormente sobre una almohadilla de celulosa impregnada con una solución permeabilizante que contenía 200 \mug/ml de PEI solo, 500 \mug/ml de PEI solo o una mezcla compuesta de 10% de etanol y PEI a una concentración de 500 \mug/ml durante 10 minutos a temperatura ambiente. Como control se usó una membrana que no había sido tratada.
Posteriormente la membrana se colocó sobre una almohadilla de celulosa impregnada con una solución de fijación (metanol 80%, formaldehído 1%, NaN_{3} 5 mM, H_{2}O_{2}-urea 0,01%) durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se trató como se ha indicado anteriormente.
Los resultados obtenidos para las diversas concentraciones de PEI y también para el uso conjunto de PEI y alcohol se muestran en la figura 9.
Se puede observar que el uso conjunto de PEI y EtOH posibilita obtener una señal intensa y precisa en comparación con la que se puede obtener en ausencia de agente permeabilizante (control) o en presencia de PEI solo.
Ejemplo 3
Detección no específica de microorganismos por bioluminiscencia-ATP
La composición permeabilizante de acuerdo con la invención se puede usar en un método para detectar el ATP producido por microorganismos vivos, de acuerdo con una reacción conocida de quimiobioluminiscencia de la técnica anterior [D. N. Alexander, G. M. Ederer y J. M. Matsen, Evaluation of an adenosine 5'-triphosphate assay as screening method to detect significant acteiuria, J. Clin. Microbiol. (1976), 3: 41-46].
El uso de una composición de acuerdo con la invención posibilita obtener mayor permeabilización de la pared de microorganismos con vistas a liberar su contenido de ATP.
(a) Tratamiento de células con etanol de 90% o con etanol de 25% y PEI de 500 \mug/ml antes de la detección de ATP por quimioluminiscencia
Se ensayó un método para detectar Saccharamyces cerevisiae presente en agua, por bioluminiscencia-ATP, en el que las diversas etapas se ilustran en la figura 8. En este ensayo, las células se pretratan con etanol de 90% o con etanol de 25% y PEI de 500 \mug/ml, antes de la reacción de quimioluminiscencia.
El protocolo consiste, como en los ejemplos precedentes, en filtrar 100 ml de una solución usando el dispositivo Milliflex®.
La membrana se trata después con 40 \mul de una solución de 90% de etanol o de 25% de etanol-500 \mug/ml de PEI, que se rocía sobre la superficie de la membrana, y después se seca de nuevo.
Posteriormente la membrana se trata con 40 \mul de una solución de bioluminiscencia rociada sobre la superficie de la membrana y se coloca después en el analizador de imágenes en el que se registran las señales luminosas.
(b) Tratamiento con PEI solo (100-500 \mug/ml) o con mezclas de etanol-PEI antes de la detección de ATP por quimioluminiscencia
Se realizó el mismo protocolo descrito anteriormente, en el que se sustituyó el tratamiento con etanol por un tratamiento con PEI solo (100-250-500 \mug/ml) o con mezclas de etanol-PEI (composición de acuerdo con la invención): EtOH 10% - PEI 100 \mug/ml; EtOH 10% - PEI 250 \mug/ml; EtOH 10% - PEI 500 \mug/ml.
Los resultados relativos a los diversos tratamientos de acuerdo con (a) y (b) se muestran en la tabla de la figura 10 y en el diagrama de la figura 11. De estos resultados comparativos se deduce que la combinación de EtOH y PEI posibilita obtener una señal que es claramente más intensa que cuando se usa PEI solo a concentraciones altas.
Ejemplo 4
Detección no específica de microorganismos por penetración de un agente intercalador de DNA (SYBRgreen)
Se realizó un experimento que consistió en incubar bacterias E. coli en solución en una composición de acuerdo con la invención que comprendía una mezcla de etanol 10%-PEI 100 \mug/ml.
Se realizó el mismo experimento incubando las células en una solución de PEI solo a una concentración de 25 \mug/ml o de 100 \mug/ml o en ausencia de permeabilización (PBS).
El experimento consistió en incubar las bacterias durante 15 minutos en presencia de los agentes antes mencionados y de un agente intercalador de DNA (SYBRgreen I, 1/4000) y medir después la presencia de fluorescencia usando un lector de microplacas.
Los resultados se indican en la siguiente tabla 1.
La combinación de EtOH y PEI posibilita obtener una señal que es claramente más intensa que cuando se usa PEI solo. Esto demuestra que se puede obtener mayor permeabilidad de la pared de los microorganismos combinando el alcohol con PEI.
TABLA 1 Permeabilización y marcaje de E. coli (SYBRgreen)
1 
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> MILLIPORE CORPORATION
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composición para incrementar la permeabilidad de la pared de microorganismos y método para detectar los citados microorganismos sobre una membrana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BIF 116880
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 05/12971
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2005-12-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> DNA artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCTACCGCGT CACTTACGTG ACACC 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> DNA artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGACCAGCCA GAGCTTACGG AGTA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> DNA artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCGAGGTGC TGGTAAACT 
\hfill

Claims (26)

1. Composición para permeabilizar paredes de microorganismos, que comprende entre 5 y 95% en peso de etanol y entre 100 y 900 \mug/ml de polietilenimina (PEI).
2. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración de polietilenimina en la composición es entre 200 y 800 \mug/ml.
3. Composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque comprende entre 5 y 50% y preferiblemente entre 10 y 50% de etanol.
4. Método para contar y/o identificar sobre una membrana los microorganismos inicialmente presentes en un medio líquido o gaseoso, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
(a)
filtrar el medio líquido o gaseoso a través de una membrana para retener en o sobre la membrana los microorganismos presentes en ese medio,
(b)
poner en contacto la membrana y los microorganismos con una composición permeabilizante como la antes descrita que comprende polietilenimina (PEI) y por lo menos un alcohol,
(c)
fijar las células a la membrana por medio de un agente reticulante,
(d)
poner en contacto los microorganismos con una o más macromoléculas, opcionalmente marcadas, capaces de reticularse a la pared de los microorganismos, y
(e)
realizar la detección de las moléculas que han penetrado en los microorganismos.
5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende, entre la etapa (a) y la etapa (b), una etapa adicional que consiste en el cultivo de los microorganismos.
6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque el agente que actúa como agente reticulante en la etapa (c) se elige de glutaraldehído, formaldehído y paraformaldehído.
7. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque, en la etapa (d), la macromolécula usada es una sonda del tipo de PNA.
8. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque, en la etapa (d), la macromolécula usada es una sonda del tipo de oligonucleótidos.
9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 y 9, caracterizado porque la sonda usada en la etapa (d) comprende una secuencia que presenta por lo menos 80% de identidad con las secuencias SEQ ID nº 1, SEQ ID nº 2 ó SEQ ID nº 3.
10. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, caracterizado porque, en la etapa (d), las sondas o los cebadores se marcan por acoplamiento con una enzima que permite la emisión de una señal luminosa.
11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque la detección de los microorganismos en la etapa (e) se realiza por medio de una reacción de quimioluminiscencia y reconocimiento de la señal luminosa emitida por medio de una interfaz apropiada.
12. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, caracterizado porque, en la etapa (d), las sondas o los cebadores se marcan con una molécula fluorescente.
13. Método de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque la detección de los microorganismos en la etapa (e) se realiza detectando la señal de fluorescencia emitida, correspondiente al marcaje de la sonda o del cebador, por medio de una interfaz apropiada.
14. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13, caracterizado porque comprende, entre la etapa (d) y la etapa (e), una etapa adicional que consiste en la hibridación específica de las sondas o de los cebadores con los ácidos nucleicos de los citados microorganismos.
15. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, caracterizado porque comprende, entre la etapa (d) y la etapa (e), una etapa adicional que consiste en la amplificación específica de los ácidos nucleicos presentes en los microorganismos.
16. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 15, caracterizado porque la membrana sobre la que se detectan los microorganismos es principalmente de PVDF o de nailon®.
17. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 16, caracterizado porque la composición permeabilizante de la etapa (b) comprende la combinación de PEI y etanol.
18. Método de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque la citada combinación permeabilizante es una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
19. Uso de una combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la citada composición se usa para incrementar la permeabilidad de las paredes de microorganismos.
20. Uso de una combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la citada composición se usa en un método para contar y/o identificar microorganismos.
21. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la citada composición se usa para hacer que penetren macromoléculas en una célula aislada.
22. Estuche para detectar y contar microorganismos, caracterizado porque comprende:
- una membrana para filtrar un líquido y
- una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
23. Estuche de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende también una composición que comprende un agente reticulante elegido de glutaraldehído, formaldehído y paraformaldehído.
24. Estuche de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 23, caracterizado porque comprende también por lo menos una sonda para la detección específica de microorganismos.
25. Estuche de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado porque la sonda para la detección específica de microorganismos comprende una secuencia que presenta por lo menos 80% de identidad con las secuencias SEQ ID nº 1, SEQ ID nº 2 ó SEQ ID nº 3.
26. Estuche de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, caracterizado porque la membrana es principalmente de PVDF o de nailon®.
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