ES2343271T3

ES2343271T3 - Proteina de resistencia autoactivada.

Info

Publication number: ES2343271T3
Application number: ES06753229T
Authority: ES
Inventors: Dietmar Jurgen Stahl
Original assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Current assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Priority date: 2005-06-03
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2010-07-27
Anticipated expiration: 2026-06-02
Also published as: JP5054677B2; US20090300795A1; UA91542C2; RU2375453C2; ATE462795T1; EP1891220B1; US8080706B2; JP2008541739A; RU2007147689A; PL1891220T3; ZA200710943B; AU2006254528A1; CN101292037B; DE502006006581D1; AU2006254528B2; CA2610271A1; DE102005026045A1; DK1891220T3; WO2006128444A2; WO2006128444A3

Abstract

Proteína de resistencia autoactivada para la producción de una resistencia contra patógenos en plantas, caracterizada porque la proteína de resistencia es codificada por un ácido nucleico que presenta una parte limitada de un gen de resistencia NBS-LRR, que se extiende desde el extremo 5'' de la zona codificante del gen de resistencia NBS-LRR descendente hasta el inicio del dominio NBS del gen de resistencia NBS-LRR y no comprende ningún bucle P, no siendo el gen de resistencia NBS-LRR un gen de resistencia TIR-NBS-LRR.

Description

Proteína de resistencia autoactivada.

La presente invención se refiere a una proteína de resistencia autoactivada para la producción de una resistencia contra patógenos en plantas, a un procedimiento para la preparación de una planta transgénica, así como a plantas transgénicas.

Debido a las enfermedades de las plantas causadas por hongos, virus, nematodos y bacterias se producen en todo el mundo grandes pérdidas de cultivos, afecta a la calidad de los productos cultivados y hace necesario un empleo extendido de pesticidas químicos, porque las medidas defensivas naturales de las plantas, con cuya ayuda pueden combatir la mayoría de agentes patógenos potenciales o retardar y limitar su propagación, a menudo no son suficientes. A estas medidas defensivas pertenecen la reacción hipersensitiva, la muerte celular controlada del tejido huésped en el lugar de la infección, el refuerzo de la pared celular vegetal mediante lignificación y formación de calosa, la formación de fitoalexinas y la producción de proteínas PR (relacionadas con la patogénesis, del inglés patogénesis-related). Las moléculas clave para la activación de las medidas defensivas inducidas son los genes de resistencia vegetales (genes R). Según la hipótesis "gen por gen" de Flohrschen, la proteína de un gen R interacciona con la correspondiente proteína de un gen avirulencia microbiano (gen Avr) y desencadena de este modo la reacción defensiva inducida.

La mayoría de los genes R se pueden clasificar en 5 clases según la formación de la proteína R codificada por ellos (Martin et al, 2003). La clase 1 comprende sólo el gen Pto del tomate, que codifica para una serina/treonina quinasa. Sin embargo, la mayoría de los genes R vegetales pertenecen a la superfamilia de los genes NBS-LRR, que codifican para un "sitio de unión de nucleótidos" (NBS, del inglés "nucleotide binding site" y una "repetición rica en leucina" (LRR, del inglés "Leucine rich repeat"). Los genes NBS-LRR, que en su terminal N presentan una estructura de "super hélice" (CC, del inglés "coiled-coil"), como por ejemplo una "cremallera de leucina", se clasifican como genes CC-NBS-LRR de clase 2. Los genes R del tipo CC-NBS-LRR se encuentran en angiospermas extraños. En la clase 3 se encuentran los genes R del tipo TIR-NBS-LRR, que en el terminal N llevan una secuencia con homología con la región TIR (del inglés "toll-interleukin-1-receptor", receptor interleuquina-1/toll) animal, en lugar de un dominio CC. Los genes TIR-NBS-LRR representan un 75% de los genes R en Arabidopsis thaliana, aunque no se encuentran en céspedes y remolacha azucarera (Tian et al., 2004).

Los genes Cf forman la clase 4 de los genes R. Las proteínas CF no tienen ningún dominio NBS, pero tienen un dominio transmembrana (TM) y un LRR extracelular. A la clase 5 pertenece la proteína Xa21 del arroz, que está formada por un dominio LRR extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de quinasas intracelulares.

Mientras que los genes R se expresan sólo débilmente a través de los promotores del gen R, una fuerte expresión constitutiva de los genes R de la clase 1, 2 y 3 conduce a una activación de la propia defensa contra patógenos vegetal en ausencia del correspondiente producto del gen avirulencia y por tanto conduce a la autoactivación de la proteína R (Tang et al., 1999; Oldroyd y Staskawicz, 1998; Bendahmane et al., 2002).

Sin embargo, en general la sobreexpresión constitutiva de los genes R en plantas transgénicas se relaciona con propiedades agronómicas indeseadas, como micronecrosis (Tang et al., 1999) o crecimiento reducido de las plantas (Frost et al., 2004).

Otra posibilidad de la autoactivación de proteínas R de clase 2 y 3 es la mutagénesis de motivos de aminoácido conservados especiales en las proteínas completas CC-NBS-LRR o TIR-NBS-LRR. La mutagénesis de secuencias en el dominio NBS o LRR del gen Rx de la patata (Bendahmane et al., 2002) y el dominio NBS del gen L6 del lino (Howles et al., 2005) conduce a mutantes, que en ausencia del correspondiente gen de avirulencia tras la expresión transitoria desencadenan la muerte celular.

Los experimentos de deleción con el gen Rx mostraron que los productos de deleción compuestos por el dominio CC y partes del dominio NBS tras su sobreexpresión transitoria también pueden desencadenar una muerte celular que se inicia más rápidamente que usando el gen R de longitud completa. Estos productos de deleción, además del dominio CC necesitan también el bucle P, la quinasa-2 y la quinasa-3a completa del dominio NBS. En cambio, otra reducción del dominio NBS conduciría a una activación HR más lenta en comparación con el gen R de longitud completa (Bendahmane et al. 2002).

Una autoactivación del gen L10 del lino, un gen R de clase 3, se podría conseguir mediante la formación de una proteína TIR-NBS-LRR reducida, que consta del dominio TIR y 34 aminoácidos del dominio NBS adyacente, incluido el bucle P (Frost et al., 2004).

Aunque se conocen varios métodos de autoactivación de genes R, hasta ahora no se han descrito plantas transgénicas en las cuáles la autoactivación de proteínas R conduzca a una elevada resistencia a los hongos sin perjudicar al mismo tiempo sus propiedades agronómicas. Los intentos de transformar de forma estable en el lino dos variantes autoactivadas de longitud completa del gen L6 bajo el control respectivo del promotor del gen de resistencia L6 nativo o un promotor inducido por hongos, condujeron a plantas de crecimiento normal sensibles a los hongos o bien a plantas de crecimiento reducido resistentes a los hongos (Howles et al., 2005).

Por consiguiente, es objetivo de la presente invención modificar la capacidad defensiva de una planta contra patógenos, de manera que las reacciones defensivas de la planta se activen de forma fiable en ataques patógenos, pero sin influir negativamente en las propiedades agronómicas de la planta.

Según la invención, se alcanza el objetivo propuesto mediante una proteína de resistencia autoactivada que es codificada por un ácido nucleico que presenta una parte limitada de un gen de resistencia NBS-LRR, que se extiende desde el extremo 5' de la zona codificante del gen de resistencia NBS-LRR de forma descendente hasta el inicio del dominio NBS del gen de resistencia NBS-LRR y no comprende ningún bucle P, no siendo el gen de resistencia NBS-LRR un gen de resistencia TIR-NBS-LRR.

La parte limitada del gen de resistencia NBS-LRR empieza por el codón de inicio para la translación (codón ATG) y llega hasta el dominio NBS, caracterizado fundamentalmente por el bucle P (motivo quinasa-1a). Para la función de esta parte del gen de resistencia NBS-LRR, no puede contener el bucle P. Tampoco deberían estar disponibles otras secciones del dominio NBS y del dominio LRR del gen de resistencia NBS-LRR. Por supuesto pueden permanecer nucleótidos individuales del dominio NBS incluido el bucle P, siempre que éstos no perjudiquen la activación
de HR.

Se entiende por proteína de resistencia autoactivada una proteína tal, que en ausencia de un producto del gen de avirulencia correspondiente conduce a una activación de las defensas vegetales contra patógenos. Así, la invención tiene la ventaja que para la formación de una resistencia contra patógenos no es necesaria ninguna interacción entre una proteína de resistencia y una proteína de avirulencia, por lo que las reacciones defensivas de la planta pueden transcurrir esencialmente de forma más directa y finalmente de forma más fiable.

Una autoactivación se puede conseguir, por ejemplo, mediante una sobreexpresión transitoria del gen de resistencia. Sobreexpresión significa que se supera la fuerza de expresión del promotor natural del gen R hasta que se activa la cascasda de transducción de la señal regulada por la proteína R en ausencia del correspondiente producto del gen de avirulencia microbiano. Por consiguiente se produce la activación de la defensa contra patógenos que se traduce en una resistencia parcial o total a la enfermedad.

Sin embargo, se puede conseguir una autoactivación de la proteína de resistencia mediante la reducción de la longitud completa del gen R BvKWS3_165, BvKWS3_135, Bv13033 y Bv12069 de la remolacha azucarera, así como del gen StR3a de la patata en la zona 5', que sólo codifica para el terminal N libre de los dominios NBS y LRR de la proteína, incluido un eventual dominio CC. En este contexto, el terminal N libre del dominio NBS representa que el extremo 5' de la zona codificante del gen de resistencia NBS-LRR sólo se extiende hasta el extremo 3' si no comprende en su estructura efectiva el bucle P del gen de resistencia NBS-LRR. En casos sencillos el bucle P está completamente alejado. Sin embargo, aún pueden quedar nucleótidos individuales del bucle P en el gen de resistencia reducido, siempre que por ellos no se ralentice la activación de HR. Con la reducción del gen de resistencia NBS-LRR en el terminal N se suprimen también los motivos quinasa-2, quinasa-3, GLPC y MHD, incluídos los aminoácidos flanqueantes según las informaciones de las bases de datos Prosite (Bairoch et al., 1996) y Pfam (Sonnhammer et al., 1997), así como las definiciones de motivo indicadas por Bendahmane et al. (2002).

El uso de los genes reducidos 165_#176, 135_#147, 13033-#159 y Bv12069 y StR3a-#1-155 conduce, en comparación con los genes R de longitud completa, a una activación más rápida de la muerte celular en el tejido vegetal. En combinación con un promotor inducible por patógenos se puede provocar una defensa inducida mejorada contra patógenos. Esto también es válido para aquellas proteínas R que mediante mutaciones conocidas en los dominios MHD o VHD no se pueden autoactivar, como muestra la expresión de los genes 135_#147 y BvKWS3_135-D480V.

Como los genes R reducidos son capaces de desencadenar la muerte celular claramente antes, en comparación con los genes R de longitud completa, para los genes R reducidos es suficiente una expresión menor para conseguir una concentración de proteína crítica para la defensa patógena, como se muestra para el gen R 135_#147.

El bucle P o el motivo quinasa-1 a, junto al motivo quinasa-2 y quinasa-3, es característico de las proteínas que hidrolizan ATP o GTP (Traut, 1994) y se encuentra en el dominio NBS de los genes NBS-LRR. El bucle P caracteriza las zonas N terminales del dominio NBS (Bendahmane et al., 2002). La secuencia consenso del bucle P para los genes R Prf, Rx, Rpm1, BvKWS3_135, BvKWS3_133 y BvKWS3_165 es: (I/V)VG(M/I) GG(L/I/S)GKTT(L/V).

De forma sorprendente ha resultado que es posible una autoactivación particularmente buena con ácidos nucleicos que codifican para una secuencia de aminoácidos con un motivo de secuencia DAE. En particular los ácidos nucleicos codifican para el motivo de secuencia AVLXDAE. Los motivos de secuencia DAE y AVLXDAE se encuentran, por ejemplo, en las SEC. ID. Nº 13 y 15.

Son secuencias de ácidos nucleicos preferidas las de los grupos siguientes:

a): Secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1;

b): Secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 2 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 2 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 2 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 2;

c): Secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 3 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 3 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 3 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 3;

d): Secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 4 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 4 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 4 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 4,

e): Secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 16 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 16 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 16 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 16;

La parte limitada del gen de resistencia NBS-LRR se extiende en las secuencias de nucleótidos preferidas siguientes, como sigue:

SEC. ID. Nº 1 de pos. 124-654

SEC. ID. Nº 2 de pos. 155-598

SEC. ID. Nº 3 de pos. 94-573

SEC. ID. Nº 4 de pos. 194-694

El término aquí empleado "hibridar" significa hibridar bajo condiciones habituales, como las decritas en Sambrook et al. (1989), preferiblemente bajo condiciones astringentes. Por ejemplo, son condiciones de hibridación astringentes: hibridación en 4 x SSC a 65ºC y a continuación lavado múltiple en 0,1 x SSC a 65 ºC durante aproximadamente 1 hora en total. Por ejemplo, son condiciones de hibridación poco astringentes: hibridación en 4 x SSC a 37ºC y a continuación lavado múltiple en 1 x SSC a temperatura ambiente. "Condiciones de hibridación astringentes" también puede significar: hibridar a 68ºC en fosfato sódico 0,25 M, pH 7,2, SDS 7%, EDTA 1 mM y BSA 1% durante 16 horas y a continuación lavar dos veces con 2 x SSC y SDS 0,1% a 68ºC.

De forma preferible el gen de resistencia que codifica para una proteína de resistencia autoactivada procede de remolacha azucarera o patata.

De forma más preferible el ácido nucleico codifica para una secuencia de aminoácidos con una de las secuencias consenso según SEC. ID. Nº 13 a 15. Dentro de las secuencias consenso se pueden intercambiar entre sí aminoácidos funcionalmente equivalentes, por ejemplo Asp por Glu, Leu por Ile, Ala o Val, Arg por Lys, Phe por Trp.

Las dos secuencias consenso según SEC. ID. Nº 13 y 14 representan dos bloques funcionales que se pueden disponer entre sí a una distancia no fijada. Una distancia preferible entre ambos bloques resulta de la secuencia consenso según SEC. ID. Nº 15, así como de la secuencia consenso según la Fig. 10.

El ácido nucleico se puede combinar preferiblemente con un promotor inducible por patógenos. En reacción a la infección del tejido huésped, un promotor inducible por patógenos se activa por un agente patógeno de la enfermedad, por ejemplo un hongo dañino, una bacteria, un virus o un nematodo. Durante el intento de infección o la infección exitosa del tejido vegetal el promotor inducible por patógenos es más activo que en el tejido vegetal no infectado.

Los promotores inducibles por patógeno son conocidos fundamentalmente por el especialista. Son ejemplos de promotores inducibles por patógenos un promotor quitinasa (Samac y Shah 1991), un promotor glucanasa (Hennig et al., 1993) y el promotor prp-1 (Martini et al., 1993).

Mediante la sobreexpresión del gen R inducida por patógeno se evitan consecuencias negativas de una expresión constitutiva, como por ejemplo crecimiento reducido o bajo rendimiento de las plantas.

Los promotores sintéticos han resultado ser promotores particularmente adecuados. Se trata de promotores preparados mediante técnicas de trabajo de biología molecular, que no se encuentran en la naturaleza en esta configuración. Un promotor sintético es un promotor minimalista que junto a un promotor mínimo contiene tan sólo uno o varios elementos cis definidos y seleccionados. Estos elementos cis son sitios de unión para proteínas de unión de ADN como factores de transcripción y se aislan a partir de promotores naturales, derivan de elementos cis ya aislados o son producidos por técnicas de recombinación orientadas aleatoriamente y se seleccionan mediante procedimientos apropiados. En comparación con un promotor natural, un promotor sintético, debido a su construcción poco compleja, se activa sólo mediante pocos factores exógenos y endógenos y por tanto se regula específicamente.

El promotor mínimo o promotor "Core" es una secuencia de ácidos nucleicos que contiene los sitios de unión para el complejo del factor de transcripción basal y permite la iniciación precisa de la transcripción mediante la ARN-polimerasa II. Los motivos de secuencia característicos del promotor mínimo son la caja TATA, el elemento iniciador (Inr), el "elemento de reconocimiento TFBII" (BRE, del inglés "TFBII recognition element") y el "elemento promotor núcleo descendente" (DPE, del inglés "downstream core promoter element"). Estos elementos pueden encontrarse en el promotor mínimo individualmente o combinados. El promotor mínimo o sus motivos de secuencia se pueden obtener de cualquier gen vegetal o viral.

En el marco de la presente invención se han desarrollado nuevos promotores sintéticos que junto con genes de resistencia conocidos, que no codifican forzosamente para una proteína de resistencia autoactivada, se pueden emplear para la preparación de una planta resistente a los patógenos. Así, se trata de promotores del tipo promotor mínimo nxS-mxD, promotor mínimo nxW2-mxD y promotor mínimo nxGst1-mxD, de manera que el promotor sintético comprende una o varias de las combinaciones de elementos cis siguientes:

a): una caja nxS-mxD

b): una caja nxW2-mxD

c): una caja nxGst1-mxD

(en las que n y m representan un número natural de 1...10).

La caja S (CAGCCACCAAAGAGGACCCAGAAT) con la secuencia de nucleótidos SEC. ID. Nº 6, la caja W2 (TTATTCAGCCATCAAAAGTTGACCAATAAT) con la secuencia de nucleótidos SEC. ID. Nº 7, la caja D (TA
CAATTCAAACATTGTTCAAACAAGGAACC) con la secuencia de nucleótidos SEC. ID. Nº 8 y la caja Gst (TTC
TAGCCACCAGATTTGACCAAAC) con la secuencia de nucleótidos SEC. ID. Nº 9 son descritas por Rushton et al., 2002, incluidas las secuencias núcleo importantes para su función.

Los promotores se diferencian según la selección de elementos (nxS-mxD, nxW2-mxD o nxGst1-mxD) en su actividad básica, inducibilidad por patógenos, cinética de activación y fuerza del promotor, como se muestra por ejemplo para los promotores con las combinaciones de elementos cis

: 2xS-2xD con la secuencia de nucleótidos de SEC. ID. Nº 10,

: 2xW2-2xD con la secuencia de nucleótidos de SEC. ID. Nº 11 y

: 2xGstl-2xD con la secuencia de nucleótidos de SEC. ID. Nº 12.

Las propiedades de un promotor sintético se pueden modificar también mediante la variación del número de elementos cis (n, m = 1...10) correspondiente a las necesidades de la expresión del gen. La comparación del promotor 2xS-2xD con las variantes 2xS-4xD, 4xS-2xD y 4xS-4xD muestra que la fuerza promedio del promotor se incrementa mediante el uso de tetrámeros, en comparación con el promotor construido a partir dímeros. Además, la inducibilidad por patógenos aumenta desde el promotor dímero (2xS-2xD) pasando por los promotores tetrámero-dímero y dímero-tetrámero (4xS-2xD, 4xS-2xD) hasta el promotor tetrámero-tetrámero (4xS-4xD) para todos los tiempos de medida. Paralelamente al aumento de la fuerza del promotor y de la inducibilidad por patógenos, en el caso del ejemplo descrito se produce también un aumento de la actividad básica de los promotores que contienen tetrámeros. Este ejemplo muestra que las propiedades importantes del promotor se regulan mediante la cantidad de elementos cis y para la correspondiente transformación técnica se pueden obtener e identificar variantes óptimas del pro-
motor.

Sin embargo, se pueden obtener los resultados correspondientes con combinaciones de elementos cis que presentan derivados o la secuencia de nucleótidos de SEC. ID. Nº 10, SEC. ID. Nº 11 o SEC. ID. Nº 12 y disponen de propiedades comparables con la combinación de elementos cis de la SEC. ID. Nº 10, SEC. ID. Nº 11 o SEC. ID. Nº 12.

Los promotores promotor mínimo 2xS-2xD y promotor mínimo 2xW2-2xD se han combinado respectivamente por ejemplo con los cuatro genes R de longitud completa BvKWS3_133, BvKWS3_123, BvKWS3_135 y BvKWS3_165 y se han transformado en la remolacha azucarera. Un ensayo de la resistencia de las plantas transgénicas frente a los hongos realizado con el hongo dañino más importante de la remolacha azucarera, Cercospora beticola, el patógeno de la enfermedad de la viruela de la hoja, condujo con cada construcción a una resistencia mejorada contra el hongo, sin que la planta transgénica se diferenciara de la planta no transgénica en su crecimiento u otras propiedades agronómicas. Estos resultados muestran que usando un promotor inducible por patógenos es esencialmente posible conseguir una sobreexpresión del gen R que desencadena la muerte celular y por tanto una resistencia mejorada a la enfermedad, sin influir negativamente en el desarrollo de la planta. Mediante el uso de promotores optimizados por selección de la cantidad apropiada de repeticiones del elemento cis se puede mejorar aún más la resistencia a enfermedades.

La presente invención se refiere también a plantas transgénicas que han sido transformadas con la nueva construcción de ácidos nucleicos, en particular plantas de remolacha azucarera, partes y semillas o simientes de dichas plantas, así como el uso de la nueva construcción de ácidos nucleicos para la preparación de una planta transgénica.

La invención se explica más detalladamente a continuación, con referencia a las figuras y ejemplos.

La invención descrita a modo de ejemplo para la remolacha azucarera se puede aplicar también sin problemas a otros cultivos a partir de los cuales se puedan aislar genes de resistencia.

Figuras

La Fig. 1 muestra el mapa del vector binario pER-35Sluci que se ha empleado para la expresión transitoria de los genes R mediada por Agrobacterium tumefaciens en las hojas de la remolacha azucarera. El vector lleva un gen Luciferasa de Photinus pyralis interrumpido por un intrón, que no se puede expresar en A. tumefaciens.

La Fig. 2 muestra la activación de la muerte celular en las hojas de remolacha azucarera tras la expresión transitoria del gen R BvKWS3_133 por Agrobacterium tumefaciens. Mientras la expresión transitoria de la construcción pER-35Sluci conduce a una fuerte actividad del gen reportero en las hojas de la remolacha, la expresión de la construcción pER133-35Sluci activa la muerte celular, de manera que no se puede medir ninguna actividad del gen reportero.

La Fig. 3 muestra el vector pCaMV-2 que se ha empleado para la transformación biolística transitoria de las hojas de la remolacha azucarera. Los genes R reducidos y de longitud completa se han preparado como se describe, bajo los controles del promotor 35S doble de este vector.

La Fig. 4 muestra la activación de la muerte celular en las hojas de remolacha azucarera tras la expresión transitoria de los genes R BvKWS3_123, BvKWS3_133 y BvKWS3_165 mediante transformación biolística. Los genes BvKWS3_123, BvKWS3_133 y BvKWS3_165 quedan bajo el control del promotor 35S doble (d35S) y han sido co-transformados con la construcción del gen reportero p70S-luc. La actividad del gen reportero se midió 20 h después de la transformación. Mediante la activación de una reacción hipersensitiva se reduce la actividad del gen reportero en comparación con los controles (vector vacío pCaMV-2 y p70S-luc). Se representa el valor promedio de 3 repeticiones independientes del ensayo con 9 experimentos individuales por cada construcción. Las barras de error indican el error estándar.

La Fig. 5 muestra una activación reforzada de la muerte celular mediante la expresión de la zona 5'-terminal del gen R BvKWS3_165 en comparación con la expresión del gen R de longitud completa BvKWS3_165. La zona N-terminal y el gen R de longitud completa se han co-transformado bajo el control del promotor d35S (p70S-165_#175 y p70S-BvKWS3_165) con la construcción p70S-luc por transformación biolística en las hojas de la remolacha azucarera. Se representa el valor promedio de 3 repeticiones independientes del ensayo con 9-12 experimentos individuales por cada construcción.

La Fig. 6 muestra una activación de la muerte celular mediante la expresión del gen R de longitud completa BvKWS3_135 y en comparación con ella una activación reforzada de la muerte celular mediante la zona 5'-terminal 135_#147 del gen R BvKWS3_135. El gen R de longitud completa y la zona N-terminal 135_#147 se han co-transformado bajo el control del promotor d35S (p70S-BvKWS3_135 y p70S-135_#147) con la construcción p70S-luc mediante transformación biolística en las hojas de la remolacha azucarera. Se representa el valor promedio de 2 repeticiones independientes del ensayo con 9-12 experimentos individuales por cada construcción.

La Fig. 7 muestra una activación reforzada de la muerte celular mediante la expresión de la zona 5'-terminal 13033_#159 del gen R Bv13033 en comparación con la expresión del gen R de longitud completa Bv13033. El gen R de longitud completa y la zona N-terminal 13033_#159 se han co-transformado bajo el control del promotor d35S (p70S-13033 y p70S-13033_#159) con la construcción p70S-luc mediante transformación biolística en las hojas de la remolacha azucarera. Se representa el valor promedio de 2 repeticiones independientes del ensayo con 9-12 experimentos individuales por cada construcción.

La Fig. 8 muestra la activación de la muerte celular mediante la expresión del gen R Bv12069.

La Fig. 9 muestra la autoactivación de la proteína BvKWS3_135 mediante reducción en la zona 5' del clon 135_#147 de ADNc en comparación con la mutación del motivo VHD del dominio NBS.

Las Fig. 10a)-c) muestran comparaciones de las secuencias de aminoácidos de las proteínas autoactivas reducidas Bv12069, Bv13033_#159, BvKWS135_#147, BvKWS3_165_#175 y StR3a-#1-155 entre sí y con las secuencias de comparación de proteínas de resistencia reducidas no autoactivas de patata (RX-160) y StR1 (355-540) así como proteínas R completas del tipo NBS-LRR de Arabidopsis thaliana (AtAB028617), haba (PvulgarisJ71), arroz (OsativaAP003073), haba de soja (GmaxKR4) y tomate (Tomato-I2). Las secuencias consenso están subrayadas.

La Fig. 11 muestra que la deleción de los aminoácidos 147-175 reduce claramente la capacidad de autoactivación de la proteína 165_#175.

La Fig. 12 muestra la activación del promotor sintético 2xS-2xD en remolacha azucarera transgénica tras el ataque de Cercospora beticola.

La Fig. 13 muestra la activación del promotor sintético 2xW2-2xD en remolacha azucarera transgénica tras el ataque de Cercospora beticola.

La Fig. 14 muestra la comparación de la actividad del gen reportero de los promotores 2xS-2xD, 4xS-2xD, 2xS-4xD y 4xS-4xD en remolacha azucarera transgénica tras el ataque de Cercospora beticola.

Las Fig. 15 y 16 muestran combinaciones de los genes R de longitud completa 123, 133, 135, 165 con el promotor sintético 2xS-2xD.

Las Fig. 17 y 18 muestran combinaciones de los genes R de longitud completa 123, 133, 135, 165 con el promotor sintético 2xW_{2}-2xD.

La Fig. 19 muestra el aumento de la resistencia de la línea transgénica PR68-6 de la remolacha azucarera frente al hongo dañino Cercospora beticola en comparación con el control no transgénico 3DC4156.

La Fig. 20 muestra el aumento de la resistencia de la línea transgénica PR70-32 de la remolacha azucarera frente al hongo dañino Cercospora beticola en comparación con el control no transgénico 3DC4156.

Las Fig. 21 y 22 muestran la combinación de las zonas N-terminales de los genes R, 165_#176 y 12069 con los promotores sintéticos 2xS-2xD y 2xW_{2}-2xD.

Ejemplos Prueba de la activación de una reacción de resistencia rápida en hojas de remolacha azucarera mediante sobreexpresión del gen BvKWS3 133

La sobreexpresión transitoria del clon de ADNc de longitud completa del gen BvKWS3_133 en hojas de remolacha azucarera por Agrobacterium tumefaciens desencadena una muerte celular rápida sin formación de necrosis visible. El clon de ADNc BvKWS3_133 se combinó con el promotor d35S y se insertó en el vector binario pER-35Sluci (Fig. 1). El vector formado lleva la denominación pER133-35Sluci. Los vectores pER-35Sluci y pER133-35Sluci se transformaron en la cepa C58C1 de Agrobacterium (An 1987). Las agrobacterias positivas para la expresión transitoria se sometieron durante 4-5 h a 50 ml de medio LB con espectinomicina 100 mg/ml y acetosiringona 20 \muM. A continuación las bacterias se centrifugaron y el sedimento se recogió en una solución de MgCl_{2} 10 mM, MES 10 mM, acetosiringona 100 \muM y se ajustó una densidad de bacterias de OD600 = 0,1. La suspensión de bacterias se agitó 2-3 h y después con ayuda de una jeringa de 2,5 ml se inyectó sobre el dorso de la hoja de remolacha azucarera de 10 semanas de edad. Tras la incubación a 25ºC en una incubadora, el día 1, 2 y 3 tras la inoculación de Photinus pyralis se midió la actividad del gen reportero Luciferasa en las hojas transformadas. Para ello, la actividad Luciferasa se determinó con el Luciferase Assay System (Promega, Mannheim, Alemania) en un luminómetro Sirius (Berthold Detection System GmbH, Pforzheim, Alemania) según las indicaciones del fabricante. Para la obtención de un extracto enzimático apropiado para la medición se definieron dos discos de hoja por cada punto de medición. Para cada construcción se tomaron 8 puntos de medida cada día. Las muestras de hoja se homogeneizaron en un mortero añadiendo arena con 10 veces el volumen (v/p) de tampón de lisis pasiva (PLB, del inglés Passive Lysis Buffer). El sobrenadante líquido se transfirió a un recipiente Eppendorf de 1,5 ml y se centrifugó 5 min a 4ºC y 20.000 g. El residuo claro se extrajo y se emplearon 10 \mul de extracto crudo para cada medición de la actividad Luciferasa-Photinus. Las hojas de remolacha azucarera que se transformaron con la construcción control pER-35Sluci mostraron el día 1 una baja actividad Luciferasa y el día 2 y 3 una actividad Luciferasa de 124.000 y 116.000 RLU/mg de tejido de hoja. Las hojas de remolacha que se transformaron con la construcción pER133-35Sluci no mostraron en los 3 puntos de medida una actividad mayor que la de las hojas inoculadas de MgCl_{2} (Fig. 2). Con ello la expresión transitoria del clon BvKWS3_133 de ADNc desencadena una muerte celular muy rápida en las hojas de remolacha inoculadas.

La expresión constitutiva de los genes R BvKWS3 123, BvKWS3 133 y BvKWS3 165 desencadena la muerte celular en las hojas de remolacha azucarera

El gen R BvKWS3_133, así como el gen R BvKWS3_165 con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 5 y el gen R BvKWS3_123 se combinaron con el promotor 35S doble del vector pCaMV-2 (Fig. 3). Los vectores formados se denominan p70S-BvKWS3_133, p70S-BvKWS3_165 y p70S-BvKWS3_123. Para comprobar la funcionalidad de los genes R, las construcciones p70S-BvKWS3_133, p70S-BvKWS3_165 y p70S-BvKWS3_123 se expresaron transitoriamente con el vector del gen reportero p70S-luc en las hojas de remolacha azucarera mediante transformación biolística según Schmidt et al., 2004. Como control positivo se empleó el vector vacío pCaMV-2 en combinación con el vector del gen reportero p70S-luc. A diferencia de Schmidt et al. (2004), se renunció al empleo de un vector de normalización. La actividad Luciferasa se determinó con el Luciferase Assay System (Promega, Mannheim, Alemania) 20 h después de la transformación. Los experimentos de transformación se repitieron tres veces, comprendiendo cada experimento 9 repeticiones del ensayo por cada construcción. La formación del valor promedio de los 3 experimentos mostró que en comparación con la actividad Luciferasa del control positivo (vector vacío) fijada en el 100%, la actividad del gen reportero ascendió sólo al 37,7% para p70S-BvKWS3_133, al 66% para p70S-BvKWS3_165 y al 68,7% para p70S-BvKWS3_123 (Fig. 4). La fuerte expresión de los genes R BvKWS3_133, BvKWS3_165 y BvKWS3_123 mediante el promotor d35S desencadena por tanto la muerte celular o una reacción hipersensitiva en una parte de las células transformadas, que impide una co-expresión del vector del gen reportero transformado conjuntamente. Con ello se mostró que la fuerte expresión de los tres genes R conduce a muerte celular o HR en ausencia de un producto del gen de avirulencia correspondiente.

La zona 5' del gen BvKWS3 165 desencadena una rápida muerte celular como el clon BvKWS3 165 de ADNc completo

Partiendo del clon BvKWS3_165 de ADNc de longitud completa con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 5, en la construcción p70S-BvKWS3_165 se amplificó la zona 5' del gen con ayuda de la polimerasa Pfu (Stratagene) usando el cebador S316 (CTGGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG) y S318 (CTGGATCCTCACCTCCGTTC
TTCATGTTGCTCTACC) y al mismo tiempo se introdujo un codón de parada en la zona codificante. La zona amplificada corresponde a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1 y codifica para la secuencia de aminoácidos 1-175 de BvKWS3_165 (Fig. 10). La secuencia de aminoácidos comprende sólo la zona N-terminal de BvKWS3_165 y no contiene ningún dominio NBS ni LRR (Fig. 10). El producto de PCR se cortó con los enzimas de restricción SacII y BamHI y se clonó en el vector pCaMV-2. El vector resultante se denomina p70S-165_#175. La capacidad de las construcciones p70S-BvKWS3_165 y p70S-165_#175 de desencadenar la muerte celular en las hojas de remolacha azucarera se ensayó cuantitativamente mediante transformaciones biolísticas transitorias. Para ello se co-transformó cada vector con el vector del gen reportero p70S-luc. Como control positivo se empleó el vector vacío pCaMV-2 en combinación con el vector reportero p70S-luc.

En comparación con la transformación del vector vacío (pCaMV-2), la transformación de p70S-BvKWS3_165 conduce a una actividad medible del gen reportero del 65% y la transformación de p70S-165_#175 conduce a una actividad medible del gen reportero de sólo el 38% (Fig. 5). Este resultado muestra que la expresión exclusiva del terminal N de 165_#175 de 175 aminoácidos de tamaño conduce a una activación más intensa de la muerte celular en las hojas de remolacha azucarera transformadas que el uso de la proteína de longitud completa BvKWS3_165 de 1066 aminoácidos de tamaño. Mediante la expresión de 165_#175 mueren más células de hoja transformadas que en el caso de la expresión de BvKWS3_165. La causa de esta diferencia es una nueva forma más intensa de autoactivación de la proteína R mediante una reducción en el terminal N.

La zona 5' del gen BvKWS3 135 desencadena una muerte celular más rápida que el clon BvKWS3 135 de ADNc completo

Partiendo del clon BvKWS3_135 de ADNc de longitud completa, en la construcción p70S-BvKWS3_135 se amplificó la zona 5' del gen con ayuda de la polimerasa Pfu (Stratagene) usando el cebador S316 (CTGGAGAATTC
GAGCTCCACCGCGG) y S330 (CTGGATCCTCAGGGAGAACTCCATCTGGGTGGTCC) y al mismo tiempo se introdujo un codón de parada en la zona codificante. La zona amplificada corresponde a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 2 y codifica para la secuencia de aminoácidos 1-147 de BvKWS3_135 (Fig. 10). La secuencia de aminoácidos comprende sólo la zona N-terminal de BvKWS3_135 y no contiene ningún dominio NBS ni LRR ni motivos de estos dominios. El producto de PCR se cortó con los enzimas de restricción SacII y BamHI y se clonó en el vector pCaMV-2. El vector resultante se denomina p70S-135_#147. La capacidad de las construcciones p70S-BvKWS3_135 y p70S-135_#147 de desencadenar la muerte celular en las hojas de remolacha azucarera se ensayó cuantitativamente mediante transformaciones biolísticas transitorias. Para ello se co-transformó cada vector con el vector del gen reportero p70S-luc. Como control positivo se empleó el vector vacío pCaMV-2 en combinación con el vector reportero p70S-luc. En comparación con la transformación del vector vacío (pCaMV-2), la transformación de p70S-BvKWS3_135 conduce a una actividad medible del gen reportero del 74,5% y la transformación de p70S-135_#147 conduce a una actividad medible del gen reportero de sólo el 58,5% (Fig. 6). Los resultados muestran que la expresión del clon de longitud completa BvKWS3_135 conduce a la activación de la muerte celular en el tejido transformado. Por supuesto la expresión exclusiva del terminal N de 135_#147 de 147 aminoácidos de tamaño tiene como resultado una muerte celular más intensa en las hojas de remolacha azucarera transformadas que el uso de la proteína BvKWS3_135 de 844 aminoácidos de tamaño. Mediante la expresión de 135_#147 mueren más células de hoja transformadas que en el caso de la expresión de BvKWS3_135. La causa de esta diferencia es una nueva forma más intensa de autoactivación de la proteína R mediante una reducción en el terminal N.

La zona 5' del gen Bv13033 desencadena una muerte celular más rápida que el clon Bv13033 de ADNc completo

Partiendo del clon Bv13033 de ADNc de longitud completa en la construcción p70S-13033 se amplificó la zona 5' del gen con ayuda de la polimerasa Pfu (Stratagene) usando el cebador S316 (CTGGAGAATTCGAGCTC
CACCGCGG) y S333 (CTGGATCCTCAAGAACAAGTCTCAGGCCTTCTGTT) y al mismo tiempo se introdujo un codón de parada en la zona codificante. La zona amplificada corresponde a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 3 y codifica para la secuencia de aminoácidos 1-159 de Bv13033 (Fig. 10). La secuencia de aminoácidos comprende sólo la zona N-terminal de Bv13033 y no contiene ningún dominio NBS ni LRR o motivos de estos dominios. El producto de PCR se cortó con los enzimas de restricción SacII y BamHI y se clonó en el vector pCaMV-2. El vector resultante se denomina p70S-13033_#159. La capacidad de las construcciones p70S-13033 y p70S-13033_#159 de desencadenar la muerte celular en las hojas de remolacha azucarera se ensayó cuantitativamente mediante transformaciones biolísticas transitorias. Para ello se co-transformó cada vector con el vector del gen reportero p70S-luc. Como control positivo se empleó el vector vacío pCaMV-2 en combinación con el vector reportero p70S-luc. En comparación con la transformación del vector vacío (pCaMV-2), la transformación de p70S-13033 conduce a una actividad medible del gen reportero del 95% y la transformación de p70S-165_#175 conduce a una actividad medible del gen reportero de sólo el 68% (Fig. 7). Estos resultados muestran que la expresión del clon de longitud completa Bv13033 sólo conduce a la activación de una muerte celular débil en el tejido transformado. Por el contrario, la expresión exclusiva del terminal N de 13033_#159 de 159 aminoácidos de tamaño tiene como resultado una muerte celular intensa en las hojas de remolacha azucarera transformadas. La causa de esta diferencia es una nueva forma más intensa de autoactivación de la proteína R mediante una reducción en el terminal N.

Activación de la muerte celular en hojas de remolacha azucarera mediante la zona 5' del gen Bv12069

El gen R Bv12069 con la secuencia de nucleótidos SEC. ID. Nº 4 codifica para el terminal N de 166 aminoácidos de tamaño de una proteína R. La proteína Bv12069 no contiene dominios NBS ni LRR, pero muestra una clara analogía con los terminales N de 175, 147 y 159 aminoácidos de tamaño de las proteínas R autoactivadas 165_#175, 135_#147, 13033_#159 (Fig. 10). El clon de ADNc se combinó con el promotor 35S doble del vector pCaMV-2 (Fig. 3) dando el vector p70S-12069. Para comprobar la funcionalidad del gen Bv12069, la construcción p70S-12069 en combinación con el vector del gen reportero p70S-luc se expresó de forma transitoria en hojas de remolacha azucarera mediante transformación biolística. La actividad del gen reportero en las hojas transformadas con p70S-12069 y p70S-luc en tres ensayos independientes ascendió sólo al 51% de la actividad que se pudo medir en los controles positivos (vector vacío pCaMV-2 y p70S-luc) (Fig. 8). Así, la expresión de la proteína Bv12069 de 166 aminoácidos de tamaño desencadena la muerte celular en las células de remolacha azucarera.

La reducción del gen BvKWS3 135 no conduce a una proteína R autoactivada pese a la mutagénesis del dominio MHD

El mecanismo según la invención de la autoactivación mediante la reducción de una proteína R del tipo NBS-LRR en el terminal N libre de NBS y LRR se comparó con el método de autoactivación por mutagénesis del motivo MHD: la mutagénesis del motivo MHD del gen Rx de la patata y del gen L6 del lino condujo a una autoactivación de los genes mencionados (Bendahmane et al., 2002; Howles et al., 2005). El clon BvKWS3_135 de ADNc codifica para el motivo VHD correspondiente al motivo MHD, un motivo que junto al motivo MHD se encuentra a menudo en los genes R (Howles et al., 2005). La mutación correspondiente se introdujo en el clon BvKWS3_135 de longitud completa, como se describe en Bendahmane et al. (2002). Para ello el aminoácido aspartato se sustituyó por el aminoácido valina en el motivo VHD del gen BvKWS3_135. El gen formado se denomina BvKWS3_135_D480V. La eficacia de los genes 135_#147, BvKWS3_135_D480V y del gen no modificado BvKWS3_135 se comprobó mediante la sobreexpresión transitoria mediada por Agrobacterium tumefaciens en las hojas de remolacha azucarera. Para ello el clon BvKWS3_135 de ADNc se combinó con el promotor d35S y se insertó en el vector binario pER-35Sluci. El vector formado se denomina pER135-35Sluci. Se procedió respectivamente con el clon 135_#147 de ADNc reducido con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 2, así como con el clon BvKWS3_135_D480V de ADNc mutagenizado. Los vectores formados se denominan pER135 #147-35Sluci y pER135_D480V-35Sluci. Los vectores se transformaron como se describe en la cepa C58C1 de Agrobacterium y se inyectaron en las hojas de remolacha azucarera junto con el control positivo pER-35Sluci. La actividad del gen reportero Luciferasa de Photinus pyralis se midió 1, 2 y 3 días después de la inoculación en las hojas transformadas. Las hojas de remolacha azucarera que fueron transformadas con la construcción control pER-35Sluci mostraron el día 1 una actividad Luciferasa baja y el día 2 y 3 una actividad Luciferasa de 299.000 y 433.000 RLU/mg de tejido de hoja. Las hojas de remolacha que fueron transformadas con la construcción pER-35Sluci mostraron el día 2 y 3 una actividad Luciferasa de 190.000 y 245.000 RLU/mg de tejido de hoja y por tanto una muerte celular medible en comparación con el control positivo pER-35Sluci. La actividad del gen reportero de la construcción pER_135_D480V-35Sluci el día 2 y 3 ascendió a 188.000 y 206.000 RLU/mg (Fig. 9). Por consiguiente, la introducción de la mutación MHD en el gen BvKWS3_135 no condujo a ninguna autoactivación o a una autoactivación apenas medible. Por el contrario, el gen R 135#147 reducido correspondiente a este procedimiento mostró el día 2 y 3 una actividad del gen reportero de 90.000 y 63.000 RLU/mg (Fig. 9) y por tanto una autoactivación y desencadenamiento de la muerte celular claramente más fuerte que las construcciones pER135-35Sluci y pER_135_D480V-35Sluci.

Identificación de motivos aminoácido comunes en los terminales N de las proteínas R de BvKWS3 165, BvKWS3 135, Bv13033 y Bv12069 y StR3a

Para identificar motivos de secuencia comunes se llevó a cabo una comparación de homología entre los terminales N de las proteínas R BvKWS3_165, BvKWS3_135, Bv13033 y Bv12069 de 175, 147, 159 y 166 aminoácidos de tamaño y el terminal N del gen R3a de la patata, de 155 aminoácidos de tamaño (Huang et al., 2005). La comparación condujo a la identificación de varias secuencias consenso en los terminales N de las proteínas R autoactivadas. Los motivos de secuencia comunes se subrayan como secuencias consenso en la Fig. 10a).

Una secuencia consenso se corresponde con la secuencia de aminoácidos según SEC. ID. Nº 13: AVLXDAEXKQ
XX XXXLXXWLXD LKDXVYDXDD ILDE. Otra secuencia consenso se corresponde con la secuencia de aminoácidos según SEC. ID. Nº 14: IXEIXXKLDD L.

La mayúscula X representa cualquier aminoácido.

Ambas secuencias consenso están contenidas en la forma descrita sólo en aquellos terminales N de proteínas R CC-NBS-LRR, cuya expresión conduce a una autoactivación. Así, el dominio CC del gen RX de 160 aminoácidos de tamaño no es capaz de desencadenar la muerte celular o una reacción hipersensitiva (Bendahmane et al., 2002). La expresión transitoria del terminal N del gen R BvKWS3_133_e08 de 177 aminoácidos de tamaño de la remolacha azucarera y del terminal N del gen R1 de 540 aminoácidos de tamaño de la patata (Ballvora et al., 2002), en comparación con el gen R BvKWS3_133_e08 completo, no desencadenó una muerte celular reforzada o en el caso del gen R1, ninguna muerte celular (no se muestran los datos). La comparación de aminoácidos de los terminales N de las proteínas autoactivadas BvKWS3_165_#176, BvKWS3_135_#147, Bv13033_#159, Bv12069 y StR3a-#1-155 con las secuencias de aminoácidos de los dominios CC de las proteínas Rx, StR1 y BvKWS3_133_#177 muestra la ausencia de las secuencias consenso descritas arriba en los terminales N no autoactivados (Fig. 10b). En particular, el motivo de secuencia DAE es un agente auxiliar importante para la identificación de proteínas R cuyo terminal N es autoactivo. Con ayuda del motivo de secuencia DAE en la secuencia consenso se pueden encontrar en numerosas especies vegetales genes R adecuados para una autoactivación, como muestra la Fig. 10c para los ejemplos de Arabidopsis thaliana (AtAB028617), haba (PvulgarisJ71), arroz (osativaAp003073), haba de soja (GmaxKR4) y tomate (Tomato-12).

La secuencia de aminoácidos de 147-175 es importante para la autoactivación de la proteína R 165 #175

Para identificar en la proteína 165_#175 las secciones de aminoácidos que son importantes para la autoactivación del terminal N de las proteínas NBS-LRR se acortó la zona codificante del clon 165_#175 de ADNc. Los clones 165_#93 y 165_#146 de ADNc codifican para los aminoácidos 1-93 o 1-146 de la proteína 165_#175. El ensayo biolístico transitorio de las construcciones p70S_165_#93, p70S_165_#146 y p70S_165_#175 mostró que sólo la proteína 165_#175, y no las 165_#93 y 165_#146, desencadena una muerte celular intensa (Fig. 11). Por tanto, la zona de la secuencia 146-175 es esencial para la autoactivación de las proteínas NBS-LRR. En esta zona se encuentra un motivo de secuencia conservado entre todas las proteínas estudiadas (Fig. 10a)).

Rápida activación de los promotores sintéticos inducibles por patógenos 2xS-2xD y 2xW2-2xD mediante ataque de hongos

Para la sobre-expresión inducida por patógenos de los genes de resistencia completos o parciales son apropiados en particular promotores sintéticos del tipo nxS-mxD, nxW2-mxD y nxGst1-mxD, siendo n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y m=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. A modo de ejemplo se combinaron promotores del tipo 2xS-2xD según SEC. ID. Nº 10, 2xW2-2xD según SEC. ID. Nº 11 así como 2xGst1-2xD según SEC. ID. Nº 12 con el gen Luciferasa de Photinus pyralis, se transformaron en remolacha azucarera y se analizaron en reacción al ataque de hongos.

Para la transformación de plantas se emplearon los vectores binarios 2xS-2xD-luc-kan, 2xW2-2xD-luc-kan y 2xGst1-2xD-luc-kan. Los vectores binarios se transformaron en la cepa C58C1 de Agrobacterium tumefaciens, con el plásmido residente pGV2260 mediante un procedimiento directo de transformación de ADN (An, 1987). La selección de clones recombinantes de A. tumefaciens se realizó usando el antibiótico canamicina (50 mg/l).

La transformación de la remolacha azucarera se realizó según Lindsey et al. (1991) usando el antibiótico canamicina. La transgenicidad de las plantas se comprobó por PCR. El uso de los cebadores GTGGAGAGGCTATTCGGTA y CCACCATGATATTCGGCAAG condujo a la amplificación de un fragmento de ADN del gen nptII de 553 pb de tamaño. El PCR se realizó empleando 10 ng de ADN genómico, una concentración de cebador de 0,2 \muM a una temperatura de alineamiento de 55ºC en un multiciclador PTC-200 (MJ Research, Watertown, EUA).

Para analizar la inducibilidad por patógenos de los promotores, las remolachas azucareras transgénicas se infectaron bajo condiciones in vitro con la enfermedad de la viruela de la hoja de la remolacha azucarera, Cercospora beticola. Se sumergieron respectivamente 4 plantas de una línea transgénica en una suspensión de fragmentos de micelio de C. beticola (400.000 fragmentos/ml) y 4 plantas con finalidad de control en zumo vegetal diluido. Las plantas infectadas y las plantas control se incubaron a continuación a 25ºC y 16 horas de iluminación en una cabina de cultivo. El material de hojas infectadas y no infectadas se retiró 1, 2, 3, 4 y 6-7 días tras la inoculación y se determinó la actividad del gen reportero Luciferasa con el Luciferase Assay System (Promega, Mannheim, Alemania) como se describe.

Tanto el promotor 2xS-2xD como el 2xW2-2xD mostraron una rápida e intensa inducibilidad por patógenos en la fase temprana de la infección, aunque se diferencian en la actividad básica y la fuerza del promotor (Fig. 12-13). En el caso de las líneas transgénicas PR39/11, PR39/48 y PR39/49 el promotor 2xS-2xD se indujo muy rápidamente, 11-59 veces ya el día 1 tras la inoculación y 21-380 veces el día 2, en comparación con las plantas no infectadas (Fig. 12). Mientras el día 1 aún se caracteriza por un crecimiento de las hifas del hongo en la epidermis, el día 2 aparece una penetración de las hojas a través de los estomas y por tanto una introducción en el tejido de la hoja. En la fase tardía de la infección, con un desarrollo visible de necrosis, el día 7 se observó una inducción del promotor de 113-792 veces. La actividad básica del promotor 2xS-2xD medida como actividad del gen reportero de las plantas no infectadas es muy baja y asciende sólo a 1-10 veces la actividad Luciferasa medible en plantas no transgénicas. La activación del promotor 2xW2-2xD transcurre algo más lenta que la del promotor 2xS-2xD. El promotor 2xW2-2xD presenta una inducción por patógenos de sólo 2-17 veces el primer día de la infección y de 5-56 veces el segundo día de infección. Con la aparición de la necrosis el día 7 se consigue una máxima inducción por patógenos de 318-672 veces (Fig. 13). La actividad básica del promotor 2xW2-2-D, con 10-50 veces la actividad del gen reportero medible en plantas no transgénicas, es mayor que en el caso del promotor 2xS-2xD. Sin embargo, destaca claramente el promotor 2xW2-2xD con una fuerza del promotor unas 10 veces mayor que el promotor 2xS-2xD.

Optimización de las propiedades del promotor mediante la modificación de la cantidad de elementos cis

Las propiedades de un promotor sintético del tipo nxS-mxD, nxW2-mxD y nxGstl-mxD con n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y m=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 se pueden modular y optimizar a través de la variación de la cantidad de elementos cis en referencia a las necesidades de la expresión génica. Esto se muestra a modo de ejemplo para el tipo de promotor nxS-mxD. Junto al vector binario 2xS-2xD-luc-kan se prepararon los vectores binarios 4xS-2xD-luc-kan, 2xS-4xD-luc-kan y 4xS-4xD-luc-kan y se transformaron en remolacha azucarera. Las plantas transgénicas se infectaron con C. beticola como se describe y se midió diariamente la actividad del gen reportero tras la inoculación del hongo. Se promediaron los resultados de la medición de 13 líneas independientes de 2xS-2xD-luc, 14 líneas independientes de 4xS-2xD-luc, 15 líneas independientes de 2xS-4xD-luc, así como 15 líneas independientes de 4xS-4xD-luc y se compararon los valores promedio de la fuerza del promotor, la inducción por patógenos y la actividad básica.

La comparación de las propiedades del promotor 2xS-2xD con las variantes 2xS-4xD, 4xS-2xD y 4xS-4xD muestra que la fuerza promedio del promotor aumenta mediante el uso de tetrámeros en comparación con el promotor formado a partir de dímeros (Fig. 14). Además, la inducibilidad por patógenos aumenta desde el promotor dímero-dímero (2xS-2xD), pasando por los promotores tetrámero-dímero y dímero-tetrámero (4xS-2xD, 4xS-2xD) hasta el promotor tetrámero-tetrámero (4xS-4xD) en todos los instantes de medida (Tabla 1).

TABLA 1 Inducibilidad por patógenos de los promotores 2xS-2xD, 4xS-2xD, 2xS-4xD y 4xS-4xD en remolacha azucarera transgénica tras la infección con Cercospora beticola. Se representa el valor promedio de la inducción por patógenos de 13-15 transformantes (líneas) independientes por construcción de promotor 1-4 días tras la inoculación

1

Paralelamente al incremento de la fuerza del promotor y de la inducibilidad por patógenos se produce un aumento de la actividad básica de los promotores que contienen tetrámeros (Tabla 2).

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TABLA 2 Actividad básica de los promotores 2xS-2xD, 4xS-2xD, 2xS-4xD y 4xS-4xD en hojas de remolacha azucarera transgénica. Se presenta el valor promedio de la actividad básica de 13-15 transformantes independientes (líneas) por construcción de promotor, que se midieron como controles no infectados en el ensayo de infección de cuatro días. La actividad básica indica la relación de la actividad del gen reportero de las plantas transgénicas en comparación con la actividad de fondo inespecífica de plantas transgénicas

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Este ejemplo muestra que las propiedades del promotor importantes en relación con el concepto, como la fuerza del promotor, la inducibilidad por patógenos y la actividad básica, se regulan mediante la cantidad de elementos cis y se pueden conseguir variantes de promotor óptimas para las respectivas realizaciones técnicas. En el ejemplo estudiado la cantidad óptima de elementos cis de los promotores inducibles por patógenos, en referencia a la inducibilidad por patógenos, es mayor que la solución dímera descrita por Rushton et al., 2002.

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Preparación de remolacha azucarera resistente a los hongos mediante transformación del gen de resistencia inducible por patógenos

Para aumentar la resistencia a los hongos de la remolacha azucarera los promotores 2xS-2xD o 2xW2-2xD se combinan respectivamente con uno de los cuatro genes R BvKWS3_123, BvKWS3_133, BvKWS3_135 y BvKWS3_165 y se transforman en la remolacha azucarera.

Para ello los vectores binarios 2xS-2xD-luc-kan y 2xW2-2xD-luc-kan de 13.959 y 13.969 kb de tamaño se cortaron con SacI y los sitios de unión se rellenaron mediante el tratamiento con ADN polimerasa T4. A continuación, los vectores se siguieron cortando con XhoI, se separaron por electroforesis de gel y los vectores de 12.284 y 12.294 kb de tamaño se separaron y aislaron del gen Luciferasa de 1.675 kb de tamaño.

El aislamiento del gen de resistencia ZR se realiza a partir de los vectores p70S-BvKWS3_123, p70S-BvKWS3_
133, p70SBvKWS3_135 y p70S-BvKWS3_165. Para ello en primer lugar los vectores se linealizan con NotI y los sitios de unión se rellenan mediante el tratamiento con Klenow. Después, los vectores se cortan con XhoI y se aíslan los genes R. Los vectores resultantes se denominan 2xS-2xD-BvKWS3_123, 2xS-2xD-BvKWS3_133, 2xS-2xD-BvKWS3_135 y 2xS-2xD-BvKWS3_165 o 2xW_{2}-2xD-BvKWS3_123, 2xW_{2}-2xD-BvKWS3_133, 2xW_{2}-D-BvKWS3_135 y 2xW_{2}-2xD-BvKWS3_165 (Fig. 15-18). Los vectores binarios se emplean, como se describe, para la preparación de remolacha azucarera transgénica.

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Identificación de remolacha azucarera resistente a los hongos mediante el ensayo de resistencia con el hongo dañino Cercospora beticola

La elevada resistencia a los hongos de las plantas se observó en ensayos de resistencia a los hongos, como se describe a modo de ejemplo a continuación para el ensayo de resistencia de la remolacha azucarera frente a Cercospora beticola.

Para la infección de la remolacha azucarera con C. beticola, el patógeno de la viruela de la hoja, junto a las plantas transgénicas se introduce en el invernadero remolacha azucarera del genotipo 3DC4156 usado para la transformación. Dos semanas antes de la inoculación planeada, placas de zumo vegetal (zumo vegetal Albani 40%) con el C. beticola agresivo se vacunan con aislado Ahlburg y se incuban a 25ºC. Justo antes de la inoculación se raya el agar donde crecen los hongos con ayuda de un portaobjetos y algo de agua. La concentración de fragmentos de micelio y esporas de hongo se determina con ayuda de una cámara de contaje. La densidad de inóculo se ajusta con agua a una concentración de 20.000 fragmentos/ml. Para la infección, las plantas de 10-12 semanas de edad se sumergen de cabeza en un recipiente de 5 L lleno con el inóculo. Se inoculan 30 plantas por cada línea estudiada y las plantas se sitúan en el invernadero de forma aleatoria.

Tras la inoculación las plantas se incuban en un invernadero durante 4 días a 28ºC y 95% de humedad del aire. Después del cuarto día se reduce la humedad del aire al 60%-70%. Dos, tres y cuatro semanas tras la inoculación se valora ópticamente el ataque de las hojas con ayuda del esquema de evaluación de nueve niveles (1970) (1 = hojas sanas, 9 = 100% hojas destruidas) de Kleinwanzlebener Saatzucht (KWS). Las líneas transgénicas que se transformaron con una de las construcciones 2xS-2xDBvKWS3_123, 2xS-2xD-BvKWS3_133, 2xS-2xD-BvKWS3_165, 2xW_{2}-2xD-BvKWS3_123, 2xW_{2}-2xD-BvKWS3_133, 2xW_{2}-2xD=BvKWS3_135 o 2xW_{2}-2xD-BvKWS3_165, mostraron una elevada resistencia a los hongos en comparación con los controles (Tabla 3).

TABLA 3 Aumento de la resistencia de la remolacha azucarera transgénica frente al hongo dañino Cercospora beticola

4

El análisis de la evolución en el tiempo del desarrollo del ataque para los transformantes PR68-6 y PR70-32 en los tres términos de evaluación muestra que al avanzar la duración del ensayo aumenta la diferencia en el desarrollo del ataque entre los controles y la línea transgénica (Fig. 19 y 20). Estos resultados muestran que la expresión inducida de diferentes genes R de la remolacha azucarera con ayuda de promotores específicos de patógeno conduce a un aumento de la resistencia a los hongos.

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Preparación de plantas resistentes a los hongos mediante la transformación de las zonas N-terminales de los genes R bajo el control de promotores con respuesta a patógenos

Para preparar plantas resistentes a los hongos mediante el uso de fragmentos N-terminales de los genes R, se combinaron los genes R reducidos 13033_#159, 135_#147, 165_#175 y Bv12069 con los promotores 2xS-2xD y 2xW2-2xD y se transformaron en remolacha azucarera. Para ello los vectores binarios 2xS-2xD-luc-kan y 2xW2-2xD-luc-kan de 13.959 y 13.969 kb de tamaño se cortaron con SacI y los sitios de unión se rellenaron mediante tratamiento con ADN polimerasa T4. A continuación, los vectores se siguieron cortando con XhoI, se separaron por electroforesis de gel y los vectores de 12.284 y 12.294 kb de tamaño se separaron y aislaron del gen Luciferasa de 1.675 kb de tamaño.

El aislamiento del gen de R reducido se realizó a partir de los vectores p70S-12069, p70S-13033_#159, p70S-135_#147 y p70S-165_#175. En primer lugar los vectores se linealizaron con XbaI y los extremos de ADN se rellenaron mediante el tratamiento con Klenow y después los vectores se siguieron cortando con XhoI. Los fragmentos de gen R aislados se clonaron entonces en los vectores binarios preparados. Los vectores resultantes obtenidos se denominan 2xS-2xD-12069, 2xS-2xD-13033_#159, 2xS-2xD-135_#147, 2xS-2xD-165_#175 y 2xW2-2xD-12069; 2xW2-2xD-13033_#159, 2xW2-2xD-135_#147, 2xW2-2x-165_#175 (Fig. 21-22). Los vectores binarios se transformaron, como se describe, en la remolacha azucarera y las plantas resistentes a los hongos se identificaron mediante un ensayo de resistencia a Cercospora beticola.

Referencias

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Organización solicitante:

Calle: Grimsehlstrasse 31

Ciudad: Einbeck

Región:

País: Alemania

Código postal: D-37555

Teléfono: 0049-5561-311-0

Fax: 0049-5561-311-322

Correo electrónico: info@kws.de

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<110> Nombre de la organización: KWS SAAT AG

Proyecto de la solicitud

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<120> Título: Proteína de resistencia autoactivada

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<130> Referencia del archivo de solicitud: KWS SAAT AG

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<140> Número de solicitud actual:

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<141> Fecha de archivo actual:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

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6

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

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<211> Longitud: 660

Nombre de la secuencia: secuencia 1

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

\newpage

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<400> Cadena pre-secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

7

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

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<211> Longitud: 604

Nombre de la secuencia: secuencia 2

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

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8

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

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<211> Longitud: 580

Nombre de la secuencia: secuencia 3

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

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<212> Tipo: ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<211> Longitud: 2047

Nombre de la secuencia: secuencia 4

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

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11

12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<211> Longitud: 3463

Nombre de la secuencia: secuencia 5

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagccaccaa agaggaccca gaat

\hfill

24

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<212> Tipo: ADN

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<211> Longitud: 24

Nombre de la secuencia: secuencia 6

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttattcagcc atcaaagttg accaataat

\hfill

29

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

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<211> Longitud: 29

Nombre de la secuencia: secuencia 7

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacaattcaa acattgttca aacaaggaac c

\hfill

31

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

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<211> Longitud: 31

Nombre de la secuencia: secuencia 8

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctagccac cagatttgac caaac

\hfill

25

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<211> Longitud: 25

Nombre de la secuencia: secuencia 9

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

13

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

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<211> Longitud: 141

Nombre de la secuencia: secuencia 10

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

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14

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<212> Tipo: ADN

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<211> Longitud: 150

Nombre de la secuencia: secuencia 11

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

15

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> Tipo: ADN

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<211> Longitud: 142

Nombre de la secuencia: secuencia 12

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AVLXDAEXKQ XXXXXLXXWL XDLKDXVYDX DDILDE

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<212> Tipo: PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<211> Longitud: 36

Nombre de la secuencia: secuencia 13

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

IXEIXXKLDD I

\hfill

11

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<212> Tipo: PRT

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<211> Longitud: 11

Nombre de la secuencia: secuencia 14

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

\vskip1.000000\baselineskip

100

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> Tipo: PRT

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<211> Longitud: 99

Nombre de la secuencia: secuencia 15

Descripción de la secuencia:

Secuencia

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<213> Nombre del organismo:

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> Cadena pre-secuencia:

16

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<212> Tipo: ADN

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<211> Longitud: 468

Nombre de la secuencia: secuencia 16

Descripción de la secuencia:

Claims

1. Proteína de resistencia autoactivada para la producción de una resistencia contra patógenos en plantas, caracterizada porque la proteína de resistencia es codificada por un ácido nucleico que presenta una parte limitada de un gen de resistencia NBS-LRR, que se extiende desde el extremo 5' de la zona codificante del gen de resistencia NBS-LRR descendente hasta el inicio del dominio NBS del gen de resistencia NBS-LRR y no comprende ningún bucle P, no siendo el gen de resistencia NBS-LRR un gen de resistencia TIR-NBS-LRR.

2. Proteína de resistencia autoactivada según la reivindicación 1, que presenta una secuencia de aminoácidos con un motivo de secuencia DAE.

3. Proteína de resistencia autoactivada según la reivindicación 1, que presenta una secuencia de aminoácidos con un motivo de secuencia AV LXDAE.

4. Proteína de resistencia autoactivada según la reivindicación 1, caracterizada porque los ácidos nucleicos presentan una secuencia de nucleótidos del grupo siguiente:

a): Secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones astringentes con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 1;

b): Secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 2 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 2 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones astringentes con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 2 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 2;

c): Secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 3 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 3 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones astringentes con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 3 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 3;

d): Secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 4 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 4 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones astringentes con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 4 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 4,

e): Secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 16 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 16 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones astringentes con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 16 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 16.

5. Proteína de resistencia autoactivada según la reivindicación 1, caracterizada porque el gen de resistencia NBS-LRR es un gen de resistencia de remolacha azucarera o patata.

6. Proteína de resistencia autoactivada según la reivindicación 1, que presenta una secuencia de aminoácidos con una secuencia del grupo siguiente:

a): SEC. ID. Nº 13

b): SEC. ID. Nº 14

c): SEC. ID. Nº 15.

7. Planta transgénica con una proteína de resistencia autoactivada según una de las reivindicaciones anteriores.

8. Partes de una planta transgénica según la reivindicación 7.

9. Semilla transgénica o simiente transgénica con una proteína de resistencia autoactivada según una de las reivindicaciones 1 a 6.

10. Procedimiento para la preparación de una planta transgénica con resistencia incrementada contra patógenos, así como de semillas transgénicas o simientes transgénicas de una de tales plantas mediante el uso de ácidos nucleicos, en que los ácidos nucleicos codifican para una proteína de resistencia autoactivada y la parte limitada presenta un gen de resistencia NBS-LRR que se extiende desde el extremo 5' de la zona codificante del gen de resistencia NBS-LRR de forma descendente hasta el inicio del dominio NBS del gen de resistencia NBS-LRR y no comprende ningún bucle P, no siendo el gen de resistencia NBS-LRR un gen de resistencia TIR-NBS-LRR.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para una secuencia de aminoácidos con un motivo de secuencia DAE.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para una secuencia de aminoácidos con un motivo de secuencia AVLXDAE.

13. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico presenta una secuencia de nucleótidos del grupo siguiente:

e): Secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 16 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 16 o una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones astringentes con la secuencia de nucleótidos según SEC. ID. Nº 16 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos SEC. ID. Nº 16.

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14. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el gen de resistencia NBS-LRR se trata de un gen de remolacha azucarera o patata.

15. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para una secuencia de aminoácidos con una secuencia seleccionada del grupo siguiente:

a): SEC. ID. Nº 13

b): SEC. ID. Nº 14

c): SEC. ID. Nº 15.

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16. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque emplea una construcción de ácidos nucleicos con

a): un promotor inducible por patógenos, así como

b): un ácido nucleico que se encuentra bajo el control del promotor según una de las reivindicaciones 10 a 15.

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17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque el promotor inducible por patógenos es un promotor sintético.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque el promotor sintético comprende una o varias de las combinaciones de elementos cis siguientes, representando n y m un número natural de 1...10:

a): una caja nxS-mxD

b): una caja nxW2-mxD

c): una caja nxGst1-mxD.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque la combinación de elementos cis comprende

a): una secuencia de nucleótidos de SEC. ID. Nº 10 o

b): una secuencia de nucleótidos de SEC. ID. Nº 11 o

c): una secuencia de nucleótidos de SEC. ID. Nº 12.