BRPI0613089A2 - proteìna de resistência auto-ativada - Google Patents
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Abstract
PROTEìNA DE RESISTêNCIA AUTO-ATIVADA. A invenção refere-se a um ácido nuclélco, que codifica uma proteína de resistência auto-ativada, para produção de uma resistência em relação a agentes patogênicos em plantas, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico apresenta uma parte limitada de um gene de resistência de NBS-LRR, que se estende do terminal 5' da região codificada do gene de resistência de NBS-LRR, a jusante, até o início do domínio de NBS do gene de resistência de NBS-LRR, sendo que o resistência de NBS-LRR não é um gene de resistência de TIR-NBS-LRR.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNADE RESISTÊNCIA AUTO-ATIVADA".
A presente invenção refere-se a um ácido nucléico, que codificauma proteína de resistência auto-ativada, para produção de uma resistênciaem relação a agentes patogênicos em plantas, ao uso do ácido nucléico pa-ra produção de uma planta transgênica, bem como a plantas transgênicas.
Doenças de plantas provocadas por fungos, vírus, nematóides ebactérias, causam grandes perdas de colheita a nível mundial, prejudicam aqualidade dos produtos de colheita e tornam necessário um uso complexode defensivos químicos, uma vez que as medidas de defesa naturais dasplantas, com ajuda das quais elas se defendem da maioria dos causadoresde doença potenciais ou podem retardar ou limitar a propagação dos mes-mos, freqüentemente não são suficientes. A essas medidas de defesa per-tencem a reação hipersensitiva, a mórte celular controlada do tecido hospe-deiro no local da infecção, o reforço da parede celular vegetal por Iignifica-ção e formação de calos, a formação de fitoalexinas e a produção de proteí-nas de PR (pathogeneses-related). Moléculas-chave para a ativação dasmedidas de defesa induzidas são os genes de resistência (genes R) dasplantas. De acordo com a hipótese de gene por gene de Flohr, a proteína deum gene de R interage com uma proteína correspondente de um gene deavirulência (gene de Avr) microbiano e, com isso, inicia a reação de defesainduzida.
A pluralidade dos genes R pode ser dividida em 5 classes, deacordo com a estrutura das proteínas R codificadas pelos mesmos (Martin etal., 22003). A classe 1 compreende apenas o gene Pto do tomate, que codi-fica uma serina/treonina quinase. A pluralidade dos genes R vegetais, po-rém, pertence à superfamília dos genes de NBS-LRR, que codificam um"nucleotide binding site (NBS) e uma "Leicine rich repet" (LRR). Genes deNBS-LRR, que em seu terminal N apresentam uma estrutura de "coiled coil"(CC), tal como, por exemplo, um "leucine zipper", são associados como ge-nes de CC-NBS-LRR da classe 2. Genes R do tipo CC-NBS-LRR são encon-trados em todos os angiospermas. Na classe 3 incluem-se os genes R dotipo TIR-NBS-LRR, que no terminal N apresentam, em vez de um domínioCC, uma seqüência com homologia à região de TIR animal ("toll-interleukin-1-receptor"). Embora os genes de TIR-NBS-LRR perfaçam 75% dos genesR em Arabidopsis thaliaria, eles não são encontrados, no entanto, nem emgramíneas e nem em beterrabas de açúcar (Tian et al., 2004).
Os genes de Cf do tomate formam a 4ã. classe dos genes R.Proteínas de CF não têm domínios de NBS, mas um domínio de transmem-brana (TM) e um LRR extracelular. A 5-. classe pertence a proteína de Xa21do arroz, que está formado de um domínio de LRR extracelular, um domíniode transmembrana e um domínio de quinase intracelular.
Enquanto os genes R só são exprimidos fracamente pelos pro-motores de gene de R, uma expressão constitutiva, forte, de genes R dasclasses 1, 2 e 3 leva a uma ativação da defesa contra agentes patogênicosdas plantas, mesmo na ausência do produto de gene de avirulência corres-pondente e, desse modo, à auto-ativação da proteína de R (Tange et al.,1999; Oldroyd and Staskawicz, 1988; Bendahmane et al., 2002).
Em geral, porém, a superexpressão constitutiva de genes R emplantas transgênicas está associada a propriedades agronomicamente inde-sejáveis, tais como micronecroses (Tange et al., 1999) ou crescimento pe-queno das plantas (Frost et al., 2004).
Uma outra possibilidade da áuto-âtivação de proteínas R dasclasses 2 e 3 é a mutagênese de motivos de aminoácido especiais, conser-vados, nas proteínas de CC-NBS-LRR ou TIR-NBS-LRR completas. A muta-gênese de seqüências no domínio de NBS ou LRR do gene de Rx da batata(Bendahmane et al., 2002) e no domínio de NBS do gene L6 de Iinho (Ho-wles et al., 2005) leva a mutantes, que na ausência do gene de avirulênciacorrespondente, provocam a morte celular, após expressão transitória.
Experiências de eliminação com o gene de Rx mostraram queprodutos de eliminação, constituídos do domínio de CC e partes do domíniode NBS, também ainda podem causar uma morte celular, depois de sua su-perexpressão transitória, que ocorre mais rapidamente do que no gene de Rde comprimento total. Esses produtos de eliminação necessitam, além dodomínio de CC1 ainda do Ioop de P, da quinase 2 e da quinase 3a completado domínio de NBS. Por outro lado, um encurtamento do domínio de NBSlevou a uma ativação de HR mais lenta, em comparação com o gene de Rde comprimento total (Bendahmane et ah, 2002).
Uma auto-ativação do gene L10 de linho, um gene de R da clas-se 3, pôde ser obtida pela formação de uma proteína de TIR-NBS-LRR en-curtada, que consiste no domínio de TIR e 34 aminoácidos do domínio deNBS adjacente, inclusive o Ioop de P (Frost et al., 2004).
Embora sejam conhecidos diversos métodos da auto-ativaçãode genes R, até o presente ainda não foram descritas quaisquer plantastransgênicas, nas quais a auto-ativação de proteínas R leva a uma maiorresistência a fungos, sem prejudicar, simultaneamente, as propriedades a-gronômicas. Testes para transformar estavelmente duas variantes de com-primento total do gene L6, em cada caso, sob o controle do promotor do ge-ne de resistência de L6 nativo ou um promotor induzido por fungos em linho,levaram ou a plantas de crescimento normal, suscetíveis a fungos, ou aplantas de crescimento pequeno, mais resistentes a fungos (Howles et al.,2005).
É, portanto, tarefa da presente invenção modificar a capacidadede resistência de uma planta em relação a agentes patogênicos de tal modoque as reações de defesa da planta no caso de ataque por agentes patogê-nicos são ativadas com segurança, sem, no entanto, influenciar negativa-mente as propriedades agronômicas da planta.
De acordo com a invenção, a solução da tarefa proposta dá-sepor um ácido nucléico, que apresenta uma parte limitada de um gene de re-sistência de NBS-LRR, que se estende do terminal 5' da região de codifica-ção do gene de resistência de NBS-LRR a jusante^ até o início do domíniode NBS do gene de resistência de NBS-LRR. Um ácido nucléico desse tipopode ser isolado de plantas ou ser produzido sinteticamente.
A parte limitada do gene de resistência de NBS-LRR começa nocódon inicial para a translação (códon de ATG) e chega até o domínio deNBS, que, em princípio está caracterizado pelo loop de P (motivo de quinase1a). Para a função da parte de acordo com a invenção do gene de resistên-cia de NBS-LRR, o Ioop de ρ não pode estar compreendido. Do mesmo mo-do, outras partes dos domínios de NBS e LRR do gene de resistência deNBS-LRR não devem mais estar presentes. No entanto, ainda podem per-manecer nucleotídeos isolados do domínio de NBS, inclusive o Ioop de P,desde que a ativação do HR não seja prejudicada pelos mesmos.
Por uma proteína de resistência auto-ativada é entendida umaproteína que, na ausência de um produto de gene de avirulência correspon-dente, leva a uma ativação da defesa contra agentes patogênicos dás plan-tas. Nesse sentido, a invenção tem a vantagem de que, para formação deuma resistência em relação a agentes patogênicos não é necessária ne-nhuma interação entre uma proteína de resistência e uma proteína de aviru-lência, com o que as reações de defesa da planta podem desenrolar-se demodo substancialmente mais direto e, em última análise, mais seguro.
Uma auto-ativação pode ser obtida, por exemplo, por uma su-perexpressão transitória do gene de resistência. Superexpressão significaque a intensidade de expressão do promotor de gene de R natural é excedi-da até o ponto em que a cascata de transdução de sinais, regulada pela pro-teína de R, na ausência do produto de gene de avirulência microbiana, éativada. Com isso, ocorre a ativação da defesa contra agentes patogênicos,que resulta em uma resistência parcial ou total contra doenças.
Uma auto-ativação da proteína de resistência também pode, noentanto, ser obtida por encurtamento dos comprimentos totais dos genes RBvKWS3-165, BvKWS3-135, Bv13033 e Bv12069 da beterraba de açúcar,bem como do gene StR3a da batata para a região 5', que só codifica o ter-minal N livre dos domínios NBS e LRR das proteínas, inclusive um domíniode CC eventual. Terminal N livre do domínio de NBS significa, no presentecontexto, que o terminal 5 da região codificada do gene de resistência deNBS-LRR só se estendem em direção ao terminal 3' até um ponto em que oloop de P do gene de resistência de NBS-LRR não está compreendido emsua estrutura eficaz. Em um caso simples, o Ioop de P está totalmente elimi-nado. Mas, também podem permanecer nucleotídeos isolados do Ioop de Pem genes de resistência encurtados, desde que o mesmo não seja retarda-do pela ativação do HR. Com o encurtamento do gene de resistência deNBS-LRR para o terminal N, também os motivos de quinase-2, quinase-3,GLPC e MHD são eliminados, inclusive os aminoácidos flanqueadores, deacordo com as informações dos bancos de dados Prosite (Bairoch et al.,1996) e Pfam (Sonnhammer et al., 1997), bem como nas definições de moti-vos dadas em Bandahmane et al. (2002).
O uso dos genes R encurtados 165_#176, 135_#147,13033_#159 e Bv12069 e StR3a-#1-155 leva a uma ativação mais rápida,em comparação com os genes R de comprimento total, de morte celular notecido das plantas. Em combinação com um promotor indutível por agentespatogênicos, pode ser produzida, desse modo, uma defesa contra agentespatogênicos induzida, aperfeiçoada. Isso também vale para as proteínas Rque não podem ser auto-ativadas por mutações nos domínios de MHD ouVHD, tal como mostra a expressão dos genes 135_#147 e BvKWS3_135-D480V.
Como o gene de R encurtado, em comparação com genes R decomprimento total, estão em condições de provocar morte celular nitidamen-te mais cedo, para os genes R encurtados é suficiente uma expressão me-nor, para obter uma concentração de proteínas crítica para a defesa contraagentes patogênicos, tal como é mostrado para o gene de R 135_#147.
O Ioop P ou o motivo de quinase-1a, junto com o motivo de qui-nase-2 e quinase-3, é característico para as proteínas que hidrolisam ATPou GTP (Traut, 1994) e encontra-se no domínio de NBS de genes de NBS-LRR. O Ioop de P caracterizada a região terminal N do domínio de NBS(Bendahmane et al., 2002). A seqüência de consenso do Ioop de P para osgenes R Prf, Rx, Rpm1, BvKWS3_135, BvKWS3_133 e BvKWS3_165 é:(l/V)VG(M/l)GG(L/l/S)GKTT(L/V).
Surpreendentemente, constatou-se que é possível uma auto-ativação particularmente boa com ácidos nucléicos, que codificam uma se-qüência de aminoácido, com um motivo de seqüência DAE. Os ácidos nu-cléicos codificam, particularmente, o motivo de seqüência AVLXDAE. Osmotivos de seqüência DAE e AVLXDAE encontram-se, por exemplo, nasSEQ ID NOS: 13e15.
Seqüências de ácido nucléico preferidas são aquelas do seguin-te grupo:
a) seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 1 ouuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo deacordo com SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência de nucleotídeo que se hibridi-za com a seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 1 ou comuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo deacordo com SEQ ID NO: 1;
b) seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 2 ouuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo deacordo com SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência de nucleotídeo que se hibridi-za com a seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 2 ou comuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo deacordo com SEQ ID NO: 2;
c) seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 3 ouuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo deacordo com SEQ ID NO: 3 ou uma seqüência de nucleotídeo que se hibridi-za com a seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 3 ou comuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo deacordo com SEQ ID NO: 3;
d) seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 4 ouuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo deacordo com SEQ ID NO: 4 ou uma seqüência de nucleotídeo que se hibridi-za com a seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 4 ou comuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo deacordo com SEQ ID NO: 4;
e) seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 16 ouuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo deacordo com SEQ ID NO: 16 ou uma seqüência de nucleotídeo que se hibri-diza com a seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 16 ou comuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo deacordo com SEQ ID ND: 16.
Nas seqüências de nucleotídeo preferidas, a parte limitada dogene de resistência de NBS-LRR estende-se tal como se segue:
SEQ ID NO: 1 da pos. 124-654
SEQ ID NO: 2 da pos. 155-598
SEQ ID NO: 3 da pos. 94-573
SEQ ID NO: 4 da pos. 194-694
O termo "hibridizar-se" aqui utilizado, significa hibridizar-se sobcondições usuais, tais como estão descritas em Sambrook et al. (1989), depreferência, sob condições rigorosas. Condições de hibridização rigorosassão, por exemplo: hibridizar-se em 4 χ SSC1 a 65°C, e subseqüente lavagemrepetida em 0,1 χ SSC, a 65°C, por, no total, cerca de 1 hora. Condições dehibridização pouco rigorosas são, por exemplo: hibridizar-se em 4 χ SSC, a37°C, e subseqüente lavagem repetida em 0,1 χ SSC, à temperatura ambi-ente. "Condições de hibridização rigorosas" também pode significar: hibridi-zar-se a 68°C em 0,25 M de fosfato de sódio, pH 7,2, 7% de SDS, 1 mM deEDTA e 1 % de BSA por 16 horas e subseqüente lavagem por duas vezescom 2 χ SSC e 0,1 % de SDS, a 68°C.
De modo preferido, o gene de resistência que codifica uma pro-teína de resistência auto-ativada origina-se da beterraba de açúcar ou dabatata.
Em outro modo preferido, o ácido nucléico de acordo com a in-venção codifica uma seqüência de aminoácido com uma das seqüências deconsenso de acordo com SEQ ID NOS: 13 a 15. Dentro das seqüências deconsenso, aminoácidos funcionalmente de valor igual podem ser trocadosuns pelos outros, por exemplo, Asp por Glu, Leu por lie, Ala por Vai, Arg porLys, Phe por Trp.
As duas seqüências de consenso de acordo com SEQ ID NOS:13 e 14 representam dois blocos funcionais, que podem encontrar-se a umadistância não fixada um do outro. Uma distância preferida entre os dois blo-cos resulta da seqüência de consenso de acordo com SEQ ID NO: 15, bemcomo da seqüência de consenso de acordo com a figura 10.
O ácido nucléico de acordo com a invenção pode ser combina-da, de preferência, com um promotor indutível por agente patogênico. Umpromotor indutível por agente patogênico é ativado em reação à infecção dotecido hospedeiro por um causador de doença, por exemplo, um fungo noci-vo, uma bactéria, um vírus ou um nematóide. O promotor indutível por agen-te patogênico é mais ativo durante a infecção tentada ou bem-sucedida dotecido vegetal do que no tecido vegetal não infectado.
Promotores indutíveis por agentes patogênicos são, em princí-pio, conhecidos do técnico. Exemplos de promotores indutíveis por agentespatogênicos são um promotor de quitinase (Samac and Shah, 1991), umpromotor de glucanase (Hennig et ai:, 1993) e o promotor de prp-1 (Martini etal., 1993).
Pela superexpressão induzida por agentes patogênicos do genede R são evitadas conseqüências negativas de uma expressão constitutiva,tal como, por exemplo, crescimento pequeno ou produtividade reduzida dasplantas.
Como promotores particularmente apropriados mostraram-sepromotores sintéticos. Nesse caso, trata-se de promotores produzidos portécnicas de trabalho biológicas moleculares, que nessa modalidade não sãoencontrados na natureza. Um promotor sintético é um promotor minimalista,que, além de um promotor mínimo só contém ainda um ou mais elementoseis definidos, escolhidos. Esses elementos eis são pontos de ligação paraproteínas de ligação de DNA, como fatores de transcrição e são isolados depromotores naturais, derivados de elementos eis já isolados ou produzidospor técnicas de recombinação orientadas ao acaso e escolhidos por proces-sos apropriados. Em comparação com um promotor natural, um promotorsintético, devido à sua estrutura menos complexa, só é ativado por poucosfatores exógenos e endógenos e, desse modo, regulados especificamente.
O promotor mínimo ou promotor de "core" [núcleo] é uma se-qüência de ácido nucléico, que contém os pontos de ligação para o comple-xo do fator de transcrição basal e possibilita a iniciação precisa da transcri-ção pela polimerase Il de RNA. Motivos de seqüência característicos dopromotor mínimo são o box de TATA, o elemento iniciador (Inr)1 o "TFBII re-cognition elemento" (BRE) e o "downstream core promoter element" (DPE).Esses elementos podem ocorrer no promotor mínimo isoladamente ou emcombinação. O promotor mínimo ou seus motivos de seqüência são obtení-veis de um gene vegetal ou viral.
No contexto da presente invenção foram desenvolvidos novospromotores sintéticos, que mesmo em combinação de genes de resistênciaconhecidos, que não forçosamente codificam uma proteína de resistênciaauto-ativada, podem ser usados para produção de uma planta resistente aagentes patogênicos. Nesse caso, trata-se de promotores do tipo de promo-tor mínimo de nxS-mxD e promotor mínimo de nxGstl-mxD, de modo que opromotor sintético compreende uma ou mais das seguintes combinações deelementos eis:
a) um box de nxS-mxD
b) um box de nxW2-mxD
c) um box de nxGst1-mxD(sendo que nem significam um número natural de 1 ...10).
O box de S (CAGCCACCAAAGAGGACCCAGAAT), com a se-qüência de nucleotídeo DA SEQ ID NO: 6, o box de W2 (TTATTCAGCCAT-CAAACTTGACCAATAAT), com a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO:7, o box de D (TACAATTCAAACATTGTTCAAACAAGGAACC), com a se-qüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 8 e o box de Gst (TTCTAGCCAC-CAGATTTGACCAAAC), com a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 9são descritos em Rushton et al., 2000, inclusive as conseqüências das se-qüências de núcleo importantes para a função das mesmas.
Os promotores diferenciam-se de acordo com a escolha de ele-mentos (nxS-mxD, nxW2-mxD ou nxGst1-mxD) em sua atividade básica,indutibilidade por agentes patogênicos, cinética de ativação e força dos pro-motores, tal como é mostrado, por exemplo, para promotores com as combi-nações de elementos eis 2xS-2xD, com a seqüência de nucleotídeo da SEQID NO: 10, 2xW2-2xD, com a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 11 e2xGst1-2xD, com seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 12. As proprie-dades de um promotor sintético, além disso, podem ser modificadas pelamodificação do número dos elementos eis (n,m=1...10) de acordo com asnecessidades da expressão de gene. A comparação do promotor 2xS-2xDcom as variantes 2xS-4xD, 4sS-2xD e 4xS-4xD mostra que a força do pro-motor média é aumentada pelo uso de tetrâmeros, em comparação com opromotor formado por dímeros. Além disso, a indutibilidade por agentes pa-togênicos aumenta do promotor de dímero-dímero (2xS-2xD), através dospromotores de tetrâmero-dímero e dímero-tetrâmero (4xS-2xD, 4xS-2xD)para o promotor de tetrâmero-tetrâmero (4xS-4xD), em todos os pontos detempo de medição. Paralelamente ao aumento da força do promotor e daindutibilidade por agentes patogênicos, no caso do exemplo descrito, tam-bém ocorre um aumento da atividade básica dos promotores que contêmtetrâmeros. Esse exemplo mostra que propriedades de promotor importantessão reguladas pelo número dos elementos eis e variantes de promotor óti-mas podem ser criadas e identificadas para a respectiva conversão técnica.
Mas, resultados correspondentes também podem ser obtidoscom combinações de elementos eis, que representam derivados da seqüên-cia de nucleotídeo da SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 edispões de propriedades comparáveis à combinação de elementos eis daSEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.
Os promotores do promotor mínimo 2xS-=2xD ou promotor mí-nimo 2xW2-2xD foram combinados, exemplificadamente, em cada caso, comos genes R de comprimento total BvKWS3-133, BvKWS3-123, BvKWS3_135 eBvKWS3_165 e transformados em beterrabas de açúcar. Um teste de resis-tência a fungos das plantas transgênicas com o fungo nocivo mais importan-te da beterraba de açúcar, Cercospora beticola, o causador da doença deferrugem das folhas, levou em cada construto a uma resistência a fungosaperfeiçoada, sendo que a planta transgênica não se diferencia em seucrescimento ou outras propriedades agronômicas das plantas não transgêni-cas. Esses resultados mostram que sob uso do promotor indutível por agen-tes patogênicos é possível, em princípio, obter uma superexpressão do genede R que causa a morte celular e, com isso, uma resistência à doença aper-.feiçoada, sem que se dê uma influência negativa sobre o desenvolvimentodas plantas. Pelo uso de promotores otimizados por escolha do número maisfavorável de repetições de elementos eis, a resistência a doenças ainda po-de ser aperfeiçoada adicionalmente.
A presente invenção também se refere a plantas transgênicas,que foram transformadas com o novo construto de ácido nucléico, particu-larmente, plantas de beterrabas de açúcar, partes, bem como sementes oumaterial de semente dessas plantas, bem como o uso do novo construto deácido nucléico para produção de uma planta transgênica.
A invenção é explicada a seguir, mais detalhadamente e comreferência às figuras e exemplos.
A invenção descrita exemplificadamente para beterrabas de a-çúcar pode ser transferida, sem problemas, a outras plantas economicamen-te úteis, das quais podem ser isolados genes de resistência.
FIGURAS
A figura 1 mostra a carta do vetor binário pER-35Sluci, que foiusado para a expressão transitória, mediada para o Agrobacterium tumefa-ciens, de genes R em folhas de beterraba sacarina. O vetor contém um genede Iuciferase interrompido por um intron de Photinus pyralis, que não podeser exprimido em A. Tumefaciens.
Figura 2 mostra a ativação de morte celular em folhas de beter-raba sacarina após a expressar transitória dos genes R BvKWS3_133 emAgrobacterium tumefaciens. Enquanto a expressão transitória do construtopER-35Sluci leva a uma forte atividade do gene transmissor nas folhas debeterraba sacarina, causa a morte celular, após a expressão do construtopER133-Sluci, de modo que não pode ser medida nenhuma atividade degene transmissor.
A figura 3 mostra o vetor pCaMV-2, que foi usado para a trans-formação transitória, biolística, das folhas de beterraba sacarina. Os genes Rde comprimento total e encurtados, tal como descrito, foram postos sob ocontrole do promotor 35S dupla desse vetor.A figura 4 mostra a ativação de morte celular em folhas de beter-raba sacarina após a expressão transitória dos genes R BvKWS3-123,BvKWS3_133 e BvKWS3_165 por transformação biolística. Os genesBvKWS3-123, BvKWS3_133 e BvKWS3_165 encontram-se sob o controledo promotor de 35S duplo (d35S) e foram co-transformados com o construtodo gene transmissor p70S-luc. A atividade do gene transmissor foi medida20 h após a transformação. Pela ativação de uma reação hipersensível, aatividade do gene transmissor está reduzida em comparação com o controle(vetor vazio pCaMV-2 e p70S-luc). Está representado o valor médio de 3repetições de teste independentes com, em cada caso, 9 testes individuaispor construto. A barra de erros indica o erro padrão.
A figura 5 mostra uma ativação de morte celular intensificadapela expressão da região terminal 5' do gene de R BvKWS3_165, em com-paração com a expressão do gene de R de comprimento total BvKWS3_165.A região terminal Neo gene de R de comprimento total foram co-transformados sob o controle do promotor de d35S (p70S-165_#175 e p70S-BvKWS3_165) com o construto p70S-luc por transformação biolística emfolhas de beterraba sacarina. Está representado o valor médio de 3 repeti-ções de teste independentes com, em cada caso, 9-12 testes individuais porconstruto.
A figura 6 mostra uma ativação de morte celular do gene de RBvKWS3_135, e uma ativação de morte celular intensificada em compara-ção a isso, com a expressão da região terminal 135_#147 do gene de RBvKWS3_135. O gene de R de comprimento total e da região terminal135_#147 foram co-transformados sob o controle do promotor de d35S(p70S-BvKWS3_135 e p70S-135_#147) com o construto p70S-luc por trans-formação biolítica em folhas de beterraba sacarina. Está representado o va-lor médio de 2 repetições de teste independentes com, em cada caso, 9-12testes individuais por construto.
A figura 7 mostra uma ativação de morte celular intensificadapela expressão da região terminal 5' do gene de R 13033, em comparaçãocom a expressão do gene de R de comprimento total Bv13033. O gene de Rde comprimento total e a região terminal N 13033_#159 foram co-transformados sob o controle do promotor de d35S (p70S-13033 e p70S-13033_159) com o construto p70S-luc por transformação biolística em folhasde beterraba sacarina. Está representado o valor médio de 2 repetições deteste independentes com, em cada caso, 9-12 testes individuais por construto.
A figura 8 mostra a ativação de morte celular pela expressão dogene de R Bv12069.
A figura 9 mostra a auto-ativação da proteína BvKWS3_135 porencurtamento para a região 5' do clone de cDNA 135_#147, em comparaçãocom a mutação do motivo de BHD do domínio de NBS.
As figuras 10a)-c) mostram comparações das seqüências deaminoácido das proteínas auto-ativas, encurtadas, Bv12069, Bv13033_#159,BvKWSI 35_#147, BvkWS3_165_#175 e StR3a-#10155 umas com as ou-tras, bem como com seqüências comparativas de proteínas de resistênciaencurtadas, não auto-ativas, de batata (RX-160) e StR1 (355-540), bem co-mo proteínas R completas do tipo NBS-LRR de Arabidopsis thaliana (A-tAB028617), feijão (PvulgarisJ71), arroz (OsativaAP003073), soja (Gmax-KR4) e do tomate (Tomato-l2). São destacas seqüências de consenso.
A figura 11 mostra que a eliminação dos aminoácidos 147-175reduz nitidamente a auto-atividade da proteína 165_#175.
A figura 12 mostra a ativação do promotor sintético 2xS-2xD embeterrabas de açúcar transgênicas após ataque por Cercospora beticola.
A figura 13 mostra a ativação do motor sintético 2xW2-2xD embeterrabas de açúcar transgênicas após ataque por Cercospora beticola.
A figura 14 mostra a comparação da atividade de gene transmis-sor dos promotores 2xS-2xD, 4xS-2xD, 2xS-4xD e 4xS-4xD em beterrabasde açúcar transgênicas após ataque por Cercospora beticola.
A figura 15 e 16 mostra combinações dos genes R de compri-mento total 123, 133, 135,165 com o promotor sintético 2xS-2xD.
A figura 17 e 18 mostra combinações dos genes R de compri-mento total 123, 133, 135, 165 com o promotor sintético 2xW2-2xD.A figura 19 mostra o aumento de resistência da linha de beterra-ba de açúcar transgênica PR68-6 em relação ao fungo nocivo Cercosporabeticola, em comparação com o controle não transgênico 3DC4156.
A figura 20 mostra o aumento de resistência da linha de beterra-ba de açúcar transgênica PR70-32 em relação ao fungo nocivo Cercosporabeticola, em comparação com o controle não transgênico 3DC4156.
As figuras 21 e 22 mostram a combinação das regiões de termi-nal N dos genes R 165_#176 e 12069 com os promotores sintéticos 2xS-2xDe 2xW2-2xD.
EXEMPLOS
Comprovação da ativação de uma reação de resistência rá-pida em folhas de beterraba sacarina por superexpressão do geneBvKWS3 133
A superexpressão transitória do clone de cDNA de comprimentototal do gene BvKWS3_133 em folhas de beterraba sacarina por Agrobacte-rium tumefaciens, desencadeia uma rápida morte celular, sem formação denecrose visível. O clone de cdNA de BvkWS3_133 foi combinado com opromotor de d35S e inserido no vetor binário pER-35Sluci (Fgi. 1). O vetorresultante leva a designação pER133-35Sluci. Os vetores pER-35Sluci epER133-35Sluci são transformados na linhagem Agrobaeterium c58c1 (EM1987). Agrobactérias positivas foram cultivadas para a expressão transitóriaem 50 ml de meio de LB com 100 mg/ml de espectinomicina e 20 μΜ de a-cetossiringona por 4-5 h. Subseqüentemente, as bactéricas foram removidaspor centrifugação e o sedimento foi incorporado em uma solução de 10 mMde MgCI2, 10 mM de MÊS, 100 μΜ de acetosringona e foi ajustada umadensidade de bactérias de OD6oo=0,1. A suspensão de bactérias foi deixadaem repouso por 2-3 h e, depois, com ajuda de uma seringa de 2,5 ml, injeta-da sobre as folhas através do lado inferior da folha de beterrabas de açúcarcom 10 semanas de idade. Depois da incubação a 25°C em uma estufa decultura, no dia 1, 2 e 3 após a inoculação, foi medida a atividade do genetransmissor de Iuciferase de Photinus pyralis nas folhas transformadas. Paraisso, foi determinada a atividade de Iuciferase com o Luciferase Assay Sys-tem (Promega, Mannheim1 Alemanha) em um luminômetro Sirius (BertholdDetection System GmbH, Pforzheim, Alemanha), de acordo com as instru-ções do fabricante. Para a obtenção de um extrato de enzima apropriadopara a medição, foram estampados por ponto de medição, em cada caso,dois discos de folha por construto foram retirados 8 pontos de medição pordia de medição. As amostras de folhas são homogeneizadas sob adição deareia marinha com 10 vezes o volume (v/w) em Passive Lysis Buffer (PLB)em um pilão. A parte sobrenadante líquida foi transferida para um recipientede Eppendorf de 1,5 ml e centrifugado por 5 min a 4°C e 20 000 g. A partesobrenandante transparente foi retirada e usados, em cada caso, 10 μΙ deextrato bruto para a medição de atividade de Iuciferase de Photinus. Folhasde beterraba sacarina, que foram transformadas com um cosntruto de con-trole pER-35 Slucl, mostraram no dia 1 uma atividade de Iuciferase pequenae nos dias 2 e 3, uma atividade de Iuciferase de 124.000 ou 116.000 R-LU/mg de tecido foliar. Folhas de beterraba, que foram transformadas com oconstruto pER133-35Sluci, mostraram em todos os 3 momentos de mediçãonenhuma atividade que era maior do que a das folhas inoculadas com MgCI2(fig. 2). Com isso, a expressão transitória do clone de cDNA BvKWS3-133provoca uma morte celular muito rápida nas folhas de beterraba inoculadas.
A expressão constitutiva dos genes R BvkWS3_123,BvkWS3_133 e BvKWS3_165 provoca uma morte celular em folhas debeterraba sacarina
O gene de R BvKWS3_133, bem como o gene de RBvKWS3_165, com a seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO:5 e o gene de R BvKWS3_123 foram combinados com o promotor duplo 35Sdo vetor pCaMV-2 (Fig. 3). Os vetores formados levam a designação p70S-BvKWS3_133, p70S-BvKWS3_165 e p70S-BvKWS3_123. Para testar a fun-cionalidade dos genes R, os construtos p70S-BvKWS3_133, p70S-BvKWS3_165 e p70S-BvKWS3_123 foram exprimidos transitoriamente como vetor do gene transmissor p70S-luc em folhas de beterraba sacarina portransformação biológica de acordo com Schmidt et al., 2004. Como controlepositivo, foi usado o vetor vazio pCaMV-2, em combinação com o vetor degene transmissor p70S-luc. Foi dispensado o uso de um vetor de normaliza-ção, de modo divergente de Schmidt et al. (2004). A atividade de Iuciferasefoi determinada com o Luciferase Assay System (Promega, Mannheim, Ale-manha), 20 h depois da transformação. Os testes de transformação foramrepetidos três vezes, sendo que cada teste compreendeu 9 repetições deteste por construto. A formação do valor médio dos 3 testes mostrou que, emcomparação com a atividade equipada em 100% do controle positivo (emptyvector), a atividade do gene transmissor em p70S-BvKWS3_133 só perfez37,7%, em p70S-BvKWS3_165, só 66% e em p70S-BvKWS3_123, só 68,7%(fig. 4). A forte expressão dos genes BvKWS3_133, BvKWS3_165 eBvKWS3_123 pelo promotor d35S provoca, desse modo, a morte celular ouuma reação hipersensível em uma parte das células transformadas, que im-pede uma co-expressão do vetor do gene transmissor transformado conjun-tamente. Com isso, foi mostrado que a forte expressão dos três genes R Ie-va a uma morte celular ou a uma HR na ausência de um produto de gene deavirulência correspondente.
A região 5' do gene BvkWS3_165 provoca uma morte celularmais rápida do que o clone de cDNA completo BvKWS3_165
Partindo do clone de cDNA de comprimento total BvKWS_165,com a seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 5, no construtop70S-BvKWS3_165, a região 5' do gene foi amplificada com ajuda da poli-merase de Pfu (esratagene), sob uso dos iniciadores S316 (CTCGAGA-ATTCGAGCTCCACCGCGG) e S318 (CTGGATCCTCACCTCCGTTCTT-CATGTTGCTCTACC) e, simultaneamente, foi introduzido um stop-códon naregião codificada. A região amplificada corresponde à seqüência de nucleo-tídeo de acordo com SEQ ID NO: 1 e codifica a seqüência de aminoácido 1-175 de BvKWS3_165. A seqüência de aminoácido compreende apenas aregião terminal de N de BvKWS3_165 e não contém nenhum domínio deNBS e nenhum domínio de LRR (fig. 10). O produto de PCR foi cortado comas enzimas de restrição Sacll e BamHI e clonado no vetor pCaMV-2. O vetorresultante traz a designação p70S-165_#175. A aptidão dos construtosp70S-BvKWS3_165 e p70S-165_#175 de provocar uma morte celular emfolhas de beterraba sacarina foi testada quantitativamente por transforma-ções biolísticas transitórias. Para esse fim, cada vetor foi co-transformadocom o vetor do gene transmissor p70S-luc. Como controle positivo, foi usadoo vetor vazio pCaMV-2, em combinação com o vetor do gene transmissorp70S-luc. Em comparação com transformação do vetor vazio (pCaMV-2), atransformação de p70S-BvKWS3_165 leva a 65% de atividade mensuráveldo gene transmissor e a transformação de p70S-165_#175, apenas a 38%de atividade mensurável do gene transmissor (fig. 5). Esse resultado mostraque a expressão exclusiva do terminal N com tamanho de 175 aminoácidosde 165_#175 leva a uma ativação mais intensa de morte celular nas folhasde beterraba sacarina transformadas, do que o uso da proteína de compri-mento total com tamanho de 1066 aminoácidos BvKWS3_165. Pela expres-são de 165_#175, morrem mais células foliares transformadas do que nocaso da expressão de BvKWS3_165. A causa dessa diferença é uma formanova, mas intensa da auto-ativação da proteína de R, por um encurtamentoao terminal N.
A região 5' do gene BvkWS3_135 provoca uma morte celularmais rápida do que o clone de cDNA completo BvKWS3_135
Partindo do clone de cDNA de comprimento total BvKWS_135no construto p70S-BvKWS3_135, a região 5' do gene foi amplificada comajuda da polimerase de Pfu (esratagene), sob uso dos iniciadores S316(CTCGAGAATTCGAGCTCCACCGCGG) e S330 (CTGGATCCTCAGGGA-GAACTCCATCTGGGTGGTCC) e, simultaneamente, foi introduzido um có-don de parada na região codificada. A região amplificada corresponde à se-qüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 2 e codifica a seqüênciade aminoácido 1-147 de BvKWS3_135. A seqüência de aminoácido compre-ende apenas a região terminal de N de BvKWS3_135 e não contém nenhumdomínio de NBS e nenhum domínio de LRR ou motivos desses domínios. Oproduto de PCR foi cortado com as enzimas de restrição Sacll e BamHI eclonado no vetor pCaMV-2. O vetor resultante traz a designação p70S-135_#147. A aptidão dos construtos p70S-BvKWS3_135 e p70S-135_#147de provocar uma morte celular em folhas de beterraba sacarina foi testadaquantitativamente por transformações biolísticas transitórias. Para esse fim,cada vetor foi co-transformado com o vetor do gene transmissor p70S-luc.Como controle positivo, foi usado o vetor vazio pCaMV-2, em combinaçãocom o vetor do gene transmissor p70S-luc. Em comparação com a transfor-mação do vetor vazio (pCaMV-2), a transformação de p70S-BvKWS3_135leva a 74,5% de atividade mensurável do gene transmissor e a transforma-ção de p70S-135_#147, apenas a 58,5% de atividade mensurável do genetransmissor (fig. 6). Os resultados mostram que a expressão do clone decomprimento total BvKWS3_135leva à ativação de morte celular no tecidotransformado. No entanto, a expressão exclusiva do terminal N, com tama-nho de 175 aminoácidos, de 135_#147 causa uma morte celular mais inten-sa nas folhas de beterraba sacarina transformadas, do que o uso da proteínade comprimento total com tamanho de 844 aminoácidos BvKWS3_135. Pelaexpressão de 135_#147, morrem mais células foliares transformadas do queno caso da expressão de BvKWS3_135. A causa dessa diferença é umaforma nova, mais intensa da auto-ativação da proteína de R, por um encur-tamento ao terminal N.
A região 5' do gene Bv13033 provoca uma morte celularmais rápida do que o clone de cDNA completo Bv13033
Partindo do clone de cDNA de comprimento total Bv13033 noconstruto p70S-13033, a região 5' do gene foi amplificada com ajuda da po-Iimerase de Pfu (esratagene), sob uso dos iniciadores S316 (CTCGAGA-ATTCGAGCTCCACCGCGG) e S333 (CTGGATCCTCAAGAACAAGTCT-CAGGCCTTCTGTT) e, simultaneamente, foi introduzido um códon de para-da na região codificada. A região amplificada corresponde à seqüência denucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 3 e codifica a seqüência de aminoá-cido 1 -159 de Bv13033. A seqüência de aminoácido compreende apenas aregião terminal de N de Bv13033 e não contém nenhum domínio de NBS enenhum domínio de LRR ou motivos desses domínios. O produto de PCR foicortado com as enzimas de restrição Sacll e BamHI e clonado no vetorpCaMV-2. O vetor resultante traz a designação p70S-13033_#159. A aptidãodos construtos p70S-13033 e p70S-13033_#159 de provocar uma morte ce-lular em folhas de beterraba sacarina foi testada quantitativamente por trans-formações biolísticas transitórias. Para esse fim, cada vetor foi co-transfor-mado com o vetor do gene transmissor p70S-luc. Como controle positivo, foiusado o vetor vazio pCaMV-2. Em comparação com a transformação do ve-tor vazio (pCaMV-2), a transformação de p70S-13033 leva a 95% de ativida-de mensurável do gene transmissor e a transformação de p70S-165_#175,apenas a 68% de atividade mensurável do gene transmissor (fig. 7). Essesresultados mostram que a expressão do clone de comprimento totalBv13033 só leva à ativação de uma morte celular fraca no tecido transfor-mado. A expressão exclusiva do terminal N, com tamanho de 159 aminoáci-dos, de 13033_#159 causa, por outro lado, uma morte celular mais intensanas folhas de beterraba sacarina transformadas. A causa dessa diferença éuma forma nova, mais intensa da auto-ativação da proteína de R, por umencurtamento ao terminal N.
Ativação de morte celular em folhas de beterraba sacarinapela região 5' do gene Bv12069
O gene de R Bv12069, com a seqüência de nucleotídeo de a-cordo com SEQ ID NO: 4, codifica o terminal N, com tamanho de 166 ami-noácidos, de uma proteína de R. A proteína Bv12069 não contém nenhumdomínio de NBS e nenhum domínio de LRR, mas mostra uma nítida homo-logia com os terminais N com tamanho de 175, 147 e 159 aminoácidos dasproteínas auto-ativadas 165_#175, 135_#147, 13033_#159 (fig. 10). O clonede cDNA foi combinado com o promotor de 35S duplo do vetor pCaMV-2(fig. 3) para o vetor p70S-12069. Para testar a funcionalidade do geneBv12069, o construto p70S-12069 foi exprimido por transformação biolísticatransitória em folhas de beterraba sacarina, em combinação com o vetor degene transmissor p70S-luc. A atividade do gene transmissor nas folhastransformadas com p70S-12069 e p70S-luc perfez em três testes indepen-dentes apenas 51% da atividade, que pôde ser medida no controle positivo(vetor vazio pCaMV-2 e p70S-luc) (fig. 8). A expressão da proteína Bv12069com tamanho de 166 aminoácidos provoca, portanto, uma morte celular emcélulas de beterraba de açúcar.O encurtamento do gene BvKWS3_135 leva a uma proteínade R auto-ativada, mas não a mutagênese dos domínios de MHD
O mecanismo de acordo com a invenção da auto-ativação porencurtamento de uma proteína de R do tipo de NBS-LRR no terminal N livrede NBS e LRR foi comparado com o método da auto-ativação por mutagê-nese do motivo de MHD. A mutagênese do motivo de MHD do gene de Rxda batata e do gene L6 de linha levou a uma auto-ativação dos genes cita-dos (Bendahmane et al., 2002; Howles et al., 2005). O clone de cDNABvKWS3_135 codifica o motivo de VHD, correspondente ao motivo de MHD,um motivo que, além do motivo de MHD, freqüentemente é encontrado emgenes R (Howles et al., 2005). A mutação correspondente foi introduzida noclone de comprimento total BvKWS3_135, tal como descrito por Bendahma-ne et al. (2002). Para esse fim, o aminoácido aspartato no motivo de VHD dogene BvKWS3_135 foi trocado pelo aminoácido valina. O gene formado traza designação BvKWS3_135_D480V. A eficiência dos genes 135_#147,BvKWS3_135_D480V e do gene BvKWS3_135 não modificado foi testadapor superexpressão transitória, mediada por Agrobacterium tumefaciens emfolhas de beterraba sacarina. Para esse fim, o clone de cDNA BvKWS3_135foi combinado com o promotor de d35S e inserido no vator binário pER-35Sluci. O vetor formado traz a designação pER135-35Sluci. Procedeu-sede modo correspondente com o clone de cDNA 135_#147, com a seqüênciade nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 2, bem como com o clone decDNA BvKWS3_135_D480V mutageneizado. Os vetores formados trazem adesignação pER135_#147-35Sluci e pER135_D480V-35Sluci. Os vetoresforam transformados, tal como descrito, na linhagem de AgrobacteriumC58C1 e injetados em folhas de beterraba sacarina, junto com o controlepositivo pER-35Sluci. A atividade do gene transmissor de Iuciferase de Pho-tinus pyralis foi medida 1, 2 e 3 dias depois da inoculação nas folhas trans-formadas. Folhas de beterraba sacarina, que foram transformadas com oconstruto de controle pER-35Sluci, mostraram no 19 dia uma atividade deluciferase pequena e no 2e e no 3e dia, uma atividade de Iuciferase de299.000 e 433.000 RLU/mg de tecido foliar. Folhas de beterraba, que foramtransformadas com o construto pER135-35Sluci, mostraram no 2- e no 3Q diauma atividade de Iuciferase de 190.000 e 245.000 RLU/mg de tecido foliar e,com isso, em comparação com o controle positivo pER-35Sluci uma mortecelular mensurável. A atividade do gene transmissor do construtopER_135_D480V-35Sluci perfez no 2e e no 35 dia 188.000 e 206.000 R-LU/mg (fig. 9.). Desse modo, a introdução da mutação de MHD no geneBvKWS3_135 não levou a nenhuma auto-ativação ou a uma auto-ativaçãopraticamente não mensurável. O gene de R 135_#147, encurtado de acordocom esse processo, por sua vez, mostrou no 2- e 3Q dia uma atividade degene transmissor de 90.000 e 63.000 RLU/mg (fig. 9) e, com isso, uma ati-vação de morte celular e auto-ativação mais forte do que os construtospER135-35Sluci e pER_135_D480V-35Sluci; Identificação de motivos deaminoácidos comuns nos terminais N das proteínas R de BvKWS3_165,BvkWS3_135, Bv13033 e Bv12069 e StR3a
Uma comparação de homologia entre os terminais N com tama-nho de 175, 147, 159 e 166 aminoácidos, das proteínas R BvKWS3_165,BvkWS3_135, Bv13033 e Bv12069 e do terminal N com tamanho de 155aminoácidos do gene de R3a da batata (Huang et al., 2005) foi realizadapara identificar motivos de seqüência comuns. A comparação levou à identi-ficação de várias seqüências de consenso nos terminais N das proteínas Rauto-ativadas. Os motivos de seqüência comuns estão destacados comoseqüência de consenso na figura 10a).
Uma seqüência de consenso corresponde à seqüência de ami-noácido de acordo com SEQ ID NO: 13: AVLXDAEXKQXXXXXLXXWLX-DLKDXVYDXDDILDE. Uma outra seqüência de consenso corresponde àseqüência de aminoácido de acordo com SEQ ID NO: 14: IXEIXXKLDDL.
A letra X representa, nesse caso, qualquer aminoácido.
As duas seqüências de consenso só estão contidas na formadescrita nos terminais N de proteínas R de CC-NBS-LRR, cuja expressãoleva a uma auto-ativação. Desse modo o domínio de CC, com tamanho de160 aminoácidos, do gene de RX não está em condições de ativar uma mor-te celular ou uma reação hipersensível (Bendahmane et al., 2002). A ex-pressão transitória do terminal N com tamanho de 177 aminoácidos do genede R GvKWS3_133_e08 da beterraba de açúcar e do terminal N com tama-nho de 540 aminoácidos do gene de R1 da batata (Ballvora et al., 2002), emcomparação com o gene de R completo BvKWS3_133_e08 não provocounenhuma morte celular intensificada ou, no caso do gene de R1, nenhumamorte celular (dados não mostrados). A comparação de aminoácidos dosterminais N das proteínas auto-ativadas BvKWS3_165_#176, BvkWS3_135_#147, Bv13033_#159, Bv12069 e StRa-#1-155 com as seqüências deaminoácido dos domínios de CC das proteínas Rx1 StR1 e BvKWS3_133_#177 mostra a ausência das seqüências de consenso descritas acimanos terminais N não auto-ativadas (fig. 10b). Particularmente o motivo deseqüência DAE é um auxiliar importante para identificação de proteínas R,cujo terminal N é auto-ativo. Com ajuda do motivo de seqüência DAE na se-qüência de consenso, podem ser encontrados em numerosas espécies deplantas genes R apropriados para uma auto-ativação, tal como mostra a fi-gura 10c para exemplos de Arabidopsis thaliana (AtAB028617), feijão (Pvul-garisJ71), arroz (osativaAp003073), soja (GmaxKR4) e tomate (Tomato-l2).
A seqüência de aminoácido de 147-175 é importante para aativação da proteína de R 165_#175
Para identificar as partes de aminoácido na proteína 165_#175,que são importantes do terminal N de proteínas de NBS-LRRm a região co-dificada do clone de cDNA 165_#175 foi encurtada. Os clones de cDNA165_#93 e 165_#146 codificam os aminoácidos 1-93 ou 1-146 da proteína165_#175. O teste biolístico, transitório, dos construtos p70S_165_#93,p70S_165_#146 e p70S_165_#175 mostrou que apenas a proteína165_#175, mas não 165_#93 e 165_#146, provoca uma forte morte celular(fig. 11). Desse modo, a região de seqüência de 146-175 é essencial para aauto-ativação de proteínas de NBS-LRR. Nessa região está situado um mo-tivo de seqüência conservado entre todas as proteínas testadas (fig. 10a).
Ativação rápida dos promotores sintéticos, ihdutíveis poragentes patogênicos, 2xS-2x-D e 2xW2-2xD por ataque de fungos
Para a superexpressão induzida por agentes patogênicos degenes de resistência completos ou parciais, são apropriados, particularmen-te, promotores sintéticos do tipo nxS-mxD, nxW2-mxD e nxGst1-mxD, sendoque η é =1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 e m é =1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Exemplificadamen-te, promotores do tipo 2xS-2xD de acordo com SEQ ID NO: 10, 2xW2=2xDde acordo com SEQ ID NO: 11, bem como 2xGst1-2xD de acordo com SEQID NO: 12 foram combinados com o gene de Iuciferase de Photinus pyralis,transformados em beterrabas de açúcar e analisados na reação a ataquepor fungos.
Para a transformação na planta, foram usados os vetores biná-rios 2xS-2xD-luc-kan, 2xW2-2xD-luc-kan e 2xGst1-sxD-luc-kan. Os vetoresbinários foram transformados na linhagem C58C1 de Agrobacterium tumefa-ciens com o plasmídio residente pGV2260 por um processo de transforma-ção de DNA direto (Na, 1987). A seleção de clones de A. tumefaciens re-combinantes deu-se sob uso do antibiótico canamicina (50 mg/l).
A transformação de beterrabas de açúcar deu-se de acordo comLindsey et al. (1991), sob uso do antibiótico canamicina. A transgenicididadedas plantas foi examinada por PGR. O uso dos iniciadores GTGGAGAGGC-TATTCGGTA e CCACCATGATATTCGGCAAG levou à amplificação de umfragmento de DNA com um tamanho de 553 bp do gene de nptiI. O PCR foirealizado sob uso de 10 ng de DNA genômico, uma concentração de inicia-dor de 0,1 μΜ, a uma temperatura de annealing de 55°C, em um MulticyclerPTC-200 (MJ Research, Watertown, USA).
Para analisar a indutibilidade por agentes patogênicos dos pro-motores, as beterrabas de açúcar transgênicas foram infectadas, sob condi-ções de in vitro, com o agente patogênico de ferrugem das folhas da beter-raba de açúcar, Cercospora beticola. Em cada caso, 4 plantas de uma linhatransgênica foram imersas em uma suspensão de fragmentos de micélio deC. beticola (400.000 fragmentos/ml) e 4 plantas, para fins de controle, emsuco de legumes diluído. Plantas infectadas e plantas de controle foramsubseqüentemente incubadas, a 25°C e 16 h de iluminação, em uma estufade cultura. Material de folha infectado e não infectado foi retirado 1, 2, 3, 4, e6-7 dias depois da inoculação e a atividade do gene transmissor de Iucifera-se foi determinada, tal como descrito, com o Luciferase Assay System (Pro-mega, Mannheim, Alemanha).
Tanto o promotor 2xS-2xD como também 2xW2-2xD mostraramuma indutibilidade por agente patogênico rápida e forte na fase precoce dainfecção, mas diferenciaram-se na atividade básica e força do promotor (fi-guras 12-13). O promotor 2xS-2xD, no caso das linhas transgênicasPR39/11, PR 39/48 e PR39/49, foi induzido muito rapidamente, já no 1e diadepois da inoculação 11-59 vezes e no 2- dia, 21-380 vezes, em compara-ção com plantas não infectadas (fig. 12). Enquanto o 19 dia ainda está carac-terizado por um crescimento de hífens de fungos sobre a epiderme, no 2- diaocorre uma penetração das folhas pelos estornas e, com isso, a uma pene-tração no tecido foliar. Na fase tardia da infecção, no 7- dia, a um desenvol-vimento de necrose visível, foi constatada uma indução de 113-792 vezes dopromotor. A atividade do promotor 2xS-2xD, medida como atividade de genetransmissor das plantas não infectadas, é muito pequena e só perfaz 1-10vezes da atividade de luciferase, mensurável em plantas não transgênicas.
A ativação do promotor 2xW2-2xD desenvolve-se um poucomais lentamente do que a do promotor 2xS-2xD. No primeiro dia da infec-ção, o promotor 2xW2-2xD só apresenta uma indução por agente patogênicode 2-17 vezes e no segundo dia de infecção, de 5-56 vezes. Com a ocorrên-cia das necroses no 7S dia, é atingida uma indução por agente patogênicomáxima, de 318-672 (fig. 13). A atividade básica do promotor 2xW2-2xD,com a atividade de gene transmissor de 10-50 vezes a medida em plantasnão transgênicas, é mais alta do que no caso do promotor 2xS-2xD. O pro-motor 2xW2-2xD, porém, destaca-se nitidamente do promotor 2xS-2xD porsua força de promotor 10 vezes mais alta.
Otimização das propriedades de promotor por modificaçãodo número de elementos eis
As propriedades de um promotor sintético do tipo nxS-mxD,nxW2-mxD e nxGst1-mxD, sendo que η é =1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 e m é =1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, podem ser moduladas e otimizadas por variação do númerodos elementos eis, de açoro com as necessidades da expressão de genes.Isso é mostrado, exemplificadamente para o tipo de promotor nxS-mxD. A-lém do vetor binário 2xS-2xD-luc-kan, foram produzidos os vetores binários4xS-2xD-luc-kan, 2xS-4xD-luc-kan e 4xS-4xD-luc-kan e transformados embeterrabas de açúcar. As plantas transgênicas foram infectadas com C.beticola, tal como descrito, e a atividade do gene transmissor foi medidadiariamente, depois da inoculação do fungo. Foi tirada a média dos resul-tados de medição de 13 linhas independentes de 2xS-2xD-luc, 14 linhasindependentes de 4xS-2xD-luc, 15 linhas independentes de 2xS-4xD-luc,bem como 15 linhas independentes de 4xS-4xD-luc e os valores médios daforça de promotor, indução por agente patogênico e atividade básica foramcomparados.
A comparação das propriedades do promotor 2xS-2xD com asvariantes 2xS-4xD, 4xS-2xD e 4xS-4xD mostra que a força de promotor mé-dia é aumentada pelo uso de tetrâmeros, em comparação com o promotorformado de dímeros (fig. 14). Além disso, a indutibilidade por agentes pato-gênicos aumenta do promotor de dímero-dímero (2xS-2xD), pelos promoto-res de tetrâmero-dímero e dímero-tetrâmero (4xS-2xD, 4xS-2xD), até o pro-motor de tetrâmero-tetrâmero (4xS-4xD), em todos os pontos de tempo demedição (tabela 1).
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Tabela 1: Indutibilidade por agentes patogênicos dos promotores2xS-2xD, 4xS-2xD, 2xS-4xD e 4xS-4xD em beterrabas de açúcar transgêni-cas, após infecção com Cercospora beticola. Está representado o valor mé-dio da indução por agente patogênico de 13-15 transformantes (linhas) inde-pendentes por construto de promotor, 1-4 dias após a inoculação.
Paralelamente ao aumento da força do promotor e da indutibili-dade por agente patogênico, há um aumento da atividade básica dos promo-tores que contêm tetrâmeros (tabela 2).<table>table see original document page 27</column></row><table>
Tabela 2: atividade básica dos promotores 2xS-2xD, 4xS-2xD, 2xS-4xD e4xS-4xD em folhas de beterraba sacarina transgênicas.
Está representado o valor médio da atividade de 13-15 transfor-mantes (linhas) independentes por construto de promotor, que foram medi-dos em um teste de infecção de quatro dias como controles não infectados.A atividade básica indica a relação da atividade de gene transmissor dasplantas transgênicas em comparação com a atividade básica de plantas nãotransgênicas.
Esse exemplo mostra que as propriedades de promotor, impor-tantes em conexão com o conceito, tais como força de promotor, indutibili-dade por agentes patogênicos e atividade básica, são reguladas pelo núme-ro dos elementos eis e podem ser criadas variantes de promotor ótimas paraa respectiva conversão técnica. O número ótimo de elementos eis de promo-tores indutíveis por agentes patogênicos é maior no exemplo examinado, noque se refere à indutibilidade por agentes patogênicos, do que na solução dedímero, descrita por Rushton et al., 2002.
Produção de beterrabas de açúcar resistentes a fungos portransformação dos genes de resistência indutíveis por agentes patogê-nicos
Para aumento da resistência de beterrabas de açúcar, os prom-tores 2xS-2xD ou 2xW2-2xD foram combinados, em cada caso, com um dosquatros genes de R BvKWS3_123, BvKWS3_133, BvKWS3_135 e BvKWS3_65e transformados em beterrabas de açúcar. Para esse vim, os vetores biná-rios 2xS-2xD-luc-kan e 2xW2-2xD-luc-kan, com tamanho de 13.959 ou13.969 kb, foram cortados com Sacl e o ponto de corte foi preenchido portratamento com polimerase de DNA T4. Subseqüentemente, os vetores fo-ram cortados adicionalmente com Xhol, separados por eletroforese de gel eos vetores com tamanho de 12.284 ou 12.294 kb foram separados e isola-dos do gene de Iuciferase com tamanho de 1.675 kb.
A isolação dos genes de resistência de ZR dá-se dos vetoresp70S-BvKWS3_123, p70S-BvKWS3_133, p70S-BvKWS3_135 e p70S-BvKWS3_165. Para esse fim, os vetores são primeiramente Iinearizadoscom Notl e e ponto de corte é preenchido por tratamento com Klenow. Osvetores são então cortados com Xhol e os genes de R são isolados. Os veto-res resultantes trazem a designação 2xS-2xD-p70S-BvKWS3_123, 2xS-2xD-p70S-BvKWS3_133, 2xS-2xD-p70S-BvKWS3_135, 2xS-2xD-p70S-BvKWS3_165 ou 2xW2-2xD-BvkWS3-123, 2xW2-2xD-BvkWS3-133, 2xW2-2xD-BvkWS3-135 e 2xW2-2xD-BvkWS3-165 (fig. 15-18). Os vetores bináriossão usados, tal como descrito, para a produção de beterrabas de açúcartransgênicas.
Identificação de beterrabas de açúcar resistentes a fungospor teste de resistência com o fungo nocivo Cercospora beticola
A resistência a fungos aumentada das plantas foi observada emtestes de resistência a fungos, tais como são descritos a seguir, exemplifica-damente, para o teste de resistência das beterrabas de açúcar em relação àCercospora beticola.
Para a infecção de beterrabas de açúcar com o agente patogê-nico de ferrugem das folhas, C. beticola, além das plantas transgências, sãocultivadas na estufa beterrabas de açúcar do genótipo 3DC4156, usado paraa transformação. Duas semanas antes da inoculação programada, placascom suco de legumes (suco de legumes Albani de 40%) foram inoculadascom o produto de isolação Ahlburg agressivo de C. beticola e incubadas a259C. Imediatamente antes da inoculação, o ágar coberto de fungos é ras-pado com ajuda de um porta-objetos e um pouco de água. A concentraçãode fragmentos de micélio e esporos de fungo é determinada com ajuda deuma câmara de contagem. A densidade do material de inoculação é ajusta-da por diluição com água para uma concentração de 20.000 fragmentos/ml.Para a infecção, as plantas com 10-12 semanas de idade são imersas decabeça para baixo em um balão de vidro de 5 I. Por linha a ser examinada,são inoculadas 30 plantas e as plantas são aleatoriamente colocadas na es-tufa.
Depois da inoculação, as plantas são incubadas por 4 dias e95% de umidade do ar em uma estufa. Depois do quarto dia, a umidade doar é reduzida para 60%-70%. Duas, três e quatro semanas depois da inocu-lação, é avaliada opticamente a infestação das folhas, com ajuda do esque-ma de avaliação Kleinwanzlebener Saatzucht (KWS) de nove partes(1970) (1 = folhas saudáveis, 9 = 100% de folhas destruídas). Linhas trans-gênicas, que foram transformadas com um dos construtos 2xS-2xD-p70S-BvKWS3_123, 2xS-2xD-p70S-BvKWS3_133, 2xS-2xD-p70S-BvKWS3_165,2xW2-2xD-BvkWS3-123, 2xW2-2xD-BvkWS3-133, 2xW2-2xD-BvkWS3-135ou 2xW2-2xD-BvkWS3-165, mostraram uma resistência a fungos aumentadaem comparação com o controle (tabela 3)
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Tabela 3: Aumento da resistência de beterrabas de açúcar transgênicas emrelação ao fungo nocivo Cercospora beticola
1 Terceira e última avaliação do teste de resistência (1 - saudável, 9 = 100%das folhas destruídas)
2 AUDPC (Area under disease progress curve) valor determinado sobre 3prazos de avaliação (T1-T3). O valor de AUDPC compreende o desenvolvi-mento da intensidade de infestação de vários momentos de avaliação emum valor.
A análise do curso temporal do desenvolvimento de infestaçãono transformante PR68-6 e PR70-32 sobre os três prazos de avaliação mos-tra que com progressiva duração do teste, a diferença no desenvolvimentoda infestação entre controle e linha transgênica aumenta (figs. 19 e 20). Es-ses resultados mostram que a expressão induzida de diversos genes de Rda beterraba de açúcar, com ajuda dos promotores específicos para o agen-te patogênico, leva a uma resistência a fungos mais alta.
Produção de plantas resistentes a fungos por transforma-ção da região terminal N dos genes de R, sob controle de promotoresreativos a agentes patogênicos
Para produzir plantas mais resistentes a fungos, sob uso daspartes terminais N dos genes de R, os genes de R encurtados 13033_#159,135_#147, 165_#175 e Bv12060 foram combinadas com os promotores 2xS-2xD e 2xW2-2xD e transformadas em beterrabas de açúcar.
Para esse fim, os vetores binários 2xS-2xD-luc-kan e 2xW2-2xD-luc-kan, com tamanho de 13.959 ou 13.969 kb, foram cortados com Sacl e oponto de corte preenchido por tratamento com polimerase de DNA de T4.Subseqüentemente, os vetores foram cortados adicionalmente com Xhol,separados por eletroforese de gel e os vetores, com tamanho de 12.284 ou12.294 kb, foram separados e isolados do gene de luciferase, com tamanhode 1.675 kb.
A isolação dos genes encurtados deu-se dos vetores p70S-12069, p70S-13033_#159, p70S-135_#147 e p70S-165_#175. Os vetoresforam primeiramente Iinearizados com Xbal, as extremidades de DNA forampreenchidas por tratamento de Klenow e, depois, os vetores foram cortadosadicionalmente com Xhol. Os fragmentos de gene de R isolados foram entãoclonados nos vetores binários preparados. Os vetores formados receberama designação de 2xS-2xD-12069, 2xS-2xD-13033_#159, 2xS-2xD-135_#147,2xS-2xD-165_#175 ou 2xW2-2xD-12069, 2xW2-2xD-13033_#159, 2xW2-2xD-135_#147, 2xW2-2xD-165_#175 (figs. 21-22). Os vetores binários foramtransformados em beterrabas de açúcar, tal como descrito, e plantas maisresitentes a fungos foram identificadas por um teste de resistência à Cercos-pora beticola.REFERÊNCIA:
Altschul, S.F. eí al. (1990). Basic Local Alignment search tool, J.Mol. Biol. 215: 403-410
An1 G. (1987). Binary Ti vectors for plant transformation and promoter analysis. MethodsEnzymol. 153, 292-305.
Bairoch et al., (1996) The PROSITE database, its status in 1995. NucIeicAcids Res24:189-96
Ballavora A., Ercolana M R., Weiss J., Meksem K., Bormann C.A.I, Oberhagemann P.,Salamini F., Gebhardt C. (2002). The R1 gene for potato resistance to late blight(Phytophthora infestans) belongs to the Ieucine zipper/NBS/LRR class of plant resistancegenes. Plant J. 30(3):361-71.
Bendahmane A., Farnham G., Moffett P., and Baulcombe D.C. (2002). Constltutive galn-of-function mutants in a nucleotide binding site-leucine rich repeat protein encoded at theRx Iocus of potato. Plant J. Oct;32(2):195-204.
Frost D., Way H., Howles P., Luck J., Manners J., Hardham A., Finnegan J., and Ellis J.(2004). Tobacco transgenic for the flax rust resistance gene L expresses allele-specíficactivation of defense responses. Mol Plant Microbe Interact. 17(2):224-32.
Hennig, J., Dewey, R.E., Cutt1 J. R1 and Klessig, D. F. (Ί993). Pathogen, salicylie acidand developmental dependent expression of a beta-1,3-glucanase/GUS gene füsion intransgenic tobacco plants. Plant J. 4(3):481-93.
Howles P., Lawrence G., Finriegan J., McFadden H., Ayliffe M., Dodds D., and EllisJ. (2005). Autoactive Alleles of the Flax 16 Rust Resistance Gene Induce Non-Race-Spedfie Rust Resistance Associated with the Hypersensitive Response. Mol PlantMicrobe Interact. 18(6):570-582.
Huang S., an der Vossen E.A., Kuang H., Vlesshouwers V.G., Zhang N:, Borm, T.J., vanEck H.J., Baker B., Jacobsen E., and Visser R.G. (2005). Comparative genomics enabledthe isolation of the R3a late blight resistance gene in potato. Plant J. 42(2):251-61.Lindsey1 K1. GaIIois1 P., and Eady1 C. (1991). Regeneration and transformation of sugarbeet by Agrobacterium tumefeclens. Plant Tissue Culture Manual B7:1-13; KluwerAcademic Publishers.
Lupas1 Am Van Dyke M., and Stoek J. (1991) Predicting coiled coils from proteinsequences. Science 252:1162-4.
Martin1 G. B., Bogdanove1 A. J., and Sessa1 G. (2003). Understanding the functions ofplant disease resistanee proteins. Annu. Rev. PIant BioI. 54: 23-61.
Martini1 N., Egen, M., Rüntz, i., and Síriítmaiter, G. (1993). Promoter sequences of apotato pathogenesis-related gene mediate transcriptional activation selectiveiy uponfungai irifection. Mol Gen Genet 236:179-186.
Oldroyd, G. E. D., and. Staskawiez1 B. J. (1998). Genetieallyengineered broad-spectrumdisease resistanee'in tomato. Proe Natl Acad Sci USA. 95(17): 10300-10305
Rushton P. J., ReinstadIerA., Lipka V.. Lippok B., Somssieh I.E. (2002). Synthetie plantpromoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen-and wound-induced signaling. Plant Cell 14(4):749-62.
Samae1 D. A. and Shah, D.M. (1991). Developmental and Pathogen-Indueed Activationof the Arabidopsis Acidic Chitinase Promoter. Plant CeIL 3(10):1063-1072.
Sehmidt K., Heberle B., Kurraseh J., Nehls R1 and Stahl D. J. (2004). Suppression ofphenylalanine ammonia Iyase expression in sugar beet by the fungai pathogenCercospora beticola is mediated at the core promoter of the gene. Plant MoL Biol., 55:835-852.
Sonnhammert E. L.t Eddy, S. R., and Durbin, R. D. (1997) Pfam: A comprehensive ·database of protein domain families based on seed alignments. Proteins 28:405-20.
Tang X., Xie M., Kim Y.J„ Zhou J., Klessig D.F., Martin G.B. (1999). Overexpression ofPto activates defense responses and confers broad resistanee. Plant Cell 11(1): 15-29.
Tian Y., Fan L., Thurau T., Jung C., and Cai D. (2004). The absence of TIR-typéresistanee gene analogues in the sugar beet (Beta vulgaris L.) genome. J. Mol. EvoL58(1):40-53.
Traut1 T. W. (1994). The functions and consensus motifs of nine types of peptidesegments that form different types of nucleotide binding sites. Eur. J. Biochem. 222:9-19.Empresa - depôsitante
Rua: Grimsehlstrasse 31Cidade: EinbeckEstado:
País: AlemanhaCódigo postal: D-37555Telefone: 0049-5561-311-0Fax: 0049-5561-311-322Endereço de e-mail: infoSkws.de<110> Nome da empresa: KWS SAAT AG
Projeto do pedido
<120> Título: Proteína de resistência auto-ativada
<130> Referência do arquivo do pedido
<140> Número atual do pedido:
<141> Data atual do pedido:
Seqüência
<213> Nome do organismo
<400> Filamento de pré-seqüência
gaattcgagc tccaccgcgg gattctaata cgactcacta tagggcaagc agtggtatca 60
acgcagagta cgcggrgatt catactctac ttccatactt tgtaaaaaca aaaaaagata 120
aaaatggtga taggcggaga gatttttcta tcagcgtttc .ttcaagtgct ctttgaaaag 180
cttgcatcag gagggataag tctattccta aaaagagaaa aaggaatagg acctaaagtt 240
attcaaagat ggaacaaaaa attgagatta atagaggcgg ttttaagtga cgccgagcaa 300
aagcagtttc acaacaatgc cgtcaaattg tggcttcgag atcttcaaga gttcgcgtac 360
gatttagagg acatcttaga cgaatttgat acagatgctc gacttaagga gttcaatgat 420
cagcctcagc cacagccaca ggaacatcaa cccaaatctt cttgttctcc tttcaataag 480
gtacaaagct gtctttcttg tggtttccca actttaaata agaaaactac aaagtattca 540
actagcattg aagagatgag cactcgcttg gaagatcttc tggaccaagt aaggtctttg 600
gctctctcaa cgcagataca ctcaagggta gagcaacatg aagaacggag gtgàggatcc 660
<212> Tipo: DNA
<211> Tamanho: 660
OOU
Nome da seqüência: seqüência 1Descrição da seqüência
Seqüência
<213>
<400> Filamento de pré-seqüência
gaattcgagc tccaccgcgg gattctaata cgactcacta tagggcaagc agtggtatca 60
acgcagagta cgcggggaat ttgaagtcat catcaacctc ttatçatcat ccaactccaa 120
gattctctca tcactgacag ttctggagta gaatatggtg gacgcagtgg tcactgtgtt 180
tttggaaaaa cttttcaatg tccttgttca ggagggtggt gttttacttg gtttcaaaga 240
tcggtttaag aagctacaaa atgatctcaa atacatgcaa agcttcttta aagacgccga 300
gaggctcaaa aggaaagatg agtctctaaa atgçactctg gccgacatgc gtgagctggt 360
atatgaagct gaagacatac ttgcagattg ccagcttttg tcaaatagtt ctggaaaact 420
tcttgaagac tattctccta caaaggttcc agccaaatat caaatgggga aaagaattgg 480
tgaaatcaat gaaaagatca atagcattaa aaataacatc tcagcttttc. ttgggcctct 540
tcaacctgtc catggtaatg tagaagaaga gggaccaccc agatggagtt ctccctgagg 600
atcc 604
<212> Tipo: DNA
<211> Tamanho: 604
Nome da seqüência: seqüência 2Descrição da seqüênciaSeqüência<213>
<400> Filamento de pré-seqüência
gaattcgagc tccaccgcgg acgcgtgggc agcagccaaa cacacacttt ctctcctgat 60
catcaatcat cattatcatc tccaaaacca aaaatggaat tcataagcac aacagtctct 120
atcgctgaaa aactgaatac tgcactgcag ttatgggagt tcaaagacaa gctctttagt 180
aacttcagct acgaaaccga acttgaggat ctccaacgca ccgtcagttc cataactgcg 240
gcgctacatg tagcagagac caagctggag ctctccgatg aactacaacg tcaaatcgag 300
gagctcaagg ataccatctt fcgaagcggat gatctactgg atgagcttgt cactctttct 360
caccagcagc gggttgtaga tgccgatggt agtctcctag ataaagtaag acacttcttc 420
tctagttcca acccaatctg tgtttcttac tggatgtctc gggggagtaa ggatatcaag 480
aagaaattag atgatattgc taacaataat cagtttagct tagagcttga tcatgagcct 540
atcaggaaca gaaggcctga gacttgttct tgaggatcct 580
<212> Tipo: DNA
<211> Tamanho: 580
Nome da seqüência: seqüência 3Descrição da seqüência
Seqüência
<213>
<400> Filamento de pré·agtttgtacã aaaaagcagggcgtccgctt oaacaacccataatttctgc accacttttgaataatcatt agaatgtctgcattgctact tttgctggtgtcaaggtgtc cgaaacgacctctgcaagat gcagaaagtatgtcaaaaât gttgtgtatgacgaaagaga atcaacaaaagaatccaatt ctgagtaatttgatgacatt gctgctaataatacaacatt gagaggaatctggtagagat gaagctaggtagatgctagt aggttggttgattggcaaag cttgtttttaggcatgtgtc tctgaaaaataagtaatgaa accactgcaaáttggatgat cggáagcattgcactccaca ggaagcatttccaaagcttg ctacaatcgggttaaggttc ttgcaagccttctgaaacaa acaacataatcatctcaatt aaaagcatgtatcctccgat tttgtcatgcatgaagagtt ataatccattttcaggatgc atttcttgtgtcpatgattt.agcaactgacttaatgtttc agatatgtgccagataagaa tttcccaaaagctatgcaat gggctatattgcttacgtgt gttggatttgagttagaaca tctaagatatgtacactatg caagttgttggcggccgctc tagagtatcccaaagtg
-seqüencia
ctggtaccgg
tctcttcaat
catcctcagc
aagcactacfc
atcttacctg
tcaaaaagat
agcaatatga
atatagatga
gccatctgct
tttattggag
gacgagatct1
ctttagatgc
ccgaaataat.
tgcttccgat
atgatgagtg
ttgatctgca
acctcaacat
tccttgtgct
ccttgtactg
gaaaagcatt
gttacacagt
gatatcaaac
ttttcctatt
ctgtggagtg
ggatacaagt
ttcaccgaaa
cttgttggtg
aggcatttag
gagctactta
agcaagtcat
cattagagta
cttgacctgt
aatctacaat
ctcgaggggc
tccggaattc
aattgtgaaa
cccttctaaa
gtgggctgtc
cagttatgct
cgagaacaag
tagcgaggct
cctcttggat
tcgacaaatc
tgataagatt
tggattggat
ataatcatat
tagacgctta
agttgggttt
ggttgctagt
gaagactaca·
gagacagttg
ggacaatgtg
gcatttagag
gttgaaaatt
gaaaggaacg
aagctttgag
gttcattatt
cacttggaat
attgtgaaga
ttataagtga
aagagatagc
tatggggata
gagcaaagaa
ttattgaaag
gcttcgagga
cctacaaccc
ccgggatatc
aaccacaaat
tccttccccc
acaaaaacaa'
acacaaggca
ctgattgcta
gtcaagattt
gaagttcaca
aggtactatc
agagaccttg
ggtcatgatc
gtgaagaaat
actagtagta
ggcgggattg
aactttgata
gaagaaattt
catgaaaaac
tggatcgagg
agggtgaaga
Stggcggggt
agaaagaatg
agtgagctac
tgtgaaggat
cttgcaacga
cctatagtca
atgtagaatg
tgttgtgacc
tgaaggaggt
ggctcgaact
tattatacac
gttgtcgatg
aatcatcaaa
gtcgacccac
catgattaacf
tgaagtgatc
cacttgcaca
ttttagcagc
ttcgcgctgt
ggctgaaaga
ctgatctgtt
tttcatcctc
ttcaaagatt
caattgaagt
cagaaattat
ctagtgttgg
ggaaaacagc
ttaagttgtg
tgaattctgt
tccgtgagat
acatcaaagt
aacaagatac
tcctctggtt
gaggcgaatt
aataaactcc
agcaagctta
ggtaacgaca·
agatgtcttc
càcgacttat
agtaatcatc
gaaggtttat
ttcagatttg
aacttcaggt
tcaattggga
tttcttccaa
cgttgtatgt tccaaaaaaa aaaaaaaaggccaagcttac gcgtacccag ctttcttgta
601201802403003604204805406006607207808409009601020108011401200126013201380144015001560162016801740180018601920.198020402047
<212> Tipo:<211> Tamanho:
Seqüência
DNA2047
Nome da seqüência: seqüência 4Descrição da seqüência
<213>
<400> Filamento de pré-seqüênciagagagatttt tctatcagcg tttcttcaag tgctctttga aaagcttgca tcaggaggga 120
taagtctatt cctaaaaaga gaaaaaggaa taggacctaa agttattcaa agatggaaca 180
aaaaattgag attaatagag gcggttttaa gtgacgccga gcaaaagcag tttcacaaca 240
atgccgtcaa attgtggctt cgagatcttc aagagttcgc gtacgattta gaggacatct 300
tagacgaatt tgatacagat gctcgactta aggagttcaa tgatcagcct cagccacagc 360
cacaggaaca tcaacccaaa tcttcttgtt ctcctttcaa taaggtacaa agctgtcttt 420
cttgtggttt cccaacttta aataagaaaa ctacaaagta ttcaactagc attgaagaga 480
tgagcactcg cttggaagat cttctggacc aagtaaggtc tttggctctc tcaacgcaga 540
tacactcaag ggtagagcaa catgaagaac ggagggaaac atcatctatg atacgggagc 600
cagttgtata tgggagggac gatgagaaaa atcagataat ccaaagatta ttaaagacag 660
atgagccatt ttgtgaaaat tacaatgtaa ttcctattgt tggaacagga ggcattggga 720
agacgaccct cgctcaggct gtatacaatg atgagcaggt gaaggctcac tttgatgtaa 780
aagcatgggt gtgcatctcc gatgagtttg atgtcaaaca agtgacaaca agcattatca 840
cttcagccac tcgtgataca tgtaatttcg gtgttctaga tgaggcacaa gataaattaa 900
agaacttgct tgtagacaaa agatfccttga tcgttcttga tgatatatgg agtgatgaat 960
atgatccttg ggaccaactt caaacccctt tttcatcagc gaagaaggga agtagagttc 1020
taatcacgac cagaatggag acggtggcaa agaacatggt taaaagacca gatcaaagcc 1080
ccatcatcaa gttaaaggtt ttatctgatg atgattgttg gcttctcttt caaaagcatg 1140
cãgtcgtãgã tgaagácctc attgtgatgc agaaggactt ggttgggttg ttcaaaggat 1200
tgcctttggc tgcaaaagct ctaggaggtc tcctaaggag agagcgfeaag agtaattggg 1260caaggatatt aaagagcaat atttggagtg aagaaggtgg tgttctgcca gtcttgaggc 1320
ttagttatca tcatctccca cáaaacctca aacgtgcctt tgcttattgt tctatattcc 1380
cgaaagatta taaattcacg gagatgaatg ttatattaat gtggatagca gaaggcttgc 1440
tgccagagca cgacaaggag tgcaaggaag acattggtcg tgactatttt cttgatctag 1500
tatcaagatc attgtttgaa ccaaacagtc caatgtatat ggatggatct ttcattatgc 1560
atgacctaât ccatgaccta gctcaatggg ctgctggtga agtttgttgc acattgaata 1620
tccaaaaact ttcttctaga acacgttatt ggtctttctc tgaagaaata ctgatagatc 1680
aaacatggac ttcaaagaaa cttgtccagg tacgatcatt tgcttctttt ggtgcattag 1740
atgttcgaat tcctatgcaa ctactagatt ccattttccg tcagtttcaa tacttaogct 1800
tgttgcgtat gcataaggcg ggaataattg agttaccaaa tagtatgggt aatctgaaac 1860
acttgagact tcttgaoctc tcatggaata caaaactaac tagattgcca aágtccacta 1920
gcaagctttg caacctcoag acgctgctgt taagaggatg taagtctctt gtggagatag 1980
fcccctcfcaat cgaacttcaa caccttgatg ttagtagtag gtatgctgct tcaccgttgg 2040
ggattggaaa atbaacaaac ttgcagacat tgaagggatt tactttgaga agatactcta 2100
agacaagtat aagtgaattg aagaacttga aatgcctccg tggctcactg gacatccatg 2160
gcctagagaa tgtgtttagt agtgaagaag cacaagcagc aaggttgcac gaaaagacag 2220
gccttgataa gttggaaatg tattggggag ataatgccca tgatgttgat gacaacatta 2280
aaaaagatgt agttgatcga ttacagcctc cggaatccat caaagaatta acgttgaatg 2340
ggtacgacgg cttaacattc cctgcttggt tgggaaatcc ctcttacact aatatggttt 2400
tcatagaatt aagggagtgt aggagatgtg aattcttacc agcactaggg cagctgccct 2460
cattaaagaa catcataata gaagggatgg atgatattaa gactgtaggc cctgaatfctt 2520
acggcaatga tgatggttgt tcaaacotgt ttcctgcatt gaaaagtcta cgattctatg 2580
gaatgggggg ttgggaggag tggttggccc catcagttga caatagcaat gcatttccct . 2640
gccttgaàta tattagcata tatgaatgtc cattgttgcg ggctaactta ccttcccatc 2700
tcccatccct aaaagacttg tccattggca aatgcaaaga gttgagattg tcacttccaa 2760
gctgcccttt gctccaaaaa ttgactatta taacatatga gacgccattt agtattgctg 2820
attgtttgcc ctoaactctt gagaccctgg aaatcttgca ctccgaaata gágcagccaa 2880ttcaagagtg gaaacttgac ctccttactt ctcttaaatc tcttgatctc caaaaoatag · 2940
gcagagccgc agatacaata gagcatattc cccaaccaga ttttcatctt ccétcttcct 3000tgtcttcctt atatatctcg gatttcaaga atttgaaatc cttgtcatgc tctacccttc · 3060
ccaacctcac tgaaattaaa atctggaatt gtaagaagct ggaatcattg ggtgtcgatt 3120
tcccaccatc gaagcttcag gaagcgtatt ttagtgattg ccctttgatt tatcaacgat 3180
gcaaaccgga tccccatgga cttattgttt ttaattatat tgataaatac aaatattcgt 3240
acatttgaag attccagttt tcattccctg aagattgagt tggaggtgga gttttggggt 3300
ttttttcaga ttttgttttt gttttttttc attctcttta gtttatttgt atgaaactag 3360
aatatattca aggaattgtg ataaaaaaaa aaaaaaaagg gcggccgctc tagagtatcc 3420
ctcgaggggc ccaagcttac gcgadccagc tttcttacaa agg 3463
<212> Tipo: DNA
<211> Tamanho: 3463
Nome da seqüência: seqüência 5Descrição da seqüência
Seqüência
<213>
<400> Filamento de pré-seqüência
<213> Nome do organismo
<400> Filamento de pré-seqüênciacagccaccaa agaggaccca gaac 24
<212> Tipo: DNA
<211> Tamanho: 24
Nome da seqüência: seqüência 6
Descrição da seqüência
Seqüência
<213> Nome do organismo
<400> Filamento de pré-seqüência
ttattcagcc accaaagtfcg accaataat 29
<212> Tipo: DNA
<211> Tamanho: 29
Nome da seqüência: seqüência 7
Descrição da seqüência
Seqüência
<213> Nome do organismo
<400> Filamento de pré-seqüência
tacaattcaa acattgttca aacaaggaac c 31
<212> Tipo: DNA
<211> Tamanho: 31
Nome da seqüência: seqüência 8
Descrição da seqüência
Seqüência
<213> Nome do organismo
<400> Filamento de pré-seqüência
ttcvagccac cagatttgac caaac 25
<212> Tipo: DNA
<211> Tamanho: 25
Nome da seqüência: seqüência 9
Descrição da seqüência
Seqüência
<213> Nome do organismo.
<400> Filamento de pré-seqüência
actagtcagc caccaaagag gacccagaat tctagtcagc caccaaagag gacccagaattctagttaca atfccaaacat tgttcaaaca aggaacctct agttacaatt caaacattgttcaaacaagg aacctctaga g
<212> Tipo: DNA
<211> Tamanho: 141
Nome da seqüência: seqüência 10
Descrição da seqüência
Seqüência
60120141
<213> Nome do organismo<400> Filamento de pré-seqüência
actagtttat tcagccatca aagttgacca ataattctag tttattcagc catcaaagttgaccaataat tctagttaca attcaaacat tgttcaaaca aggaacctct agttacaattcaaacattgt tcaaacaagg aacctctaga
<212> Tipo: DNA
<211> Tamanho: 150
Nome da seqüência: seqüência 11
Descrição da seqüência
Seqüência
<213> Nome do organismo
<400> Filamento de pré-seqüência
actagtttct agccaccaga tttgaccaaa ctctagtttc tagccaccag atttgaccaaactctagtta caattcaaac attgttcaaa caaggaacct ctagttacaa ttcaaacattgttcaaacaa ggaacctcta ga
<212> Tipo: DNA
<211> Tamanho: 142
Nome da seqüência: seqüência 12
Descrição da seqüência
Seqüência
<213> Nome do organismo<400> Filamento de pré-seqüência
AVLXDAEXKQ XXXXXLXXWL XDLKDXVYDX DDXtiDE 36
<212> Tipo: PRT
<211> Tamanho: 3 6
Nome da seqüência: seqüência 13
Descrição da seqüência
Seqüência
60120150
60120142
<213> Nome do organismo
<400> Filamento de pré-seqüência
IXBXXXKIiDD I 11
<212> Tipo: PRT
<211> Tamanho: 11
Nome da seqüência: seqüência 14
Descrição da seqüência
Seqüência
<213> Nome do organismo
<400> Filamento de pré-seqüência
AVLXDAEXKQ XXXXXLXXWL XDLKDXVYDX DDILDEXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX 60
XXXXXXXXXX XXXXXXXXXX XXXXXXXXIX EIXXKLDDI 99
<212> Tipo: PRT
<211> Tamanho: 99
Nome da seqüência: seqüência 15
Descrição da seqüência
Seqüência<213> Nome do organismo
<400> Filamento de pré-seqüência
atggagattg gcttagcagt tggtggtgca tttctctctt cagctttgaa tgttctcttt 60
gataggcttg ctcctcacgg tgatctgctc aacatgtttc agaagoataa ggatcatgtt 120
aagctcttaa agaàgctgga ggacattttg ctcggtcttc agattgtgct aagtgatgca 180
gagaataaac aagcatcaaa tcgacatgtg agccagtggt tcaataagct tcagaatgct 240
gtggacggtg ctgagaactt gatagaacaa gtcaattatg aagctttgag gcttaaggtg 300
gaaggccagc atcaaaatct tgcagaaaca agcaaccagc aagtaagtga ccttaacctg· 360
tgcttcagtg atgatttctt tcttaacata aaggataagt tggaagaaac cattgaaaca 420
ttggaggtgt tggaaaagca aattggtcgc cttgtaatca ctagctag 468
<212> Tipo: PRT
<211> Tamanho: 468
Nome da seqüência: seqüência 16
Descrição da seqüência
Seqüência
Claims (14)
1. Ácido nucléico, que codifica uma proteína de resistência auto-ativada, para produção de uma resistência em relação a agentes patogêni-cos em plantas, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico apresentauma parte limitada de um gene de resistência de NBS-LRR, que se estendedo terminal 5' da região codificada do gene de resistência de NBS-LRR, ajusante, até o início do domínio de NBS do gene de resistência de NBS-LRR,sendo que o gene de resistência de NBS-LRR não é um gene de resistênciade TIR-NBS-LRR.
2. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, que codificauma seqüência de aminoácido com um motivo de seqüência DAE.
3. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, que codificauma seqüência de aminoácido com um motivo de seqüência AVLXDAE.
4. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação, com uma se-qüência de nucleotídeo do seguinte grupo:a) seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 1 ouuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüênciade nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 1, que se hibri-diza com uma seqüência de nucleotídeo de acordo comSEQ ID NO: 1 ou com uma seqüência de nucleotídeo com-plementar à seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQID NO: 1;b) seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 2 ouuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüênciade nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 2, que se hibri-diza com uma seqüência de nucleotídeo de acordo comSEQ ID NO: 2 ou com uma seqüência de nucleotídeo com-plementar à seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQID NO: 2;c) seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 3 ouuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüênciade nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 3, que se hibri-diza com uma seqüência de nucleotídeo de acordo comSEQ ID NO: 3 ou com uma seqüência de nucleotídeo com-plementar à seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQID NO: 3;d) seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 4 ouuma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüênciade nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 4, que se hibri-diza com uma seqüência de nucleotídeo de acordo comSEQ ID NO: 4 ou com uma seqüência de nucleotídeo com-plementar à seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQID NO: 4;e) seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 16ou uma seqüência de nucleotídeo complementar à se-qüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 16,que se hibridiza com uma seqüência de nucleotídeo de a-cordo com SEQ ID NO: 16 ou com uma seqüência de nu-cleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo de a-cordo com SEQ ID NO: 16.
5. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que no caso do gene de resistência de NBS-LRR trata-se de umgene de resistência da beterraba de açúcar.
6. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, que codificauma seqüência de aminoácido, com uma seqüência escolhida do seguintegrupo:a) SEQ ID NO: 13b) SEQ ID NO: 14c) SEQ ID NO: 15.
7. Construto de ácido nucléico para produção de uma resistênciaem relação a agentes patogênicos em plantas, coma) um promotor indutível por agente patogênico, bem comob) um ácido nucléico de acordo com uma das reivindicações 1a 6, que se encontra sob o controle do promotor.
8. Construto de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que, no caso do promotor indutível por agentepatogênico, trata-se de um promotor sintético.
9. Construto de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que o promotor sintético compreende uma oumais das seguintes combinações de elementos eis:a) um box de nxS-mxDb) um box de nxW2-mxDc) um box de nxGstl -mxD(sendo que η e m significam um número natural de 1... 10).
10. Construto de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a combinação de elementos eis compreen-dea) uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 10 oub) uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 11 ouc) uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 12 oud) um derivado da seqüência de nucleotídeo de acordo coma) a c), com propriedades equiparáveis.
11. Planta transgênica com um ácido nucléico ou um construtode ácido nucléico de acordo com uma das reivindicações precedentes.
12. Partes de uma planta transgênica como definida na reivindi-cação 11.
13. Sementes ou material de sementes de uma planta transgêni-ca como definida na reivindicação 11.
14. Uso de um ácido nucléico ou de um construtor de ácido nu-cléico como definida em uma das reivindicações 1 a 10, para produção deuma planta transgênica.
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