ES2344219T3 - Supresores de rechazo a injerto. - Google Patents

Abstract

Una sustancia que tiene una actividad de modular la transducción de señales mediada por AILIM para aumentar el efecto de uno o más agente(s) inmunosupresor(es) sobre la supresión, tratamiento o prevención del rechazo a injerto que acompaña el trasplante de un órgano, una parte del mismo o un tejido, dicha sustancia se selecciona de cualquiera de (a) a (e): (a) un anticuerpo que se une a AILIM, o una parte de dicho anticuerpo; (b) un polipéptido que comprende el total o una parte de la región extracelular de AILIM; (c) un polipéptido de fusión que comprende el total o una parte de una región extracelular de AILIM y el total o un parte de una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina; (d) un polipéptido que se une a AILIM; y (e) un ADN antisentido o un ARN antisentido contra AILIM.

Description

Supresores de rechazo a injerto.

Campo técnico

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una sustancia que tiene una actividad para modular la actividad biológica de la "molécula inmunomoduladora de linfocitos inducible por activación" (AILIM, en sus siglas en inglés) (también conocida como "coestimulador inducible" (ICOS)), especialmente la transducción de señales mediada por AILIM.

Específicamente, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una sustancia que tiene una actividad para modular (por ejemplo, inhibir) la proliferación de células que expresan AILIM o modular (por ejemplo, inhibir) la producción de una citoquina (por ejemplo, interferón-\gamma o interleuquina-4) por células que expresan AILIM.

Más específicamente, la presente invención se refiere a (1) composiciones farmacéuticas para la inhibición, tratamiento o prevención de rechazo a injertos (rechazo inmunológico) que acompaña el trasplante de un órgano, o una parte del mismo, o un tejido; y (2) composiciones farmacéuticas para aumentar el efecto inhibidor, terapéutico o preventivo de agentes inmunosupresores sobre el rechazo a injertos (rechazo inmunológico) que acompaña el trasplante de un órgano, o una parte del mismo, o un tejido.

Antecedentes técnicos

Debido a la reciente revisión de las leyes sobre trasplante de órganos, se han realizado en Japón unos pocos trasplantes de órganos de pacientes con muerte cerebral. En un caso, siete pacientes recibieron tales beneficios de un donante. Después de ello, se espera que los trasplantes de órganos aumenten.

Por otra parte, se estima que los pacientes japoneses afectados por enfermedades cardiovasculares graves, tales como, enfermedades hepáticas (insuficiencia hepática aguda, cirrosis hepática, etc.), enfermedades cardíacas (insuficiencia cardíaca grave, cardiomiopatía, hipertrofia cardíaca, etc.), enfermedades renales (insuficiencia renal, glomerulonefritis crónica, nefropatía diabética, pielonefritis, etc.), enfermedades pulmonares (disfunción pulmonar de ambos pulmones, etc.) y enfermedades pancreáticas (tratamiento de pacientes diabéticos), para cuyo tratamiento es vital el trasplante de órganos, aumentan cada año en alrededor de 600 pacientes de corazón, alrededor de 3.000 pacientes de hígado y alrededor de 500 pacientes de pulmón. Mientras se desarrolla el aspecto legal, la falta de órganos trasplantables también es un problema real que existe en este momento. De manera similar, la falta de órganos es un problema serio también en los Estados Unidos, que es un país avanzado en términos de trasplantes. En los Estados Unidos, aproximadamente 4.300 personas (1999) están esperando trasplantes de corazón y aproximadamente 43.000 personas (1999) están esperando trasplantes renales. En realidad, aproximadamente 800 personas y aproximadamente 2.300 personas mueren cada año sin poder recibir trasplantes de corazón y riñón, respectivamente.

El trasplante de tejidos (tales como piel, córnea y hueso) u órganos (tales como hígado, corazón, riñón, pulmón y páncreas) incluye: (1) autotrasplante (trasplante autólogo), (2) isotrasplante, (3) alotrasplante y (4) xenotrasplante.

Autotrasplante se refiere al trasplante de una parte de un individuo a otra parte del mismo individuo, y un ejemplo es el caso de tratar una quemadura injertando la piel normal de uno mismo en el área afectada.

El isotrasplante se realiza entre animales homogéneos. En seres humanos, tal trasplante se realiza entre gemelos homocigóticos (por ejemplo, trasplante de uno de los riñones o tejidos hepáticos).

El alotrasplante se realiza entre dos individuos diferentes que tienen contextos genéticos diferentes, y en seres humanos, tal trasplante se realiza entre gemelos dicigóticos o entre individuos que no tienen absolutamente ninguna relación sanguínea entre sí.

El xenotrasplante se realiza entre individuos de diferentes especies animales. Un ejemplo es el caso se trasplanta un tejido o un órgano de un chimpancé o un cerdo en un ser humano.

Como se ha mencionado anteriormente, se espera que aumenten los alotrasplantes de pacientes cerebralmente muertos debido al desarrollo de la legislación relativa al trasplante de órganos. Sin embargo, para resolver la falta absoluta de órganos trasplantables, actualmente se persiguen activamente varias investigaciones cuyo fin son las aplicaciones prácticas del xenotrasplante, más específicamente, el trasplante de tejidos u órganos de mamíferos no humanos tales como cerdos a seres humanos.

Mientras se espera que el tema de la falta de tejidos y órganos trasplantables se resuelva mediante el desarrollo de leyes sobre la muerte cerebral y trasplante, y mediante la mejora de las técnicas de xenotrasplante, hay otro obstáculo extremadamente grande en el tratamiento enfermedades mediante alotrasplante y xenotrasplante. Más específicamente, el obstáculo es el rechazo inmunológico grave (rechazo a injerto) en receptores que se produce después del trasplante de tejidos u órganos de donantes.

Rechazo a injerto se refiere a varias respuestas inmunes que tratan de rechazar y eliminar un injerto (una parte de un cuerpo vivo que se trasplante, una célula, un tejido o un órgano) de un donante cuyo contexto genético es diferente al del receptor (es decir, alotrasplante o xenotrasplante) ya que el receptor reconoce el injerto como una sustancia extraña. Las respuestas inmunes que acompañan este trasplante se pueden clasificar en: (1) rechazo hiperagudo, que es un rechazo fuerte que se produce inmediatamente después del trasplante; (2) rechazo agudo, que se observa a los pocos meses después del trasplante; y (3) rechazo crónico observado varios meses después del trasplante. Además, aunque la inmunidad celular debida a las células inmunocompetentes representadas por las células T y la inmunidad humoral debida a los anticuerpos se producen de una manera intrincadamente coordinada, la respuesta principal es mediante inmunidad celular.

Como resultado del rechazo a injerto, por último el injerto se vuelve necrótico y se cae. Además, el receptor desarrolla no solo síntomas sistémicos graves tales como fiebre, leucocitosis y fatiga, sino también hinchazón y sensibilidad en el sitio del trasplante. Además, pueden producirse complicaciones graves tales como infecciones.

En particular, cuando se trasplanta una injerto xenogénico tal como el de un cerdo, se produce el problema serio del rechazo hiperagudo por lo que el injerto se rechaza en minutos.

Un número limitado de agentes inmunosupresores que suprimen la función de células inmunocompetentes se usan para suprimir el rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que acompaña tales trasplantes, porque el rechazo inmunológico producido por el alotrasplante se debe principalmente a inmunidad celular. Tales agentes inmunosupresores incluyen ciclosporina (CsA); tacrolimus (FK-506); azatioprina (AZ); micofenolato de mofetilo (MMF); mizorribina (MZ); leflunomida (LEF); esteroides corticosuprarrenales (también conocidos como hormonas corticosuprarrenales, corticoesteroides, corticoides) tales como prednisolona y metilprednisolona; sirolimus (también conocido como rapamicina); deosxiespergualina (DSG) y FTY720 (nombre químico: clorhidrato de 2-amino-2-[2-(4-octilfenil)etil]-1,3-propanediol).

También se están desarrollando clínicamente como agentes inmunosupresores CTLA4 y CD28, que son moléculas responsables de transducir señales coestimuladoras necesarias para la activación de células T (moléculas de transducción de señal coestimuladora), y especialmente fármacos de CTLA4 que usan la región soluble de CTLA4 y el gen que la codifica.

Por otra parte, recientemente, de forma similar a CTLA4 y CD28, que son moléculas de transducción de señales coestimuladoras, se identificó una molécula llamada molécula inmunomoduladora de linfocitos inducible por activación (AILIM, humana, de ratón y rata; Int. Immunol., 12 (1), p.51-55, 2000; también llamada coestimulador inducible (ICOS; humano; Nature, 397(6716), p.263-266, 1999); J. Immunol., 166(1), p.1, 2001; J. Immunol., 165(9), p.5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276(1), p.335, 2000; Immunity, 13(1), p.95, 2000; J. Exp. Med., 192(1), p.53, 2000; Eur. J. Immunol., 30(4), p.1040, 2000) como la tercera molécula transductora de señales coestimuladoras que transduce una segunda señal (señal coestimuladora) necesaria para la activación de linfocitos tales como células T, y acoplada con la señal, regula la función de linfocitos activados tales como células T activadas.

Basado en los descubrimientos de estudios recientes relacionados con esta molécula, se predice que la molécula AILIM esté posiblemente implicada en varias enfermedades (por ejemplo, enfermedades autoinmunes, alergias e inflamaciones) producidas por la activación de células inmunocompetentes tales como células T (especialmente células T). Sin embargo, no hay descripciones sobre la relación entre la modulación funcional de la molécula AILIM y el rechazo a injertos (rechazo inmunológico) que acompaña al trasplante de tejidos u órganos, así como intentos de suprimir, tratar o prevenir tales reacciones de rechazo que acompañan al trasplante de tejidos u órganos modulando la actividad de la molécula AILIM.

Además, muy recientemente se ha identificado una molécula nueva llamada B7h, B7RP-1, GL50 o LICOS que se considera que es un ligando que interacciona con la molécula de transducción de señales coestimuladoras AILIM (Nature. Vol.402, No.6763, pp. 827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5, No.12, pp.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol.164, pp.1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol.10, No.6, pp.333-336, 2000).

La identificación de estos dos nuevos tipos de moléculas, es decir, AILIM (ICOS) y B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS), reveló que, además de la primera y segunda vías de transducción de señales conocidas entre CD28 y CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2) y entre CTLA4 y CD80 (B7-1)/CD86 (B7-2), hay una tercera vía de transducción de señales coestimuladoras nueva que es esencial para la activación mencionada anteriormente de linfocitos tales como células T y el control de la función de células T activadas, que funciona a través de la interacción de AILIM (ICOS) y B7RP-1 (B7h, GL50, LICOS).

Están en vía de realizarse estudios exhaustivos sobre las funciones biológicas de estas moléculas nuevas, la regulación de funciones de linfocitos tales como células T mediante la tercera transducción de señales coestimuladoras por las moléculas y la relación entre la nueva transducción de señales y enfermedades.

Divulgación de la invención

Más específicamente, un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos y agentes farmacéuticos que supriman, traten o prevengan rechazos inmunológicos (rechazo a injerto) que acompañan a un trasplante de tejido o un órgano (alotrasplante o xenotrasplante) usando técnicas médicas y farmacéuticas (por ejemplo, agentes farmacéuticos tales como compuestos de bajo peso molecular y anticuerpos) para modular la función biológica de una molécula nueva, AILIM, que se considera que transduce una segunda señal (señal coestimuladora) necesaria para activar linfocitos tales como células T y acoplada con la señal, modula la función de linfocitos activados tales como células T activadas.

Otro objetivo es proporcionar métodos para aumentar el efecto supresor sobre el rechazo a injertos por agentes inmunosupresores existentes (ciclosporina, azatioprina, esteroides corticosuprarrenales, FK-506, etc.) usando tales agentes farmacéuticos que modulan la función biológica de AILIM (por ejemplo, agentes farmacéuticos tales como compuestos de bajo peso molecular o anticuerpos).

Como resultado de la investigación exhaustiva relacionada con la función biológica de AILIM de mamífero y un método para suprimir el rechazo inmunológico (rechazo a injerto), que es un problema serio que acompaña a un trasplante de tejido o un órgano (alotrasplante o xenotrasplante) de injertos (células, un tejido o un órgano), los presentes inventores encontraron que (1) los agentes farmacéuticos que modulan la función de AILIM suprimen significativamente el rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que acompaña el trasplante de tejido(s) u órgano(s) y (2) el efecto supresor en el rechazo a injerto de los agentes inmunosupresores existentes aumenta usando agentes farmacéuticos que modulan la función de AILIM, y completaron la presente invención.

Una composición farmacéutica de la presente invención es útil como un fármaco para modular varias reacciones in vivo en las que está implicada la transducción de una señal coestimuladora a células que expresan AILIM mediada por AILIM (por ejemplo, proliferación de células que expresan AILIM, producción de citoquina(s) por células que expresan AILIM, citolisis inmune o apoptosis de células que expresan AILIM y la actividad de inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo contra células que expresan AILIM), y/o como fármacos para prevenir el inicio y/o progresión de varias enfermedades en las que está implicada la transducción de señales mediada por AILIM, y para el tratamiento o profilaxis de las enfermedades.

Específicamente, una composición farmacéutica de la presente invención puede modular (suprimir o fomentar) la proliferación de células que expresan AILIM, o puede modular (inhibir o fomentar) la producción de citoquinas (por ejemplo interferón \gamma o interleuquina 4) por células que expresan AILIM y puede prevenir varias enfermedades desencadenadas por varios fenómenos fisiológicos en los que está implicada la transducción de señales mediada por AILIM, y permite el tratamiento o prevención de varias enfermedades.

El uso de una composición farmacéutica de esta invención permite la supresión, prevención y/o tratamiento de rechazo inmunológico (rechazo a injerto), que es un problema serio en terapias donde se trasplanta (alotrasplanta o xenotrasplanta) un órgano (hígado, corazón, pulmón, riñón, páncreas, etc.) o una parte del mismo, o un tejido (tales como piel, córnea y hueso) de un donante a un receptor afectado por una enfermedad cardiovascular grave.

Además, el uso de una composición farmacéutica de esta invención permite el aumento del efecto supresor de rechazo a injerto de agentes inmunosupresores existentes administrados para suprimir el rechazo inmunológico en tales terapias de trasplante.

Más específicamente, las presentes invenciones son como sigue:

(1) Una composición farmacéutica para suprimir, tratar o prevenir el rechazo a injerto que acompaña el trasplante de un órgano, una parte del mismo, o un tejido, dicha composición comprende una sustancia que tiene una actividad de modular la transducción de señales mediada por AILIM y un soporte farmacéuticamente aceptable.

(2) Una composición farmacéutica para aumentar el efecto de uno o más agente(s) inmunosupresor(es) en la supresión, tratamiento o prevención del rechazo a injerto que acompaña el trasplante de un órgano, una parte del mismo, o un tejido, dicha composición comprende una sustancia que tiene una actividad de modular la transducción de señales mediada por AILIM y un soporte farmacéuticamente aceptable.

(3) La composición farmacéutica de (2), en donde dicho agente inmunosupresor es uno o más agente(s) terapéuti-
co(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en azatioprina, esteroide corticosuprarrenal, ciclosporina, mizorribina y tacrolimus (FK-506), micofenolato de mofetilo, leflunomida, sirolimus, desoxiespergualina, FTY720 y fármaco de CTLA4.

(4) La composición farmacéutica de cualquiera de (1) a (3), en donde dicho trasplante es alotrasplante.

(5) La composición farmacéutica de cualquiera de (1) a (3), en donde dicho trasplante es xenotrasplante.

(6) La composición farmacéutica de cualquiera de (1) a (5), en donde dicho órgano es el hígado, corazón, riñón, pulmón o páncreas.

(7) La composición farmacéutica de cualquiera de (1) a (5), en donde dicho tejido es la piel, córnea o tejido óseo.

(8) La composición farmacéutica de cualquiera de (1) a (7), en donde dicha sustancia es una sustancia proteica.

(9) La composición farmacéutica de (8) en donde dicha sustancia proteica se selecciona del grupo que consiste en:

a)

un anticuerpo que se une a AILIM, o una parte de dicho anticuerpo;

b)

un polipéptido que comprende el total o una parte de una región extracelular de AILIM;

c)

un polipéptido de fusión que comprende el total o una parte de una región extracelular de AILIM y el total o una parte de una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina;

d)

un polipéptido que se une a AILIM.

\vskip1.000000\baselineskip

(10) La composición farmacéutica de cualquiera de (1) a (7), en donde dicha sustancia es una sustancia no proteica.

(11) La composición farmacéutica de (10) en donde dicha no proteica es ADN, ARN o un compuesto químicamente sintetizado.

\vskip1.000000\baselineskip

Las presentes invenciones se describen en detalle aquí posteriormente mediante la definición de los términos y los métodos para producir las sustancias usadas en esta invención.

Aquí, el término "mamífero" significa un ser humano, vaca, cabra, conejo, ratón, rata, hámster y cobaya; preferido es un ser humano, vaca, rata, ratón o hámster y particularmente preferido es un ser humano.

"AILIM" de esta invención es una abreviación para "molécula inmunomoduladora de linfocitos inducible por activación" y significa una molécula de superficie celular de un mamífero que tiene la estructura y función descritas en artículos previos (J. Immunol., 166(1), p.1, 2001; J. Immunol., 165(9), p.5035, 2000; Biochem. Biophys. Res. Commun., 276(1), p.335, 2000; Immunity, 13(1), p.95, 2000; J. Exp. Med., 192(1), p.53, 2000; Eur. J. Immunol., 30(4), p.1040, 2000; Int. Immunol., 12(1), p.51, 2000; Nature, 397(6716), p.263, 1999; Número de acceso en GenBank: BAA82129 (humana); BAA82128 (rata); BAA82127 (variante de rata); BAA82126 (ratón)).

En especial preferiblemente, el término significa AILIM derivada de un ser humano (por ejemplo, International Immunology, Vol. 12, No. 1, p.51-55, 2000).

Esta AILIM también se denomina ICOS (Nature, Vol.397, No.6716, p. 263-266, 1999) o antígeno JTT-1/antígeno JTT-2 (Solicitud de patente japonesa publicada sin examinar No. (JP-A) Hei 11-29599, Solicitud International de Patente No. WO98/38216) y estas moléculas se refieren mutuamente a la misma molécula.

Además, "AILIM" como se la denomina en esta invención incluye un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos de AILIM de cada mamífero descritas en bibliografía previamente publicada y en especial preferiblemente también un polipéptido que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la de AILIM humana. Además, también se incluyen en "AILIM" de esta invención variantes humanas de AILIM similares a la variante de AILIM previamente identificada derivada de rata (Número de acceso de GenBank: BAA82127).

Aquí, la expresión "que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos" significa que "AILIM" de la presente invención incluye un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en la que múltiples aminoácidos, preferiblemente de 1 a 10 aminoácidos, en particular preferiblemente de 1 a 5 aminoácidos, se han sustituido, delecionado y/o modificado, y polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos en las que múltiples aminoácidos, preferiblemente de 1 a 10 aminoácidos, en particular preferiblemente de 1 a 5 aminoácidos, se han añadido, siempre que los polipéptidos tengan sustancialmente las mismas propiedades biológicas que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostradas en artículos anteriores.

Tales sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos se pueden alcanzar según el método normal (Experimental Medicine: SUPLEMENTO, "Handbook of Genetic Engineering" (1992), etc.).

Los ejemplos son mutagénesis dirigida con oligonucleótidos sintéticos (método de dúplex con huecos), mutagénesis puntual por la que se introduce una mutación puntual al azar mediante tratamiento con nitrito o sulfito, el método por el que se prepara un mutante de deleción con la enzima Bal31, etcétera, mutagénesis con casete, método de barrido del enlazador, método de mala incorporación, método del cebador mal emparejado, método de síntesis de segmento de ADN, etc.

El método de mutagénesis dirigida con oligonucleótido sintético (método de dúplex con huecos) se puede realizar, por ejemplo, como sigue. Se clona la región que se quiere mutagenizar en un vector de fago M13 que tiene una mutación ámbar para preparar ADN monocatenario de fago. Después de linealizar el ADN RFI del vector M13 sin mutación ámbar mediante tratamiento con enzima de restricción, el ADN se mezcla con el ADN monocatenario de fago mencionado anteriormente, se desnaturaliza y se alinea formando de esta manera un "ADN dúplex con huecos". Se hibrida un oligonucleótido sintético en el que se introducen las mutaciones con el ADN dúplex con huecos y se prepara un ADN bicatenario circular cerrado mediante reacción con ADN polimerasa y ADN ligasa. Se transfectan con este ADN células de E. coli mutS, deficientes en actividad reparadora de malos emparejamientos. Las células de E. coli que no tienen actividad supresora se infectan con los fagos crecidos y solo se criban los fagos que no tienen mutaciones ámbar.

El método por el que se introduce una mutación puntual con nitrito utiliza, por ejemplo, el principio mencionado posteriormente. Si se trata ADN con nitrito, los nucleótidos se desaminan para cambiar la adenina a hipoxantina, citosina a uracilo y guanina a xantina. Si el ADN desaminado se introduce en las células, se cambian "A:T" y "G:C" por "G:C" y "A:T", respectivamente, porque hipoxantina, uracilo y xantina se aparean con citosina, adenina y timina, respectivamente, en la replicación de ADN. Realmente, los fragmentos monocatenarios de ADN tratados con nitrito se hibridan con "ADN dúplex con huecos" y posteriormente se separan cepas mutantes manipulando de la misma manera que en la mutagénesis dirigida con oligonucleótido sintético (método de dúplex con huecos).

El término "citoquina" como en "producción de una citoquina por células que expresan AILIM" en la presente invención significa una citoquina arbitraria producida por células que expresan AILIM (especialmente, células T).

Ejemplos de células T son células T del tipo Th1 y del tipo Th2, y una citoquina de la presente invención específicamente significa una citoquina producida por células T del tipo Th1 y/o una citoquina arbitraria producida por células T del tipo Th2.

Las citoquinas producidas por células T del tipo Th1 incluyen IFN-\gamma, IL-2, TNF, IL-3 y las citoquinas producidas por células T de tipo Th2 incluyen IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 y TNF (Cell, Vol. 30, No. 9, pp.343-346, 1998).

El término "sustancia" como se usa en la presente invención, específicamente una "sustancia que tiene una actividad para modular la transducción de señales mediada por AILIM", y más específicamente "una sustancia que tiene una actividad para inhibir la proliferación de células que expresan AILIM o para inhibir la producción de una citoquina por células que expresan AILIM" significa una sustancia natural o una sustancia arbitraria preparada artificialmente.

Aquí, la expresión "transducción de señales mediada por AILIM" significa transducción de señales a través de AILIM que produce un cambio en cualquier fenotipo en las células que expresan AILIM descritas anteriormente o en los ejemplos siguientes (un cambio en la proliferación celular, activación de células, apoptosis y/o la capacidad de producir una citoquina arbitraria por células que expresan AILIM).

"La sustancia" se puede clasificar fundamentalmente en una "sustancia proteica" y una "sustancia no proteica".

Ejemplos de "sustancias proteicas" son los siguientes polipéptidos, anticuerpos (anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales o partes de anticuerpos monoclonales).

Cuando la sustancia es un anticuerpo, es preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Cuando la sustancia es un anticuerpo monoclonal, incluye no solo anticuerpos monoclonales derivados de mamíferos no humanos, sino también los siguientes anticuerpos monoclonales quiméricos recombinantes, anticuerpos monoclonales humanizados recombinantes y anticuerpos monoclonales humanos.

Cuando la sustancia es un polipéptido, incluye los siguientes polipéptidos, fragmentos de polipéptido (olipéptido), polipéptidos de fusión y polipéptidos químicamente modificados. Ejemplos de oligopéptidos son péptidos que comprenden de 5 a 30 aminoácidos, preferiblemente de 5 a 20 aminoácidos. Se puede diseñar una modificación dependiendo de varios fines, por ejemplo, para aumentar la semivida en sangre en el caso de administración in vivo o para aumentar la tolerancia contra degradación o para aumentar la absorción en al aparato digestivo en administraciones orales.

Ejemplos de polipéptidos son como sigue:

(1) Un polipéptido que comprende el total o una parte de una región extracelular de AILIM;

(2) Un polipéptido de fusión que comprende el total o una parte de una región extracelular de AILIM y el total o una parte de una región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina; o

(3) Un polipéptido que se une a AILIM.

Ejemplos de "sustancias no proteicas" son ADN, ARN y compuestos químicamente sintetizados.

Aquí, "ADN" significa "ADN útil como un fármaco ADN antisentido que comprende una secuencia parcial de nucleótidos de un ADN que codifica la AILIM anterior (preferiblemente AILIM humana), o ADN químicamente modificado de la misma, que se puede diseñar basado en el ADN (ADNc o ADN genómico) que codifica AILIM". Específicamente, el ADN antisentido puede inhibir la transcripción del ADN que codifica AILIM a ARNm o la traducción del ARNm a una proteína, hibridando con el ADN o ARN que codifica AILIM.

La frase "secuencia parcial de nucleótidos" como se denomina aquí se refiere a una secuencia parcial de nucleótidos que comprende un número arbitrario de nucleótidos en una región arbitraria. Una secuencia parcial de nucleótidos incluye de 5 a 100 nucleótidos consecutivos, preferiblemente de 5 a 70 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente de 5 a 50 nucleótidos consecutivos e incluso más preferiblemente de 5 a 30 nucleótidos consecutivos.

Cuando se usa el ADN como un fármaco ADN antisentido, la secuencia de ADN se puede modificar químicamente en parte para extender la semivida (estabilidad) en sangre cuando se administra el ADN a pacientes, para aumentar la permeabilidad de membranas intracitoplásmicas del ADN o para aumentar la resistencia a degradación o la absorción de ADN administrado por vía oral en los órganos digestivos. Las modificaciones químicas incluyen, por ejemplo, la modificación de un enlace fosfato, una ribosa, un nucleótido, el grupo azúcar y el extremo 3' y/o el extremo 5' en la estructura de un oligonucleótido de ADN.

Las modificaciones de los enlaces fosfato incluyen, por ejemplo, la conversión de uno o más enlaces a enlaces fosfodiéster (D-oligo), enlaces fosforotioato, enlaces fosforoditioato (S-oligo), enlaces metil fosfonato (MP-oligo), enlaces fosforamidato, enlaces no fosfato o enlaces metil fosfonotioato o combinaciones de los mismos. La modificación de una ribosa incluye, por ejemplo, la conversión a 2'-fluororribosa o 2'-O-metilribosa. La modificación de un nucleótido incluye, por ejemplo, la conversión a 5-propiniluracilo o 2-aminoadenina.

Aquí, "ARN" significa "ARN útil como un fármaco ARN antisentido que comprende una secuencia parcial de nucleótidos de un ARN que codifica la AILIM anterior (preferiblemente AILIM humana), o ARN químicamente modificado de la misma, que se puede diseñar basado en el ARN que codifica la AILIM". El ARN antisentido puede inhibir la transcripción del ADN que codifica AILIM a ARNm o la traducción del ARNm a una proteína, hibridando con el ADN o ARN que codifica AILIM.

La frase "secuencia parcial de nucleótidos" como se emplea aquí, se refiere a una secuencia parcial de nucleótidos que comprende un número arbitrario de nucleótidos en una región arbitraria. Una secuencia parcial de nucleótidos incluye de 5 a 100 nucleótidos consecutivos, preferiblemente de 5 a 70 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente de 5 a 50 nucleótidos consecutivos e incluso más preferiblemente de 5 a 30 nucleótidos consecutivos.

La secuencia de ARN antisentido se puede modificar químicamente en parte para extender la semivida en sangre cuando se administra el ARN a pacientes, para aumentar la permeabilidad de membranas intracitoplásmicas del ARN o para aumentar la resistencia a degradación o la absorción de ARN administrado por vía oral en los órganos digestivos. Las modificaciones químicas incluyen modificaciones tales como las que se aplican al ADN antisentido anterior.

Ejemplos de "un compuesto químicamente sintetizado" son un compuesto arbitrario excluyendo los anteriores ADN, ARN y sustancias proteicas, que tienen peso molecular de alrededor de 100 hasta alrededor de 1000 o menos, más preferiblemente un compuesto que tiene un peso molecular de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 800 y más preferiblemente un peso molecular de aproximadamente 100 hasta aproximadamente 600.

El término "polipéptido" incluido en la definición de la "sustancia" anterior significa una parte (un fragmento) de una cadena polipeptídica que constituye AILIM (preferiblemente AILIM humana), preferiblemente el total o una parte de una región extracelular del polipéptido que constituye AILLIM (se pueden añadir opcionalmente de 1 a 5 aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal de la región).

AILIM según la presente invención es una molécula transmembrana que penetra la membrana celular, que comprende 1 ó 2 cadenas polipeptídicas.

Aquí, una "proteína transmembrana" significa una proteína que está unida a la membrana celular a través de una región peptídica hidrofóbica que penetra en la bicapa lipídica de la membrana una vez o varias veces, y cuya estructura está, como un toto, compuesta de tres regiones principales, es decir, una región extracelular, un región transmembrana y una región citoplásmica, como se ha visto en muchos receptores o moléculas de superficie celular. Tal proteína transmembrana constituye cada receptor o molécula de superficie celular como un monómero, o como un homodímero, heterodímero u oligómero acoplado con una o varias cadenas que tienen la(s) misma(s) o diferente(s) secuencia(s) de aminoácidos.

Aquí, una "región extracelular" significa el total o una parte de la estructura parcial (región parcial) de la estructura entera de la proteína transmembrana mencionada anteriormente donde la estructura parcial existe fuera de la membrana. En otras palabras, significa el total o una parte de la región de la proteína transmembrana excluyendo la región incorporada en la membrana (región transmembrana) y la región que existe en el citoplasma después de la región transmembrana (región citoplásmica).

"Un polipéptido de fusión" incluido en la "sustancia proteica" anterior significa un polipéptido de fusión que comprende el total o una parte de la región extracelular de un polipéptido que constituye AILIM (preferiblemente AILIM humana) y "el total o una parte de la región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina (Ig, preferiblemente Ig humana)". Preferiblemente, el polipéptido de fusión es un polipéptido de fusión que tiene la región extracelular de AILIM y una parte de la región constante de la cadena pesada de una IgG humana, y en particular preferiblemente, un polipéptido de fusión de la región extracelular de AILIM y una región (Fc) de la cadena pesada de una IgG humana que comprende la región bisagra, el dominio C_{H}2 y el dominio C_{H}3. Como IgG, es preferible IgG1, y como AILIM, es preferible AILIM humana, de ratón o rata (preferiblemente humana).

La expresión "el total o una parte de la región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina (Ig)" como se usa aquí significa la región constante o la región Fc de una cadena pesada (cadena H) derivada de una inmunoglobulina humana, o una parte de la misma. La inmunoglobulina puede ser cualquier inmunoglobulina que pertenezca a cualquier clase y a cualquier subclase. Específicamente, la inmunoglobulina incluye IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgM, IgA (IgA1 e IgA2), IgD e IgE. Preferiblemente, la inmunoglobulina es IgG (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) o IgM. Ejemplos de inmunoglobulinas particularmente preferidas de la presente invención los las que pertenecen a las IgG de seres humanos (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4).

La inmunoglobulina tiene una unidad estructural en forma de Y en la que cuatro cadenas compuestas de dos cadenas ligeras (cadenas L) homólogas y dos cadenas pesadas (cadenas H) homólogas están unidas a través de puentes disulfuro (puentes S-S). La cadena ligera está compuesta de la región variable de la cadena ligera (V_{L}) y la región constante de la cadena ligera (C_{L}). La cadena pesada está compuesta de la región variable de la cadena pesada (V_{H}) y la región constante de la cadena pesada (C_{H}).

La región constante de la cadena pesada está compuesta de algunos dominios que tienen secuencias de aminoácidos únicas para cada clase (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE) y para cada subclase (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, IgA1 e IgA2).

La cadena ligera de las IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) está compuesta de V_{H}, dominio C_{H}1, región bisagra, dominio C_{H}2 y dominio C_{H}3 en este orden a partir del N-terminal.

De forma similar, la cadena pesada de IgG1 está compuesta de V_{H}, dominio C\gamma_{1}1, región bisagra, dominio C\gamma_{1}2 y dominio C\gamma_{1}3 en este orden a partir del N-terminal. La cadena pesada de IgG2 está compuesta de V_{H}, dominio C\gamma_{2}1, región bisagra, dominio C\gamma_{2}2 y dominio C\gamma_{2}3 en este orden a partir del N-terminal. La cadena pesada de IgG3 está compuesta de V_{H}, dominio C\gamma_{3}1, región bisagra, dominio C\gamma_{3}2 y dominio C\gamma_{3}3 en este orden a partir del N-terminal. La cadena pesada de IgG4 está compuesta de V_{H}, dominio C\gamma_{4}1, región bisagra, dominio C\gamma_{4}2 y dominio C\gamma_{4}3 en este orden a partir del N-terminal.

La cadena pesada de IgA está compuesta de V_{H}, dominio C\alpha1, región bisagra, dominio C\alpha2 y dominio C\alpha3 en este orden a partir del N-terminal.

De forma similar, la cadena pesada de IgA1 está compuesta de V_{H}, dominio C\alpha_{1}1, región bisagra, dominio C\alpha_{1}2 y dominio C\alpha_{1}3 en este orden a partir del N-terminal. La cadena pesada de IgA2 está compuesta de V_{H}, dominio C\alpha_{2}1, región bisagra, dominio C\alpha_{2}2 y dominios C\alpha_{2}3 en este orden a partir del N-terminal.

La cadena pesada de IgD está compuesta de V_{H}, dominio C\delta1, región bisagra, dominio C\delta2 y dominio C\delta3 en este orden a partir del N-terminal.

La cadena pesada de IgM está compuesta de V_{H}, dominio C\mu1, dominio C\mu2, dominio C\mu3 y dominio C\mu4 en este orden a partir del N-terminal y no tiene región bisagra como se ve en IgG, IgA e IgD.

La cadena pesada de IgE está compuesta de V_{H}, dominio C\varepsilon1, dominio C\varepsilon2, dominio C\varepsilon3 y dominio C\varepsilon4 en este orden a partir del N-terminal y no tiene región bisagra como se ve en IgG, IgA e IgD.

Si, por ejemplo, se trata IgG con papaína, se corta en un lateral ligeramente N-terminal detrás de los puentes disulfuro que existen en la región bisagra donde los puentes disulfuro unen las dos cadenas pesadas para generar dos Fab homólogos, en el que un fragmento de cadena pesada compuesto de V_{H} y C_{H}1 está unido a una cadena ligera a través de un puente disulfuro; y un Fc, en el que dos fragmentos de cadena pesada homólogos compuestos de la región bisagra, el dominio C_{H}2 y el dominio C_{H}3 están unidos a través de puentes disulfuro. (Véase, "Immunology Illustrated", original 2ª ed., Nankodo, pp.65-75 (1992); y "Focus of Newest Medical Science ``Recognition Mechanism of Immune System''", Nankodo, pp.4-7 (1991); etcétera).

Es decir, "una parte de la región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina" mencionado anteriormente significa una parte de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene las características estructurales mocionadas anteriormente, y preferiblemente es una región constante sin el dominio C1, o la región Fc. Específicamente, un ejemplo de la misma es una región compuesta de la región bisagra, el dominio C2 y el dominio C3 de cada una de IgG, IgA e IgD, o es una región compuesta del dominio C2, el dominio C3 y el dominio C4 de cada una de IgM e IgE. Un ejemplo particularmente preferible de la misma es la región Fc de IgG1 humana.

El polipéptido de fusión mencionado anteriormente tiene la ventaja de que es extremadamente fácil de purificar usando cromatografía en columna de afinidad usando la propiedad de la proteína A que se une específicamente al fragmento de inmunoglobulina, porque el polipéptido de fusión de la presente invención tiene una parte de la región constante (por ejemplo Fc) de una inmunoglobulina tal como IgG como se ha mencionado anteriormente como compañero de fusión. Además, puesto que están disponibles varios anticuerpos contra Fc de varias inmunoglobulinas, se puede realizar fácilmente un inmunoensayo para los polipéptidos de fusión con anticuerpos contra Fc.

"Un polipéptido que se une a AILIM" está comprendido en "un polipéptido" incluido en la definición de la "sustancia" anterior.

Un ejemplo específico de "un polipéptido que se une a AILIM" es el total o una parte de un polipéptido que comprende una molécula conocida denominada B7h, B7RP-1, GL50 o LICOS, que es un ligando que interacciona con AILIM (Nature, Vo1.402, No.6763, pp.827-832, 1999; Nature Medicine, Vol.5, No.12, pp.1365-1369, 1999; J. Immunology, Vol.164, pp.1653-1657, 2000; Curr. Biol., Vol.10 No 6, pp.333-336, 2000).

Preferiblemente, el polipéptido es un polipéptido que comprende el total o una parte de una región extracelular de los ligandos anteriores (B7h, B7RP-1, GL50, LICOS) o un polipéptido de fusión que comprende el polipéptido y el total o una parte de la región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina (preferiblemente inmunoglobulina humana). Aquí, las expresiones "región extracelular" y "región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina" tienen los mismos significados que se han mencionado anteriormente.

Se pueden producir los polipéptidos, partes de polipéptidos (fragmento) y polipéptidos de fusión mencionados anteriormente no solo mediante tecnología de ADN recombinante como se menciona posteriormente, sino también mediante un método bien conocido en la técnica tal como un método de síntesis química o un método de cultivo celular o un método modificado del mismo.

El "anticuerpo" de la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal (antisuero) o un anticuerpo monoclonal contra AILIM de mamífero (en particular preferiblemente AILIM humana) definida anteriormente y preferiblemente un anticuerpo monoclonal.

Específicamente, el anticuerpo es un anticuerpo que tiene una actividad para inhibir la proliferación de células que expresan AILIM uniéndose a AILIM o para inhibir la producción de interferón-\gamma o interlequina-4 por células que expresan AILIM mediante unión a AILIM.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos naturales obtenidos inmunizando mamíferos tales como ratones, ratas, hámsteres, cobayas y conejos con un antígeno tal como células (células naturales, líneas celulares, células tumorales, etc.) que expresan AILIM de la presente invención, transformantes preparados usando tecnología de ADN recombinante de modo que sobreexpresen AILIM en la superficie de las mismas, polipéptidos que constituyen AILIM o los polipéptidos de fusión anteriormente mencionados que comprenden el polipéptido AILIM o la región extracelular de AILIM. Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados (anticuerpos con CDR injertado) que se pueden producir mediante tecnología de ADN recombinante y anticuerpos humanos que se pueden producir usando animales transgénicos que producen anticuerpos
humanos.

Los anticuerpos monoclonales incluyen los que tienen cualquier isotipo de IgG, IgM, IgA, IgD o IgE. Es preferible IgG o IgM.

Se puede producir un anticuerpo policlonal (antisuero) o un anticuerpo monoclonal por métodos conocidos. Es decir, se inmuniza un mamífero, preferiblemente un ratón, rata, hámster, cobaya, conejo, gato, perro, cerdo, cabra, caballo o vaca, o más preferiblemente un ratón, rata, hámster, cobaya o conejo, por ejemplo, con un antígeno mencionado anteriormente con adyuvante de Freund, si es necesario.

Se puede obtener un anticuerpo policlonal a partir del suero obtenido del animal así inmunizado. Además, los anticuerpos monoclonales se producen como sigue. Se preparan hibridomas de las células productoras de anticuerpo obtenidas del animal así inmunizado y células de mieloma que no son capaces de producir autoanticuerpos. Los hibridomas se clonan y se criban los clones que producen los anticuerpos monoclonales que muestran una afinidad específica hacia el antígeno usado para inmunizar el mamífero.

Específicamente, se puede producir un anticuerpo monoclonal como sigue. Se realizan las inmunizaciones inyectando o implantando una vez o varias veces un antígeno mencionado anteriormente como inmunógeno, si es necesario, con adyuvante de Freund, por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, a través de la almohadilla plantar o por vía intraperitoneal en un mamífero no humano, específicamente un ratón, rata, hámster, cobaya o conejo, preferiblemente un ratón, rata o hámster (incluyendo un animal transgénico generado de modo que produzca anticuerpos derivados de otro animal tal como un ratón transgénico que produce anticuerpos humanos mencionado posteriormente). Normalmente, las inmunizaciones se realizan de una a cuatro veces de uno a catorce días después de la primera inmunización. Se obtienen las células productoras de anticuerpos del mamífero así inmunizado aproximadamente de uno a cinco después de la última inmunización. La frecuencia e intervalo de inmunizaciones se puede organizar de forma apropiada dependiendo de, por ejemplo, la propiedad del inmunógeno usado.

Se pueden preparar los hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales mediante el método de Köhler y Milstein (Nature, Vol.256, pp.495-497 (1975)) o mediante un método modificado del mismo. Es decir, se preparan los hibridomas fusionando las células productoras de anticuerpos contenidas en el bazo, ganglio linfático, médula ósea o amígdalas obtenidas de un mamífero no humano inmunizado como se menciona anteriormente, preferiblemente un bazo, con mielomas sin capacidad productora de autoanticuerpos, que derivan de, preferiblemente, un mamífero tales como ratón, rata, cobaya, hámster, conejo o ser humano, o más preferiblemente un ratón, rata o ser humano.

Por ejemplo, se pueden usar como mieloma para fusión celular un mieloma derivado de ratón P3/X63-AG8.653 (653), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.U1 (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/0, Sp2), PAI, F0, NSO o BW5147, mieloma derivado de rata 210RCY3-Ag.2.3., o mieloma derivado de ser humano U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 o CEM-T15.

Se pueden cribar los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales cultivando los hibridomas, por ejemplo, en placas de microtitulación y midiendo la reactividad del sobrenadante del cultivo en pocillos en los que se observa crecimiento del hibridoma, hacia el inmunógeno usado para la inmunización mencionada anteriormente, por ejemplo, mediante un inmunoensayo enzimático tal como RIA y ELISA.

Los anticuerpos monoclonales se pueden producir a partir de hibridomas cultivando los hibridomas in vitro o in vivo tal como en el líquido ascítico de un ratón, rata, cobaya, hámster o conejo, preferiblemente un ratón o rata, más preferiblemente un ratón, y aislando los anticuerpos del sobrenadante del cultivo resultante o líquido ascítico de un mamífero.

Cultivar los hibridomas in vitro se puede realizar dependiendo de, por ejemplo, la propiedad de las células de ser cultivadas, el objeto del estudio y las varias condiciones del método de cultivo, usando medios de nutrientes conocidos o cualquier medio de nutrientes derivado medios basales conocidos para crecer, mantener y almacenar los hibridomas para producir anticuerpos monoclonales en el sobrenadante del cultivo.

Ejemplos de medios basales son medios con baja concentración de calcio tales como medio de Ham F12, medio MCDB153 o medio MEM con baja concentración de calcio, y medios con alta concentración de calcio tales como medio MCDB104, medio MEM, medio D-MEM, medio RPMI1640, medio ASF104 o medio RD. Los medios basales pueden contener, por ejemplo, suero, hormonas, citoquinas y/o varias sustancias inorgánicas u orgánicas dependiendo del objetivo.

Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar del sobrenadante del cultivo o del líquido ascítico mencionados anteriormente mediante precipitación con sulfato de amonio saturado, método de precipitación de euglobulina, método del ácido caproico, método del ácido caprílico, cromatografía de intercambio iónico (DEAE o DE52) y cromatografía de afinidad usando una columna de anti-inmunoglobulina o una columna de proteína A.

Un "anticuerpo monoclonal quimérico recombinante" es un anticuerpo monoclonal preparado mediante ingeniería genética y específicamente significa un anticuerpo quimérico tal como un anticuerpo monoclonal quimérico de ratón/humano cuyas regiones variables derivan de una inmunoglobulina de un mamífero no humano (ratón, rata, hámster, etc.) y cuyas regiones constantes derivan de una inmunoglobulina humana.

Una región constante derivada de una inmunoglobulina humana tiene una secuencia de aminoácidos única para cada isotipo tal como IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD e IgE. La región constante del anticuerpo monoclonal quimérico recombinante puede ser la de una inmunoglobulina humana perteneciente a cualquier isotipo. Preferiblemente, es una región constante de una IgG humana.

Se puede producir un anticuerpo monoclonal quimérico, por ejemplo, como sigue. Huelga decir, que el método de producción no está limitado al mismo.

Se puede producir un anticuerpo monoclonal quimérico de ratón/humano, con referencia a Experimental Medicine: SUPLEMENTO, Vol.1.6, No.10 (1988); y la solicitud de patente japonesa publicada examinada No. (JP-B) Hei 3-73280. Es decir, se puede preparar insertando operativamente el gen CH (gen C que codifica la región constante de la cadena H) obtenido de un ADN que codifica la inmunoglobulina humana después de los genes V_{H} activos (gen VDJ reorganizado que codifica la región variable de la cadena H) obtenido de un ADN que codifica un anticuerpo monoclonal de ratón aislado de un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de ratón, y el gen C_{L} (gen C que codifica la región constante de la cadena L) obtenido de un ADN que codifica la inmunoglobulina humana después de los genes V_{L} activos (gen VJ reorganizado que codifica la región variable de la cadena L) obtenido de un ADN que codifica un anticuerpo monoclonal de ratón aislado de un hibridoma, en el mismo vector o un vector diferente en una manera expresable, seguido por transformar células huésped con el vector de expresión y después cultivar los transformantes.

Específicamente, primero se extraen los ADN de hibridomas productores de anticuerpo monoclonal de ratón mediante el método normal, se digieren con las enzimas de restricción apropiadas (por ejemplo, EcoRI y HindIII), se someten a electroforesis (usando, por ejemplo, un gel de agarosa al 0,7%) y se analizan mediante transferencia de Southern. Después de teñir un gel de electroforesis, por ejemplo con bromuro de etidio, y fotografiarlo, al gel se le dan posiciones marcadoras, se lava dos veces con agua y se remoja en HCl 0,25 M durante 15 minutos. Después, el gel se remoja en una solución de NaOH 0,4 N durante 10 minutos con agitación suave. Los ADN se transfieren a un filtro durante 4 horas mediante el método normal. El filtro se recupera y se lava dos veces con SSC 2X. Después de secar suficientemente el filtro, se hornea a 75ºC durante 3 horas. Después de hornear, el filtro se trata con SSC 0,1X/SDS al 0,1% a 65ºC durante 30 minutos. A continuación, se remoja en SSC 3X/SDS al 0,1%. El filtro obtenido se trata con una solución de prehibridación en una bolsa de plástico a 65ºC durante 3 a 4 horas.

Después, se añaden a la bolsa la sonda de ADN marcada con ^{32}P y una solución de hibridación y se hacen reaccionar a 65ºC alrededor de 12 horas. Después de la hibridación, el filtro se lava a la concentración de sal, temperatura de reacción y tiempo apropiados (por ejemplo, SSC 2X/SDS al 0,1%, temperatura ambiente, 10 minutos). El filtro se pone en una bolsa de plástico con un pequeño volumen de SSC 2X y se somete a autorradiografía después de sellar la bolsa.

Se identifican el gen VDJ y el gen VJ reorganizados que codifican la cadena H y la cadena L de un anticuerpo monoclonal de ratón mediante la transferencia de Southern mencionada anteriormente. La región que comprende el fragmento de ADN identificado se fracciona mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa y se inserta en un vector de fago (por ejemplo, Charon 4A, Charon 28, \lambdaEMBL3 y \lambdaEMBL4). Se transforma E. coli (por ejemplo LE392 y NM539) con el vector de fago para generar una genoteca genómica. Se criba la genoteca genómica mediante una técnica de hibridación en placa tal como el método de Benton-Davis (Science, Vol.196, pp.18-182 (1977)) usando las sondas apropiadas (gen J de la cadena H, gen J de la cadena L (\kappa), etc.) para obtener clones positivos que comprenden el gen VDJ o el gen VJ reorganizados. Al hacer un mapa de restricción y determinar la secuencia de nucleótidos de los clones obtenidos, se confirma si se han obtenido los genes que comprenden el gen (VDJ) de V_{H} o el gen (VJ) de V_{L} reorganizados deseados.

Por separado, se aíslan el gen C_{H} humano y el gen C_{L} humano usados para la quimerización. Por ejemplo, cuando se produce un anticuerpo quimérico con IgG1 humana, se aísla el gen C\gamma1 como un gen C_{H} y el gen C\kappa como gen C_{L}. Estos genes se pueden aislar de una genoteca genómica humana con el gen C\gamma1 de ratón y el gen C\kappa de ratón, correspondientes al gen C\gamma1 humano y el gen C\kappa humano, respectivamente, como sondas, aprovechando la alta homología entre las secuencias de nucleótidos del gen de la inmunoglobulina de ratón y el gen de la inmunoglobulina humana.

Específicamente, se aíslan fragmentos de ADN que comprenden el gen C\kappa humano y una región potenciadora de la genoteca genómica humana \lambda Charon 4A HaeIII-AluI (Cell, Vol.15, pp.1157-1174 (1978)), por ejemplo, usando un fragmento de 3 kb HindIII-BamHI del clon Ig146 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.75, pp.4709-4713 (1978)) y un fragmento EcoRI de 6.8 kb del clon MEP10 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.78, pp.474-478 (1981)) como sondas. Además, por ejemplo, después de digerir el ADN de hepatocitos fetales humanos con HindIII y fraccionarlo mediante electroforesis en gel de agarosa, se inserta un fragmento de 5,9 kb en \lambda788 y después se aísla el gen C\gamma1 humano con las sondas mencionadas anteriormente.

Usando el gen V_{H} de ratón, el gen V_{L} de ratón, el gen C_{H} humano y el gen C_{L} humano así obtenidos, y considerando la región promotora y la región potenciadora, se inserta un gen C_{H} humano después del gen V_{H} de ratón y se inserta el gen C_{L} humano después del gen V_{L} de ratón en un vector de expresión tal como pSV2gtp o pSV2neo con las enzimas de restricción apropiadas y ADN ligasa mediante el método normal. En este caso, se pueden insertar genes quiméricos de gen V_{H} de ratón/gen C_{H} humano y gen V_{L} de ratón/gen C_{L} humano, respectivamente en el mismo vector de expresión o en diferentes vectores de expresión.

El/los vector(es) de expresión con genes quiméricos insertados así preparados se introducen en mielomas que no producen anticuerpos, por ejemplo, células P3X63\cdotAg8\cdot653 o células SP210 mediante el método de fusión del protoplasto, método del DEAE-dextrano, método del fosfato de calcio o método de electroporación. Se criban los transformantes cultivándolos en medio que contiene un fármaco que corresponde al gen de resistencia a fármaco insertado en el vector de expresión y, después, se obtienen las células que producen los anticuerpos monoclonales quiméricos deseados.

Los anticuerpos monoclonales quiméricos deseados se obtienen del sobrenadante del cultivo de las células productoras de anticuerpo cribadas así.

El "anticuerpo monoclonal humanizado (anticuerpo con CDR injertado)" de la presente invención es un anticuerpo monoclonal preparado mediante ingeniería genética y específicamente significa un anticuerpo monoclonal humanizado en donde una parte o el total de las regiones determinantes de complementariedad de la región hipervariable derivan de las regiones determinantes de complementariedad de la región hipervariable de un anticuerpo monoclonal de un mamífero no humano (ratón, rata, hámster, etc.), las regiones marco de la región variable derivan de las regiones marco de la región variable de una inmunoglobulina humana y la región constante deriva de una región constante de una inmunoglobulina derivada de un ser humano.

Las regiones determinantes de complementariedad de la región hipervariable existen en la región hipervariable en la región variable de un anticuerpo y significa tres regiones que se unen directa y complementariamente a un antígeno (residuos determinantes de complementariedad, CDR1, CDR2 y CDR3). Las regiones marco de la región variable significan cuatro regiones comparativamente conservadas situadas delante, detrás o entre las tres regiones determinantes de complementariedad (región marco, FR1, FR2, FR3 y FR4).

En otras palabras, un anticuerpo monoclonal humanizado significa ese en el que todas las regiones excepto una parte o todas las regiones determinantes de complementariedad de la región hipervariable de un anticuerpo monoclonal derivado de un mamífero no humano se han cambiado por sus regiones correspondientes derivadas de una inmunoglobulina humana.

La región constante derivada de una inmunoglobulina humana tiene una secuencia única para cada isotipo tales como IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD e IgE. La región constante de un anticuerpo monoclonal humanizado en la presente invención puede ser la de una inmunoglobulina humana que pertenece a cualquier isotipo. Preferiblemente, es una región constante de IgG humana. Las regiones marco de la región constante derivada de una inmunoglobulina humana no están particularmente limitadas.

Se puede producir un anticuerpo monoclonal humanizado, por ejemplo, como sigue. Huelga decir, que el método de producción no está limitado al mismo.

Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante derivado de un anticuerpo monoclonal de ratón mediante ingeniería genética, con referencia a la traducción japonesa publicada de la publicación internacional (JP-WA) No. Hei 4-506458 y JP-A Sho 62-296890. Es decir, se aíslan al menos un gen CDR de la cadena H de ratón y al menos un gen CDR de la cadena L de ratón correspondiente al gen CDR de la cadena H de ratón de hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal de ratón, y el gen de la cadena H humana que codifica las regiones enteras excepto la CDR de la cadena H humana correspondiente a la CDR de la cadena H de ratón mencionada anteriormente y el gen de la cadena L humana que codifica la región completa excepto la CDR de la cadena L humana correspondiente a la CDR de la cadena L de ratón mencionada anteriormente se aíslan de genes humanos de inmunoglobulinas.

El/los gen(es) CDR de la cadena H de ratón y el/los gen(es) de la cadena H humana así aislados se insertan operativamente en un vector apropiado de modo que se puedan expresar. De forma similar, el/los gen(es) CDR de la cadena L de ratón y el/los gen(es) de la cadena L humana se insertan operativamente en otro vector apropiado de modo que se puedan expresar. De modo alternativo, el/los gen(es) CDR de la cadena H de ratón/gen(es) de la cadena H humana y el/los gen(es) CDR de la cadena L de ratón/gen(es) de la cadena L humana se pueden insertar operativamente en el mismo vector de expresión en una manera expresable. Se transforman células huésped con el vector de expresión así preparado para obtener transformantes que producen anticuerpo monoclonal humanizado. Al cultivar los transformantes, se obtiene un anticuerpo monoclonal humanizado deseado del sobrenadante del cultivo.

El "anticuerpo monoclonal humano" es una inmunoglobulina en que las regiones enteras que comprenden la región variable y constante de la cadena H y la región variable y constante de la cadena L que constituyen la inmunoglobulina derivan de genes que codifican inmunoglobulina humana.

El anticuerpo humano (preferiblemente anticuerpo monoclonal humano) se puede producir mediante métodos bien conocidos, por ejemplo, de la misma manera que el método de producción de anticuerpos policlonales o monoclonales mencionado anteriormente inmunizando, con un antígeno, un animal transgénico preparado integrando al menos un gen de inmunoglobulina humano en el locus génico de un mamífero no humano tal como un ratón.

Por ejemplo, se prepara un ratón transgénico que produce anticuerpos humanos mediante los métodos descritos en Nature Genetics, Vol.7, pp.13-21 (1994); Nature Genetics, Vo1.15, pp.146-156 (1997); JP-WA Hei 4-504365; JP-WA Hei 7-509137; Nikkei Science, No.6, pp.40-50 (1995); WO94/25585; Nature, Vol.368, pp.856-859 (1994); y JP-WA No. Hei 6-500233.

Además, también se puede aplicar una técnica recientemente desarrollada para producir una proteína derivada de la humana de la leche de una vaca o cerdo transgénico (Nikkei Science, pp.78-84 (Abril, 1997)).

La frase "parte de un anticuerpo" como se usa en la presente invención significa una región parcial de un anticuerpo monoclonal como se ha mencionado anteriormente. Específicamente significa F(ab')_{2}, Fab', Fab, Fv (fragmento variable de anticuerpo), sFv, dsFv (Fv estabilizado por disulfuro) o dAb (anticuerpo de dominio único) (Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, pp.441-456 (1996)).

Se pueden producir "F(ab')_{2}" y "Fab'" tratando una inmunoglobulina (anticuerpo monoclonal) con una proteasa tales como pepsina y papaína, y significa un fragmento de anticuerpo generado al digerir la inmunoglobulina cerca de los puentes disulfuro en las regiones bisagra que existen entre cada una de las dos cadenas H. Por ejemplo, la papaína corta la IgG antes de los puentes disulfuro en las regiones bisagra que existen entre cada una de las dos cadenas H para generar dos fragmentos homólogos de anticuerpo en los que una cadena L compuesta de V_{L} (región variable de la cadena L) y C_{L} (región constante de la cadena L) y un fragmento de la cadena H compuesto de V_{H} (región variable de la cadena H) y C_{H}\gamma1 (región \gamma1 en la región constante de la cadena H) están unido en sus regiones C-terminales a través de un puente disulfuro. Cada uno de tales dos fragmentos homólogos de anticuerpo se llama Fab'. La pepsina también corta IgG después de los puentes disulfuro en las regiones bisagra que existen entre cada una de las dos cadenas H para generar un fragmento de anticuerpo ligeramente mayor que el fragmento en el que dos Fab' mencionados anteriormente están unidos en la región bisagra. Este fragmento de anticuerpo se denomina F(ab')_{2}.

El término "rechazo a injerto" de la presente invención se refiere a varias respuestas inmunes que tratan de rechazar y eliminar un injerto (una parte de un cuerpo vivo que se trasplanta; una célula, un tejido o un órgano) de un donante cuyo contexto genético es diferente al del receptor (es decir, alotrasplante o xenotrasplante) ya que el receptor reconoce el injerto como materia extraña. Las respuestas inmunes que acompañan a este trasplante se pueden clasificar en (1) rechazo hiperagudo, que es un rechazo fuerte que se produce inmediatamente después del trasplante, (2) rechazo agudo, que se observa a los pocos meses del trasplante y (3) rechazo crónico observado varios meses después del trasplante. Además, aunque la inmunidad celular debida a las células inmunocompetentes representadas por las células T y la inmunidad humoral debida a los anticuerpos se producen de una manera intrincadamente coordinada, la respuesta principal es mediante inmunidad celular.

Como resultado del rechazo al injerto, el injerto por último se vuelve necrótico y se cae. Además, el paciente desarrolla no solo síntomas sistémicos graves tales como fiebre, leucocitosis y fatiga, sino también hinchazón y sensibilidad en el sitio del trasplante. Además, se pueden producir complicaciones graves tales como infecciones.

En particular, cuando se trasplante un injerto xenogénico tal como el de un cerdo, se produce el problema serio del rechazo hiperagudo, por lo que el injerto se rechaza en minutos.

El término "injerto" de esta invención se refiere a "un órgano o una parte del mismo" o "un tejido" que se trasplanta a un mamífero receptor de un mamífero donante.

La frase "un órgano o una parte del mismo" refiriéndose al trasplante de esta invención se refiere a un órgano arbitrario o una parte del mismo que compone el cuerpo vivo de un mamífero (preferiblemente un ser humano o un cerdo, y en especial preferiblemente un ser humano). Un ejemplo preferido es el hígado, corazón, pulmón, páncreas riñón, intestino grueso, intestino delgado o una parte de los mismos. Especialmente preferido es el hígado o una parte del mismo.

El término "tejido" refiriéndose al trasplante de esta invención se refiere a un tejido arbitrario que deriva del cuerpo vivo de un mamífero (preferiblemente un ser humano o un cerdo, y preferiblemente un ser humano). Un ejemplo preferido es un tejido tal como piel, córnea, hueso o válvula cardíaca; sin embargo, no se limita a ellos.

El término "agente inmunosupresor" de esta invención se refiere a uno cualquiera o más de los agentes inmunosupresores existentes usados para suprimir un rechazo inmunológico (rechazo a injerto) en un receptor producido por el trasplante de un injerto en el trasplante clínico de células, tejido u órganos, cuya fabricación y venta como agente farmacéutico ha sido aprobada por una organización gubernamental; o uno cualquiera o más de los agentes inmunosupresores que actualmente están en uso en ensayos clínicos o preclínicos o se usará en ensayos clínicos en el futuro, cuya fabricación y venta como agente farmacéutico puede ser aprobada por una organización gubernamental después de los ensayos.

Tales agentes inmunosupresores no sólo se usan solos, sino también en combinación con 2, 3 o más agentes. Por lo tanto, el término "agente inmunosupresor" según esta invención incluye el uso de tipo único de agente farmacéutico o el uso combinado de una pluralidad de agentes farmacéuticos (preferiblemente usados en combinación con 2 ó 3 agentes).

Preferiblemente, el agente inmunosupresor es uno o más agentes farmacéuticos seleccionados de ciclosporina (CsA); tacrolimus (FK-506); azatioprina (AZ); micofenolato de mofetilo (MMF); mizorribina (MZ); leflunomida (LEF); esteroides corticosuprarrenales (también llamados hormonas corticosuprarrenales, corticoesteroides, corticoides) tales como prednisolona y metilprednisolona; sirolimus (también llamado rapamicina); desoxiespergualina (DSG); FTY720 (nombre químico: clorhidrato de 2-amino-2-[2-(4-octilfenil)etil]-1,3-propanediol) y un "fármaco de CTLA4" descrito posteriormente. Especialmente preferible son bien uno o ambos de tacrolimus (FK-506) y ciclosporina.

El término "fármaco de CTLA4" de esta invención se refiere a un medicamento que contiene como principio activo (1) un polipéptido que comprende la longitud completa (incluyendo moléculas que tienen prácticamente la misma secuencia de aminoácidos), o el total o una parte de la región extracelular de CTLA4 humana (antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos; <secuencia de aminoácidos> No. de acceso en GenBank NP 005205; <ADNc> No. de acceso en GenBank NM 005214); (2) un polipéptido de fusión que comprende el total o una parte de la región extracelular de CTLA4 humano y el total o una parte de otra proteína (en especial preferiblemente, el total o una parte de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana) (de aquí en adelante abreviado como CTLA4-IgFc o CTLA4-Ig); o (3) un ADN que puede proporcionar a un mamífero (en especial preferiblemente un ser humano) el polipéptido de (1) o el polipéptido de fusión de (2), o un vector que comprende el ADN (especialmente preferible es un plásmido en general usado en terapia génica, o un vector vírico derivado de un virus (retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, etc.) o similar).

Aquí, cada uno de los términos/frases tales como "región extracelular", "una parte", "región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana", "polipéptido de fusión" y "prácticamente el mismo" tiene el mismo significado que se ha definido anteriormente.

Hay un número de artículos sobre el significativo efecto inmunosupresor del anteriormente mencionado CTLA4-Ig. Por ejemplo, se ha confirmado el gran efecto inmunosupresor de Y100F (la tirosina de la posición 100 se sustituye con alanina) desarrollado por Bristol-Myers Squibb/Repligen a partir de varios experimentos con animales, y este producto también se incluye como una de los fármacos de CTLA4 de esta invención. (Igaku no Ayumi, Vol.194, No.14, p.1195-1200, 2000; J. Clin. Invest., Vol.103, p.1223-1225, 1999; N. Engl. J. Med., Vol.335, p.1369-1377, 1996; J. Exp. Med., Vol.178, p.1801-1806, 1993; Blood, Vol.94, p.2523-2529, 1999; Nature Med., Vol.6, p.464-469, 2000; Blood, Vol.83, p.3815-3823, 1995; J. Clin. Invest., Vol.2, p.473-482, 1998; Blood, Vol.85, p.2607-2612, 1995; N. Engl. J. Med., Vol.340, p.1704-1714, 1999; N. Engl. J. Med. Vol.335, p.1369-1377, 1996; J. Clin. Invest., Vol.103, p.1243-1252, 1999).

\newpage

La frase "soporte farmacéuticamente aceptable" de esta invención incluye un excipiente, un diluyente, un relleno, un agente de descomposición, un estabilizante, un conservante, un tampón, un emulsionante, un agente aromático, un colorante, un edulcorante, un agente que aumenta la viscosidad, un saborizante, un agente que aumenta la solubilidad o algún otro aditivo. Usando uno o más de tales soportes, se puede formular una composición farmacéutica en comprimidos, píldoras, polvos, gránulos, inyecciones, soluciones, cápsulas, pastillas, elixires, suspensiones, emulsiones, jarabes, etc.

La composición farmacéutica se puede administrar por vía oral o parenteral. Otras formas para la administración parenteral incluyen una solución para la aplicación externa, supositorios para la administración rectal y un óvulo vaginal prescrito mediante el método usual, que comprende uno o más principios activos.

La dosis puede variar dependiendo de la edad, sexo, peso y síntomas de un paciente, efecto del tratamiento, vía de administración, periodo de tratamiento, el tipo de principio activo (la "sustancia" según la presente invención, mencionada anteriormente) contenido en la composición farmacéutica, etc. Normalmente, la composición farmacéutica se puede administrar a un adulto en una dosis de 10 \mug a 1000 mg (o de 10 \mug a 500 mg) por una administración. Dependiendo de varias condiciones, en algunos casos una dosis menor de la mencionada anteriormente puede ser suficiente y en otros una dosis mayor que la mencionada anteriormente puede ser necesaria.

En el caso de una inyección, se puede producir disolviendo o resuspendiendo un anticuerpo en un soporte no tóxico farmacéuticamente aceptable tal como solución salina fisiológica o agua destilada para inyección comercialmente disponible ajustando la concentración en el intervalo de 0,1 \mug de anticuerpo/ml de soporte a 100 mg de anticuerpo/ml de soporte. La inyección así producida se puede administrar a un paciente humano en necesidad de tratamiento en un intervalo de dosis de 1 \mug a 100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente en el intervalo de 50 \mug a 50 mg/kg de peso corporal, una o más veces al día. Ejemplos de vías de administración son vías de administración médicamente apropiadas tales como inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal o similares, preferiblemente inyección intravenosa.

La inyección también se puede preparar en un diluyente no acuoso (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal tal como aceite de oliva, y alcohol tal como etanol), suspensión o emulsión.

La inyección se puede esterilizar mediante filtración con un filtro que filtra bacterias, mezclando un bactericida o mediante irradiación. La inyección se puede producir de tal manera que se prepara al tiempo de uso. Es decir, se liofiliza para ser una composición sólida estéril que se puede disolver en agua destilada estéril para inyección u otro solvente antes de su uso.

La composición farmacéutica de la presente invención es extremadamente útil para la supresión, prevención y/o tratamiento de rechazo inmunológico (rechazo a injerto), que es un problema serio en terapias donde se trasplanta un órgano (alotrasplanta o xenotrasplanta) (hígado, corazón, pulmón, riñón, páncreas, etc.) o una parte del mismo, o un tejido (tal como piel, córnea y hueso) de un donante a un receptor afectado por una enfermedad cardiovascular
grave.

Además, la composición farmacéutica de esta invención puede aumentar el efecto de supresión de rechazo a injerto (rechazo inmunológico) por agentes inmunosupresores existentes administrados para suprimir el rechazo a injerto durante tales terapias de trasplante cuando se usa la composición farmacéutica en combinación con los agentes inmunosupresores.

\vskip1.000000\baselineskip

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra el efecto de un anticuerpo anti-AILIM y/o un agente inmunosupresor en la supresión de rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que acompaña el trasplante de órganos, usando como índice, la prolongación de la supervivencia del injerto en un receptor al que se trasplantó un hígado de un donante.

La figura 2 muestra el efecto de supresión de rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que se produce acompañando al trasplante de órgano por un anticuerpo anti-AILIM y/o un agente inmunosupresor, que usa como índice, los días extendidos de la supervivencia del injerto de un hígado trasplantado de un donante a un receptor.

La figura 3 muestra el efecto de supresión de rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que se produce acompañando al trasplante de órgano por un anticuerpo anti-AILIM (de otra manera denominado anticuerpo anti-ICOS), que usa como índice la extensión de días de supervivencia del injerto del corazón trasplantado de un donante a un receptor.

La figura 4 muestra el efecto de supresión de rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que se produce acompañando al trasplante de órgano por AILIM-Ig (de otra manera denominado ICOS-Ig), que usa como índice la extensión de días de supervivencia del injerto del corazón trasplantado de un donante a un receptor.

La figura 5 es una fotografía que muestra el grado de infiltración de células que expresan AILIM en un corazón trasplantado.

La figura 6 muestra el efecto de supresión de rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que se produce acompañando al trasplante de órgano por un anticuerpo anti-AILIM y/o AdCTLA4-Ig, que usa como índice la extensión de días de supervivencia del injerto del corazón trasplantado de un donante a un receptor.

La figura 7 muestra el efecto de un anti-AILIM usado en combinación con AdCTLA4-Ig en la supresión del rechazo inmunológico (rechazo a injerto) que acompaña al trasplante de órganos, usando como índice la presencia o ausencia de supervivencia del injerto de un corazón trasplantado (trasplante primario de corazón y trasplante secundario de corazón) y piel trasplantada (trasplante primario de piel) en un donante.

Mejor manera de llevar a cabo la invención

De aquí en adelante, la presente invención se ilustrará específicamente con referencia a los ejemplos, pero no se debe considerar que esté limitada a las formas de realización descritas en los ejemplos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Supresión del rechazo a injerto por una sustancia que modula AILIM en trasplante de hígado <1> Materiales y métodos <1-1> Animales

Se usaron ratas Lewis adultas (machos, 210-250 g) y ratas DA adultas (machos, 210-250 g) como receptores y donantes, respectivamente.

\vskip1.000000\baselineskip

<1-2> Anticuerpo monoclonal anti-AILIM de rata

Se usó un anticuerpo monoclonal purificado de líquido ascítico o del sobrenadante del cultivo obtenido de cultivar in vitro o in vivo el hibridoma previamente descrito denominado "JTT-1" (este hibridoma se ha depositado internacionalmente el 11 de octubre de 1996, en el Instituto Nacional de Biociencias y Tecnología Humana, Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Ministerio de Economía, Comercio e Industria, que es un agencia internacional de depósitos certificada según el tratado de Budapest. No. de acceso internacional: FERM BP-5707) que produce un anticuerpo monoclonal de ratón anti-AILIM de rata (anticuerpo monoclonal de ratón anti-antígeno JTT-1 de rata) (JP-A Hei 11-29599 (ejemplos 1 y 2) y solicitud internacional de patente No. WO98/38216 (ejemplos 1 y 2)). De aquí en adelante, este anticuerpo se denomina simplemente "anticuerpo anti-AILIM".

\vskip1.000000\baselineskip

<1-3> Trasplante de hígado

Según el método descrito anteriormente por Kamada et al., se trasplantaron hígados de ratas donantes DA en ratas receptoras Lewis (Surgery, 93, p.64, 1983; Transplantation, 30, p.43, 1980; Transplantation, 28, p.47, 1979).

Específicamente, los hígados obtenidos de ratas DA se lavaron limpiando con un chorro de agua destilada estéril helada desde la vena porta. A continuación, se inició el trasplante de los hígados a las ratas Lewis receptoras cosiendo la vena cava suprahepática. Después, usando la técnica del manguito, se cosieron la vena porta y la vena cava infrahepática (Transplant. Proc., 19, p.1158, 1987; Transplantation, 43, p.745, 1987).

Si las ratas receptoras murieron en los 3 días posteriores a la terminación del trasplante, se determinó que esto era un fallo técnico del trasplante. Como resultado, la tasa de éxito del trasplante fue del 95%.

\vskip1.000000\baselineskip

<1-4> Administración del anticuerpo anti-AILIM y/o un agente inmunosupresor

Después de terminar el trasplante, se administraron el anticuerpo anti-AILIM y/o el agente inmunosupresor FK-506 a cada una de las ratas Lewis (cada grupo contenía de 5-9 animales) en las dosis y los tiempos descritos posteriormente. El día en que se completó el trasplante se contó como día cero (0).

El grupo al que no se administró ni el anticuerpo anti-AILIM ni el agente inmunosupresor FK-506 se usó como control.

1. Anticuerpo anti-AILIM (1 mg/kg; inyección intravenosa, día 0).

2. Anticuerpo anti-AILIM (1 mg/kg; inyección intravenosa, días 0 y 6).

3. Anticuerpo anti-AILIM (1 mg/kg; inyección intravenosa, días 0, 3 y 6).

4. Anticuerpo anti-AILIM (1 mg/kg; inyección intravenosa, días 0, 3, 6, 9 y 12).

5. Anticuerpo anti-AILIM (0,3 mg/kg; inyección intravenosa, días 0, 3, 6, 9 y 12).

6. FK-506 (1 mg/kg, inyección intramuscular; día 0).

7. Anticuerpo anti-AILIM (1 mg/kg; inyección intravenosa, día 0) y FK-506 (1 mg/kg, intramuscular; día 0).

\vskip1.000000\baselineskip

La duración de la supervivencia del injerto del hígado trasplantado en el receptor se evaluó y determinó según la prueba de Kaplan-Meier.

\vskip1.000000\baselineskip

<2> Resultados

Los resultados se muestran en la figura 1 y la figura 2. Partes de los datos en la figura 2 son actualizaciones de los datos en la figura 1.

Como resultado, en el grupo al que se administró el anticuerpo anti-AILIM (1 mg/kg) 3 veces o 5 veces a lo largo del tiempo que siguió al trasplante, se observó una prolongación significativa de la supervivencia del injerto del hígado trasplantado comparado con la del control.

Además, en el grupo en el que se administró una dosis baja de anticuerpo anti-AILIM (0,3 mg/kg) 5 veces a lo largo del tiempo después del trasplante, también se observó una prolongación significativa similar de la supervivencia del injerto del hígado trasplantado.

Además, sorprendentemente, cuando el anticuerpo anti-AILIM se administró incluso solo una vez en combinación con FK-506, que es un agente inmunosupresor clínicamente usado para múltiples fines, la supervivencia del injerto del hígado trasplantado se prolongó mucho, que fue significativamente más larga que cuando sólo se administró FK-506 (1 mg/kg) una vez.

A partir de estos resultados, se reveló lo siguiente.

1) El anticuerpo anti-AILIM suprime significativamente el rechazo a injerto (rechazo inmunológico) que acompaña al trasplante de un injerto tal como un órgano.

2) El rechazo a injerto que acompaña al trasplante de un injerto tal como un órgano se puede suprimir adicionalmente usando el anticuerpo anti-AILIM en combinación con un agente inmunosupresor, comparado a cuando sólo se usa uno de ellos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Supresión del rechazo inmunológico por una sustancia moduladora de AILIM en trasplante de corazón (parte 1) <1> Reactivos, animales y métodos de prueba <1-1> Animales

Se usaron ratones adultos C3H/He (machos, 6 semanas de edad) y ratones adultos BALB/c (machos, 6 semanas de edad) como receptores y donantes, respectivamente.

\vskip1.000000\baselineskip

<1-2> Preparación de un anticuerpo monoclonal anti-AILIM de ratón

La preparación se hizo como sigue.

Usando el ADNc que codifica la secuencia de aminoácidos de longitud completa de AILIM de ratón previamente descrita (Int. Immunol., Vol. 12, No.1, p.51-55, 2000), se preparó una célula transformada que expresaba AILIM de ratón según métodos estándar usando tecnología de recombinación genética.

La célula transformada se homogenizó y se ultracentrifugó (100.000 x g) y el residuo centrifugado que contenía la fracción de membrana celular se recogió y resuspendió en PBS. La fracción de membrana celular obtenida se inyectó junto con adyuvante de Freund completo en la almohadilla plantar de una rata Wistar para la inmunización inicial (día 0). Además, la fracción de membrana celular se administró como antígeno en la almohadilla plantar con intervalos, en el día 7, día 14 y día 28. Dos días después de la inmunización final, se recogieron las células e los ganglios
linfáticos.

Se mezclaron las células de los ganglios linfáticos y células de mieloma de ratón PAI (JCR No. B0113; Res. Disclosure, Vol.217, p.155, 1982) en una relación 5:1 y se preparó un hibridoma productor de anticuerpo mediante fusión de las células usando polietilenglicol 4000 (Boehringer Mannheim) como agente de fusión. La selección de hibridomas se realizó mediante cultivo en medio ASF104 que contenía HAT (Ajinomoto) con suero bovino fetal al 10% y aminopterina.

Se midieron las intensidades de fluorescencia de las células teñidas haciendo reaccionar los sobrenadantes de cultivo de cada hibridoma con las células transfectadas que expresaban AILIM de ratón mencionadas anteriormente y después haciéndolas reaccionar con IgG anti-rata marcada con FITC (Cappel) usando el citómetro de flujo EPICS-ELITE para confirmar la reactividad de los anticuerpos monoclonales producidos en el sobrenadante del cultivo de cada hibridoma contra AILIM de ratón. Como resultado, se obtuvieron varios hibridomas que producían anticuerpos monoclonales que tenían reactividad hacia AILIM de ratón.

Uno de estos hibridomas se nombró "B10.5". Este hibridoma (de 10^{6} a 10^{7} células/0,5 mL/ratón cada uno) se inyectó por vía intraperitoneal en un ratón nu/nu ICR (hembra, de 7 a 8 semanas de edad). De diez a veinte días después, se realizó una laparotomía en el ratón con anestesia, y se llevó a cabo la preparación a gran escala de anticuerpo monoclonal de rata anti-AILIM de ratón (IgG2a) a partir de ascitis obtenidos según procedimientos estándar. De aquí en adelante, este anticuerpo se denomina simplemente "anticuerpo anti-AILIM".

\vskip1.000000\baselineskip

<1-3> trasplante de corazón

Siguiendo el método anteriormente descrito, se trasplantaron los corazones de ratones donantes BALB/c en los abdómenes de ratones receptores C3H/He. Se juzgó que la desaparición del latido del corazón trasplantado era la finalización del rechazo a injerto.

\vskip1.000000\baselineskip

<2> Experimento 1 (administración de anticuerpos anti-AILIM)

A cada ratón C3H/He (10 ratones) que había completado el trasplante, se le administró el anticuerpo anti-AILIM (10 mg/kg) inmediatamente después del trasplante (día 0; 200 \mug), el día 2 (200 \mug), día 4 (200 \mug), día 7 (200 \mug) y día 10 (100 \mug). El grupo al que no se administró anticuerpo anti-AILIM (25 ratones) se usó como control.

La duración de la supervivencia de injerto del corazón trasplantado en el receptor después del trasplante se evaluó y determinó según la prueba de Kaplan-Meier.

La duración media de la supervivencia del injerto del corazón trasplantado en los receptores fue como sigue:

\vskip1.000000\baselineskip

(Grupo al que se administró el anticuerpo anti-AILIM)

Duración de la supervivencia del injerto: 9 días en un ratón, 10 días en 3 ratones, 13 días en 4 ratones, 16 días en 2 ratones

\vskip1.000000\baselineskip

(Grupo control)

Duración de la supervivencia del injerto: 6 días en 2 ratones, 7 días en 9 ratones, 8 días en 7 ratones, 9 días en 3 ratones, 10 días en 4 ratones.

La duración de la supervivencia del injerto en el grupo control al que no se administró el anticuerpo anti-AILIM fue de 7,9 días, pero en contraste, fue de 12,3 días en el grupo al que se le administró el anticuerpo anti-AILIM, y se demostró una prolongación significativa de la supervivencia del injerto en el grupo con anticuerpo anti-AILIM administrado.

\vskip1.000000\baselineskip

<3> Experimento 2 (administración de anticuerpo anti-AILIM o AILIM-Ig)

Los animales (donantes y receptores) y el anticuerpo anti-AILIM usados fueron los mismos que los mencionados anteriormente. La AILIM-Ig usada en este examen era una proteína de fusión entre IgG-Fc y la región extracelular de AILIM de ratón preparada de forma similar a la descripción anterior (Solicitud internacional de patente No. WO98/38216; Solicitud europea de patente No. EP0984023).

El trasplante de corazón fue llevado a cabo de manera similar al experimento 1.

A cada ratón C3H/He que había completado el trasplante se le administró el anticuerpo anti-AILIM (100 \mug/día) o AILIM-Ig (100 \mug/día) por vía intraperitoneal inmediatamente después del trasplante (día 0), el día 2, día 4, día 7 y día 10. El grupo al que no se administró ni el anticuerpo anti-AILIM ni AILIM-Ig se usó como control.

La duración media de la supervivencia del injerto del corazón trasplantado en los ratones receptores fue aproximadamente de 7,7 días en el grupo control, mientras que en grupo al que se administró anticuerpo anti-AILIM fue aproximadamente de 40,9 días (valor intermedio: 29 días/valor máximo: 120 días) y en el grupo al que se administró AILIM-Ig fue de 30 días o más (valor intermedio: 20 días/valor máximo: 64 días) (Fig. 3 y Fig. 4). Es decir, tanto en el grupo al que se administró el anticuerpo anti-AILIM como en el grupo al que se administró AILIM-Ig se demostró una prolongación significativa de la supervivencia del injerto del corazón trasplantado.

Además, mediante la tinción con hematoxilina/eosina (tinción HE) según métodos estándar, se analizó el grado de infiltración de células que expresan AILIM (ICOS) en el corazón trasplantado en cada uno de los ratones control (sin tratamiento terapéutico después del trasplante de corazón) y los ratones a los que administró anticuerpo anti-AILIM después del trasplante.

Como resultado, en el grupo sin tratar, se observó una infiltración significativa de células que expresan AILIM (ICOS) así como necrosis del músculo cardíaco (parte teñida). Por otra parte, en el corazón trasplantado de un ratón al que se administró anticuerpo anti-AILIM, no se pudo observar necrosis del músculo cardíaco y se confirmó un descenso significativo de células que expresan AILIM (ICOS) (Fig. 5).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Supresión de rechazos inmunológicos por sustancias que modulan AILIM en trasplante de corazón y piel <1> Reactivos, animales y métodos de prueba <1-1> Vector de adenovirus

Se produjo un adenovirus recombinante que contenía un casete de expresión del ADNc que codifica hCTLA4-Ig (proteína de fusión que comprende la región extracelular de CTLA4 humana y Fc humana) o el gen de la \beta-galactosidasa (LacZ) de E. coli mediante recombinación homóloga entre el casete del cósmido de expresión pAdex/CAhCTLA4-Ig (Transplantation, Vol.68, No.6, p.758, 1999) y el genoma del adenovirus de la cepa parental (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.90, No.24, p.11498-11502, 1993).

A continuación, el virus recombinante se hizo proliferar en la línea celular 293 derivada de riñón humano. Se recogió el vector vírico preparado de esta manera y se almacenó mediante congelación a -80ºC. El adenovirus recombinante que contenía el ADNc de hCTLA4-Ig y el adenovirus recombinante que contenía LacZ se llamaron AdhCTLA4-Ig y AdLacZ, respectivamente.

\vskip1.000000\baselineskip

<1-2> Animales y anticuerpos

Se usaron ratas adultas macho (210-250 g) Lewis (RT1^{1}) como receptores, y se usaron ratas adultas macho (210-205 g) DA (RT1^{a}) o BN (RT1^{n}) como donantes.

Se usó el anticuerpo monoclonal de ratón anti-AILIM de rata preparado en el ejemplo 1.

\vskip1.000000\baselineskip

<1-3> Trasplante de corazón y piel y método de prueba

Siguiendo un método previamente descrito (J. Thorac. Cardiovasc. Surg., Vol.57, No.2, p.225-229, 1969), los corazones obtenidos de ratas DA se trasplantaron en el abdomen de ratas Lewis. Inmediatamente después del trasplante de corazón, se administraron un anticuerpo anti-AILIM de rata (1 mg/kg) y/o AdCTLA4-Ig (10^{9} unidades formadoras de placa; ufp) por vía intravenosa en una dosis única a las ratas receptoras.

El grupo de animales trasplantados a los que no se les administró ni el anticuerpo anti-AILIM de rata ni AdCTLA4-Ig, y el grupo de animales trasplantados al que en su lugar se les administró AdLacZ se usaron como controles. El método de tratamiento de cada grupo de animales es como se muestra a continuación.

Grupo 1: Alotrasplante (Lewis/DA) sin tratamiento inmunosupresor.

Grupo 2: Isotrasplante (Lewis/Lewis) sin tratamiento inmunosupresor.

Grupo 3: Alotrasplante (Lewis/DA) con administración de AdLacZ.

Grupo 4: Alotrasplante (Lewis/DA) con administración de AdCTLA4-Ig.

Grupo 5: Alotrasplante (Lewis/DA) con administración de anticuerpo anti-AILIM.

Grupo 6: Alotrasplante (Lewis/DA) con administración de AdCTLA4-Ig y anticuerpo anti-AILIM.

Se juzgó que la desaparición del latido del corazón trasplantado era el final del rechazo al injerto. El rechazo al injerto se confirmó analizando histológicamente células mononucleares que se infiltraban en el tejido cardíaco trasplantado y la necrosis de las células musculares mediante tinción HE según métodos estándar.

A continuación, a la pared torácica lateral de las ratas receptoras del grupo 4 y el grupo 6 en las que el corazón trasplantado sobrevivió un periodo largo, se les trasplantó un injerto de piel suficientemente grueso de una rata donante DA el día 140 a partir del trasplante de corazón. Después del trasplante de piel, no se realizó un tratamiento inmunosupresor con el anticuerpo anti-AILIM, AdCTLA4-Ig o similar. Se determinó el final de la duración de la supervivencia del injerto de piel cuando el grado de injerto de piel visualmente observable disminuyó al 10% o menos del estado inicial.

Después, el día 200 a partir del trasplante inicial del corazón de la rata DA, usando la técnica del manguito (Acta. Pathol. Microbiol. Scand. [A], Vol.79, No.4, p.366-372, 1971), se trasplantó de nuevo el corazón de una rata donante DA en la región cervical de 3 ratas receptoras del grupo 6 que indicaron rechazo a injerto después de recibir trasplante de piel donante.

Además, el día 150 a partir del trasplante inicial de corazón de ratas donantes DA, se trasplantaron corazones de ratas donante BN en las ratas receptoras restantes del grupo 6 en las que el corazón trasplantado sobrevivió durante un periodo largo.

Se realizó la evaluación estadística del grado de supervivencia del injerto en los receptores según la prueba de Kaplan-Meier.

\vskip1.000000\baselineskip

<2> Resultados del examen

Como se muestra en la figura 6, no se observó una prolongación significativa de la supervivencia del injerto del corazón trasplantado en receptores comparados con el grupo de animales sin tratar en los que se realizó xenotrasplante (grupo 1) en el grupo de animales a los que se administró AdLacZ (Grupo 3) ni en el grupo de animales a los se dio una única dosis de anticuerpo anti-AILIM (grupo 5).

Por otra parte, en el grupo de animales a los que se administró AdCTLA4-Ig (Grupo 4), la supervivencia del injerto del corazón trasplantado (inicialmente corazón de rata DA trasplantado) se prolongó significativamente (la media: aproximadamente 64 días). Además, en 3 ratas del grupo 4 (10 ratas), se observó la supervivencia del injerto del corazón trasplantado durante un periodo largo de de 100 días o más (Fig. 6).

Además, en el grupo de animales en los que se usaron en combinación AdCTLA4-Ig y anticuerpo anti-AILIM (grupo 6), la supervivencia del injerto del corazón trasplantado (corazón de rata DA inicial) se prolongó indefinidamente (300 días o más) en todos los receptores (Fig. 6).

En las ratas receptoras del grupo 4, el corazón trasplantado (inicialmente corazón de rata donante DA trasplantado) se rechazó junto con el rechazo de piel trasplantada, mientras que en ratas receptoras del grupo 6, no se observó el rechazo del corazón trasplantado.

Como se muestra en la figura 7, en todas las ratas receptoras del grupo 4 y del grupo 6 que recibieron trasplante de piel de un donante, la piel trasplantada se rechazó. Sin embargo, al contrario que el grupo 4 y el grupo control en los que el rechazo de la piel trasplantada se completó en 12 días o menos a partir del trasplante de piel, la terminación del rechazo estuvo algo retrasada y se vio a los 16 días o menos en el grupo 6. Este resultado muestra que el uso combinado de AdCTLA4-Ig y anticuerpo anti-AILIM puede retrasar el rechazo de la piel injertada comparado con el caso en que AdCTLA4-Ig se usa sola.

De forma interesante, en las ratas receptoras del grupo 6 en el que se confirmó la supervivencia a largo plazo del corazón trasplantado (corazón de rata DA inicial), la piel trasplantada se rechazó por completo como se ha mencionado anteriormente, pero se vio supervivencia del injerto durante un periodo indefinido en el segundo corazón trasplantado (corazón de rata donante DA trasplantado la segunda vez). Además, en las ratas receptoras, el corazón donante trasplantado inicialmente sobrevivió a lo largo de todo el examen.

En el receptor del grupo 6 a los que se trasplantaron corazones de ratas donantes BN, los corazones de ratas DA inicialmente trasplantados continuaron latiendo y sobrevivieron durante el examen, pero los corazones de ratas donan-
tes BN trasplantados la segunda vez se rechazaron en un periodo similar a los resultados de los animales del grupo 1.

Aplicabilidad industrial

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son extremadamente útiles en la supresión, prevención y/o tratamiento de rechazo inmunológico (rechazo a injerto), un problema serio que acompaña a las terapias mediante trasplante (alotrasplante o xenotrasplante) de órganos (hígado, corazón, pulmones, riñones, páncreas, etc.), partes de los mismos o tejidos (piel, córnea, hueso, etc.) de donantes a receptores afectados por enfermedades cardiovasculares graves.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención también pueden suprimir más intensamente los rechazos a injertos cuando se usan en combinación con agentes inmunosupresores existentes que se administran para suprimir rechazos a injerto (rechazos inmunológicos) en tales terapias de trasplante.

Además, una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano contra AILIM incluido en las composiciones farmacéuticas de esta invención es un medicamento extremadamente útil, porque no produce efectos secundarios tal como alergia cuando el anticuerpo derivado de ratón se administra a seres humanos.

Claims (9)

1. Una sustancia que tiene una actividad de modular la transducción de señales mediada por AILIM para aumentar el efecto de uno o más agente(s) inmunosupresor(es) sobre la supresión, tratamiento o prevención del rechazo a injerto que acompaña el trasplante de un órgano, una parte del mismo o un tejido, dicha sustancia se selecciona de cualquiera de (a) a (e):

(a)

un anticuerpo que se une a AILIM, o una parte de dicho anticuerpo;

(b)

un polipéptido que comprende el total o una parte de la región extracelular de AILIM;

(c)

un polipéptido de fusión que comprende el total o una parte de una región extracelular de AILIM y el total o un parte de una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina;

(d)

un polipéptido que se une a AILIM; y

(e)

un ADN antisentido o un ARN antisentido contra AILIM.

\vskip1.000000\baselineskip

2. La sustancia de la reivindicación 1, en donde dicho agente inmunosupresor es uno o más agente(s) terapéuti-
co(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en azatioprina, esteroide corticosuprarrenal, ciclosporina, mizorribina y tacrolimus (FK-506), micofenolato de mofetilo, leflunomida, sirolimus, desoxiespergualina, FTY720 y un fármaco de CTLA4.

3. La sustancia de la reivindicación 1 ó 2, para su uso en combinación con tacrolimus (FK-506) y/o un fármaco de CTLA4.

4. La sustancia de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho trasplante es alotrasplante.

5. La sustancia de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho trasplante es xenotrasplante.

6. La sustancia de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha sustancia es un anticuerpo que se une a AILIM, o una parte de dicho anticuerpo.

7. Una combinación farmacéutica de una sustancia que tiene una actividad de modular la transducción de señales mediada por AILIM y uno o más agente(s) inmunosupresor(es), en donde dicha sustancia se selecciona de cualquiera de los siguientes de (a) a (e):

(a)

un anticuerpo que se une a AILIM, o una parte de dicho anticuerpo;

(b)

un polipéptido que comprende el total o una parte de la región extracelular de AILIM;

(c)

un polipéptido de fusión que comprende el total o una parte de una región extracelular de AILIM y el total o un parte de una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina;

(d)

un polipéptido que se une a AILIM; y

(e)

un ADN antisentido o un ARN antisentido contra AILIM.

\vskip1.000000\baselineskip

8. La combinación farmacéutica de la reivindicación 7, en donde dicho agente inmunosupresor es uno o más agen-
te(s) terapéutico(s) seleccionado(s) del grupo que consiste en azatioprina, esteroide corticosuprarrenal, ciclosporina, mizorribina y tacrolimus (FK-506), micofenolato de mofetilo, leflunomida, sirolimus, desoxiespergualina, FTY720 y un fármaco de CTLA4.

9. La combinación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en donde dicha sustancia es un anticuerpo que se une a AILIM o una parte de dicho anticuerpo.