ES2292746T3 - Anticuerpo monoclonal anti-cd40. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo para CD40 humano que tiene secuencias de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por un hibridoma 4D11 con el No. de acceso de FERM BP-7758.

Description

Anticuerpo monoclonal anti-CD40.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo o a un fragmento funcional del mismo que reconoce un antígeno CD40 humano presente en la superficie de las células B, células dendríticas (CD) humanas y similares. Específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-CD40 humano o a un fragmento funcional del mismo que es sustancialmente antagonista a un antígeno CD40 humano en la superficie de las células dendríticas (CD), y un anticuerpo anti-CD40 humano agonista o un fragmento funcional del mismo que se espera que tenga un efecto terapéutico mayor que el de los anticuerpos anti-CD40 humanos convencionales.

Antecedentes técnicos 1. CD40

CD40 es un antígeno con un peso molecular de 50 kDa que está presente en la superficie de la membrana celular. CD40 se expresa en células B, células dendríticas (CD), ciertos tipos de células cancerosas, y células epiteliales del timo. Se sabe que CD40 juega un papel importante en la proliferación y diferenciación de células B y CD. CD40 se ha identificado como un antígeno que se expresa en la superficie de las células B humanas (E.A. Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986; I. Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989). Basado en la homología de la secuencia de aminoácidos, se piensa que CD40 es un miembro de la familia del receptor de TNF, a la que pertenecen el receptor de baja afinidad de NGF, el receptor de TNF, CD27, OX40, CD30 y similares. Recientemente se ha clonado el gen de un ligando (CD40L) para CD40 humano y de ratón, revelando que es una proteína de membrana de tipo II, y se expresa en células T CD4+ activadas. También se ha mostrado que CD40L introduce señales de activación fuertes en células B humanas y de ratón.

La expresión de CD40 se ha confirmado con mayor frecuencia en células dendríticas que en células B, de modo que se ha puesto de manifiesto que CD40 juega un papel importante. La unión de CD40 con CD40L produce la activación de las células presentadoras de antígeno (CPA). Específicamente, aumenta la expresión de moléculas de coestimulación tales como CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2), o la producción de IL-12 (Caux, C., et al.: Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J. Exp. Med. 180:1263, 1994), (Shu, U., et al.: Activated T cells induce interleukin-12 production by monocyte via CD40-CD40 ligand interaction. Eur. J. Immunol. 25:1125; 1995). Las células dendríticas muestran una gran capacidad presentadora de antígeno, y tienen una gran capacidad de activar células T auxiliares (Th). Además, se cree que las células dendríticas controlan la diferenciación de células Th indiferenciadas a células Th1 o Th2. Cuando se hacen madurar células dendríticas (CD1) cultivando monocitos de sangre periférica que son células dendríticas mieloides en presencia de GM-CSF e IL-4 y utilizando CD40L, las CD1 in vitro son capaces de producir IL-12, estimular y activar células Th indiferenciadas alogénicas, y así inducir células T productoras de IFN\gamma (específicamente, promueve la diferenciación a Th1). Puesto que esta acción se inhibe por anticuerpos anti-IL-12, la reacción puede estar mediada por IL-12. Por otra parte, cuando se preparan células dendríticas linfoides (CD2) cultivando regiones de tejido T linfático o células T plasmacitoides presentes en la sangre periférica con IL-3 y ligandos de CD40, las CD2 son incapaces de producir IL-12, estimular y activar células Th indiferenciadas alogénicas, inducir células T productoras de IL-4, y promover de este modo la diferenciación a Th2. Se piensa que las células Th1 están implicadas en la activación de la inmunidad celular, y que las células Th2 están implicadas en el aumento de la capacidad para la inmunidad humoral así como en la supresión de la capacidad para la inmunidad celular. Las células T citotóxicas (LCT) activadas con la ayuda de las células Th1 pueden eliminar factores etiológicos (muchos virus, Listeria monocytogenes, bacilo de la tuberculosis, protozoos toxoplasma y similares) que se multiplican en el citoplasma y células tumorales.

Se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales anti-CD40 que reconocen CD40 expresado en las superficies de membranas ejercen una variedad de actividades biológicas en células B. Los anticuerpos monoclonales anti-CD40 se clasifican en su mayor parte en anticuerpos agonistas y antagonistas que tienen efecto sobre la interacción entre CD40 y CD40L.

2. Anticuerpo agonista

La activación de células B se conoce como una acción de los anticuerpos agonistas. Por ejemplo, se ha publicado que anticuerpos anti-CD40 inducen adhesión celular (Barrett et al., J. Immunol. 146: 1722, 1991; Gordon et al., J. Immunol. 140: 1425, 1988), aumentan el tamaño celular (Gordon et al., J. Immunol. 140: 1425, 1988; Valle et al., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989), inducen la división de células B que se activan solo con anticuerpos anti-IgM, anticuerpos anti-CD20 o ésteres de forbol (Clark y Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986; Gordon et al., LEUCOCYTE TYPING III. A.J. McMicheal ed. Oxford University Press. Oxford, p.426; Paulie et al., J. Immunol. 142: 590, 1989), inducen la division de células B en presencia de IL-4 (Valle et al., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989; Gordon et al., Eur. J. Immunol. 17: 1535, 1987), inducen la expresión de IgE (Jabara et al., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990; Gascan et al., J. Immunol. 147: 8, 1991), IgG e IgM (Gascan et al., J. Immunol. 147: 8, 1991) en células estimuladas con IL-4 y cultivadas sin células T, aumentan la secreción y la expresión en la célula (Challa A, Allergy, 54: 576, 1999) de CD23/Fc\varepsilon RII soluble de células B por IL-4 (Gordon y Guy, Immunol. Today 8: 339, 1987; Cairns et al., Eur. J. Immunol. 18: 349, 1988), y promueven la producción de IL-6 (Clark y Shu, J. Immunol. 145: 1400, 1990). Además, se ha descrito que se han establecido clones de células B a partir de cultivos primarios humanos de células B añadiendo IL-4 y anticuerpos anti-CD40 en presencia de células de adhesión CDw32+ (Bancherau et al., Science 241: 70, 1991), y la inhibición de la apoptosis de las células del centro germinativo está mediada por CD40, indiferente a la función del receptor del antígeno (Liu et al., Nature 342: 929, 1989). Como se ha descrito anteriormente, CD40 se ha identificado como un antígeno expresado en la superficie de las células B humanas. De este modo, la mayoría de los anticuerpos aislados se han evaluado principalmente utilizando como indicadores la función para inducir la proliferación y diferenciación de células B humanas y la actividad para inducir muerte celular en células cancerosas (Katira, A. et al., LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, et al. eds. p. 547. Oxford University Press. Oxford; W.C. Flansow et al., LEUKOCYTE TYPING V. S. F. Schlossossman, et al. eds. p. 555. Oxford University Press. Oxford; J. D. Pound et al., Internacional Immunology, 11: 11, 1999).

Se ha mostrado que los anticuerpos anti-CD40 producen la maduración de CD (Z.H. Zhou et al., Hybridoma, 18: 471, 1999). Además, se ha descrito el papel de las células T CD4 en la sensibilización específica de antígeno de células T CD8 para activar CD a través de la señalización CD40-CD40L. Se mostró que el papel de las células T CD4 auxiliares en la activación de células dendríticas (CD) se puede reemplazar mediante el de los anticuerpos monoclonales (Abm) anti-CD40 (Shoenberger, S.P., et al.: T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions. Nature, 480, 1998). Además, se mostró en ratones que el organismo se puede proteger no solo de células tumorales que expresan CD40 sino también de células tumorales que no expresan el mismo mediante la administración de anticuerpos anti-CD40 (French, R.R. et al.: CD40 antibody evokes a cytotoxic T-cell response that erradicates lymphoma and bypasses T-cell help. Nature Medicine, 5, 1999).

La mayoría de los anticuerpos descritos hasta la fecha no se han aislado utilizando el efecto sobre CD como indicador. Sin embargo, en términos de las modificaciones de las funciones de CD, los anticuerpos seleccionados por su acción sobre células B son probablemente insuficientes como agentes terapéuticos. Se ha publicado que entre los anticuerpos monoclonales contra CD40 de ratón, existen clones que reaccionan con CD, pero no reaccionan con células vasculares endoteliales, y, a la inversa, clones que no reaccionan con CD, pero reaccionan con células vasculares endoteliales, dependiendo de los epítopos que reconozcan los anticuerpos (Van Den Berg, TK et al., Immunology, 88: 294, 1996). También se asume que la unión y acción de los anticuerpos humanos contra CD40 a las CD difiere dependiendo de los epítopos.

Se sabe que los anticuerpos anti-CD40 o ligandos de CD40 pueden suprimir la proliferación de líneas celulares de linfoma que expresan CD40 y así puede inducir muerte celular (Funakoshi S et al., Blood, 83: 2782, 1994; Funakoshi S et al., Journal of Immunotherapy, 19: 93, 1996; Z.H. Zhou et al., Hybridoma, 18: 471, 1999; y Joseph A et al., Cancer Research, 60: 3225, 2000). Lo que es interesante sobre los anticuerpos agonistas es que la función de los anticuerpos no coincide siempre con la de CD40L. La acción de activar células B tampoco coincide con la acción de suprimir el crecimiento tumoral de células B. Se quieren desarrollar anticuerpos que tengan tanto la capacidad de activar CD como la acción de suprimir la proliferación de células tumorales. Además, entre los anticuerpos agonistas, están presentes tanto los anticuerpos que inhiben como aquellos que no inhiben la unión de CD40L a CD40 (Challa et al., Allergy, 54: 576, 1999). Por ejemplo, los anticuerpos producidos por G28-5 (ATCC No. HB-9110) compiten con CD40L, de modo que no hay efecto que resulta del uso combinado con CD40L. El grado de activación de las células que expresan CD40 difiere dependiendo de los anticuerpos. Incluso cuando los anticuerpos muestran actividad agonista débil independientemente, el uso combinado de los anticuerpos con ligandos de CD40 puede promover de forma más significativa la actividad en presencia de los anticuerpos, que la actividad resultante de los ligandos de CD40 solos. Por el contrario, incluso cuando los anticuerpos exhiben actividad agonista independientemente, la inhibición de los ligandos de CD40 puede disminuir la actividad en presencia de los anticuerpos en un grado mayor que la actividad resultante de los ligandos de CD40 solos (Pound et al., International Immunology, 11: 11, 1999). Se ha mostrado que con anticuerpos que no compiten con los ligandos de CD40, se puede alcanzar una mayor supresión de la proliferación en presencia de los ligando de CD40, aunque la acción supresora de la proliferación de células tumorales del anticuerpos sea débil por si misma (Joseph A et al., Cancer Research, 60: 3225, 2000). De acuerdo con esto, se quieren desarrollar anticuerpos que se unan a CD40 para suprimir independientemente la proliferación celular, pero que no inhiban la unión de los ligandos de CD40 a CD40. Tomando toda la ventaja de tales características, existe una posibilidad de desarrollar un agente terapéutico que sea más eficaz que el CD40L soluble. Por ejemplo, el CD40L soluble se activa mediante unión con CD40, y al mismo tiempo, suprime la función del CD40L presente in vivo. Un anticuerpo que no compita con CD40L, no produce tal supresión, y tiene mejores efectos terapéuticos de lo que se puede esperar por el efecto sinergístico.

3. Anticuerpo antagonista

Mientras tanto, como se ha descrito anteriormente, se espera que puesto que CD40 juega un papel importante en la reacción inmune, se puedan desarrollar agentes terapéuticos para la inmunosupresión tras el trasplante de un órgano y contra la enfermedad inmune inhibiendo la unión de CD40 con su ligando. Sawada-Hase y col., han descrito que la proporción de células que expresan niveles altos de CD40 aumentó en monocitos de sangre periférica de pacientes con la enfermedad de Crohn. Sin embargo, los anticuerpos que inhiben la unión de CD40 con su ligando no se comprenden bien. Por ejemplo, tales anticuerpos que inhiben la unión pueden ser eficaces para el análisis funcional de CD40, y la terapia para la enfermedad, para la que se requiere la activación de CD40. Además, también se ha mostrado que los anticuerpos que inhiben los ligandos de CD40 tienen el potencial de ser eficaces como agentes contra enfermedades en las que está implicada la unión de CD40 con los ligandos de CD40. Sin embargo, se ha comunicado que CD40L se expresa en plaquetas sanguíneas activadas (V. Henn et al., Nature 391: 591, 1998). De este modo, se ha descrito que existe un riesgo de causar trombos, si se usan anticuerpos anti-CD40L como agente terapéutico (T. Kawai et al., Nat. Medi. 6: 114, 2000). Desde ese punto de vista, se puede esperar que los anticuerpos contra CD40 sean más seguros que los anticuerpos contra CD40L, como un agente terapéutico anticuerpo que inhibe la unión de CD40 con su ligando. Los anticuerpos anti-CD40 se requieren para suprimir la unión de CD40L a CD40, y no para activar CD40 por el propio anticuerpo.

Aunque en el pasado se han llevado a cabo un gran número de estudios acerca de los anticuerpos que se unen específicamente a CD40 humano y suprimen la unión de CD40L a CD40 sin activar CD40, solo se ha descrito un caso individual, que es un anticuerpo de ratón anti-CD40 humano, denominado 5D12 (J. Kwekkeboom et al., Immunology 79: 439, 1993). Además, no se ha sabido si los anticuerpos que muestran actividad de neutralización para las células B también pueden mostrar lo mismo para CD esto es, si los anticuerpos pueden neutralizar la acción de los ligandos de CD40. Además, se ha publicado que la acción de los anticuerpos anti-CD40 de ratón biotinilados se aumenta mediante entrecruzamiento con avidina (Johnson et al., Eur. J. Immunol. 24: 1835, 1994). Se aumentó la acción de ligandos solubles de CD40 contra un línea de células B (células Ramos) utilizando anticuerpos (M2) contra etiquetas (FLAG), que se habían proporcionado previamente a los ligandos solubles mediante técnicas de ingeniería genética, y se midió la actividad de neutralización. De este modo, se confirmó que 5D12 (ATCC No. HB-11339) muestra solo una ligera actividad de neutralización.

Se ha encontrado recientemente que 5D12, un anticuerpo antagonista, tiene actividad agonista propia, como resultado del entrecruzamiento incluso en ausencia de CD40L. Tradicionalmente, se ha descrito que la acción de los anticuerpos CD40 de ratón se aumenta mediante entrecruzamiento de biotina con avidina (Johnson et al., Eur. J. Immunol. 24: 1835, 1994). Además, se sabe que pasar los anticuerpos contra CD40 a fase sólida utilizando anticuerpos anti-inmunoglobulina en fase sólida en una placa lleva a un aumento en la actividad para suprimir la proliferación de células tumorales. Se piensa que esto es un efecto que resulta de la transformación a fase sólida. Sin embargo, no se sabe si cuando se añaden anticuerpos anti-inmunoglobulina a una solución de cultivo para el entrecruzamiento de anticuerpos anti-CD40, puede ser posible incluso para anticuerpos antagonistas mostrar actividad agonista. Si los anticuerpos que se van a utilizar para la terapia tienen antigenicidad, se puede dar un efecto totalmente contrario, de modo que se producen en el cuerpo humano anticuerpos que se unen a los anticuerpos contra CD40, y con los que los anticuerpos contra CD40 se entrecruzan, de modo que se produce una actividad aparentemente igual a la de los ligandos de CD40. De acuerdo con esto, en vista de la seguridad de un agente terapéutico, es muy importante mantener la antigenicidad de los anticuerpos a un nivel bajo. Se considera un caso en donde se desarrolla un agente terapéutico mediante la tecnología de humanización basada en la secuencia de una región variable de un anticuerpo de ratón. Puesto que se sabe que los anticuerpos humanizados tienen inmunogenicidad, se pueden producir anticuerpos anti-CD40 anti-humanizados después de la administración. Específicamente, puede existir un riesgo de que los anticuerpos se transformaran en anticuerpos agonistas. Incluso si la antigenicidad es baja, los anticuerpos anti-CD40 se pueden entrecruzar con receptores de anticuerpo (FcR). Desde estos hechos, un anticuerpo agonista preferido es un anticuerpo humano, que se une específicamente a CD40, suprimiendo la unión de CD40L, y que no activa CD40 incluso mediante entrecruzamiento, y muestra una unión débil a FcR.

Compendio de la invención

Según se ha descrito anteriormente, se han analizado cada vez más las funciones de las CD recientemente, de modo que se ha empezado a reconocer a CD40 como un gen importante en el control de las funciones de las CD. Empezando desde estos antecedentes, el propósito de la presente invención es proporcionar mediante el uso de un sistema de evaluación utilizando las CD, un anticuerpo anti-CD40 humano o un fragmento funcional del mismo, que es sustancialmente antagonista también a un antígeno CD40 humano en la superficie de la célula dendrítica (CD), y un anticuerpo anti-CD40 humano agonista o un fragmento funcional del mismo que se espera que tenga un efecto terapéutico mayor que el de los anticuerpos anti-CD40 humanos convencionales.

Como resultado de los estudios intensos respecto a la preparación de anticuerpos contra CD40 humano, la presente invención se ha completado al tener éxito en la producción de un anticuerpo agonista y un anticuerpo antagonista nuevos que se piensa que tienen un efecto terapéutico contra enfermedades que es mayor que el de anticuerpos anti-CD40 convencionales conocidos. Esto es, la presente invención es como sigue.

(1) Un anticuerpo contra un CD40 humano, o un fragmento funcional del mismo, que tiene al menos una propiedad seleccionada de entre las siguientes propiedades (a) a (f) de:

(a)

actuar sobre células dendríticas para producir IL-12 en presencia LPS e IFN\gamma;

(b)

tener actividad para actuar sobre células dendríticas produciendo que las células maduren, que es mayor que la del anticuerpo G28-5;

(c)

tener actividad para promover que una línea de células B establecida exprese CD95, que es mayor que la del anticuerpo G28-5;

(d)

tener actividad que suprima la proliferación de una línea de células B establecida, que es mayor que la del anticuerpo G28-5;

(e)

inducir la muerte celular de una línea de células B establecida; y

(f)

no inhibir la unión de los ligandos de CD40 a CD40.

(2) El anticuerpo anterior o el fragmento funcional del mismo de la presente invención, en donde la maduración de las células dendríticas se realiza a una concentración de 20 \mug/ml o menos. Además, el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo promueven que la línea de células B establecida exprese CD95 a la concentración de anticuerpo de 20 \mug/ml o menos. Ejemplos de líneas de células B establecidas incluyen Ramos, HS-Sulton o similares.

(3) Además, el anticuerpo anterior o el fragmento funcional del mismo de la presente invención conduce a la producción de 100 pg/ml o más de IL-12cuando los anticuerpos se añaden a una concentración de 0.1 \mug/ml o más a células dendríticas con una concentración de 1x10^{6} células/ml, y la producción de 1000 pg/ml o más, preferiblemente de 10000 pg/ml o más de IL-12 cuando se añaden anticuerpos a una concentración de 1 \mug/ml o más.

(4) Además, el anticuerpo anterior o un fragmento funcional del mismo de la presente invención, dentro de un intervalo de concentración entre 0.01 \mug/ml y 10 \mug/ml, promueven que la línea de células B establecida (células Ramos) exprese CD95 con una eficacia aproximadamente 2-3 mayor o más que la que se expresa mediante un anticuerpo G28-5 como control. Por ejemplo, con una concentración de anticuerpo de 0.01 \mug/ml, se promueve la expresión con una eficacia aproximadamente de 2 a 6 veces mayor o más que la que se expresa mediante el anticuerpo G28-5 como control. Con una concentración de anticuerpo de 0.1 \mug/ml, se promueve la expresión con una eficacia aproximadamente de 2 a 7 veces mayor o más que la que se expresa mediante el anticuerpo G28-5 como control. Con una concentración de anticuerpo de 1 \mug/ml, se promueve la expresión con una eficacia aproximadamente de 2 a 7 veces mayor o más que la que se expresa mediante el anticuerpo G28-5 como control. Con una concentración de anticuerpo de 10 \mug/ml, se promueve la expresión con una eficacia aproximadamente de 2 a 6 veces mayor o más que la que se expresa mediante el anticuerpo G28-5 como control.

(5) Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, que tiene las secuencias de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo que se produce por un hibridoma KM302-1 (No. de acceso: FERM BP-7578), KM341-1-19 (No. de acceso: FERM BP-7759), 2105 (No. de acceso: FERM BP-8024) o F1-102 (No. de acceso: ATCC PTA-3337); que se describen por comparación.

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(6) Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, que tiene las secuencias de aminoácidos de las partes maduras de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por un hibridoma F2-103, que están codificadas respectivamente por ADNs plasmídicos con los No. de acceso ATCC PTA-3302 y ATCC PTA-3303; una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por un hibridoma F5-77, que están codificadas respectivamente por ADNs plasmídicos con los No. de acceso ATCC PTA-3304 y ATCC PTA-3305; o una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por un hibridoma F5-157, que están codificadas respectivamente por ADNs plasmídicos con los Nos de acceso ATCC PTA-3306 y ATCC PTA-3307, descritos por comparación.

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(7) Se describen por razones comparativas un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, que tiene las secuencias de aminoácidos de las partes maduras de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por el hibridoma KM341-1-19, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 28 y 30; una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por el hibridoma 2105, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 32 y 34; una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por el hibridoma 110, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 36 y 38; una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por el hibridoma 115, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 40 y 42; una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por el hibridoma KM643-4-11, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 52 y 54; una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por el hibridoma F2-103, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 60 y 62; o una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por el hibridoma F5-77, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 64 y 66.

(8) Se describen por razones comparativas un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, que tiene las secuencias de aminoácidos de las partes maduras de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo codificadas por secuencias de ácidos nucleicos aisladas de un hibridoma KM341-1-19, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 27 y 29; una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera codificadas por secuencias de ácidos nucleicos aisladas de un hibridoma 2105, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 31 y 33; una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera codificadas por secuencias de ácidos nucleicos aisladas de un hibridoma 110, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 35 y 37; una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera codificadas por secuencias de ácidos nucleicos aisladas de un hibridoma 115, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 39 y 41; una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera codificadas por secuencias de ácidos nucleicos aisladas de un hibridoma KM643-4-11, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 51 y 53; una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera codificadas por secuencias de ácidos nucleicos aisladas de un hibridoma F2-103, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 59 y 61; o una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera codificadas por secuencias de ácidos nucleicos aisladas de un hibridoma F5-77, que están representadas respectivamente por SEQ ID NOS: 63 y 65.

(9) Un anticuerpo contra un CD40 humano, o un fragmento funcional del mismo, que tiene al menos una propiedad seleccionada de entre las siguientes propiedades (g) a (j) de:

(g)

neutralizar la acción de ligandos sobre CD40;

(h)

neutralizar o mitigar uno o más efectos que los ligandos, que son para CD40 en una línea de células B establecida, tienen sobre células que expresan CD40, y tienen una acción agonista sobre CD40 en la línea de células B establecida anterior más débil que la de 5D12 debido al entrecruzamiento por anticuerpos anti-inmunoglobulinas;

(i)

mitigar o neutralizar la acción de ligandos de CD40 en la línea establecida de células B para aumentar la expresión de CD95;

(j)

tener acción antagonista sobre CD40 expresado en células dendríticas.

(10) El anticuerpo o el fragmento funcional de (9) anteriormente puede suprimir la expresión de CD95 en células Ramos a un nivel aproximadamente del 10% o memos que el del control, cuando se añaden los anticuerpos con una concentración de 0.1 \mug/ml a las células Ramos con una concentración de 1x10^{6} células/ml suplementadas con una cantidad saturante de células que expresan CD40L; puede suprimir la expresión de CD95 en células Ramos al mismo nivel que el del control negativo, cuando se añaden los anticuerpos con una concentración de 1 \mug/ml; y puede suprimir la expresión de CD95 en células Ramos al mismo nivel que el del control negativo, cuando se añaden los anticuerpos con una concentración de 10 \mug/ml.

(11) El anticuerpo o el fragmento funcional de (9) anteriormente, en donde se suprime la proliferación de células B amigdalinas in vitro aproximadamente del 80 al 95% o más, cuando se añaden los anticuerpos con una concentración entre 0.001 \mug/ml y 10 \mug/ml a 1x10^{5} células B amigdalinas suplementadas con CD40L soluble (1 \mug/ml). Por ejemplo, cuando se añaden los anticuerpos con una concentración de entre 0.01 \mug/ml y 10 \mug/ml, se suprime la proliferación de células B amigdalinas aproximadamente en un 95% o más. En particular, cuando se añaden los anticuerpos con una concentración de 0.001 \mug/ml, se suprime la proliferación de células B amigdalinas aproximadamente en un 80% o más.

(12) Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, que tiene las secuencias de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por un hibridoma KM281-1-10 (No. de acceso: FERM BP-7579) descrito por razones comparativas, 4D11 (No. de acceso: FERM-BP-7758) o F4-465 descrito por razones comparativas (No. de acceso: ATTC PTA-3338).

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(13) Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, que tiene las secuencias de aminoácidos de las partes maduras de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por un hibridoma KM281-1-10, que están representadas respectivamente por las SEQ ID NOS: 44 y 46; una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por un hibridoma 4D11, que están representadas respectivamente por las SEQ ID NOS: 48 y 50; o una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por un hibridoma F-4-465, que están representadas respectivamente por las SEQ ID NOS: 56 y 58.

(14) Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, que tiene las secuencias de aminoácidos de las partes maduras de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera que están codificadas por secuencias de ácidos nucleicos aisladas de un hibridoma KM281-1-10, que están representadas respectivamente por las SEQ ID NOS: 43 y 45; una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo producido por un hibridoma 4D11, que están representadas respectivamente por las SEQ ID NOS: 47 y 49; o una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera que están codificadas por secuencias de ácidos nucleicos aisladas de un hibridoma F-4-465, que están representadas respectivamente por las SEQ ID NOS: 55 y 57.

(15) Los ejemplos del anticuerpo o del fragmento funcional del mismo de (1) a (14) anteriores incluyen anticuerpos humanos.

(16) Una composición farmacéutica, que contiene como principio activo el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de cualquiera de (1) a (15) anteriores.

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(17) Un agente inmunopotenciador, un agente antitumoral o un agente anti-enfermedad autoinmune, que contiene como principio activo el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de cualquiera de (1) a (8) anteriores.

(18) Un agente inmunosupresor, un agente anti-enfermedad autoinmune, un agente terapéutico contra alergias o un agente terapéutico contra el síndrome de inhibición del factor VIII de coagulación de la sangre, que contiene como principio activo el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de cualquiera de (9) a (14) anteriores.

(19) Aquí, se puede determinar un epítopo de un CD40 humano al que reconoce el anticuerpo monoclonal de la presente invención mediante un método conocido, tal como examinando la unión a oligopéptidos sintéticos que se solapan obtenidos a partir de la secuencia primaria de aminoácidos de CD40 humano (por ejemplo, Ed Harlow y David Lane (eds.) Antibodies: A Laboratory Manual, 1988 Cold Spring Harbor Laboratory Press; Patente de EE.UU. No. 4708871). También se puede utilizar un kit de librería de péptidos con el proceso de expresión en fagos (New England BioLabs) para cartografiar el epítopo. La presente invención también abarca un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que reconoce un epítopo nuevo de CD40 humano que el que reconoce un anticuerpo o fragmento funcional del mismo producido por cada uno de los hibridomas anteriores.

(20) La presente invención proporciona además un ácido nucleico (ARN o ADNc) que codifica al menos la región variable de una cadena pesada y/o cadena ligera de un anticuerpo aislado de cada uno de los hibridomas anteriores, un vector que contiene el ácido nucleico, y una célula huésped que lleva el ácido nucleico.

La presente invención se describirá en detalle. Esta especificación incluye parte del contenido o todo según se divulga en la especificación y/o figuras de la solicitud de PCT PCT/US01/13672 (registrada el 27 de abril de 2001), Solicitud de patente japonesa No. 2001-142482 (registrada el 11 de mayo de 2001), Solicitud de patente japonesa No. 2001-310535 (registrada el 5 de octubre de 2001), y solicitud de patente de EE.UU. USSN 10/040,244 (registrada el 26 de octubre de 2001) que son documentos de prioridad de la presente solicitud.

Como se describe más adelante, se ha encontrado que un anticuerpo monoclonal conocido 5D12 (ATCC No. HB-11339) que es antagonista de CD40 en células B no es antagonista de CD40 en CD. Se ha encontrado además que muchos anticuerpos monoclonales muestran actividad agonista propia como resultado del entrecruzamiento mediante anticuerpos anti-inmunoglobulina, incluso si son anticuerpos antagonistas que bloquean la acción de CD40L.

1. Definición

Los términos utilizados en esta especificación se definen como sigue.

El término "CD40 humano" en la presente invención significa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada por Clark y col., (E.A. Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4494, 1986) o Stamenkovic y col. (I. Stamenkovic et al. EMBO J. 8: 1403, 1989). Específicamente, el CD40 humano es un polipéptido antígeno que se expresa en la superficie de una célula B, CD, macrófago, célula endotelial, célula epitelial o células tumorales de estas células.

El término "anticuerpo monoclonal anti-CD40" significa cualquier anticuerpo monoclonal contra CD40 expresado por una célula, CD40 de secuencia completa o CD40 de secuencia parcial. Un anticuerpo monoclonal anti-CD40 más preferido se une a la parte extracelular de CD40 y proporciona una acción agonista o antagonista sobre las células que expresan CD40.

Además, el término "anticuerpo" en la presente invención se deriva de un gen (genéricamente denominado "gen de anticuerpo") que codifica una región variable de la cadena pesada, una región constante de la cadena pesada, una región variable de la cadena ligera y una región constante de la cadena ligera que componen una inmunoglobulina. El anticuerpo de la presente invención abarca un anticuerpo que es de cualquier clase de inmunoglobulinas y que tiene cualquier isotipo. El término "fragmento funcional" del anticuerpo en la presente invención es una parte (un fragmento parcial) de un anticuerpo según se ha definido anteriormente, y significa un fragmento que retiene una o más acciones del anticuerpo sobre el antígeno. Ejemplos específicos de tales fragmentos funcionales incluyen F(ab')_{2}, Fab', Fab, Fv, FVs con puentes disulfuro, FV de cadena sencilla (scFV), y polímeros de los mismos (D.J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, 1998, T.J. Internacional Ltd.).

El término "anticuerpo humano" en la presente invención significa un anticuerpo que es el producto de expresión de un gen de anticuerpo derivado de un ser humano.

El término "agonista" significa una acción que promueve la unión de ligandos de CD40 a CD40 expresado en la superficie de células tales como células B, células tumorales o células dendríticas, o una acción que proporciona a las células que expresan CD40 uno o más efectos que son proporcionados por ligandos de CD40 a las células que expresan CD40. El término "anticuerpo agonista" significa un anticuerpo que tiene tal acción agonista.

El término "antagonista" significa una acción que inhibe la unión de ligandos de CD40 a CD40 expresado en la superficie de células tales como células B, células tumorales o células dendríticas, o una acción que neutraliza uno o más efectos que son proporcionados por ligandos de CD40 a células que expresan CD40. El término "anticuerpo antagonista" significa un anticuerpo que tiene tal acción.

El término "células dendríticas (CD)" en la presente invención indica un grupo de células a las que también se refiere como leucocitos dendríticos que tienen una función acusada de presentación de antígenos. Las células dendríticas utilizadas aquí se inducen cultivando células precursoras CD34 positivas contenidas en, por ejemplo, médula ósea, sangre de cordón umbilical o sangre periférica. Alternativamente, las células dendríticas se pueden obtener cultivando los monocitos CD14 positivos de la sangre periférica en presencia de GM-CSF e IL-4.

El término "CD inmaduras" significa CD que son CD14 negativas, CD1a fuertemente positivas, CD83, CD86 positivas y MHC clase II positivas.

El término "CD maduras" significa CD que son CD14 negativas, CD1a positivas, y se han convertido en CD83, CD86 y MHC de clase II fuertemente positivas.

El término "activar CD" en la presente invención significa un cambio que se induce en las CD en respuesta a la estimulación por CD40. Por ejemplo, también significa que produce la maduración de CD inmaduras, la alta expresión de CD80, CD86 y HLA de clase II, y el aumento en la producción de IL-12. De forma alternativa, cuando coexisten células T, también significa estimular las células T para promover su proliferación.

El término "activar células B y una línea de células B" en la presente invención significa un cambio que se induce en las células respondiendo a la estimulación por CD40. Por ejemplo, significa producir síntesis de ADN, promover la incorporación de timidina, y de esta forma aumentar la cantidad de expresión de CD95.

2. Obtención del anticuerpo

Para obtener el anticuerpo de la presente invención, se prefiere inmunizar ratones utilizando como antígeno una línea celular de ratón con un gen recombinante que expresa un CD40 humano o un CD40 humano soluble que se ha producido y purificado con recombinantes. Se prefiere que los ratones que se usan para la inmunización produzcan anticuerpos humanos (Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000 Vol 97: 722). Seleccionando los anticuerpos monoclonales que se unen al CD40 soluble humano que se ha producido y purificado con recombinantes, se pueden obtener más fácilmente anticuerpos que también reaccionan con CD40 expresado en células diferentes de células B que en el caso en donde se seleccionan los clones que reaccionan específicamente con células B. Los hibridomas se pueden producir por el método de Kohler y Milstein y col. (Nature, 1975, Vol. 256: 495) usado generalmente en la producción de anticuerpos monoclonales utilizando las células de los ganglios linfáticos o del bazo de los ratones inmunizados.

Además, la unión de CD40L soluble a CD40 se analiza utilizando un sistema de resonancia de plasmón de superficie tal como BIAcore 2000 (Biacore), y se seleccionan entonces los anticuerpos que no compiten con CD40L. Además, se seleccionan los anticuerpos que suprimen independientemente la supresión del crecimiento celular de los linfomas de células B. Además, la selección de anticuerpos se realiza utilizando la condición de si actúan o no sobre CD como indicador. Esto permite la producción y selección de anticuerpos con las ventajas de actuar sobre células dendríticas o células B sin competir con CD40L, y suprimir la proliferación de células cancerosas que expresan
CD40.

El anticuerpo de la presente invención se obtiene cultivando el hibridoma así obtenido. Además, se clona un gen que codifica un anticuerpo monoclonal humano o una región variable del mismo a partir de una célula productora de anticuerpos tal como una célula B o un hibridoma, el gen clonado se incorpora en un vector apropiado, y el vector se introduce en un huésped (por ejemplo, una línea celular de mamífero, Escherichia coli, células de levadura, células de insecto o células de plantas), de modo que se puede preparar un anticuerpo recombinante producido mediante la tecnología de recombinación genética (P.J. Delves, ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES, 1997 WILEY; P. Shepherd y C. Dean, Monoclonal Antibodies, 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS; J.W. Goding, Monoclonal Antibodies: principles and practice, 1993 ACADEMIC PRESS). Además, se generan vacas, cabras, ovejas o cerdos transgénicos, en donde se incorpora un gen de anticuerpo diana en los genes endógenos mediante técnicas de generación de animales transgénicos. A partir de la leche de estos animales, se pueden obtener los anticuerpos monoclonales derivados del gen de anticuerpo en grandes cantidades. Cuando los hibridomas se cultivan in vitro, se hacen crecer, mantienen y almacenan en un forma adecuada para varias condiciones tales como las propiedades de las especies de células a cultivar, propósito de los experimentos y estudios, y métodos de cultivo. Entonces, los hibridomas se pueden cultivar utilizando cualquier medio nutriente que se induce y prepara a partir de un medio nutriente conocido o medio básico conocido que se utiliza para la producción de anticuerpos monoclonales en el sobrenadante del
cultivo.

3. Selección

La selección de los anticuerpos agonistas se lleva a cabo mediante análisis utilizando un linfoma de células B humano, de modo que se pueden seleccionar los anticuerpos que estimulan la expresión de CD95. Los anticuerpos se añaden además a un cultivo en solución de CD purificadas, y se seleccionan los anticuerpos que producen maduración. Alternativamente, se seleccionan los anticuerpos que muestran actividad de proliferación de células T en una reacción de linfocitos mixta utilizando CD inmaduras. Además, los anticuerpos se añaden a las CD maduras, y entonces se seleccionan los anticuerpos que tienen la actividad de estimular la producción de IL-12. Además, se seleccionan los anticuerpos que tienen la actividad de suprimir el crecimiento de células tumorales que expresan CD40 o la actividad de inducir muerte celular de las células tumorales. La competición con CD40L se puede distinguir de otros casos basado en si el anticuerpo inhibe o no la unión de CD40 soluble a los ligandos solubles de CD40 utilizando, por ejemplo, un sistema de resonancia de plasmón de superficie (BIAcore). De forma alternativa, también se puede distinguir de otros casos basado en si el anticuerpo aumenta o no la acción de los ligandos de CD40 en una línea de células B.

La selección de los anticuerpos antagonistas se lleva a cabo mediante análisis utilizando un linfoma de células B humano. La adición de CD40L soluble que tiene FLAG como una etiqueta en presencia de un anticuerpo anti-FLAG permite la selección de anticuerpos que inhiben con mayor fuerza la unión de CD40L soluble a CD40 en las células del linfoma de células B humano. Mediante la introducción de un gen que codifica CD40L en lugar de CD40L soluble, también es posible utilizar células recombinantes que expresan muchos ligandos de CD40 en la superficie celular. Posteriormente, los anticuerpos humanos se entrecruzan con anticuerpos anti-IgG humanos, de modo que se eliminan los clones que activan el linfoma de células B mediante el entrecruzamiento. Además, se seleccionan los anticuerpos que muestran la actividad de suprimir la proliferación de células T en una reacción de linfocitos mixta utilizando CD purificadas y maduras, o los anticuerpos que tienen la acción de suprimir la producción de IL-12 cuando se añaden ligandos de CD40 a CD maduras.

Los anticuerpos que se obtienen según se ha descrito anteriormente tienen al menos una de las siguientes propiedades que se creen que son terapéuticamente eficaces.

(1) En el caso de un anticuerpo agonista

(a) El anticuerpo actúa sobre células dendríticas para inducir la producción de IL-12 en presencia de LPS (lipopolisacárido) e IFN\gamma. La concentración de LPS en este caso se extiende desde 10 pg/ml hasta 10 ng/ml y la concentración de IFN\gamma se extiende desde 10^{-4} M hasta 10^{-2} M. Con una concentración de anticuerpo de 1 \mug/ml o más, o preferiblemente 0.1 \mug/ml o más, la cantidad de IL-12 producida es mayor que aquella en un ensayo utilizando el anticuerpo G28-5 como control, el anticuerpo anti-CD40 agonista conocido. Cuando los anticuerpos se añaden con una concentración de 0.1 \mug/ml o más a células dendríticas con una concentración de 1x10^{6} células/ml, se producen 100 pg/ml o más de IL-12, o cuando se añade lo mismo con una concentración de 1 \mug/ml o más, se producen 1000 pg/ml o más, preferiblemente 10000 pg/ml o más de IL-12 (ver Ejemplos 9 y 13).

(b) El anticuerpo tiene la acción de unión a células dendríticas y así producir la maduración de las células dendríticas. Además, cuando los anticuerpos con una concentración de 20 \mug/ml o menos, preferiblemente de 0.1 a 15 \mug/ml; más preferiblemente de 5 a 15 \mug/ml se cultivaron con células dendríticas, la actividad de producir maduración es mayor que aquella del anticuerpo G28-5 (ver Ejemplo 9).

(c) El anticuerpo tiene actividad de promover la expresión de CD95 de una línea de células B establecida, que es mayor que aquella del anticuerpo G28-5. En este caso, con una concentración de anticuerpo de 10 \mug/ml o más, preferiblemente 1 \mug/ml o más, más preferiblemente 0.1 \mug/ml o más, aún más preferiblemente 0.01 \mug/ml o más, y lo más preferiblemente 0.001 \mug/ml o más, la actividad de promover la expresión de CD95 es mayor que aquella del anticuerpo G28-5 que se usa como control en un ensayo. Las relaciones de la actividad del anticuerpo G28-5, que se utilizó en un ensayo como control, para promover la expresión de CD95 a la misma del anticuerpo con concentraciones de 10 \mug/ml, 1 \mug/ml, 0.1 \mug/ml y 0.01 \mug/ml se muestran a continuación (Tabla 1).

TABLA 1

5

La expresión promovida de CD95 significa que el anticuerpo activa la línea de células B establecida. Aquí, ejemplos de líneas de células B establecidas incluyen células Ramos y células HS-Sulton. Además, las células Ramos son de linfoma de Burkitt, que son células modelos de células B centroblásticas humanas. Las células HS-Sulton son de linfoma de Burkitt (ver Ejemplos 6 y 12).

(d) El anticuerpo tiene actividad para suprimir la síntesis de ADN, incorporación de timidina, y proliferación de una línea de células B establecida (células Ramos o células HS-Sulton), que es mayor que la del anticuerpo G28-5. La concentración del anticuerpo es en este caso de al menos 0.05 \mug/ml, o preferiblemente de 0.1 a 15 \mug/ml (ver
Ejemplo 8).

(e) El anticuerpo induce la muerte celular de la línea de células B establecida (ver Ejemplo 16).

(f) El anticuerpo no inhibe la unión de los ligandos de CD40 a CD40. El término "no inhibe" significa que CD40L se puede unir a CD40 en el mismo grado que cuando el anticuerpo está ausente, incluso cuando el anticuerpo se une previamente a CD40 (esto es, en presencia del anticuerpo). Tanto el ligando de CD40, como CD40 o ambos pueden ser un tipo de proteína que se expresa en la membrana o una proteína soluble (ver Ejemplo 11).

Los anticuerpos que tienen las propiedades anteriores se producen, por ejemplo, por un hibridoma KM302-1 (FERM BP-7578) y un hibridoma KM341-1-19 (FERM BP-7759).

Se determinaron las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada (cadena H) y la cadena ligera (cadena L) de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma KM341-1-19 (Ejemplo 17). La presente invención proporciona ADN que codifica al menos la región variable de la cadena pesada, o la secuencia completa de la cadena pesada, y ADN que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma KM341-1-19. Los ADNs también incluyen otros ADNs que codifican las mismas secuencias de aminoácidos debido a la degeneración de codones además de aquellas descritas en el Ejemplo 17. Además, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales o fragmentos funcionales de los mismos según se especifica mediante las secuencias de aminoácidos de al menos las regiones variables de la cadena pesada o las secuencias de aminoácidos de las secuencias completas de las cadenas pesadas, y las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera, según se divulga en el Ejemplo 17.

(2) En el caso de anticuerpo antagonistas

(g) El anticuerpo neutraliza la acción de los ligandos para CD40. Aquí, el término "la acción de los ligandos" significa tanto la acción de los ligandos expresados en células T u otras células, como la acción de los ligandos libres para CD40 (ver Ejemplos 7 y 14).

(h) El anticuerpo neutraliza uno o más de los efectos que tienen los ligandos para CD40 en la línea de células B establecida sobre células que expresan CD40, y no muestra acción agonista a CD40 en la línea de células B establecida anterior mediante entrecruzamiento por anticuerpos anti-inmunoglobulinas. Esta acción es más débil que la de 5D12. Los "efectos que tienen los ligandos sobre células que expresan CD40" significa la activación de las células que expresan CD40. Específicamente, en células B, el efecto significa la activación de la incorporación de timidina y la proliferación de las células B, y la activación de la expresión aumentada de CD95 en la línea de células B establecida. Además, en CD, el efecto significa la activación de la maduración de CD, la activación de la expresión aumentada de CD86 y HLA-DR, la activación de la incorporación de timidina por las células T coexistentes, la estimulación de la proliferación, la activación de la producción de IL-12 e IL-10, y similares. El entrecruzamiento por anticuerpos anti-inmunoglobulinas se realiza añadiendo anticuerpos anti-inmunoglobulina a una concentración de 0.1 \mug/ml o más a una solución de cultivo (ver Ejemplo 7).

(i) El anticuerpo mitiga o neutraliza la actividad del CD40L entrecruzado o del CD40L expresado por células para aumentar la expresión de CD95 en la línea de células B establecida. El anticuerpo también mitiga o neutraliza la actividad de CD40L, la acción del cual se aumenta mediante entrecruzamiento por anticuerpos y similares contra etiquetas. La unión de ligandos (incluyendo tanto los ligandos libres como los ligandos expresados por células específicas) de CD40 a células que expresan CD40 produce transducción de señales intracelulares, y finalmente produce que las células expresen CD95 (Fas) en la superficie de las células. De acuerdo con esto, el anticuerpo antagonista de la presente invención inhibe la transducción de señales anterior mediante su unión a CD40, neutralizando por lo tanto la expresión de CD95. La concentración del anticuerpo en este caso es de 1 \mug/ml o más, o preferiblemente 0.1 \mug/ml o más (ver Ejemplos 7 y 14).

(j) El anticuerpo es antagonista a CD40 en CD. Específicamente, el anticuerpo mitiga o neutraliza la actividad de CD40 sobre CD. Cuando las CD se estimulan mediante ligandos de las células T coexistentes con las CD, las células T se activan, de modo que se promueven la incorporación de timidina y similares. En la reacción de linfocitos mixta, en donde a las CD y las células T que derivan ambas de individuos diferentes se les permite coexistir, las CD interaccionan con las células T, produciendo de este modo la activación de las células T. El anticuerpo antagonista de la presente invención inhibe la interacción anterior mediante unión a CD40, lo que resulta en la supresión de la incorporación de timidina. La concentración del anticuerpo es en este caso de al menos 0.001 \mug/ml, o preferiblemente de 0.1 a 10 \mug/ml (ver Ejemplo 10).

El anticuerpo antagonista anterior se produce por, por ejemplo, hibridomas KM281-1-10 (FERM BP-7579) y KM281-2-10-1-2 (FERM BP-7580) (9 de mayo de 2001, Depositario Internacional de Organismos de Patentes (IPOD) en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki) y el inventivo 4D11 (FERM BP-7758).

(3) El anticuerpo de la presente invención puede ser cambiado a un anticuerpo de una subclase diferente (por ejemplo, ver la publicación EP314161), mediante modificación por técnicas de ingeniería genética conocidas por el experto en la materia, específicamente sustituyendo una región que define la subclase de una cadena pesada de un anticuerpo por una región que define otra clase. Una región variable de la cadena pesada y la región constante de otra subclase se pueden unir directamente. Por ejemplo, un cambio de la subclase del anticuerpo de la presente invención a IgG2 o IgG4 hace posible disminuir el grado de unión del anticuerpo al receptor Fc. Específicamente, se introduce un sitio Nhe I (GCTAGC) en una cadena pesada de un anticuerpo humano, en sitio de índice EU 118 (Ala), 119 (Ser) según Rabat y col. (Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Servicio Público de Salud, Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Md. (1991)). Se puede realizar, el cambio a otra subclase, IgG, mediante digestión utilizando la enzima de restricción, sin cambiar el aminoácido. Además, el cambio artificial de la secuencia de aminoácidos de una región constante, o la unión a una secuencia de la región constante que tiene tal secuencia cambiada con la región variable del anticuerpo de la presente invención puede disminuir el grado de unión al receptor Fc (Lund J. et al., J. Immunol. 1991, vol. 147: 2657-2662), o puede también aumentar o disminuir la actividad CDC (Tao M. et al., J. Exp. Med. 1991 vol. 1025-1028, Idusogie E.E. et al., J. Immunol 2001 vol 166: 2571-5). Además, para evitar la acción de ADCC, CDC o similares, solo se pueden seleccionar previamente los anticuerpos de las subclases IgG2 o IgG4. Además, la unión de un radionúclido, toxina bacteriana, quimioterapéutico, prodroga o similar con el anticuerpo de la presente invención puede aumentar más el efecto terapéutico contra enfermedades tales como el cáncer.

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4. Composición farmacéutica

El ámbito de la presente invención también abarca una composición farmacéutica que contiene una preparación farmacéutica que es el anticuerpo de la presente invención purificado. Tal composición farmacéutica contiene preferiblemente un diluyente o soporte fisiológicamente aceptable además del anticuerpo, o puede ser una mezcla con otros anticuerpos u otras drogas, como antibióticos. Ejemplos de los soportes apropiados incluyen, pero no están limitados a, una solución salina fisiológica, una solución salina tamponada con fosfato, una solución salina con glucosa tamponada con fosfato y una solución salina fisiológica tamponada. Alternativamente, el anticuerpo se liofiliza, y después se usa cuando es necesario añadiendo las soluciones acuosas tamponadas anteriores para su reconstrucción. Ejemplos de la vía de administración incluyen una vía oral y una vía parenteral incluyendo inyecciones o distribución de la droga intravenosa, intramuscular, hipodérmica e intraperitoneal.

En este caso, la dosis eficaz que se administra como una combinación de la dosis eficaz del anticuerpo de la presente invención, un diluyente apropiado, y un soporte farmacológicamente aceptable se extiende desde 0.1 mg a 100 mg por kg de peso corporal por administración. La administración se realiza a intervalos de 2 días hasta 8 semanas.

Cuando se usa una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo de la presente invención, y particularmente, cuando se usa un anticuerpo agonista, la composición se utiliza como una droga inmunopotenciadora (agente antiviral y droga antiinfecciosa), agente antitumoral, o agente anti-enfermedad autoinmune. Ejemplos múltiples de estas enfermedades pueden suceder juntos. Alternativamente, el anticuerpo también se puede usar como un adyuvante en combinación con una vacuna tal como un péptido específico de cáncer. Cuando la composición contiene el anticuerpo antagonista, es útil como un agente inmunosupresor (agente profiláctico o terapéutico contra el rechazo inmunológico o EICH tras el trasplante de islotes de Langerhans, riñones o similares) tras el trasplante de órganos, o un agente anti-enfermedad inmune (por ejemplo, contra el reumatismo, o como agente terapéutico contra la esclerosis arterial, la esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, trombocitemia idiopática o enfermedad de Crohn), agente terapéutico contra las alergias tales como asma, o agente terapéutico contra el síndrome de inhibición del factor VIII de coagulación de la sangre. Ejemplos múltiples de estas enfermedades pueden suceder juntos.

Cuando el anticuerpo anti-CD40 se usa como un medio terapéutico contra una enfermedad en la que CD40 está implicado, se puede esperar que los anticuerpos que proporcionan un efecto terapéutico mejor se puedan obtener seleccionando los anticuerpos utilizando la función de las CD como un indicador.

En el caso del anticuerpo agonista, se puede esperar que los anticuerpos que tengan un acción inmunopotenciadora fuerte se puedan obtener seleccionando los anticuerpos que pueden activar las CD con mayor eficacia. Además, utilizando la estimulación de la producción de IL-12 por CD maduras como indicador, se pueden obtener los anticuerpos que tienen una acción inductora de LCT fuerte. Mediante la inducción de LCT, se pueden obtener anticuerpos que son muy eficaces en eliminar las células infectadas con virus o células tumorales. Además, ya que se pueden esperar efectos sinergísticos, los anticuerpos preferidos se unen a CD40 sin inhibir la unión de los ligandos de CD40 a CD40. Cuando se considera un tratamiento contra el cáncer, si los anticuerpos que inducen directamente la muerte celular de las células cancerosas que expresan CD40 o suprimen su proliferación, y están presentes CD efectivamente activadas, se esperan efectos sinergísticos de ellas, y tales anticuerpos pueden ser agentes terapéuticos que se pueden utilizar contra tumores que no expresan CD40. Estos anticuerpos se consideran útiles como agentes terapéuticos contra enfermedades virales o agentes antitumorales.

Mientras tanto, también se espera que los anticuerpos que se unen específicamente a CD40 y suprimen la unión de CD40L sin activar CD40 sean capaces de suprimir no solo la acción de ligandos para células B, sino también la acción sobre CD. Sin embargo, los anticuerpos se han obtenido hasta ahora utilizando como indicador su efecto sobre células B. De este modo, es altamente significativo obtener anticuerpos que tienen una acción supresora fuerte también sobre células dendríticas y desarrollarlos como un producto farmacéutico. Además, es de interés que el anticuerpo anti-CD40 pueda tener una acción totalmente opuesta mediante entrecruzamiento como se ha descrito anteriormente. Así, se requieren anticuerpos que no activan CD40 incluso mediante entrecruzamiento. También es de interés que los anticuerpo monoclonales derivados de mamíferos no humanos tales como ratón, anticuerpos quiméricos que consisten en la región variable de un anticuerpo monoclonal de ratón y una región constante de una inmunoglobulina humana y anticuerpos humanizados resultantes de injertos de CDR, sobre los que se ha informado como anticuerpos contra CD40 humano, tengan antigenicidad. Por lo tanto, es deseable un anticuerpo humano como un anticuerpo para inhibir la unión con los ligandos de CD40.

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Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra que los anticuerpos KM302-1 estimularon la expresión de CD95.

La Fig. 2A muestra que los anticuerpos antagonistas neutralizaron la acción de los ligandos de CD40 en células Ramos.

La Fig. 2B muestra que los anticuerpos antagonistas neutralizaron la acción de los ligandos de CD40 en células Ramos.

La Fig. 3 muestra que los anticuerpos KM281-1-10 neutralizaron la acción de los ligandos de CD40 en células Ramos.

La Fig. 4 muestra que los anticuerpos entrecruzados KM281-1-10 no estimularon la expresión de CD95.

La Fig. 5 muestra que los anticuerpos entrecruzados 5D12 estimularon la expresión de CD95.

La Fig. 6 muestra el efecto supresor de la proliferación de los anticuerpos KM302-1 en células tumorales.

La Fig. 7 muestra que los anticuerpos KM302-1 estimularon la maduración de CD.

La Fig. 8 muestra que los anticuerpos KM302-1 estimularon la producción de IL-12 de CD.

La Fig. 9 muestra que los anticuerpos KM281-1-10 neutralizaron la acción de los ligandos de CD40 en CD.

La Fig. 10 muestra que los anticuerpos KM281-1-10 neutralizaron la acción de los ligandos de CD40 en CD.

La Fig. 11 muestra que los anticuerpos KM302-1 activaron CD-MLR inmaduras.

La Fig. 12 muestra que los anticuerpos KM341-1-19 y similares estimularon la expresión de CD95 en células Ramos.

La Fig. 13 muestra que los anticuerpos KM341-1-19 estimularon la producción de IL-12 de CD maduras.

La Fig. 14 muestra que los anticuerpos KM341-1-19 estimularon la producción de IL-10 de CD maduras.

La Fig. 15 muestra que los anticuerpos 4D11 y similares neutralizaron la acción de los ligandos de CD40 sobre células Ramos.

La Fig. 16 muestra que los anticuerpos KM302-1 mostraron efecto antitumoral sobre modelo de ratón de células tumorales humanas trasplantadas.

La Fig. 17 muestra que los anticuerpos KM341-1-19 mostraron un efecto supresor de la proliferación contra células tumorales.

La Fig. 18 muestra que F4-465, 4D11 y KM281-1-10 suprimieron la producción de IgG específica de antígeno.

La Fig. 19 muestra que F4-465, 4D11 y KM281-1-10 suprimieron la producción de IgM específica de antígeno.

La Fig. 20 muestra que F4-465 suprimió la proliferación de células B amigdalinas.

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Mejor manera de llevar a cabo la invención

La presente invención se describirá además en detalle con referencia a los ejemplos. Sin embargo, el ámbito técnico de la invención no está limitado por estos ejemplos.

Ejemplo 1 Preparación de antígeno (1) Células

Las células EL-4 son una línea de células T establecida derivada de ratón, y se pueden obtener fácilmente (ATCC No.: TIB-39). Las células B Ramos (ATCC No.: CRL-1596) y los hibridomas de ratón G28-5 (HB-9110) y 5D12 (HB-11339), que producen el anticuerpo anti-CD40 se compraron de la ATTC.

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(2) Expresión y purificación de antígeno.

Las regiones extracelulares se amplificaron mediante PCR utilizando el ADNc humano de CD40 (Número de acceso del GenBank: NM_001250) como molde y los siguientes cebadores en condiciones de 20 ciclos de 95ºC durante 5 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos.

Cebador 1:	5'-CCCAGATCTGTCCATCCAGAACCACCCACTGCATGCAGAG-3'	(SEQ ID NO.: 1)
Cebador 2:	5'- ACAAGATCTGGGCTCTACGTATCTCAGCCGATCCTGGGGAC-3'	(SEQ ID NO.: 2).

El ADN amplificado se insertó detrás de la secuencia señal de la melitina y delante de la región FC derivada de la IgG1 humana o la región FC derivada de la IgG2a de ratón de un vector pFastBac (Gibco BRL). Para producir CD40, se prepararon los baculovirus recombinantes según las instrucciones. Se infectaron células Th5 con los virus recombinantes, y después se cultivaron durante 4 días. El sobrenadante se trató con un filtro de 0.22 nm, se añadió Proteína G sepharosa (Amersham Pharmacia), y después la mezcla se agitó suavemente a 4ºC. Después de una noche, la sepharosa se transfirió a una columna y se lavó entonces con 20x volúmenes de PBS. La proteína humana CD40 FC se eluyó con un tampón glicina 20 mM (pH 3.0). El vector para expresar CD40 en la superficie celular se obtuvo de Randolph J. Noelle (Inui, S. et al., EJI 20, 1747-1753, 1990). El ADN de secuencia completa se cortó con la enzima Xba I, y se insertó en pCDNA3 (INVITROGEN). El vector se introdujo en células EL-4, y después se cultivaron las células en presencia de G418 a 0.5 mg/ml (Gibco BRL), obteniendo de esta manera una cepa de expresión estable. La expresión de CD40 se confirmó mediante análisis por FACS utilizando anticuerpos anti-CD40 humanos conjugados a FITC (Pharmingen).

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Ejemplo 2 Generación de ratones para inmunizar

Los ratones utilizados para inmunización tenían unos antecedentes genéticos por los que eran homocigotos tanto para la cadena pesada y la cadena ligera \kappa de la Ig endógena destruida, y los ratones llevaban al mismo tiempo el fragmento del cromosoma 14 (SC20) que contiene el locus del gen humano de la cadena pesada de la Ig, y un transgén de la cadena humana Ig\kappa (KCo5). Estos ratones se generaron mediante el cruce de ratones de una línea A que tenían el locus del gen humano de la cadena pesada de la Ig con ratones de una línea B que tenían un transgén con la cadena Ig\kappa humana. Los ratones de la línea A son homocigotos tanto para la cadena pesada de la Ig como para la cadena ligera \kappa endógenas destruidas, y llevan un fragmento del cromosoma 14 (SC20), que es transmisible a la progenie, según se ha descrito, por ejemplo, en el informe de Tomizuka y col. (Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000 Vol 97: 722). Los ratones de la línea A se inmunizaron, de modo que se obtuvieron los siguientes hibridomas F2-103 y F5-77. Además, los ratones de la línea B (ratones transgénicos) son homocigotos tanto para la cadena pesada de la Ig como para la cadena ligera \kappa endógenas destruidas, y llevan un transgén de la cadena Ig\kappa humana (KCo5), según se describe, por ejemplo, en el informe de Fishwild y col. (Nat Biotechnol., 1996 Vol 14: 845).

Los individuos obtenidos cruzando ratones macho de la línea A con ratones hembra de la línea B, o ratones hembra de la línea A con ratones macho de la línea B, y cuyas cadena pesada humana de Ig y cadena ligera \kappa se detectaron simultáneamente en el suero (Ishida & Lonberg, IBC's 11^{th} Antibody Engineering, Abstract 2000) se utilizaron para el siguiente experimento de inmunización. Además, los ratones anteriores que producen anticuerpos humanos están disponibles de Kirin Brewery Co., Ltd a través de contrato. Mediante inmunización de los ratones anteriores, se obtuvieron los siguientes hibridomas KM302-1, KM341-1-19, KM643-4-11, 2053, 2105, 3821, 3822, 285, 110, 115, KM281-1-10, KM281-2-10-1-2, KM283-5, KM292-1-24, KM225-2-56, KM341-6-9, 4D11, 5H10, 11E1, 5G3, 3811, 3411 y 3417. Además, también se utilizaron para el siguiente experimento de inmunización ratones quiméricos (Kuroiwa et al., Nat Biotechnol., 2000 vol 18: 1086) que llevan la cadena lambda de anticuerpos humanos de los que ha informado Kuroiwa y col. Se obtuvo un hibridoma F4-465 a partir del ratón.

Ejemplo 3 Preparación de anticuerpos monoclonales humanos contra CD40 humano

Los anticuerpos monoclonales en este ejemplo se prepararon según un método general descrito en Introduction of Experimental Procedures for Monoclonal Antibodies (escrito por Tamie ANDO y col., KODANSHA, 1991). El CD40 humano utilizado aquí como inmunógeno fueron el FC del CD40 humano y las células EL-4 que expresan CD40 preparadas en el Ejemplo 1. Los animales utilizados aquí para la inmunización fueron los ratones productores de anticuerpos humanos que producen la inmunoglobulina humana preparados en el Ejemplo 2.

Los ratones productores de anticuerpos humanos se inmunizaron con CD40:hFc de 2 a 100 \mug/inmunización por ratón. Excluyendo la primera inmunización, se mezcló una solución de antígeno con un volumen equivalente de adyuvante incompleto de Freund (Sigma), y se inyectó después subcutáneamente en varias posiciones separadas. La inmunización se realizó de 3 a 4 veces aproximadamente cada 10 días hasta 3 semanas. Para la primera inmunización, se utilizó el adyuvante incompleto de Freund (Sigma). La sangre se recogió de la cola del ratón, y se midieron los anticuerpos humanos \gamma y \kappa contra CD40 en el suero utilizando ELISA. De 3 a 4 días antes de la escisión del bazo, se realizó la inmunización final inyectando 20 \mug de CD40:Fc disuelto en PBS a través de la vena caudal.

Los ratones productores de anticuerpos humanos se inmunizaron con células de ratón EL-4 que expresan CD40 humano. Las células EL-4 (10^{8} células/ml) se resuspendieron en PBS, y después se mezclaron suavemente con un volumen equivalente de adyuvante RIBI previamente emulsionado con PBS. La inmunización se realizó con las células de 3 a 5 veces aproximadamente cada 10 días hasta 3 semanas. Cuando no se utilizó el adyuvante, las células se irradiaron con rayos X con 8000 rads para su uso.

El bazo se obtuvo quirúrgicamente de los ratones inmunizados. Los esplenocitos recogidos se mezclaron con mieloma de ratón SP2/0 (ATCC No.: CRL1581) en una proporción de 5 a 1. Las células se fusionaron utilizando polietilenglicol 1500 (Boehringer Mannheim) como un agente para la fusión de las células, preparando de este modo un gran número de hibridomas. La selección de los hibridomas se llevó a cabo mediante cultivo en medio DMEM con HAT (Gibco BRL) suplementado con suero fetal de ternera (SFT) al 10%, hipoxantina (H), aminopterina (A) y timidina (T). Además, se obtuvieron clones individuales mediante el método de la dilución limitante utilizando medio DMEM con HT. El cultivo se realizó en una placa de microtitulación de 96 pocillos (Beckton Dickinson). La selección de clones de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales anti-CD40 humanos se realizó utilizando el enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) y separación celular activada por fluorescencia (FACS), según se describe posteriormente en el Ejemplo 4.

La selección de los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos mediante ELISA se llevó a cabo mediante 3 tipos de análisis de ELISA y FACS según se describe posteriormente. De este modo, se obtuvieron un gran número de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos que tienen la cadena \gamma de la inmunoglobulina humana (hIg\gamma) y la cadena ligera \kappa de la inmunoglobulina humana y que mostraron reactividad específica a CD40 humano. En cualquiera de los siguientes ejemplos incluyendo este ejemplo, y tablas y figuras que muestran los resultados de los ensayos de los ejemplos, se indica cada clon de hibridoma que produce anticuerpos monoclonales anti-CD40 humano de la presente invención utilizando símbolos. Un clon representado mediante los símbolos seguido por "anticuerpo" significa un anticuerpo que se produce por cada uno de los hibridomas, o un anticuerpo recombinante que se produce por una célula huésped que lleva un gen de anticuerpo (secuencia completa o región variable) aislado del hibridoma. Además, en un intervalo contextualmente claro, el nombre de un clon de hibridoma puede expresar el nombre de un anticuerpo.

Los siguientes clones de hibridomas representan clones individuales.

Anticuerpos agonistas:

KM302-1, KM341-1-19, KM643-4-11, 2053, 2105, 3821, 3822, 285, 110, 115, F1-102, F2-103, F5-77 y F5-157.

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Anticuerpos antagonistas:

KM281-1-10, KM281-2-10-1-2, KM283-5, KM292-1-24, KM225-2-56, KM341-6-9, 4D11, 5H10, 11E1, 5G3, 3811, 3411, 3417 y F4-465.

Se depositaron 3 clones de hibridomas KM 302-1, KM 281-1-10 y KM 281-2-10-1-2 entre ellos el 9 de mayo de 2001, los clones KM341-1-19 y 4D11 se depositaron el 27 de septiembre de 2001 y el clon 2105 se depositó el 17 de abril de 2002, en el Depositario Internacional de Organismos de Patentes en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada (Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japón) bajo el Tratado de Budapest. Los plásmidos que tienen las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de F2-103, F5-77 y F5-157, se depositaron el 19 de abril de 2001, y los clones de hibridoma F1-102 y F4-465 se depositaron el 24 de abril de 2001 en la ATTC (Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801, University Blvd., Manassas, Virginia, EE.UU.) bajo el tratado de Budapest (Tabla 2).

TABLA 2

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Ejemplo 4 Selección de hibridoma Detección del anticuerpo monoclonal que tiene una cadena \gamma de inmunoglobulina humana

Se añadió CD40 humano FC de ratón (1 \mug/ml) preparado en el Ejemplo 1 a cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos para ELISA (Maxisorp, Nunc) a 50 \mul/pocillo y se incubó a 4ºC para que se adsorbiera el CD40 humano FC de ratón a la microplaca. A continuación, se desechó el sobrenadante, y después se añadió a cada pocillo un agente bloqueante (Block Ace, DAINIPPON PHARMACEUTICAL), seguido mediante incubación a temperatura ambiente para bloquear. Se añadió el sobrenadante del cultivo (50 \mul) de cada hibridoma a cada pocillo para la reacción, y después cada pocillo se lavó con tampón fosfato con Tween-20 al 0.1% (PBS-T). Se diluyó entonces el anticuerpo de cabra anti IgG humana (\gamma) (Sigma, A0170) marcado con peroxidasa 5000 veces con PBS-T que contenía SFB al 1%. Se añadió la solución (50 \mul/pocillo) a cada pocillo, y se llevó a cabo la incubación. La microplaca se lavó 3 veces con PBS-T, y después se añadió una solución de sustrato cromogénico (TMB, 50 \mul/pocillo, SUMITOMO BAKKELITE), seguida por incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió una solución de parada (50 \mul/pocillo) a cada pocillo para parar la reacción. Se midió la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm con un lector de microplacas. El sobrenadante del cultivo de las células positivas se analizó mediante FACS, y después se seleccionaron los pocillos en los que las células Ramos se tiñeron. Las células en los pocillos se clonaron mediante el método de la dilución limitante, y se obtuvieron las células de 1 clon por pocillo. El estado h\kappa positivo se confirmó mediante ELISA utilizando CD40 humano FC de ratón. Como resultado, se obtuvieron anticuerpos anti-CD40 humano de 173 clones a partir de 20 ratones. Algunos de estos anticuerpos se muestran en la Tabla 3 (anticuerpos agonistas) y en la Tabla 4 (anticuerpos antagonistas). Entre los anticuerpos agonistas, al menos KM341-1-19 y 2105 no compitieron significativamente con los ligandos en un ensayo de competitividad utilizando células que expresan CD40L, células que expresan CD40 y los anticuerpos.

TABLA 3 Anticuerpos agonistas

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TABLA 4 Anticuerpos antagonistas

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Los anticuerpos monoclonales que tienen la cadena ligera \kappa (Ig\kappa) de la inmunoglobulina humana se detectaron de una manera similar al método de ELISA descrito anteriormente para la cadena \gamma de la inmunoglobulina humana excepto que se utilizaron anticuerpos de cabra anti-Ig\kappa humano (diluidos 1000 veces, 50 \mul/pocillo, Southern Biotechnology) marcados con peroxidasa.

La subclase de cada anticuerpo monoclonal se identificó de una manera similar al método de ELISA anterior para la cadena \gamma de la inmunoglobulina humana, excepto que se utilizó un anticuerpo de oveja anti IgG1-humana, un anticuerpo de oveja anti IgG2-humana, un anticuerpo de oveja anti-IgG3 humana o un anticuerpo de oveja anti-IgG4 humana (cada uno diluido 2000 veces, 50 \mul/pocillo, The Binding Site) marcados con peroxidasa.

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Ensayo de reacción de cada anticuerpo monoclonal contra células que expresan CD40 humano

Se estudió mediante análisis por FACS la reactividad de cada anticuerpo monoclonal contra una línea de células Ramos de la que se ha descrito que expresa CD40.

La línea de células Ramos se resuspendió a una concentración de 2x10^{6}/ml en un tampón de tinción (SB) de PBS con NaN_{3} al 0.1% y SFT al 2%. La suspensión de células (100 \mul/pocillo) se distribuyó en una placa de 96 pocillos de fondo redondeado (Beckton Dickinson). Se añadió el sobrenadante del cultivo (50 \mul) de cada hibridoma, y después se llevó a cabo una incubación en hielo durante 30 minutos. Se utilizaron anticuerpos IgG1 humanos contra la seroalbúmina humana como control negativo, y se prepararon a una concentración de 2 \mug/ml con medio de cultivo de hibridoma. Se añadieron 50 \mul de la solución, y la incubación se realizó después en hielo durante 15 minutos. Después de lavar con SB, se añadieron 50 \mul de anticuerpo anti R-PE humano marcado con fluorescencia (Southern Biotechnology) diluido 250 veces, y la incubación se llevó a cabo en hielo durante 15 minutos. Después de lavar dos veces con SB, el producto se resuspendió en 300 a 500 \mul de un tampón de FACS, y se midió la intensidad de la fluorescencia de cada célula mediante FACS (FACSort y FACScan, Beckton Dickinson). Como resultado, se seleccionaron los anticuerpos que mostraron actividad de unión a la línea de células Ramos.

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Ejemplo 5 Preparación de cada anticuerpo

Se preparó el sobrenadante del cultivo que contenía los anticuerpos monoclonales mediante el siguiente método.

Se obtuvo un hibridoma productor de anticuerpos G28-5 de la ATCC (ATCC No. HB-9110). Los hibridomas productores de anticuerpos anti-CD40 se aclimataron en medio eRDF (Kyokutoseiyaku) con insulina bovina (5 \mug/ml, Gibco BRL), transferrina humana (5 \mug/ml, Gibco BRL), etanolamina (0.01 mM, Sigma) y selenito sódico (2.5x10^{-5} nM, Sigma). Los hibridomas se cultivaron en una botella rodante. Cuando la tasa de células viables de los hibridomas alcanzó el 90%, se recogió el sobrenadante del cultivo. El sobrenadante recogido se aplicó a filtros de 10 \mum y de 0.2 \mum (German Science) para eliminar la mezcla de restos diversos tales como hibridomas.

Los anticuerpos anti-CD40 se purificaron de los sobrenadantes de los cultivos anteriores mediante el siguiente método. El sobrenadante del cultivo que contenía los anticuerpos anti-CD40 se sometió a purificación por afinidad utilizando una columna Hyper D de Proteína A (NGK INSULATORS, LTD) o una columna de Proteína G (para purificar la IgG1 de ratón, Amersham Pharmacia Biotech) según las instrucciones adjuntadas utilizando PBS(-) como tampón de adsorción y tampón citrato sódico 0.1 M (pH 3) como tampón de elución. Se añadió Tris-HCl 1 M (pH 8.0) o una solución de Na_{2}HPO_{4} para ajustar las fracciones de elución para tener un pH de alrededor de 7.2. La solución preparada de anticuerpo se sustituyó con PBS(-) utilizando una membrana de diálisis (corte 10000, Spectrum Laboratorios) o una columna de SP (Amersham Pharmacia Biotech), y se llevó a cabo una esterilización por filtración utilizando un filtro de membrana MILLEX-GV (MILLIPORE) con un tamaño de poro de 0.22 \mum. La concentración del anticuerpo purificado se halló midiendo la absorbancia a 280 nm y calculando 1 mg/ml para una
OD de 1.45.

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Ejemplo 6 Estimulación de la expresión de CD95 en células Ramos por un anticuerpo anti-CD40 agonista

Se inoculó una suspensión de 5x10^{5} células/ml de células Ramos a 100 \mul/pocillo (5x10^{4} células por pocillo) en una placa de 96 pocillos. Se diluyó el sobrenadante del cultivo del hibridoma o el anticuerpo purificado a 20 \mug/ml con medio, y la solución se añadió después a una concentración de 100 \mul/pocillo a una placa de 96 pocillos. Después de cultivar durante la noche, las células se recogieron y se analizaron mediante FACScan o FACSort (Beckton Dickinson) utilizando anticuerpos anti-CD95 R-PE marcados (Pharmingen NJ). La figura 1 muestra el resultado. El eje horizontal en la Fig. 1 indica la intensidad de la expresión de CD95. La adición de los anticuerpos se indica con una línea gruesa, y la no adición de anticuerpos con una línea fina. Se mostró que los anticuerpos KM302-1 estimulaban mejor la expresión de CD95 que los anticuerpos G28-5, que eran los anticuerpos conocidos. Esto es, se mostró que el anticuerpo KM302-1 era más efectivamente agonista.

Ejemplo 7 Supresión de la expresión de CD95 en células Ramos por un anticuerpo anti-CD40 antagonista

Se inoculó una suspensión de células ramos de 1.0x10^{6} células/ml a 50 \mul/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se ajustó el sobrenadante del cultivo del hibridoma o el anticuerpo purificado a 2 \mug/ml con un medio, y se añadió entonces a 100 \mul/pocillo a una placa de 96 pocillos. Se añadieron al medio los ligandos de CD40 solubles (4 \mug/ml, ALEXIS CORPORATION) y anticuerpos anti-FLAG (4 \mug/ml, M2, Sigma) y se añadió el medio a 50 \mul/pocillo a la placa de 96 pocillos. Después del cultivar durante la noche, se recogieron las células y se analizaron mediante FACS utilizando anticuerpos anti-CD95 marcados con R-PE (Pharmingen, NJ). Las figuras 2A, 2B y 3 muestran los resultados. El eje horizontal en las figuras indica la intensidad de la expresión de CD95. La expresión de CD95 se suprimió al mismo nivel que la del control negativo por los anticuerpos producidos por cada uno de los siguientes hibridomas: KM281-1-10, KM281-2-10-1-2, KM283-5, KM292-1-24 y KM225-2-56.

En la Fig. 3, los anticuerpos KM281-1-10 (panel inferior) suprimieron la expresión de CD95 de forma más efectiva que los anticuerpos 5D12 (panel central), el anticuerpo conocido, que solo suprimió ligeramente la expresión de CD95. Específicamente, se mostró que el anticuerpo KM281-1-10 era más efectivamente antagonista. De este modo, se mostró que el anticuerpo monoclonal humano es un anticuerpo antagonista.

Efecto del entrecruzamiento por un anticuerpo anti-inmunoglobulina

Se inoculó una suspensión de células Ramos de 1.0x10^{6} células/ml a 50 \mul/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se ajustó el sobrenadante del cultivo del hibridoma o el anticuerpo purificado a 2 \mug/ml con un medio, y se añadió entonces a 100 \mul/pocillo a una placa de 96 pocillos. Se añadieron anticuerpos anti-IgG humanos (Sigma, I3382) o anticuerpos anti-IgG de ratón (Biosource, AMI3401) al medio a 4 \mug/ml, y los medios se añadieron a 50 \mul/pocillo a una placa de 96 pocillos. Después del cultivar durante la noche, se recogieron las células y se analizaron mediante FACS utilizando anticuerpos anti-CD95 marcados con R-PE (Pharmingen, NJ). Las figuras 4 y 5 muestran los resultados. El eje horizontal en las figuras indica la intensidad de la expresión de CD95. La expresión de CD95 fue suprimida por los anticuerpos producidos por cada uno de los hibridomas KM281-1-10 y KM281-2-10-1-2. Por el contrario, la expresión de CD95 se aumentó por los anticuerpos producidos por cada uno de los siguientes hibridomas, 5D12, KM283-5, KM292-1-24 y KM225-2-56.

Ejemplo 8 Supresión de la proliferación en células Ramos por anticuerpo anti-CD40 agonista

Se inoculó una suspensión de 1.0x10^{5} células/ml de células Ramos y células HS-Sulton a 100 \mul/pocillo en una placa de 96 pocillos. Se añadió al medio una mezcla de cantidades equivalentes de anticuerpos purificados o ligandos de CD40 solubles, y anticuerpos anti-FLAG (M2). Después de 2 días de cultivo, se añadieron 10 \mul de ^{3}H-timidina 100 \muCi/ml (Amersham Pharmacia). Después de 18 horas, el producto del cultivo se recogió en un Filtermat A impreso (Wallac) utilizando un recogedor Macro 96 (SKATRON), se secó, y después se sumergió bien en Betap;Scint (Wallac). Después de envasar, se midió la actividad utilizando un contador de centelleo líquido BETAPLATE 1205. La figura 6 muestra los resultados. En la figura, el eje longitudinal indica la cantidad de ^{3}H-timidina incorporada por las células, y el eje horizontal indica la concentración del anticuerpo o CD40L en la solución del cultivo. Cuando se añadieron los anticuerpos KM302-1 a las células Ramos y células HS-Sulton, la cantidad de timidina incorporada fue menor que con de los anticuerpos convencionales G28-5 y CD40L. De este modo, se mostró que el anticuerpo KM302-1, es un anticuerpo agonista que puede suprimir de forma efectiva la proliferación de células tumorales.

Ejemplo 9 Activación de células dendríticas por anticuerpo agonista de CD40 (1) Materiales y métodos

IL-4 recombinante humana se compró de Genzyme techne. Las bolas de MACS con anti-CD14 humano se compraron de Miltenyi Biotech GmbH. Lymphoprep se compró de Nycomed Pharma AS. El medio utilizado para el cultivo fue RPMI1640 (Gibco BRL) suplementado con SFT (Cell Culture Technologies) inactivado por calor al 10%, HEPES (Sigma) 10 mM, 2-mercaptoetanol (Gibco BRL) 55 \muM y sulfato de estreptomicina (MEIJI SEIKA KAISHA, LTD.), cuando se indujeron las CD. Las células en un proceso de tinción se lavaron con PBS (Sigma) suplementado con SFT (Cell Culture Technologies) al 2% y azida al 0.02%. Cuando las células se congelaron, se utilizó Cell banker (Nippon Zenyaku Kogyo).

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(2) Inducción de CD derivadas de monocitos

Se prepararon células mononucleares a partir de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando Lymphoprep. Las células se sometieron a selección positiva utilizando bolas de MACS con anti-CD14 humano, para separar las células en una fracción positiva y una fracción negativa para CD14. A la fracción positiva se le añadieron GM-CSF recombinante humano (50 ng/ml) e IL-4 recombinante humano (100 ng/ml), seguido por cultivo en medio RPMI1640 suplementado con SFT al 10% en un placa de 6 pocillos. Al inicio del cultivo, las células se cultivaron a una concentración de 1x10^{6}/ml (3 ml por pocillo). Durante el tiempo de cultivo, el medio se cambió cada 2 días. El cambio de medio se realizó poniendo un muestra del 10% de la solución de cultivo en un tubo de centrífuga, centrifugando la solución, retirando el sobrenadante, resuspendiendo en una nueva solución de cultivo (que contiene citoquina y similares a las concentraciones anteriores) en un volumen 2 veces mayor que la muestra de solución del cultivo, y devolviendo la solución a cada pocillo. En el día 6 de cultivo, se recogieron las células, se calculó el número de células, y se resuspendieron las células a una concentración de 1x10^{6}/ml en el medio anterior. Se añadieron al medio los anticuerpos anti-CD40 o los isotipos control de los mismos, y se cultivó durante otros 4 días en una placa de 24 pocillos. Durante este período, no se realizó cambio de cultivo (número de células por pocillo 1x10^{6} células, y concentración de células de 1x10^{6}/ml),

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(3) Tinción de células y análisis por citometría de flujo

Para la tinción, se utilizaron anticuerpos anti-HLA-DR (isotipo control: IgG2a de rata), anticuerpos anti-CD86 (isotipo control: IgG1 de rata) y anticuerpos anti-CD83 (isotipo control: IgG2b de rata). Primero, se añadieron los anticuerpos, y después se llevó a cabo la incubación a 4ºC durante 30 minutos. Después de 3 lavados, se realizó el análisis utilizando el FACS Calibur (Beckton Dickinson).

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(4) Aumento en la capacidad de secreción de IL-12 de las CD maduras

Después de que se obtuvieran CD inmaduras como se ha descrito anteriormente, se añadieron LPS (400 pg/ml) e INF\gamma (10^{-3} M), y se llevó a cabo el cultivo durante 2 días, obteniendo así CD maduras. A las CD maduras se les añadieron anticuerpos anti-CD40 a 10 \mug/ml o el isotipo control. La producción de IL-12 se midió en el sobrenadante utilizando ELISA (Pharmingen), después de 24 horas.

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(5) Resultados y Discusión

La Figura 7 muestra el efecto de los anticuerpos KM302-1, los anticuerpos agonistas, en la maduración de CD, y la Figura 8 muestra el efecto de los anticuerpos KM302-1 en la producción de IL-12 de las CD maduras. El grado de maduración se comparó con el de los anticuerpos G28-5 como control. Cuando se examinaron la expresión de CD86 y la de HLA-DR, la expresión fue más alta, esto es, el grado de maduración aumentó más en el caso de los anticuerpos KM302-1 comparado con el caso de los anticuerpos G28-5. También se mostró que la secreción de IL-12 aumentó por el tratamiento de CD maduras con anticuerpos KM302-1. De acuerdo con esto, se mostró que los anticuerpos KM302-1 actuaron como anticuerpos agonistas sobre CD.

Ejemplo 10 CD-MLR

La sangre (sangre periférica) recogida de un ser humano normal se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos, y después se absorbió el suero. La fracción celular de la sangre se resuspendió en PBS, y se colocó suavemente sobre Ficoll (Amersham Pharmacia). Se realizó una centrifugación a 2000 rpm durante 30 minutos, de modo que se recogió la parte de PBMC de la capa intermedia, se lavó dos veces con PBS, y después se utilizó para determinados procesos de separación celular utilizando MACS.

La separación de monocitos para cultivar CD se realizó según las instrucciones adjuntas utilizando MACS (Miltenyi Biotec GmbH). Esto se explica brevemente como sigue. Se añadieron 800 \mul de tampón MACS y 200 \mul de MACS CD14 (Miltenyi Biotec GmbH, 502-01) a PBMC (1x10^{8}), y se trataron a 4ºC durante 15 minutos. Las células se adsorbieron a una columna de MACS LS, y después se lavó. Las células adsorbidas a la columna se recogieron como monocitos. Se añadió MACS HLA-DR (Miltenyi Biotec GmbH, 461-01) a las células que no se adsorbieron a la columna. Las células HLR-DR positivas se retiraron con una columna BS, preparando de este modo una fracción de células T. La proporción de células CD3 positivas se midió por FACS, y se calculó un número sustancial de células T a partir del número total de células en la fracción de células T. Los monocitos obtenidos se cultivaron en medio R0 (medio PPMI suplementado con \beta-mercaptoetanol (Gibco) y HEPES (Sigma) que contiene IL-4 (R&D system) 100 ng/ml, G-CSF (KIRIN) 50 ng/ml, y SFT (SIGMA) al 10%) a una concentración de 1x10^{6} células/ml en una placa de cultivo de 6 pocillos. En el día 5 de cultivo, se añadió LPS (DIFCO) 10 ng/ml para diferenciar las células a CD maduras.

Se realizó el MLR mezclando células T y CD maduras, que se habían aislado a partir de seres humanos diferentes. Se determinó la proporción celular de células T a CD como 1:80, y el número de células T se determinó como 2x10^{5} células/pocillo. Primero, se añadieron los anticuerpos a las CD para que siguiera la reacción durante 30 minutos. Posteriormente, se añadieron las células T, el cultivo se realizó durante 4 días, y después se añadieron 10 \mul de ^{3}H-timidina (Amersham Pharmacia) 100 \muCi/ml. 14 horas después, se recogieron las células en Filtermat A impreso (Wallac) utilizando un recogedor Macro 86 (SKATRON), se secaron, y se sumergieron bien en Betap;Scint (Wallac). Después de envasar, se midió la actividad utilizando un contador de centelleo líquido 1205 BETAPLATE. El MLR utilizando CD inmaduras se realizó mezclando las células T con CD maduras, que se habían aislado de diferentes seres humanos. Con una proporción celular de células T a CD de 1:40, el MLR se realizó de forma similar. Las figuras 9 y 10 muestran los resultados. Se mostró que la adición de anticuerpos KM281-1-10 disminuyó la incorporación de timidina, y por lo tanto el MLR se pudo suprimir. Además, se mostró en la Figura 10 que los anticuerpos KM283-5 y 5D12 no pudieron suprimir el CD-MLR. Esto es, solo el anticuerpo KM281-1-10 es un anticuerpo agonista que neutraliza la acción de los ligandos de CD40 sobre CD. Además, la Fig. 11 muestra los resultados de examinar el efecto de los anticuerpos KM302-1, que son anticuerpos agonistas, sobre el MLR utilizando CD inmaduras. La activación de las CD promovió la interacción con células T, y produjo un incremento en la incorporación de timidina. Estos resultados indicaron que KM302-1 es un anticuerpo agonista que actúa sobre CD inmaduras.

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Ejemplo 11 Efecto del anticuerpo anti-CD40 sobre la unión de CD40L a CD40

Se hizo que los anticuerpos anti-CD40 se unieran al FC de CD40 humano inmovilizado utilizando BIAcore 2000 (Biacore), y después se midieron cambios en la cantidad de CD40L soluble que se une a CD40. Según las instrucciones adjuntas al sistema, el FC del CD40 humano soluble se inmovilizó sobre un chip de CM (CM5, Biacore). A continuación se añadieron anticuerpos anti-CD40 a 25 \mug/ml para unir a CD40. Además, se añadió CD40L 10 \mug/ml para la unión. Se midió la diferencia entre las cantidades unidas antes y después de la adición de CD40L. Cuando se añadió IgG control, la cantidad de CD40L unida fue de 100 RU. Después de añadir anticuerpos KM302-1, la cantidad de CD40L unida fue de 110 RU, y después de añadir anticuerpos KM283-5 la cantidad de CD40L unida fue de 18 RU. De este modo, se mostró que el anticuerpo KM302-1 no inhibe la unión de CD40L a CD40.

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Ejemplo 12 Estimulación de la expresión de CD95 en células Ramos por anticuerpo agonista anti-CD40

Se analizaron los anticuerpos de los hibridomas obtenidos en el Ejemplo 4 según el método del Ejemplo 6, y se seleccionaron los clones que producían anticuerpos agonistas (número de células por pocillo: 5x10^{4}; concentración de células: 2.5x10^{5}/ml). La Figura 12 muestra los resultados. En la figura, el eje horizontal indica la concentración de anticuerpo en las soluciones de cultivo, y el eje longitudinal indica las intensidades medias de fluorescencia, esto es, intensidades de la expresión de CD95. A una concentración de 0.01 \mug/ml o más, los anticuerpos KM341-1-19 y 2105 mostraron que estimulaban la expresión de CD95 en células Ramos de forma más efectiva que los anticuerpos G28-5, que son anticuerpos de ratón conocidos. Específicamente, se mostró que los anticuerpos KM341-1-19 y 2105 eran anticuerpos agonistas más efectivos. Además, la actividad agonista (aumentar la expresión de CD95 en células Ramos) de los anticuerpos KM341-1-19 y 2105 (0.01 \mug/ml) fue mayor que la de los anticuerpos G28-5 (10 \mug/ml) (Fig. 12). La Tabla 5 resume que a cada concentración de anticuerpo, el nivel de expresión de CD95 es cuantas veces mayor o menor que aquel expresado mediante la adición de anticuerpos G28-5.

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TABLA 5

9

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Ejemplo 13 Activación de células dendríticas por anticuerpo agonista de CD40

Según el método del Ejemplo 9, se examinó el efecto de los anticuerpos agonistas de CD40 sobre la producción de IL-12 e IL-10 por CD maduras. Se midió IL-10 mediante el método de ELISA (Pharmingen). Las Figuras 13 y 14 muestran los resultados. Se mostró que la secreción de IL-12 aumentaba por el tratamiento con anticuerpos KM341-1-19. Por el contrario, incluso cuando se permitió que coexistieran células L recombinantes que expresan ligando de CD40 (2x10^{5} células/ml) que se habían irradiado con rayos X (5000 rad), la concentración de IL-12 e IL-10 en las soluciones de cultivo fueron de 254 y 51 pg/ml, respectivamente. Fueron menores que cuando se añadieron anticuerpos KM341-1-19 a 1 \mug/ml.

Como se ha descrito anteriormente, se mostró que los anticuerpos KM341-1-19 actúan sobre CD como anticuerpos agonistas eficaces. La actividad de los anticuerpos KM341-1-19 (0.1 \mug/ml) para producir que las CD maduras secretaran IL-12 fue mayor que la de los anticuerpos G28-5 (100 \mug/ml). La actividad de los anticuerpos KM341-1-19 (1 \mug/ml) para producir que las CD maduras secretaran IL-12 fue 100 veces mayor o más que la de los anticuerpos G28-5 (100 \mug/ml) (Fig. 13). Además, la actividad de los anticuerpos KM341-1-19 (1 \mug/ml) para producir que las CD maduras secretaran IL-10 fue 10 veces mayor o más que la de los anticuerpos G28-5 (100 \mug/ml) (Fig. 14). Por otra parte, puesto que la subclase del anticuerpo KM341-1-19 era IgG2, el anticuerpo tiene menor capacidad de unión al receptor Fc que la de IgG1 o IgG3. Su capacidad de sensibilizar la actividad matadora de las células NK y su capacidad de activar el sistema del complemento también son débiles. De acuerdo con esto, puede haber un bajo riesgo de que la función de las células que expresan CD40 o el número de células misma disminuya debido al anticuerpo. Además, el anticuerpo no se entrecruza fácilmente por un receptor Fc, de modo que se puede esperar que el efecto de la droga se controle fácilmente sin grandes fluctuaciones en la actividad agonista in vivo debido al entrecruzamiento.

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Ejemplo 14 Supresión de la expresión de CD95 en células Ramos por un anticuerpo antagonista anti-CD40

Se inoculó una suspensión de 1.0x10^{6} células/ml de células Ramos a 50 \mul/pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano (número de células por pocillo: 5x10^{4}). Se añadieron anticuerpos purificados diluidos en medio a 100 \mul/pocillo a una placa de 96 pocillos. Se prepararon células L recombinantes de ratón que expresan ligando de CD40 humano (ver Spriggs, MK et al., J. Exp. Med., 176: 1543, 1992; Garrone, P. et al., J. Exp. Med., 182: 1265, 1995 y similares) a 1.0x10^{5} células/ml. Las células preparadas se añadieron a 50 \mul/pocillo (el número de células Ramos por pocillo: 5x10^{4}; concentración de células Ramos 2.5x10^{4} células/ml; el número de células L de ratón por pocillo: 5x10^{3}; concentración de células de ratón: 2.5x10^{4} células/ml). Después de cultivar durante la noche, las células se recogieron, y después se analizaron por FACS utilizando anticuerpos anti-CD95 marcados con R-PE. La Figura 15 muestra los resultados. En la figura el eje longitudinal indica intensidad media de fluorescencia, esto es, intensidad de la expresión de CD95. Mientras que los anticuerpos conocidos 5D12 suprimían ligeramente la expresión, los anticuerpos 4D11 suprimieron incluso a una concentración de 0.1 \mug/ml, la expresión de CD95 en el mismo grado que en el caso de un control negativo en donde no se añadieron células que expresan CD40L. Además, a una concentración de 1 \mug/ml, 4D11, F4-465 y KM281-1-10 suprimieron la expresión de CD95 al mismo nivel que el control negativo, en donde no se añadieron células que expresan CD40L. Estos resultados mostraron que los anticuerpos 4D11, F4-465 y KM281-1-10 son anticuerpos antagonistas más eficaces. La Tabla 6 muestra los valores relativos de la intensidad media de fluorescencia correspondiente a cada concentración de anticuerpo, cuando el valor del caso control en donde no se añaden anticuerpos antagonistas se determina como 100.

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TABLA 6

11

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Ejemplo 15 Efecto antitumoral en un modelo de trasplante de células Ramos por un anticuerpo agonista anti-CD40

Se inyectaron anticuerpos anti-asialo GM1 intravenosamente a ratones C.B.17/Icr-scidJc1 (CLEA JAPÓN) de 5 semanas de edad. 1 día después, se inyectaron intravenosamente 5x10^{6} células Ramos por ratón como células tumorales. 1 día después, se inyectaron intravenosamente anticuerpos KM302-1 o anticuerpos IgG anti albúmina humana como control negativo. Las dosis por ratón de anticuerpos KM302-1 fueron de 1, 10 y 100 \mug, y la misma de anticuerpos del control negativo fue de 100 \mug. Cada uno de estos anticuerpos se administró una vez a 5 ratones. La Figura 16 muestra los resultados. El día 34 después del trasplante, todos los ratones del grupo al que se administró el control negativo habían muerto, mientras que todos los grupos de 5 ratones cada uno a los que se habían administrado 10 y 100 \mug de anticuerpos KM302-1 sobrevivieron. De este modo, se confirmó el efecto antitumoral de los anticuerpos KM302-1. El anticuerpo KM302-1 es de la subclase IgG4, de modo que la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) mediada por el receptor Fc y la activación del sistema del complemento son débiles. A pesar de estas características, se observó que la administración individual de 10 \mug de anticuerpos KM302-1 prolongaba el tiempo de supervivencia de los ratones que tenían tumores.

Ejemplo 16 Supresión de la proliferación de células Ramos por un anticuerpo agonista anti-CD40

Se preparó una suspensión de células Ramos a 1x10^{4} células/ml en un medio RPMI1640 suplementado con SBF al 10%, y después se repartió 100 \mul de la suspensión en una placa de 96 pocillos. Se añadió un anticuerpo KM341-1-19 o una solución de ligando soluble preparado a 20 \mug/ml utilizando medio. Se dejaron coexistir anticuerpos anti-FLAG (M2) con la misma concentración que los ligandos con los ligandos solubles (la concentración en la solución de reacción fue de 10 \mug/ml), aumentando así la actividad. Después de 5 días de cultivo, se añadieron 20 \mul de reactivo MTS (Promega) a cada pocillo, y se dejó reaccionar durante 2 a 3 horas. Se midieron diferencias en absorbancia entre los pocillos libres de células y libres de anticuerpo y los pocillos con células y con anticuerpo a una longitud de onda de 490 nm, midiendo de este modo las células viables. Además, la acción supresora de la proliferación se comparó con la de los anticuerpos G28-5 utilizando una placa de 96 pocillos con el fondo en U de forma similar. Se añadieron los anticuerpos KM341-1-19 o los anticuerpos G28-5 preparados a 2 \mug/ml utilizando medio. La Figura 17 muestra los resultados. En los pocillos a los que se había añadido anticuerpos KM341-1-19, se observaron células muertas, el número de células fue significativamente menor que el de los pocillo a los se habían añadido los anticuerpos G28-5 o los ligandos, y la absorbancia también fue menor. Estos resultados indican que la proliferación de células tumorales se suprimió, y que se indujo muerte celular.

Ejemplo 17 Clonación del ADNc del gen de anticuerpo

Se cultivaron los hibridomas productores de los anticuerpos KM341-1-19, 2105, 110, 115, KM281-1-10, 4D11, KM643-4-11, F4-465, F2-103 y F5-77, y se recogieron las células mediante centrifugación. Se añadió TRIZOL (Gibco BRL) a las células y se extrajo el ARN total según las instrucciones adjuntas. Se llevo a cabo la clonación de las regiones variables del ADNc del anticuerpo según las instrucciones adjuntas utilizando un kit de amplificación de ADNc SMART RACE (CLONTECH). Utilizando 5 \mug de ARN total como molde, se construyó la primera hebra de ADNc. Para amplificar las cadenas pesadas (cadenas H) de KM341-1-19, 2105, 110, 115, KM281-1-10, 4D11, KM643-4-11, F2-103 y F5-77 se utilizaron Z-Taq (Takara) y los cebadores y UMP y hh6, y un ciclo de 98ºC durante 1 segundo y 68ºC durante 30 segundos se repitió 30 veces. Además, utilizando 1 \mul de la solución de reacción como molde y los cebadores NUMP y hh3, un ciclo de 98ºC durante 1 segundo y 68ºC durante 30 segundos se repitió 20 veces. Para amplificar una cadena pesada F4-465, se utilizaron los cebadores UMP y hh2 y un kit de PCR Advantage 2 (Clontech, cat#1910), y se realizaron 5 ciclos de 94ºC durante 5 segundos y 72ºC durante 3 minutos, 5 ciclos de 94ºC durante 5 segundos, 70ºC durante 0 segundos y 72ºC durante 3 minutos, y 25 ciclos de 94ºC durante 5 segundos, 68ºC durante 10 segundos y 72ºC durante 3 minutos.

cebador hh6:	5'-GGT CCG GGA GAT CAT GAG GGT GTC CTT-3'	(SEQ ID NO: 3)
cebador hh3:	5'-GTG CAC GCC GCT GGT CAG GGC GCC TG-3'	(SEQ ID NO: 4)
cebador hh2:	5'-GCT GGA GGG CAC GGT CAC CAC GCT G-3'	(SEQ ID NO: 5)

Posteriormente, se purificó el producto de PCR utilizando un kit de purificación de PCR (QIAGEN), y se determinó la secuencia de nucleótidos utilizando hh4 como cebador. Alternativamente, el producto se subclonó en PCR-Script (Stratagene, Lajolla, CA) o PCR-Blunt (Invitrogene, Carlsbad, CA), y después se secuenció. Basados en la información de la secuencia, se sintetizaron cebadores específicos para la cadena pesada del anticuerpo. Se sintetizó un cebador 341H en el caso de KM341-1-19, un cebador 2105Hsal en el caso de 2105, un cebador 110Hsal en el caso de 110 y 115, un cebador 281Hsal en el caso de KM281-1-10, un cebador 4D11Sal en el caso de 4D11, un cebador 643Hsal en el caso de KM643-4-11, un cebador H11-9 5' en el caso de F4-465, un cebador F2-103H en el caso de F2-103 y un cebador F5-77H en el caso de F5-77. Utilizando los cebadores específicos de la cadena pesada del anticuerpo y hh4, se amplificó el ADNc a partir de la primera hebra de ADNc, y se determinó la secuencia desde la dirección opuesta utilizando el producto amplificado como molde y los cebadores específicos de anticuerpo.

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Las cadenas ligeras (cadenas L) de KM341-1-19, 2105, 110, 115, KM281-1-10, 4D11, KM643-4-11, F2-103 y F5-77 se amplificaron utilizando los cebadores UMP y hk2 y repitiendo 30 veces un ciclo de 98ºC durante 1 segundo y 68ºC durante 30 segundos. La cadena ligera de F4-465 se amplificó utilizando los cebadores UMP y hL2 y repitiendo 30 veces un ciclo de 98ºC durante 1 segundo y 68ºC durante 30 segundos. El producto de PCR amplificado se purificó utilizando un kit de purificación de PCR, y después se determinó la secuencia de nucleótidos utilizando los cebadores hk6 o hL2. Basados en las secuencias, se sintetizaron cebadores específicos de la cadena ligera. Se sintetizó un cebador 341K en el caso de KM341-1-19, un cebador 2053KBgl en el caso de 2105, un cebador 110KBgl en el caso de 110 y 115, un cebador 281KBgl en el caso de KM281-1-10, 4D11KBgl en el caso de 4D11, un cebador 643KBgl en el caso de KM643-4-11, un cebador Lamda 5' en el caso de F4-465, y un cebador F2-103K en el caso de F-103 y F5-77.

En el caso de 341-1-19, 110, 115, KM643-4-11, KM281-1-10, 4D11 y 2105, el ADNc se amplificó de la primera hebra de ADNc utilizando el cebador específico de la cadena ligera y el cebador hk6. La secuencia se determinó después en ambas direcciones utilizando el producto amplificado como molde. Para F4-465, F2-103 y F5-77, se realizó subclonación en PCR-Script (Stratagene, Lajolla, CA) o PCR-Blunt (Invitrogene, Carlsbad, CA) para determinar la secuencia.

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Los ADNs de 341-1-19 que codifican las secuencias completas de las regiones variables de la cadena H y la cadena L y las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L respectivamente se muestran posteriormente.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena H es un codón ATG que empieza a partir de la adenina (A) 50 a partir del extremo 5' de SEQ ID NO: 27, y el codón de terminación es TGA que empieza en la timina (T) 1472. El límite de la región variable y la región constante del anticuerpo está situado entre la adenina (A) 493 y la guanina (G) 494 a partir del extremo 5'. En la secuencia de aminoácidos, la región variable de la cadena H se extiende desde el N-terminal hasta el residuo de serina (S) 148 de la SEQ ID NO: 28, y la región constante es desde la alanina (A) 149 y los siguientes residuos. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena H se extiende desde el N-terminal hasta la serina (S) 20 de la SEQ ID NO: 28. Se cree que el N-terminal de la proteína madura es la glutamina 21 (Q) de la SEQ ID NO: 28.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena L es un codón ATG que empieza a partir de la A 29 desde el extremo 5' de la SEQ ID NO: 29, y la región variable se extiende desde el extremo 5' hasta la adenina (A) 400. En la secuencia de aminoácidos, la región variable se extiende desde el N-terminal hasta la lisina (K) 124 de SEQ ID NO: 30. El análisis del N-terminal de la proteína de la cadena L purificada reveló que la secuencia señal de la cadena L se extiende desde el N-terminal hasta la glicina (G) 20 de SEQ ID NO: 30, y el N-terminal de la proteína madura es el ácido glutámico (E) 21 de SEQ ID NO: 30.

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Cadena H de 341-1-19 (SEQ ID NO: 27):

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Secuencia de aminoácidos de la cadena H de 341-1-19 (SEQ ID NO: 28)

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Cadena L de 341-1-19 (SEQ ID NO: 29):

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Secuencia de aminoácidos de la cadena L de 341-1-19 (SEQ ID NO: 30)

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Los ADNs de 2105 que codifican la región variable de la cadena H y la región variable de la cadena L y las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L se muestran posteriormente.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena H es un codón ATG que empieza a partir de la adenina (A) 70 a partir del extremo 5' de SEQ ID NO: 31. El límite de la región variable y la región constante del anticuerpo está situado entre la adenina (A) 495 y la guanina (G) 496 a partir del extremo 5'. En la secuencia de aminoácidos, la región variable de la cadena H se extiende desde el N-terminal hasta el residuo de serina (S) 142 de la SEQ ID NO: 32, y la región constante es desde la alanina (A) 149 y los siguientes residuos. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena H se extiende desde el N-terminal hasta la cisteína (C) 19 de SEQ ID NO: 32. Se cree que el N-terminal de la proteína madura es el ácido glutámico (E) 20 de la SEQ ID NO: 32.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena L es un codón ATG que empieza a partir de la A 28 desde el extremo 5' de la SEQ ID NO: 33, y la región variable se extiende desde el extremo 5' hasta la adenina (A) 405. En la secuencia de aminoácidos, la región variable se extiende desde el N-terminal hasta la lisina (K) 126 de SEQ ID NO: 34. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena L se extiende desde el N-terminal hasta la glicina (G) 20 de SEQ ID NO: 34. Se cree que el N-terminal de la proteína madura es el ácido glutámico (E) 21 de SEQ ID NO: 34.

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Cadena H de 2105 (SEQ ID NO: 31)

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Secuencia de aminoácidos de la cadena H de 2105 (SEQ ID NO: 32)

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Cadena L de 2105 (SEQ ID NO: 33)

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Secuencia de aminoácidos de la cadena L de 2105 (SEQ ID NO: 34)

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Los ADNs de 110 que codifican la región variable de la cadena H y la región variable de la cadena L y las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L respectivamente se muestran a continuación.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena H es un codón ATG que empieza a partir de la adenina (A) 60 a partir del extremo 5' de SEQ ID NO: 35. El límite de la región variable y la región constante del anticuerpo está situado entre la adenina (A) 479 y la guanina (G) 480 a partir del extremo 5'. En la secuencia de aminoácidos, la región variable de la cadena H se extiende desde el N-terminal de SEQ ID NO: 36 hasta el residuo de serina (S) 140, y la región constante es desde la alanina (A) 141 y los siguientes residuos. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena H se extiende desde el N-terminal hasta la cisteína (C) 19 de SEQ ID NO: 36. Se cree que el N-terminal de la proteína madura es la glutamina (Q) 20 de la SEQ ID NO: 36.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena L es un codón ATG que empieza a partir de la A 35 desde el extremo 5' de la SEQ ID NO: 37, y la región variable se extiende desde el extremo 5' hasta la adenina (A) 421. En la secuencia de aminoácidos, la región variable se extiende desde el N-terminal hasta la lisina (K) 129 de SEQ ID NO: 38. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena L se extiende desde el N-terminal hasta la cisteína (C) 22 de SEQ ID NO: 38. Se piensa que el N-terminal de la proteína madura es la valina (V) 23 de SEQ ID NO: 38.

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Cadena H de 110 (SEQ ID NO: 35)

25

Secuencia de aminoácidos de la cadena H de 110 (SEQ ID NO: 36)

26

Cadena L de 110 (SEQ ID NO: 37)

27

Secuencia de aminoácidos de la cadena L de 110 (SEQ ID NO: 38)

28

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Los ADNs de 115 que codifican la región variable de la cadena H y la región variable de la cadena L y las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L respectivamente se muestran a continuación.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena H es un codón ATG que empieza a partir de la adenina (A) 60 a partir del extremo 5' de SEQ ID NO: 39. El límite de la región variable y la región constante del anticuerpo está situado entre la adenina (A) 479 y la guanina (G) 480 a partir del extremo 5'. En la secuencia de aminoácidos, la región variable de la cadena H se extiende desde el N-terminal de SEQ ID NO: 40 hasta el residuo de serina (S) 140, y la región constante es desde la alanina (A) 141 y los siguientes residuos. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena H se extiende desde el N-terminal hasta la cisteína (C) 19 de SEQ ID NO: 40. Se cree que el N-terminal de la proteína madura es la glutamina (Q) 20 de la SEQ ID NO: 40.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena L es un codón ATG que empieza a partir de la A 35 desde el extremo 5' de la SEQ ID NO: 41, y la región variable se extiende desde el extremo 5' hasta la adenina (A) 421. En la secuencia de aminoácidos, la región variable se extiende desde el N-terminal hasta la lisina (K) 129 de SEQ ID NO: 42. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena L se extiende desde el N-terminal hasta la cisteína (C) 22 de SEQ ID NO: 42. Se piensa que el N-terminal de la proteína madura es la valina (V) 23 de SEQ ID NO: 42.

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Cadena H de 115 (SEQ ID NO: 39)

29

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Secuencia de aminoácidos de la cadena H de 115 (SEQ ID NO: 40)

31

\vskip1.000000\baselineskip

Cadena L de 115 (SEQ ID NO: 41)

32

\newpage

Secuencia de aminoácidos de la cadena L de 115 (SEQ ID NO: 42)

33

Los ADNs de 281-1-10 que codifican la región variable de la cadena H y la región variable de la cadena L y las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L respectivamente se muestran a continuación.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena H es un codón ATG que empieza a partir de la adenina (A) 52 a partir del extremo 5' de SEQ ID NO: 43. El límite de la región variable y la región constante del anticuerpo está situado entre la adenina (A) 468 y la guanina (G) 469 a partir del extremo 5'. En la secuencia de aminoácidos, la región variable de la cadena H se extiende desde el N-terminal de SEQ ID NO: 44 hasta el residuo de serina (S) 139, y la región constante es desde la alanina (A) 140 y los siguientes residuos. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena H se extiende desde el N-terminal hasta la serina (S) 19 de SEQ ID NO: 44. Se cree que el N-terminal de la proteína madura es la glutamina (Q) 20 de la SEQ ID NO: 44.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena L es un codón ATG que empieza a partir de la A 41 desde el extremo 5' de la SEQ ID NO: 45, y la región variable se extiende desde el extremo 5' hasta la adenina (A) 424. En la secuencia de aminoácidos, la región variable se extiende desde el N-terminal hasta la lisina (K) 128 de SEQ ID NO: 46. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena L se extiende desde el N-terminal hasta la glicina (G) 20 de SEQ ID NO: 46. Se piensa que el N-terminal de la proteína madura es el ácido glutámico (E) 21 de SEQ ID NO: 46.

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Cadena H de 281-1-10 (SEQ ID NO: 43)

34

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Secuencia de aminoácidos de la cadena H de 281-1-10 (SEQ ID NO: 44)

35

\newpage

Cadena L de 281-1-10 (SEQ ID NO: 45)

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36

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Secuencia de aminoácidos de la cadena L de 281-1-10 (SEQ ID NO: 46)

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37

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Los ADNs de 4D11 que codifican la región variable de la cadena H y la región variable de la cadena L y las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L respectivamente se muestran a continuación.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena H es un codón ATG que empieza a partir de la adenina (A) 16 a partir del extremo 5' de SEQ ID NO: 47. El límite de la región variable y la región constante del anticuerpo está situado entre la adenina (A) 456 y la guanina (G) 457 a partir del extremo 5'. En la secuencia de aminoácidos, la región variable de la cadena H se extiende desde el N-terminal de SEQ ID NO: 48 hasta el residuo de serina (S) 147, y la región constante es desde la alanina (A) 148 y los siguientes residuos. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena H se extiende desde el N-terminal hasta la serina (S) 26 de SEQ ID NO: 48. Se cree que el N-terminal de la proteína madura es la glutamina (Q) 27 de la SEQ ID NO: 48.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena L es un codón ATG que empieza a partir de la A 59 desde el extremo 5' de la SEQ ID NO: 49, y la región variable se extiende desde el extremo 5' hasta la adenina (A) 442. En la secuencia de aminoácidos, la región variable se extiende desde el N-terminal hasta la lisina (K) 128 de SEQ ID NO: 50. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena L se extiende desde el N-terminal hasta la cisteína (C) 22 de SEQ ID NO: 50. Se piensa que el N-terminal de la proteína madura es la alanina (A) 23 de SEQ ID NO: 50.

\vskip1.000000\baselineskip

Cadena H de 4D11 (SEQ ID NO: 47)

38

\newpage

Secuencia de aminoácidos de la cadena H de 4D11 (SEQ ID NO: 48)

39

\vskip1.000000\baselineskip

Cadena L de 4D11 (SEQ ID NO: 49)

40

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de aminoácidos de la cadena L de 4D11 (SEQ ID NO: 50)

41

\vskip1.000000\baselineskip

Los ADNs de KM643-4-11 que codifican la región variable de la cadena H y la región variable de la cadena L y las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L respectivamente se muestran a continuación.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena H es un codón ATG que empieza a partir de la adenina (A) 1 a partir del extremo 5' de SEQ ID NO: 51. El límite de la región variable y la región constante del anticuerpo está situado entre la adenina (A) 447 y la guanina (G) 448 a partir del extremo 5'. En la secuencia de aminoácidos, la región variable de la cadena H se extiende desde el N-terminal de SEQ ID NO: 52 hasta el residuo de serina (S) 149, y la región constante es desde la alanina (A) 150 y los siguientes residuos. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena H se extiende desde el N-terminal hasta la serina (S) 20 de SEQ ID NO: 52. Se cree que el N-terminal de la proteína madura es la glutamina (Q) 21 de SEQ ID NO: 52.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena L es un codón ATG que empieza a partir de la A 38 desde el extremo 5' de SEQ ID NO: 53, y la región variable se extiende desde el extremo 5' hasta la adenina (A) 409. En la secuencia de aminoácidos, la región variable se extiende desde el N-terminal hasta la lisina (K) 124 de SEQ ID NO: 54. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena L se extiende desde el N-terminal hasta la glicina (G) 20 de SEQ ID NO: 54. Se piensa que el N-terminal de la proteína madura es el ácido glutámico (E) 21 de SEQ ID NO: 54.

\newpage

Cadena H de KM643-4-11 (SEQ ID NO: 51)

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42

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Secuencia de aminoácidos de la cadena H de KM643-4-11 (SEQ ID NO: 52)

\vskip1.000000\baselineskip

43

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Cadena L de KM643-4-11 (SEQ ID NO: 53)

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44

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencia de aminoácidos de la cadena L de KM643-4-11 (SEQ ID NO: 54)

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45

Los ADNs de F4-465 que codifican la región variable de la cadena H y la región variable de la cadena L y las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L respectivamente se muestran a continuación.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena H es un codón ATG que empieza a partir de la adenina (A) 47 a partir del extremo 5' de SEQ ID NO: 55. El límite de la región variable y la región constante del anticuerpo está situado entre la adenina (A) 484 y la guanina (G) 485 a partir del extremo 5'. En la secuencia de aminoácidos, la región variable de la cadena H se extiende desde el N-terminal de SEQ ID NO: 56 hasta el residuo de serina (S) 146, y la región constante es desde la alanina (A) 147 y los siguientes residuos. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena H se extiende desde el N-terminal hasta la serina (S) 19 de SEQ ID NO: 56. Se cree que el N-terminal de la proteína madura es la glutamina (Q) 20 de SEQ ID NO: 56.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena L es un codón ATG que empieza a partir de la A 81 desde el extremo 5' de SEQ ID NO: 57, y la región variable se extiende desde el extremo 5' hasta la (C) 440. En la secuencia de aminoácidos, la región variable se extiende desde el N-terminal hasta la treonina (T) 120 de SEQ ID NO: 58. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena L se extiende desde el N-terminal hasta la alanina (G) 19 de SEQ ID NO: 58. Se piensa que el N-terminal de la proteína madura es la serina (S) 20 de SEQ ID NO: 58.

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Cadena H de F4-465 (SEQ ID NO: 55)

\vskip1.000000\baselineskip

46

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Secuencia de aminoácidos de la cadena H de F4-465 (SEQ ID NO: 56)

\vskip1.000000\baselineskip

48

\newpage

Cadena L de F4-465 (SEQ ID NO: 57)

49

Secuencia de aminoácidos de la cadena L de F4-465 (SEQ ID NO: 58)

50

Los ADNs de F2-103 que codifican la región variable de la cadena H y la región variable de la cadena L y las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L respectivamente se muestran a continuación.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena H es un codón ATG que empieza a partir de la adenina (A) 32 a partir del extremo 5' de SEQ ID NO: 59. El límite de la región variable y la región constante del anticuerpo está situado entre la adenina (A) 463 y la guanina (G) 464 a partir del extremo 5'. En la secuencia de aminoácidos, la región variable de la cadena H se extiende desde el N-terminal de SEQ ID NO: 60 hasta el residuo de serina (S) 144, y la región constante es desde la alanina (A) 145 y los siguientes residuos. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena H se extiende desde el N-terminal hasta la cisteína (C) 19 de SEQ ID NO: 60. Se cree que el N-terminal de la proteína madura es el ácido glutámico (E) 20 de SEQ ID NO: 60.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena L es un codón ATG que empieza a partir de la A 29 desde el extremo 5' de SEQ ID NO: 61, y la región variable se extiende desde el extremo 5' hasta la adenina (A) 415. En la secuencia de aminoácidos, la región variable se extiende desde el N-terminal hasta la lisina (K) 129 de SEQ ID NO: 62. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena L se extiende desde el N-terminal hasta la cisteína (C) 22 de SEQ ID NO: 62. Se piensa que el N-terminal de la proteína madura es el Asp (D) 23 de SEQ ID NO: 62.

Cadena H de F2-103 (SEQ ID NO: 59)

51

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Secuencia de aminoácidos de la cadena H de F2-103 (SEQ ID NO: 60)

53

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Cadena L de F2-103 (SEQ ID NO: 61)

54

Secuencia de aminoácidos de la cadena L de F2-103 (SEQ ID NO: 62)

55

Los ADNs de F5-77 que codifican la región variable de la cadena H y la región variable de la cadena L y las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L respectivamente se muestran a continuación.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena H es un codón ATG que empieza a partir de la adenina (A) 100 a partir del extremo 5' de SEQ ID NO: 63. El límite de la región variable y la región constante del anticuerpo está situado entre la adenina (A) 528 y la guanina (G) 529 a partir del extremo 5'. En la secuencia de aminoácidos, la región variable de la cadena H se extiende desde el N-terminal de SEQ ID NO: 64 hasta el residuo de serina (S) 143, y la región constante es desde la alanina (A) 144 y los siguientes residuos. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena H se extiende desde el N-terminal hasta la cisteína (C) 19 de SEQ ID NO: 64. Se cree que el N-terminal de la proteína madura es el ácido glutámico (E) 20 de SEQ ID NO: 64.

El punto de inicio de la traducción del ADN de la cadena L es un codón ATG que empieza a partir de la A 59 desde el extremo 5' de SEQ ID NO: 65, y la región variable se extiende desde el extremo 5' hasta la adenina (A) 445. En la secuencia de aminoácidos, la región variable se extiende desde el N-terminal hasta la lisina (K) 129 de SEQ ID NO: 66. Se predijo mediante un software de predicción de secuencia de genes (Signal P ver.2) que la secuencia señal de la cadena L se extiende desde el N-terminal hasta la cisteína (C) 22 de SEQ ID NO: 66. Se piensa que el N-terminal de la proteína madura es el Asp (D) 23 de SEQ ID NO: 66.

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Cadena H de F5-77 (SEQ ID NO: 63)

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56

\newpage

Secuencia de aminoácidos de la cadena H de F5-77 (SEQ ID NO: 64)

58

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Cadena L de F5-77 (SEQ ID NO: 65)

59

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Secuencia de aminoácidos de la cadena L de F5-77 (SEQ ID NO: 66)

60

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Ejemplo 18 Expresión de la proteína anticuerpo en células animales

Los fragmentos de ADN anteriores obtenidos que contienen la región variable del anticuerpo se incorporaron en un vector apropiado tal como N5KG1 (IDEC Pharmaceuticals, Patente de EE.UU. 6001358), preparando así un vector de expresión de anticuerpo. Como célula huésped para expresión, por ejemplo se utiliza apropiadamente, CHO-Ras (Katakura Y., et al., Cytotechnology, 31: 103-109, 199). El vector se puede introducir en las células huésped mediante, por ejemplo, electroporación. Aproximadamente se linearizaron 2 \mug del vector de expresión de anticuerpo con una enzima restricción. El gen se introdujo en 4x107 células CHO-Ras en condiciones de 350 V y 500 \muF utilizando un electroporador de Bio-Rad, y después inoculadas en una placa de cultivo de 96 pocillos. Se añadió una droga correspondiente al marcador de selección del vector de expresión, y se continuó con el cultivo. Cuando se observaron colonias, se seleccionaron las líneas que expresan anticuerpos mediante el método descrito en el Ejemplo 4. Los anticuerpos se pueden purificar de las células seleccionadas según el Ejemplo 5.

Ejemplo 19 Acción supresora de la producción de anticuerpo específica de antígeno del anticuerpo antagonista de CD40

Se sensibilizaron ratones con unos antecedentes genéticos por los que eran homocigotos para el CD40 endógeno de ratón interrumpido y que llevan un transgén del gen de CD40 humano (Yasui et al., Int. Immunol. 2000 Vol 14: 319) mediante inyección intraperitoneal de 100 \mug (en una cantidad de NP-CGG) de un complejo conjugados de 4-hidroxi-3-nitrofenilacetil-\gamma-globulina de pollo (NP-CGG: distribuido por Hitoshi KIKUTANI, Profesor, Instituto de Investigación de Enfermedades Microbiológicas, Universidad de Osaka) y ARAM (ARAM: Antigen Recognition Activation Motif, Motivo de activación por reconocimiento de antígeno). Se administraron 30 ó 100 \mug de cada anticuerpo monoclonal a través de la vena caudal inmediatamente antes de la sensibilización. Como control negativo se administraron 100 \mug de anticuerpo IgG4 anti-albúmina humana. 7 días después de la sensibilización, se recogió sangre del plexo venoso orbital, y se midieron las cantidades de anticuerpos IgG1 e IgM específicos de NP en suero mediante el método de ELISA. El método de ELISA se realizó añadiendo seroalbúmina bovina unida a NP (NP-BSA: 2.5 \mug/ml) (50 \mul/pocillo) a cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos para ELISA (Maxisorp, Nunc), incubando a 4ºC y después absorbiendo NP-BSA. A continuación, se desechó el sobrenadante, se añadió a cada pocillo un reactivo bloqueante (Super Block, Pierce), y se llevó a cabo la incubación a temperatura ambiente para bloquear. Cada pocillo se lavó 3 veces con un tampón fosfato con Tween20 al 0.1% (PBS-T). Posteriormente, se añadió a cada pocillo cada suero diluido con PBS-T que contenía BlockAce al 10% (50 \mul/pocillo), seguido por incubación a 37ºC durante 2 horas para la reacción. La microplaca se lavó 3 veces con PBS-T. Se añadió a cada pocillo una solución preparada diluyendo 1000 veces anticuerpo de cabra anti-IgG1 o IgM de ratón marcado con fosfatasa alcalina (COSMO BIO 1070-04 ó 1020-04) con PBS-T que contenía BlockAce al 10% (50 \mul/pocillo), seguido por 2 horas de incubación a 37ºC. A continuación, se lavó la microplaca 3 veces con PBS-T, se añadió a cada pocillo una solución cromogénica (50 \mul/pocillo, Sigma104, sustrato de fosfatasa), y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm con un lector de microplacas. Las Figuras 18 y 19 muestran los resultados. En las figuras, los ejes longitudinales indican los valores obtenidos mediante conversión utilizando como unidad el suero diluido 10000 veces en el caso del anticuerpo IgG1, y el suero diluido 100 veces en el caso del anticuerpo IgM. Aquí, el suero se preparó inyectando dos veces NP-CGG en ratones C57BL/6, recogiendo la sangre de los ratones, y juntando el suero. La administración de 100 \mug de cada uno de los anticuerpos F4-465, 4D11 y KM281-1-10 suprimió fuertemente la producción de anticuerpos IgG1 e IgM específicos para NP.

Ejemplo 20 Supresión de la proliferación de células B amigdalinas por anticuerpo antagonista de CD40

Se obtuvieron amígdalas humanas del Hospital Infantil (San Diego, California, EE.UU.). Las amígdalas se cortaron en trozos pequeños, se desmenuzaron, y después se pasaron a través de un filtro para células con una malla de nylon de 70 micrómetros, preparando así una suspensión celular. La suspensión celular se lavó varias veces con PBS, se contó el número de células, y la suspensión se congeló en suero humano (ICN) al 90% y DMSO al 10%. Después de descongelar, las células se resuspendieron en un medio RPMI estándar suplementado con suero humano al 10% y anfotericina 2.5 \mug/ml (fangizon, Gibco/BRL), y después se usaron.

Se añadieron 1x10^{5} células a una placa de 96 pocillos, y después se añadieron anticuerpos anti-CD40 humano a concentraciones de 0.01, 0.1, 1.0 y 10 \mug/ml. El ensayo se realizó por triplicado para concentración. Se añadieron a cada pocillo CD40L marcados con flag a 1 \mug/ml (Alexis) y anticuerpos potenciadores de CD40L a 1 \mug/ml (Alexis), seguido por 3 días de cultivo. Entonces, se añadió a cada pocillo 1 \muCi de [^{3}H]timidina. 12 a 15 horas después, se recogieron las células, y se midió la proliferación de células B amigdalinas utilizando un contador de centelleo líquido. El recuento obtenido cuando las células B habían proliferado debido a la estimulación de CD40L y no se había añadido anticuerpo se determinó como 100, y el recuento obtenido cuando no se había añadido CD40L y las células no se habían estimulado se determinó como 0. Por ejemplo, cuando el recuento relativo medido fue de 30, esto se expresó en este experimento como que se había producido una inhibición de la proliferación del 70%.

5D12, que es el anticuerpo antagonista conocido, no mostró una inhibición de la proliferación de más del 50% incluso con la concentración de anticuerpo de 100 \mug/ml. F4-465 mostró una supresión de la proliferación aproximadamente del 80% incluso a la concentración del anticuerpo tan baja como 0.01 \mug/ml, y mostró una supresión de la proliferación aproximadamente del 95% a una concentración de anticuerpo de 0.1 a 10 \mug/ml (Fig. 20).

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona un anticuerpo contra CD40. El anticuerpo de la presente invención incluye tanto un anticuerpo que actúa de forma agonista sobre CD40 como un anticuerpo que actúa de forma antagonista sobre CD40. De este modo, estos anticuerpos son útiles como, por ejemplo, un agente inmunopotenciador y un agente inmunosupresor, respectivamente.

Lista de secuencias en texto libre

SEQ ID NO: 1: ADN sintético

SEQ ID NO: 2: ADN sintético

SEQ ID NO: 3: ADN sintético

SEQ ID NO: 4: ADN sintético

SEQ ID NO: 5: ADN sintético

SEQ ID NO: 6: ADN sintético

SEQ ID NO: 7: ADN sintético

SEQ ID NO: 8: ADN sintético

SEQ ID NO: 9: ADN sintético

SEQ ID NO: 10: ADN sintético

SEQ ID NO: 11: ADN sintético

SEQ ID NO: 12: ADN sintético

SEQ ID NO: 13: ADN sintético

SEQ ID NO: 14: ADN sintético

SEQ ID NO: 15: ADN sintético

SEQ ID NO: 16: ADN sintético

SEQ ID NO: 17: ADN sintético

SEQ ID NO: 18: ADN sintético

SEQ ID NO: 19: ADN sintético

SEQ ID NO: 20: ADN sintético

SEQ ID NO: 21: ADN sintético

SEQ ID NO: 22: ADN sintético

SEQ ID NO: 13: ADN sintético

SEQ ID NO: 24: ADN sintético

SEQ ID NO: 25: ADN sintético

SEQ ID NO: 26: ADN sintético

<110> KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA

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<120> ANTICUERPO MONOCLONAL ANTI-CD40

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<130> PH-1569-PCT

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<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/US01/13672

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 27-04-2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US09/844,684

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 27-04-2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP2001/142482

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 11-05-2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP2001/310535

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 05-10-2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US10/040,244

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 26-10-2001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 66

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccagatctg tccatccaga accacccact gcatgcagag

\hfill

40

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

acaagatctg ggctctacgt atctcagccg atcctgggga c

\hfill

41

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtccgggag atcatgaggg tgtcctt

\hfill

27

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgcacgccg ctggtcaggg cgcctg

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 25

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctggagggc acggtcacca cgctg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtgccaggg ggaagaccga tgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatgtcgac gctgaattct ggctgaccag ggcag

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatgtcgac tcccaggtgt ttccattcag tgatcag

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatgtcgac ttccattcgg tgatcagcac tgaacac

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatgtcgac tttgagagtc ctggacctcc tgtg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatgtcgac gagtcatgga tctcatgtgc aag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatgtcgac ccagggcagt caccagagct ccagac

\hfill

36

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgtgtcga ctacgcggga gtgact

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgtgtcga cgctgatcag gactgcaca

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgtgtcga cggtgatcag gactgaacag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttgaagctc tttgtgacgg gcgagc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcttctccac ggtgctccct tcat

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatagatct gaactgctca gttaggaccc agagg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatagatct cgcggggaag gagactgctc agtt

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatagatct agtcagaccc agtcaggaca cagc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatagatct gagctgctca gttaggaccc agaggg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatagatct taagcaagtg taacaactca gagtac

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatagatct gaggaactgc tcagttagga cccagagg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactccagat ctgcctcagg aagcagcatc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactccagat ctagggcaag cagtggtaac

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Descripción de la secuencia artificial: ADN sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggcgggaag atgaagacag atggtg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1480

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 474

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

63

64

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 406

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

67

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 508

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 414

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 493

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 427

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 492

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

79

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 427

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

81

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

82

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 481

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

85

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 430

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

88

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 462

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

91

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 448

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 453

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

97

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 414

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

99

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 495

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

101

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 830

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

104

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 520

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

107

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 698

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

110

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 630

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

113

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 728

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

116

117

Claims (23)

1. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo para CD40 humano que tiene secuencias de aminoácidos de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por un hibridoma 4D11 con el No. de acceso de FERM BP-7758.

2. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo para CD40 humano que tiene secuencias de aminoácidos de las partes maduras de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo producido por un hibridoma 4D11 con el No. de acceso de FERM BP-7758, que están respectivamente representadas por SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 50.

3. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo para CD40 humano que tiene secuencias de aminoácidos, que se extienden respectivamente desde la Q 27 hasta la S 147 de SEQ ID NO: 48 y desde la A 23 a la K 128 de SEQ ID NO: 50.

4. El anticuerpo o fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un anticuerpo humano.

5. Una composición farmacéutica, que contiene como principio activo el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, que se utiliza como un agente inmunosupresor, agente anti-enfermedad autoinmune, agente terapéutico contra alergias o agente terapéutico contra el síndrome de inhibición del factor VIII de coagulación de la sangre.

7. Uso del anticuerpo o fragmento funcional del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la producción de una composición farmacéutica de la reivindicación 6, que se utiliza como un agente inmunosupresor, agente anti-enfermedad autoinmune, agente terapéutico contra alergias o agente terapéutico contra el síndrome de inhibición del factor VIII de coagulación de la sangre.

8. Un hibridoma 4D11 con el No. de acceso de FERM BP-7758.

9. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo para CD40 humano producido por un hibridoma 4D11 con el No. de acceso de FERM BP-7758.

10. Un ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo aislado de un hibridoma 4D11 con el No. de acceso de FERM BP-7758.

11. El ácido nucleico de la reivindicación 10, que es ARN o ADNc.

12. Un ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo aislado de un hibridoma 4D11 con el No. de acceso de FERM BP-7758.

13. El ácido nucleico de la reivindicación 12, que es ARN o ADNc.

14. Un vector que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 10 ó 12.

15. Una célula huésped que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 10 ó 12.

16. Un método para producir un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo a partir de una célula huésped en la que se ha introducido un vector que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 10 ó 12.

17. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo para CD40 humano, que tiene secuencias de aminoácidos de las partes maduras de una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera que están codificadas por secuencias de ácidos nucleicos aisladas de un hibridoma 4D11, que están respectivamente representadas por SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 49.

18. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo para CD40 humano, que tiene secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de ácidos nucleicos que se extienden respectivamente desde la C 94 hasta la A 496 de SEQ ID NO: 47 y desde la G 125 hasta la A 442 de SEQ ID NO: 49.

19. Un método para producir un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo para CD40 humano a partir de una célula huésped en la que se ha introducido un vector que contenía un ácido nucleico que codifica una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera del anticuerpo aislado de un hibridoma 4D11 con el No. de acceso de FERM BP-7758.

\newpage

20. Una región variable de la cadena pesada del anticuerpo para CD40 humano producido por un hibridoma 4D11 con el No. de acceso de FERM BP-7758.

21. Una región variable de la cadena ligera del anticuerpo para CD40 humano producido por un hibridoma 4D11 con el No. de acceso de FERM BP-7758.

22. Una parte madura de una región variable de la cadena pesada del anticuerpo para CD40 humano, que está representado por SEQ ID NO: 48.

23. Una parte madura de una región variable de la cadena ligera del anticuerpo para CD40 humano, que está representado por SEQ ID NO: 50.