ES2344304T3 - Un metodo para medir el colesterol en lipoproteinas remanentes. - Google Patents
Un metodo para medir el colesterol en lipoproteinas remanentes. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2344304T3 ES2344304T3 ES05809660T ES05809660T ES2344304T3 ES 2344304 T3 ES2344304 T3 ES 2344304T3 ES 05809660 T ES05809660 T ES 05809660T ES 05809660 T ES05809660 T ES 05809660T ES 2344304 T3 ES2344304 T3 ES 2344304T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cholesterol
- activity
- esterase
- lipoproteins
- lipoprotein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Un método para medir el colesterol en lipoproteínas remanentes en el que se utiliza una colesterol esterasa en un método para medir el colesterol en las lipoproteínas mediante la medición del peróxido de hidrógeno o una coenzima reducida obtenidos al permitir que la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa o una colesterol deshidrogenasa actúe sobre una muestra de ensayo que contiene una lipoproteína caracterizado porque la colesterol esterasa no sólo tiene actividad esterasa, sino también actividad lipoproteína lipasa con lo que la razón de actividad de una lipoproteína lipasa con respecto a una colesterol esterasa (actividad lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa) es de 12 a 7000.
Description
Un método para medir el colesterol en
lipoproteínas remanentes.
La presente invención se refiere a un método
para medir el colesterol en lipoproteínas remanentes, y también
para la medición de un reactivo para el colesterol en lipoproteínas
remanentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Con la tendencia reciente hacia una sociedad que
envejece, la morbilidad de las enfermedades de adultos está
aumentando rápidamente. En particular, la arteriosclerosis es bien
conocida como uno de los principales factores causantes de
enfermedades del sistema circulatorio, tales como las enfermedades
del corazón y las enfermedades cerebrovasculares (incluyendo el
infarto cerebral).
La acumulación de colesterol en los vasos
sanguíneos desempeña un papel esencial en el crecimiento de la
arteriosclerosis, y se asocia a varias lipoproteínas en la sangre.
Las lipoproteínas, incluyen el colesterol, los ésteres de
colesterol, la grasa neutra, los fosfolípidos y las apoproteínas
como componentes. De estas lipoproteínas, el colesterol en las
lipoproteínas de alta densidad (HDL) se conoce como un factor de
riesgo negativo para la arteriosclerosis, mientras que el
colesterol en lipoproteínas de baja densidad (LDL) es conocido como
un factor de riesgo positivo para la arteriosclerosis. Estos
colesteroles se observan frecuentemente en el campo del diagnóstico
clínico.
En los últimos años, sin embargo, se ha
informado de que el colesterol en una lipoproteína inducida por un
metabolismo lipídico tal como una lipoproteína remanente, más que el
colesterol LDL, es un indicador más estrechamente relacionado como
factor de riesgo de la arteriosclerosis. Desde el punto de vista de
estos problemas, es cada vez más necesario desarrollar un método
tecnológico para la medición de colesteroles en lipoproteínas de
muestras biológicas con mayor facilidad y eficiencia.
Entre los métodos convencionales existentes para
medir enzimáticamente el colesterol en lipoproteínas remanentes,
hay informes que describen un método caracterizado por una creciente
selectividad de medición mediante el uso de un gel sobre el cual se
inmoviliza un anticuerpo para una apoproteína como componente de la
lipoproteína o utilizando una enzima que degrada fosfolípidos, un
tensioactivo, o similares, lo que permite a la colesterol esterasa
y la colesterol oxidasa o la colesterol deshidrogenasa actuar para
que el éster de colesterol se convierta en colesterol, y luego
medir el peróxido de hidrógeno o la coenzima reducida producidos
(véanse los Documentos de Patente 1 y 2 y el Documento No de
Patente 1).
Incluso esos métodos, sin embargo, tienen
ventajas y desventajas en términos de selectividad de las
lipoproteínas remanentes, facilidad de operación, período de tiempo
de medición, y similares, y por lo tanto no son necesariamente
suficientes.
Documento de Patente 1: Solicitud de Patente
Japonesa Abierta a la Inspección Pública (JP-A) Núm.
2001-231597.
Documento de Patente 2: Patente Japonesa Núm.
2949354
Documento No de Patente 1: Domyakukoka
(arteriosclerosis), 25 (9, 10), 371 (1998).
\vskip1.000000\baselineskip
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un método para la medición con más facilidad y
precisión del colesterol en una proteína remanente y proporcionar
un reactivo para su uso en la realización de ese método.
A la luz de las circunstancias, los autores de
la presente invención se han centrado en el hecho de que muchas
colesterol esterasas tienen no sólo actividad esterasa sino también
un poco de actividad lipoproteína lipasa e investigaron varias
afecciones para la medición del colesterol en lipoproteínas. Como
resultado, se ha encontrado que si una colesterol esterasa en que
la tasa de actividad de la lipoproteína lipasa es superior a la de
la colesterol esterasa se selecciona y se utiliza con la colesterol
oxidasa o la colesterol deshidrogenasa para medir el colesterol de
las lipoproteínas, la selectividad hacia las lipoproteínas
remanentes será alta y el colesterol de las lipoproteínas
remanentes puede ser medido de forma selectiva a partir de muestras
biológicas que contienen lipoproteínas tales como las lipoproteínas
de alta densidad (HDL), las lipoproteínas de baja densidad (LDL),
los quilomicrones (CM), las lipoproteínas de muy baja densidad
(VLDL), los CM remanentes, las VLDL remanentes y las lipoproteínas
de densidad intermedia (IDL) remanentes.
Por lo tanto, la presente invención está
dirigida a un método para medir el colesterol en lipoproteínas
remanentes, caracterizado porque se utiliza una colesterol
esterasa, en la que la razón de actividad de una lipoproteína
lipasa con respecto a una colesterol esterasa (actividad
lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa) es de 12 a 7000,
en un método para medir el colesterol en la lipoproteína midiendo el
peróxido de hidrógeno o una coenzima reducida obtenida al permitir
que la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa o una colesterol
deshidrogenasa actúe en una muestra de ensayo que contenga una
lipoproteína.
La presente invención también se refiere a un
reactivo de medición para el colesterol en lipoproteínas remanentes,
incluyendo: una colesterol esterasa en la que la razón de actividad
de una lipoproteína lipasa con respecto a una colesterol esterasa
(actividad lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa) es de
12 a 7000; y una colesterol oxidasa o una colesterol
deshidrogenasa.
Cuando se utilizan el método de medición y el
reactivo de medición de acuerdo con la presente invención, el
colesterol de las lipoproteínas remanentes se puede medir muy
fácilmente con alta sensibilidad en poco tiempo.
La Fig. 1 es un gráfico que muestra la
especificidad de reacción con respecto a LDL en un caso en el que se
utiliza una enzima LP;
La Fig. 2 es un gráfico que muestra la
especificidad de reacción con respecto HDL en un caso en el que se
utiliza una enzima LP;
La Fig. 3 es un gráfico que muestra la
especificidad de reacción con respecto a VLDL no unida y VLDL unida
en el método de la presente invención;
La Fig. 4 es un gráfico que muestra la
reactividad con respecto a VLDL no unida y VLDL unida en un caso en
el que se añaden anticuerpos, y
La Fig. 5 es un gráfico que muestra una
correlación entre el método de medición de la presente invención y
un método de medición existente (RLP-II) cuando se
miden las lipoproteínas remanentes en sangre.
De acuerdo con la presente invención, el método
para medir el colesterol en las lipoproteínas remanentes se realiza
de la siguiente manera: se miden el peróxido de hidrógeno o una
coenzima reducida obtenidos al permitir que la colesterol esterasa
y la colesterol oxidasa o una colesterol deshidrogenasa actúen y se
utiliza una colesterol esterasa, en la que la razón de actividad de
la lipoproteína lipasa (LPL) con respecto a la colesterol esterasa
(CE) (actividad lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa)
es de 12 a 7000.
La colesterol esterasa es una enzima que puede
hidrolizar los ésteres de colesterol de las lipoproteínas para
producir colesterol. Se sabe que en muchos casos, esta enzima tiene
no sólo actividad esterasa sino también una pequeña actividad
lipoproteína lipasa, es decir, actividad lipasa que hidroliza la
grasa neutra. En la presente invención, es necesario utilizar una
colesterol esterasa que tenga una actividad lipoproteína lipasa más
fuerte que la actividad colesterol esterasa y, específicamente, es
necesario utilizar una colesterol esterasa en la que la razón de
actividad de la lipoproteína lipasa con respecto a la colesterol
esterasa (actividad lipoproteína lipasa/actividad colesterol
esterasa) sea de 12 a 7000, de modo que la enzima pueda actuar
selectivamente sobre las lipoproteínas remanentes para permitir la
hidrólisis selectiva de los ésteres de colesterol en la proteína.
Por tanto, sólo se puede medir selectivamente el colesterol deseado
de las lipoproteínas remanentes.
En la presente memoria, la actividad
lipoproteína lipasa se refiere a una unidad de actividad que se
calcula de acuerdo a un método de análisis de la actividad
lipoproteína lipasa utilizando una emulsión de aceite de oliva
(Horiuchi Y. et al., J Biochem 1976;
80:367-370), y la actividad colesterol esterasa se
refiere a una unidad de actividad que se calcula según un método de
análisis de la actividad CEN utilizando un suero bovino (Kameno Y.
et al., J Clin Jap Ruta 1976; 24:650).
La razón de actividad de la lipoproteína lipasa
con respecto a la colesterol esterasa (actividad lipoproteína
lipasa/actividad colesterol esterasa) (en adelante referida
simplemente como "razón de actividad") es de 12 a 7000,
preferiblemente de 20 a 1000, más preferiblemente de 28 a 800.
Los ejemplos de la colesterol esterasa que tiene
tal razón de actividad incluyen LP (con una razón de actividad de
460 a 800, fabricada por Asahi Kasei Pharma Corporation), LPBP (con
un razón de actividad de 5600 a 6900, fabricada por Asahi Kasei
Pharma Corporation), CEN (con una razón de actividad de 13,0 a 16,0,
fabricada por Asahi Kasei Pharma Corporation), CE (con una razón de
actividad de 13,0 a 16,0, fabricada por Amano Enzyme Inc.), COE 311
(con una razón de actividad de 28,0 a 35,0, fabricada por Toyobo
Co., Ltd.), y enzimas que tienen la misma razón de actividad que
cualquiera de las anteriores.
La colesterol esterasa puede ser cualquiera
entre una enzima derivada de microorganismos y una enzima de origen
animal, siempre y cuando cumpla las condiciones anteriores.
La cantidad de colesterol esterasa puede estar
por lo general en el intervalo de 0,1 a 200 unidades/ml,
preferiblemente de 1 a 100 unidades/mL, dependiendo del contenido o
las propiedades físicas de las lipoproteínas remanentes en la
muestra de ensayo. En general, para los sujetos sanos, se pueden
obtener buenos resultados de medición con una cantidad de 1 a 5
unidades/mL.
Aquí, se deben utilizar preferiblemente al menos
50 unidades/mL de la colesterol esterasa para los pacientes con
hiperlipemia, particularmente para los pacientes con hiperlipidemia
familiar de tipo III, para lo cual se ha demandado un método de
medición sencillo. Para las mujeres embarazadas sanas, en las que se
observa generalmente un aumento en el valor del colesterol en
sangre, se pueden obtener buenos valores medidos utilizando 20
unidades/mL de la colesterol esterasa de acuerdo con la presente
invención.
De acuerdo con la presente invención, el método
para medir el colesterol en lipoproteínas remanentes puede incluir
el pretratamiento de la muestra con un anticuerpo
anti-apoB-100 y/o un anticuerpo
anti-apoA-I. La adición del
anticuerpo puede incrementar la selectividad de la colesterol
esterasa hacia LDL o VLDL teniendo como componente y HDL o CM
teniendo apoA-I como componente.
Tal técnica de tratamiento con anticuerpos se
describe en la Patente Japonesa Núm. 2949354, en la que el
procedimiento de operación incluye añadir un gel con anticuerpos
unidos a una muestra y dejarlo reposar durante varias horas para
separar las lipoproteínas remanentes de las otras lipoproteínas
(HDL, LDL, VLDL, CM) de modo que la selectividad de la colesterol
esterasa aumenta circunstancialmente. Por el contrario, cuando se
utiliza la colesterol esterasa según la presente invención, no hay
necesidad de inmovilizar el anticuerpo en un gel, y la acción de la
enzima sobre lipoproteínas distintas de las lipoproteínas
remanentes puede ser inhibida sólo mediante la adición del
anticuerpo. Como resultado, la selectividad a la lipoproteína
remanente se puede aumentar. En el primer método, el anticuerpo
inmovilizado en el gel se debe dejar reposar durante mucho tiempo
después de la adición. De acuerdo con el método de la presente
invención, sin embargo, el objeto se logra mediante la unión entre
el anticuerpo y la lipoproteína, y por lo tanto, la siguiente
operación se puede realizar varios minutos después de la adición,
por lo que se pueden realizar mejoras espectaculares en la
simplicidad, la medición de la exactitud y la reducción del tiempo
del procedimiento.
Se puede utilizar cualquier anticuerpo
apoB-100 o apoA-I sin limitaciones
particulares, y el anticuerpo a utilizar puede ser cualquier
anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal y una de sus
combinaciones. Un ejemplo de los anticuerpos que reconocen
apoB-100 incluye JI-H (fabricado por
JIMRO Co., Ltd.), y un ejemplo del anticuerpo que reconoce
apoA-I incluye H-12 (fabricado por
JIMRO Co., Ltd.). La cantidad de adición del anticuerpo depende de
la cantidad de HDL, LDL, VLDL, o CM en la muestra de ensayo. Por lo
tanto debería ser suficiente la adición del anticuerpo en una
cantidad tal que pueda unirse a la lipoproteína.
La colesterol oxidasa puede ser cualquier enzima
que tanga la capacidad de oxidar el colesterol y producir peróxido
de hidrógeno, cuyos ejemplos incluyen colesterol oxidasas derivadas
de microorganismos o de origen animal.
La colesterol deshidrogenasa puede ser cualquier
enzima que tenga la capacidad de oxidar el colesterol y reducir la
coenzima oxidada, cuyos ejemplos incluyen colesterol deshidrogenasas
derivadas de microorganismos o de origen animal.
La colesterol oxidasa y la colesterol
deshidrogenasa se utilizan cada una preferiblemente en una cantidad
de 0,01 a 200 U/mL, más preferiblemente de 0,01 a 100 U/mL, en un
líquido de reacción.
Además de la colesterol esterasa, la colesterol
oxidasa y la colesterol deshidrogenasa, se pueden añadir varios
tipos de iones metálicos, particularmente iones Ca para aumentar la
especificidad y la estabilidad de la enzima en el método de
medición de la presente invención.
La colesterol esterasa, la colesterol oxidasa o
la colesterol deshidrogenasa se pueden modificar químicamente con
un grupo incluyendo polietilenglicol como componente principal, un
residuo oligosacárido soluble en agua, un grupo sulfopropilo, o
similares, siempre que la modificación tenga la misma actividad, o
la colesterol esterasa, la colesterol oxidasa o la colesterol
deshidrogenasa puedan ser enzimas modificadas que tengan la misma
actividad obtenidas mediante ingeniería genética.
La reacción enzimática de acuerdo con la
presente invención se puede realizar en un medio acuoso, y en
particular se realiza preferiblemente en un tampón.
Los ejemplos del tampón incluyen
tris(hidroximetil)aminometano, tampones fosfato,
tampones borato, y tampones Good. Los ejemplos de los tampones Good
incluyen ácido
N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico
(ACES), ácido N-(2-acetamido)iminodiacético
(ADA), ácido
N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico
(BES), ácido
3-[N,N-bis(2-hidroxiletil)amino]-2-hidroxipropano-sulfónico
(DIPSO), ácido
2-(2-hidroxietil)piperazino-N'-2-etanosulfónico
(HEPES), ácido
3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPSO),
piperazino-N,N'-bis(ácido
2-etanosulfónico) (PIPES), y
piperazino-N,N'-bis(ácido
2-hidroxipropano-3-sulfónico)
(POPS).
El tampón puede tener un pH de 4 a 10,
preferiblemente de 5 a 9. El tampón se utiliza preferiblemente a una
concentración de 5 a 500 mM, más preferiblemente de 10 a 200 mm,
particularmente de manera preferible de 20 a 100 mM.
Cuando la colesterol esterasa y la colesterol
oxidasa se utilizan en el método de medición de la presente
invención, el peróxido de hidrógeno se produce a partir del oxígeno
por la reacción del colesterol. Por ejemplo, el peróxido de
hidrógeno producido se puede cuantificar utilizando
4-aminoantipirina y fenoles,
4-aminoantipirina y reactivos Trinder, o un
cromógeno altamente sensible, en presencia de peroxidasa.
Los ejemplos de los fenoles incluyen fenol,
4-clorofenol, m-cresol, y ácido
3-hidroxi-2,4,6-triyodobenzoico
(HTIB).
(HTIB).
Los ejemplos de los reactivos Trinder (véase el
catálogo colectivo, 19^{a} edición, 2002, publicado por DOJINDO
LABORATORIES) incluyen anilinas tales como
N-sulfopropilanilina,
N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-m-toluidina
(TOOS),
N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetilanilina
(MAO),
N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina
(DAOS),
N-etil-N-sulfopropil-m-toluidina
(TOPS),
N-(2-hidroxi-m-toluidina,
N,N-disulfopropil-3,5-dimetoxianilina,
N-etil-N-sulfopropil-m-anisidina,
N-etil-N-sulfopropilanilina,
N-etil-N-sulfopropil-3,5-dimetoxianilina,
N-sulfopropil-disulfopropil-3,5-dimetoxianilina,
N-etil-N-sulfopropil-3,5-dimetilanilina,
N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-m-anisidina,
N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)anilina,
N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina,
N-etil-m-3-sulfopropil-3-metoxianilina
(APPS),
N-etil-N-3-sulfopropilanilina
(ALPS), y
N-etil-N-2-hidroxi-3-sulfoproxil-3-metoxianilina,
o
N-etil-N-(3-metilfenil)-N'-succiniletilendiamina
(EMSE), o
N-etil-N-(3-metilfenil)-N'-acetiletilendiamina.
Los ejemplos de los cromógenos altamente
sensibles incluyen
10-(N-metilcarbamoil)-3,7-bis(dimetilamino)-fenotiadina
(MCDP) descrita en la Publicación de la Solicitud de Patente
Japonesa (JP-B) Núm. 60-33479,
bis[3-bis(4-clorofenil)metil-4-dimetilaminofenil]amina
(BCMA) descrita en el documento JP-B Núm.
4-27839, y los compuestos descritos en el documento
JP-A Núm. 62-296. La concentración
de los cromógenos es preferiblemente de 0,01 a
10 mg/ml.
10 mg/ml.
Cuando se utilizan la colesterol esterasa y la
colesterol deshidrogenasa, se produce NAD(P)H, que es
una coenzima reducida, a partir de NAD(P) que es una
coenzima oxidada, mediante la reacción del colesterol. El
NAD(P)H puede ser cuantificado mediante la medición
de la absorbancia del líquido de reacción a una longitud de onda de
aproximadamente 300 a aproximadamente 500 nm, preferiblemente de 330
a 400 nm, preferiblemente en concreto a aproximadamente 340 nm. El
NAD(P)H también se puede cuantificar mediante un
procedimiento que incluye la adición de diaforasa y una sal de
tetrazolio para formar un colorante de formazán y determinar el
colorante de formazán mediante colorimetría.
La reacción puede llevarse a cabo de 10 a 50ºC,
preferiblemente de 30 a 40ºC, generalmente a 37ºC durante 1 a 30
minutos, preferiblemente durante 2 a 10 minutos.
El reactivo de acuerdo con la presente invención
incluye una colesterol esterasa en la que la actividad lipoproteína
lipasa es más fuerte que la actividad colesterol esterasa e incluye
colesterol oxidasa o colesterol deshidro-
genasa.
genasa.
Por ejemplo, en el caso en el que las
lipoproteínas distintas de las lipoproteínas remanentes están
presentes significativamente en la muestra de ensayo, se puede
realizar un tratamiento previo con el anticuerpo
anti-apoB-100 y el anticuerpo
anti-apoA-I con el fin de reducir el
efecto de las lipoproteínas. En tal caso, el reactivo incluye
preferiblemente un primer reactivo que contiene el anticuerpo y un
segundo reactivo que contiene la solución enzimática. En este caso,
se prefiere añadir el primer reactivo a la muestra de ensayo y dejar
que reaccione de 25 a 40ºC durante 1 a 10 minutos, y después se
debe añadir el segundo reactivo y dejar que actúe de 25 a 40ºC
durante 2 a
20 minutos.
20 minutos.
Si fuera necesario, el reactivo de medición
puede contener diferentes sales para solubilizar proteínas tales
como las globulinas en la muestra biológica, coagulantes
lipoproteicos, y otras enzimas.
Los ejemplos de las sales incluyen cloruro de
sodio, sulfato de sodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio,
cloruro de magnesio, sulfato de magnesio, acetato de magnesio,
cloruro de litio, sulfato de litio, sulfato de amonio, nitrato de
magnesio y nitrato de calcio, y las sales se pueden utilizar de 0 a
100 mM. Los ejemplos del coagulante lipoproteico incluyen
polianiones tales como fosfotungstato, sulfato de dextrano y
heparina, y sales de metales divalentes tales como magnesio, calcio
y cobalto. Los ejemplos de otras enzimas incluyen la ascorbato
oxidasa.
En la presente invención, se puede utilizar
cualquier muestra de ensayo sin limitaciones particulares. En
concreto, se pueden utilizar muestras biológicas tales como la
propia sangre (sangre completa) o plasma sanguíneo, y fracciones
sanguíneas tales como suero sanguíneo.
\newpage
La presente invención se describe con más
detalle, mostrando los ejemplos siguientes, que no tienen por objeto
limitar el alcance de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se separaron los componentes del suero en una
fracción LDL y una fracción HDL, y se midieron cada una de las
lipoproteínas. El método de fraccionamiento de proteínas se describe
a continuación. Se prepararon una columna de afinidad con
anticuerpo anti-apoB-100 unido y una
columna de afinidad con anticuerpo
anti-apoA-I unido, respectivamente.
Se les incorporó el suero sanguíneo, y las fracciones unidas se
recogieron y se designaron LDL y HDL, respectivamente. Las
fracciones VLDL se separaron por ultracentrifugación (Havel R. J.
et al., J Clin Invest 1955; 34:1345., 120.000 rpm, 1,5
horas, 4ºC) (VLDL Total), y a continuación la fracción unida por
inmunoabsorción (con una columna de afinidad con anticuerpo
anti-apoB-100 unido) fue designada
VLDL Unida, mientras que la fracción de paso fue designada VLDL No
Unida (fracción de lipoproteína remanente). En ambas mediciones en
los Ejemplos 2 y 3, se utilizaron en la medición las muestras con
una concentración de colesterol ajustada de
40 mg/dL.
40 mg/dL.
\vskip1.000000\baselineskip
Los reactivos para medir el colesterol de las
lipoproteínas remanentes fueron preparados como se muestra a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se realizó el pretratamiento con
anticuerpo, se añadieron a la célula de un espectrofotómetro 210
\muL de Reactivo 1, y se añadieron a esto 20 \mul de suero
sanguíneo y se agitó y después se incubó a 37ºC. Posteriormente,
después de cinco minutos (Punto de Reacción 17), se añadieron a esto
70 \muL de Reactivo 2 preincubado a 37ºC, y después se realizó la
medición hasta cinco minutos más tarde (Punto de Reacción 33). La
medición se realizó a una longitud de onda de 572 nm y una
sublongitud de onda de 748 nm.
La evaluación se realizó basándose en el cambio
de absorbancia del Punto de Reacción 17 al Punto de Reacción 33.
\vskip1.000000\baselineskip
La medición del colesterol se realizó con LDL y
HDL que habían sido tratadas con tensioactivo al 0,1% (Emulgen,
fabricado por Kao Corporation) y las soluciones no tratados como
muestras de ensayo. La colesterol esterasa utilizada fue la enzima
LP (con una razón de actividad de 512, fabricada por Asahi Kasei
Pharma Corporation) o una enzima CE (con una razón de actividad de
14,3, fabricada por la Amano Enzyme Inc.). La LDL y la HDL se
muestran en las Figs. 1 y 2, respectivamente. El método de medición
fue de acuerdo al Ejemplo 1. En ambos casos, cuando se utiliza la
enzima LP, la reactividad se redujo significativamente, con respecto
a la cantidad de colesterol reactivo total (tratado con
tensioactivo). Cuando se utilizó la enzima CE, se obtuvo una alta
absorción en comparación con el caso de la enzima LP.
\vskip1.000000\baselineskip
En el método de medición de acuerdo con la
presente invención, se examinó la especificidad de la reacción con
respecto a la fracción VLDL utilizando la enzima LP. El método de
medición fue de acuerdo al Ejemplo 1. La Fig. 3 muestra la
reactividad sin adición de anticuerpo
anti-apoB-100 (JI-H)
y anticuerpo anti-apoA-I
(H-12). La Fig. 4 muestra la reactividad con la
adición de los anticuerpos. Los anticuerpos se añadieron al primer
líquido de tal forma que JI-H y H-12
alcanzaron una concentración final de 100 \mug/mL. Las Figs. 3 y 4
muestran esencialmente la misma curva de reacción tanto de VLDL No
Unida como de VLDL Unida, y se demostró que el colesterol de las
lipoproteínas remanentes se midió de forma selectiva. Cuando se
añadieron los anticuerpos, la reactividad de VLDL Unida se redujo a
aproximadamente 1/3 de modo que se suprimió la reacción
enzimática.
Así, se encontró que la adición de los
anticuerpos permite una medición más precisa de las lipoproteínas
remanentes.
\vskip1.000000\baselineskip
(1) El colesterol de las lipoproteínas
remanentes en la fracción VLDL se midió con un kit de medición de
proteínas remanentes convencional (RLP-C II,
fabricado por JIMRO Co., Ltd.) y diferentes colesterol esterasas (LP
con una razón de actividad de 512 fabricada por Asahi Kasei Pharma
Corporation, LPBP con una razón de actividad de 6296 fabricado por
Asahi Kasei Pharma Corporation, CEBPM con una razón de actividad del
11,2 fabricada por Toyobo Co., Ltd., CEN con una razón de actividad
de 14,3 fabricada por Asahi Kasei Pharma Corporation, COE 311 con
una razón de actividad del 31,8 fabricada por Toyobo Co., Ltd.) en
las mismas condiciones que en el Ejemplo 3, y se determinó la
correlación. El resultado se muestra en la Tabla 1.
Como resultado, se observó una correlación con
el valor medido con el kit ya disponible en el mercado cuando se
utilizaron las cuatro enzimas distintas de CEBPM.
- Actividad Lipoproteína lipasa (LPL): medida mediante análisis de la actividad LP (emulsión de aceite de oliva).
- Actividad colesterol esterasa (CE): medida mediante análisis de la actividad CE (suero sanguíneo de ternera).
\vskip1.000000\baselineskip
(2) El colesterol de las lipoproteínas
remanentes en las muestras clínicas se midió utilizando un kit de
medición de proteínas remanentes convencional
(RLP-C II, fabricado por JIMRO Co., Ltd.) y el
método de medición de la presente invención (utilizando LP (con una
razón de actividad de 512, fabricado por Asahi Kasei Pharma
Corporation) como colesterol esterasa, y se determinó su
correlación.
En total se midieron 99 especímenes (incluyendo
14 especímenes de sujetos sanos, 20 especímenes de pacientes con
hiperlipidemia incluyendo dos pacientes con hiperlipidemia de tipo
III, y 65 especímenes de pacientes con enfermedad arterial
coronaria) mediante el método RLP-C II y mediante el
método RLP-C directo al mismo tiempo, y se
compararon y examinaron las correlaciones. Como resultado, se obtuvo
una buena correlación con la recta de regresión y = 0,987x + 0,326
y el coeficiente de correlación r = 0,962 (véase la Fig. 5).
Claims (8)
1. Un método para medir el colesterol en
lipoproteínas remanentes en el que se utiliza una colesterol
esterasa en un método para medir el colesterol en las lipoproteínas
mediante la medición del peróxido de hidrógeno o una coenzima
reducida obtenidos al permitir que la colesterol esterasa y la
colesterol oxidasa o una colesterol deshidrogenasa actúe sobre una
muestra de ensayo que contiene una lipoproteína caracterizado
porque la colesterol esterasa no sólo tiene actividad esterasa,
sino también actividad lipoproteína lipasa con lo que la razón de
actividad de una lipoproteína lipasa con respecto a una colesterol
esterasa (actividad lipoproteína lipasa/actividad colesterol
esterasa) es de 12 a 7000.
2. El método de acuerdo con la Reivindicación 1,
caracterizado porque la razón de actividad de la lipoproteína
lipasa con respecto a la colesterol esterasa (actividad de la
lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa) es de 28 a
800.
3. El método de acuerdo con la Reivindicación 1,
donde la colesterol esterasa se selecciona entre LP, LPBP, CEN, CE,
y COE 311.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente el
pretratamiento de la muestra de ensayo con un anticuerpo
anti-apoB-100 y/o un anticuerpos
anti-apoA-I.
5. Un reactivo de medición para el colesterol en
las lipoproteínas remanentes, que comprende:
- (a)
- una colesterol esterasa que tiene no sólo actividad esterasa sino también actividad lipoproteína lipasa con lo que la razón de actividad de una lipoproteína lipasa con respecto a un colesterol esterasa (actividad lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa) es de 12 a 7000; y
- (b)
- una colesterol oxidasa o una colesterol deshidrogenasa.
\vskip1.000000\baselineskip
6. El reactivo de medición de acuerdo con la
Reivindicación 5, donde la razón de actividad de la lipoproteína
lipasa con respecto a la colesterol esterasa (actividad lipoproteína
lipasa/actividad colesterol esterasa) es 28 a 800.
7. El reactivo de acuerdo con la Reivindicación
5, donde la colesterol esterasa se selecciona entre LP, LPBP, el
CEN, CE, y COE 311.
8. Un reactivo de medición para el colesterol en
lipoproteínas remanentes, que comprende:
- (i)
- un primer reactivo que comprende un anticuerpo anti-apoB-100 y/o un anticuerpos anti-apoA-I, y
- (ii)
- un segundo reactivo que comprende el reactivo de medición de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 7.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004-344427 | 2004-11-29 | ||
| JP2004344427 | 2004-11-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2344304T3 true ES2344304T3 (es) | 2010-08-24 |
Family
ID=36498110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05809660T Expired - Lifetime ES2344304T3 (es) | 2004-11-29 | 2005-11-28 | Un metodo para medir el colesterol en lipoproteinas remanentes. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7799537B2 (es) |
| EP (1) | EP1818412B1 (es) |
| JP (1) | JP4842838B2 (es) |
| CN (1) | CN101065495B (es) |
| CA (1) | CA2589459C (es) |
| DE (1) | DE602005020678D1 (es) |
| ES (1) | ES2344304T3 (es) |
| WO (1) | WO2006057377A1 (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5766426B2 (ja) * | 2010-11-10 | 2015-08-19 | デンカ生研株式会社 | レムナント様リポ蛋白コレステロールの定量方法及びそのためのキット |
| WO2012118017A1 (ja) * | 2011-02-28 | 2012-09-07 | デンカ生研株式会社 | 高密度リポタンパク質２中のコレステロールの定量方法およびそのための試薬キット |
| CN104583419B (zh) * | 2012-04-20 | 2017-12-19 | 电化生研株式会社 | 低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三酯的除去方法 |
| CN105044364B (zh) * | 2015-05-02 | 2016-09-14 | 王贤俊 | 一种采用联合遮蔽法制备的ldl-c检测试剂盒 |
| CN106645763B (zh) * | 2017-01-03 | 2019-03-22 | 长沙中生众捷生物技术有限公司 | 总胆固醇的检测试纸 |
| CN106950095B (zh) * | 2017-04-01 | 2020-01-10 | 合肥迪安医学检验所有限公司 | 一种减少脂血样本检测干扰的方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2949354B2 (ja) | 1990-02-22 | 1999-09-13 | 株式会社日本抗体研究所 | 変性リポタンパクの測定法及びこれに用いるキット |
| JPH03251304A (ja) | 1990-02-27 | 1991-11-08 | Sumitomo Electric Ind Ltd | Ｓｉ↓３Ｎ↓４焼結体製マイクロドリル |
| EP1020532B1 (en) | 1997-06-25 | 2009-04-08 | Sysmex Corporation | Method for assaying biological specimens for substances contained in the components thereof and reagent to be used in this method |
| JP4456715B2 (ja) | 2000-02-28 | 2010-04-28 | 協和メデックス株式会社 | レムナント様リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定試薬 |
| DE60140251D1 (de) * | 2000-06-07 | 2009-12-03 | Sysmex Corp | Verfahren zur analyse von komponenten biologischer proben |
| CN1914333A (zh) * | 2004-01-29 | 2007-02-14 | 协和梅迪克斯株式会社 | 极低密度脂蛋白残粒(vldl残粒)中的胆固醇的定量方法、试剂及试剂盒 |
| TWI379904B (en) * | 2005-02-14 | 2012-12-21 | Kyowa Medex Co Ltd | A method for quantifying cholesterol of remnant-like particles lipoprotein, reagent and kit |
-
2005
- 2005-11-28 CA CA2589459A patent/CA2589459C/en not_active Expired - Lifetime
- 2005-11-28 US US11/720,338 patent/US7799537B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2005-11-28 DE DE602005020678T patent/DE602005020678D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2005-11-28 CN CN2005800407163A patent/CN101065495B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-28 ES ES05809660T patent/ES2344304T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2005-11-28 JP JP2006547888A patent/JP4842838B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-28 WO PCT/JP2005/021757 patent/WO2006057377A1/ja not_active Ceased
- 2005-11-28 EP EP05809660A patent/EP1818412B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1818412B1 (en) | 2010-04-14 |
| CA2589459A1 (en) | 2006-06-01 |
| JPWO2006057377A1 (ja) | 2008-06-05 |
| CN101065495B (zh) | 2011-05-04 |
| EP1818412A1 (en) | 2007-08-15 |
| US7799537B2 (en) | 2010-09-21 |
| JP4842838B2 (ja) | 2011-12-21 |
| CN101065495A (zh) | 2007-10-31 |
| DE602005020678D1 (de) | 2010-05-27 |
| US20080268461A1 (en) | 2008-10-30 |
| CA2589459C (en) | 2014-01-07 |
| EP1818412A4 (en) | 2008-06-04 |
| WO2006057377A1 (ja) | 2006-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2335658T3 (es) | Metodo y reactivo que permite medir el colesterol en la lipo proteina de alta densidad. | |
| CN101896620B (zh) | 定量测定小而密ldl胆固醇的方法和试剂盒 | |
| ES2226408T3 (es) | Metodos para cuantificacion fraccionada de colesterol en lipoproteinas y reactivos de cuantificacion. | |
| EP0878716B1 (en) | Measurement of LDL-cholesterol | |
| JPH08131197A (ja) | 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法 | |
| WO2008050636A1 (fr) | Procédé de quantification du cholestérol dans une lipoprotéine de faible densité | |
| US20080318258A1 (en) | Method for Measuring Cholesterol in Remnant-Like Lipoprotein | |
| EP1132482B1 (en) | Method and reagent for determination of cholesterol in remnant-like lipoprotein particles | |
| ES2396236T3 (es) | Procedimiento de multicuantificación del colesterol de lipoproteína de baja densidad | |
| JPH08116996A (ja) | 血清または血漿中のｈｄｌ−コレステロールを測定する方法 | |
| JP4842838B2 (ja) | レムナント様リポタンパク質中のコレステロールの測定方法 | |
| ES2299704T3 (es) | Procedimiento de cuantificacion de colesterol en lipoproteina de alta densidad y composiciones de reactivos. | |
| AU2005281814B2 (en) | Test device for determining the concentration of LDL-cholesterol in a sample | |
| JPH1130617A (ja) | Ｌｄｌ−コレステロール測定法 | |
| KR19980086568A (ko) | Ldl -콜레스테롤의 측정 | |
| KR100276749B1 (ko) | 저밀도리포단백증의콜레스테롤의정량법 | |
| ES2654437T3 (es) | Método de medición de la actividad de la lipasa pancreática humana | |
| JP2007014201A (ja) | レムナント様リポタンパク質中のコレステロールの測定方法 | |
| JP2007174951A (ja) | リパーゼ活性測定用組成物および活性測定法 | |
| CN112824906A (zh) | 用于检测白蛋白的组合物和方法 | |
| JPH1080300A (ja) | コレステロール測定用試薬 |