ES2344802T3 - Estrategias mejoradas para la secuenciacion de genomas complejos utilizando tecnologias de secuenciacion de alto rendimiento. - Google Patents
Estrategias mejoradas para la secuenciacion de genomas complejos utilizando tecnologias de secuenciacion de alto rendimiento. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2344802T3 ES2344802T3 ES06757809T ES06757809T ES2344802T3 ES 2344802 T3 ES2344802 T3 ES 2344802T3 ES 06757809 T ES06757809 T ES 06757809T ES 06757809 T ES06757809 T ES 06757809T ES 2344802 T3 ES2344802 T3 ES 2344802T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- fragments
- restriction
- sequence
- sequencing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 174
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 88
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 53
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 53
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 239000011049 pearl Substances 0.000 claims description 28
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 22
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 8
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002487 chromatin immunoprecipitation Methods 0.000 claims description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 3
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 79
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 59
- 208000005652 acute fatty liver of pregnancy Diseases 0.000 description 35
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 16
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 12
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 11
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 9
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 8
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 6
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 6
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 6
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 101150044508 key gene Proteins 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100065878 Caenorhabditis elegans sec-10 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 101000582320 Homo sapiens Neurogenic differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 102100030589 Neurogenic differentiation factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 101100236420 Oryza sativa subsp. japonica MADS2 gene Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
Procedimiento para determinar una secuencia genómica que comprende las etapas de: (a) proporcionar un primer subconjunto del genoma mediante la digestión del genoma con por lo menos una primera endonucleasa de restricción para proporcionar fragmentos de restricción; (b) realizar la ligación de por lo menos un adaptador con los fragmentos de restricción del primer subconjunto para proporcionar un primer conjunto de fragmentos de restricción ligados al adaptador; (c) amplificar selectivamente el primer conjunto de fragmentos de restricción ligados al adaptador utilizando una primera combinación de cebador en la que por lo menos un primer cebador contiene una sección complementaria al adaptador y a una parte de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción y que contiene además una primera secuencia seleccionada en el extremo 3'' de la secuencia del cebador, comprendiendo la primera secuencia seleccionada entre 0 y 10 nucleótidos selectivos, para proporcionar un primer subconjunto de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador; (d) repetir la etapa (c) con por lo menos un segundo y/o una o más combinaciones adicionales del cebador en las que el cebador contiene una distinta secuencia seleccionada segunda y/o adicionales en su extremo 3'' que contiene el mismo número de nucleótidos selectivos, para proporcionar unos subconjuntos segundo y/o adicionales de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador; (e) fragmentar cada uno de los subconjuntos primero, segundo y/o adicionales de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador para generar unas genotecas de secuenciación primera, segunda y/o adicionales; (f) determinar por lo menos una parte de las secuencias de nucleótidos de por lo menos una parte de los fragmentos contenidos en cada una de las genotecas primera, segunda y/o adicionales; (g) alinear la secuencia de los fragmentos en cada una de las genotecas primera, segunda y/o adicionales para generar cóntigos de los fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador obtenidos que representan fracciones dispersas del genoma; (h) repetir las etapas (a)-(g) para por lo menos unas endonucleasas de restricción segunda y/o adicionales; (i) alinear los cóntigos obtenidos en las etapas (g) y (h) para cada una de las endonucleasas de restricción segunda y/o adicionales para proporcionar una secuencia del genoma.
Description
Estrategias mejoradas para la secuenciación de
genomas complejos utilizando tecnologías de secuenciación de alto
rendimiento.
La presente invención se refiere a los campos de
la biología molecular y de la genética. La presente invención se
refiere a unas estrategias mejoradas para determinar la secuencia de
genomas preferentemente complejos (es decir, grandes), basándose en
la utilización de técnicas de secuenciación.
El ensamblaje secuencias aleatorias del genoma
completas en genomas grandes (de 100 Mbp o superiores) con
secuencias borrador del genoma es un tema complicado. Muchas plantas
y animales contienen además un gran número de secuencias repetidas,
con lo que se complica aún más el problema. Dicho problema
informático aún es mayor con la aparición de las técnicas de alta
capacidad de secuenciación, tales como las técnicas de 454 Life
Science. Dichas técnicas ya no se basan en el método de
didesoxisecuenciación de Sanger, sino fundamentalmente en la
secuenciación por síntesis (pirosecuenciación), que resulta más
sencilla de realizar en una superficie sólida. La secuenciación por
síntesis proporciona una gran cantidad de secuencias, aunque de una
longitud relativamente corta (aproximadamente 100 bp [pares de
bases]) en comparación con la longitud relativamente grande de entre
500 y 1000 bp tal como resulta habitual en el método de
didesoxisecuenciación de Sanger.
Una de las desventajas de las que adolecen
dichos fragmentos cortos es que el ensamblaje de los cóntigos para
determinar la secuencia genómica requiere una gran potencia
informática, lo que hace que los procedimientos actuales de
secuenciación constituyan una tarea relativamente costosa y lenta.
Por consiguiente, existe la necesidad de procedimientos de
secuenciación compleja que sean económicos, fiables y rápidos, es
decir, grandes genomas, para reforzar la tecnología que a veces se
ha denominado del "genoma de 1000 \textdollar", es decir, un
procedimiento que permita la determinación de la secuencia entera
de un genoma complejo (en particular humano) que no cueste más de
1000 \textdollar. Ello permitiría, entre otras cosas, el
desarrollo de medicaciones personalizadas.
Los presentes inventores han descubierto ahora
que dicho problema se puede solucionar con una estrategia distinta
y que las técnicas de alta capacidad de secuenciación se pueden
utilizar eficientemente en el ensamblaje del genoma.
La presente invención comprende la utilización
de una técnica que divide el genoma en partes complementarias y
reproducibles mediante la restricción del genoma con una o más
endonucleasas de restricción para obtener un conjunto de fragmentos
de restricción y proporcionar posteriormente un subconjunto de
fragmentos de restricción mediante amplificación selectiva. Se
secuencia y ensambla el subconjunto a un cóntigo. Mediante la
repetición de dicha etapa para uno o más conjuntos distintos de
endonucleasas de restricción, se obtienen distintos cóntigos.
Dichos cóntigos distintos se utilizan para ensamblar la secuencia
borrador del genoma. La presente invención no requiere conocimiento
alguno de la secuencia y se puede aplicar a genomas de cualquier
tamaño y complejidad. La presente invención se puede ajustar para
cualquier tipo y tamaño de genoma. La presente invención proporciona
un acceso más rápido, fiable y veloz a cualquier genoma de interés
y permite, por lo tanto, acelerar el análisis del genoma.
En la descripción y ejemplos siguientes, se
utiliza un cierto número de términos. A fin de proporcionar una
comprensión clara y consistente de la presente memoria y
reivindicaciones, comprendiendo el alcance a proporcionar a dichos
términos, se proporcionan las siguientes definiciones. Excepto si se
define de otro modo en la presente memoria, todos los términos
técnicos y científicos tienen el mismo significado que les atribuyen
habitualmente los expertos en la materia a la que pertenece la
presente invención.
Ácido nucleico: un ácido nucleico según la
presente invención puede comprender cualquier polímero u oligómero
de bases de pirimidina y purina, preferentemente citosina, timina y
uracilo, y adenina y guanina, respectivamente (véase Albert L.
Lehninger, Principles of Biochemistry ("Principios de
Bioquímica"), en 793-800 (Worth Pub. 1982)). La
presente invención contempla cualquier desoxirribonucleótido,
ribonucleótido o componente peptídico de un ácido nucleico, y
cualquier variante química de los mismos, tales como las formas
metiladas, hidroximetiladas o glucosiladas de los mismos. Los
polímeros u oligómeros pueden presentar una composición heterogénea
u homogénea, y se pueden aislar a partir de fuentes naturales o se
pueden producir artificialmente o sintéticamente. Además, los
ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, o una mezcla de los mismos, y
pueden existir de un modo permanente o transitorio en forma
monocatenaria o bicatenaria, comprendiendo los estados homodúplex,
heterodúplex e híbrido.
Reducción de la complejidad: el término
reducción de la complejidad se utiliza para indicar un procedimiento
en el que la complejidad de una muestra de ácido nucleico, tal como
un ADN genómico, se reduce al generar un subconjunto de la muestra.
Dicho subconjunto puede ser representativo de la muestra entera (es
decir, complejo) y es preferentemente un subconjunto reproducible.
Reproducible significa en el presente contexto que cuando se reduce
la complejidad de la misma muestra utilizando el mismo
procedimiento, se obtiene el mismo subconjunto, o por lo menos uno
de comparable. El procedimiento utilizado en la reducción de la
complejidad puede ser cualquier procedimiento de reducción de la
complejidad conocido en la técnica. Los ejemplos de procedimientos
de reducción de la complejidad comprenden, por ejemplo, el AFLP®
(Keygene N.V., Países Bajos; véase, por ejemplo, el documento EP 0
534 858), los procedimientos descritos por Dong (véanse, por
ejemplo, los documentos WO 03/012118, WO 00/24939, EP 1 124 990) o
Barany (por ejemplo el documento US 6 534 293), ligamiento indexado
(Unrau et al., véase posteriormente), etc. Los
procedimientos de reducción de la complejidad utilizados en la
presente invención tienen en común que son reproducibles.
Reproducibles en el sentido de que cuando se reduce la complejidad
de la misma muestra del mismo modo, se obtiene el mismo subconjunto
de la muestra, al contrario de lo que sucede con una reducción de
la complejidad más aleatoria tal como la microdisección o la
utilización de ARNm (ADNc) que representa una parte del genoma
transcrito en un tejido seleccionado y que su reproducibilidad
depende del tejido, el período de aislamiento, etc.
Etiquetado: el término etiquetado se refiere a
la adición de una etiqueta a una muestra de ácido nucleico a fin de
poder distinguirla de una segunda u otra muestra de ácido nucleico.
El etiquetado se puede realizar, por ejemplo, mediante la adición
de un identificador de la secuencia durante la reducción de la
complejidad o mediante cualquier otro medio conocido en la técnica.
Dicho identificador de la secuencia puede, por ejemplo, ser una
secuencia de bases única con una longitud variable pero definida que
se utiliza para identificar una muestra específica de ácido
nucleico. Los ejemplos habituales de las mismas son, por ejemplo
secuencias ZIP. Al utilizar dicha etiqueta, se puede determinar el
origen de una con un procesamiento adicional. En el caso de
combinación de productos procesador procedentes de muestras de ácido
nucleico distintas, se tendrían que identificar las distintas
mezclas de ácidos nucleicos utilizando distintas etiquetas.
Genoteca etiquetada: el término genoteca
etiquetada se refiere a una genoteca de ácido nucleico
etiquetado.
Secuenciación: el término secuenciación se
refiere a la determinación del orden de nucleótidos (secuencias de
bases) en a muestra de ácido nucleico, por ejemplo ADN o ARN.
Alinear y alineación: los términos
"alinear" y "alineación" se refieren a la comparación de
dos o más secuencias de nucleótidos basándose en la presencia de
extensiones cortas o largas de nucleótidos idénticos o similares.
En la técnica se conocen diversos procedimientos de alineación de
secuencias de nucleótidos, tal como se describirá con mayor detalle
posteriormente. A veces se utiliza ensamblaje como sinónimo.
Técnicas de alta capacidad de identificación:
las técnicas de alta capacidad de identificación, con frecuencia
abreviadas como HTS, consisten en un procedimiento de
experimentación científica especialmente adecuado para los campos
de la biología y la química. Mediante una combinación de robótica
actual y otro hardware especializado para laboratorios, permite al
investigador identificar simultáneamente con efectividad grandes
cantidades de muestras.
Endonucleasa de restricción: una endonucleasa de
restricción o enzima de restricción es un enzima que reconoce unas
secuencias específicas de nucleótidos (sitio seleccionado) en una
molécula de ADN bicatenario y separará ambas cadenas de la molécula
de ADN en cada sitio seleccionado.
Fragmentos de restricción: se hace referencia a
las moléculas de ADN producidas mediante la digestión con una
endonucleasa de restricción como fragmentos de restricción.
Cualquier genoma determinado (o ácido nucleico, con independencia
de su origen) se digerirá mediante una endonucleasa de restricción
particular en un conjunto descrito de fragmentos de restricción.
Los fragmentos de ADN que se obtienen a partir de la escisión
mediante la endonucleasa de restricción se pueden continuar
utilizando en diversas técnicas y, por ejemplo, se pueden detectar
mediante electroforesis en gel.
Electroforesis en gel: a fin de detectar los
fragmentos de restricción, se puede requerir un procedimiento
analítico para fraccionar las moléculas de ADN bicatenario que se
basa en el tamaño. La técnica que se utiliza más habitualmente para
alcanzar dicho fraccionamiento es la electroforesis (capilar) en
gel. La velocidad a la que dichos fragmentos de ADN se desplazan en
dichos geles depende de su peso molecular; de este modo, la
distancia de desplazamiento disminuye al aumentar la longitud del
fragmento. Los fragmentos de ADN fraccionados mediante
electroforesis en gel se pueden visualizar directamente mediante un
procedimiento de tinción, por ejemplo, tinción con plata o una
tinción que utilice bromuro de etidio, si el número de fragmentos
que se encuentran en la banda es suficientemente pequeño.
Alternativamente, un tratamiento adicional de los fragmentos de ADN
puede incorporar etiquetas detectables en los fragmentos, tales como
fluoróforos o etiquetas radiactivas.
Ligación: se hace referencia a la reacción
enzimática catalizada por un enzima ligasa en la que dos moléculas
de ADN bicatenario se unen entre sí con un enlace covalente como
ligación. En general, ambas cadenas de ADN se unen entre sí con un
enlace covalente, pero es asimismo posible evitar la ligación de una
de las dos cadenas mediante la modificación química o enzimática de
uno de los extremos de las cadenas. En dicho caso, el enlace
covalente se producirá en únicamente en una de las dos cadenas de
ADN.
Oligonucleótido sintético: se hace referencia a
las moléculas de ADN monocatenario que presentan preferentemente
entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 bases, que se pueden
sintetizar químicamente como oligonucleótidos sintéticos. En
general, dichas moléculas sintéticas de ADN se diseñan para que
presenten una secuencia de nucleótidos única o pretendida, aunque
resulta posible sintetizar familias de moléculas que presenten
secuencias relacionadas y que presenten unas composiciones
distintas en los nucleótidos en unas posiciones específicas de la
secuencia de nucleótidos. El término oligonucleótido sintético se
utilizará para hacer referencia a moléculas de ADN que presenten
una secuencia de nucleótidos diseñada o pretendida.
Adaptadores: moléculas cortas de ADN bicatenario
con un número limitado de pares de bases, por ejemplo entre
aproximadamente 10 y aproximadamente 30 pares de bases en longitud,
que se diseñan de tal modo que se puedan ligar a los extremos de
fragmentos de restricción. Los adaptadores están compuestos
generalmente de dos oligonucleótidos sintéticos que presentan unas
secuencias de nucleótidos que son parcialmente complementarias entre
sí. Cuando se mezclan dos oligonucleótidos sintéticos en disolución
con unas condiciones apropiadas, se aparearán entre sí formando una
estructura bicatenaria. Tras el apareamiento, un extremo de la
molécula adaptadora se diseña de tal modo que sea compatible con el
extremo de un fragmento de restricción y se pueda ligar al mismo; el
otro extremo del adaptador se puede diseñar de tal modo que no se
pueda ligar, pero esta necesidad no constituye el caso (adaptadores
con doble ligación).
Fragmentos de restricción ligados al adaptador:
fragmentos de restricción que se han rematado con adaptadores como
resultado de la ligación.
Cebadores: en general, el término cebadores se
refiere a una cadena de ADN que puede iniciar la síntesis de ADN.
La ADN polimerasa no puede sintetizar ADN de novo sin
cebadores: únicamente puede extender una cadena existente de ADN en
una reacción en la que la cadena complementaria se utiliza como
molde para dirigir el orden de nucleótidos a ensamblar. Nos
referiremos a las moléculas de oligonucleótidos sintéticos que se
utilizan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como
cebadores.
Amplificación del ADN: el término amplificación
del ADN se utilizará habitualmente para indicar la síntesis in
vitro de moléculas de ADN bicatenario utilizando la PCR. Se ha
de indicar que existen otros procedimientos de amplificación y que
se pueden utilizar en la presente invención sin apartarse de la
esencia de la misma.
La presente invención proporciona un
procedimiento para determinar una secuencia genómica que comprende
las etapas de:
- (a)
- proporcionar un primer subconjunto del genoma mediante la digestión del genoma con por lo menos una primera endonucleasa de restricción para proporcionar fragmentos de restricción;
- (b)
- realizar la ligación de por lo menos un adaptador con los fragmentos de restricción del primer subconjunto para proporcionar un primer conjunto de fragmentos de restricción ligados al adaptador;
- (c)
- amplificar selectivamente el primer conjunto de fragmentos de restricción ligados al adaptador utilizando una primera combinación de cebador en la que por lo menos un primer cebador contiene una sección complementaria al adaptador y a una parte de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción y que contiene además una primera secuencia seleccionada en el extremo 3' de la secuencia del cebador, comprendiendo la primera secuencia seleccionada entre 1 y 10 nucleótidos selectivos, para proporcionar un primer subconjunto de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador;
- (d)
- repetir la etapa (c) con por lo menos un segundo y/o una o más combinaciones adicionales del cebador en las que el cebador contiene una distinta secuencia seleccionada segunda y/o adicionales en su extremo 3' que contiene el mismo número de nucleótidos selectivos, para proporcionar unos subconjuntos segundo y/o adicionales de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador;
- (e)
- fragmentar cada uno de los subconjuntos, primero, segundo y/o adicionales de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador, seguido opcionalmente por la selección del tamaño de los fragmentos en el intervalo óptimo de tamaños, para generar unas genotecas de secuenciación primera, segunda y/o adicionales, y a continuación mezclar opcionalmente las genotecas;
- (f)
- determinar (por lo menos una parte de) las secuencias de nucleótidos de (por lo menos una parte de) los fragmentos contenidos en cada una de las genotecas de secuenciación primera, segunda y/o adicionales;
- (g)
- alinear la secuencia de los fragmentos en cada una de las genotecas primera, segunda y/o adicionales para generar cóntigos de los fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador obtenidos a partir del/de los subconjunto(s) del genoma;
- (h)
- repetir las etapas (a)-(g) para por lo menos unas endonucleasas de restricción segunda y/o adicionales;
- (i)
- alinear los cóntigos obtenidos en las etapas (g) y (h) para cada una de las endonucleasas de restricción segunda y/o adicionales para proporcionar una secuencia del genoma.
\vskip1.000000\baselineskip
En la etapa (a) del procedimiento, el genoma de
interés se somete a una o más endonucleasas de restricción. En
determinadas formas de realización, se utilizan por lo menos dos
endonucleasas de restricción. En determinadas formas de
realización, en particular con genomas grandes, se pueden utilizar
tres o más endonucleasas de restricción. La digestión del genoma
proporciona un primer subconjunto del genoma. Las endonucleasas de
restricción pueden ser cortadoras frecuentes (es decir,
habitualmente cortadoras 4 y 5, es decir, endonucleasas de
restricción que presentan una secuencia de reconocimiento de 4 ó 5
nucleótidos, respectivamente) o pueden ser cortadoras raras, (es
decir, habitualmente cortadoras 6 y superiores (7, 8, ... etc., es
decir, endonucleasas de restricción que presentan una secuencia de
reconocimiento de 6 o más nucleótidos, respectivamente)), o
combinaciones de las mismas. En determinadas formas de realización
se utiliza una combinación de una cortadora poco frecuente y una
frecuente. En determinadas formas de realización se pueden utilizar
dos cortadoras poco frecuentes. Las endonucleasas de restricción
pueden ser de cualquier tipo, comprendiendo los tipos IIs y IIsa
que cortan el ADN fuera de su secuencia de reconocimiento, tanto en
una como en ambas caras de la secuencia de reconocimiento.
En etapa (b) del procedimiento, por lo menos un
adaptador se liga a los fragmentos de restricción obtenidos en la
etapa (a). Preferentemente, los adaptadores son de tal modo que el
sitio de restricción no se restablece mediante ligación del
adaptador. Resulta asimismo posible, por ejemplo, en el caso de dos
o más endonucleasas de restricción utilizar dos o más adaptadores
distintos. Dicha etapa de ligación produce fragmentos de restricción
ligados al adaptador. Los adaptadores, en función de la
endonucleasa de restricción, pueden presentar un extremo romo o
pueden contener un extremo saliente.
En determinadas formas de realización, el
adaptador puede ser un conjunto de adaptadores conocidos como
ligadores de indización (Unrau et al., 1994, Gene,
145: 163-169).
En etapa (c), el primer conjunto de fragmentos
de restricción ligados al adaptador se amplifica utilizando una
primera combinación del cebador. La combinación del cebador
comprende por lo menos un primer cebador que contiene una sección
complementaria a (por lo menos una parte de) el adaptador y a una
parte de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de
restricción utilizada en la restricción del genoma. Habitualmente,
la parte de la secuencia de reconocimiento es aquella parte que
permanece tras la restricción de la secuencia con la endonucleasa
de restricción. En su extremo 3', el cebador contiene una primera
secuencia seleccionada. La primera secuencia seleccionada comprende
a conjunto seleccionado previamente de 1 a 10 nucleótidos,
preferentemente entre 1 y 8 nucleótidos seleccionados,
preferentemente entre 1 y 5, más preferentemente entre 1 y 3. Dicho
cebador puede presentar la siguiente estructura ilustrativa (para 2
nucleótidos selectivos (AC)) "5' - región específica del
adaptador - región específica de la secuencia de restricción - AC -
3'". Este primer cebador presentado a título de ejemplo contiene
2 nucleótidos selectivos AC que amplificarán únicamente fragmentos
ligados al adaptador que comprendan la secuencia complementaria TG
como los dos primeros nucleótidos obtenidos a partir de la
secuencia del fragmento de restricción. Ello proporciona el primer
subconjunto de fragmentos de restricción amplificados ligados al
adaptador.
La primera combinación del cebador puede
comprender asimismo dos cebadores selectivos, transportando cada
uno de ellos una secuencia seleccionada en su extremo 3'. Los
cebadores se pueden etiquetar para permitir estrategias de
agrupamiento.
La amplificación se realiza preferentemente
utilizando la PCR larga. En determinadas formas de realización se
prefiere la utilización de la PCR.
En la etapa (d), se repite la amplificación
selectiva con las combinaciones del cebador segunda y adicional.
Por lo menos uno de los cebadores de cada una de las combinaciones
adicionales del cebador contiene una secuencia seleccionada
distinta en su extremo 3'. La selección de las secuencias
seleccionadas se realiza de tal modo que, dado el número de
nucleótidos seleccionados, se utilizan todas las permutaciones
posibles de los nucleótidos selectivos. En el ejemplo anterior ello
significa AT, AG, AA, CA, CT, CG, CA, etc. En la práctica ello
significa que todos los fragmentos de restricción ligados al
adaptador en el subconjunto del genoma (es decir, en el conjunto de
fragmentos de restricción obtenidos utilizando una o más
endonucleasas de restricción) se han amplificado.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, la reducción de la complejidad del genoma
mediante amplificación selectiva se realiza mediante la técnica
AFLP® (Keygene N. V., Países Bajos; véase por ejemplo el documento
EP 0 534 858 y Vos et al. (1995). AFLP: una nueva técnica
para la obtención de la huella genética del ADN, Nucleic Acids
Research, vol. 23, n.º 21, 4407-4414).
La AFLP consiste en un procedimiento de
amplificación de un fragmento de restricción selectivo. La AFLP no
requiere información previa alguna de la secuencia y se puede
realizar en cualquier ADN inicial. En general, la AFLP comprende
las etapas de:
- (a)
- digerir un ácido nucleico, en particular a ADN, con una o más endonucleasas de restricción específicas, para fragmentar el ADN en la serie correspondiente de fragmentos de restricción;
- (b)
- ligar los fragmentos de restricción obtenidos de este modo con adaptador de un oligonucleótido sintético bicatenario, siendo un extremo del mismo compatible con uno o ambos extremos de los fragmentos de restricción, para producir de este modo fragmentos de restricción del ADN inicial ligados al adaptador, preferentemente etiquetados;
- (c)
- poner en contacto los fragmentos de restricción ligados al adaptador, preferentemente etiquetados, en unas condiciones de hibridación con uno o más cebadores de oligonucleótidos que contienen nucleótidos selectivos en su extremo 3';
- (d)
- amplificar el fragmento de restricción ligado al adaptador, preferentemente etiquetado hibridado con los cebadores mediante la PCR o una técnica similar de tal modo que provoque una elongación adicional de los cebadores hibridados a lo largo de los fragmentos de restricción del ADN inicial con los que se hibridan los cebadores; y
- (e)
- detectar, identificar o recuperar el fragmento amplificado o alargado de ADN obtenido de este modo.
\vskip1.000000\baselineskip
El AFLP proporciona de este modo un subconjunto
reproducible de fragmentos ligados al adaptador. Una variante útil
de la técnica AFLP no utiliza nucleótidos selectivos (es decir,
cebadores +0/+0) y a veces se denomina PCR de enlace. Ello
proporciona asimismo una reducción de la complejidad muy adecuada,
en particular para los genomas más pequeños.
Para una descripción adicional de la AFLP, sus
ventajas, sus formas de realización, así como las técnicas,
enzimas, adaptadores, cebadores y compuestos y herramientas
adicionales utilizados en la misma, se hace referencia a los
documentos US 6.045.994, EP-B-O 534
858, EP 976835 y EP 974672, WO 01/88189 y Vos et al.
Nucleic Acids Research, 1995, 23,
4407-4414.
De este modo, en una forma de realización
preferida del procedimiento de la presente invención, se reduce la
complejidad del genoma mediante las siguientes etapas:
- (a)
- digerir la muestra de ácido nucleico con por lo menos una endonucleasa de restricción para fragmentar la misma en fragmentos de restricción;
- (b)
- ligar los fragmentos de restricción obtenidos con por lo menos un adaptador de un oligonucleótido sintético bicatenario que presente un extremo compatible con uno o ambos extremos de los fragmentos de restricción para producir fragmentos de restricción ligados al adaptador;
- (c)
- poner en contacto dichos fragmentos de restricción ligados al adaptador con uno o más cebadores de oligonucleótidos en unas condiciones de hibridación; y
- (d)
- amplificar dichos fragmentos de restricción adaptados mediante la elongación de uno o más cebadores de oligonucleótidos,
- (e)
- comprendiendo por lo menos uno de los uno o más cebadores de oligonucleótidos una secuencia de nucleótidos que presente una secuencia de nucleótidos como parte terminal de las cadenas en los extremos de dichos fragmentos de restricción adaptados, comprendiendo los nucleótidos implicados en la formación de la secuencia seleccionada para dicha endonucleasa de restricción y comprendiendo por lo menos una parte de los nucleótidos presentes en los adaptadores, en los que, opcionalmente, por lo menos uno de dichos cebadores comprende en su extremo 3' una secuencia seleccionada que comprende por lo menos un nucleótido dispuesto inmediatamente adyacente a los nucleótidos implicados en la formación de la secuencia seleccionada para dicha endonucleasa de restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
La AFLP constituye un procedimiento muy
reproducible para la reducción de la complejidad y resulta, por lo
tanto, particularmente adecuado como método según la presente
invención.
Hasta la fecha, en la técnica de la
secuenciación, no se ha descrito o propuesto la utilización de
dichas amplificación selectiva en la determinación de la secuencia
de genomas enteros y, en particular, en genomas complejos. La
técnica AFLP se conoce en la especialidad como técnica de obtención
de la huella genética y no se ha identificado todavía como una
solución para ayudar en la secuenciación de genomas complejos. En
particular, la utilización de un conjunto de combinaciones del
cebador que cubren todas o la mayoría de las permutaciones de
nucleótidos para un número determinado de nucleótidos selectivos
(por ejemplo, 16 combinaciones del cebador en el caso de dos
nucleótidos selectivos) proporciona un método fiable y rápido para
proporcionar subconjuntos complementarios y reproducibles de un
genoma que se puede secuenciar. En determinadas formas de
realización, los cebadores utilizados para reducir la complejidad
contienen uno o más enlaces tioato para aumentar su selectividad
y/o rendimiento.
En ciertas formas de realización alternativas,
la reducción de la complejidad comprende el método CHIP. Otros
métodos aptos para la reducción de la complejidad son la
inmunoprecipitación de la cromatina (ChiP). Ello significa que se
aísla el ADN del núcleo, mientras que las proteínas tales como los
factores de transcripción se enlazan con el ADN. Con la técnica
Chip, en primer lugar se utiliza un anticuerpo contra la proteína,
lo que tiene como resultado un complejo
Ab-proteína-ADN. Al purificar dicho
complejo y precipitarlo, se selecciona el ADN al que se enlaza
dicha proteína. Posteriormente, se puede utilizar el ADN en la
construcción y la secuenciación de la genoteca. Es decir, este es
un método para realizar una reducción de la complejidad de un modo
no aleatorio dirigido a unas áreas funcionales específicas; en el
presente ejemplo, factores de transcripción específicos. Unas
formas de realización alternativas pueden utilizar el diseño de los
cebadores de la PCR dirigidos contra motivos conservados tales como
las regiones SSRs, NBS (regiones de enlace de nucleótidos),
secuencias promotor/potenciador, secuencias consenso de telómeros,
secuencias
de genes MADS, familias de genes de la familia de genes de la adenosinatrifosfatasa y otras familias de genes.
de genes MADS, familias de genes de la familia de genes de la adenosinatrifosfatasa y otras familias de genes.
En etapa (e), se generan las genotecas de
secuenciación primera segunda y adicional para cada subconjunto de
fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador. Las
genotecas se generan habitualmente mediante la fragmentación de los
fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador. Se
puede realizar la fragmentación mediante técnicas físicas, es
decir, corte, sonicación u otros procedimientos de fragmentación.
En la etapa (f), se determina por lo menos una parte, pero
preferentemente la totalidad, de la secuencia de nucleótidos de por
lo menos una parte de, pero preferentemente de todos los fragmentos
contenidos en las genoteca.
La secuenciación se puede realizar en principio
utilizando cualquier medio conocido en la técnica, tal como el
procedimiento de terminación de la cadena de
didesoxirribonucleótidos. Se prefiere, sin embargo, que la
secuenciación se realice utilizando procedimientos de secuenciación
de alto rendimiento, tales como los procedimientos descritos en los
documentos WO 03/004690, WO 03/054142, WO 2004/069849, WO
2004/070005, WO 2004/070007 y WO 2005/003375 (todos ellos a nombre
de 454 Life Sciences), por Seo et al. (2004) Proc. Natl.
Acad. Sci. EE. UU. 101: 5488-93, y las técnicas
de Helios, Solexa, US Genomics. Se prefiere que la secuenciación se
realice utilizando el aparato y/o el procedimiento descrito en los
documentos WO 03/004690, WO 03/054142, WO 2004/069849, WO
2004/070005, WO 2004/070007 y WO 2005/003375 (todos ellos a nombre
de 454 Life Sciences). La técnica descrita permite la secuenciación
de 40 millones bases en una serie simple y es 100 veces más rápida
y económica que las técnicas alternativas. La técnica de
secuenciación consiste aproximadamente en 5 etapas: 1)
fragmentación de ADN y ligación de un adaptador específico para
crear una genoteca de ADN monocatenario (ADNmc); 2) apareamiento
del ADNmc con perlas, emulsificación de las perlas en
microrreactores de agua en aceite y realizar la PCR en emulsión
para amplificar las moléculas individuales de ADNmc en las perlas;
3) selección de/enriquecimiento de las perlas que contienen
moléculas ADNmc amplificado en su superficie 4) sedimentación del
ADN que transporta las en una PicoTiterPlate®; y 5) secuenciación
simultánea en 100,000 pocillos mediante la generación de una señal
óptica de pirofosfato. El procedimiento se explicará posteriormente
con mayor detalle.
En una forma de realización preferida, la
secuenciación comprende las etapas de:
- (a)
- aparear los fragmentos adaptados a las perlas, apareándose cada perla con un fragmento adaptado simple;
- (b)
- emulsionar las perlas en microrreactores de agua en aceite, comprendiendo cada microrreactor de agua en aceite una perla simple;
- (c)
- cargar las perlas en pocillos, comprendiendo cada pocillo una perla simple; y generar una señal de pirofosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
En la primera etapa (a), los adaptadores de la
secuenciación se enlazan con fragmentos en la genoteca de la
combinación. Dicho adaptador de la secuenciación comprende por lo
menos una región "clave" para aparearse con una perla, una
región del cebador de la secuenciación y una región del cebador de
la PCR. De este modo se obtienen los fragmentos adaptados.
En una primera etapa, los fragmentos adaptados
se aparean con las perlas, apareándose cada perla con un fragmento
adaptado simple. Al grupo de fragmentos adaptados, se añaden las
perlas en exceso para garantizar el apareamiento de un fragmento
adaptado simple por perla en el caso de la mayoría de las perlas
(distribución de Poisson).
En una etapa posterior, se emulsionan las perlas
en microrreactores de agua en aceite, comprendiendo cada
microrreactor de agua en aceite una perla simple. Los reactivos de
la PCR se encuentran presentes en los microrreactores de agua en
aceite permitiendo que se produzca una reacción de la PCR en los
microrreactores. Posteriormente, se rompen los microrreactores y se
enriquecen las perlas que comprenden ADN (perlas positivas en
ADN).
En una etapa posterior, se cargan las perlas en
pocillos, comprendiendo cada pocillo una perla simple. Los pocillos
forman parte preferentemente de una PicoTiter^{TM}Plate que
permite la secuenciación simultánea de una gran cantidad de
fragmentos.
Tras la adición de perlas que transportan
enzimas, se determina la secuencia de los fragmentos utilizando la
pirosecuenciación. En etapas sucesivas, la PicoTiter^{TM}Plate y
las perlas así como las los enzimas de las mismas se someten a
distintos desoxirribonucleótidos en presencia de reactivos
convencionales de la secuenciación y, mediante la incorporación de
un desoxirribonucleótido, se genera una señal óptica que se
registra. La incorporación del nucleótido correcto generará una
señal de pirosecuenciación que se puede detectar.
La propia pirosecuenciación resulta conocida en
la técnica y se describe, entre otros, en www.biotagebio.com;
www.pyrosecuencing.com/sección técnica. La técnica se aplica además
en, por ejemplo, los documentos WO 03/
004690, WO 03/054142, WO 2004/069849, WO 2004/070005, WO 2004/070007 y WO 2005/003375 (todos ellos a nombre de 454 Life Sciences).
004690, WO 03/054142, WO 2004/069849, WO 2004/070005, WO 2004/070007 y WO 2005/003375 (todos ellos a nombre de 454 Life Sciences).
En la etapa (g) del procedimiento de la presente
invención, se alinean las secuencias determinadas de los fragmentos
de las genotecas primera, segunda y/o adicionales. La alineación
proporciona cóntigos de los fragmentos en los subconjuntos de los
fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador. De este
modo para cada fragmento de restricción amplificado ligado al
adaptador, se genera un cóntigo a partir de los fragmentos
secuenciados, es decir, el cóntigo de un fragmento de restricción
amplificado ligado al adaptador, se construye a partir de la
alineación de la secuencia de los diversos fragmentos obtenidos a
partir de la fragmentación de la etapa (e). Mediante la
construcción de cóntigos a partir de las secuencias que representan
los fragmentos de restricción dispersos de una pequeña parte del
genoma, disminuyen considerablemente los problemas de la
construcción de cóntigos que son consecuencia de las abundantes
secuencias repetidas obteniéndose secuencia borrador del genoma de
una calidad superior que contiene menos errores debidos a uniones
falsas de secuencias repetidas. Además, el proceso de ensamblaje
resultará menos complejo desde el punto de vista informático y, por
lo tanto, más rápido de realizar. Al alinear las secuencias de las
distintas genotecas, se pueden construir los cóntigos de cada
fragmento de restricción del conjunto de fragmentos de restricción
para cada combinación del cebador. Ello tiene como resultado un
conjunto de cóntigos, correspondiendo cada uno a un fragmento de
restricción particular. Como resultado de ello, cada fragmento de
restricción obtenido a partir de la restricción del genoma con por
lo menos una endonucleasa de restricción presenta ahora una
secuencia determinada (cóntigo). El procedimiento de la presente
invención se ilustra en las figuras 1 y 2.
Los procedimientos de alineación de secuencias
con un propósito comparativo resultan muy conocidos en la técnica.
Se describen diversos programas y algoritmos de alineación en: Smith
& Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; Needleman
& Wunsch (1970) J. MoI. Biol. 48: 443; Pearson &
Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85: 2444;
Higgins & Sharp (1988) Gene 73: 237-244;
Higgins & Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153;
Corpet et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:
10881-90; Huang et al. (1992) Computer
Appl. in the Biosci. 8: 155-65; y
Pearson et al. (1994) Meth. MoI. Biol. 24:
307-31, que se incorporan en la presente memoria
como referencia. Altschul et al. (1994) Nature Genet.
6: 119-29 (que se incorpora en la presente memoria
como referencia) presenta una consideración detallada de
procedimientos de alineación de secuencias y cálculos de
analogías.
El programa básico de búsqueda de alineación
local (BLAST) del NCBI (Altschul et al., 1990) se encuentra
disponible a partir de fuentes diversas, entre ellas el Centro
Nacional de Información Biológica (NCBI, Bethesda, Md.) y en
Internet, para utilizar junto con los programas de análisis de
secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se puede
conseguir en <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/>. Una
descripción de como determinar la identidad de la secuencia
utilizando dicho programa se encuentra disponible en
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html>. Una
aplicación adicional se puede encontrar en la extracción de
microsatélites (véase Varshney et al. (2005) Trends in
Biotechn. 23(l): 48-55.
Habitualmente, la alineación se realiza en los
datos de la secuencia que se han extraído para los
adaptadores/cebador y/o identificadores pero con secuencias de
reconocimiento reconstruidas de enzimas de restricción, es decir,
utilizando únicamente los datos de la secuencia procedentes de los
fragmentos que se originan en la muestra de ácido nucleico.
Habitualmente, los datos de la secuencia obtenidos se utilizan para
identificar el origen del fragmento (es decir, de qué muestra), las
secuencias obtenidas a partir del adaptador y/o identificador se
eliminan de los datos y la alineación se realiza en este conjunto
extraído.
En la etapa (h), se repite el procedimiento
completo por lo menos una vez con una o más endonucleasas de
restricción distintas, es decir, una endonucleasa de restricción
que contiene, preferentemente, un sitio de reconocimiento distinto
al de la primera endonucleasa, para proporcionar un conjunto de
fragmentos de restricción segundo o incluso adicionales que
posteriormente se enlazan con el adaptador, se amplifican
selectivamente utilizando combinaciones del cebador con una
secuencia seleccionada que se selecciona independientemente, es
decir, no tiene relación alguna con la secuencia seleccionada,
(tanto en el número como en el tipo de nucleótidos) con las que se
han utilizado con el mismo objetivo con la primera endonucleasa de
restricción. Por ejemplo, el primer subconjunto se puede obtener
mediante la restricción con MseI/PstI y amplificar selectivamente
utilizando un cebador selectivo para los restos MseI del sitio de
reconocimiento y que transporta 2 nucleótidos selectivos en su
extremo 3'. El segundo subconjunto se puede obtener mediante la
digestión de EcoRI/HindIII y la amplificación selectiva con un
cebador selectivo para los restos EcoRI del sitio de reconocimiento
con 1 nucleótido selectivo.
Por lo tanto, se puede obtener de este modo un
segundo (y/o adicionales) conjunto de cóntigos para todos los
fragmentos de restricción, de un modo similar a tal como se ha
descrito anteriormente en la presente memoria. Ello resulta
necesario, ya que para una endonucleasa de restricción determinada,
las fracciones del genoma que se están secuenciando son
complementarias, no se superponen. Los cóntigos obtenidos con
distintas combinaciones enzimáticas se superponen y, por lo tanto,
permiten la generación de un cóntigo a partir de los mismos y, de
este modo, permiten la formación de una secuencia genómica
(borrador).
En etapa (i) del procedimiento, los cóntigos
obtenidos a partir de las etapas anteriores del procedimiento para
cada fragmento se alinean para que formen una secuencia del
genoma.
En determinadas formas de realización, se puede
contribuir a la construcción del cóntigo de tanto los fragmentos de
restricción como de la secuencia genómica mediante la utilización de
secuencias de nucleótidos del genoma que se obtienen a partir de
otras fuentes, entre ellas, pero sin limitarse a las mismas,
secuencias del extremo BAC, secuencias aleatorias BAC, secuencias
EST o secuencias aleatorias del genoma entero.
El procedimiento de la presente invención es
independiente de la fuente de ADN, es decir, se puede aplicar a
todos los organismos ya que no requiere información previa de la
secuencia. Mediante la selección apropiada de enzimas, adaptadores,
cebadores y del número de nucleótidos selectivos, se presenta la
técnica graduable que se puede aplicar a genomas de todos los
tamaños y complejidades. Además, las fracciones del genoma que se
obtienen con las distintas combinaciones del cebador y/o con los
cebadores selectivos que difieren entre sí en las secuencias
selectivas específicas de nucleótidos del extremo 3', son
complementarias. Ello significa que cuando, para un número
determinado de nucleótidos selectivos, se utilizan todas las
permutaciones (1 nucleótido selectivo equivale a 4 variantes (A, C,
T, G), 2 nucleótidos selectivos 16, 3 nucleótidos selectivos 64
variantes, etcétera), los fragmentos de restricción combinados
constituyen el genoma restringido.
Figura 1: Partiendo del ADN genómico, se realiza
una digestión con una combinación de endonucleasas de restricción
(combinación enzimática 1, EC1), lo que tiene como resultado un
conjunto de fragmentos de restricción. Los fragmentos de
restricción se enlazan con adaptadores tras los que los fragmentos
de restricción enlazados con adaptadores se amplifican con una
primera combinación selectiva del cebador (PC1) para obtener n
fragmentos. Cada fragmento se divide para secuenciación de alto
rendimiento y se somete a secuenciación y alineación para generar
los cóntigos de los fragmentos de restricción. De este modo, se
determina la secuencia n de todos o de la mayoría de fragmentos de
restricción enlazados con adaptadores para una combinación del
cebador.
Figura 2: Para cada combinación del cebador
posible de una combinación enzimática determinada (EC1), se repiten
las etapas de fragmentación de los fragmentos de restricción
amplificados enlazados con adaptadores, secuenciación, alineación y
construcción de cóntigos. Ello significa que cuando, por ejemplo, se
realiza la amplificación selectiva con cebadores que transportan
cada uno un nucleótido selectivo en su extremo 3' (es decir,
cebadores +1/+1), 16 combinaciones del cebador (PC1 ... PCm) cubren
todas las permutaciones y con 16 combinaciones del cebador todos
los fragmentos de restricción enlazados con adaptadores se han
amplificado y posteriormente secuenciado. A partir de los cóntigos
generados con la EC1, es decir, a partir de EC1/PC1 ... EC1/PCm, un
ensamblaje cubrirá una gran parte del genoma, pero necesitará
fijarse a fin de proporcionar una secuencia genómica. Con este
objetivo, se utiliza una segunda combinación enzimática (y, si es
necesario una tercera y una cuarta, etc.). Las etapas de las
figuras 1 y 2 se repiten con la combinación enzimática 2 (EC2), es
decir, restricción, ligación con el adaptador, etc. La amplificación
selectiva se realiza con un conjunto de cebadores selectivos que
habitualmente pueden ser distintos (secuencia y selectividad) de los
cebadores utilizados con la EC1. Los fragmentos de restricción
enlazados con adaptadores se amplifican de nuevo con todas las
permutaciones posibles de un conjunto de cebadores selectivos
obteniéndose unos subconjuntos distintos y complementarios. La
fragmentación de cada subconjunto de fragmentos de restricción
enlazados con adaptadores amplificados selectivamente, y la
posterior secuenciación de alto rendimiento, la construcción de
cóntigos, etc. conduce a un segundo ensamblaje, que de nuevo cubre
una gran parte del genoma. A partir de dichos dos ensamblajes (y la
combinación enzimática opcional tercera, cuarta, etc.), que se
superponen entre sí en grandes áreas, se genera la secuencia
borrador del genoma que se investiga.
Figura 3. Secuencia de 662 pares de bases del
cóntigo 606 prevista informáticamente, que contiene los fragmentos
de restricción que se superponen EcoRI/HindIII +C/+CT y BamHI/XbaI
+C+G.
Figura 4. Cóntigos de la secuencia observada del
cóntigo 606 previsto informáticamente basándose en la secuenciación
por AFLP de las genotecas de fragmentos EcoRI/HindIII +C/+CT
(r1_9_35974-36087) y BamHI/XbaI +C/+G
(r2_9_36138-36200). Se ha de indicar que la
superposición de 42 pares de bases entre
(r1_9_35974-36087) y
(r2_9_36138-36200) se cubre completamente mediante
las secuencias obtenidas a partir de ambas genotecas de
fragmentos.
La presente invención se puede ilustrar mediante
los ejemplos siguientes que no pretenden limitar la presente
invención en modo alguno, si no que se presentan a título
simplemente ilustrativo.
Etapa
1
El ADN se somete a restricción utilizando dos 6
cortadoras A y B (por ejemplo EcoRI e HindIII). Ello genera tres
tipos de fragmentos de restricción: A-A (25%),
B-B (25%) y A-B (50%) con una
longitud media de aproximadamente 3-4 kb, en
función del contenido en GC del genoma de interés, y la selección de
las endonucleasas de restricción. Tras la ligación de los
adaptadores, se realiza la PCR larga con cebadores +X/+Y (es decir,
uno de los cebadores contiene X nucleótidos selectivos y el otro Y),
hasta una secuencia de 1 Mb por combinación del cebador. En el caso
de que X = 2
e Y = 3, ello se repite para todas las 1024 combinaciones del cebador. En el caso de que X = 1 e Y = 2, ello se repite para todas las 64 combinaciones del cebador.
e Y = 3, ello se repite para todas las 1024 combinaciones del cebador. En el caso de que X = 1 e Y = 2, ello se repite para todas las 64 combinaciones del cebador.
- A:
- Tamaño del genoma maíz de 2700 Mbp: fragmentos de tipo A-B = 1350 Mbp. Mediante una amplificación selectiva +2/+3 (1024 combinaciones del cebador) el producto de la amplificación de cada una de las combinaciones del cebador contiene, en promedio, una secuencia de 1350/1024 = 1,32 Mbp. Con una longitud media de aproximadamente 3000 de pares de bases por fragmento A-B, ello produce 1320000/3000 = 440 fragmentos A-B.
- B:
- 130 Mbp de Arabidopsis: fragmentos del tipo A-B de 65 Mbp. Con X = 1 e Y = 2, cada combinación del cebador (PC) contiene una secuencia de aproximadamente 1 Mbp. Con una longitud media de 3000 de pares de bases por fragmento, es decir, fragmentos A-B de 1000000/3000 = 330.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
Construcción de genotecas cortando cada conjunto
de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador y
secuenciación utilizando la PCR en emulsión junto con la
pirosecuenciación de 454 Technologies tal como se describe en otras
partes de la presente memoria, para cada combinación del cebador
(1024 ó 64 veces). La secuenciación utilizando esta tecnología
proporciona unos datos de 40 Mbp de la secuencia por genoteca, lo
que significa que cada genoteca presenta un nivel de repeticiones en
la secuencia de 40 veces. Variando el número de nucleótidos, se
amplifica una cantidad distinta de fragmentos A-B y
se obtiene un nivel distinto de repeticiones. Ello se puede
determinar en su puesta en práctica.
Etapa
3
Se realiza el ensamblaje para generar los
cóntigos de todos los fragmentos A-B que se han
amplificado por PC. Con ello se producen aproximadamente entre 300
y 500 cóntigos por PC cuya longitud media se corresponderá con la
longitud media del fragmento A-B. La secuenciación
de todos los PC tiene como resultado un número de cóntigos que
varía desde varias decenas de miles hasta varios centenares de miles
(Arabidopsis 21000, maíz 450000).
Etapa
4
Repetición de las etapas 1 a 3 para por lo menos
otra combinación enzimática (EC), por ejemplo, A-C.
Ello resulta imprescindible ya que todos los PC del EC
A-B proporcionan únicamente cóntigos complementarios
y no cóntigos que se superpongan, con lo que se cubre únicamente el
50% del genoma. Se puede aumentar asimismo la cobertura del genoma
procesando todos los fragmentos A-A y
B-B. Al utilizar EC adicionales, se consigue la
superposición entre los cóntigos de AB y de AC y aumenta la
cobertura del genoma.
Etapa
5
Una de las ventajas de dicho procedimiento
radica en el hecho de que uno de los problemas del ensamblaje del
genoma y la posibilidad de formación de cóntigos erróneos debido a
que se minimiza la presencia de múltiples secuencias repetidas
mediante la formación de cóntigos dispersos pequeños (es decir, no
adyacentes) de 1-10 kb en una fracción del genoma de
1-5 Mbp en vez del genoma entero. Los cóntigos con
longitudes mucho más largas se pueden etiquetar un las primeras
etapas como producto de un enlace falso y descartarlos. Una ventaja
adicional es que el ensamblaje resulta menos complejo desde el punto
de vista informático debido al ensamblaje inicial (etapa 3), menos
secuencias se encuentran implicadas que cuando se va a ensamblar la
secuencia genómica entera en una etapa. Una ventaja adicional es
que el proceso de amplificación selectiva permite graduar el
procedimiento entero a un genoma de cualquier tamaño y es de
aplicación universal.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Tal como en el caso anterior, con una cortadora
6 (EcoRI) y una cortadora 4 (MseI). La longitud media del fragmento
es aproximadamente de 250 pares de bases. Los fragmentos
A-B representan aproximadamente entre el 8 y el 15%
del genoma. En comparación con la digestión con la enzima de
restricción utilizando dos enzimas de restricción cortadoras 6, se
necesita en promedio aproximadamente 1 nucleótido selectivo menos
para obtener un nivel de complejidad de secuencia por PC de
aproximadamente 1-5 Mbp.
- A:
- Tamaño del genoma de maíz de 2700 Mbp: fragmentos de tipo A-B = 270 Mbp, (10%) mediante una amplificación selectiva +2/+2 (256 combinaciones del cebador) contiene el producto de la amplificación de cada una de las combinaciones del cebador, en promedio, secuencia de 270/256 = 1,05 Mbp. Con una longitud media por fragmento A-B de aproximadamente 250 pares de bases, se obtienen 1050000/250 = 4200 fragmentos A-B/cóntigos.
- B:
- 130 Mbp de Arabidopsis: fragmentos de tipo A-B de 13 Mbp (10%). Con X = 1 e Y = 1, cada combinación del cebador (PC) contiene aproximadamente una secuencia de 1 Mbp. Con una longitud media de 250 pares de bases por fragmento, es decir, 1000000/3000 = 4000 fragmentos A-B.
Etapa
2
Tal como en el caso anterior. Para evitar el
error sistemático de los fragmentos demasiado cortos, se puede
utilizar una selección del tamaño para eliminar los fragmentos
inferiores a 100-150 pares de bases.
Etapa
3
Se realiza el ensamblaje para generar cóntigos
de todos los fragmentos A-B que se han amplificado
por PC. Ello produce varios miles de cóntigos por PC cuya longitud
media se corresponderá con la longitud del fragmento
A-B (250 pares de bases). La secuenciación de todos
los PC tiene como resultado un número de cóntigos que varía desde
varias decenas de miles hasta aproximadamente un millón
(Arabidopsis 64000, maíz 1000000).
Etapa
4
Repetición de las etapas 1-3 con
diversos EC (A-C, B-C,
C-C, C-D, A-D,
etc.). Ello es necesario ya que los PC de combinación enzimática
A-B no cubren más del 8-15% del
genoma y, tal como en el caso anterior, los cóntigos de los PC no
se superponen.
Etapa
5
Tal como en el caso anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
Digestión del ADN con una endonucleasa de
restricción A (EcoRI, por ejemplo). Fragmentos de restricción de
aproximadamente 3-4 kb, en función del contenido en
GC y la elección del enzima. Se enlaza la mezcla al adaptador y se
realiza la PCR larga (véase anteriormente) con cebadores selectivos
que reducen la cantidad de secuencia por PC hasta aproximadamente 1
Mb. En el caso de X = 2 e Y = 3 se repite para los 1024 PC. En el
caso (X,Y) = (+1/+2) se repite para todos los 64 PC.
- A:
- Tamaño del genoma de maíz de 2700 Mbp: fragmentos de tipo A-A = 2700 Mbp, mediante una amplificación selectiva +2/+3 (1024 combinaciones del cebador) contiene el producto de la amplificación de cada una de las combinaciones del cebador, en promedio, secuencia de 2700/1024 = 2,64 Mb. Con una longitud media por fragmento A-A de aproximadamente 3000 pares de bases, se obtienen 2640000/300 = 880 fragmentos A-A/cóntigos.
- B:
- 130 Mbp de Arabidopsis: fragmentos de tipo A-A de 130 Mb. Con X = 1 e Y = 2, cada combinación del cebador (PC) contiene aproximadamente una secuencia de 2 Mb. Con una longitud media de 3000 pares de bases por fragmento, es decir, 2000000/3000 = 660 fragmentos A-A.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
Construcción de genotecas cortando cada conjunto
de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador y
secuenciación utilizando la PCR en emulsión junto con la
pirosecuenciación de 454 Technologies tal como se describe en otras
partes de la presente memoria, para cada combinación del cebador
(1024 ó 64 veces). La secuenciación utilizando esta tecnología
proporciona unos datos de 40 Mbp de la secuencia por genoteca, lo
que significa que cada genoteca presenta un nivel de repeticiones en
la secuencia de 20 veces.
Etapa
3
Se realiza el ensamblaje para generar cóntigos
de todos los fragmentos A-A que se han amplificado
por PC. Ello produce, teóricamente, entre 600 y 900 cóntigos por PC
cuya longitud media se corresponderá con la longitud del fragmento
A-A (3000 pares de bases). La secuenciación de todos
los PC tiene como resultado un número de cóntigos que varía desde
varias decenas de miles hasta aproximadamente unos centenares de
miles (Arabidopsis 42000, maíz 900000).
\newpage
Etapa
4
Repetir las etapas 1-3 con por
lo menos otro EC (B-B). Ello es necesario ya que los
PC de combinación enzimática A-B no cubren más del
8-15% del genoma y, tal como en el caso anterior,
los cóntigos de los PC no se superponen.
Etapa
5
Tal como en el caso anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente ejemplo describe la capacidad de
utilizar la secuenciación de alto rendimiento de fragmentos AFLP
obtenidos a partir 2 combinaciones de enzimas de restricción para
determinar la secuencia genómica de un genoma vegetal complejo.
En el presente ejemplo se realizaron las
siguientes etapas:
La secuencia genómica entera del genoma de
Arabidopsis (ecotipo Colombia) se descargó de Genbank. Se realizó
la predicción informática de los fragmentos de AFLP +1/+1 para la
combinación de enzimas de restricción BamHI/XbaI utilizando los
nucleótidos selectivos +C y +G, respectivamente, utilizando RECOMB.
De un modo similar, se realizó la predicción de los fragmentos AFLP
+1/+2 para la combinación de enzimas de restricción EcoRI/HindIII
utilizando los nucleótidos selectivos +C y +CT. La recogida de los
fragmentos AFLP obtenidos a partir de dos digestiones informáticas
tuvo como resultado diversas secuencias de fragmentos AFLP (de
aproximadamente 14) que se superponían entre las combinaciones
enzimáticas BamHI/XbaI y EcoRI/HindIII. Uno de los fragmentos de
restricción superpuestos forma un cóntigo denominado cóntigo
"606", que presenta una longitud total de 662 pares de bases.
La secuencia de dicho cóntigo se representa en la figura 3.
El fragmento previsto EcoRI/HindIII AFLP +C/+CT
en dicho cóntigo presenta 218 pares de bases de longitud, lo que
supone el 32,9 % de la longitud total del cóntigo de 606 pares de
bases. El fragmento BamHI/XbaI AFLP +C/+G presenta una longitud de
486 pares de bases, lo que equivale al 73,4% de la longitud total
del cóntigo. Ambos fragmentos se superponen en 42 pares de bases,
tal como se indica en la figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon los moldes del ADN genómico del
ecotipo de Arabidopsis Colombia y AFLP moldes para las
combinaciones de enzimas de restricción EcoRI/HindIII y BamHI/XbaI
basándose en los protocolos descritos por Zabeau & Vos, 1993:
Selective restriction fragment amplification; a general method
for DNA fingerprinting (documento EP
0534858-A1, B1; la patente US 6045994) y Vos et
al. (Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee,
T., Homes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. et
al. (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting.
Nucl. Acids Res., 21, 4407-4414).
Se utilizaron las siguientes secuencias
(5'-3') del adaptador:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron las amplificaciones (+1/+1)
selectivas (E/H y B/X) utilizando los siguientes cebadores de
fosforotioato (5'-3'):
con una "s" indicando la posición de los
enlaces fosforotioato de los oligonucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mezclas de las reacciones por AFLP
presentaron la composición siguiente:
5 \mul 1/10 en molde AFLP diluido con MQ
10 \mul de solución amortiguadora para PCR de
herculasa II
0,5 \mul de dNTP (20 mM)
1,5 \mul de cebador AFLP 1 (50 ng/\mul)
1.5 \mul de cebador AFLP 2 (50 ng/\mul)
1 \mul de la ADN-polimerasa
Herculase® II Fusion
30,5 \mul de MQ
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones del ciclo de la PCR fueron las
siguientes:
Desnaturalización inicial 94ºC 2 min
Desnaturalización 94ºC 10 seg
Apareamiento 56ºC 30 seg 10 ciclos
Elongación 68ºC 2 min
Desnaturalización 94ºC 15 seg
Apareamiento 56ºC 30 seg 20 ciclos
Elongación 68ºC 2 min *
* Ajuste: 20 seg por ciclo
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la amplificación AFLP, se purificaron los
productos de las reacciones utilizando columnas Qiagen siguiendo
los protocolos de los fabricantes.
Se prepararon dos genotecas de secuencias 454
utilizando fragmentos purificados BamHI/XbaI AFLP y fragmentos
EcoRI/HindIII AFLP como ADN inicial, respectivamente, tal como
describen Margulies y colaboradores, empezando con la nebulización
(fragmentación) de los productos purificados de la reacción AFLP. Se
realizó una serie simple de la secuencia 454 secuencia utilizando
un instrumento de secuenciación GS20 (Roche Molecular Diagnostics),
aplicando cada una de las genotecas de fragmentos de las dos
combinaciones enzimáticas AFLP a una mitad de una PicoTiterPlate
GS20.
Tras completar la serie de la secuencia, se
procesaron los datos originales utilizando el programa RUNASSEMBLY
del GS20. Los datos obtenidos de las genotecas de fragmentos
EcoRI/HindIII y BamHI/XbaI AFLP se procesaron por separado y
juntos, obteniéndose los cóntigos de las lecturas de las secuencias
de superposición.
A continuación, se cartografiaron los cóntigos
obtenidos del RUNASSEMBLY con respecto al genoma de referencia
(cóntigo 606 previsto en la etapa a) anterior utilizando RUNMAPPING,
a fin de determinar hasta qué grado se habían secuenciado los
fragmentos previstos informáticamente BamHI/XbaI +C/+G y
EcoRI/HindIII +C/+CT AFLP contenidos en el cóntigo 606. Los
porcentajes de cobertura obtenidos a partir de las genotecas
respectivas se representan en la tabla siguiente.
Las secuencias de los cóntigos resultantes se
representan en la figura 4.
Dichos resultados demuestran la viabilidad
determinar la secuencia genómica de genomas vegetales complejos
mediante la digestión del ADN genómico total con múltiples
combinaciones de enzimas de restricción por AFLP, seguido por el
ensamblaje de cóntigos por genoteca de fragmentos y el posterior
ensamblaje de los cóntigos en la secuencia genómica del
vegetal.
<110> Keygene NV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Estrategias mejoradas para la
secuenciación de genomas complejos utilizando técnicas de
secuenciación de alto rendimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P27925PC00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US60/693,053
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2005-06-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US60/714,897
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2005-09-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP06075104.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2006-01-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US60/759,034
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2006-01-17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> adaptador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtagact gcgtacc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> adaptador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcggtacg cagtc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> adaptador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtagact gcgtaca
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> adaptador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtgtacg cagtct
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> adaptador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtagact gcgtacc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> adaptador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattggtacg cagtctac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> adaptador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgtagact gcgtacc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> adaptador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctggtacg cagtctac
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactgcgtac cgatccc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactgcgtac cgatccc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactgcgtac cgatccc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlaces fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactgcgtac cgatcscsc
\hfill19
Claims (16)
1. Procedimiento para determinar una secuencia
genómica que comprende las etapas de:
- (a)
- proporcionar un primer subconjunto del genoma mediante la digestión del genoma con por lo menos una primera endonucleasa de restricción para proporcionar fragmentos de restricción;
- (b)
- realizar la ligación de por lo menos un adaptador con los fragmentos de restricción del primer subconjunto para proporcionar un primer conjunto de fragmentos de restricción ligados al adaptador;
- (c)
- amplificar selectivamente el primer conjunto de fragmentos de restricción ligados al adaptador utilizando una primera combinación de cebador en la que por lo menos un primer cebador contiene una sección complementaria al adaptador y a una parte de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción y que contiene además una primera secuencia seleccionada en el extremo 3' de la secuencia del cebador, comprendiendo la primera secuencia seleccionada entre 0 y 10 nucleótidos selectivos, para proporcionar un primer subconjunto de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador;
- (d)
- repetir la etapa (c) con por lo menos un segundo y/o una o más combinaciones adicionales del cebador en las que el cebador contiene una distinta secuencia seleccionada segunda y/o adicionales en su extremo 3' que contiene el mismo número de nucleótidos selectivos, para proporcionar unos subconjuntos segundo y/o adicionales de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador;
- (e)
- fragmentar cada uno de los subconjuntos primero, segundo y/o adicionales de fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador para generar unas genotecas de secuenciación primera, segunda y/o adicionales;
- (f)
- determinar por lo menos una parte de las secuencias de nucleótidos de por lo menos una parte de los fragmentos contenidos en cada una de las genotecas primera, segunda y/o adicionales;
- (g)
- alinear la secuencia de los fragmentos en cada una de las genotecas primera, segunda y/o adicionales para generar cóntigos de los fragmentos de restricción amplificados ligados al adaptador obtenidos que representan fracciones dispersas del genoma;
- (h)
- repetir las etapas (a)-(g) para por lo menos unas endonucleasas de restricción segunda y/o adicionales;
- (i)
- alinear los cóntigos obtenidos en las etapas (g) y (h) para cada una de las endonucleasas de restricción segunda y/o adicionales para proporcionar una secuencia del genoma.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que por lo menos una de las endonucleasas de restricción
primera, segunda y/o adicionales es una cortadora poco
frecuente.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que por lo menos una de las
endonucleasas de restricción primera, segunda y/o adicionales es
una cortadora frecuente.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2 ó 3, en el que se utilizan por lo menos dos
cortadoras poco frecuentes.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que se utilizan una cortadora poco
frecuente y una cortadora frecuente.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el procedimiento de amplificación
es la PCR.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en el que la secuencia seleccionada en el
extremo 3' del cebador contiene entre 1 y 8 nucleótidos
seleccionados.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que las secuencias seleccionadas
primera, segunda y adicionales presentan el mismo número de
nucleótidos pero difieren en las secuencias de nucleótidos entre sí
de la secuencia selectiva que se encuentra en el extremo 3' del
cebador.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que secuenciación se realiza mediante
la didesoxisecuenciación de Sanger.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que secuenciación se realiza en un
soporte sólido tal como una perla.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la secuenciación se basa en la
secuenciación de alto rendimiento.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la secuenciación se basa en la
secuenciación la secuenciación por síntesis.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la secuenciación se basa en la
pirosecuenciación.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que secuenciación comprende las etapas
de:
- (f1)
- enlazar los adaptadores de la secuenciación con los fragmentos;
- (f2)
- aparear los fragmentos de la secuenciación enlazados con el adaptador con las perlas, apareándose cada perla con un fragmento simple,
- (f3)
- emulsionar las perlas en microrreactores de agua en aceite, comprendiendo cada microrreactor de agua en aceite una perla simple;
- (f4)
- realizar la PCR en emulsión para amplificar los fragmentos enlazados con el adaptador sobre la superficie de perlas
- (f5)
- seleccionar/enriquecer las perlas que contienen fragmentos amplificados enlazados con el adaptador
- (f6)
- cargar las perlas en pocillos, comprendiendo cada pocillo una perla simple; y
- (f7)
- generar una señal de pirofosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la construcción de cóntigos
se ve ayudada además por la utilización de secuencias de nucleótidos
obtenidas a partir de otras fuentes, que comprenden, pero sin
limitarse a las mismas, secuencias del extremo BAC, secuencias
aleatorias BAC, secuencias EST o secuencias aleatorias del genoma
entero.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento para reducir
la complejidad de la mezcla se basa en ligadores de indización, la
inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) o cebadores de la PCR
dirigidos contra motivos conservados.
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69305305P | 2005-06-23 | 2005-06-23 | |
| US693053P | 2005-06-23 | ||
| US71489705P | 2005-09-08 | 2005-09-08 | |
| US714897P | 2005-09-08 | ||
| EP06075104 | 2006-01-16 | ||
| EP06075104 | 2006-01-16 | ||
| US75903406P | 2006-01-17 | 2006-01-17 | |
| US759034P | 2006-01-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2344802T3 true ES2344802T3 (es) | 2010-09-07 |
Family
ID=36950154
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06757809T Active ES2344802T3 (es) | 2005-06-23 | 2006-06-23 | Estrategias mejoradas para la secuenciacion de genomas complejos utilizando tecnologias de secuenciacion de alto rendimiento. |
| ES06757808T Active ES2357549T3 (es) | 2005-06-23 | 2006-06-23 | Estrategias para la identificación y detección de alto rendimiento de polimorfismos. |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06757808T Active ES2357549T3 (es) | 2005-06-23 | 2006-06-23 | Estrategias para la identificación y detección de alto rendimiento de polimorfismos. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20090142758A1 (es) |
| EP (1) | EP1910563B1 (es) |
| JP (1) | JP2008546405A (es) |
| CN (1) | CN101278058A (es) |
| AT (1) | ATE465274T1 (es) |
| AU (1) | AU2006259990B2 (es) |
| CA (1) | CA2613248A1 (es) |
| DE (1) | DE602006013831D1 (es) |
| DK (1) | DK1910562T3 (es) |
| ES (2) | ES2344802T3 (es) |
| WO (1) | WO2006137734A1 (es) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK2302070T3 (da) | 2005-06-23 | 2012-11-26 | Keygene Nv | Strategier til identifikation og detektion af polymorfismer med højt gennemløb |
| US10316364B2 (en) | 2005-09-29 | 2019-06-11 | Keygene N.V. | Method for identifying the source of an amplicon |
| WO2007037678A2 (en) | 2005-09-29 | 2007-04-05 | Keygene N.V. | High throughput screening of mutagenized populations |
| CN103937899B (zh) | 2005-12-22 | 2017-09-08 | 凯津公司 | 用于基于aflp的高通量多态性检测的方法 |
| CN101365803B (zh) * | 2005-12-22 | 2013-03-20 | 关键基因股份有限公司 | 采用高通量测序技术的改进的转录谱描述策略 |
| US7932029B1 (en) * | 2006-01-04 | 2011-04-26 | Si Lok | Methods for nucleic acid mapping and identification of fine-structural-variations in nucleic acids and utilities |
| EP3239304B1 (en) | 2006-04-04 | 2020-08-19 | Keygene N.V. | High throughput detection of molecular markers based on aflp and high troughput sequencing |
| CN103333949B (zh) | 2006-07-12 | 2015-05-06 | 凯津公司 | 使用aflp的高通量物理作图 |
| WO2008093098A2 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-07 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
| AR066922A1 (es) | 2007-06-08 | 2009-09-23 | Monsanto Technology Llc | Metodos de mejoramiento molecular del germoplasma de una planta por secuenciamiento dirigido |
| US9080211B2 (en) | 2008-10-24 | 2015-07-14 | Epicentre Technologies Corporation | Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids |
| WO2010082815A1 (en) | 2009-01-13 | 2010-07-22 | Keygene N.V. | Novel genome sequencing strategies |
| EP2248914A1 (en) * | 2009-05-05 | 2010-11-10 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | The use of class IIB restriction endonucleases in 2nd generation sequencing applications |
| CN101693918B (zh) * | 2009-10-13 | 2012-01-04 | 东南大学 | 一种提高核酸内切酶v切割位置特异性的方法 |
| WO2011071382A1 (en) * | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Keygene N.V. | Polymorfphic whole genome profiling |
| EP2333104A1 (en) | 2009-12-11 | 2011-06-15 | Lexogen GmbH | RNA analytics method |
| EP2354243A1 (en) | 2010-02-03 | 2011-08-10 | Lexogen GmbH | Complexity reduction method |
| WO2012005595A2 (en) * | 2010-07-09 | 2012-01-12 | Wouter Leonard De Laat | V3-d genomic region of interest sequencing strategies |
| AU2012304328B2 (en) | 2011-09-09 | 2017-07-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods for obtaining a sequence |
| LT2756098T (lt) | 2011-09-16 | 2018-09-10 | Lexogen Gmbh | Nukleorūgščių molekulių bibliotekos sudarymo būdas |
| CN102373288B (zh) * | 2011-11-30 | 2013-12-11 | 盛司潼 | 一种对目标区域进行测序的方法及试剂盒 |
| CN103305503B (zh) * | 2012-03-16 | 2016-05-11 | 江苏基谱生物科技发展有限公司 | 一种用于高通量测序的索引序列组 |
| EP2959011A1 (en) * | 2013-02-19 | 2015-12-30 | Cergentis B.V. | Sequencing strategies for genomic regions of interest |
| US9328382B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-05-03 | Complete Genomics, Inc. | Multiple tagging of individual long DNA fragments |
| CN104630202A (zh) * | 2013-11-13 | 2015-05-20 | 北京大学 | 一种能够减小微量核酸物质整体扩增时产生偏倚的扩增方法 |
| GB201409282D0 (en) * | 2014-05-23 | 2014-07-09 | Univ Sydney Tech | Sequencing process |
| EP3208343B1 (en) * | 2014-10-13 | 2022-01-05 | MGI Tech Co., Ltd. | Nucleic acid fragmentation method and sequence combination |
| CN107590362B (zh) * | 2017-08-21 | 2019-12-06 | 武汉菲沙基因信息有限公司 | 一种基于长读序测序判断重叠组装正误的方法 |
| EP4245861B1 (en) | 2018-05-08 | 2025-02-26 | MGI Tech Co., Ltd. | Single tube bead-based dna co-barcoding for accurate and cost-effective sequencing, haplotyping, and assembly |
| CN110157781B (zh) * | 2018-12-29 | 2020-08-21 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法 |
| EP3918088B1 (en) * | 2019-01-29 | 2024-03-13 | MGI Tech Co., Ltd. | High coverage stlfr |
| EP3973073A1 (en) * | 2019-05-20 | 2022-03-30 | Arima Genomics, Inc. | Methods and compositions for enhanced genome coverage and preservation of spatial proximal contiguity |
| CN111667883B (zh) * | 2020-06-03 | 2021-01-22 | 四川大学 | 一种基于复合微单倍型焦磷酸测序图谱解析的法医学混合dna的分析方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU672760B2 (en) * | 1991-09-24 | 1996-10-17 | Keygene N.V. | Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerprinting |
| AU6024598A (en) * | 1997-01-10 | 1998-08-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Hybridization-based genetic amplification and analysis |
| JP2001515362A (ja) * | 1997-05-13 | 2001-09-18 | ディスプレイ・システムズ・バイオテック・アクティーゼルスカブ | ｍＲＮＡをクローニングする方法および差次的に発現された転写物のディスプレイ（ＤＯＤＥＴ） |
| AU5585599A (en) * | 1998-08-31 | 2000-03-21 | University Of Washington | Stable isotope metabolic labeling for analysis of biopolymers |
| CA2345441A1 (en) * | 1998-10-27 | 2000-05-04 | Affymetrix, Inc. | Complexity management and analysis of genomic dna |
| US6534293B1 (en) * | 1999-01-06 | 2003-03-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Accelerating identification of single nucleotide polymorphisms and alignment of clones in genomic sequencing |
| EP1173612B1 (en) * | 1999-04-09 | 2004-09-29 | Keygene N.V. | METHOD FOR THE DETECTION AND/OR ANALYSIS, BY MEANS OF PRIMER EXTENSION TECHNIQUES, OF SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS IN RESTRICTION FRAGMENTS, IN PARTICULAR IN AMPLIFIED RESTRICTION FRAGMENTS GENERATED USING AFLP$m(3) |
| EP1282729A2 (en) * | 2000-05-15 | 2003-02-12 | Keygene N.V. | Microsatellite-aflp |
| US20050064406A1 (en) * | 2001-04-20 | 2005-03-24 | Eugene Zabarovsky | Methods for high throughput genome analysis using restriction site tagged microarrays |
| CA2513899C (en) * | 2003-01-29 | 2013-03-26 | 454 Corporation | Methods of amplifying and sequencing nucleic acids |
-
2006
- 2006-06-23 DE DE602006013831T patent/DE602006013831D1/de active Active
- 2006-06-23 ES ES06757809T patent/ES2344802T3/es active Active
- 2006-06-23 US US11/993,961 patent/US20090142758A1/en not_active Abandoned
- 2006-06-23 JP JP2008518057A patent/JP2008546405A/ja active Pending
- 2006-06-23 AT AT06757809T patent/ATE465274T1/de not_active IP Right Cessation
- 2006-06-23 CA CA002613248A patent/CA2613248A1/en not_active Abandoned
- 2006-06-23 ES ES06757808T patent/ES2357549T3/es active Active
- 2006-06-23 EP EP06757809A patent/EP1910563B1/en not_active Not-in-force
- 2006-06-23 AU AU2006259990A patent/AU2006259990B2/en not_active Ceased
- 2006-06-23 DK DK06757808.8T patent/DK1910562T3/da active
- 2006-06-23 CN CNA2006800306078A patent/CN101278058A/zh active Pending
- 2006-06-23 WO PCT/NL2006/000312 patent/WO2006137734A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2006259990A1 (en) | 2006-12-28 |
| ATE465274T1 (de) | 2010-05-15 |
| DK1910562T3 (da) | 2011-03-21 |
| EP1910563B1 (en) | 2010-04-21 |
| DE602006013831D1 (de) | 2010-06-02 |
| US20090142758A1 (en) | 2009-06-04 |
| EP1910563A1 (en) | 2008-04-16 |
| JP2008546405A (ja) | 2008-12-25 |
| ES2357549T3 (es) | 2011-04-27 |
| AU2006259990B2 (en) | 2011-01-27 |
| CA2613248A1 (en) | 2006-12-28 |
| CN101278058A (zh) | 2008-10-01 |
| WO2006137734A1 (en) | 2006-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2344802T3 (es) | Estrategias mejoradas para la secuenciacion de genomas complejos utilizando tecnologias de secuenciacion de alto rendimiento. | |
| ES2393318T3 (es) | Estrategias para la identificación y detección de alto rendimiento de polimorfismos | |
| US10612090B2 (en) | Methods and systems for processing polynucleotides | |
| ES2829295T3 (es) | Detección de alto rendimiento de marcadores moleculares basados en AFLP y secuenciación de alto rendimiento | |
| ES2403312T3 (es) | Nuevas estrategias para la secuenciación del genoma | |
| ES2947437T3 (es) | Creación de Códigos de barra compartidos en el ADN, en un solo tubo con perlas, para la secuenciación, haplotipado y ensamblaje preciso y rentable | |
| ES2724824T3 (es) | Métodos para la secuenciación de ácidos nucleicos | |
| JP6525473B2 (ja) | 複製物配列決定リードを同定するための組成物および方法 | |
| ES2391837T3 (es) | Método para la detección de polimorfismos basados en AFLP de alto rendimiento | |
| ES2990227T3 (es) | Composiciones y procedimientos de análisis de ácido nucleico de secuencia única | |
| CN105358714B (zh) | 从含有少量靶标dna的样品富集dna测序文库 | |
| ES2352987T3 (es) | Cartografía física de alto rendimiento utilizando aflp. | |
| ES2889875T3 (es) | Secuenciación a partir de cebadores múltiples para incrementar la velocidad y la densidad de los datos | |
| CN103476946A (zh) | 基于配对末端随机序列的基因分型 | |
| CN114502742A (zh) | 用于核酸测序及相关应用的方法和试剂 | |
| JP7030857B2 (ja) | モジュラー核酸アダプター | |
| ES2942546T3 (es) | Métodos de alta sensibilidad para la cuantificación paralela precisa de ácidos nucleicos | |
| Cummings et al. | Combining target enrichment with barcode multiplexing for high throughput SNP discovery | |
| CN102782152A (zh) | Rna分析方法 | |
| Ungelenk | Sequencing approaches | |
| CA3208896A1 (en) | Highly sensitive methods for accurate parallel quantification of variant nucleic acids | |
| CN119061128A (zh) | 一种微卫星dna扩增引物对及二代测序方法 |