ES2344873T3 - Procedimiento de hibridacion in situ para detectar un acido nucleico diana. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para detectar un fragmento de ácido nucleico diana directamente en un espécimen obtenido de un paciente por hibridación in situ que comprende las etapas: a) depositar una muestra del espécimen sobre un porta; b) fijar la muestra al porta con un fijador que comprende metanol y ácido acético en una proporción de 99:1 a 80:20. c) poner en contacto los ácidos nucleicos de la muestra fijada con una sonda de ácido nucleico marcada específica para el fragmento de ácido nucleico diana, en condiciones apropiadas para la hibridación; d) eliminar por enjuague la sonda de ácido nucleico marcada no hibridada de la muestra; e) teñir la muestra enjuagada con azul de Evans; y f) detectar visualmente el complejo de la sonda hibridado mediante microscopia, siendo la presencia del complejo de la sonda una indicación de la presencia del fragmento de ácido nucleico diana.
Description
Procedimiento de hibridación in situ para
detectar un ácido nucleico diana.
Tradicionalmente se entiende por hibridación el
procedimiento por el que, en condiciones de reacción
predeterminadas, dos hebras parcial o completamente complementarias
de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN), moléculas de ácido
ribonucleico (ARN), y combinaciones de ADN y ARN, se separan en
hebras monocatenarias y después se dejan hibridar formando hélices
dobles de bases pareadas. El término hibridación in situ, tal
como se usa en el presente documento, se refiere a una técnica de
hibridación que de forma eficaz detecta las secuencias específicas
de ácido nucleico en células o tejidos intactos. La técnica de
hibridación in situ presenta la ventaja añadida de que
también proporciona información morfológica sobre las células
intactas individuales.
La técnica de hibridación in situ fue
descrita por vez primera por Gall y Padre (Proc. Nat. Acad Sciences
63: 378-83 (1969)) y Jone et al. (Nature 225:
946-8 (1969)). Ambos grupos estudiaron la formación
y detección de híbridos de ARN-ADN en preparaciones
citológicas usando sondas radiomarcadas. La técnica permite la
detección de ADN o ARN en células individuales que contienen
secuencias específicas, en una población de células heterogénea.
También permite la determinación simultánea de características
bioquímicas y morfológicas de las células examinadas. Desde su
descripción inicial, la hibridación in situ ha sufrido una
evolución continua en su metodología y aplicación. Actualmente, la
técnica tiene aplicaciones directas en muchas áreas de la
investigación biomédica y clínica que incluyen la biología celular,
el diagnóstico clínico, la biología del desarrollo, la genética y la
virología.
En J Cell Science, 104,
1187-1197 (1993) (Dirks et al) se desvelan
metodologías para la localización de intrones y exones específicos
de ARN en células cultivadas mediante sondas haptenizadas y
fluorocromizadas.
El documento
US-A-5449604 desvela marcadores
genéticos y ensayos para el cromosoma 14 y la enfermedad de
Alzheimer familiar.
El documento
US-A-5264343 desvela un
procedimiento para distinguir células normales y cancerosas.
En Cytogenet Cell Genet
41:181-184 (1986) (Korthof) se desvela un
procedimiento de fijación mejorado para la preparación de cromosomas
de líneas celulares de hámster chino, híbridas de hámster chino y
humanas y murinas.
J Clinical Microbiology, Nov 1996, p
2791-2794 (Krause et al) desvela la
comparación por PCR con frotis de sangre e inoculación de animales
pequeños para el diagnóstico de parasitemia por Babesia
microti.
El documento
US-A-5629147 desvela el
enriquecimiento e identificación de células fetales en sangre
materna mediante la hibridación in situ.
El documento
WO-A-9002173 desvela un ensayo de
hibridación in situ en una etapa.
Un aspecto de la presente invención es un
procedimiento para detectar un fragmento de ácido nucleico diana
directamente en un espécimen obtenido de un paciente por hibridación
in situ. El procedimiento comprende varias etapas que se
realizan en el orden que se enumeran. Se deposita una muestra del
espécimen sobre un porta. La muestra se fija al porta con un
fijador que comprende metanol y ácido acético en una proporción de
99:1 a 80:20. Los ácidos nucleicos de la muestra fijada se ponen en
contacto con un complejo de la sonda específica para el fragmento
de ácido nucleico diana, en condiciones apropiadas para la
hibridación. El complejo de la sonda no hibridado se elimina de la
muestra por enjuague. La muestra enjuagada se tiñe con azul de
Evans. El complejo de la sonda hibridado se detecta visualmente
mediante microscopia, y la presencia del complejo de la sonda
indica la presencia del fragmento de ácido nucleico diana. Las
diferentes realizaciones incluyen el uso del procedimiento con
diferentes tampones de hibridación. En una realización, se usa el
tampón de hibridación que está constituido esencialmente por de 10%
a 50% de formamida, 2 X SSC (pH 7,4), 1% de NP40. En otra
realización, se usa el tampón de hibridación que está constituido
esencialmente por GuSCN 1,5 M a 4 M. En otra realización, se usa el
tampón de hibridación que está constituido esencialmente por GuHCl 2
M a 6 M. Otras realizaciones de la invención suponen el uso de
sondas específicas para la identificación de patógenos de la especie
Babesia, en una muestra. Otras realizaciones incluyen
detectar ácidos nucleicos de una amplia variedad de especímenes,
que incluyen suero, plasma, esputo, orina, líquido cefalorraquideo,
tejido, leche materna e insectos como por ejemplo garrapatas.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de un procedimiento mejorado para detectar
directamente la presencia de un ácido nucleico diana en células de
especímenes obtenidos de un paciente (por ejemplo frotis de sangre,
tejidos incluidos en parafina y garrapatas), mediante hibridación
in situ. El procedimiento de la invención está
particularmente bien adaptado a la detección de secuencias de
nucleótidos específicas de patógenos, que se encuentran en el
interior de células hemáticas enteras o en tejidos infectados,
usando sondas de oligonucleótidos, soluciones de fijación previa a
la hibridación, soluciones de fijación posterior a la hibridación y
protocolos especiales. Más específicamente, se describen mejoras
novedosas de los tradicionales procedimientos de
fijación/pretratamiento que emplean compuestos orgánicos e
inorgánicos que permiten selectivamente que las sondas de
oligonucleótidos penetren en los patógenos, tanto bacterianos como
protozoarios, que están localizados en el interior de las células
infectadas. Además, un procedimiento posterior a la fijación con
azul de Evans después de la hibridación con una sonda marcada por
fluorescencia, permite visualizar fácilmente los organismos que
albergan las sondas hibridadas en el interior de las células
hemáticas.
La novedosa y única técnica de hibridación y
detección in situ que se describe en el presente documento es
un protocolo que permite usar las sondas de ADN o ARN recombinantes
con células, microorganismos, o secciones de tejido, y es
compatible con el examen microscópico que habitualmente se realiza
en los laboratorios de bacteriología, parasitología, histología o
patología. La presente invención aplica una sonda de ácido nucleico
de una secuencia de nucleótidos predeterminada a las células (o
tejido) y al examen de la muestra por microscopia para determinar
qué células (o tejidos) de la población contienen las secuencias de
ácido nucleico específicas de interés. Por lo tanto, en frotis de
sangre entera o de cortes de tejidos infectados, pueden detectarse
organismos patógenos como por ejemplo bacterias, virus, protozoos u
hongos, dentro de las células infectadas. Dichos protocolos
proporcionan una información útil científica y de diagnóstico dado
que la presencia o ausencia de un ácido nucleico específico puede
correlacionarse directa o indirectamente con una o más células de
estructura y morfología observable y, de ese modo, constituyen una
base para el diagnóstico y pronóstico clínicos.
El procedimiento para detectar un fragmento de
ácido nucleico diana directamente a partir de un espécimen está
compuesto por múltiples etapas que pueden realizarse en el orden
específico que se enumera. Un espécimen, habitualmente obtenido de
un paciente, se deposita primero sobre un porta. La muestra se fija
sobre el porta con fijador. El fijador comprende metanol y ácido
acético en una proporción de aproximadamente 99:1 a 80:20. Una vez
se ha fijado la muestra, los ácidos nucleicos de la muestra fijada
se ponen en contacto con un complejo de la sonda específica para el
fragmento de ácido nucleico diana, en condiciones apropiadas para la
hibridación. El complejo de la sonda está formado por una secuencia
de ácido nucleico que es lo suficientemente complementaria al ácido
nucleico diana para hibridarse con el ácido nucleico diana en
condiciones restrictivas. El complejo de la sonda también se derivó
con un resto que sirve de marcador para la presencia de la sonda.
Después de un periodo adecuado de hibridación, la sonda no
hibridada se elimina de la muestra por enjuague. La muestra después
se enjuaga con azul de Evans para conseguir una tinción de contraste
de las células huésped y observar con claridad la(s)
sonda(s) marcada(s) por fluorescencia
unida(s)
a ácidos nucleicos específicos de los patógenos que pueden estar presentes en la muestra (por ejemplo en las células de la muestra). Cualquier sonda que se hibrida al ácido nucleico de la muestra fijada después se detecta visualmente por microscopia. La presencia de la sonda en la muestra es una indicación de la presencia del fragmento de ácido nucleico diana. La tinción de contraste de las células del patógeno de forma concurrente con el ensayo de hibridación in situ potencia el procedimiento permitiendo una determinación más clara de la localización del ácido nucleico diana presente en la muestra. Dicha información ayuda, por ejemplo, a determinar con mayor claridad la hibridación de fondo. Se ha determinado que la sensibilidad de este procedimiento es la detección de al menos 10 copias de un ácido nucleico diana.
a ácidos nucleicos específicos de los patógenos que pueden estar presentes en la muestra (por ejemplo en las células de la muestra). Cualquier sonda que se hibrida al ácido nucleico de la muestra fijada después se detecta visualmente por microscopia. La presencia de la sonda en la muestra es una indicación de la presencia del fragmento de ácido nucleico diana. La tinción de contraste de las células del patógeno de forma concurrente con el ensayo de hibridación in situ potencia el procedimiento permitiendo una determinación más clara de la localización del ácido nucleico diana presente en la muestra. Dicha información ayuda, por ejemplo, a determinar con mayor claridad la hibridación de fondo. Se ha determinado que la sensibilidad de este procedimiento es la detección de al menos 10 copias de un ácido nucleico diana.
Este procedimiento es adecuado para usar con
cualquier espécimen obtenido de un paciente. Esto incluye, sin
limitación, sangre entera, suero, plasma, esputo, orina, leche
materna, líquido cefalorraquídeo y tejido. Este procedimiento
también es adecuado para la detección de un patógeno presente en el
interior de las células de un insecto vector. La muestra se
deposita sobre el porta por los medios habituales, y después se fija
sobre el porta usando el fijador de metanol y ácido acético.
El fin de fijar las células o el tejido es
conservar la morfología de las células o el tejido de tal forma que
el ARN quede retenido en la matriz celular en las rigurosas
condiciones que sufre durante la hibridación in situ. El
procedimiento preferido, por lo tanto, utiliza un fijador que es
capaz de conservar y mantener los ácidos nucleicos de la célula y
al mismo tiempo reticular y/o precipitar las proteínas de la matriz
celular de tal forma que la célula o tejido permanezca
sustancialmente en configuración abierta para la penetración de las
sondas y posterior hibridación.
Los fijadores novedosos que se describen aquí
son mezclas de los compuestos metanol y ácido acético, en una
proporción de aproximadamente 99:1 a 80:20. Cuando se usan estos
fijadores, no es necesario realizar un pretratamiento, como por
ejemplo con proteasas, anhídrido acético, etc. En una realización
preferida, el fijador es metanol y ácido acético en una proporción
de 95:5.
Como se usa en el presente documento, el término
sonda se refiere a ácidos nucleicos sintéticos o producidos
biológicamente (ADN, ARN, o sus equivalentes) que se diseñan para
que contengan unas secuencias de nucleótidos específicas que se
hibridan en condiciones restrictivas a secuencias de ácido nucleico
diana. El complejo de la sonda se define como una sonda que se
deriva con un resto marcador para la detección. El resto marcador
está unido al extremo 5', al extremo 3', internamente o en cualquier
combinación posible de las mismas. El resto preferido es un
marcador de identificación como por ejemplo un radiomarcador (por
ejemplo ^{32}P, ^{125}I, ^{3}H), un resto de biotina, o un
resto de fluoresceína. De forma alternativa, el oligonucleótido
tiene una cola de polidesoxinucleótidos que se usa para la detección
del complejo de la sonda. El complejo de la sonda también puede
estar formado por una pluralidad de diferentes secuencias de ácido
nucleico cada una marcada con un resto marcador. Puede ser
beneficioso marcar las diferentes secuencias de ácido nucleico cada
una con un resto marcador diferente.
La secuencia de nucleótidos del oligonucleótido
es sustancialmente similar a al menos una porción del ácido
nucleico diana. El ácido nucleico diana es o bien un ácido nucleico
normalmente presente en la célula o tejido fijados, o de forma
alternativa que no está presente normalmente en la célula o tejido y
está asociado a un estado anormal o patológico. Cada molécula del
complejo de la sonda preferentemente está formada por un fragmento
de ADN o ARN con un tamaño que varía entre aproximadamente
10-50 nucleótidos.
La cantidad del complejo de la sonda total que
se usa es una cantidad predeterminada que debe superar la cantidad
estimada de la diana disponible que se cree que está en la muestra
(aproximadamente 100:1) para dirigir la reacción de hibridación de
forma eficaz y para promover una velocidad elevada de hibridación
entre la sonda y la diana.
El complejo de la sonda se pone en contacto con
los ácidos nucleicos de la muestra fijada, de forma general
añadiendo una solución de complejo de la sonda a la muestra. Las
condiciones apropiadas para la hibridación son soluciones que
proporcionan el entorno tamponado apropiado. Algunos ejemplos de
tampones de hibridación apropiados son:
1) un tampón que tiene entre aproximadamente 10%
y 50% de formamida, 2 X SSC (pH 7,4), y 1% de NP40; 2) un tampón que
tiene entre aproximadamente de tampón de GuSCN entre 1,5 M y 4
M;
La solución madre de tampón de GuSCN se prepara
a partir de GuSCN 5 M, Tris-HCl 100 mM (pH 7,8),
EDTA 40 mM, 1% de NP40. Este tampón madre se diluye a la molaridad
indicada de GuSCN mediante la adición de agua desionizada para
producir las molaridades de tampón de GuSCN indicadas
anteriormente.
3) un tampón que tiene aproximadamente entre 2 y
6 M de tampón de GuHCl.
La solución madre de tampón de GuHCl se prepara
a partir de GuSCN 8 M, Tris-HCl 200 mM (pH 7,8),
EDTA 40 mM, 1% de NP40. Este tampón madre se diluye a la molaridad
indicada de GuHCl mediante la adición de agua desionizada para
producir las molaridades de tampón de GuHCl indicadas
anteriormente.
La concentración específica de tampón de
hibridación varía en función de la secuencia y longitud del ácido
nucleico del complejo de la sonda. La concentración exacta de tampón
a usar depende del Tm de la sonda, de la secuencia de la sonda, de
la longitud de la sonda, y de la temperatura de hibridación, y puede
ser determinada por una persona de experiencia en la técnica a
través una experimentación únicamente rutinaria.
Debe entenderse que el uso de formamida en el
líquido de hibridación permite realizar la hibridación a una
temperatura mucho menor que los protocolos de hibridación
habituales. La hibridación de un complejo de la sonda a la diana de
forma específica (y no a las células huésped) en un líquido de
hibridación acuoso como por ejemplo cloruro sódico de forma general
necesitaría una temperatura de 60-65ºC. La misma
hibridación realizada a 42ºC en el líquido de hibridación 1)
anterior, conferiría especificidad.
Debe entenderse que el uso de GuSCN también
permite realizar la hibridación a una temperatura mucho menor que
los protocolos de hibridación estándar. Por ejemplo, en un
procedimiento normal, la hibridación de la sonda a la diana de
forma específica (y no a las células huésped) en líquido de
hibridación acuoso como por ejemplo cloruro sódico requeriría una
temperatura de aproximadamente 60-65ºC. Sin embargo,
la hibridación realizada en el tampón de hibridación de GuSCN o
GuHCl anteriores, a 37ºC conferirá especificidad de hibridación.
Cuando se ha completado la hibridación, la sonda
no hibridada se elimina de la muestra por enjuague, de forma
general aplicando una serie de lavados con un tampón de lavado. Está
dentro de los medios de los expertos en la técnica determinar los
tampones de lavado apropiados. Uno de dichos tampones de lavado es
cloruro sódico 0,3 M, citrato sódico 0,03 M y 0,5% de NP40. Otro
tampón de lavado es solución salina tamponada con fosfato (PBS).
Después de enjuagada, la muestra puede teñirse
con azul de Evans. Esta tinción de contraste permite visualizar los
organismos presentes en el interior de las células que contienen las
sondas hibridadas. Esta etapa de tinción se aplica de forma general
cuando se usa una sonda marcada por fluorescencia para detectar los
ácidos nucleicos que son específicos de un patógeno. Aunque útil,
la tinción de contraste con azul de Evans no es necesaria para el
procedimiento anterior.
La sonda se detecta por medios adecuados para el
resto específico que se usa para marcar el complejo de la sonda. El
procedimiento preferido para detectar una sonda marcada de marcada
por fluorescencia, emplea filtros especiales como por ejemplo un
filtro azul (sonda marcada por fluorescencia) y un filtro verde
(para la sonda marcada con rodamina-X o rojo de
Texas). Deberá reconocerse que la hibridación de las sondas
radiomarcadas a las dianas puede detectarse mediante
autorradiografía. Las sondas marcadas con biotina pueden detectarse
mediante sistemas de detección enzimática y dichos sistemas de
detección están disponibles comercialmente.
El procedimiento descrito anteriormente permitió
la detección simultánea de diferentes patógenos en una única
muestra clínica para realizar una reacción con un complejo de la
sonda que está compuesto por una pluralidad de diferentes
secuencias de ácido nucleico, cada una marcada con un resto marcador
diferente. Para la detección simultánea de los oligonucleótidos que
son específicos para los diferentes ácidos nucleicos (de los
diferentes patógenos) habitualmente presentes en un espécimen
clínico pueden diseñarse de forma que los valores de Tm de todas
las secuencias de los complejos de sondas sean muy similares. Cada
oligonucleótido específico se marca después con un resto detectable
diferente (por ejemplo diferentes restos fluorescentes). La
hibridación se realiza con los múltiples componentes del complejo
de la sonda. La muestra hibridada se procesa como se describe
anteriormente y la muestra se observa por medios apropiados para la
detección de los oligonucleótidos con marcaje diferente del
complejo de la sonda (por ejemplo se visualizan usando filtros
apropiados si se usan diferentes restos fluorescentes) para detectar
cual de los patógenos está presente en la muestra.
Las personas de experiencia ordinaria en esta
técnica reconocerán que el novedoso protocolo de hibridación in
situ que se describe en el presente documento es compatible con
todos los procedimientos de detección conocidos anteriormente así
como con el que se describe en el presente documento. El protocolo
de hibridación in situ se ha optimizado para que sean
necesarias menos manipulaciones y por lo tanto pueda realizarse en
un periodo corto. Se espera proporcionar los reactivos en forma de
kit para practicar el protocolo que ha sido optimizado para mayor
simplicidad y para su compatibilidad con una amplia variedad de
procedimientos de detección. También es de esperar que dichos kits
preparados que contienen los reactivos y sondas preparados de forma
específica, podrán aplicarse en los laboratorios clínicos o de
diagnóstico, en los que la capacidad de detectar la presencia (o
ausencia) de ácidos nucleicos específicos servirá para identificar
de forma positiva o negativa los estados patológicos caracterizados
por la presencia de genes específicos.
El actual diagnóstico de muchas patologías
celulares depende de evaluaciones microscópicas, parámetros de
morfología celular, características de tinción y de la presencia (o
ausencia) de ciertos antígenos. Muchos de estos procedimientos de
diagnóstico no son totalmente exactos ni suficientemente sensibles.
La hibridación in situ usando el protocolo descrito
anteriormente y las sondas específicas de patógeno permitirán una
identificación más fácil y más exacta de los patógenos en las
muestras.
La presente invención proporciona un protocolo
simple de hibridación in situ que supone un mejor
procesamiento de las muestras, mejor hibridación y características
de detección así como conservación morfológica mejorada de las
muestras frente a los protocolos descritos anteriormente. Las
mejoras incluyen:
1) Maximizar la sensibilidad del ensayo
aumentando la eficacia de hibridación y detección de la "señal"
específica y disminuyendo el "ruido" no específico.
2) Maximizar la conservación de las secuencias
de ácido nucleico diana en la muestra de células o tejidos.
3) Maximizar la conservación de otras
características bioquímicas y morfológicas de la muestra de células
o tejidos.
4) Minimizar tanto el tiempo total como las
etapas necesarias para el protocolo.
\vskip1.000000\baselineskip
Algunas características y ventajas específicas
del procedimiento descrito que lo diferencian de la técnica
anterior son las siguientes: el protocolo de fijación es simple.
Elimina varias etapas previas a la hibridación de muestras de
células o tejidos sin ningún efecto adverso. Las siguientes etapas
que se usan de forma general en la técnica se han eliminado o
mejorado: se ha eliminado la incubación con proteasas. Se ha
eliminado la prehibridación. Se ha eliminado la incubación en
anhídrido acético. Este procedimiento permite tiempos de
hibridación menores y una reducción de los enjuagues posteriores a
la hibridación de varias horas a unos pocos minutos a temperatura
ambiente. Este procedimiento permite usar las sondas no
radiomarcadas, que tienen una vida útil en depósito mucho mayor y
no requieren un espacio de almacenamiento especial. Puede emplearse
o bien un sistema de detección directo usando microscopia en campo
oscuro, o pueden añadirse unas pocas etapas simples para la
detección por microscopia
óptica.
óptica.
Un uso preferido del procedimiento anterior es
en la detección de sangre infectada pro Babesia microti. Un
experto en la técnica entenderá y apreciará que la novedosa
metodología es aplicable igualmente a una amplia variedad de otros
sistemas, células, cultivos de tejidos y tejidos para la hibridación
de ácidos nucleicos específicos de interés con conservación
concomitante de la integridad y morfología celulares.
Preferentemente se usa una sonda de
oligonucleótidos compuesta por una secuencia de ADN que de forma
específica se hibrida a la subunidad pequeña del ARN ribosómico de
B. microti en la detección de la presencia de B.
microti en las células. Un complejo de la sonda adecuado es:
\vskip1.000000\baselineskip
| 5'-Fluoresceína-GCCACGCGAAAACGCGCCTCGA-Fluoresceína-3' | (SEC. ID. N.º: 1) |
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, este complejo de la sonda se
pone en contacto con los ácidos nucleicos de la muestra fijada en un
tampón de hibridación de GuSCN 2,5 M, Tris 50 mM (pH 7,8), EDTA 20
mM y 1% de NP40 a 37ºC. En una realización alternativa, este
complejo de la sonda se pone en contacto con los ácidos nucleicos de
la muestra fijada en un tampón de hibridación de 50% de formamida, 2
X SSC (pH 7,4), EDTA 20 mM, 1% de NP40 a 42ºC.
\newpage
Otras secuencias de oligonucleótidos adecuadas
para usar en complejos de sondas alternativos para la detección de
especies de Babesia son:
| B5: | 5'-GCCACGCGAAAACGCGCC-3' | (SEC. ID. N.º: 2) |
| B6: | 5'-AATAAACGCCACGCGAAAAC-3' | (SEC. ID. N.º: 3) |
| B7: | 5'-GCCACGCGAAAACGCGCCTCGAG-3' | (SEC. ID. N.º: 4) |
| B8-1: | 5'-AATAAACGCAGCCAAGAC-3' | (SEC. ID. N.º: 5) |
| B8-2: | 5'-AATAAACGCAGCCAAGACAG-3' | (SEC. ID. N.º: 6) |
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias B5, B6, B7, y sus complementos
son adecuadas para la detección de B. microti.
B8-1, B8-2, y sus complementos, son
adecuadas para la detección de B. WA-l. Estas
y otras secuencias de oligonucleótidos que pueden usarse en la
detección específica de un fragmento de ácido nucleico diana en un
espécimen se recogen en la solicitud de patente de Estados Unidos
presentada de forma concurrente con la presente descripción,
titulada "Procedimientos mejorados para detectar un fragmento de
ácido nucleico diana".
Para la detección de los patógenos de
Babesia se ha elegido la secuencia de ARN ribosómico debido a
la gran abundancia de ARNr en las células de B. microti
(1.000-10.000 copias). Preferentemente, el
oligonucleótido del complejo de la sonda es un ADN con una
secuencia complementaria al ARNr de B. microti. El
oligonucleótido es preferentemente está marcado en los extremos 3'
y 5' con fluoresceína. Se reconocerá que también puede usarse una
sonda oligonucleótidica de ARN.
Como se ha descrito anteriormente, la cantidad
de la sonda total es una cantidad predeterminada que debe superar
la cantidad estimada del ARNr disponible que se cree que está en la
muestra (aproximadamente 100:1) para dirigir la reacción de
hibridación de forma eficaz y para promover una velocidad elevada de
hibridación entre la sonda y la diana. En términos cuantitativos,
esto significa que es necesario usar una sonda compuesta por un
oligonucleótido de 30 nucleótidos de longitud en concentraciones
que varían de 1-2 \mug/ml para producir una señal
fiable por encima del ruido de fondo.
Debe entenderse que el uso de GuSCN también
permite realizar la hibridación a una temperatura mucho menor que
los protocolos de hibridación estándar. La hibridación de la sonda
especificada a la diana específicamente (y no a las células
huésped) en un líquido de hibridación acuoso como por ejemplo
cloruro sódico necesitaría una temperatura de
60-65ºC. Sin embargo, la hibridación realizada en el
tampón de hibridación de GuSCN o GuHCl anteriores, a 37ºC asegura
especificidad.
Una de las ventajas del procedimiento de
hibridación in situ es que la muestra está formada por un
número relativamente pequeño de células y puede procesarse un gran
número de muestras idénticas en un periodo de tiempo corto. El
exclusivo procedimiento de hibridación in situ que se
describe es muy simple. Los procedimientos de la presente invención
también pueden aplicarse a cualquier tipo muestra, entre otros, sin
limitación, cortes de tejido incluidos en parafina, muestras fijadas
en acetona.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis mediante hibridación fluorescente
in situ (FISH) de la presente invención se comparó con el
procedimiento de aislamiento en dos etapas y detección por PCR y
análisis de inmunofluorescencia indirecta (IFA) en la detección del
patógeno B. microti. El ensayo por FISH se diseñó para
detectar ARN ribosómico específico de B. microti en un
frotis de sangre entera. El aislamiento y el ensayo por PCR se usó
para detectar ADN específico de B. microti de sangre entera,
usando cebadores específicos de B. microti. Los IFA para la
detección de los anticuerpos IgG e IgM contra B. microti se
realizaron en suero de todos los pacientes de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante.
Las pruebas se realizaron en un total de 221
muestras de sangre entera de pacientes con presunta Babesiosis. El
resultado de un ensayo por FISH se consideraba positivo si se
detectaba en el glóbulo rojo o bien la forma de trofozoíto (anillo)
de B. microti o la forma de merozoíto (espora) de B.
microti, o ambas formas. Las muestras se consideraban positivas
para IFA si las valoraciones de anticuerpos contra B. microti
superaban 1:80.
Los resultados de cada prueba se presentan en la
Tabla 1. De las 221 muestras analizadas mediante IFA, 38 muestras
se consideraron positivas por IFA (valoraciones de 1:80 o
superiores) y 183 muestras se consideraron negativas. Como se
muestra en la Tabla 1, de las 38 muestras que se determinó que eran
positivas por IFA, 13 también se determinó que eran positivas por
FISH. De estas 13 muestras, 11 también se determinó que eran
positivas mediante el análisis por PCR. Además, hubo seis muestras
que dieron negativo por FISH pero dieron positivo en el análisis
por PCR. La sensibilidad del ensayo de FISH fue del 34% frente a
IFA. La sensibilidad del ensayo por PCR fue de 45%. De las 183
muestras que dieron negativo por IFA, se determinó que 60 muestras
eran positivas por FISH. De estas 60, 45 también se determinó que
eran positivas mediante el análisis por PCR. Además, 26 muestras que
dieron negativo por FISH dieron positivo en el análisis por PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La discrepancia entre los resultados por IFA y
los resultados por FISH no es sorprendente. El diagnóstico basado
en la respuesta de los anticuerpos requiere la seroconversión de los
pacientes infectados para la producción de anticuerpos contra B.
microti. En el pico de la Babesiosis, semanas después de la
picadura inicial, un paciente con fiebre puede no tener
anticuerpos. El ensayo por FISH de B. microti detecta el ARNr
del parásito y al mismo tiempo es independiente de la respuesta
inmunitaria del huésped. Por lo tanto, puede detectar una infección
activa. Eso explica porqué 45 muestras positivas para B.
microti por FISH y PCR dieron negativo por IFA. Además, hubo 15
muestras positivas por FISH pero negativas por PCR. Es posible que
estas muestras fueran negativas por PCR debido a la presencia de
inhibidores o debido a la degradación del ADN durante el
procesamiento. También es posible que el procedimiento de detección
por FISH produzca resultados positivos falsos. Dado que estas
muestras dieron negativo también por IFA, los presentes inventores
consideran que estas 15 muestras pueden ser positivos falsos.
Asumiendo que estas 15 muestras fueran "negativos verdaderos",
el ensayo por FISH todavía tiene una especificidad del 93%.
Las pruebas basadas en anticuerpos policlonales
no son muy específicas. En un estudio anterior de 45 pacientes
positivos por IFA, 17 no presentaban ADN específico detectable de
B. microti por PCR (Krause et al., J. Clin Microbiol.
34: 2014-2016 (1996)).
Además, los anticuerpos a menudo persisten
después de que el parásito haya desaparecido. El ensayo FISH es un
ensayo muy específico, no amplificado que detecta ARNr específico de
B. microti directamente en frotis de sangre entera. Por lo
tanto, no es sorprendente que 26/38 fueran positivos por IFA pero
negativos por FISH.
La discrepancia entre los resultados por FISH y
los resultados por PCR tampoco es sorprendente. El ensayo FISH es un
ensayo no amplificado que detecta ARNr de B. microti en los
glóbulos rojos. La PCR para B. microti es un ensayo
amplificado que detecta cantidades diminutas de ADN del parásito y
al mismo tiempo es independiente de la respuesta inmunitaria del
huésped. Además, la PCR no depende de la viabilidad del organismo.
Por lo tanto, la PCR es más sensible que el FISH. Esto explicaría la
razón por la que hubo 32 muestras positivas por PCR pero negativas
por FISH. Estas incluían seis muestras positivas por IFA y 26
muestras negativas por IFA.
Basándose en los datos presentados
anteriormente, 89 muestras (40%) se consideraron positivos
verdaderos asumiendo la especificidad del ensayo PCR como del 100% y
la especificidad del ensayo FISH como del 93%. El ensayo FISH
controla la infección activa, y tienen una sensibilidad del 67%
frente a la PCR. Además, los datos demuestran claramente que FISH es
más sensible y específico que IFA. Estos resultados indican que la
técnica FISH de la presente invención es muy simple y fiable.
\newpage
Se ha analizado una variedad de especímenes con
diferentes patógenos: frotis de sangre entera, cultivos puros de
intestinos de garrapatas infectadas y cultivos tisulares mediante el
ensayo FISH para determinar la aplicabilidad general de esta
metodología. En todos los especímenes analizados, el análisis FISH
proporcionó unos resultados exactos y claros que se confirmaron
mediante otros ensayos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon frotis de sangre finos y gruesos a
partir de sangre fresca tratada con EDTA mediante una técnica
estándar sobre portas de vidrio. Los frotis se secaron al aire y se
almacenaron a temperatura ambiente hasta el día del experimento. Los
frotis secados al aire se trataron mediante una mezcla de metanol y
ácido acético (95:5) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se
eliminó el exceso de solución, y los portas se secaron al aire.
\vskip1.000000\baselineskip
La hibridación se realizó o bien (1) en 50% de
formamida, 2 x SSC, pH 7,4, 1% de NP40, y 1-2
\mug/ml de la sonda de B. microti, o (2) GuSCN 2,5 M, Tris
50 mM, EDTA 20 mM, 1% de NP40, pH 7,8, y 1-2
\mug/ml de la sonda de B. microti.
Se aplicaron 25 \muI del líquido de
hibridación (1) por porta. Después el porta se cubrió con un cubre y
se incubó en una cámara húmeda a 42ºC durante 30 minutos.
(Observación: Si se aplicaban 25 \muI de líquido de hibridación
(2) por porta, la hibridación se realizaba a 37ºC durante 30
minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizó una sonda oligonucleotídica de ADN
complementaria a B. microti, marcada a 3' y 5' con
fluoresceína mediante el procedimiento habitual. La secuencia de
ácido nucleico de la sonda se incluye a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
| 5'-fluoresceína-GCCACGCGAAAACGCGCCTCGA-fluoresceína-3' | (SEC. ID. N.º: 1) |
\vskip1.000000\baselineskip
Después de completar la hibridación, se
retiraron los cubres y los portas se lavaron tres veces
individualmente con un tampón de lavado, a pH 7,4, (cloruro sódico
de 0,3 M, citrato sódico 0,03 M, 0,5% de NP40) a temperatura
ambiente, durante 2 minutos cada uno. Después del tercer lavado, los
portas se enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato, a pH
7,2 (PSS) durante 2 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, los
portas lavados se introdujeron en un recipiente Coplin que contenía
PBS y azul de Evans (30 ml PBS + 3 gotas de 0,1% de azul de Evans
en PBS). Los portas se secaron y se añadieron 2 gotas de fijador por
porta y se cubrieron con un cubre. Los portas se guardaron durante
aproximadamente 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente y
después se observaron en campo oscuro a 40 aumentos.
\vskip1.000000\baselineskip
La sonda marcada por fluorescencia se detectó
por microscopia usando filtros especiales como por ejemplo un filtro
azul (sonda marcada por fluorescencia) y un filtro verde (para la
sonda marcada con rodamina-X o rojo de Texas).
\vskip1.000000\baselineskip
Se trataron muestras de sangre entera tratadas
con EDTA con tampón de GuSCN 5 M, a pH 7,4,
(Tris-HCl 100 mM, a pH 7,8, EDTA 40 mM, GuSCN 5 M y
1% de Sarkosyl). La concentración de GuSCN se ajustó a 2,5 M, con
agua o TE (pH 7,8). Los tubos con muestras se agitaron en un
vórtice durante 30 segundos y después se calentaron a 85ºC durante
10 minutos para desnaturalizar el ADN. La temperatura se redujo a
65ºC y las muestras se dejaron equilibrar durante 5 minutos. Se
añadieron 40 \mul de sonda B2 de ADN de B. microti (1
\mug/ml), marcada con biotina en el extremo 5', a cada muestra.
La muestra más la sonda se dejaron a 65ºC durante otros 5 minutos.
La muestra después se incubó a 37ºC durante más de tres horas para
permitir la hibridación de las sondas a los ácidos nucleicos
complementarios específicos de B. microti. La sonda y los
ácidos nucleicos hibridados después se capturaron sobre partículas
paramagnéticas derivadas con estreptavidina (10 \mug/ml a 100
\mug/ml) diluyendo la concentración de GuSCN a GuSCN 1,25 M. Las
partículas unidas a la sonda se lavaron una vez con tampón de
lavado de GuSCN (tampón de GuSCN 1,25 M, 0,1% de BSA), seguido de 2
lavados con 0,1 x tampón de SSCN (NaCl 0,015 M, citrato sódico
0,0015 M, 0,1% de BSA, 0,1% de NP40, a pH 7,4), y después una vez
con 0,1 X tampón de SSC (NaCl 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M, a pH
7,4). Después de las etapas de lavado, los ácidos nucleicos
hibridados a la sonda se liberaron añadiendo 100 \mul de agua
desionizada.
Se sometieron a amplificación por PCR 10 \mul
de la solución que contenía los ácidos nucleicos liberados usando
procedimientos estándar. Se observó que el límite de detección era
de un organismo por muestra analizada.
\vskip1.000000\baselineskip
La sonda de selección que se usó era un
oligonucleótido de ADN marcado en el extremo 5' con biotina, con la
secuencia de nucleótidos
5'-ATAGGTCAGAAACTTGAATGATACATCGCCGGC-3'
(SEC. ID. N.º: 7).
Los cebadores de la PCR eran oligonucleótidos de
ADN con la secuencia
5'-GTTATAGTTTATTTGATGTTCGTT-3' (SEC.
ID. N.º: 8) y
5'-AATAAACGCCACGCGAAAAC-3' (SEC. ID.
N.º: 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron ensayos por inmunofluorescencia
para la detección de anticuerpos IgG y IgM contra B. microti
en suero de todos los pacientes, de acuerdo con las recomendaciones
del fabricante (MRL Diagnostics, CA).
Claims (10)
1. Un procedimiento para detectar un fragmento
de ácido nucleico diana directamente en un espécimen obtenido de un
paciente por hibridación in situ que comprende las
etapas:
a) depositar una muestra del espécimen sobre un
porta;
b) fijar la muestra al porta con un fijador que
comprende metanol y ácido acético en una proporción de 99:1 a
80:20.
c) poner en contacto los ácidos nucleicos de la
muestra fijada con una sonda de ácido nucleico marcada específica
para el fragmento de ácido nucleico diana, en condiciones apropiadas
para la hibridación;
d) eliminar por enjuague la sonda de ácido
nucleico marcada no hibridada de la muestra;
e) teñir la muestra enjuagada con azul de Evans;
y
f) detectar visualmente el complejo de la sonda
hibridado mediante microscopia, siendo la presencia del complejo de
la sonda una indicación de la presencia del fragmento de ácido
nucleico diana.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el fijador es metanol y ácido acético en una proporción de
95: 5 a 99: 1.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que
(a) la sonda de ácido nucleico marcada se pone
en contacto con los ácidos nucleicos de la muestra fijada en un
tampón que está formado esencialmente entre 10% y 50% de formamida,
2 X SSC (pH 7,4), 1% de NP40; o
(b) la sonda de ácido nucleico marcada se pone
en contacto con los ácidos nucleicos de la muestra fijada en un
tampón que está formado esencialmente por tampón de GuSCN de 1,5 M a
4 M; o
(c) la sonda de ácido nucleico marcada se pone
en contacto con los ácidos nucleicos de la muestra fijada en un
tampón que está formado esencialmente por tampón de GuHCl de 2 M a
6 M; o
(d) la sonda de ácido nucleico marcada comprende
un oligonucleótido ligado a un marcador fluorescente.
\vskip1.000000\baselineskip
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la sonda de ácido nucleico marcada comprende un ácido
nucleico ligado a biotina.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el ácido nucleico diana es específico para un patógeno con el
que presuntamente está infectado el paciente, y opcionalmente, en el
que el patógeno es B. microti y el complejo de la sonda es
5'-Fluoresceína-GCCACGCGAAAACGCGCCTCGA-Fluoresceína-3'.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, en
el que
(a) la sonda de ácido nucleico marcada se pone
en contacto con los ácidos nucleicos de la muestra fijada en un
tampón que está formado esencialmente por GuSCN 2,5 M, Tris 50 mM
(pH 7,8), EDTA 20 mM y 1% de NP40 a 37ºC, o
(b) la sonda de ácido nucleico marcada se pone
en contacto con los ácidos nucleicos de la muestra fijada en un
tampón que está formado esencialmente por 50% de formamida, 2 X SSC
(pH 7,4), EDTA 20 mM, 1% de NP40 a 42ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que la sonda de ácido nucleico marcada comprende una pluralidad
de diferentes secuencias de ácido nucleico, cada una marcada con un
marcador fluorescente diferente.
8. El procedimiento de la reivindicación 5, en
el que el patógeno es Babesia y el complejo de la sonda
comprende uno o más de los siguientes oligonucleótidos o sus
complementos:
\vskip1.000000\baselineskip
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que
(a) el patógeno es B. microti y la sonda
de ácido nucleico marcada comprende uno o más de los siguientes
oligonucleótidos o sus complementos:
(b) el patógeno es B.
WA-1 y el complejo de la sonda comprende
5'-AATAAACGCAGCCAAGAC-3' (SEC. ID.
N.º: 5).
\vskip1.000000\baselineskip
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el espécimen es cualquiera de sangre entera, suero, plasma,
esputo, orina, líquido cefalorraquídeo, tejido y leche materna; o se
obtiene de una garrapata.
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2010
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