ES2345032T3

ES2345032T3 - Composicion que contiene lipasa no fungica, reticulada y metodos de uso.

Info

Publication number: ES2345032T3
Application number: ES01922251T
Authority: ES
Inventors: Alex Margolin; Bhami Shenoy
Original assignee: Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics Inc; Cystic Fibrosis Foundation
Current assignee: Cystic Fibrosis Foundation
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2010-09-14
Anticipated expiration: 2021-02-23
Also published as: US20100040592A1; US20030017144A1; JP2012040028A; US20060128587A1; JP5217050B2; PT1261368E; WO2001062280A3; IL151313A0; WO2001062280A2; JP2003524421A; DK1261368T3; ATE465748T1; AU2001249072B2; EP1261368A2; EP1261368B1; US20010046493A1; DE60141950D1

Abstract

Una composición que comprende: (a)un cristal de lipasa no fúngica reticulado con un agente reticulante multifuncional; (b)una proteasa; y (c)una amilasa, en forma amorfa en la que el cristal de lipasa es activo a un pH de 2,0 a 9,0.

Description

Composición que contiene lipasa no fúngica, reticulada y métodos de uso.

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a composiciones que contienen enzimas y, más concretamente, a composiciones que contienen lipasa para el tratamiento de trastornos caracterizados por una baja secreción de lipasas.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades metabólicas o gastrointestinales a menudo son el resultado de la ausencia de una enzima eficaz cuya función es necesaria en un punto determinado de la vía bioquímica. Por ejemplo, puede determinarse que unos niveles inapropiados de lipasa conducen a una diversidad de trastornos digestivos, incluyendo la malabsorción de grasas. La malabsorción de grasas se desarrolla a menudo en pacientes que padecen fibrosis quística, pancreatitis crónica y otras enfermedades del páncreas, cuando la secreción de lipasa pancreática disminuye por debajo del 5-10% de los niveles normales. Las consecuencias de la malabsorción de grasas que habitualmente se observan incluyen molestias abdominales, esteatorrea (deposiciones grasas), deficiencia en ácidos grasos esenciales (EFA), deficiencia en vitaminas liposolubles (por ejemplo, A, D, E y K), y una incapacidad generalizada para desarrollarse.

Un método reconocido para tratar enfermedades o trastornos asociados con una insuficiencia en lipasa es la terapia de sustitución oral. Este régimen de tratamiento incluye la administración oral de enzimas lipasas al individuo afectado para aumentar la digestión y la posterior absorción de los nutrientes. Las preparaciones disponibles en el mercado de lipasa pueden no tratar completamente los síntomas asociados con la insuficiencia en lipasa. Por ejemplo, la lipasa porciona disponible en el mercado puede no eliminar la esteatorrea pancreática provocada por la pancreatitis crónica o por la fibrosis quística. Los factores responsables de las dificultades en el tratamiento de la esteatorrea pueden incluir la destrucción de la lipasa sustituida por el jugo gástrico, la destrucción de la lipasa sustituida por las proteasas intraluminales, y el vaciado gástrico asincrónico del suplemento enzimático y los nutrientes de los alimentos.

Las lipasas que se emplean habitualmente en la terapia de sustitución son más activas a un pH alcalino, y muestran una pérdida significativa de actividad cuando el pH es menor que 5. Se ha indicado que la lipasa pancreática, por ejemplo, se desnaturaliza de forma irreversible a pH 4 o menor. Debido a esta inestabilidad, las terapias de sustitución basadas en lipasas pueden incluir administraciones repetidas de lipasas y/o la administración de altas dosis de las enzimas a los individuos afectados. Unas altas dosis de enzimas pueden estar asociadas con unos efectos secundarios indeseables.

Sumario de la invención

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de composiciones que incluyen lipasas en una forma cristalina reticulada que es muy resistente a la degradación proteolítica y ácida. Debido a que la lipasa cristalina reticulada muestra una alta estabilidad frente a proteasas y a ácidos, la composición puede administrarse en dosis bajas a pacientes que padecen trastornos gastrointestinales. En un aspecto, la invención proporciona una composición que incluye un cristal de lipasa reticulado, una proteasa, y una amilasa en forma amorfa. El cristal de lipasa en la composición se reticula con un agente reticulante multifuncional y es preferiblemente estable a pH 1-9. La enzima es activa a un pH de aproximadamente 2,0 a 9,0. Más preferiblemente, la enzima es activa a pH 4-7.

Una composición preferida incluye un cristal de enzima reticulado de Burkholderia cepacia ("BC"), una proteasa fúngica o vegetal, y una amilasa fúngica o bacteriana. Preferiblemente, la proteasa es bromelaína.

Preferiblemente, el cristal de lipasa es activo tras la exposición del cristal de lipasa durante periodos extensos de tiempo a proteasas, condiciones ácidas, temperaturas elevadas, o una combinación de éstas.

La invención también proporciona un método para tratar o prevenir la malabsorción de grasas en un mamífero, por ejemplo, un ser humano, que padece, o está en riesgo de padecer, un trastorno caracterizado por una baja actividad lipasa. El método incluye administrar al sujeto una composición que incluye un cristal reticulado de una lipasa, una proteasa y una amilasa, en una cantidad suficiente para prevenir o inhibir una baja actividad lipasa, o para reducir o prevenir los síntomas asociados con una baja actividad lipasa.

Las lipasas muy estables descritas en la presente son estables tras su administración a un sujeto. Por tanto, pueden administrarse sin preparaciones de microesferas con revestimiento entérico. Las lipasas descritas en la presente también pueden administrarse en dosis más bajas a un sujeto.

A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entienden habitualmente los expertos en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o el ensayo de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente solicitud, incluyendo las definiciones, dominará. Además, los materiales, los métodos y los ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un histograma que muestra el efecto de diversas dosis de complejo de enzima reticulada de Burkholderia cepacia ("CLEC-BC") sobre el coeficiente medio de la absorción de grasas ("CFA").

La Figura 2 es un histograma que muestra el efecto de diversas dosis de CLEC-BC sobre la grasa media en las deposiciones.

La Figura 3 es un histograma que muestra el efecto de diversas dosis de CLEC-BC sobre el coeficiente medio de la absorción de grasas ("CPA").

La Figura 4 es un histograma que muestra el efecto de diversas dosis de una partícula que contiene CLEC-BC, amilasa, y una proteasa, sobre el coeficiente medio de la absorción de grasas ("CFA").

La Figura 5 es un histograma que muestra el efecto de diversas dosis de una partícula que contiene CLEC-BC, una amilasa y una proteasa, sobre la grasa media en las deposiciones.

La Figura 6 es un histograma que muestra el efecto de diversas dosis de una composición que contiene CLEC-BC, una amilasa y una proteasa, sobre el coeficiente medio de la absorción de proteínas ("CPA").

La Figura 7 es una gráfica que muestra el efecto de diversas lipasas terapéuticas sobre el CPA medio.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona composiciones que incluyen cristales de lipasa reticulados que son inesperadamente activos tras su exposición a condiciones rigurosas asociadas con el tracto gastrointestinal superior. Estas condiciones incluyen el entorno ácido (es decir, el pH bajo) del estómago y los altos niveles de proteasas presentes en el tracto gastrointestinal. En realizaciones preferidas, las composiciones se proporcionan en composiciones duraderas que pasan a través del entorno gástrico muy ácido del estómago y permiten el transporte de las enzimas en la composición al intestino de un sujeto.

Los componentes de proteasas pueden proporcionarse en forma cristalina o amorfa, no cristalina. Estas últimas enzimas degradan los carbohidratos y las proteínas presentes en las regiones intestinales.

Debido a la mayor estabilidad de los cristales de lipasa reticulados, las composiciones farmacéuticas de la invención tienen unas mayores actividades específicas en el tracto gastrointestinal. Como resultado, pueden administrarse en menores cantidades por dosis, y pueden administrarse menos veces a lo largo del régimen de tratamiento, a menos dosis, y en menos administraciones.

Composiciones que contienen cristales de lipasa reticulados estabilizados

La invención proporciona una composición que incluye un cristal de lipasa no fúngico, una proteasa y una amilasa en forma amorfa. El cristal de lipasa está presente en la composición como un cristal reticulado.

En general, puede utilizarse cualquier lipasa en la composición, con la condición de que pueda proporcionarse en una forma cristalina reticulada que resista la degradación proteolítica y que sea estable a pH bajo. En diversas realizaciones, la lipasa se proporciona como un cristal reticulado que es estable a un pH menor que 7, 6, 5, 4,5, 4, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5 o menor. La lipasa puede aislarse a partir de una célula procariota o eucariota. Preferiblemente, la lipasa procede un organismo no fúngico. Una fuente preferida de la lipasa es una bacteria de Pseudomonas. Si se desea, la lipasa puede aislarse a partir de una célula que expresa una forma recombinante de la lipasa.

Los cristales de lipasa se hacen crecer mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la precipitación controlada de las proteínas fuera de una disolución acuosa, o una disolución acuosa que contenga disolventes orgánicos, como se describe, por ejemplo, en la patente de EEUU nº 5.618.710. Por ejemplo, los cristales de lipasa pueden producirse combinando la proteína de lipasa que se va a cristalizar con un disolvente acuoso apropiado o con un disolvente acuoso que contenga agentes precipitantes apropiados, como sales o agentes orgánicos. El disolvente se combina con la lipasa a una temperatura determinada de modo experimental como apropiada para la inducción de la cristalización y aceptable para el mantenimiento de la estabilidad y la actividad de la proteína. El disolvente puede incluir opcionalmente cosolutos, como cationes divalentes, cofactores o caotropos, así como especies tamponantes para controlar el pH. La necesidad y las concentraciones de cosolutos se determinan de modo experimental para facilitar la cristalización. En un proceso a escala industrial, la precipitación controlada que conduce a la cristalización se puede realizar del mejor modo mediante la sencilla combinación de proteínas, precipitantes, cosolutos y, opcionalmente, tampones en un proceso discontinuo. También pueden adaptarse métodos de cristalización de laboratorio alternativos, como diálisis o difusión de vapor. Por ejemplo, McPherson (Methods Enzymol., 114:112 (1985)), y Gilliland (J. Crystal Growth, 90:51-59 (1988)) incluyen una lista exhaustiva de condiciones adecuadas en artículos de la bibliografía sobre cristalización. A veces una incompatibilidad entre el reactivo reticulante y el medio de cristalización puede requerir cambiar los cristales a un sistema disolvente más
adecuado.

Cuando los cristales se han hecho crecer en un medio adecuado pueden reticularse. La reticulación produce la estabilización del látice cristalino introduciendo enlaces covalentes entre las moléculas enzimáticas constituyentes en el cristal. Esto hace posible trasladar la enzima a un medio de reacción alternativo que, de otra forma, podría ser incompatible con la existencia del látice cristalino, o incluso con la existencia de la proteína intacta sin desnaturalizar. Las interacciones reticulantes evitan que las moléculas enzimáticas constituyentes en el cristal vuelvan a entrar en disolución, insolubilizando o inmovilizando con eficacia las moléculas enzimáticas en estructuras microcristalinas.

Los cristales macroscópicos, inmovilizados e insolubilizados pueden separarse con facilidad, por ejemplo, de la materia prima que contiene el producto o del sustrato sin reaccionar mediante procedimientos sencillos conocidos en la técnica, por ejemplo filtración y/o decantación.

La reticulación puede lograrse mediante una amplia variedad de reactivos, por ejemplo glutaraldehído. La reticulación con glutaraldehído forma enlaces covalentes fuertes principalmente entre restos aminoácidos lisina dentro y entre las moléculas enzimáticas en el látice cristalino que constituye el cristal. El agente reticulante es un reactivo reticulante multifuncional. Los agentes reticulantes se describen, por ejemplo, en la edición de 1999 del catálogo de Pierce Chemical Company.

Los ejemplos de agentes reticulantes adecuados incluyen glutaraldehído, succinaldehído, octandialdehído y glioxal. Otros agentes reticulantes multifuncionales incluyen halotriazinas, por ejemplo cloruro cianúrico; halopirimidinas, por ejemplo 2,4,6-tricloro/bromopirimidina; anhídridos o haluros de ácidos mono- o dicarboxílicos alifáticos o aromáticos, por ejemplo anhídrido maleico, cloruro de (met)acriloílo, cloruro de cloroacetilo; compuestos de N-metilol, por ejemplo N-metilolcloroacetamida; diisocianatos o diisotiocianatos, por ejemplo fenilen-1,4-diisocianato y azidirinas. Otros agentes reticulantes incluyen epóxidos, como por ejemplo diepóxidos, triepóxidos y tetraepóxidos. Estos agentes reticulantes multifuncionales también pueden utilizarse, al mismo tiempo (en paralelo) o en secuencia, con agentes reticulantes reversibles, como HCl.3,3'-ditiobispropionimidato de dimetilo (DTBP, Pierce) y ditiobis(succinimidilpropionato) (DSP, Pierce).

Las formulaciones y las composiciones que incluyen cristales según esta invención pueden reticularse para lograr más estabilidad. Esto permite el uso de dichos cristales, formulaciones y composiciones de cristales en zonas de pH extremos, como el tracto gastrointestinal de seres humanos y animales. Por ejemplo, los cristales de lipasa pueden reticularse utilizando uno de una diversidad de reticulantes incluyendo, pero sin limitarse a HCl.3,3'-ditiobispropionimidato de dimetilo (DTBP), ditiobis(succinimidilpropionato) (DSP), bis-maleimidohexano (BMH), bis[sulfosuccinimidil]suberato (BS), 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (DFDNB), 2HCl.dimetilsuberimidato (DMS), glutarato de disuccinimidilo (DSG), tartrato de disulfosuccinimidilo (sulfo-DST), clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC), etilenglicol-bis[sulfosuccinimidilsuccinato] (sulfo-EGS), éster de N-[g-maleimidobutiriloxi]succinimida (GMBS), N-hidroxisulfosuccinimidil-4-azidobenzoato (sulfo-HSAB), hexanoato de sulfosuccinimidil-6-[a-metil-a-(2-piridilditio)toluamido] (sulfo-LC-SMPT), disulfuro de bis-[b-(4-azidosalicilamido)etilo] (BASED) y glutaraldehído (GA).

En algunas realizaciones, el cristal de lipasa se proporciona como un cristal en forma de polvo. La forma de polvo puede producirse, por ejemplo, mediante liofilización o secado por pulverización. La liofilización permite separar el agua de la composición, produciendo un cristal que puede conservarse a temperaturas no refrigeradas (ambiente) durante periodos extensos de tiempo, y que puede reconstituirse con facilidad en disolventes acuosos, orgánicos o acuosos-orgánicos mixtos seleccionado sin la formación de suspensiones amorfas y con riesgo mínimo de desnaturalización (Carpenter, et al., Pharm. Res., 14:969 (1997)). La liofilización puede realizarse como se indica en la patente de EEUU nº 5.618.710, o mediante cualquier otro método conocido en la técnica. Por ejemplo, el cristal de proteínas en primer lugar se congela y después se coloca a un vacío elevado en que el agua cristalina se sublima, dejando un cristal de proteínas que contiene sólo las moléculas de agua que están unidas con mucha fuerza.

Debido a que las lipasas reticuladas descritas en la presente son estables frente a proteasas, las preparaciones pueden formularse en agua y proporcionarse como formulaciones en suspensión acuosa, que es un modo preferido de administrar las lipasas, en especial a un sujeto pediátrico.

La actividad catalítica de la lipasa cristalizada puede medirse utilizando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la actividad lipasa puede determinarse de modo espectrofotométrico como se describe en el ejemplo 6 de la patente de EEUU nº 5.618.710. La actividad lipasa puede determinarse controlando la hidrólisis del sustrato acetato de p-nitrofenilo. La ruptura del sustrato se controla mediante un aumento en la absorbancia a 400 nm, con una concentración inicial del sustrato del 0,005% y una concentración enzimática de partida de 1,5 x 10^{-8} M. La enzima lipasa se añade a un volumen de reacción de 5 ml que contiene sustrato en Tris 0,2 M, pH 7,0, a temperatura ambiente. La lipasa cristalina se retira de la mezcla de reacción mediante centrifugación antes de medir la absorbancia.

Como alternativa, la actividad lipasa puede medirse in vitro mediante la hidrólisis del aceite de oliva como se describe en los ejemplos 2-4 de la patente de EEUU 5.614.489.

La actividad lipasa también puede medirse in vivo. Por ejemplo, un volumen pequeño (aproximadamente 3 ml) de aceite de oliva o de aceite de maíz puede marcarse con ^{99}TC-(V)-tiocianato, y la lipasa cristalina puede marcarse con ^{111}In. La grasa marcada se mezcla con un alimento animal sobre el cual se rocía la lipasa cristalina marcada. Se obtienen imágenes centelleográficas del estómago proximal y distal y del intestino delgado hasta que <5% de la actividad permanece en el estómago. Se determinan las curvas de vaciado para cada uno de los isótopos (por ejemplo, el porcentaje de retención en el estómago a lo largo del tiempo) y las cantidades de isótopos que entran en el intestino delgado proximal, medio y distal desde las respectivas regiones de interés.

Preferiblemente, la composición incluye una lipasa cristalina reticulada que tenga una alta actividad específica. Una actividad lipasa de alta actividad específica es, de forma típica, la que muestra una actividad específica frente a la trioleína (aceite de oliva) mayor que 500, 1000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 ó 9000 o más unidades/mg de proteína.

Una lipasa preferida también es estable durante un periodo extenso de tiempo en el entorno riguroso que se encuentra en las regiones gastrointestinales, por ejemplo, las regiones gástrica, duodenal e intestinal. Por ejemplo, la lipasa es preferiblemente estable durante al menos una hora en pH ácido, por ejemplo un entorno en que el pH es menor que 7, 6, 5, 4,5, 4, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5 o menor.

Como alternativa, o además, el cristal de lipasa cristalina reticulado en la composición es termorresistente. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la lipasa cristalina reticulada es diversas realizaciones es estable durante al menos una hora a 30ºC, 35ºC, 37ºC, 40ºC, 42ºC o incluso 45ºC.

Preferiblemente, la composición es estable en un entorno riguroso, por ejemplo, los entornos ácidos o los entornos a alta temperatura, o ambos, durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 12 o más horas.

"Estable" significa que el cristal de lipasa es más activo que la forma soluble de la lipasa para la condición y el tiempo dados. Por tanto, un cristal de lipasa estable conserva un mayor porcentaje de su actividad inicial que la correspondiente forma soluble de la lipasa. En algunas realizaciones, el cristal de lipasa es más activo que la forma cristalina no reticulada de la lipasa. En algunas realizaciones, el cristal de lipasa conserva al menos 50% de su actividad después de su exposición a las condiciones y al tiempo dados. En algunas realizaciones, la lipasa conserva 60%, 65%, 75% 85%, 90% o más de su actividad.

El cristal de lipasa en la composición es activo tras su exposición durante al menos una hora a un entorno que tenga un pH de 1,0 a 4,0. Como alternativa, el cristal de lipasa en la composición es activo tras su exposición durante al menos dos horas a un entorno que tenga un pH de 1,0 a 4,0. Como alternativa, el cristal de lipasa en la composición es activo tras su exposición durante al menos cinco horas a un entorno que tenga un pH de 1,0 a 4,0.

La composición se proporciona con una proteasa y una amilasa. Cualquier proteasa conocida en la técnica puede utilizarse en la composición. Las proteasas preferidas son tripsina, bromelaína, papaína, proteasas fúngicas o una combinación de estas proteasas.

La amilasa puede proceder de cualquier hospedante procariota o eucariota adecuado. Las amilasas preferidas incluyen las de especies de Bacillus o Aspergillus.

Además, la proteasa, la amilasa o ambas pueden proporcionarse en forma cristalina o en forma liofilizada. Aunque la proteasa, la amilasa o ambas pueden proporcionarse en forma liofilizada, en realizaciones preferidas están presentes en formas no cristalinas, es decir, amorfas.

Si se desea pueden estar presentes otros componentes en la composición. Estos componentes pueden incluir, por ejemplo, una enterasa.

Composiciones farmacéuticas que contienen cristales de lipasa reticulados estables frente a ácidos, una proteasa y una amilasa

En la invención se incluye una composición farmacéutica que incluye una lipasa proteolíticamente resistente y estable frente a ácidos, una proteasa y una amilasa. La lipasa se proporciona en forma cristalina reticulada.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por un organismo regulador de gobierno federal o estatal, o listado en la farmacopea de EEUU o en otra farmacopea reconocida de modo en general para su uso en animales y, más en concreto, en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o portador con el que se administra el compuesto terapéutico.

Los excipientes típicos incluyen azúcares y polímeros biocompatibles. Los ejemplos de excipientes se describen en Handbook of Pharmaceutical Excipients, publicado conjuntamente por the American Pharmaceutical Association y the Pharmaceutical Society of Great Britain. Los excipientes representativos incluyen sacarosa, trehalosa, lacitol, gelatina, hidroxipropil-\beta-ciclodextrina, metoxipolietilenglicol y polietilenglicol.

Si la composición se va a proporcionar en forma de cápsula o comprimido, puede incluirse un diluyente. Los diluyentes típicos incluyen, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico, fosfato de calcio tribásico, sulfato de calcio, celulosa microcristalina, celulosa en polvo, dextratos, dextrina, excipiente de dextrosa, fructosa, caolín, lactosa, manitol, sorbitol, almidón, almidón pregelatinizado, sacarosa, azúcar compresible, y azúcar de pastelería. Preferiblemente, la composición farmacéutica se formula para la administración oral.

En algunas realizaciones, la composición de lipasa, proteasa y amilasa están presentes en la composición farmacéutica en asociación con un vehículo polimérico. En una realización, se forma una composición de liberación lenta que contiene un cristal de lipasa reticulado. La formulación de cristales de lipasa reticulados, amilasa liofilizada, proteasa liofilizada y un vehículo polimérico permite producir una cápsula de liberación controlada resistente a ácidos que da como resultado el transporte de las enzimas en cantidades eficaces y a bajas dosis hasta el intestino, por ejemplo el intestino distal, tras la ingestión oral. Además, los cristales de lipasa encapsulados dentro de vehículos poliméricos para formar microesferas pueden secarse mediante liofilización.

Un vehículo polimérico puede incluir, por ejemplo, polímeros utilizados para la encapsulación de cristales de proteínas para el transporte de proteínas, incluyendo el transporte biológico de liberación controlada. Estos polímeros incluyen polímeros biocompatibles y biodegradables. Preferiblemente, el vehículo polimérico es un polímero biodegradable. Los polímeros biodegradables son polímeros que se degradan mediante hidrólisis o solubilización. La degradación puede ser heterogénea, es decir, se produce principalmente en la superficie de las partículas, u homogénea, es decir, la degradación se produce de manera uniforme a través de la matriz polimérica, o una combinación de ambos procesos. El vehículo polimérico puede ser un único tipo de polímero o puede estar compuesto por una mezcla de tipos de polímeros.

Para proteger a la lipasa, la proteasa y la amilasa del entorno riguroso del tracto gastrointestinal, la composición preferiblemente se encapsula dentro de una matriz del vehículo polimérico.

Se producen microesferas cuando los cristales de proteínas se encapsulan en al menos un vehículo polimérico para formar microesferas en virtud de la encapsulación dentro de la matriz del vehículo polimérico, para conservar su estructura terciaria nativa y biológicamente activa. Los cristales pueden encapsularse utilizando diversos polímeros biocompatibles y/o biodegradables que tengan propiedades exclusivas que sean adecuadas para el transporte a diferentes entornos biológicos o para efectuar funciones específicas. La velocidad de disolución y, por tanto, el transporte de la proteína activa viene determinada por la técnica de encapsulación, la composición del polímero, la reticulación del polímero, el espesor del polímero, la solubilidad del polímero, la geometría y el grado cristalino del polímero y, si existe, de la reticulación de los cristales de proteína particulares. El cristal o los cristales pueden encapsularse utilizando una diversidad de vehículos poliméricos que tengan propiedades exclusivas adecuadas para el transporte a entornes diferentes y específicos o para efectuar funciones específicas. La velocidad de disolución de la composición y, por tanto, el transporte de la proteína activa puede modularse variando el tamaño de los cristales, la composición del polímero, la reticulación del polímero, la reticulación del cristal, el espesor del polímero, la hidrofobicidad del polímero, la cristalinidad del polímero o la solubilidad del polímero.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se proporciona como una composición de liberación controlada. Por ejemplo, la composición puede ser aquella en la que al menos 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90% o incluso 95% o más de la composición permanece encapsulada dentro de la matriz tras la exposición del vehículo polimérico a un entorno ácido durante un periodo extenso de tiempo, por ejemplo un entorno ácido que tenga un pH menor que 7, 6, 5, 4,5, 4, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5 o menor, durante al menos una hora. En algunas realizaciones, la composición se mantiene en condiciones ácidas durante 2, 3, 4, 6, 10, 12 ó 24 o más horas. Para la administración oral, la composición también puede ser aquella en la que al menos 50% de la composición permanece encapsulada dentro de la matriz tras la exposición del vehículo polimérico a un entorno que tenga un pH de 1,0 a 3,0 durante al menos una hora.

En diversas realizaciones, la composición farmacéutica se administrará a un sujeto antes, de modo simultáneo o después de la ingestión de alimentos por el sujeto. El sujeto al cual se le va a administrar la composición de modo preprandial, prandial o postprandial puede ser, por ejemplo, un ser humano, un perro, un gato, un ratón, una rata, un caballo, una vaca u otro mamífero.

Usos terapéuticos de las composiciones que contienen cristales de lipasa reticulados estabilizados

La invención también proporciona métodos para tratar o prevenir trastornos gastrointestinales en un mamífero. Según este método, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de lipasa cristalina reticulada, proteasa y amilasa a un sujeto que necesite tratamiento. El sujeto puede ser, por ejemplo, un ser humano, un perro, un gato, un ratón, una rata, un caballo, una vaca u otro mamífero. Preferiblemente, la composición se administra por vía oral, por ejemplo en la hora de la comida. Por ejemplo, la composición puede administrarse justo antes, justo después o en el mismo momento de la comida.

Las composiciones de la invención pueden utilizarse para tratar o prevenir, por ejemplo, la pancreatitis, la insuficiencia pancreática, la malabsorción de grasas, la secreción baja de lipasas, y las complicaciones gastrointestinales asociadas con la fibrosis quística. Los métodos de esta invención también pueden utilizarse para tratar cualquier trastorno caracterizado por cantidad inadecuadas de lipasa o por lipasas ineficaces. Estos trastornos incluyen la esteatorrea, la deficiencia en ácidos grasos esenciales, la incapacidad para desarrollarse y la deficiencia en vitaminas
liposolubles.

La eficacia del método de tratamiento puede evaluarse midiendo y comparando el coeficiente de absorción de grasas (CFA) en individuos sanos con el del sujeto que se está tratando según los métodos de esta invención. Por ejemplo, un mamífero sano tienen un CFA mayor que 90%. Los sujetos que padecen un trastorno gastrointestinal que se caracteriza por deficiencia pancreática, pancreatitis, malabsorción de grasas o baja secreción de lipasas tendrán, de forma típica, un CFA menor que 60%. Preferiblemente, los métodos de la invención se emplean para aumentar el CFA de un sujeto que necesite tratamiento hasta al menos 60%. Más preferiblemente, el CFA se aumenta hasta más del 80%. Lo más preferiblemente, el CFA se aumenta hasta más del 85%.

Un medio alternativo para medir la eficacia del tratamiento de un sujeto según los métodos de esta invención es realizar un ensayo de deposiciones de 72 horas. Por ejemplo, un tratamiento eficaz según la invención disminuye el contenido en grasas de las deposiciones en un sujeto humano adulto hasta menos de 7 gramos diarios.

La invención se ilustrará más a fondo en los siguientes ejemplos no limitantes.

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Ejemplo 1

Ensayo de la farmacopea de EEUU para la actividad lipasa

Se determinó la actividad de la lipasa de Burkholderia cepacia valorando los ácidos grasos liberados del aceite de oliva frente al hidróxido de sodio como se describe en la farmacopea de EEUU (Assay for lipase activity in Pancretin, USP 24, 2000, 1254-1255). Se calculó la actividad lipasa en unidades USP mediante la comparación con la actividad del patrón, utilizando la actividad lipasa mencionada en la etiqueta de USP Pancreatin Lipase RS. Una unidad USP de actividad lipasa es la cantidad de enzima que libera 1,0 \muEq de ácido por minuto a pH 9,0 y 37ºC bajo las condiciones del ensayo para la actividad lipasa.

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Ejemplo 2

Ensayo basado en aceite de oliva para la actividad lipasa

Se midió la actividad lipasa utilizando un ensayo de aceite de oliva. Se evaluó la lipasa en el sobrenadante de la muestra para determinar actividad contra el aceite de oliva en tampón a pH 7,7. El ensayo se realizó de forma valorimétrica utilizando ligeras modificaciones del procedimiento descrito en Pharmaceutical Enzymes - Properties and Assay Methods, Ruyssen y Lauwers (eds.), Scientific Publishing Company, Gante, Bélgica (1978).

Las disoluciones utilizadas en el ensayo incluyen las siguientes:

1.: Emulsión de aceite de oliva: se disolvieron 16,5 g de goma arábiga (Sigma) en 180 ml de agua y 20 ml de aceite de oliva (Sigma) y se emulsionaron utilizando un mezclador Quick Prep durante 3 minutos.

2.: Valorador: NaOH 0,05 M

3.: Disolución A: NaCl 3,0 M

4.: Disolución B: CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 75 mM

5.: Mezcla: se reunieron 40 ml de la disolución A con 20 ml de la disolución B y 100 ml de H_{2}O.

6.: Albúmina al 0,5%.

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Disolución del sustrato de lipasa

El sustrato se preparó añadiendo 50 ml de emulsión de aceite de oliva (disolución 1) a 40 ml de mezcla (disolución 5) y 10 ml de albúmina al 0,5% (disolución 6).

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Procedimiento de ensayo

La disolución del sustrato de lipasa (disolución 7) se calentó hasta 37ºC en un baño de agua. En primer lugar se añadieron 20 ml de sustrato al recipiente de reacción y se ajustó el pH a 7,7 utilizando NaOH 0,05 M (disolución 2) y se equilibró hasta 37ºC con agitación. La reacción se inició añadiendo enzima. El avance de la reacción se controló valorando la mezcla de enzima y sustrato con NaOH 0,05 M para mantener el pH a 7,7.

La actividad específica (\mumol/min/mg de proteína) es igual a la velocidad inicial x 1000 x concentración del valorador/cantidad de enzima. Se determinó el punto cero realizando la reacción sin enzima, es decir, utilizando tampón en lugar de la enzima en la mezcla de reacción. La velocidad inicial es igual al consumo de base en ml/tiempo en min. El blanco era una muestra sin enzima, es decir, se utilizó tampón en lugar de la enzima en la mezcla de reacción.

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Ejemplo 3

Ensayo para la actividad proteasa

Se determinó la actividad de las proteasas utilizando caseína como sustrato en un procedimiento como se describe en la farmacopea de EEUU (Assay for lipase activity in Pancretin, USP 24, 2000, 1254-1255). Se calculó la actividad proteasa en unidades USP mediante la comparación con la actividad del patrón, utilizando la actividad proteasa mencionada en la etiqueta de USP Pancreatin Amylase and Protease RS. Una unidad USP de actividad proteasa es la cantidad de enzima que hidroliza la caseína a una velocidad inicial de forma que se libera una cantidad de péptido (que no es precipitado por el ácido trifluoroacético) por minuto que produce la misma absorbancia a 280 nm que 15 nmol de tirosina bajo las condiciones del ensayo para la actividad proteasa.

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Ejemplo 4

Ensayo para la actividad amilasa

Se determinó la actividad de las amilasas utilizando almidón como sustrato en un procedimiento como se describe en la farmacopea de EEUU (Assay for lipase activity in Pancretin, USP 24, 2000, 1254-1255). Se calculó la actividad amilasa en unidades USP mediante la comparación con la actividad del patrón, utilizando la actividad amilasa mencionada en la etiqueta de USP Pancreatin Amylase and Protease RS. Una unidad USP de actividad amilasa es la cantidad de enzima que descompone el almidón a una velocidad inicial de forma que se hidrolizan 0,16 mEq de enlaces glicosídicos por minuto bajo las condiciones del ensayo para la actividad amilasa.

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Ejemplo 5

Cristalización de la lipasa de Burkholderia cepacia

La lipasa de Burkholderia cepacia (lipase PS 3000 - Amano) ("LPS", 150 g) se disolvió en 1000 ml de agua desionizada destilada y se dializó contra el agua durante la noche con tres cambios. A la proteína se le añadió terc-butanol hasta una concentración final del 25% y se añadió tampón acetato de sodio 1 M hasta una concentración final de 10 mM, seguido de una centrifugación para eliminar el precipitado que se formó después de 1 hora. Los cristales de lipasa comenzaron a formarse en 15 min. Después se dejó que la cristalización se desarrollase durante 16 h antes de la recolección. Se obtuvo un rendimiento mayor que 95% (basado en la actividad) mediante este
procedimiento.

Los cristales tenían forma de varilla y tenían un tamaño bastante uniforme (longitud de aproximadamente 10-15 \mum) y una forma bastante uniforme cuando se observan bajo el microscopio óptico, y según se miden mediante un analizador del tamaño de partícula Coulter LS.

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Ejemplo 6

Reticulación de cristales de lipasa de Burkholderia cepacia

La reticulación de los cristales de lipasa se realizó utilizando bis(sulfosuccinimidil)suberato-BS ("BS") 2 mM en licor madre (terc-butanol al 25% a pH 8,5 en tampón fosfato 50 mM). La reticulación se realizó a 4ºC durante la noche (16 h) con volteo. Después de 16 horas, la suspensión se centrifugó a 3000 rpm y el sobrenadante se rechazó. La reticulación se terminó eliminando el exceso de reactivo mediante un lavado con licor madre en presencia de HCl.Tris 10 mM para inactivar cualquier reticulante no reactivo. Por último, el complejo enzimático reticulado de Burkholderia cepacia (CLEC-BC) se lavó a fondo con tampón acetato de sodio 10 mM, pH 4,5, y se conservó a
4ºC.

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Ejemplo 7

Medición de la cristalinidad

Se controló la integridad de los cristales de las formulaciones mediante inspección bajo un microscopio óptico y mediante una análisis con un contador Coulter para la medición del tamaño de partícula. La forma de varilla de los cristales y su tamaño permanecieron sin cambios después de la reticulación.

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Ejemplo 8

Caracterización de la estructura secundaria mediante espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR)

Se recogieron los espectros de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR) de los cristales de lipasa solubles, reticulados y no reticulados en un espectrómetro Nicolet modelo 550 de serie Magna como describen Dong et al., en Biochemistry, 31:9364-9370 (1992), y en J. Pharm. Sci., 84:415-424 (1995). Las muestras de la suspensión de cristales de lipasa no reticulados y de la suspensión de CLEC-BC (aproximadamente 5 a 10 mg/ml cada una) se colocaron en un cristal de selenuro de cinc de ARK ESP. Se recogieron los espectros y se procesaron utilizando Grams 32 de Galactic Software para la determinación de las áreas relativas de los componentes individuales de la estructura secundaria utilizando un programa de segunda derivada y de ajuste de curva bajo la región amida I (1600-1700 cm^{-1}). La lipasa soluble

\hbox{no reticulada y CLEC-BC produjeron
espectros idénticos sin  cambios importantes en la estructura
secundaria.}

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Ejemplo 9

Actividad de los cristales de la enzima reticulada de Burkholderia cepacia ("BC")

Se estudió la actividad de los cristales de la enzima reticulada de Burkholderia cepacia ("BC").

El CLEC-BC reticulado con el sustrato de bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS) es activo. El CLEC-BC reticulado con BS es aproximadamente 50% activo cuando se compara con la lipasa soluble no reticulada (tabla 1). Las actividades de la lipasa soluble y de la lipasa reticulada se compararon utilizando el método de USP (ejemplo 1) y el método de la liberación de aceite de oliva (ejemplo 2).

TABLA 1 Actividad de la preparación de CLEC lipasa

1

Ejemplo 10

Actividad de CLEC-BC a diversos niveles de pH

Se determinó la actividad de CLEC-BC a diversos niveles de pH utilizando una valoración de punto final. Las actividades se determinaron a pH 2,0, pH 4,5, pH 5,5, pH 6,5, pH 7,7 y pH 9,0. Las muestras se valoraron utilizando un pH STAT durante 15 min a los niveles de pH mencionados anteriormente y después el pH de cada muestra se elevó inmediatamente hasta pH 7,7, excepto para la muestra con pH 9,0, que se midió tal cual. En los casos en que el pH aumentó hasta 7,7, los controles se ensayaron inmediatamente sin incubación durante 15 minutos.

El CLEC-BC reticulado con bis(sulfosuccinimidil)suberato-BS era activo a diversos niveles de pH ensayados. El CLEC-BC mostró actividad en diversos intervalos de pH. Con la excepción del pH 2,0, en el que se observó una actividad de sólo 25%, el CLEC-BC mostró una alta actividad a todos los niveles de pH ensayados.

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Ejemplo 11

Estabilidad del CLEC-BC a lo largo del tiempo

Se estudió la estabilidad del CLEC-BC a lo largo del tiempo. Se determinó la estabilidad del CLEC-BC a diferentes niveles de pH a 37ºC durante 5 horas. Los CLEC se suspendieron en pH 2,0 (tampón HCl.glicina), pH 3,0 (tampón HCl.glicina), pH 4,0 (tampón acetato), pH 5,0 (tampón acetato), pH 6,0 (tampón fosfato), pH 7,0 (tampón fosfato), pH 8,0 (tampón fosfato), pH 9,0 (tampón carbonato bicarbonato), y pH 10,0 (tampón carbonato bicarbonato) de forma separada durante 5 h a 37ºC. Se determinó la estabilidad de los CLEC estimando las actividades de los CLEC en el tiempo cero y al final de las 5 horas. También se estudió la estabilidad de la enzima de BC soluble a pH 2,0 a lo largo de un periodo de 5 horas. Se midió la actividad como el porcentaje de actividad inicial.

Se descubrió que CLEC-BC era estable a todos los valores de pH ensayados durante el intervalo de tiempo estudiado.

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Ejemplo 12

Medición de la disolución de los cristales en tampón

Se determinó la solubilidad de una formulación de BC-CLEC bajo condiciones ácidas utilizando tampón
HCl.glicina 10 mM, pH 2,0. Los CLEC se lavaron con tampón HCl.glicina 10 mM, pH 2,0, y se suspendieron en el mismo tampón con volteo a 37ºC durante 5 h. Se estudió la disolución de los cristales haciendo pasar una parte alícuota a través de un filtro de 0,22 um. Se determinó la actividad de proteínas (método de Bradford) y lipolítica (ensayo de lipasa utilizando aceite de oliva) en el filtrado (CLEC soluble) que produce la cantidad de cristales solubilizados. Para determinar la actividad de los cristales (CLEC), se restó la actividad de la enzima soluble de la actividad total en la muestra (actividad antes de la filtración).

No se observó un lixiviado significativo desde los CLEC-BC a pH 2,0. Se determinó la solubilidad de la formulación de CLEC bajo condiciones ácidas utilizando tampón HCl.glicina 10 mM, pH 2,0. Los CLEC se lavaron con tampón HCl.glicina 10 mM, pH 2,0, y se suspendieron en el mismo tampón con volteo a 37ºC durante 5 h. Sólo se observó un lixiviado del 0,44% a lo largo de un periodo de 5 horas.

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Ejemplo 13

Ensayo in vitro de la biodisponibilidad de CLEC-BC

Se evaluó la estabilidad frente a la degradación proteolítica incubando los CLEC con diversas proteasas, como pepsina (que está presente en el estómago), y tripsina o quimotripsina (que están presentes en el duodeno). Además se ensayó la proteasa bromelaína porque se ha seleccionado para ser incluida en una terapia de combinación para sustituir a la proteasa en el extracto pancreático. Cada CLEC se incubó a 37ºC con agitación suave en una disolución de tampón HCl.glicina 10 mM, pH 2,0 para la pepsina, o de tampón fosfato 10 mM para la tripsina/quimotripsina, pH 7,0, o de tampón acetato 10 mM, pH 5,5, para la bromelaína, con una proporción entre CLEC a proteasa de 10:1 1 (en p/p). Se tomaron partes alícuotas cada hora y se midió la actividad lipolítica residual utilizando el aceite de oliva como sustrato.

El CLEC-BC mostró una alta estabilidad frente al tratamiento con pepsina durante 5 h, sin pérdida de actividad ni de látice cristalino. Bajo condiciones similares, la lipasa soluble pierde aproximadamente 58% de actividad. El CLEC-BC no mostró pérdida de actividad después de 5 horas de incubación con tripsina, mientras que la enzima soluble perdió aproximadamente 36% de actividad en 4 h bajo condiciones similares. Con la quimotripsina, el CLEC-BC mostró una pérdida de sólo 28% de actividad durante 5 horas, mientras que la lipasa soluble perdió 82% de actividad en 5 horas a pH 7,0. Además, CLEC-BC y la lipasa soluble fueron estables frente a la degradación proteolítica por la bromelaína.

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Ejemplo 14

Ensayo in vivo de la biodisponibilidad de CLEC-BC

Se realizarón estudios de eficacia y de biodisponibilidad para demostrar que la administración de partículas (5-20 \mum de diámetro) de CLEC-BC corrige la esteatorrea en sujetos caninos con insuficiencia pancreática. La reducción de la esteatorrea con CLEC-lipasa se relaciona con la supervivencia de la actividad lipolítica. La ralentización del vaciado gástrico, que se produce con comidas con alto contenido en grasas, potencia el mezclado de la lipasa con la grasa que conduce a una eficaz digestión y absorción de las grasas.

Para los estudios se emplearon perras mestizas que pesaban entre 18-21 kg. En primer lugar las perras se anestesiaron con una inyección intravenosa de tiopental sodio y después se sometieron a una intubación endotraqueal. Se mantuvo la anestesia con halotano gaseoso. Después de la celiotomía, se ligaron de modo individual los conductos pancreáticos menor y mayor, y se transeccionaron todas las demás conexiones de tejido entre el duodeno y la cabeza del páncreas.

Durante los estudios de equilibrio, los perros fueron alimentados con dos comidas diarias. Con la primera comida del estudio se administró un marcador de rojo carmín. Después de la aparición de rojo carmín en las deposiciones se comenzó una recolección de deposiciones de 72 horas. Se registró la consistencia fecal (grado 1: bien formadas, grado 2: consistencia de puré o sueltas, grado 3: acuosas) y la frecuencia fecal y se calculó una puntuación fecal multiplicando la consistencia y la frecuencia fecal. Las deposiciones de 72 horas se analizaron para el peso total, los carbohidratos, las grasas y las proteínas. Entre los estudios, los perros se mantuvieron como se describe a continuación durante al menos 3-7 días antes de empezar con un nuevo estudio de equilibrio fecal.

Cada perro ingirió una comida con alto contenido en grasas que contenía 850 Kcal compuestos de 21%, 43% y 36% de calorías, respectivamente, de carbohidratos, grasas y proteínas. La comida básica era alimento para perros enlatado Hill (Hill's Pet Products, Topeka, KS). Contenía pollo, subproductos cárnicos, arroz, maíz triturado, hígado, grasa animal, huevo completo, pavo, harina de soja y cebada en perlas agrietada. La comida se suplementó con 46 g de polvo Promod y minerales. Se empleó una comida con alto contenido en grasas (alto contenido en grasas, alto contenido en proteínas y bajo contenido en carbohidratos). Además, esta comida ha sido asociada con la mejor coordinación entre el vaciado de la comida sólida y el transporte de lipasa al duodeno (Suzuki et al., Gastroenterology, 112:2048-2055 (1997); Cornell, Experiments with mixtures, Nueva York, Wiley (1981); Boivin et al., Gastroenterology, 99:1763-1771 (1990)). Para ajustar el contenido en minerales de forma que los requerimientos de minerales diarios fueran casi iguales entre las comidas, se añadieron 1,7 g de Na_{3}(C_{6}H_{5}O_{7}) y 2,0 g de KCl a las comidas. El contenido global en minerales era el siguiente: Ca, 2088 mg; Na, 1170 mg; K, 2108 mg; Cl, 1869 mg; P, 1699 mg; Mg, 180 mg.

Entre los estudios, los perros fueron alimentados con alimento para perros enlatado (Hill's Prescription Diet, canine i/d, Hill's Pet Products, Topeka, KS). Cada lata contenía 580 Kcal, compuestas de 48% de carbohidratos, 27% de grasas y 25% de proteínas como porcentaje de calorías, 15 g de grasas como triglicéridos, diglicéridos, monoglicéridos y ácidos grasos, 1 g de colesterol y 1 g de éster de colesterol, y 0,5 g de fosfolípidos. Los perros recibieron dos latas por la mañana y una lata por la tarde. Se introdujeron 10 gramos de polvo de pancreatina porcina (Viokase, AH Robins Company, Richmond, VA) en la comida de la mañana, y 7 g en la comida de la tarde. Esta dosis de enzimas pancreáticas mantiene el peso corporal de perros con insuficiencia pancreática dentro del 10% de los valores preoperatorios. Los perros fueron pesados cada semana. Los niveles de glucosa sanguínea en ayunas se midieron cada semana.

Los resultados se presentan en las figuras 1, 2 y 3. El CLEC-BC se administró a dosis de 150.000 unidades ("Thera CLEC-BC" (1) en las figuras 1-3); 30.000 unidades ("Thera CLEC-BC" (2) en las figuras 1-3); o 7.500 unidades ("Thera CLEC-BC" (3) en las figuras 1-3). La figura 1 muestra el efecto de diversas dosis de CLEC-BC sobre el coeficiente medio de absorción de grasas (CFA). Los niveles de CFA medios postoperatorios en perros no tratados se redujeron hasta aproximadamente 60% de los niveles preoperatorios. Para todas las dosis ensayadas, la adición de CLEC-BC restableció el porcentaje de CFA a aproximadamente 90% de los niveles preoperatorios.

La figura 2 muestra el efecto de diversas dosis de CLEC-BC sobre la grasa media en las deposiciones. En perros posoperatorios no tratados, la grasa media en las deposiciones aumentó desde niveles apenas perceptibles a 40 gramos/24 horas. La adición de CLEC-BC a perros posoperatorios disminuyó la grasa media en las deposiciones hasta aproximadamente 10 gramos/24 horas para todas las dosis ensayadas.

La figura 3 muestra el efecto de diversas dosis de CLEC-BC sobre el coeficiente medio de absorción de proteínas (CPA) en cuatro perros. El CPA medio disminuyó desde aproximadamente 95% de absorción en perros preoperatorios hasta aproximadamente 40% en perros postoperatorios. La adición de CLEC-BC no afectó significativamente al CPA medio. El CLEC-BC logró unas reducciones en el CFA comparables a las observadas utilizando VIOKASE® y CREON®, dos agentes utilizados para tratar la insuficiencia exocrina pancreática.

Sin embargo, CLEC-BC se diferenciaba de los agentes en la cantidad de dosis requerida para corregir la esteatorrea en perros. Se lograron efectos similares utilizando sólo 6-113 mg de CLEC-BC frente a 1-4 g de VIOKASE® y 0,5-1,0 g de CREON®. Puede observarse a partir de la figura 3 que CLEC-BC no aumentó el CPA por encima de su nivel postoperatorio no tratado.

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Ejemplo 15

Ensayo in vivo de la biodisponibilidad de una composición que incluye CLEC-BC, bromelaína y amilasa

Se estudió la biodisponibilidad de una composición que incluye CLEC-BC, bromelaína y amilasa para corregir la azotorrea pancreática. La eficacia se comparó con la eficacia de la adición de las lipasas VIOKASE® y CREON®.

Se midió el coeficiente de absorción de proteína (CPA) tras la adición de los agentes mediante estudios de equilibrio fecal de 72 horas inmediatamente antes y después de la operación que produce la insuficiencia pancreática, y 3 semanas después de la operación con las dosis de los siguientes productos: VIOKASE® 8, 4 y 2 comprimidos (240.000, 120.000 y 60.000 unidades USP de proteasa); CREON® 2 y 1 cápsulas (150.000 y 75.000 USP de proteasa); CLEC-Total que consiste en CLEC-BC (150.000 USP; 113,5 mg), bromelaína (150.000 USP; 214 mg) y amilasa de Bacillus (150.000 USP; 71,9 mg). La actividad enzimática de estas preparaciones se muestra en la tabla 2.

Durante estos estudios, los perros ingirieron una dieta compuesta por 43% de grasas, 36% de proteínas y 21% de carbohidratos como porcentaje de calorías (1700 kCal/d).

El coeficiente de absorción de grasas fue > 88% con todos los tratamientos (figura 4). El coeficente de absorción de proteínas (CPA) se correlacionó directamente (r = 0,86) con la cantidad de proteasa en las preparaciones. El CPA aumentó desde 59% con la dosis más baja de proteasa hasta 79% con la dosis más alta de proteasa. El CPA con bromelaína (69%; 150.000 unidades USP de proteasa) fue similar al CPA de 2 cápsulas de CREON® (63%; 150.000 unidades USP) y al CPA de 4 comprimidos de VIOKASE® (72%; 120.000 unidades USP de proteasa) (figuras 6 y 7). Se advirtió que las actividades proteolíticas reales de VIOKASE® y CREON® fueron al menos 35% mayores que sus actividades declaradas. En efecto, la actividad proteasa real de VIOKASE® era de 46.248 unidades USP por comprimido frente a 30.000 unidades USP por comprimido indicadas para VIOKASE®, y de 100.519 unidades USP por cápsula frente a 75.000 unidades USP por cápsula indicadas para CREON®,

TABLA 2 Actividades de lipasa, proteasa y amilasa en diversas preparaciones terapéuticas

2

Estos resultados demuestran que la composición que contiene CLEC-BC, bromelaína y amilasa es al menos tan eficaz, en una base por unidades, como las proteasas porcinas para reducir la malabsorción de proteínas (figuras 6 y 7). Además, los resultados demuestran que una pequeña cantidad (114 mg) de CLEC-BC en CLEC-Total corrige la esteatorrea en perros al menos tan bien como 8 comprimidos de VIOKASE® (aproximadamente 4 g) o 2 cápsulas de CREON® (aproximadamente 1 g) (figura 4).

Otras realizaciones se encuentran en las reivindicaciones.

Claims

1. Una composición que comprende:

(a): un cristal de lipasa no fúngica reticulado con un agente reticulante multifuncional;

(b): una proteasa; y

(c): una amilasa, en forma amorfa

en la que el cristal de lipasa es activo a un pH de 2,0 a 9,0.

2. La composición según la reivindicación 1, en la que el cristal de lipasa es activo tras su exposición durante al menos una hora a un entorno que tiene un pH de 1,0 a 4,0.

3. La composición según la reivindicación 1, en la que el cristal de lipasa es activo tras su exposición durante al menos dos horas a un entorno que tiene un pH de 1,0 a 4,0.

4. La composición según la reivindicación 1, en la que el cristal de lipasa es activo tras su exposición durante al menos cinco horas a un entorno que tiene un pH de 1,0 a 4,0.

5. La composición según la reivindicación 1, en la que el agente reticulante multifuncional es bis(succinimidil)suberato.

6. La composición según la reivindicación 1, en la que la lipasa se deriva de una lipasa bacteriana.

7. La composición según la reivindicación 6, en la que la lipasa bacteriana es una lipasa de Pseudomonas.

8. La composición según la reivindicación 7, en la que la lipasa de Pseudomonas es la lipasa de Burkholderia cepacia.

9. La composición según la reivindicación 1, en la que la amilasa se selecciona del grupo que consiste en una amilasa de Bacillus y una amilasa de Aspergillus.

10. La composición según la reivindicación 1, en la que la proteasa es una proteasa fúngica.

11. La composición según la reivindicación 1, en la que la proteasa es un cristal de proteasa.

12. La composición según la reivindicación 11, en la que el cristal de proteasa es un cristal de proteasa reticulado.

13. La composición según la reivindicación 1, en la que la proteasa está en una forma no cristalina.

14. La composición según la reivindicación 1, en la que la composición está en forma de polvo.

15. La composición según la reivindicación 1, en la que la composición es una suspensión acuosa.

16. La composición según la reivindicación 1, en la que la composición está en forma de cápsula o de comprimido.

17. La composición según la reivindicación 1, en la que el cristal de lipasa muestra una actividad específica frente al aceite de oliva mayor que 500, 1000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o más unidades por mg de lipasa.

18. La composición según la reivindicación 1, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. La composición según la reivindicación 1, en la que la composición es una composición farmacéutica.

20. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 18 ó 19, en la que la composición está presente en una formulación adecuada para la administración oral a un sujeto.

21. La composición según la reivindicación 18, en la que el vehículo farmacéutico se selecciona del grupo que consiste en un diluyente, un excipiente y un adyuvante.

22. La composición según la reivindicación 18, en la que el vehículo es un vehículo polimérico.

23. La composición según la reivindicación 22, en la que el vehículo polimérico es un polímero biodegradable.

24. La composición según la reivindicación 22, en la que la composición está encapsulada dentro de una matriz del vehículo polimérico.

25. La composición según la reivindicación 24, en la que al menos 50% de la composición permanece encapsulada dentro de la matriz tras la exposición del vehículo polimérico a un entorno que tiene un pH de 1,0 a 3,0 durante al menos una hora.

26. El uso de la composición según la reivindicación 1 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir un trastorno gastrointestinal en un mamífero.

27. El uso según la reivindicación 26, en el que la composición se administra por vía oral.

28. El uso según la reivindicación 26, en el que el mamífero es un ser humano.

29. El uso según la reivindicación 26, en el que el trastorno gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste en pancreatitis e insuficiencia pancreática.

30. El uso según la reivindicación 26, en el que el sujeto padece o está en riesgo de padecer fibrosis quística.

31. El uso de la composición según la reivindicación 1 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir la malabsorción de grasas en un mamífero que padece o que está en riesgo de padecer un trastorno que se caracteriza por una baja secreción de lipasas.

32. El uso según la reivindicación 31, en el que la composición se administra por vía oral al mamífero.

33. El uso según la reivindicación 31, en el que el mamífero es un ser humano.

34. El uso según la reivindicación 31, en el que la composición se administra de modo preprandial al sujeto.

35. El uso según la reivindicación 31, en el que la composición se administra de modo prandial al sujeto.

36. El uso según la reivindicación 31, en el que la composición se administra de modo postprandial al sujeto.

37. El uso según la reivindicación 31, en el que la composición se administra al mamífero en una cantidad suficiente para aumentar el coeficiente de absorción de grasas en el mamífero hasta más del 60%.

38. El uso según la reivindicación 31, en el que la composición se administra al mamífero en una cantidad suficiente para aumentar el coeficiente de absorción de grasas en el mamífero hasta más del 80%.

39. El uso según la reivindicación 26, en el que la composición se administra al mamífero en una cantidad suficiente para aumentar el coeficiente de absorción de proteínas en el mamífero hasta más del 60%.