ES2345842T3

ES2345842T3 - Peptidos biologicamente activos.

Info

Publication number: ES2345842T3
Application number: ES07000950T
Authority: ES
Inventors: Wai Ming Wong; Kong Lam
Original assignee: CMS Peptides Patent Holding Co Ltd
Current assignee: CMS Peptides Patent Holding Co Ltd
Priority date: 2001-07-13
Filing date: 2002-07-11
Publication date: 2010-10-04
Anticipated expiration: 2022-07-11
Also published as: NO20073914L; PL368059A1; SG142165A1; MXPA03011190A; PL208666B1; KR20070070258A; NZ544079A; ZA200401108B; JP2004533846A; JP4213581B2; WO2003006492A3; NO20040134L; NO332061B1; EP1478659B1; EP1790655B1; AU2002319423B2; ES2316586T3; WO2003006492A2; NZ553507A; ATE466871T1

Abstract

Un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1.

Description

Péptidos biológicamente activos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la inmunología. En particular, la presente invención se refiere a péptidos y sus composiciones farmacéuticas que son capaces de modular las respuestas inmunes.

Antecedentes de la invención

Los péptidos se conocen en la técnica para el tratamiento de enfermedades y como composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.191.113 describe un péptido que tiene actividad inhibidora para el crecimiento de las células del músculo liso y por lo tanto es útil para prevenir y tratar afecciones patológicas asociadas con el crecimiento de las células del músculo liso tales como arteriosclerosis, reestenosis después de angioplastia, estenosis luminal después de injertar vaso sanguíneo y sarcoma de músculo liso. El documento US 6.184.208 describe otro péptido que se ha descubierto que modula los procesos fisiológicos tales como la actividad de aumento de peso de la zona de crecimiento epitelial y crecimiento del cabello.

Karelin c.s. (Peptides, VOL. 16, Nº 4, 693-697, 1995) describe los fragmentos de alfa-hemoglobina (33-38) y (33-46) que tienen respectivamente actividad inmunomoduladora y liberadora de ACTH. El documento US5861483 describe el fragmento de alfa-hemoglobina (1-97) que tiene actividad inmunomoduladora.

Sumario de la invención

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es identificar polipéptidos biológicamente activos. Se sintetizaron muchos péptidos por métodos químicos convencionales y se exploraron para su actividad biológica. A los péptidos se les dan códigos que tienen las letras CMS seguidas de un número. Se ha identificado un total de 30 péptidos que tienen actividad biológica in vivo. Las secuencias los números ID correspondientes de estos péptidos biológicamente activos se muestran en la Tabla A.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA A

1

3

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a un péptido sustancialmente puro que tiene una secuencia de aminoácidos identificada como la ID de secuencia Nº 1. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1. En una realización específica, el péptido puede modular, pero no se limita a modular, una o más de las siguientes: actividad inmune; infección de hepatitis, incluyendo, aunque sin limitación, infección de hepatitis B; nefritis; el desarrollo de un cáncer, incluyendo aunque sin limitación sarcoma, cáncer de hígado, leucemia y melanoma; y el peso corporal.

Otro aspecto más de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1.

Otro aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para preparar una composición farmacéutica que comprende proporcionar un péptido sustancialmente puro constituido por una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1; y mezclar dicho péptido sustancialmente puro con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un aspecto adicional más, la invención proporciona un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 para su uso en terapia.

La invención también posibilita el uso de un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 para la fabricación de un medicamento para modular actividades inmunes, hepatitis vírica o el desarrollo de un cáncer.

Análogamente, la invención proporciona un péptido sustancialmente puro constituido por la SEC ID Nº 1 para su uso en la modulación de actividades inmunes, hepatitis vírica o el desarrollo de un cáncer.

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Descripción detallada

Los péptidos pueden sintetizarse fácilmente por métodos sintéticos convencionales a partir de L-aminoácidos, pero también pueden sintetizarse por métodos de ingeniería genética usando ácidos nucleicos que tienen secuencias que codifican los péptidos individuales.

I. Actividad Biológica

Para investigar la posible actividad biológica de los péptidos, se examinó el efecto inmunológico de los péptidos sobre un modelo animal, con procedimientos que acatan los "Principios de Investigación Preclínica de Nuevos Fármacos" (Principles of Pre-clinical Research of New Drugs) presentados por el Ministerio de Salud de la República Popular de China ^{[1]}.

Se usaron el ensayo de transformación de linfocitos T, el ensayo de actividad citotóxica de células NK, y el ensayo de secreción de IL-2 e IFN-\gamma por linfocitos T para detectar cualquier posible efecto de los péptidos sobre la función inmune celular específica. Se usó el ensayo de eliminación de partículas de carbono para detectar cualquier efecto posible de los péptidos sobre la función inmune celular no específica. Se usó el ensayo de hemólisis de glóbulos rojos de oveja (SRBC) para detectar cualquier efecto posible de los péptidos sobre la función inmune humoral. Se usó el ensayo de peso del órgano inmunitario para detectar cualquier efecto posible de los péptidos a nivel orgánico.

En este estudio, se usó el grupo de solución salina como control negativo, mientras que se usaron los grupos IL-2 e IFN-\gamma como controles positivos, ya que IL-2 e IFN-\gamma son inmunoestimulantes bien estudiados ^{[10]}. Se usaron cuatro concentraciones arbitrarias de los péptidos de muestra en este estudio, para cubrir un intervalo de dosificación de factor 1.000. Debido a la complejidad intrínseca de la respuesta inmunológica in vivo, y la ausencia de conocimiento previo sobre la función de la dosificación frente a la respuesta, por lo tanto, se ha valorado cualquier diferencia estadísticamente significativa sobre el control negativo en cualquier grupo de dosificación como actividad biológica positiva.

Los resultados de este estudio fueron los siguientes:

1.: Se descubrió que los péptidos CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS015, CMS019, CMS021, CMS029, y CMS034 eran capaces de potenciar la transformación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina. También se descubrió que los péptidos CMS014 y CMS036 eran capaces de inhibir la transformación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.

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2.: Se descubrió que los péptidos CMS001, CMS002, CMS003, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS015, CMS016, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina. También se descubrió que los péptidos CMS008 y CMS012, a concentración adecuada, eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.

3.: Se descubrió que los péptidos CMS001, CMS003, CMS007, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS015, CMS020, CMS022, y CMS034 eran capaces de potenciar la secreción de interleuquina-2 (IL-2) por linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.

4.: Se descubrió que los péptidos CMS001, CMS003, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS016, CMS021, CMS022, y CMS028 eran capaces de potenciar la secreción de IFN por linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.

5.: Se descubrió que los péptidos CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de potenciar la síntesis de anticuerpo anti-SRBC tras la estimulación antigénica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina. También se descubrió que los péptidos CMS002, CMS003, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS018, CMS019, CMS020, CMS026, CMS028, CMS029, CMS030, CMS034, y CMS036, a concentración adecuada, eran capaces de inhibir la síntesis de anticuerpo anti-SRBC tras la estimulación antigénica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.

6.: Se descubrió que los péptidos CMS003, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS016, CMS018, CMS019; CMS020, CMS022, CMS024, CMS027, CMS030, CMS035, CMS036 eran capaces de potenciar la actividad fagocítica de fagocitos mononucleados, que tiene diferencia estadística significativa del grupo de control normal de solución salina.

7.: Se descubrió que los péptidos CMS001, CMS002, CMS008, CMS010, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de aumentar el peso de la glándula tímica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.

8.: Se descubrió que los péptidos CMS019, CMS020, y CMS030 eran capaces de aumentar el peso del bazo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina. También se descubrió que los péptidos CMS001, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS021, CMS023, CMS024, CMS027, CMS029, y CMS036, a concentración adecuada, eran capaces de disminuir el peso del bazo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.

Los materiales y métodos usados para analizar el efecto de los péptidos sobre ratones se describen a continua-
ción:

Materiales 1. Animal Experimental

Ratones BALB/c, de 18-22 g de peso, 50% hembras y 50% machos, proporcionados por Experimental Animal Center, National Institute of Medical Science, RP de China.

2. Administración

Grupo de IFN-\gamma de ratón recombinante (rmIFN-\gamma): 3 x 10^{5} IU/kg/día

Grupo de IL humana recombinante (rhlL)-2: 3 x 10^{5} IU/kg/día

Grupo de solución salina: 0,5 ml/cada uno/día

Grupo I de dosis de péptido: 500 \mug/kg/día

Grupo II de dosis de péptido: 50 \mug/kg/día

Grupos III de dosis de péptido: 5 \mug/kg/día

Grupo IV de dosis de péptido: 0,5 \mug/kg/día

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Las sustancias anteriores se disolvieron todas en 0,5 ml de solución salina y se inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) durante 15 días continuos, una vez al día.

3. Reactivos Principales

Los péptidos se fabricaron a petición del cliente por American Peptide Company, Inc., USA

Suero fetal bovino, y medio de cultivo celular RPMI-1640, Gibco, USA

MTT, y ConA, Sigma, USA

rmlFN-\gamma, Beijing Biotech Inc., China

rhIL-2, Shanghai Huaxin Biotech Inc., China

Solución de separación de linfocitos, Research Institute of Hematologic Disease, National Institute of Medical Science, RR de China

Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV), muestra convencional de IFN-\gamma y IL-2, National Institute For The Control Of Pharmaceutical And Biological Products, RP de China

Células HT-2 y células L929, cedidas por el Prof. WF Chen de Beijing University Department of Immunology, RP de China

Método 1. El efecto de los péptidos sobre la inmunidad celular 1.1 Preparación de suspensión celular esplénica ^{[1,2]}

Los ratones BALB/c se dividieron aleatoriamente en los grupos de péptido, IFN, IL-2, y solución salina. Diez ratones por grupo. El día después de la última administración de sustancia de ensayo, se sacrificó a los ratones por dislocación cervical. Se aisló el bazo asépticamente y se dispersó manualmente en solución de D-Hank fría usando una aguja de inyección. La suspensión celular dispersada se tamizó adicionalmente a través de un tamiz de acero inoxidable de 150 \mum de diámetro calibre 100. Después de centrifugación a 200 g durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante. Se resuspendió el sedimento celular en 10 volúmenes de tampón Tris-NH_{4}Cl y después se mantuvo en reposo aún durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células suspendidas se recogieron por centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Las células se lavaron 2-4 veces con solución de D-Hank fría resuspendiendo y recogiendo por centrifugación con las condiciones que se han descrito anteriormente. Después las células lavadas se diluyeron a las densidades celulares deseadas por medio de cultivo RPMI-1640, que contenía suero fetal bovino al 10%.

1.2 El efecto de los péptidos sobre la transformación de linfocitos T ^{[1,2]}

Se colocaron células esplénicas de densidad 1x10^{6}/ml en una placa de cultivo celular de 96 pocillos, 100 \mul/pocillos, tres pocillos paralelos cada una de la muestra de ensayo y muestra de control por ratón. A los pocillos de ensayo se añadieron 100 \mul/pocillos de ConA de 100 \mug/ml en RPMI-1640, y se usó 100 \mul/pocillo de RPMI-1640 sencillo para los controles. Los pocillos se incubaron durante 66 h a 37ºC, CO_{2} al 5%. Después las células se sedimentaron por centrifugación a 150 g durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió y se almacenó a -20ºC para la determinación de citoquinas IL-2 e IFN.

Se añadieron 50 \mul/pocillo de MTT de 1 mg/ml en RPMI-1640 al sedimento celular y las células se re-suspendieron agitando durante 2 minutos. La incubación se continuó durante 4 horas. Se desechó el sobrenadante después de la centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Se añadieron 120 \mul de HCl-2-propanol 40 mM al sedimento celular y se agitó durante 3 minutos, para obtener una DO_{570 \ nm} de cada pocillo con referencia a 630 nm. Se usó un lector ELISA

Cálculo:

Cada ratón formó tres pocillos de ensayo y tres pocillos de control. El Índice de Estimulación (SI) de cada ratón se obtuvo derivando primero la DO promedio de los tres pocillos paralelos, después dividiendo el valor de los pocillos de ensayo por los pocillos de control.

1.3 El efecto de los péptidos sobre la actividad de células NK ^{[3,4]}

Se prepararon células esplénicas de ratón a 4x10^{6}/ml como se ha descrito en la sección 1.1 anterior. Las células YAC-1 diana se llevaron a fase log y se ajustaron a 1x10^{5}/ml. Usando una placa de cultivo celular de 96 pocillos, se añadieron 100 \mul de células esplénicas de ratón y 100 \mul de medio de cultivo al pocillo de control que contenía solamente las células esplénicas; se añadieron 100 \mul de células diana y 100 \mul de medio de cultivo al pocillo de control que contenía solamente células diana; se añadieron 100 \mul de células esplénicas de ratón y 100 \mul de células de diana al pocillo de ensayo de la actividad NK. Se prepararon tres series paralelas de lo anterior por ratón.

Las muestras se centrifugaron a 150 g durante 10 minutos para recoger las células. Se desechó el sobrenadante y se añadieron 50 \mul/pocillo de MTT de 1 mg/ml. Después se agitó la mezcla de reacción durante 2 minutos, y se incubó a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 4 horas. Se desechó el sobrenadante después de centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Se añadieron 120 \mul de HCl-2-propanol 40 mM y se agitaron durante 3 minutos. Se usó un lector ELISA para obtener la DO_{570 \ nm} de cada pocillo con referencia a 630 nm.

Cálculo:

Cada ratón tenía 9 pocillos: tres de control solamente con células esplénicas, tres de control solamente con células diana, y tres pocillos de ensayo con células tanto esplénicas como diana. El índice de actividad de células NK de cada ratón se obtuvo derivando primero la DO promedio de los tres pocillos paralelos de cada combinación, después aplicando esta DO promedio a la siguiente fórmula:

Índice de actividad de células NK = [1-(DO promedio del pocillos de células esplénicas y diana - DO promedio del pocillo solamente de células esplénicas) \textdiv (DO promedio del pocillo solamente de células diana)] x 100%

1.4 El efecto de los péptidos sobre la actividad de linfocitos T en la secreción de IL-2 ^{[5]}

Se recogieron células HT-2 en fase log por centrifugación a 150 g durante 10 minutos, y se lavaron tres veces con solución de Hank fría por resuspensión y centrifugación. Las células HT-2 recogidas se resuspendieron en RPMI-1640 y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 30 minutos. Las células se lavaron adicionalmente dos veces con RPMI-1640 por resuspensión y centrifugación, y se resuspendieron a una concentración final de 2x10^{5}/ml con RPMI-1640.

El sobrenadante obtenido en la sección 1.2 se diluyeron al siguiente porcentaje con RPMI-1640: 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, y 3,125%.

Se diluyó rlL-2 a la siguiente concentración con RPMI-1640: 500 IU/ml, 250 IU/ml, 125 IU/ml, 62,5 IU/ml, 31,25 IU/ml y 15,5 IU/ml.

Se preparó una placa de cultivo celular de 96 pocillos con tres pocillos paralelos por combinación:

: Control negativo: 100 \mul de RPMI-1640 + 100 \mul de suspensión celular HT-2

: Patrón rlL-2: 100 \mul de solución de rlL-2 + 100 \mul de suspensión celular HT-2

: Pocillo de ensayo: 100 \mul de sobrenadante diluido + 100 \mul de suspensión celular HT-2

La placa se incubó a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 68 horas, después se centrifugó a 150 g durante 15 minutos y se retiró el sobrenadante. Se añadieron 100 \mul de 0,5 mg/ml de MTT en RPMI-1640 sin fenolsulfonftaleína en cada pocillo. Después de agitar durante 3-4 minutos para resuspender las células, se continuó incubado durante otras 4 horas. Después se centrifugaron las muestras a 150 g durante 15 minutos y se retiró el sobrenadante. A cada pocillo, se añadieron 120 \mul de HCl-2-propanol 40 mM, se mezclaron durante 3-4 minutos y se analizó la DO a 570 nm, con referencia a 630 nm con un lector de placa ELISA.

Cálculo:

Se tomó la DO promedio de los tres pocillos paralelos de cada dilución y se representó frente a la concentración en un papel semi-log, concentración en el eje X. Se obtuvo la concentración a la saturación de DO al 50% para el ensayo tanto del sobrenadante como de rlL-2.

Actividad de IL-2 de muestra = (dilución de la muestra a la acción máxima al 50% \textdiv la dilución de patrón de rlL-2 a la acción máxima al 50%) x la actividad del patrón de rlL-2 a la acción máxima al 50% (IU/ml)

1.5 El efecto de los péptidos sobre la actividad de linfocitos T en la secreción de interferón (IFN) ^{[6]}

El sobrenadante de la sección 1.2 se diluyó con medio de cultivo RPMI-1640 a los siguientes porcentajes: 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, y 3,125%.

El patrón de interferón recombinante (rIFN) se diluyó con RPMI-1640 a las siguientes concentraciones: 500 IU/ml, 250 IU/ml, 125 IU/ml, 62,5 IU/ml, 31,25 IU/ml, y 15,5 IU/ml.

Las células L929 diana en fase log se ajustaron a 2x10^{5}/ml con RPMI-1640, con el mismo tratamiento que las células HT-2 descrito en la sección 1.4. También se ajustó el VSV de reserva a 100 TCID_{50} con RPMI-1640.

Se preparó lo siguiente en una placa de cultivo de 96 pocillos, tres pocillos paralelos por combinación:

: Pocillo de control negativo: 150 \mul de RPMI-1640 + 100 \mul de L929

: Pocillo de control positivo: 100 \mul de RPMI-1640 + 100 \mul de L929 + 50 \mul de VSV

: Pocillo de actividad rIFN: 100 \mul de patrón de rIFN + 100 \mul de L929 + 50 \mul de VSV

: Pocillo de ensayo: 100 \mul de sobrenadante diluido + 100 \mul de L929 + 50 \mul de VSV

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Las muestras se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 24 horas. Los pocillos de control positivo se observaron periódicamente en un microscopio invertido para confirmar la lisis celular, después se recogieron, se lavaron, y se leyó la DO de todos los pocillos igual que se ha descrito en la sección 1.4.

Cálculo:

Las concentraciones a la acción máxima al 50% se obtuvieron del mismo modo que la sección 1.4. La actividad IFN de la muestra se calcula del siguiente modo:

Actividad IFN de la muestra = (dilución de la muestra a la acción máxima al 50% \textdiv dilución del patrón de rIFN a la acción máxima al 50%) x actividad rIFN del patrón a la acción máxima al 50% (IU/ml)

2. El efecto de los péptidos sobre la formación de anticuerpos ^{[7]}

Se prepararon glóbulos rojos de oveja (SRBC) recogiendo sangre de la vena cervical y se pusieron en un matraz estéril con perlas de vidrio. El matraz se agitó durante 3 minutos y después se mezcló la sangre con solución de Alsever (glucosa 2,05 g, NaCI 0,4 g, limonada Na 0,8 g, ajustada a 100 ml con agua destilada) y se almacenó a 4ºC. Inmediatamente antes de su uso, se centrifugaron las muestras a 130 g, 5 minutos para recoger los SRBC. Las células se lavaron dos veces por resuspensión y centrifugación en solución salina normal. Después se recogió el sedimento celular por centrifugación a 180 g durante 10 minutos y se resuspendió en solución salina para preparar la suspensión de SRBC de trabajo final, al 2% (v/v).

Se preparó el complemento añadiendo 10 volúmenes de suero de cobaya fresco en un volumen de SRBC compactados en centrífuga, y después se agitaron suavemente durante 30 minutos a 4ºC. Los SRBC se retiraron por centrifugación a 200 g durante 10 minutos. Se añadieron 10 volúmenes de solución salina normal para obtener la solución del complemento de trabajo.

Los ratones BALB/c se dividieron aleatoriamente en el grupo de péptido, el grupo de IFN, el grupo de IL-2, y el grupo de solución salina, 10 ratones por grupo. Las sustancias de ensayo se administraron como se ha descrito en la sección 1.1, más inyección intraperitoneal de 0,2 ml de SRBC por ratón en el día 12. En el día después de la última administración de sustancia de ensayo (día 16), se recogió la sangre del canthus ocular y se dejó a temperatura ambiente durante una hora para la exudación del suero. Después de centrifugación a 200 g durante 10 minutos, se diluyó el suero por un factor 500 con solución salina normal.

A 1 ml de suero de ratón diluido de cada ratón, se añadieron 0,5 ml de suspensión de SRBC. Refrigeración en hielo. Después se añadió 1 ml de solución del complemento de trabajo y se incubó en un baño de agua a 37ºC durante 10 minutos. Las reacciones se terminaron por refrigeración en hielo. Las muestras después se centrifugaron a 200 g durante 10 minutos para obtener el sobrenadante.

A 1 ml de este sobrenadante, se añadieron 3 ml de solución de Drabkin y se dejó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se obtuvo la DO_{540 \ nm}.

Cálculo:

La DO_{540 \ nm} de referencia se obtuvo mezclando 0,25 ml de suspensión de SRBC con solución de Drabkin a 4 ml y se pusieron a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de que se tomara la DO_{540 \ nm}.

Índice sérico de la muestra = (DO_{540 \ nm} de la muestra de ensayo \textdiv DO_{540 \ nm} de referencia) x 500

3. El efecto de los péptidos sobre la función de fagocitosis de fagocitos mononucleados y el peso de órganos inmu-nes ^{[8,9]}

Al siguiente día después de la última administración de sustancia de ensayo (día 16), se inyectó a los ratones
0,1 ml/kg de peso corporal de tinta india (dilución de factor 5 con solución salina normal) de la vena de la cola.

Un minuto y cinco minutos después de la inyección de tinta india, se obtuvieron 20 \mul de sangre del canthus ocular con un catéter para entubado heparinizado. La sangre se mezcló con 2 ml de Na_{2}CO_{3} al 0,1% p/v y después se obtuvo la DO_{680 \ nm}. Se calculó el índice K inequívoco por la siguiente fórmula:

4

Clave:

A1: DO a 680 nm en el primer minuto

A2: DO a 680 nm en el quinto minuto

t2: 5 minutos

t2: 1 minuto

Un día después de la última administración de sustancia de ensayo (día 16), se separaron el hígado, el bazo, y la glándula tímica y se transfirieron en seco con papel de filtro y se pesaron. Se calculó en índice de fagocitosis \alpha del siguiente modo:

5

Clave:

W: peso corporal

W_{LS}: peso del hígado más el bazo

Índice de la glándula tímica (%) = (peso del timo/peso corporal) x 100%

Índice del bazo (%) = (peso del bazo/peso corporal) x 100%

Resultados

Debido a la gran cantidad de datos sin procesar implicados, solamente se presentan los resultados finales reunidos. Los grupos sin diferencia estadísticamente significativa del control negativo de solución salina también se omiten.

1. El efecto de los péptidos sobre la transformación de linfocitos T

A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS002, CMS007, CMS008, CMS010, CMS012, CMS015, CMS019,
CMS021, y CMS029 eran capaces de potenciar la transformación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS010 y CMS015 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la siguiente Tabla 1.

TABLA 1

6

7

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A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001, CMS002 y CMS003 eran capaces de estimular la transformación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina, el grupo de
IFN-\gamma, y el grupo de IL-2 (P<0,05). Se descubrió que CMS014 y CMS036 eran capaces de inhibir la transformación de linfocitos T, que tiene diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 2.

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TABLA 2

8

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A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001, CMS003, CMS007, y CMS034 eran capaces de estimular la transformación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05) como se muestra en la Tabla 3.

TABLA 3

9

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A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS008, CMS010, y CMS011 eran capaces de estimular la transformación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05) como se muestra en la Tabla 4.

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TABLA 4

10

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2. El efecto del péptido sobre la actividad citotóxica de células NK

A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS010, CMS013, CMS016, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027,
CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK, con diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos, se descubrió que CMS010, CMS016, y CMS030 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 5.

TABLA 5

12

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A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001, CMS003, CMS015, CMS021, CMS026, y CMS035 eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS021 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05). Se descubrió que CMS012 era capaz de inhibir la actividad citotóxica de células NK, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 6.

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TABLA 6

13

14

A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS020, CMS024, CMS034, y CMS036 eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS008 y CMS009 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 7.

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TABLA 7

15

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A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS002, CMS011, CMS012, CMS022, CMS028, y CMS035 eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Se descubrió que CMS008 era capaz de inhibir la actividad citotóxica de células NK, que tiene diferencia estadística significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 8.

TABLA 8

16

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3. El efecto de los péptidos sobre la actividad de linfocitos T en la secreción de IL-2

A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS007, CMS009, CMS010, y CMS015 eran capaces de promover la secreción de IL-2 por linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS007 y CMS015 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS009 y CMS010 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 9.

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TABLA 9

17

18

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A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001 y CMS003 eran capaces de promover la actividad de linfocitos T en la secreción de IL-2, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS003 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 10.

TABLA 10

19

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A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS007, CMS012, y CMS020 eran capaces de promover los linfocitos T en la secreción de IL-2, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05) como se muestra en la Tabla 11.

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TABLA 11

20

21

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A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS010, CMS011, CMS012, CMS022; y CMS034 eran capaces de promover los linfocitos T en la secreción de IL-2, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS034 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS011 y CMS022 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 12.

TABLA 12

22

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4. El efecto de los péptidos sobre la actividad de linfocitos T en la secreción de IFN

A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS010, CMS013, y CMS016 eran capaces de promover los linfocitos T en la secreción de interferón (IFN), que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina, el grupo de IFN-\gamma, y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 13.

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TABLA 13

24

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A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001, CMS003, y CMS021 eran capaces de promover los linfocitos T en la secreción de IFN que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS021 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 14.

TABLA 14

25

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A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS009 y CMS012 eran capaces de promover los linfocitos T en la secreción de IFN que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS009 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 15.

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TABLA 15

27

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A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS010, CMS011, CMS022, y CMS028 eran capaces de promover los linfocitos T en la secreción de IFN, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS010 y CMS022 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 16.

TABLA 16

28

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5. El efecto de los péptidos sobre la formación de anticuerpos

A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011,
CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024,
CMS029, MS033, y CMS035 eran capaces de promover la formación de anticuerpos anti-SRBC, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS013, CMS019, CMS024, y CMS035 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS014, CMS015, CMS016, CMS020, CMS023, CMS029, y CMS033 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 17.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 17

29

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A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS003, CMS011, CMS012, CMS013, CMS015, CMS021, CMS022, CMS023, CMS026, CMS027, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de promover la formación de anticuerpos anti-SRBC, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS011, CMS013, y CMS015 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS021, CMS022, CMS023, CMS026, CMS027, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 tienen diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05). Se descubrió que CMS009 era capaz de inhibir la formación de anticuerpos anti-SRBC, que tiene diferencia estadística significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 18.

TABLA 18

30

31

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A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS011, CMS012, CMS013, CMS015, CMS016, CMS019, CMS020, CMS021, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029,
CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de promover la formación de anticuerpos anti-SRBC, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS003, CMS008, CMS009, CMS012, CMS015, CMS016, CMS020, y CMS021 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS001, CMS007, CMS011, CMS019, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033,
CMS034, CMS035, y CMS036 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 19.

TABLA 19

32

33

A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS021, CMS023, CMS024, CMS027, y CMS033 eran capaces de promover la formación de anticuerpos anti-SRBC, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS021 y CMS033 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS023, CMS024, y CMS027 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05). Además, se descubrió que CMS002, CMS003, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS018, CMS019, CMS020, CMS026, CMS028, CMS029, CMS030, CMS034, y CMS036 eran capaces inhibir la formación de anticuerpos anti-SRBC, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 20.

TABLA 20

34

35

6. El efecto de péptidos sobre la actividad fagocítica de fagocitos mononucleados

A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS003, CMS008, CMS020, CMS022, y CMS024 eran capaces de potenciar la actividad fagocítica de fagocitos mononucleados, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS022 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 21.

TABLA 21

36

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A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS019, CMS024, y CMS030 eran capaces de potenciar la actividad fagocítica de fagocitos mononucleados, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS019 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 22.

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TABLA 22

37

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A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS003*, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS016, CMS018, CMS019, y CMS035 son capaces de potenciar la actividad fagocítica de fagocitos mononucleados, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS003, CMS009, CMS010, CMS016, CMS019, y CMS035 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 23.

TABLA 23

38

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A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS024, CMS027, y CMS036 eran capaces de potenciar la actividad fagocítica de fagocitos mononucleados, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS024 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 24.

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TABLA 24

39

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7. El efecto de los péptidos sobre el peso de los órganos inmunes

A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS008, CMS010, CMS016, CMS019, CMS020, CMS022, CMS026,
CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de aumentar el peso de la glándula tímica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS027 y CMS034, tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS008, CMS022, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, y CMS035 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 25.

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TABLA 25

41

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A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS019 era capaz de aumentar el peso del bazo, con diferencia estadísticamente significativa de los grupos de control de solución salina (P<0,05) como se muestra en la Tabla 26. Se descubrió que CMS001, CMS003, CMS007, CMS009, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS021, CMS023, CMS024, CMS027, y CMS036 eran capaces de disminuir el peso del bazo, con diferencia estadísticamente significativa del grupo de control de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 26.

TABLA 26

43

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A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS002, CMS008, CMS012, CMS014, CMS016, CMS018, CM019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, y CMS036 eran capaces de aumentar el peso de la glándula tímica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS034 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS002, CMS008, CMS012, CMS014, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS030, CMS032, y CMS036 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 27.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 27

44

A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS008, CMS010, y CMS029 eran capaces de disminuir el peso del bazo, con diferencia estadísticamente significativa del grupo de control de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 28.

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TABLA 28

46

A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001, CMS002, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS028, CMS029,
CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, y CMS036 eran capaces de aumentar el peso de la glándula tímica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS002, CMS014, CMS024, y CMS030 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS010, CMS012, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS026, CMS028, CMS032, CMS034, y CMS036 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 29.

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TABLA 29

47

A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS030 era capaz de aumentar el peso del bazo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Se descubrió que CMS015 era capaz de disminuir el peso del bazo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 30.

TABLA 30

49

50

A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS002, CMS008, CMS010, CMS012, CMS014, CMS018, CMS020, CMS022, CMS026, CMS028, CMS030, y CMS032 eran capaces de aumentar el peso de la glándula tímica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS008 y CMS012 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS002, CMS020, y CMS030 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 31.

TABLA 31

51

A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS020 era capaz de aumentar el peso del bazo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina, el grupo de IFN-\gamma, y el grupo de IL-2 (P<0,05). Se descubrió que CMS001 era capaz de disminuir el peso del bazo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 32.

TABLA 32

52

En resumen, se descubrió que los péptidos CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022,
CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 tenían actividades biológicas in vivo en el modelo animal ensayado.

II. El efecto antiviral in vivo de los péptidos

Para descubrir si estos péptidos tienen un posible efecto terapéutico sobre infecciones víricas, en este estudio usamos el modelo animal de infección por hepatitis B en pato para probar los efectos in vivo de los péptidos anteriores sobre animales enfermos.

Se estableció el modelo de hepatitis B en patos Chongqing y se trataron con péptidos mediante inyección intraperitoneal (50 \mug/kg/día, una vez al día) durante 4 semanas. El nivel en suero de ADN del DHBV se analizó mediante hibridación por transferencia en manchas de suero. Se usaron lamivudina y solución salina normal como control positivo y negativo respectivamente. Se descubrió que el péptido CMS001 era capaz de reducir el nivel en suero de ADN de DHBV a la 4ª semana de tratamiento, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control de solución salina (p<0,05). Se concluye que CMS001 a un nivel de dosificación adecuado puede usarse como una parte, o en sí mismo, para la gestión de la infección de hepatitis vírica.

Materiales y métodos 1. Los péptidos se sintetizaron a petición del cliente por American Peptide Company, Inc., USA, a partir de L-aminoácidos. 2. Modelo animal ^{[1]}

Se inocularon patos Chongqing de un día de edad con 0,1ml de suero de reserva positivo para ADN del virus de la Hepatitis B de pato (DHBV) (5 x 10^{7} copias/ml) mediante inyección intraperitoneal. Una semana después, se recogieron muestras de sangre de la vena yugular externa y la infección se confirmó mediante hibridación por transferencia en mancha con una sonda de ADN de DHBV marcada con digoxina ^{[2]}. Los patos se criaron hasta 2 semanas de edad para entrar en el estudio.

3. Agrupamiento y tratamiento

Los patos infectados por DHBV se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos:

a): Grupo de control negativo (n=9): se administró solución salina normal, 1 ml por pato mediante inyección intraperitoneal, una vez al día.

b): Grupo de lamivudina (n=8): Como grupo de control positivo. Se administró lamivudina ^{[4]} a 50 mg/kg/día mediante administración oral, una vez al día.

c): Grupo del péptido (n=9): se administraron 50 \mug/kg/día de péptido (ajustado a un volumen final de 0,5 a 1 ml con solución salina normal) una vez al día mediante inyección intraperitoneal. El tratamiento duró 4 semanas y la observación continuó durante otra semana después de la finalización del tratamiento. Se extrajeron muestras de sangre de 1 ml de la vena yugular externa de los patos los días 0, 7, 14, 21, 28 y 35 cuando comenzó el tratamiento. Los sueros de las muestras de sangre se aislaron inmediatamente ^{[3]} y se almacenaron a -20ºC hasta el análisis.

4. Determinación del nivel de ADN de DHBV en suero

La sonda de ADN de DHBV se marcó con fluorescencia de acuerdo con el protocolo del kit de marcado del fabricante del kit (Amersham Pharmacia Biotech Co.). Se sometieron a transferencia en mancha 40 \mul de sueros de pato (1 mancha duplicada por muestra) sobre una membrana de nitrocelulosa e hibridaron con sonda de ADN de DHBV marcada por fluorescencia para la cuantificación ^{[2]}. Después de completar la hibridación, las manchas se desarrollaron en reactivo de fluorimetría RPN3690 de CDP-Star y se barrieron con un escáner Vuego Scan (Brisa-620st). Se usó el software ImageMaster TotalLab v1.11.Ink para el análisis cuantitativo de las manchas. El análisis estadístico se realizó de acuerdo con el test t por parejas con el software SPSS.

Resultados

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TABLA II.1. Valoración del ADN de BHBV antes y después del tratamiento

53

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El grupo de control negativo (solución salina normal) y positivo (lamivudina) demostraron un establecimiento con éxito del modelo animal de hepatitis. A 50 \mug/kg/día, se descubrió que el péptido CMS001 era capaz de disminuir el valor de ADN de DHBV en suero después de 4 semanas de tratamiento, que tiene una diferencia estadísticamente significativa (p<0,05) del valor de tratamiento anterior de los mismos animales. Tras la finalización del tratamiento, el valor de ADN de DHBV en suero rebotaba hasta un valor sin diferencia estadística de este tratamiento anterior, mostrando que el efecto del péptido CMS001 puede ser reversible y/o no necesitar un periodo de tratamiento más largo para la erradicación del virus.

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Discusión

El modelo animal de la hepatitis de pato ^{[1]} es un modelo experimental establecido para estudios de patogenia de hepatitis B humana y para la selección de agentes terapéuticos de hepatitis B. En este estudio, se descubrió que CMS001 era capaz de disminuir el valor en suero de ADN de DHBV después de 4 semanas de tratamiento, lo que indicaba que el péptido CMS001 a un nivel de dosis adecuado y con un esquema de aplicación adecuado, puede ser útil por sí mismo o en combinación con otras sustancias como agente para la gestión de la hepatitis B humana.

En el presente estudio, se ensayó la administración mediante inyección intraperitoneal, pero esto no excluye la posible eficacia del péptido si se administra mediante otras vías alternativas. Los péptidos pueden administrarse por inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección subcutánea, e implante subcutáneo con o sin un dispositivo facilitador tal como liposoma, protección de liberación sostenida, etc. El péptido también puede administrarse en cualquier forma de administración oral como comprimido, cápsula, suspensión, solución etc., en la forma habitual sin modificación o en forma de liberación lenta, o con o sin protección gastro-entérica. El péptido puede aplicarse adicionalmente en cualquier forma de aplicación tópica como pomada, crema, gel etc. con o sin un dispositivo de facilitación transdérmica o como inhalante de polvo, disuelto, o como forma protegida por liposoma. El péptido también puede interpretarse en su secuencia génica y clonarse en un sistema de expresión, en sí mismo o en combinación con otras secuencias peptídicas, para generar una molécula peptídica resultante para hacer uso de la actividad del péptido descrito en esta memoria, con o sin purificación del péptido resultante.

TABLA II.2. Péptidos Eficaces para Hepatitis B

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Referencias

1. Chen Yaxi, Guo shuhua, Zhang Dingfeng, et al. Foundation and application of Chongqing duck hepatitis B model. Chinese Journal of Hepatology. 1993; 1(2): 89-91

2. Chen Yaxi, Guo shuhua, Chen Xuehua. Preparation and application of DHBV DNA probe labeled with digoxin. Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 1994; 19(4): 295-297

3. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. Systemic foundation and application of serological parameters of humoral immunity to duck hepatitis B virus. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(1): 13-15

4. Chen Yaxi, Guo shuhua, Qi Zhenyuan, et al. An experimental study of lamivudine against duck hepatitis B virus in combination with famciclovir. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(4): 209-211

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III. Efecto de los péptidos sobre la nefritis

Para descubrir si estos péptidos tienen un posible efecto terapéutico sobre la nefritis, usamos el modelo animal de nefritis de Masugi en rata en este estudio para ensayar los efectos in vivo de los péptidos anteriores en animales enfermos ^{[3,4]}.

El objetivo de este estudio es investigar el efecto terapéutico in vivo de los péptidos sobre glomerulonefritis crónica. El modelo de nefritis de Masugi en rata se construyó inyectando IgG de conejo anti-corteza renal de rata en ratas Sprague Dawley sanas, y a continuación se trataron inmediatamente con inyección intraperitoneal de péptidos a 50 \mug/kg/día, una vez al día durante 3 semanas. Se usó Hidrocortisona como control positivo. Se descubrió que la proteinuria, el nivel de creatinina en suero, y el índice esplénico de las ratas tratadas con CMS014, CMS018, CMS030, y CMS036 se rebajaban en comparación con los del grupo de control, con significación estadística (p<0,05). El examen microscópico post-mortem del riñón mostró que el efecto terapéutico de estos péptidos era similar al tratamiento con hidrocortisona. Se concluyó que CMS014, CMS018, CMS030, y CMS036 pueden usarse como medio para la gestión de la nefritis crónica.

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Materiales

Las ratas Sprague Dawley (SD), machos, con un peso de 120\pm20 g, eran del Center of Experimental Animal, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, y también de First Military Medical University. Conejos Chinchilla que pesaban 3 kg eran del Center of Experimental Animal, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine.

Los péptidos, originados a partir de L-aminoácidos, se sintetizaron a petición del cliente por American Peptide Company, Inc, USA, y se diluyeron a 10 \mug/ml en solución salina normal estéril. La hidrocortisona era de Yangzhou Pharmaceutical Factory, China.

El kit de determinación de creatinina en suero de Shanghai Rongsheng Biological Technique Company, PR China.

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Métodos

1. Preparación de anti-suero de conejo anti-corteza renal de rata ^{[1]}: 20 ratas SD sanas se anestesiaron con inyección intravenosa de pentobarbital sódico al 3%, 40 mg/kg. La aorta abdominal se expuso y los riñones se perfundieron con solución salina normal hasta que estaban limpios de sangre. La corteza renal se aisló, se homogeneizó en 5 volúmenes de tampón Tris-HCl 0,01 M, pH 8,1, y se filtró a través de una malla de acero inoxidable de calibre 140. El filtrado se recogió y se mezcló con adyuvante completo o incompleto de Freund de GIBCO-RRE a 1:1 y se emulsionó para obtener la solución de inmunización de trabajo.

10 conejos sanos se inmunizaron con las soluciones de inmunización, en primer lugar con adyuvante completo de Freund y posteriormente con el incompleto. El antígeno se inyectó por vía hipodérmica mediante 6 puntos aleatorios, 0,1 ml por punto, una vez cada 10 días. A partir de la 6ª semana en adelante, se recogió sangre de la vena auricular y el valor de anticuerpo se determinó mediante el método de doble difusión ^{[2]}. A la 8ª semana después del inicio de la inmunización, los conejos se anestesiaron con inyección intravenosa de pentobarbital sódico al 3%, 20 mg/kg, y se recogió sangre de la arteria carótida. El anti-suero se exudó y aisló a continuación.

Se recogió sangre completa de 15 ratas SD sanas. El eritrocito se aisló y se lavó tres veces con solución salina normal. El eritrocito limpio se mezcló con 250 ml de anti-suero de conejo y se incubó a 4ºC durante una noche. Después de la incubación, el eritrocito se retiró mediante centrifugación y el sobrenadante se inactivó adicionalmente a 56ºC durante 30 minutos. Después de la centrifugación para retirar cualquier precipitado, se aisló IgG en bruto y se purificó parcialmente a partir del sobrenadante mediante precipitación con (NH_{4})_{2}SO_{4} tres veces (50%, 33%, y después 33%) ^{[5]}. La IgG en bruto se disolvió en 125 ml de agua destilada doble y se dializó para limpiarla de sulfato de amonio. El valor del anticuerpo anti-corteza renal de rata se determinó mediante el método de doble difusión ^{[2]}.

2. Inducción de glomerulonefritis de rata ^{[5]}: 0,25 ml de solución sensibilizadora (que contenía aproximadamente 4 mg de IgG no específica de conejo con adyuvante completo de Freund) se inyectaron por vía intraperitoneal en ratas SD sanas para sensibilizar a las ratas cinco días antes de la inducción. A excepción del grupo de control sano normal que recibía solución salina normal, todos los grupos se indujeron posteriormente mediante inyección intraperitoneal de 1 ml de IgG de conejo anti-corteza renal de rata preparada como se ha descrito en la sección del Método 1.

3. Agrupamiento y administración: ratas SD macho se asignaron aleatoriamente en grupos de control sano normal (normal), control de tratamiento de nefritis con placebo (placebo), tratamiento de nefritis con péptido, y el control de tratamiento de nefritis con hidrocortisona (hidrocortisona), 12 por grupo. El tratamiento se iniciaba el día de la inducción. Péptidos a 50 \mug/kg/día, hidrocortisona a 3,3 mg/kg/día, y solución salina normal que se usó como placebo, todos administrados por vía intraperitoneal una vez al día y se prolongó durante 3 semanas.

4. Parámetros monitorizados ^{[4]}:

(a): nivel de proteína en la orina: cada rata se mantuvo individualmente en una jaula. Se suministró el agua para beber adecuada. La orina se recogió una vez a la semana, 24 horas por vez. El contenido de proteína de la orina se determinó mediante el método de azul de Coomassie.

(b): nivel de creatinina en suero: se recogió sangre después de tres semanas de tratamiento y se realizó la determinación del nivel de creatinina en suero. El kit de creatinina fue proporcionado por Shanghai Rongsheng Biological Technique Company.

(c): índice de peso del bazo: el índice de peso del bazo se determinó mediante la siguiente fórmula: Índice de peso del bazo = peso medio del bazo/peso corporal medio

(d): Examen microscópico patológico del riñón: se seleccionaron los 6 riñones más pesados de cada grupo para el examen patológico.

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Análisis estadístico

Se usó el test t para comparaciones entre grupos, el límite se estableció a p<0,05. Para todos los grupos, las dos ratas con los niveles de proteína urinaria más bajos se excluyeron del análisis estadístico.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Resultado 1. El efecto del tratamiento con péptidos sobre el nivel del proteínas en la orina TABLA III.1. El efecto del tratamiento con péptidos sobre el nivel de proteínas en la orina (unidad:mg)

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Se descubrió que los péptidos CMS014, CMS018, CMS030, y CMS036 a 50 \mug/kg/día una vez al día pueden rebajar el nivel de proteínas en la orina del modelo de nefritis de Masugi en rata, con diferencia estadísticamente significativa del grupo de control tratado con placebo, p<0,05. También se observó que la velocidad de crecimiento de los grupos de CMS014, CMS030, CMS036, e hidrocortisona tienen una velocidad de crecimiento menor de la normal. La velocidad de crecimiento del grupo de hidrocortisona se redujo en tal medida después de la primera semana, que la dosis de tratamiento tuvo que dividirse a la mitad para evitar intolerancia grave.

2. El efecto del tratamiento con péptidos sobre el nivel del creatinina en suero TABLA III.2. La influencia de los péptidos sobre el nivel de creatinina en suero

57

El nivel de creatinina en suero de ratas con nefritis de Masugi que recibían tratamiento con placebo era mucho más alto que el del grupo de control normal, mostrando que la función renal de las ratas con nefritis era anormal. Se descubrió que los péptidos CMS014, CMS018, CMS030, y CMS036 a 50 \mug/kg/día una vez al día eran capaces de rebajar el nivel de creatinina en suero, con diferencia estadísticamente significativa de las ratas de nefritis con tratamiento con placebo.

3. El efecto de los péptidos sobre los índices esplénicos

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TABLA III.3. El efecto de los péptidos sobre el índice esplénico (x10^{-3})

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Los bazos de todas las ratas inducidas aumentaban de tamaño en comparación con las ratas normales, mostrando que la inducción de nefritis estaba relacionada con la respuesta inmune. Se descubrió que los péptidos CMS014, CMS018, CMS030, y CMS036 a 50 \mug/kg/día una vez día al eran capaces de disminuir el índice esplénico, con diferencia estadísticamente significativa del grupo de ratas con nefritis que recibían el tratamiento con placebo, p< 0,05.

Esto sugería que los péptidos podrían ejercer su efecto corrector contra la nefritis a través de mecanismos de inmunosupresión.

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4. Los efectos de los péptidos sobre el examen microscópico patológico renal

En comparación con ratas normales, las ratas con nefritis que reciben tratamiento con placebo (grupo de placebo) mostraban signos de formación de tejido fibroso en la cápsula glomerular, hiperplasia del epitelio glomerular, formación de drepanocitos, dilatación y congestión de capilares glomerulares, edema del epitelio del túbulo proximal, y formación de cilindros en el túbulo distal y el conducto recolector. Estos cambios patológicos confirmaban la inducción con éxito de la nefritis. Se observó que, en el grupo de CMS014, solamente había una rata que mostraba signos de formación de tejido fibroso en la cápsula glomerular e hiperplasia del epitelio glomerular. Otros parámetros de la misma rata, y otras ratas del mismo grupo tienen esencialmente la misma histología renal que las ratas normales. En los grupos de CMS018, CMS030, y CMS036, todos los parámetros patológicos de todas las ratas eran normales.

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Conclusión

Se concluyó que los péptidos CMS014, CMS018, CMS030, y CMS036 a 50 \mug/kg/día, una vez al día, administrados por vía intraperitoneal pueden tener efecto terapéutico sobre el modelo experimental en rata de nefritis de Masugi. La proteinuria, excreción de creatinina, y la histología renal de las ratas tratadas se corrigieron mediante estos péptidos, con diferencia estadísticamente significativa del grupo de control que recibía tratamiento con placebo. Estos péptidos pueden actuar a través de mecanismos inmunológicos como se indica mediante su influencia sobre el índice de peso del bazo, pero esto no excluye la posibilidad de acciones mediante otros mecanismos.

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Discusión

Los péptidos CMS014, CMS018, CMS030, y CMS036 pueden ser útiles como parte, o en sí mismos, en la gestión de nefritis en el ser humano. Por ejemplo, los péptidos pueden usarse para corregir proteinuria o para restaurar las funciones excretoras de pacientes con nefritis. Los péptidos también pueden usarse para prevenir una alteración adicional de la función renal en pacientes con nefritis. Los péptidos pueden usarse en sí mismos, en combinaciones de dos o más péptidos, o en combinación con otros productos farmacéuticos o suplementos alimenticios como un transcurso total para la gestión de la nefritis.

TABLA III.4. Péptidos eficaces para nefritis

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Referencias

1. SDA (State Drug Administration, P.R.China). The guideline of preclinical researches of new drugs. 1994, the 1 st edition, Page 96

2. Xu Shuyun, et al. The methodology of pharmacological experiment, the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, the 2nd edition, 1991: 1071.

3. Chen Qi, et al. The methodology of pharmacological researches of traditional Chinese medicine, the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, the 1st edition. 1993: 390.

4. Du Guanhua. The guideline for pharmacological experiment - - -the discovery and pharmacological evaluation of new drugs, Science Publishing Company, Beijing, the 1st edition, 2001: 598.

5. Wang Shuxian. Nephrology, the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, the 11th edition, 1987: 244.

IV. Efecto de los péptidos cms sobre el cáncer

Para descubrir si estos péptidos tienen posible efecto terapéutico sobre el cáncer, se usaron diversos modelos animales de cáncer convencionales en este estudio para ensayar los efectos biológicos de los anteriores péptidos sobre animales enfermos.

Materiales 1. Animales experimentales

Ratones BALB/c, ratones C_{57}BL/6, y ratones DBA/2, que pesan 18-22 g, del China Medical Science Institute, RP de China.

2. Líneas celulares

Células S_{180} de sarcoma de ratón, células B_{16}, y células L_{1210}, del Cancer Research Department, China Medical Science Institute.

Células YAC-1, como obsequio del Prof. Yao Zhi, Tianjin Medical University.

3. Fármaco y reactivo principales

Los péptidos usados en este estudio se fabricaron a petición del cliente por American Peptide Company, Inc., USA.

Suero fetal bovino, medio de cultivo celular RPMI-1640, de Gibco, USA.

MTT, ConA, de Sigma, USA.

Interferón \gamma de ratón recombinante (rmlFN-\gamma), de Beijing Biotech Inc., RP de China.

Interleuquina-2 humana recombinante (rhIL-2), de Shanghai Huaxin Biotech Inc., RP de China.

Solución de separación de linfocitos, del Research Institute of Hematologic Disease, National Institute of Medical Science, RP de China.

Ciclofosfamida, de The 12the pharmaceutical factory of Shanghai, RP de China.

Métodos 1. Administración de sustancia de ensayo

Inyección intraperitoneal, una vez al día. Con la excepción del grupo de ciclofosfamida, todos los grupos empezaron el tratamiento 5 días antes del transplante de las células cancerosas. Los grupos de ciclofosfamida se trataron el siguiente día después del transplante de las células cancerosas. El tratamiento de todos los grupos con sustancia de ensayo duró 30 días o hasta que el animal murió a menos que se indique otra cosa.

2. El efecto de los péptidos sobre la velocidad de crecimiento de células de sarcoma S_{180} transplantadas en ratones BALB/c, y sobre la función inmunológica del hospedador

Los ratones BALB/c se asignaron aleatoriamente en el grupo de péptido, el grupo de ciclofosfamida, el grupo de rmlFN-\gamma, el grupo de rhIL-2, y el grupo de solución salina, 20 animales por grupo.

Se incubaron células de sarcoma S_{180} de reserva en medio DMEM/F12 suplementado con suero fetal bovino al 10%, 37ºC, CO_{2} al 5% durante 72 h, después se lavaron 3-4 veces con solución de Hank a temperatura ambiente. La concentración celular se ajustó a 1-2 x 10^{9} por litro con solución de Hank. Se implantaron 0,2 ml de suspensión celular a varios ratones BALB/c a través de la pata delantera durante 10-12 días. Los ratones se sacrificaron por dislocación de la vértebra cervical. Se recogieron masas tumorales de crecimiento vigoroso y no alteradas y se limpiaron por lavado con solución salina estéril. El tejido se dispersó en solución salina hasta una suspensión celular homogénea, en una proporción de 1 g de tejido a 4 ml de solución salina. El modelo de ratón que alberga sarcoma se preparó con una inyección de 0,2 ml de suspensión celular a través de la pata delantera [1]. La administración del tratamiento con sustancia de ensayo empezó como se ha descrito en el método de la sección 1.

2.1 El efecto de los péptidos sobre la función fagocítica de fagocitos mononucleados en ratones con sarcoma S_{180} [2,3] se analizó inyectando a los ratones desde la vena de la cola 0,1 ml/10 g de peso corporal de tinta india (dilución 1:5 con solución salina normal) en el segundo día después de la última administración de sustancia de ensayo. A un minuto y cinco minutos después de la inyección, se obtuvieron 20 \mul de sangre del canthus ocular con un catéter para entubado heparinizado. La sangre se mezcló con 2 ml de Na_{2}CO_{3} al 0,1% p/v y después se obtuvo la DO_{680 \ nm}. El índice K inequívoco se calculó por la siguiente fórmula:

60

Clave:

A1: DO_{680 \ nm} en el primer minuto

A2: DO_{680 \ nm} en el quinto minuto

t2: 5 minutos

t2: 1 minuto

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Después del estudio del índice de fagocitosis, los ratones se sacrificaron por dislocación de la vértebra cervical. Se diseccionaron el hígado, el bazo, y el tejido canceroso, se transfirieron en seco, y se pesaron.

El índice de fagocitosis \alpha se calculó del siguiente modo:

61

Clave:

W: peso corporal

W_{LS}: peso del hígado más el bazo

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2.2 El índice de inhibición del crecimiento tumoral se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:

Índice de inhibición del crecimiento tumoral = (peso medio del tumor del grupo de control - peso medio del tumor del grupo de tratamiento) \textdiv peso medio del tumo del grupo de control

3. El efecto de los péptidos sobre la supervivencia de ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico

Los ratones BALB/c se asignaron aleatoriamente en el grupo de péptido, el grupo de ciclofosfamida, el grupo de rmlFN-\gamma, el grupo de rhIL-2 y el grupo de solución salina, 20 animales por grupo.

Se incubaron células H_{22} de reserva en medio DMEM/F12 suplementado con suero fetal bovino al 10%, 37ºC/CO_{2} al 5% durante 72 h, después se lavaron 3-4 veces con solución de Hank a temperatura ambiente. La concentración celular se ajustó a 1-2 x 10^{9} por litro con solución de Hank. Se implantaron 0,2 ml de la suspensión celular en la cavidad abdominal de varios ratones BALB/c durante 6-8 días [1]. Los ratones se sacrificaron por dislocación de la vértebra cervical. Se recogió el fluido ascítico de los ratones asépticamente y la concentración celular se ajustó a 1 x 10^{6} por ml con solución de Hank. Se implantaron 0,2 ml de la suspensión celular en la cavidad abdominal de ratones sanos para generar el modelo de ratón que porta H_{22} para el cáncer hepático de tipo fluido ascítico. La administración de sustancia de ensayo empezó como se ha descrito en el método de la sección 1. Se registraron los datos de supervivencia de los ratones. Si el animal sobrevivía más tiempo que el experimento, los días de supervivencia se registraban como la duración del experimento. Se obtuvo la media de días de supervivencia por el método de Kaplan-meier en la opción de Supervivencia del software SPSS. El índice de supervivencia se calculó de acuerdo con la siguiente
fórmula:

Índice de supervivencia = (días de supervivencia media en el grupo de tratamiento - días de supervivencia media del grupo de control) \textdiv días de supervivencia media del grupo de control x 100%

4. El efecto de los péptidos sobre la inmunidad celular de ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico 4.1 Preparación de suspensión celular esplénica ^{[1,4]}

Ratones BALB/c sanos se asignaron aleatoriamente en el grupo de péptido, el grupo de rmIFN-\gamma, el grupo de rhIL-2, y el grupo de solución salina, 15 ratones por grupo, y se prepararon en el modelo de ratón portador de H_{22} como se ha descrito en el método de la sección 3. Después del implante de las células cancerosas, se administraron las sustancias de ensayo durante 15 días, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical. Se aisló el bazo asépticamente y se dispersó manualmente en solución de D-Hank fría usando una aguja de inyección. La suspensión celular dispersada se tamizó adicionalmente a través de un tamiz de acero inoxidable de 150 \mum de diámetro de calibre 100. Después de centrifugación a 200 g durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante. Se resuspendió el sedimento celular en 10 volúmenes de tampón Tris-NH_{4}Cl y después se mantuvo en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células suspendidas se recogieron por centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Las células se lavaron 2-4 veces con solución de D-Hank fría resuspendiendo y recogiendo por centrifugación con las condiciones como se ha descrito anteriormente. Después las células lavadas se diluyeron a las densidades celulares deseadas por medio de cultivo RPMI-1640, que contenía suero fetal bovino al 10%.

4.2 El efecto de los péptidos sobre la transformación de linfocitos T en ratones con cáncer hepático H_{22} de tipo fluido ascítico ^{[1,4]}

Se colocaron células esplénicas de densidad 1 x 10^{6}/ml en una placa de cultivo celular de 96 pocillos, 100 \mul/pocillo, tres pocillos paralelos cada uno de la muestra de ensayo y la muestra de control por ratón. A los pocillos de ensayo, se añadieron 100 \mul/pocillo de ConA de 100 \mug/ml en RPMI-1640, y se usaron 100 \mul/pocillo de RPMI-1640 sencillo para los controles. Las células se incubaron durante 66 h a 37ºC, CO_{2} al 5%. Las células después se sedimentaron por centrifugación a 150 g durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió y se almacenó a -20ºC para la determinación de citoquinas IL-2 e IFN.

Se añadieron 50 \mul/pocillo de MTT de 1 mg/ml en RPMI-1640 al sedimento celular y las células se resuspendieron por agitación durante 2 minutos. La incubación se continuó durante 4 horas. Se desechó el sobrenadante después de centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Se añadieron 120 \mul de HCl-2-propanol 40 mM al sedimento celular y se agitó durante 3 minutos. Se usó un lector ELISA para obtener la DO_{570 \ nm} de cada pocillo con referencia a 630 nm.

4.3 El efecto de los péptidos sobre la actividad de células NK en ratones con cáncer hepático H_{22} de tipo fluido ascítico ^{[5,6]}

Se prepararon células esplénicas de ratón a 4x10^{6}/ml como se ha descrito en la sección 4.1 anterior. Las células YAC-1 diana se llevaron a fase log y se ajustaron a 1x10^{5}/ml. Usando una placa de cultivo celular de 96 pocillos, se añadieron 100 \mul de células esplénicas de ratón y 100 \mul de medio de cultivo al pocillo de control que contenía solamente las células esplénicas; se añadieron 100 \mul de células diana y 100 \mul de medio de cultivo al pocillo de control que contenía solamente células diana; se añadieron 100 \mul de células esplénicas de ratón y 100 \mul de células diana al pocillo de ensayo de la actividad NK. Se prepararon tres series paralelas de lo anterior por ratón. Después de eso las placas de cultivo celular de 96 pocillos se incubaron durante 4 h a 37ºC, CO_{2} al 5%.

Las muestras se centrifugaron a 150 g durante 10 minutos para recoger las células. Se desechó el sobrenadante y se añadieron 50 \mul/pocillo de MTT de 1 mg/ml. La mezcla de reacción después se agitó durante 2 minutos, y se incubó a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 4 horas. Se desechó el sobrenadante después de centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Se añadieron 120 \mul de HCl-2-propanol 40 mM y se agitaron durante 3 minutos. Se usó un lector ELISA para obtener la DO_{570 \ nm} de cada pocillo con referencia a 630 nm.

Cada ratón tiene 9 pocillos: tres de control solamente con células esplénicas, tres de control solamente con células diana, y tres pocillos de ensayo tanto con células esplénicas como células diana. El índice de actividad de células NK de cada ratón se obtuvo derivando primero la DO promedio de los tres pocillos paralelos de cada combinación, después aplicando esta DO promedio a la siguiente fórmula:

Índice de actividad de células NK = [1-(DO promedio del pocillo de células esplénicas y diana - DO promedio del pocillo de células esplénicas solamente) \textdiv (DO promedio del pocillo de células diana solamente)] x 100%

5. El efecto de los péptidos sobre la supervivencia de ratones DBA/2 con leucemia L_{1210} transplantada

Se asignaron aleatoriamente ratones DBA/2, de 6-8 semanas de edad, en el grupo de péptido, el grupo de ciclofosfamida, el grupo de rmIFN-\gamma, el grupo de rhIL-2, y el grupo de solución salina, 20 animales por grupo.

Se incubaron células L_{1210} de reserva en medio DMEM/F12 suplementado con suero fetal bovino al 10%, 37ºC/CO_{2} al 5% durante 72 h, después se lavaron 3-4 veces con solución de Hank, y se ajustaron a 1x10^{5} células por litro. Se implantó 0,1 ml de la suspensión celular en la cavidad abdominal de varios ratones DBA sanos durante 6-8 días. Los ratones después se sacrificaron por dislocación de la vértebra cervical y se recogió su fluido ascítico asépticamente. La concentración celular del fluido ascítico recogido se ajustó a 1x10 por ml con solución de Hank. Se implantó 0,1 ml de la suspensión celular en cada uno de los animales de ensayo y se registraron los datos de supervivencia de los animales. El tratamiento empezó en los animales de ensayo como se ha descrito en el método de la sección 1. La media de días de supervivencia se obtuvo por el método de Kaplan-meier en la opción de Supervivencia del software SPSS. Si el animal sobrevivía más tiempo que el experimento, los días de supervivencia se introducían como la duración del experimento. El índice supervivencia se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:

Índice de supervivencia = (días de supervivencia media del grupo de tratamiento - días de supervivencia media del grupo de control) \textdiv días de supervivencia media del grupo de control

6. El efecto de los péptidos sobre la inmunidad humoral de ratones C_{57}BL/6 portadores de melanoma B_{16} transplantado, y sobre el potencial metastásico de las células de melanoma inoculadas

Se asignaron aleatoriamente ratones C_{57}BL/6, de 6-8 semanas de edad, 18-22 g de peso corporal, en el grupo de péptido, el grupo de ciclofosfamida, el grupo de rmIFN-\gamma, el grupo de rhIL-2, y el grupo de solución salina, 20 animales por grupo.

Se incubaron células de melanoma de ratón B_{16} de reserva en medio DMEM/F12 suplementado con suero fetal bovino al 10%, 37ºC/CO_{2} al 5% durante 72 h, después se lavaron 3-4 veces con solución de Hank. La concentración celular se ajustó a 1 x 10^{5} por ml con solución de Hank y se inyectó 0,1 ml de la suspensión celular mediante la vena de la cola en los ratones de ensayo para generar el modelo animal que alberga melanoma B_{16} [7,8]. El tratamiento con sustancia de ensayo empezó como se ha descrito en el método de la sección 1.

6.1 El efecto de los péptidos sobre la inmunidad humoral de ratones C_{57}BL/6 que albergan melanoma B_{16} transplantado ^{[9]}

Se prepararon glóbulos rojos de oveja (SRBC) recogiendo sangre de la vena cervical y se pusieron en un matraz estéril con perlas de vidrio. El matraz se agitó durante 3 minutos y la sangre después se mezcló con solución de Alsever (glucosa 2,05 g, NaCI 0,4 g, limonada Na 0,8 g, ajustada a 100 ml con agua destilada) y se almacenó a 4ºC. Inmediatamente antes de su uso, las muestras se centrifugaron a 130 g, 5 minutos para recoger los SRBC. Las células se lavaron dos veces por resuspensión y centrifugación en solución salina normal. Después se recogió el sedimento celular por centrifugación a 180 g durante 10 minutos y se resuspendió en solución salina para hacer la suspensión de SRBC de trabajo final, al 2% (v/v).

El complemento se preparó añadiendo 10 volúmenes de suero de cobaya fresco en un volumen de SRBC compactados en centrífuga, y después se agitó suavemente durante 30 minutos a 4ºC. Los SRBC se retiraron por centrifugación a 200 g durante 10 minutos. Se añadieron 10 volúmenes de solución salina normal para obtener la solución del complemento de trabajo.

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En los animales de ensayo, en el día 27 del tratamiento con sustancia de ensayo, se inyectaron 0,2 ml de la suspensión celular de SRBC de trabajo en cada animal para producir anticuerpos. En el día después de la última administración de sustancia de ensayo, se recogió la sangre del canthus ocular y se dejó a temperatura ambiente durante una hora para la exudación del suero. Después de centrifugación a 200 g durante 10 minutos, se diluyó el suero recogido a un factor 500 con solución salina normal.

A 1 ml de suero de ratón diluido de cada ratón, se añadieron 0,5 ml de suspensión de SRBC. Refrigeración en hielo. Después se añadió 1 ml de solución del complemento de trabajo y se incubó en un baño de agua a 37ºC durante 10 minutos. Las reacciones se terminaron por refrigeración en hielo. Las muestras después de centrifugaron a 200 g durante 10 minutos para obtener el sobrenadante.

La DO_{540 \ nm} de referencia se obtuvo mezclando 0,25 ml de suspensión de SRBC con solución de Drabkin a 4 ml y se colocaron a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de que se tomara la DO_{540 \ nm}.

Índice de hemólisis = (DO_{540 \ nm} de la muestra de ensayo \textdiv DO_{540 \ nm} de referencia) x 500

6.2 Después del estudio de inmunidad humoral, se sacrificaron los ratones por dislocación de la vértebra cervical. Se realizó el examen post-mortem de los animales. Se registraron los cambios patológicos, y se contaron las cantidades de focos de metástasis pulmonar de melanoma.

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Resultados 1. El efecto del péptido sobre la fagocitosis celular en ratones BALB/c con sarcoma S_{180} transplantado (Método 2.1)

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TABLA IV.1. El efecto del péptido sobre el índice de fagocitosis de ratones BALB/c con sarcoma S_{180} transplantado

66

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Se descubrió que CMS001 a 50 \mug/kg/día y 5 \mug/kg/día, y CMS034 a 5 \mug/kg/día y 0,5 \mug/kg/día eran capaces de aumentar el índice de fagocitosis, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina.

2. El efecto del péptido sobre la velocidad de crecimiento de sarcoma S_{180} transplantado en ratones BALB/c (Método 2.2)

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TABLA IV.2. El efecto del péptido sobre el crecimiento tumoral de S_{180} transplantado

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Se descubrió que CMS010 a 500 \mug/kg/día, CMS034 a 0,5 \mug/día, y CMS035 a 5 \mug/kg/día eran capaces de reducir el crecimiento del sarcoma S_{180} transplantado, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05).

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(Tabla pasa a página siguiente)

3. El efecto del péptido sobre la supervivencia de ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico (Método 3)

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TABLA IV.3. El efecto del péptido sobre el índice de supervivencia de ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico

69

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Se descubrió que CMS008 a 5 \mug/kg/día, CMS011 a 5 \mug/kg/día, CMS024 a 50 \mug/kg/día, CMS024 a 0,5 \mug/kg/día, y CMS032 a 0,5 \mug/kg/día eran capaces de prolongar la supervivencia de ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). También se observó que en el grupo de CMS024 a 0,5 \mug/kg/día, más del 30% (n=6) de los ratones podía sobrevivir más de 90 días (dos meses después de finalizar el experimento). El examen post-mortem de los ratones no mostró signos de establecimiento de tumor. CMS024 a 0,5 \mug/kg/día por lo tanto puede impedir el crecimiento de H_{22} transplantado impidiendo su establecimiento o induciendo la curación completa del cáncer establecido.

4. El efecto del péptido sobre la transformación de linfocitos T en ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico (Método 4.2)

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TABLA IV.4. El efecto del péptido sobre la transformación de linfocitos T

70

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Se descubrió que CMS010 a 500 \mug/kg/día, CMS019 a 0,5 \mug/kg/día, CMS024 a 0,5 \mug/kg/día y 5 \mug/kg/día, y CMS035 a 0,5 \mug/kg/día y 5 \mug/kg/día eran capaces de aumentar el índice de estimulación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05).

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5. El efecto del péptido sobre la actividad de células NK en ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico (Método 4.3)

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TABLA IV.5. El efecto del péptido sobre el índice de actividad citotóxica de células NK

71

72

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Se descubrió que CMS003 a 500 \mug/kg/día, CMS014 a 0,5 \mug/kg/día, CMS024 a 0,5 \mug/kg/día, 5 \mug/kg/día, y
50 \mug/kg/día, y CMS034 a 50 \mug/kg/día eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK en el modelo animal de ensayo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05).

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6. El efecto del péptido sobre la supervivencia de ratones DBA/2 con leucemia L_{1210} transplantada (Método 5)

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TABLA IV.6. El efecto del péptido sobre el índice de supervivencia de animales de ensayo

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Se descubrió que CMS019 a 0,5 \mug/kg/día y CMS035 a 0,5 \mug/kg/día eran capaces de prolongar la supervivencia de ratones DBA/2 con leucemia L_{1210} transplantada, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05).

7. El efecto del péptido sobre la inmunidad humoral de ratones C_{57}BL/6 con melanoma B_{16} transplantado (Método 6.1)

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TABLA IV.7. El efecto del péptido sobre el índice de hemólisis de ratones C57B/6 con melanoma B16 transplantado

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Se descubrió que CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS016, CMS019, CMS024, CMS034, y CMS035 eran capaces de potenciar la respuesta humoral (aumento en el índice de hemólisis) de ratones C_{57}BL/6 con melanoma B_{16} transplantado a dosificaciones que se muestran en la Tabla IV.7, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05).

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8. El efecto del péptido sobre la supervivencia de células de melanoma B16 inoculadas en ratones C_{57}BL/6 (Método 6.2)

El examen post-mortem de los animales después de finalizar el tratamiento con sustancia de ensayo no mostró ningún signo de existencia de focos metastásicos B16 en el pulmón de ratones tratados con CMS008 a 0,5 \mug/kg/día, 5 \mug/kg/día, y 50 \mug/kg/día, y CMS016 a 5 \mug/kg/día y 500 \mug/kg/día.

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Conclusión

De conformidad con las Directrices de Investigación Preclínica de Nuevos Fármacos (Preclinical New Drug Research Guidelines) presentadas por la División de Administración de Fármacos del Departamento de Salud de la RP de China en 1993, se estudiaron los efectos del péptido sobre ratones con células cancerosas transplantadas. Se concluyó que

1.: CMS010, CMS034, y CMS035 a la dosificación adecuada podían inhibir significativamente el desarrollo de sarcoma S_{180} transplantado en ratones;

2.: CMS001 y CMS034 a la dosificación adecuada podían potenciar las actividades inmunes fagocíticas de ratones transplantados con sarcoma S_{180};

3.: CMS008, CMS011, CMS024, y CMS032 a la dosificación adecuada podían prolongar la supervivencia de ratones transplantados con cáncer hepático H22 de tipo fluido ascítico;

4.: CMS010, CMS019, CMS024, CMS034, y CMS035 a la dosificación adecuada podían potenciar la transformación de linfocitos T en ratones transplantados con cáncer hepático H22 de tipo fluido ascítico;

5.: CMS003, CMS014, CMS024, CMS032, y CMS034 a la dosificación adecuada podían aumentar la actividad citotóxica de células NK de ratones transplantados con cáncer hepático H22 de tipo fluido ascítico;

6.: CMS019 y CMS035 a la dosificación adecuada podían prolongar la supervivencia de ratones transplantados con leucemia L1210;

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7.: CMS008 y CMS016 a la dosificación adecuada podían inhibir el desarrollo de melanoma B16 transplantado en ratones;

8.: CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS016, CMS019, CMS024, CMS034, y CMS035 a la dosificación adecuada podían potenciar la respuesta inmune humoral de ratones transplantados con melanoma B16.

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Discusión

CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS014, CMS016, CMS019, CMS024, CMS032, CMS034, CMS035 pueden ser útiles como parte, o en sí mismos, en el tratamiento del cáncer en seres humanos. Por ejemplo, CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS014, CMS016, CMS019, CMS024, CMS032, CMS034, y CMS035 pueden usarse para aumentar la inmunidad de pacientes con cáncer. CMS008, CMS010, CMS016, CMS034, y CMS035 pueden usarse para impedir el crecimiento de células cancerosas en pacientes. CMS008, CMS011,
CMS019, CMS024, CMS032, y CMS035 pueden usarse para prolongar la expectativa de vida de pacientes con cáncer. Los péptidos pueden usarse en sí mismos, en combinaciones de dos o más péptidos, o en combinación con otros compuestos farmacéuticos o suplementos alimenticios como un transcurso total para el tratamiento del cáncer.

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TABLA IV.8. Péptidos Eficaces para el Cáncer

76

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Referencias

1. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:137-143

2. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:128-129

3. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 137-138

4. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 1991, 1221-1234

5. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:140

6. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6): 356-358

7. Yaoqin Yang, Huchuan Yang, Huihong Tao, et al. The synergic effect of Tween-80 on the antitumor of hiperthermia-Experimental studies of mouse melanoma. Cancer Research on Prevention and Treatment. 1999, 26(4): 8-12

8. Jian Fu, Jie Zheng, Weigang Fang, et al. lnterleukin-12 gene transfection in murine B16 melanoma cells suppresses tumorigenicity and decreases metastatic potential. National Medical Journal of China. 1998, 78(8): 627-629

9. Qian Wang. Modem medical experiment method. People's Health Publishing House. 1998, 482-483

10. Qichao Pan, Bin Xu. Cancer pharmacology and chemotherapy. Henan medical university Publishing House. 2000, 66-69

11. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 131

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V. El efecto sobre el peso corporal

Se alimentó a ratas sanas con dieta altamente nutritiva durante 5 semanas, con o sin tratamiento simultáneo con péptidos (intramuscular 300 \mug/kg/día). Se usaron ratas con una dieta ordinaria con inyección de solución salina como control negativo. Después de 5 semanas de tratamiento, se interrumpió la inyección y se mantuvo la misma dieta durante otras tres semanas. Los datos del peso corporal se recogieron a un intervalo de una vez por semana. También se observó el comportamiento de las ratas. Se descubrió que las ratas que recibieron el péptido CMS015 tenían un menor aumento de peso corporal estadísticamente significativo en comparación con el control durante el transcurso del tratamiento con el péptido. Esta tendencia de peso corporal disminuido se reduce gradualmente después del cese del tratamiento con CMS015. Se concluye que CMS015 a un nivel de dosificación adecuado puede controlar de forma reversible el desarrollo de obesidad inducida por sobre-alimentación.

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Materiales

Ratas Sprague-Dawley (SD), que pesaban 145\pm10 g, fueron suministradas por el Center of Experimental Animal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, PR China (Nº de certificado: 2000A019). Los péptidos se sintetizaron a petición del cliente (de origen de L-aminoácidos) por American Peptide Company, Inc., USA, y se diluyeron a 10 \mug/ml en solución salina normal. Las dietas altamente nutritiva y normal se prepararon acatando las directrices de investigación pre-clínica de fármacos anti-obesidad, presentada por la SDA (State Drug Administration), PR China ^{[1]}.

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Métodos

Ratas sanas se asignaron aleatoriamente en los grupos de experimento, control positivo, y control negativo. 10 ratas por grupo, la mitad machos y la mitad hembras. El grupo de ratas del experimento se alimentó con dieta altamente nutritiva durante 5 semanas con inyección intramuscular simultánea de 300 \mug/kg/día de péptido, una vez al día. El grupo de control positivo recibió la misma dieta altamente nutritiva pero con inyección de solución salina de placebo, mientras que el grupo de control negativo, usando para demostrar el establecimiento con éxito del modelo de obesidad, recibió una dieta nutritiva normal e inyección de solución salina de placebo. Después de 5 semanas de tratamiento, se interrumpió la inyección y se mantuvo la misma dieta durante otras 3 semanas. Las ratas se pesaron a intervalos de una vez por semana. También se observó el comportamiento de las ratas.

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Estadísticas

Los datos se presentaron como la media \pm desviación estándar. Se usó el test t por parejas o ANOVA de factor único para comparación entre y dentro de los grupos. El límite de significación estadística estaba a P\leq0,05.

Resultados 1. Efecto del péptido sobre el peso corporal de ratas SD

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TABLA V.1. Efecto del péptido sobre el peso corporal de ratas SD

77

A la dosis de 300 \mug/kg/día, se descubrió que CMS015 era capaz de limitar el aumento de peso de ratas con obesidad inducida por sobre-alimentación, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control (p<0,05). La diferencia de los grupos de tratamiento y de control aumentaba con la duración del tratamiento. Tras la finalización del tratamiento con el péptido CMS015 en el grupo de tratamiento, la diferencia de los grupos de tratamiento y de control se reducía gradualmente y se volvió estadísticamente no significativa después de tres semanas, mostrando que el efecto del péptido sobre el peso corporal de la rata SD es reversible.

Durante todo el transcurso del experimento, se observó que el apetito y la actividad de todos los grupos de ratas seguían siendo normales.

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Discusión

Se concluyó que CMS015 a un nivel de dosificación adecuado puede limitar el desarrollo de la obesidad inducida por sobre-alimentación. El péptido puede utilizarse en seres humanos para controlar la obesidad. Los péptidos pueden usarse por sí mismos, en combinaciones de dos o más péptidos, o en combinación con otros productos farmacéuticos o suplementos alimenticios como un transcurso total para la gestión de la obesidad.

En el presente estudio, se ensayó la administración mediante inyección intramuscular, pero esto no excluye la posible eficacia del péptido si se administra mediante otras vías alternativas. Los péptidos pueden administrarse por inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, e implante subcutáneo con o sin un dispositivo facilitador tal como liposoma, protección de liberación sostenida, etc. El péptido también puede administrarse en cualquier forma de administración oral como comprimido, cápsula, suspensión, solución etc., en la forma habitual sin modificación o en forma de liberación lenta, o con o sin protección gastro-entérica. El péptido puede aplicarse adicionalmente en cualquier forma de aplicación tópica como pomada, crema, gel etc. con o sin un dispositivo de facilitación transdérmica o como inhalante de polvo, disuelto, o como forma protegida por liposoma. El péptido también puede interpretarse en su secuencia génica y clonarse en un sistema de expresión, en sí mismo o en combinación con otras secuencias peptídicas, para generar una molécula peptídica resultante para hacer uso de la actividad del péptido descrito en esta memoria, con o sin purificación del péptido resultante.

TABLA V.2. Péptidos eficaces para obesidad

78

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Referencias

1. SDA, PR China. The guideline for pre-clinical research of new drugs. 1993.

"Péptido sustancialmente puro" se refiere a péptidos que tienen al menos 10% p/p de pureza, más preferentemente el 20%, incluso más preferentemente el 40% y mucho más preferentemente el 60% y más preferentemente mucho más del 90% puro. En la realización más preferida, la pureza es mayor del 99%. El péptido sustancialmente puro puede usarse para preparar formulaciones farmacéuticas y nutricionales que pueden ser mezclas complejas, como se describe a continuación.

El uso del péptido identificado anteriormente, en formulaciones farmacéuticas puede emplearse como posible tratamiento para trastornos inmunológicos o enfermedades que tienen efectos secundarios sobre la inmunidad, por ejemplo, cáncer o infecciones o cualquiera de las afecciones mencionadas anteriormente. Las formulaciones pueden contener el péptido mezclado con otros constituyentes activos o inactivos, incluyendo otros péptidos. Por ejemplo, pueden añadirse de dos a varios (por ejemplo, 3-5) de los péptidos enumerados a la misma formulación con o sin otros ingredientes. Como alternativa, el péptido puede usarse para preparar la formulación junto con péptidos no enumerados en este documento. Pueden administrarse en forma intravenosa, intramuscular, intracutánea, subcutánea o intradérmica. El modo de administración también puede ser inyección intraarterial que conduce directamente al órgano del problema. Otros modos de administración son transdérmico, por inhalación en forma de polvo o pulverización, y otras formas de suministro conocidas por los expertos en la materia. La formulación también puede tomarse por vía oral, y puede contener vehículos que pueden usarse para evitar la digestión gástrica del péptido después de la ingesta oral o cualquier otro vehículo conocido en la técnica (para la vía transdérmica tal como liposomas).

La formulación farmacéutica puede incluir cualquiera de los vehículos farmacéuticos conocidos. Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen cualquiera de los vehículos farmacéuticamente aceptados convencionales conocidos para los expertos en la materia. Éstos incluyen, aunque sin limitación, solución salina fisiológica, agua, emulsiones que incluyen mezclas de aceite y agua o emulsiones de triglicéridos, y otros tipos de agentes, cargas, comprimidos recubiertos y cápsulas. El vehículo apropiado puede seleccionarse en base al modo de administración de la composición farmacéutica.

El péptido puede administrarse por inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, e implante subcutáneo. El péptido también puede administrarse en cualquier forma de administración oral como comprimido, cápsula, suspensión, solución etc., en la forma habitual sin modificación o en forma de liberación lenta, o con o sin protección gastro-entérica. El péptido puede aplicarse adicionalmente en cualquier forma de aplicación tópica como pomada, crema, gel etc. con o sin un dispositivo de facilitación transdérmica. El péptido también puede interpretarse en su secuencia génica y clonarse en un sistema de expresión, en sí mismo o en combinación con otras secuencias peptídicas, para generar una molécula peptídica resultante para hacer uso de la actividad del péptido descrito en esta memoria.

La dosis de cada péptido puede ser de 1 ng - 10 g por kg de peso corporal. Una dosis preferida es de 10 ng - 10 mg por kg, y más preferentemente de 1 \mug - 1 mg por kg para un modo de administración por inyección. Sin embargo, la dosis eficaz puede ser tan baja como 1 ng por kg de peso corporal, ya que uno o más de los péptidos pueden funcionar a través de receptores que inducirán a una cascada de respuesta fisiológica normal. Como alternativa, uno o más de los péptidos puede ser justo un iniciador para una cascada completa de reacción. Para un ingesta oral, la cantidad puede ser de 1 ng - 10 g por día por kg de peso corporal, más preferentemente de 0,1 \mug - 1 g por día por kg de peso corporal e incluso más preferentemente de 1 \mug - 10 mg por día.

VI Terapia Génica y Método de Tratamiento

La terapia génica basada en las secuencias peptídicas descubiertas se realiza diseñando una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido. El ácido nucleico puede sintetizarse químicamente y ligarse de forma funcional a un promotor, y clonarse en un vector de expresión. El vector de expresión después se administra en el cuerpo humano como forma de terapia génica para la expresión en la célula humana. La expresión "vectores genéticos" como se usa en este documento incluye estos vectores de expresión. Los vectores que pueden usarse para terapia génica incluyen virus adeno-asociados (Mizuno, M. et al. (1998). Jpn J Cancer Res 89, 76-80), vectores LNSX (Miller, A.D. et al. (1993) Methods Enzymol 217, 581-599) y lentivirus (Goldman, M.J. et al. (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268).

Otros vehículos para el suministro del péptido incluyen vectores de expresión que codifican el péptido deseado que puede transferirse en un organismo que puede replicarse en el organismo hospedador al que se desea administrar el péptido sin efectos perjudiciales significativos sobre la salud del organismo hospedador. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden transferirse en un organismo que no es patógeno para el organismo hospedador al que se desea administrar el péptido.

El vector de expresión puede producir el péptido deseado en un organismo bacteriano o fúngico que no tiene efectos perjudiciales significativos sobre la salud del organismo hospedador al que se tiene que administrar el péptido. Por ejemplo, el vector de expresión que codifica el péptido deseado puede ser un vector de expresión que produce el péptido deseado en un organismo tal como bacterias ácido lácticas, E. coli, o levaduras. El vector de expresión puede producir el péptido deseado en un microbio normalmente encontrado en el intestino de mamíferos o un microbio tolerado por el tracto digestivo de mamíferos. Algunas de las especies microbianas en que puede expresarse el péptido deseado incluyen, aunque sin limitación especies de Lactobacillus, tales como L. acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L. crispatus, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus u otros; especies de Bifidobacterium, tales como B. adolescentis, B. animalus, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum u otros; Enterococcus faecalis o Ent. facium; Sporolactobacillus inulinus; Bacillus subtilis o Bacillus cereus; Escherichia coli; Propionibacterium freudenreichii; o Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces boulardii.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican el péptido de la presente invención, sintetizadas químicamente o producidas por otros medios, incluyendo, aunque sin limitación, la transcripción inversa de ARNm para producir moléculas de ADNc, se incorporan en vectores de expresión para la transferencia génica en los organismos deseados por métodos de ingeniería genética familiares para los expertos en la materia. Los vectores de expresión pueden ser vectores ADN o vectores ARN. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden basarse en elementos genéticos plasmídicos o virales. Los vectores de expresión pueden ser vectores que se replican extra-cromosómicamente o vectores que se integran en el cromosoma.

Los vectores de expresión comprenden un promotor unido funcionalmente a un ácido nucleico que codifica un de la presente invención. El promotor puede ser un promotor regulable, tal como un promotor inducible, o un promotor constitutivo. En algunas realizaciones, el promotor puede seleccionarse para proporcionar un nivel deseado de expresión peptídica. Además, si se desea, los vectores de expresión pueden comprender otras secuencias para promover la producción, presentación y/o secreción de péptidos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica un péptido de la presente invención está unido de forma funcional a una secuencia de ácido nucleico que dirige la secreción del péptido. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica el péptido de la presente invención puede estar unido funcionalmente a un ácido nucleico que codifica un péptido señal.

En algunas realizaciones, los vectores de expresión que están modificados para codificar el péptido de la presente invención pueden ser vectores de expresión que están adaptados para expresar el péptido de la presente invención en una especie bacteriana que compone la flora intestinal normal de mamíferos, tal como especies de Lactobacillus y Bacillus subtilis. Pueden encontrarse ejemplos de dichos vectores de expresión en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.100.388, de Casas, y Nº 5.728.571, de Bellini, respectivamente. Estos documentos se incorporan expresamente por la presente como referencia. Se apreciará que puede usarse cualquier vector de expresión que facilite la expresión de un péptido de la presente invención en un organismo que no es perjudicial para la salud del organismo hospedador al que tiene que administrarse el péptido.

En algunas realizaciones, los vectores de expresión que están modificados para codificar el péptido de la presente invención pueden ser vectores de expresión que están adaptados para expresar el péptido de la presente invención en una especie de levadura que se tolera bien por el intestino de mamíferos, tal como Saccharomyces cerevisiae; o, preferentemente, Saccharomyces boulardii, que puede colonizar el intestino humano y se usa para tratar ciertas formas de diarrea. Pueden usarse vectores de expresión de levaduras que expresan constitutivamente proteínas y péptidos heterólogos, son altamente estables, por lo tanto se transmiten bien a las células descendientes durante la mitosis y meiosis y pueden comprender la secuencia codificante para un péptido o péptidos señal que dirigen elevados niveles de secreción de proteína recombinante. Un ejemplo de dicho vector de levaduras se da en la Patente de Estados Unidos Nº 6.391.585, de Jang et al.

Los vectores de expresión que codifican el péptido de la presente invención pueden introducirse en el organismo en que se pretende que exprese los péptidos a través de técnicas conocidas en la técnica. Estas técnicas incluyen métodos tradicionales para transformar bacterias, levaduras, u otros microbios, a través del uso de células bacterianas químicamente competentes, electroporación o transformación con acetato de litio (para levaduras), por ejemplo, así como avances recientes en la transformación de especies bacterianas recalcitrantes a estos procedimientos. Los vectores de expresión pueden introducirse en bacterias ácido lácticas que se sabe que son recalcitrantes a la transformación usando el método descrito por Leer et al. (documento WO 95/35389). Las secuencias introducidas pueden incorporarse en ADN cromosómico microbiano o pueden permanecer como elementos de ADN extracromosómicos.

Este microbio modificado genéticamente que contiene el vector de expresión después puede inocularse en el conducto alimentario, la vagina, la tráquea etc. para conseguir inmunoterapia sostenida. Los organismos que expresan el péptido de la presente invención pueden ingerirse en una forma inactiva o, preferentemente, en forma viva. En el intestino estos microorganismos producen dichos péptidos, los liberan en la luz por secreción o por lisis del microorganismo o presentan de otro modo los péptidos al hospedador, por lo cual los péptidos producen su efecto pretendido sobre el organismo hospedador. Los péptidos pueden presentarse al hospedador en la membrana mucosa de los conductos nasales, la vagina o el intestino delgado.

Otro método de tratamiento es el uso de liposomas como un medio para suministrar el ácido nucleico específico a las células en el cuerpo humano. El ácido nucleico (tal como un vector de expresión que contiene una secuencia nucleica que codifica péptidos de la secuencia ID Nº 16) se suministra en un entorno que fomenta la captación celular y la incorporación cromosómica como se describe en Gao, X. y Huang, L. (1995) Gene Ther 2, 710-722 y el documento US 6.207.456. Como alternativa, el propio péptido puede encapsularse en el liposoma y suministrarse directamente, usando un método descrito en el documento US 6.245.427.

Las secuencias de ácido nucleico útiles para la terapia génica mencionada anteriormente y el método de tratamiento incluyen secuencias que codifican este péptido. Puede usarse una cualquiera de las numerosas secuencias de ácido nucleico para codificar este péptido en base al sistema de codones degenerados.

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Referencias

1. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:134-135

2. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 1991, 1221-1234

3. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7: 140

4. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6): 356-358

5. Qian Wang. Modern medical experiment method. People's Health Publishing House. 1998, 482-483

6. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7: 141

7. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7: 132-133

8. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7: 128-129

9. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Phamalogical experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 137-138

10. Jiatai Li, clinical pharmacology (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 1338-1339.

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Ejemplo 1 Suministro de péptidos a través de especies bacterianas de Lactobacillus modificadas genéticamente

Lo siguiente se proporciona como un método ejemplar para suministrar el péptido de la presente invención a un hospedador como se ha descrito anteriormente. Se sintetiza una secuencia de ADN que codifica el péptido por medios químicos y esta secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión usando técnicas convencionales de ingeniería genética familiares para los expertos en la materia. El vector de expresión seleccionado contiene un promotor constitutivo funcional en Lactobacilli, un sitio de clonación múltiple para la introducción de secuencias de ADN en una orientación 5' a 3' específica así como un gen marcador de selección que confiere resistencia a un antibiótico (para ayudar en procedimientos de clonación) y puede comprender otras secuencias para ayudar en la producción y/o secreción de los péptidos, tales como secuencias peptídicas señal. Un ejemplo de dicho vector se proporciona por la Patente de Estados Unidos Nº 5.592.908, de Pavla. En resumen, esta patente analiza varios promotores conocidos que funcionan en especies de Lactobacillus, así como un método para descubrir nuevos promotores en dichas bacterias, cualquiera de los cuales puede unirse de forma funcional a un ácido nucleico que codifica un péptido de la presente invención para expresar el péptido en Lactobacilli. Un ácido nucleico que codifica un péptido señal, tal como péptidos que comprenden de 16 a 35 aminoácidos principalmente hidrófobos que son activos en Lactobacillus lactis descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.529.908, citados anteriormente se intercala entre el promotor y el ácido nucleico que codifica el péptido de la presente invención de modo que el ácido nucleico que codifica el péptido señal está en fase con el ácido nucleico que codifica el péptido de la presente invención.

Además de la secuencia codificante del péptido, la secuenciad de ADN sintetizada puede comprender secuencias para ayudar en el ligamiento y clonación de dicho ADN en el vector de expresión. Por ejemplo, pueden incorporarse sitios de reconocimiento de enzimas de restricción que corresponden con los encontrados en el sitio de clonación múltiple del vector en el ADN sintetizado en los extremos 5' y 3' de la secuencia, de modo que la secuencia pueda clonarse en la orientación apropiada dentro del vector. Tanto el vector como el ADN sintetizado se digieren con las enzimas de restricción particulares, después se purifican. Las reacciones de ligamiento con el vector y el ADN sintetizado están seguidas de la introducción por transformación en una cepa adecuada de E. coli. Las bacterias transformadas se siembran en placas en medios que contienen el antibiótico al que el vector confiere resistencia. Se selecciona una colonia de bacterias transformadas para procedimientos de cultivo de crecimiento y preparación de plásmidos; se confirma la presencia del ADN sintetizado en la orientación correcta.

Este vector de expresión después se introduce por transformación en una célula hospedadora bacteriana de una especie de Lactobacillus, tal como L. acidophilus. Las células transformadas se seleccionan en virtud del marcador de selección encontrado dentro de la secuencia del vector y la secreción del péptido puede verificarse realizando una transferencia de western, realizando electroforesis en gel de los péptidos presentes en el medio de cultivo u otras técnicas convencionales. Se elige una colonia transformada de bacterias y se usa para preparar cultivos a gran escala de las bacterias modificadas genéticamente. Se hace crecer un cultivo de las bacterias modificadas genéticamente que expresan el péptido deseado y al menos una parte del mismo se administra en el conducto alimentario, la vagina, la tráquea u otra área del organismo hospedador en que las bacterias son capaces de replicarse. Si se desea, los cultivos bacterianos pueden tratarse en una diversidad de modos para producir un suplemento para el consumo entérico por el hospedador. Estos tratamientos incluyen liofilización u otros métodos para conservar las bacterias, además de combinar las bacterias con agentes portadores, tales como soluciones, disolventes, medios de dispersión, agentes de retardo, emulsiones y similares. El uso de estos agentes para preparar suplementos es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, las bacterias pueden usarse para preparar productos lácteos cultivados u otros productos alimenticios para consumo humano, de modo que el organismo que expresa el péptido colonice el intestino del organismo hospedador. Se describen varios métodos diferentes para incorporar cepas específicas de bacterias ácido lácticas en productos alimenticios tales como yogurt, kimchi, queso y mantequilla en la Patente de Estados Unidos Nº 6.036.952, de Oh. Tras el consumo de las bacterias a través de una de cualquiera de las vías, los organismos modificados pueden colonizar el intestino y permitir la presentación y/o absorción de los péptidos de esta invención mediante la capa mucosa del intestino.

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Ejemplo 2 Suministro de péptidos a través de una forma modificada genéticamente de Bacillus subtilis

Lo siguiente se proporciona como otro método ejemplar para suministrar el péptido útil de esta invención a un hospedador como se ha descrito anteriormente. Se sintetiza una secuenciad de ADN que codifica el péptido por medios químicos y esta secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión mediante técnicas de ingeniería genética, siendo todas las técnicas conocidas en la técnica. El vector de expresión seleccionado comprende un vector lanzadera, tal como pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ), capaz de propagarse tanto en E. coli como en B. Subtilis y que contiene un gen de resistencia a antibióticos para seleccionar colonias de bacterias transformadas. Este vector puede contener un promotor constitutivo activo en B. subtilis, tal como un promotor derivado del gen Sac B de B. subtilis así como una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal o líder activo en B. subtilis que dirige la exportación eficaz de proteínas heterólogas expresadas desde la célula bacteriana. Un ejemplo de dicho vector se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.268.169, de Fahnestock. En resumen, como se ha detallado anteriormente, se sintetizará el ADN que codifica un péptido de esta invención con sitios de enzimas de restricción y/u otras secuencias para facilitar la clonación del ADN a través de técnicas familiares para los expertos en la materia. Después de la introducción por transformación en E. coli., la siembra en placa, la selección y la propagación del plásmido para crear una reserva de plásmido, después el plásmido se introduce por transformación en B. subtilis y los transformantes se seleccionan en virtud de su resistencia a un antibiótico en el medio de siembra.

La producción de péptido y la secreción desde B. subtilis modificado genéticamente se verifica usando técnicas bien conocidas para los expertos en la materia, tales como radiomarcaje de péptidos para la detección auto-radiográfica después de análisis por SDS-PAGE o transferencia de Western.

Se hace crecer un cultivo de bacterias modificadas genéticamente y se administra al menos una parte del mismo al conducto alimentario, la vagina, la tráquea u otra área del organismo hospedador en que las bacterias son capaces de replicarse.

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Ejemplo 3 Suministro de péptidos a través de especies de levaduras Saccharomyces modificadas genéticamente

Lo siguiente se proporciona como otro método ejemplar para suministrar el péptido de esta invención a un hospedador como se ha descrito anteriormente. Se sintetiza una secuencia de ADN que codifica el péptido por medios químicos y esta secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión mediante técnicas de ingeniería genética, siendo todas las técnicas conocidas en la técnica. El vector de expresión seleccionado comprende un vector de expresión de proteínas de levaduras mantenido estable, que comprende un promotor de levaduras constitutivo tal como pADH1, sitios para la replicación del vector tanto en levaduras como en E. coli, un gen o genes que confieren prototrofia a un mutante de levadura auxotrófico para propósitos de selección, un sitio de clonación múltiple (MCS) y, si se desea, secuencias que codifican un péptido señal. Los vectores tales como éste están disponibles en el mercado y son bien conocidos en la técnica o pueden construirse fácilmente usando técnicas convencionales. Después de la inserción del ADN sintetizado en el vector de levaduras, la introducción por transformación en E. coli, la siembra en placa de E. coli transformada en medios selectivos, la selección de una colonia bacteriana transformada y la preparación de ADN plasmídico a partir de un cultivo de crecimiento de las bacterias a partir de dicha colonia, el vector se introduce por transformación en Saccharomyces cerevisiae mediante técnicas bien conocidas tales como transformación con acetato de litio o electroporación. La cepa de Saccharomyces cerevisiae seleccionada para la transformación es una cepa auxotrófica mutante que requerirá un gen en el plásmido para crecer en placas de medio mínimo. Las colonias de levadura transformadas se aíslan sembrando en placa la levadura en medios de cultivo que carecen del gen proporcionado en el vector. Solamente aquellas levaduras que han recibido el vector y su gen de selección y que expresen ese producto génico serán capaces de crecer en colonias en el medio mínimo. La verificación de la secreción del péptido puede obtenerse realizando una transferencia de Western, realizando electroforesis en gel de los péptidos presentes en el medio de cultivo u otras técnicas convencionales.

Se elige una colonia transformada de levaduras y se usa para preparar cultivos a escala mayor. Se hace crecer un cultivo de la levadura modificada genéticamente que expresa el péptido deseado y se administra al menos una parte del mismo al conducto alimentario, la vagina, la tráquea u otra área del organismo hospedador en que las bacterias son capaces de replicarse. Si se desea, los cultivos de levaduras pueden tratarse en una diversidad de modos para producir un suplemento para el consumo entérico por el hospedador. Estos tratamientos incluyen liofilización u otros métodos para conservar las levaduras, además de combinar las bacterias con agentes portadores, tales como soluciones, disolventes, medios de dispersión, agentes de retardo, emulsiones y similares. El uso de estos agentes para preparar suplementos es bien conocido en la técnica. La levadura transformada también puede usarse en la creación de productos alimenticios, tales como productos lácteos fermentados como yogurt y kefir, por técnicas conocidas para los expertos en la materia. Como con cultivos de bacterias ácido lácticas vivas en estos productos alimenticios, la levadura transformada coloniza el intestino de forma al menos transitoria y sirve para presentar los péptidos al hospedador mediante la luz del intestino.

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<110> CMS Peptides Patent Holding Company Limited

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<120> PÉPTIDOS BIOLÓGICAMENTE ACTIVOS

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<130>P001.030DIVEP

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<150> 10/237.405

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<151> 05-09-2002

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<150> 10/178.684

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<151> 20-06-2002

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<160> 30

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<170> PatentIn versión 3.3

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Claims

1. Un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1.

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho péptido modula al menos una de las siguientes afecciones: actividades inmunes, infección por hepatitis, infección por hepatitis B y el desarrollo de un cáncer.

3. Una composición farmacéutica que comprende un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1.

4. Un método de preparación de una composición farmacéutica que comprende proporcionar un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 y mezclar dicho péptido sustancialmente puro con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. Un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 para su uso en terapia.

6. Uso de un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 para la fabricación de un medicamento para modular actividades inmunes, hepatitis vírica o el desarrollo de un cáncer.

7. Un péptido sustancialmente puro constituido por la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 para su uso en la modulación de actividades inmunes, hepatitis vírica o el desarrollo de un cáncer.