ES2345877T3

ES2345877T3 - Usos de un glucano derivado de bacterias acido lacticas como agente contra la corrosion.

Info

Publication number: ES2345877T3
Application number: ES02749437T
Authority: ES
Inventors: Gerritdina Hendrika Van Geel-Schutten
Original assignee: Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO
Current assignee: Nederlandse Organisatie voor Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO
Priority date: 2001-07-20
Filing date: 2002-07-22
Publication date: 2010-10-05
Anticipated expiration: 2022-07-22
Also published as: JP2005500839A; ATE466950T1; WO2003008618A2; US20050059633A1; EP1409708B1; NZ530638A; CA2454563A1; DK1409708T3; DE60236287D1; EP1409708A2; WO2003008618A3

Abstract

El uso de un glucano que comprende 15 - 26% de AGU con enlace α(1,3), 30 - 50% de AGU con enlace α(1,6), y 5 - 20% de AGU con enlace α-(1,3,6), como un agente anticorrosivo.

Description

Usos de un glucano derivado de bacterias ácido lácticas como agente contra la corrosión.

La presente invención está en el campo de las biomoléculas enzimáticamente producidas. La invención está particularmente relacionada con el uso de glucanos derivados de bacterias ácido lácticas.

Antecedentes de la invención

Se sabe que diferentes bacterias producen exopolisacáridos, es decir polisacáridos secretados en el medio de cultivo. Los ejemplos bien conocidos de exopolisacáridos bacterianos incluyen xantano de Xanthomonas campestris, gellan de Sphingomonas paucimobilis y pullulan de Aureobasidium pullulans. Las bacterias ácido lácticas que se sabe que producen exopolisacáridos incluyen a las cepas Leuconostoc mesenteroides que producen dextranos, poliglucosa anhidra con enlaces \alpha(1\rightarrow6), y alternanos, es decir poliglucosas anhidras que tienen enlaces alternantes \alpha(1\rightarrow6) y \alpha(1\rightarrow3), cepas de Estreptococo oral que producen glucanos responsables de la formación de placa dental, y una cepa particular de Lactobacillus reuteri que produce glucosa anhidra con enlaces \alpha(1,6)- y \alpha(1,4) (Van Geel-Schutten, y colaboradores., Appl. Environ. Microbiol. (1999) 65, 3008 - 3014). Las propiedades de los exopolisacáridos dependen del tipo de unidades de monosacárido, del tipo de enlaces, del grado y tipo de ramificaciones, la longitud de la cadena del polisacárido, el peso molecular y la conformación de los polímeros.

Argiiello-Morales y colaboradores. (FEMS Microbiol. Lett. 182 (2000) 81 - 85) describen una alternanosucrasa del Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1355. Monchois y colaboradores. (Gene 182 (1996) 23 - 32; FEMS Microbiol. Lett. 159 (1998) 307 - 315) describen por ejemplo dos diferentes dextranosucrasas del Lc. mesenteroides NRRL B-1299. Un método para seleccionar cepas de Leuconostoc mesenteroides que producen una alta proporción de alternano con relación a dextrano es descrito en la patente estadounidense No. 5.789.209. El estado del arte no divulga o sugiere otras bacterias ácido lácticas diferentes a Leuconostoc o Estreptococos que sean capaces de producir glucanos que tengan enlaces tanto \alpha(1\rightarrow6) como \alpha(1\rightarrow3).

Se encontró que diferentes cepas de bacterias ácido lácticas eran capaces de producir una clase particular de glucanos. Estos glucanos tienen en común que sus unidades de glucosa anhidra (AGU) están enlazadas con enlaces glucosídicos \alpha(1,3) y/o \alpha(1,6), es decir son \alpha-glucanos en gran parte o completamente desprovistos de enlaces \alpha(1,4). Estos glucanos pueden ser de tipo alternano (enlaces alternantes \alpha (1,3) y \alpha(1,6)), mutano (mezclados \alpha(1,3) y \alpha(1,6), usualmente predominando \alpha(1,3)) o dextrano (principalmente enlaces \alpha(1,6), algunos \alpha(1,3)), o de otro tipo. Los glucanos pueden ser producidos a partir de sacarosa, utilizando enzimas sucrasa que son activas en la bacteria ácido láctica. Pueden ser producidos a gran escala y aislados en una forma comercialmente factible, ya que los glucanos son producidos fuera de la célula bacteriana, o incluso en ausencia de la bacteria, utilizando enzimas aisladas de sacarosa. Los glucanos son producidos por cepas de grado alimenticio y tienen interesantes propiedades, tales como utilidad prebiótica o espesante de composiciones en base acuosa.

La invención está relacionada con el uso de glucanos específicos como anticorrosivos.

Descripción de la invención

Las cepas de Lactobacillus que contienen una glucosiltransferasa (glucanosucrasa) capaz de producir un glucano que tiene al menos 10 unidades de glucosa anhidra (AGU) que tiene una columna vertebral que consiste esencialmente de AGU con enlaces \alpha(1,3) y/o \alpha(1,6), en presencia de sacarosa pueden encontrarse entre las fuentes actuales de Lactobacilli, tales como fuentes alimenticias, ensilaje, muestras de mamíferos, etc. Estas cepas que contienen las glucosiltransferasas y que producen los glucanos pueden ser identificadas por aislamiento de cepas de Lactobacillus a partir de estas fuentes, cultivándolas sobre sacarosa y analizando el producto polisacárido utilizando métodos analíticos adecuados tales como cromatografía. Los genes que codifican estas glucosiltransferasas pueden ser identificados por medio de amplificación de fragmentos de secuencias de nucleótidos de la cepa utilizando iniciadores con base en genes conocidos para glucosiltransferasa y reteniendo las cepas positivas (ver los ejemplos). Se aislaron e identificaron diferentes cepas que producen glucano a partir de diferentes fuentes y diferentes especies de Lactobacillus, tales como Lb. reuteri, Lb. fermentum, Lb. sake y Lb. parabuechneri o especies relacionadas. Se identificaron también las gluco-
siltransferasas de estas cepas que producen glucano y, se las secuenció parcial o completamente (ver los Ejemplos).

Los nuevos glucanos pueden ser producidos por medio de la actividad de la glucosiltransferasa (glucanosucrasa) de una bacteria ácido láctica sobre un sustrato donante de sacarosa. Los glucanos tienen un peso molecular promedio entre 10 kDa y 1 GDa, y consisten esencialmente de unidades de glucosa anhidra con enlaces \alpha(1,3) y/o \alpha(1,6) (AGU), a las cuales pueden estar unidas cadenas laterales que consisten también de AGU con enlaces \alpha(1,3) y/o \alpha(1,6).

En particular, los glucanos contienen ya sea 15 - 80% de AGU con enlaces \alpha(1,3), 2 - 80%, especialmente 4 - 80% y más especialmente 15 - 80% de AGU con enlaces \alpha(1,6) y 2 - 25% de AGU (ramificación) con enlaces \alpha-(1,3,6), o 80 - 99% de AGU con enlaces \alpha(1,6) y 1 - 20% de AGU (ramificación) con enlaces \alpha(1,3) o \alpha(1,3,6), en particular 1 - 15% de AGU con enlaces \alpha(1,3) y 5 - 15% de unidades con enlaces \alpha(1,3) y \alpha(1,3,6) tomadas en conjunto. La invención se relaciona con el uso de un glucano que tiene un peso molecular promedio de 10 kDa - 50 MDa y que contiene 15 - 26% de AGU con enlaces \alpha(1,3), 30 - 50% de AGU con enlaces \alpha(1,6), 5 - 20% de AGU con enlaces \alpha(1,3,6) y 5 - 35% de AGU terminales.

Las enzimas que se originan en bacterias ácido lácticas, o de fuentes recombinantes, capaces de producir los glucanos descritos anteriormente partiendo de sacarosa pueden ser clasificadas como glucanosucrasas o glucosiltransferasas. Se da información más completa de las secuencias en las SEQ ID Nos 11 y 12.

Se pueden utilizar las enzimas como tales para la producción de los glucanos descritos anteriormente, o para la producción de oligosacáridos y polisacáridos que tienen una estructura similar a la del glucano con enlaces \alpha(1,3) y/o \alpha(1,6). Sus genes pueden ser incorporados también en organismos huésped adecuados, para producir sistemas alternativos de producción de glucano. Tales microorganismos recombinantes, preferiblemente grado alimenticio, por ejemplo bacterias, especialmente bacterias ácido lácticas, levaduras, hongos, etc., que contienen los genes de las glucanosucrasas descritas anteriormente son capaces de expresar las glucanosucrasas.

Este glucano puede ser producido por una cepa de Lactobacillus como se describió anteriormente, o por medio de un microorganismo recombinante que expresa la glucosiltransferasa o por medio de una glucosiltransferasa aislada y una fuente adecuada de glucosa tal como por ejemplo sacarosa. La glucosiltransferasa puede ser aislada por medios convencionales a partir del cultivo de una bacteria ácido láctica positiva para glucosiltransferasa, especialmente una especie de Lactobacillus, o a partir de un organismo recombinante que expresa al gen para la glucosiltransferasa.

El glucano y los glucooligosacáridos producidos por las cepas de Lactobacillus pueden ser recuperados del sobrenadante del cultivo de cepas de Lactobacillus descritas anteriormente, que contienen la glucosiltransferasa. El glucano puede incluir al menos 20, hasta aproximadamente 100.000 unidades \alpha de glucosa anhidra con la estructura única descrita anteriormente.

Las enzimas que producen glucano, o al menos las más preferidas, son constitutivas en las cepas de Lactobacillus, ya que siempre están presentes. Esto es contrario a la mayoría de las cepas de Leuconostoc que producen glucano (dextrano) del estado del arte, en donde las enzimas se expresan únicamente sobre el crecimiento en presencia de sacarosa. Esto permite una producción más eficiente de glucanos por parte de los microorganismos.

Los glucanos de la invención son útiles como agentes anticorrosión, por ejemplo para la protección de cascos de buques. Para ese propósito, se pueden aplicar en forma de soluciones o suspensiones, por medio de atomización, recubrimiento, inmersión y otras técnicas conocidas en el arte del control de la corrosión.

Los glucanos pueden utilizarse como tales. También pueden ser modificados por medios físicos o químicos. Los ejemplos adecuados de modificación clínica incluyen oxidación, especialmente oxidación 2,3 ó 3,4 utilizando peryodato o hipohalito, en glucanos que tienen enlaces \alpha-1,6, u oxidación en posición 6 utilizando nitroxilos con perácido o hipohalito en glucanos que tienen enlaces \alpha-1,3. La oxidación con hipohalito resulta en unidades de 2,3 ó 3,4-dicarboxi-anhidroglucosa abiertas en el anillo (ver, por ejemplo, EP-A-427349), mientras que la oxidación con peryodato resulta en unidades de 2,3 ó 3,4-dialdehído-anhidroglucosa de anillo abierto (ver, por ejemplo WO 95/12619), que pueden ser oxidadas adicionalmente hasta unidades (parcialmente) carboxiladas (ver, por ejemplo 00/26257). La oxidación mediada por nitroxilo utilizando hipoclorito o un perácido resulta en unidades 6-aldehídodo- y 6-carboxi-anhidroglucosa (ver, por ejemplo WO 95/07303).

Los glucanos oxidados tienen mayor solubilidad en agua, viscosidad alterada y una fermentabilidad retardada y pueden ser utilizados como agentes complejantes de metal, aditivos detergentes, aditivos reforzadores, carbohidratos bioactivos, emulsificantes y agentes enlazantes de agua. También pueden ser utilizados como materiales de partida para conversión adicional en derivados tal como entrecruzamiento y la introducción de hidrófobos. Los glucanos oxidados acoplados a proteínas pueden ser utilizados como emulsificantes y estabilizantes. Los glucanos oxidados contienen preferiblemente 0.05 - 1.0 grupos carboxilo, más preferiblemente 0.2 - 0.8 grupos carboxilo por unidad de glucosa anhidra, por ejemplo como grupos 6-carboxilo sobre unidades con enlace 1,3.

Cuando se desean glucanos modificados con alta proporción de grupos carboxilo, se pueden combinar dos procesos de oxidación o se puede combinar una oxidación con, por ejemplo, carboximetilación (ver más adelante). Por lo tanto, se puede preparar convenientemente un \alpha-(1,3/1,6)-glucano que tiene un grado de sustitución (DS) para grupos carboxilo entre 0,3 y 1,0 primero por medio de oxidación mediada por nitroxilo, resultando en la oxidación de unidades sustituidas en 1,3 hasta unidades de ácido glucurónico, seguido por ejemplo por peryodato y oxidación con clorito, resultando en la conversión de unidades sustituidas en 1,6* en unidades dicarboxi-sustituidas de anillo abierto. Se puede invertir también el orden de los procesos, o se puede combinar un proceso de oxidación, tal como oxidación en posición 6 mediada por nitroxilo con carboximetilación. También, por medio de una adaptación apropiada de los procesos de oxidación se puede obtener una mezcla de polímeros que contienen carboxilo y aldehído.

Otras modificaciones útiles son alquilación, acilación, hidroxialquilación, amino-alquilación, carboxialquilación, fosforilación, sulfatación, así como entrecruzamiento físico y químico. Se puede lograr la fosforilación (ver: O. B. Wurzburg (1986), Modified Starches: properties and uses. CRC Press Inc., Boca Raton, 97 - 112) por medio de calentamiento en seco de glucanos con una mezcla de hidrógeno fosfato monosódico y disódico o con tripolifosfato. Los glucanos fosforilados son adecuados como aditivos para "wet-end" en la elaboración de papel, como aglomerantes en composiciones para recubrimiento de papel, como agentes para urdir encolado, y como aglomerantes de núcleos para moldes de arena para fundición de metal. La acilación, especialmente acetilación o propionilación usando anhídrido acético o propiónico respectivamente, resulta en productos adecuados como asistentes de blanqueo y para uso en láminas. La acilación por ejemplo con anhídridos alquenil succínicos o ácidos grasos (activados) resulta en productos de superficie activa adecuados por ejemplo como tensoactivos, emulsificantes, y estabilizantes. El entrecruzamiento, por ejemplo por medio de acoplamiento de derivados oxidados, o por reacción con un agente de entrecruzamiento tal como ácido trifosfórico, epiclorohidrina o un dialdehído, puede ser utilizado para ajustar las propiedades físicas de los glucanos, por ejemplo para mejorar sus capacidades de enlazamiento de agua o de espesamiento.

La hidroxialquilación se realiza comúnmente por medio de reacción catalizada por una base con óxidos de alquileno, tales como óxido de etileno, óxido de propileno o epiclorohidrina; los productos hidroxialquilados tienen mejores características de solubilidad y viscosidad. La carboximetilación se logra por reacción de los glucanos con ácido monocloroacético o sus sales de metal alcalino y resulta en polímeros aniónicos adecuados para diferentes propósitos incluidos inhibidores de cristalización, y complejantes metálicos. La amino-alquilación se puede lograr por reacción de los glucanos con alquilen-iminas, halo-alquil aminas u óxidos de amino-alquileno, o por reacción de aductos de epiclorohidrina de los glucanos con aminas adecuadas. Estos productos pueden ser utilizados como polímeros catiónicos en una variedad de aplicaciones, especialmente como un aditivo para wet-end en la elaboración del papel para incrementar la resistencia, para relleno y retención de finos, y para mejorar la velocidad de drenaje de la pulpa de papel. Otras aplicaciones potenciales incluyen encolado de textiles y purificación de aguas residuales. Las modificaciones anteriormente mencionadas pueden ser utilizadas ya sea separadamente o en combinación dependiendo del producto deseado. Además, el grado de modificación química es variable y depende del uso pretendido. Si fuera necesario, se puede llevar a cabo una modificación del 100%, es decir modificación de todas las unidades de glucosa anhidra. Sin embargo, a menudo será suficiente una modificación parcial, por ejemplo de menos de 1 (por ejemplo 0.2) unidad de glucosa anhidra modificada por 100 unidades hasta niveles superiores, con el propósito de obtener el efecto deseado.

Se forma otro tipo adecuado de derivados por medio de hidrolizados de los presentes glucanos. Se puede realizar la hidrólisis en una forma controlada en una forma ya conocida, utilizando por ejemplo ácido diluido o enzimas glucanolíticas, especialmente \alpha-1,3-glucanasas o \alpha-1,6-glucanasas. La hidrólisis produce polisacáridos de longitud de cadena reducida (grado de polimerización, DP, de más de 20) u oligosacáridos (DP de menos de 20).

Los glucooligosacáridos que contienen la estructura característica del glucano descrito anteriormente pueden ser producidos utilizando una glucanosucrasa aislada o una cepa de Lactobacillus, o un microorganismo recombinante que contiene (una parte de) una glucosiltransferasa. La producción de los glucooligosacáridos es diferente de la reacción de síntesis del glucano. Además de la sacarosa, se puede utilizar el sustrato de la glucanosucrasa, una molécula aceptora tal como maltosa o lactosa como aceptor, para sintetizar oligosacáridos. La unión consecutiva de unidades de glucosa en una forma determinada por medio de la glucanosucrasa particular resulta en glucooligosacáridos con enlaces \alpha(1,3) y/o \alpha(1,6), cuya longitud de cadena se puede determinar por medio de la selección apropiada de las condiciones de reacción. Tiempos de reacción más largos, niveles más altos de sacarosa y niveles menores de aceptor usualmente darán como resultado cadenas relativamente largas, que tienen por ejemplo un grado de polimerización (DP) de más de 10, hasta varios cientos si se desea, mientras que tiempos de reacción más cortos, menores niveles de sacarosa y niveles más altos aceptor resultarán en cadenas relativamente cortas, por ejemplo con un DP aproximadamente de 3 a 10 o superior. Otra forma de producir glucooligosacáridos es por medio de hidrólisis del glucano descrito anteriormente. Esta hidrólisis se puede llevar a cabo por medio de métodos conocidos de hidrólisis tales como hidrólisis enzimática con enzimas tales como amilasa, dextranasa o pullulanasa o por medio de hidrólisis ácida. Los glucooligosacáridos producidos contienen al menos un enlace 1,6- ó 1,3-glucosídico que son utilizados como prebióticos.

Ejemplos General

Se aislaron las diferentes cepas bacterianas ácido lácticas a partir de una variedad de fuentes, incluidos los alimentos fermentados, el tracto gastrointestinal de diferentes especies humanas o animales, y ensilaje.

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Ejemplo 1 Identificación y secuencia de nucleótidos de los genes de la glucanosucrasa/glucosiltransferasa de lactobacilos

Los genes de la glucanosucrasa fueron identificados por medio de amplificación con PCR utilizando iniciadores degenerados (GTFrev, 5' ADRTC NCCRT ARTAN AVNYK NG 3' y GTFforw, 5'-GAYAAYWSNA AYCCNRYNGT NC-3'; N = A, C, G o T, Y = T o C, K = G o T, W = A o T, S = C o G, R = A o G), con base en secuencias conservadas de aminoácidos de diferentes genes publicados de glucanosucrasa. Se obtuvo un producto de amplificación con el tamaño predicho de aproximadamente 660 pb y se lo clonó en Escherichia coli Top 10 utilizando pCR-XL-TOPO (Invitrogen). El análisis de la secuencia confirmó que parte de un gen gtf había sido aislado. Se utilizó el producto amplificado de 660 pb para diseñar iniciadores para PCR inverso. Para PCR inverso se digirió ADN cromosómico con 10 enzimas diferentes ligadas, produciendo moléculas circulares de ADN. La PCR con los iniciadores divergentes con los productos circulares de ligación como molde produjo amplicones de diferentes tamaños, aquellos productos fueron clonados en pCR-XLTOPO (Invitrogen) y secuenciados (GATC, Konstanz, Alemania). Si fuera necesario, se llevaron a cabo reacciones adicionales de PCR inverso para obtener el(los) gen(es) completo(s). Se secuenciaron dos veces ambas cepas de los genes completes para la glucanosucrasa.

Ejemplo 2 Aislamiento e identificación de \alpha-(1,6) glucano y una glucanosucrasa a partir de la cepa 180 de Lactobacillus reuteri

Se depositó la cepa 180 de L. reuteri como LMG P-18389 en la BCCM/LMG Culture Collection en Gent, Bélgica. Se cultivó la cepa en 18 litros de medio MRS-s (en g por kg): extracto de levadura (22), acetato de sodio trihidratado (5), citrato de sodio dihidratado (2.42),cloruro de amonio (1.32), fosfato ácido dipotásico (2), sulfato de magnesio heptahidratado (0.2), sulfato de manganeso heptahidratado (0.05), sorbitan monooleato (1), vitaminas (en mg por kg: B1: 14.4, B2: 3.6, B3: 72, H 0.216), sacarosa (100), agua del grifo (restante), durante 21 h a 37ºC bajo condiciones anaeróbicas (pH 5.5). Ver también: Van Geel-Schutten y colaboradores., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1998) 50, 697 - 703. Durante el cultivo, se produjeron 13 g/l de polisacárido. Se aisló este polisacárido como se describe en la referencia citada anteriormente. Se determinó la composición de monosacáridos del polisacárido por medio de hidrólisis de la parte soluble del polisacárido y cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento. Fue caracterizado como un glucano. Este glucano no se formó cuando se cultivó la cepa sobre glucosa en vez de sobre sacarosa. El análisis de metilación (Van Geel-Schutten y colaboradores. 1999) reveló la presencia de 17 - 24% de unidades de glicosilo con enlaces \alpha(1,3), 34 - 44% de unidades de glicosilo con enlaces \alpha(1,6), 7 - 15% de unidades de glicosilo con enlaces \alpha(1,3,6) y 7 - 35% de unidades glicosilo terminales. Se determinó que el peso molecular promedio del glucano era de 3.6 x 10^{7} Da y el Rg era de 45 nm.

Se estableció el peso molecular promedio del polisacárido utilizando el sistema SEC-MALLS: se disolvieron 0.0522 g del glucano en 10 ml de DMSO/agua (90/10) y se calentó durante 1 hora a 80ºC, se filtró a través de un filtro de 0.45 \mum y se inyectó sobre el sistema SEC-MALLS y se analizó utilizando las siguientes condiciones:

Eluyente:: DMSO/agua (90/10) con NaNO_{3} 0,1 M

Velocidad de flujo:: 0.5 ml/min

Volumen de inyección:: 0.247 ml

Columna:: PLgel Guard, mezclada con A y mezclada con D

Temperatura:: 90ºC.

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Detección: MALLS (DAWN-DSP), 50ºC, A_{2} = 0, dn/dc = 0.074, celda F2, RI; SDS PAGE seguido por coloración con PAS (Van Geel-Schutten y colaboradores. 1999) reveló la presencia de una sucrasa extracelular con un peso molecular de aproximadamente 190 kDa. Parte del gen que codifica la enzima sucrasa fue aislado utilizando técnicas de PCR y secuenciado. Sobre la secuencia deducida de aminoácidos del fragmento, se encontraron grandes homologías con otras glucanosucrasas. Esta información parcial de la secuencia es presentada en la SEQ ID No. 1 (ADN) y 2 (proteína). La información de la secuencia completa se presenta en las SEQ ID Nos. 11 y 12.

Se ha analizado el glucano producido por la cepa 180 L. reuteri para su aplicación sobre cascos de buques para la prevención de la corrosión (ver el Ejemplo 4).

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Ejemplo 3 Aislamiento e identificación de \alpha-(1,6/1,3) glucano y una glucanosucrasa a partir de la cepa ML1 de Lactobacillus reuteri

La cepa ML1 de L. reuteri, depositada como LMG P-20347 en la BCCM/LMG Culture Collection en Gent, Bélgica, fue cultivada durante la noche bajo condiciones anaeróbicas a 37ºC sobre MRS suplementado con sacarosa (ver el Ejemplo 2). Se removieron las células por centrifugación y se añadieron dos volúmenes de etanol al sobrenadante. Se recolectaron los polisacáridos precipitados por centrifugación y se resuspendió en 2 - 3 litros de agua desmineralizada y se precipitó nuevamente con dos volúmenes de etanol. El glucano producido por esta cepa (7 g) fue caracterizado por medio de análisis de metilación y análisis de composición de monosacáridos como se describe en el Ejemplo 2. Se encontró que el polímero consiste de 48 - 53% unidades de glicosilo con enlaces \alpha(1-3), 3 - 8% de unidades glicosilo con enlaces \alpha(1-6), 12 - 20% de unidades glicosilo con enlaces \alpha(1-3-6) (unidades de ramificación) y 20 - 30% de unidades de glucosa enlazadas en posición 1 (terminal). No se produjeron glucanos durante el cultivo sobre glucosa. Se estableció que el peso molecular promedio del polisacárido era de 7.6 x 10^{6} Da utilizando el sistema SEC-MALLS como se describe en el ejemplo 2. Estos fueron los primeros ejemplos de la producción de polímeros tipo mutante por parte de lactobacilos. Se ha analizado la aplicación del glucano producido por la cepa ML1 de L. reuteri como agente anticorrosivo y mostró una excelente utilidad para la prevención de la corrosión por ejemplo sobre cascos de buques.

SDS PAGE seguido por coloración con PAS (Van Geel-Schutten y colaboradores. 1999) reveló la presencia de una sucrasa extracelular con un peso molecular de aproximadamente 190 kDa. Se encontró que esta cepa produce dos glucanosucrasas.

Ejemplo 4 Propiedades anticorrosivas de los glucanos

Se expusieron laminas planas de acero al carbono de 1 cm^{2} embebidas en una matriz epóxica a un medio ligeramente corrosivo (150 ml de LiClO_{4} 0.1 M) con o sin la adición de un polisacárido bacteriano (0.2 g) durante varios días. Se examinaron luego las laminas visual y electroquímicamente cada cierto tiempo. Tanto el potencial de corrosión (E_{corr} en mV con referencia a Ag/AgCl) como la resistencia a la polarización (R_{p} en k\Omega/cm^{2}) son ambos una medida del efecto anticorrosión. Después de una adaptación inicial de 3 - 10 horas, estos parámetros alcanzaron un valor estable. Se llevaron a cabo los experimentos con un heteropolisacárido de Lactobacillus sake, y un homopolisacárido de la invención (de LB 180 de acuerdo con el ejemplo 2), así como sin polisacárido. Los resultados aparecen resumidos en la tabla a continuación. Se aprecia que las propiedades anticorrosión del glucano de la invención son superiores. Se encontró que el homopolisacárido de ML 1 (ejemplo 3) tiene al menos un desempeño anticorrosión como el del polisacárido de LB 180.

TABLA Experimentos de corrosión

1

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Ejemplo 5 Modificación del \alpha-1,3/1,6-glucano por oxidación

Se resuspende un gramo (6.15 mmol de unidades de glucosa anhidra) del \alpha-1,3/1,6-glucano producido por la cepa LB 33 en 100 ml de agua. Luego se añaden 2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo (TEMPO; 0.01 g, 0.065 mmol) y bromuro de sodio (100 mg, 1 mmol) y se enfría la suspensión a 0ºC. También puede llevarse a cabo la reacción sin bromuro. Se añade una solución de hipoclorito (3 ml, solución al 15%, 6.3 mmol) de pH 10.0 (0ºC). Se mantiene constante el pH por medio de la adición de NaOH 0.1 M. Después de 1 h, se vierte la solución en 150 ml de etanol al 96%, provocando que se precipite el producto. Se centrifuga el precipitado, se resuspende en etanol/agua (70/30 v/v) y se centrifuga nuevamente. Luego, se resuspende el precipitado en etanol al 96%, se centrifuga y se seca. Se determina el contenido de ácido urónico por medio del análisis del ácido urónico de acuerdo con Blumenkrantz y Abdoe-Hansen (Anal. Biochem. 54 (1973), 484). Se generó una curva de calibración utilizando ácido poligalacturónico (5, 10, 15 y 20 \mug). Con esta curva de calibración se determina el contenido de ácido urónico en una muestra de 20 \mug del producto. La mayor parte de los grupos 6-hidroxilo han sido oxidados hasta grupos carboxilo.

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Ejemplo 6 Construcción de plásmidos para la expresión de los genes para la glucanosucrasa en E. coli

Se diseñaron dos iniciadores con sitios de restricción apropiados; el iniciador C-terminal contenía en todos los casos una etiqueta His. Se clonaron primero los productos PCR en pCR-XL-TOPO. Se removieron los productos PCR de pCR-XL-TOPO utilizando las enzimas apropiadas y ligadas en los sitios apropiados de un vector de expresión (por ejemplo pET15b (Novagen)). Para la expresión de parte del gen para la glucosiltransferasa de LB 180 (para mejor expresión, no se clonó la región N-terminal que codifica al dominio variable N-terminal de la glucanosucrasa) en E. coli, se llevó a cabo una reacción PCR utilizando Forw180 (5'-GATGCATGAG CTCCCATGGG CATTAACGGC CAACAATATT ATTATTGACC C-3') que contienen sitios SacI (negrilla) y NcoI (subrayado), y Rev180 (5'-ATATC
GATGG GCCCCGGATC CTATTAGTGA TGGTGATGGT GATGTTTTTG GCCGTTTAAA TCACCAGGTT TTAA
TGG-3'), que contiene ApaI (negrilla), BamHI (subrayado) y una etiqueta 6x His (cursiva) como iniciadores. Se clonó el producto PCR en pCR-XL-TOPO. Se removió el producto PCR de pCRXL-TOPO utilizando NcoI/BamHI y se lo ligó en los sitios correspondientes de pET15b (Novagen). El plásmido resultante (pET15b180) que contiene parte del gen para glucanosucrasa de 704 aminoácidos que codifica una glucanosucrasa sin el dominio variable N-terminal fue transformado en B121 DE3 star de E. coli (Invitrogen).

Se recolectaron células de E. coli que albergan al pET15b180 por medio de centrifugación después de 16 h de crecimiento bajo condiciones aeróbicas a 37ºC. Se lavó el precipitado con amortiguador de acetato de sodio 50 mM pH 5.5 que contiene CaCl_{2} 1 mM y Tween 80 al 1% (v/v) y se centrifugó la suspensión nuevamente. Se resuspendieron las células precipitadas con amortiguador de acetato de sodio 50 mM pH 5.5 que contiene CaCl_{2} 1 mM y Tween 80 al 1% (v/v), y \beta-mercaptoetanol 7.2 mM. Se rompieron las células por medio de sonicación y se removieron los restos celulares y las células intactas por centrifugación durante 15 minutos a 4ºC a 14.000 rpm (Eppendorf). Se utilizó el extracto resultante libre de células como fuente de enzimas para producir glucanos de alto peso molecular de sacarosa en amortiguador de acetato de sodio 50 mM pH 5.5 que contiene CaCl_{2} 1 mM y Tween 80 al 1% (v/v) y 10 g/l de sacarosa. Después de 16 horas de incubación, se aislaron los glucanos utilizando precipitación con etanol. Cuando se utilizaron los extractos libres de células de B121 DE3 star de E. coli (Invitrogen) que albergan al plásmido pET15b (sin inserto) como fuente de la enzima, no se produjeron glucanos a partir de la sacarosa.

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Información de la secuencia

Las SEQ ID Nos 1 y 2 presentan las secuencias de nucleótidos y aminoácidos, respectivamente, de una parte de la glucanosucrasa de la cepa Lb180 como se la determinó originalmente (Ejemplo 2). La secuencia parcial muestra 53% (199/223) de identidad de secuencia y 68% de similitud con la dextranosucrasa DSRB742 de Leuconostoc mesenteroides (Lc. mes.), con 2 huecos (entre los aminoácidos F172 y N173), y 52% de identidad con algunas otras dextranosucrasas y alternanosucrasas de Lc. mes.

Las SEQ ID Nos 11 y 12 presentan las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos, respectivamente, de la glucanosucrasa de la cepa Lb180 (Ejemplo 2). La secuencia muestra la identidad de secuencia (74%) de 1322/1768 y la similitud (82%) de 1476/1768 con 15/1768 huecos con glucanosucrasa de LB 121 de Lb. reuteri como se divulga en WO 01/90372. Los sitios -35 y -10 TTGAAA y TATAA se localizan en las posiciones de los nucleótidos 561 y 599, respectivamente. El sitio de enlazamiento del ribosoma (RBS) GAAGGAG está en 574 y el codón de inicio ATG en 587. Las repeticiones invertidas AAGCAGCTC y GAGCTGCTT están en 6025 y 6051. Los codones de detención posibles (TAA, TAG, TGA) están indicados con un * (5963).

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

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Documentos de patente citados en la descripción

\bullet US 5789209 A [0003]: \bullet WO 0026257 A [0015]

\bullet EP 427349 A [0015]: \bullet WO 9507303 A [0015]

\bullet WO 9512619 A [0015]: \bullet WO 0190372 A [0035]

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Literatura citada en la descripción que no es de patente

\bullet Van Geel-Schutten y colaboradores. Appl. Environ. Microbiol., 1999, vol. 65, 3008 - 3014 [0002]

\bulletArgiiello-Morales y colaboradores. FEMS Microbiol. Lett., 2000, vol. 182, 81 - 85 [0003]

\bulletMonchois y colaboradores. Gene, 1996, vol. 182, 23 - 32 [0003]

\bulletFEMS Microbiol. Lett., 1998, vol. 159, 307 - 315 [0003]

\bullet O.B. Wurzburg. Modified Starches: properties and uses. CRC Press Inc, 1986, 97 - 112 [0018]

\bullet Van Geel-Schutten y colaboradores. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1998, vol. 50, 697 - 703 [0024]

\bulletBlumenkrantz; Abdoe-Hansen. Anal. Biochem., 1973, vol. 54, 484 [0031]

<110> TNO

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<120> Nuevos glucanos y nuevas glucanosucrasas derivadas de bacterias ácido lácticas

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<130> Nuevos glucanos y glucanosucrasas

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<140>

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<141>

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<160> 10

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 665

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<212> ADN

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<213> Lactobacillus reuteri

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<400> 1

2

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<210> 2

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<211> 221

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<212> PRT

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<213> Lactobacillus reuteri

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<400> 2

3

4

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<210> 3

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<211> 674

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<212> ADN

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<213> Cepa LB 33 de Lactobacillus

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<400> 3

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5

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<210> 4

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<211> 224

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<212> PRT

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<213> Cepa LB 33 de Lactobacillus

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<400> 4

6

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<210> 5

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<211> 671

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<212> ADN

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<213> Cepa 86 de Leuconostoc

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<400> 5

7

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<210> 6

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<211> 223

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<212> PRT

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<213> Cepa 86 de Leuconostoc

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<400> 6

8

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<210> 7

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<211> 746

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<212> ADN

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<213> Cepa 86 de Leuconostoc

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<400> 7

9

90

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<210> 8

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<211> 221

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<212> PRT

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<213> Cepa 86 de Leuconostoc

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<400> 8

10

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<210> 9

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<211> 670

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<212> ADN

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<213> Cepa 86 de Leuconostoc

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<400> 9

11

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<210> 10

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<211> 223

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<212> PRT

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<213> Cepa 86 de Leuconostoc

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<400> 10

12

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SEQ ID No. 11 ADN

SEQ ID No. 12 PRT

Cepa 180 de Lactobacillus reuteri

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13

14

15

16

17

18

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SEQ ID No. 13 ADN

SEQ ID No. 14 PRT

Cepa ML1 de Lactobacillus reuteri

19

20

21

22

23

24

SEQ ID No. 15 ADN

SEQ ID No. 16 PRT

Cepa ML1 (ML4) de Lactobacillus reuteri

25

26

27

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SEQ ID No. 17 ADN

Cepa LB33 de Lactobacillus

: 28

29

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SEQ ID No. 18 PRT

Cepa LB33 de Lactobacillus

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30

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SEQ ID No. 19 ADN

SEQ ID No. 20 PRT

Cepa KG15 de Lactobacillus sake

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31

32

33

34

35

36

SEQ ID No. 21 ADN

SEQ ID No. 22 PRT

Cepa LB33 de Lactobacillus fermentum

37

38

39

Claims

1. El uso de un glucano que comprende 15 - 26% de AGU con enlace \alpha(1,3), 30 - 50% de AGU con enlace \alpha(1,6), y 5 - 20% de AGU con enlace \alpha-(1,3,6), como un agente anticorrosivo.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el glucano tiene un peso molecular promedio entre 10 kDa y 50 MDa.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el glucano puede ser producido por medio de la actividad de la glucosiltransferasa de la cepa 180 de Lactobacillus reuteri depositada como LMG P-18389.