ES2345954T3 - Deteccion de la union de recombinacion de adn. - Google Patents

Abstract

Un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado en un sitio de unión en una secuencia polinucleotídica diana, comprendiendo el método, poner en contacto el polinucleótido diana con un primer cebador, un segundo cebador, un polinucleótido bloqueante, una polimerasa, y uno o más nucleótidos trifosfato, en el que: (i) el polinucleótido diana comprende una cadena polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana, (ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el polinucleótido de inserción integrado está ausente, (iii) el primer cebador hibrida con una primera región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de unión, de manera que (iv) el segundo cebador hibrida con una segunda región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, de manera que cuando una secuencia de inserción integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, según lo cual se determina la presencia o ausencia del polinucleótido de inserción integrado en el sitio de unión en el polinucleótido diana.

Description

Detección de la unión de recombinación de ADN.

Antecedentes de la invención

La detección de secuencias de inserción de nucleótidos integradas es importante en muchos contextos. Por ejemplo, las secuencias de inserción de nucleótidos pueden transportar oncogenes en mamíferos, genes de resistencia a antibióticos en bacterias y genes que expresan rasgos identificables en plantas. La resistencia a antibióticos bacteriana es un problema clínico importante a nivel mundial y una preocupación de salud pública (véanse, por ejemplo, Sheldon, Clin Lab Sci (2005) 18:170 y French, Adv Drug Deliv Rev (2005) 57:1514). Claramente, un método eficaz, sensible y fiable para detectar la presencia o ausencia de un nucleótido de inserción integrado es valioso en el diagnóstico clínico y en otros contextos.

Otros han desarrollado métodos para detectar secuencias de inserción de nucleótidos integradas. En una estrategia, el nucleótido de inserción integrado se detecta usando PCR en la que un cebador hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana y el otro cebador hibrida con el nucleótido de inserción. La detección positiva del amplicón indica la presencia de un polinucleótido de inserción. Este método puede resultar en falsos negativos, o nucleótidos de inserción no detectados, ya que las secuencias de los nucleótidos de inserción son a menudo variables. Los cebadores disponibles pueden o no hibridar con el polinucleótido de inserción. Véase, por ejemplo, el Ensayo IDI-MRSA^{TM} de GeneOhm Sciences, San Diego, CA.

En otra estrategia, el nucleótido de inserción integrado se detecta usando PCR en la que los dos cebadores hibridan con el polinucleótido de inserción. De nuevo, la detección positiva del amplicón indica la presencia de un polinucleótido de inserción integrado. Este método también tiene la desventaja de que puede resultar en falsos negativos, debido a la naturaleza polimórfica de los nucleótidos de inserción integrados. Además, no está claro si el polinucleótido de inserción está integrado en la secuencia de ácido nucleico diana cuando hibridan con el polinucleótido de inserción cebadores directos e inversos. Véanse, por ejemplo, Kreiswirth, et al., J Clin Microbiol (2005) 43:4585 y el Kit de Detección LightCycler® MRSA de Roche Diagnostics, Alameda, CA.

En una estrategia más, la presencia o ausencia del polinucleótido de inserción integrado se identifica usando PCR en la que un cebador hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana y el otro cebador hibrida con una secuencia que se extiende a ambos lados del sitio de integración entre la secuencia de ácido nucleico diana y el polinucleótido de inserción. Aquí, la detección negativa (ausencia de amplificación) del amplicón indica la presencia de un polinucleótido de inserción integrado. Este método tiene la desventaja de que una señal negativa indica la integración positiva de un polinucleótido de inserción (véase, Patente de EEUU No. 6.156.507).

Todavía existe la necesidad de métodos eficaces, sensibles para detectar polinucleótidos de inserción integrados que proporcionen una señal positiva indicativa de la integración del polinucleótido de inserción.

Resumen breve de la invención

La presente invención proporciona composiciones (p. ej., disoluciones, mezclas de reacción), métodos y kits para detectar la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción en un ácido nucleico. Las composiciones, métodos y kits encuentran un uso en la detección, por ejemplo, de polinucleótidos de inserción integrados que confieren resistencia en bacterias a antibióticos.

Respecto a los métodos, la invención proporciona métodos para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado en un sitio de unión en una secuencia de polinucleótido diana. En algunas realizaciones, los métodos comprenden poner en contacto el polinucleótido diana con un primer cebador, un segundo cebador, un polinucleótido bloqueante, una polimerasa, y uno o más nucleótidos trifosfato, en el que:

(i) el polinucleótido diana comprende una cadena polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana,

(ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el polinucleótido de inserción integrado está ausente,

(iii) el primer cebador hibrida con una primera región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de unión, de manera que

(iv) el segundo cebador hibrida con una segunda región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana,

de manera que cuando una secuencia de inserción integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, según lo cual se determina la presencia o ausencia del polinucleótido de inserción integrado en el sitio de unión en el polinucleótido diana.

Respecto a las composiciones, la invención proporciona composiciones, incluyendo mezclas de reacción y disoluciones para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado en un sitio de unión de una primera secuencia diana y una segunda secuencia diana en un polinucleótido diana. En algunas realizaciones, las composiciones comprenden el polinucleótido diana, un primer cebador, un segundo cebador y un polinucleótido bloqueante, en el que:

(i) el polinucleótido diana comprende una cadena polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana,

(ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el polinucleótido de inserción integrado está ausente,

(iii) el primer cebador hibrida con una primera región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de unión, de manera que

(iv) el segundo cebador hibrida con una segunda región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana,

de manera que cuando una secuencia de inserción integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana.

Respecto a los kits, la invención proporciona kits para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado en un sitio de unión de una primera secuencia diana y una segunda secuencia diana en un polinucleótido diana. En algunas realizaciones, los kits comprenden un primer cebador, un segundo cebador y un polinucleótido bloqueante, en el que:

(i) el polinucleótido diana comprende una cadena polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana,

(ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el polinucleótido de inserción integrado está ausente,

(iii) el primer cebador hibrida con una primera región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de unión, de manera que

(iv) el segundo cebador hibrida con una segunda región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana,

de manera que cuando una secuencia de inserción integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana.

Respecto a realizaciones adicionales de los métodos, composiciones y kits, en algunas realizaciones, la longitud completa del primer cebador hibrida con la primera secuencia diana de manera competitiva con el bloqueante. En algunas realizaciones, una parte del primer cebador hibrida con la primera secuencia diana de manera competitiva con el bloqueante.

En algunas realizaciones, la primera región de la primera secuencia diana está fuera de la región de las repeticiones invertidas que pueden existir cerca de un sitio de unión o integración. En algunas realizaciones, la primera región de la primera secuencia diana está al menos a 20, 30, 40 o más bases nucleotídicas del sitio de unión.

En algunas realizaciones, el primer cebador y el polinucleótido bloqueante son sustancialmente complementarios a la primera región en el polinucleótido diana y el primer cebador tiene menos nucleótidos emparejados erróneamente que el polinucleótido bloqueante respecto a la primera región en el polinucleótido diana. En algunas realizaciones, el primer cebador es completamente complementario a la primera región en el polinucleótido diana y el polinucleótido bloqueante contiene al menos un emparejamiento erróneo interno comparado con la primera región del polinucleótido diana.

En algunas realizaciones, la primera secuencia diana y la segunda secuencia diana son partes de orfX de Staphylococcus aureus, el sitio de unión es un sitio de integración attB, el polinucleótido de inserción es al menos una parte de un complejo SCCmec, y el polinucleótido diana es ADN de Staphylococcus aureus.

En algunas realizaciones, el bloqueante no es extensible. En algunas realizaciones, el polinucleótido bloqueante comprende un resto en su extremo 3' seleccionado del grupo que consiste en fosfato y hexilamina. En algunas realizaciones, el polinucleótido bloqueante comprende al menos una base análoga de ácido nucleico.

En alguna realización, los nucleótidos trifosfato son nucleótidos dNTP.

En algunas realizaciones, la polimerasa es una ADN polimerasa, por ejemplo, una Taq polimerasa.

Los métodos, composiciones y kits pueden diseñarse para la evaluación simultánea de múltiples polinucleótidos diana para la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado. En algunas realizaciones, los métodos se realizan en un formato múltiple.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden además la etapa de exponer la mezcla de reacción o polinucleótido diana a condiciones de amplificación. En algunas realizaciones, la amplificación es por PCR. En algunas realizaciones, los métodos se realizan por PCR múltiple. En algunas realizaciones, la amplificación se detecta por PCR en tiempo real.

En algunas realizaciones, el polinucleótido de inserción tiene una longitud de al menos 10 bases nucleotídicas. En algunas realizaciones, el polinucleótido de inserción está integrado en el sitio de unión. En algunas realizaciones, el polinucleótido de inserción no está integrado en el sitio de unión.

En algunas realizaciones, los kits comprenden además un polinucleótido diana control que comprende la primera secuencia diana y la segunda secuencia diana.

Definiciones

Un "polinucleótido de inserción" o "secuencia de inserción" se refiere indistintamente a un polinucleótido que no está localizado en su forma nativa en un sitio de inserción particular, pero que puede insertarse en y convertirse en una secuencia contigua en la secuencia del polinucleótido diana. El polinucleótido de inserción puede tener su origen en otro lugar en la misma secuencia (p. ej., transposones) o proceder del genoma de otro organismo (p. ej., virus). Un polinucleótido de inserción integrado puede transmitirse de un organismo a su progenie. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos de inserción incluyen transposones, elementos genéticos móviles y vectores retrovirales. La integración del polinucleótido de inserción puede resultar, aunque no se necesita, en un fenotipo detectable. Por ejemplo, un polinucleótido de inserción también puede incluir una secuencia de ácido nucleico que confiere resistencia a antibióticos en bacterias. Un polinucleótido de inserción también puede crearse por un evento de translocación de ADN (p. ej., un marcador tumoral translocacional, incluyendo las variantes de corte y empalme de ARN de c-erb-B2; fusión bcr/abl; y translocaciones que afectan a Bcl-2 o Bcl-10) o puede ser cualquier otra unión marcadora creada por un evento de recombinación de ADN. Véanse las Figuras 1 y 2.

"Unión" o "sitio de unión" se refiere indistintamente a un sitio en el que la primera secuencia diana linda con la segunda secuencia diana en una secuencia polinucleotídica diana. Una unión también se refiere como un sitio de integración. Una secuencia de inserción se inserta en la secuencia polinucleotídica diana en el sitio de unión o integración. Véanse las Figuras 1 y 2.

"Que abarca la unión" se refiere a la capacidad de un polinucleótido para hibridar con dos polinucleótidos que forman una unión hibridando con el extremo 5' de un polinucleótido y el extremo 3' del otro polinucleótido. Los polinucleótidos que abarcan la unión de dos secuencias hibridan con el extremo 3' de la primera secuencia y el extremo 5' de la segunda secuencia, en el que el nucleótido 3' de la primera secuencia y el nucleótido 5' de la segunda secuencia son inmediatamente adyacentes entre sí.

Los términos "próximo" o "adyacente" se refieren indistintamente al posicionamiento de una región en la secuencia polinucleotídica diana sustancialmente complementaria a y que puede hibridar con el primer cebador respecto al sitio de unión en la secuencia polinucleotídica diana. La región que puede hibridar con el primer cebador y el sitio de unión pueden estar separados por 1 a aproximadamente 20 nucleótidos, por ejemplo, aproximadamente 1 a 10 nucleótidos. En algunas realizaciones, la región que puede hibridar con el primer cebador y el sitio de unión lindan directamente una con otra.

Las "condiciones de amplificación" o "condiciones de extensión" se refieren indistintamente a condiciones bajo las cuales una polimerasa puede añadir nucleótidos al extremo 3' de un polinucleótido. Dichas condiciones de amplificación o extensión son muy conocidas en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Edición, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1987-2007, John Wiley & Sons.

"Sustancialmente complementaria", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia que tiene no más de 20% (p. ej., no más de 15, 10 ó 5%) de los nucleótidos en la secuencia en cuestión con emparejamiento erróneo con una secuencia diana. En algunas realizaciones, los dos polinucleótidos tienen 1, 2, 3, 4, 5, o más emparejamientos erróneos de nucleótidos.

Un "nucleótido con emparejamiento erróneo" se refiere a un nucleótido en una secuencia de interés que no es el complemento del nucleótido correspondiente en una secuencia correspondiente cuando una secuencia de interés y la secuencia diana se hibridan en una reacción de amplificación. El complemento de C es G y el complemento de A es T. Los expertos en la técnica apreciarán que se conocen varios nucleótidos sintéticos que tienen propiedades de unión de Watson-Crick y se pretende que los nucleótidos sintéticos complementarios estén englobados en esta definición.

Un "polinucleótido bloqueante" se refiere a un polinucleótido que hibrida con una secuencia polinucleotídica diana que abarca un sitio de integración (es decir, unión) para un polinucleótido de inserción. En ausencia de un polinucleótido de inserción integrado, un polinucleótido bloqueante hibrida tanto con la primera secuencia diana como con la segunda secuencia diana de la secuencia polinucleotídica diana. En algunas realizaciones, el polinucleótido bloqueante no es extensible por la polimerasa.

Tal y como se usa en la presente memoria, los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" no están limitados por la longitud y son genéricos para polímeros lineales de polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa) y cualquier otro N-glicósido de una base purínica o pirimidínica o bases purínicas o pirimidínicas modificadas. Estos términos incluyen ADN bicatenario y monocatenario, así como ARN bicatenario y monocatenario.

Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uniones fosfodiéster o uniones modificadas incluyendo, pero sin limitarse a, uniones fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, fosforamidato con puente, fosfonato de metileno con puente, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforotioato con puente o sulfona, y combinaciones de dichas uniones.

Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender las cinco bases que aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, p. ej., para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más restos de base modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N^{6}-metil-adenina, N^{6}-terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (\gamma), wybutoxosina, pesudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.611; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785.

Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcar modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.

"Temperatura de fusión de la hibridación" o "Tm" se refiere a la temperatura bajo condiciones especificadas a la que un dúplex de polinucleótido está en un 50% en forma de cadena única y 50% en forma de cadena doble. La temperatura de fusión de la hibridación se calcula usando el modelo del vecino más próximo de dos estados, que se puede aplicar a dúplex de ADN cortos,

Tm(ºC)=(\DeltaH^{0}/(\DeltaS^{0} + Rln[oligo])) - 273,15

en el que \DeltaH^{0} (entalpía) y\DeltaS^{0} (entropía) son los parámetros de fusión calculados a partir de la secuencia y el parámetro termodinámico del vecino más próximo publicado, R es la constante de gas ideal (1,987 cal K^{-1} mol^{-1}), [oligo] es la concentración molar de un polinucleótido, y la constante -273,15 convierte la temperatura de grados Kelvina Celsius. Los parámetros del vecino más próximo para los pares de bases ADN/ADN se obtienen de Allawi, et al., Biochemistry (1997) 36:10581; Allawi, et al., Biochemistry (1998) 37:2170; Allawi, et al., Biochemistry (1998) 37:9435; y Peyret, et al., Biochemistry (1999) 38:3468. La Tm depende de la concentración de sal monovalente ([Na^{+}]) del disolvente. La concentración por defecto de [Na^{+}] es 50 mM. Hay programas informáticos fácilmente disponibles para calcular la Tm, por ejemplo, de Integrated DNA Technologies, Coralville, IA.

Descripción breve de los dibujos

Figura 1. Un esquema que muestra la relación entre la primera secuencia diana, la segunda secuencia diana, la unión y el polinucleótido de inserción. La primera y segunda secuencias diana pueden ser de una secuencia no codificadora, el mismo o diferentes marcos de lectura o secuencia génica.

Figura 2. Un esquema que muestra la relación entre los sitios de hibridación del primer cebador, segundo cebador, polinucleótido bloqueante, unión y polinucleótido de inserción cuando una secuencia de inserción está ausente y cuando está presente. El polinucleótido bloqueante puede contener uno o más emparejamientos erróneos internos con la secuencia diana.

Figura 3. Los resultados de un experimento que demuestran el efecto de dos polinucleótidos bloqueantes diferentes en la detección de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) y Staphylococcus aureus sensibles a meticilina (MSSA) usando el ensayo de 5'-nucleasa. La fluorescencia de FAM de punto final se indica en unidades relativas de fluorescencia (RFU).

Figura 4. Los resultados de un experimento que demuestran el efecto de la presencia o ausencia de un polinucleótido bloqueante en la detección de MRSA y MSSA. La fluorescencia de FAM de punto final se indica en unidades relativas de fluorescencia (RFU).

Figura 5. El efecto del Bloqueante GCG49 en 80 aislados clínicos diferentes de MSSA. Los datos se representan como el cambio en el ciclo umbral (\DeltaCt; Ct_{con \ bloqueante} - Ct_{con \ bloqueante}), para la cepa MSSA bloqueada, frente al ciclo Umbral (C_{t}) de las cepas MSSA no bloqueadas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona métodos, composiciones y kits para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado. La invención permite la amplificación de una secuencia de ácido nucleico adyacente a un polinucleótido de inserción integrado proporcionando por lo tanto una señal de detección positiva cuando el polinucleótido de inserción integrado está presente y una señal de detección negativa cuando el polinucleótido de inserción integrado está ausente.

Los métodos están dirigidos a determinar la presencia de un polinucleótido de inserción integrado en una secuencia polinucleotídica diana amplificando una secuencia polinucleotídica adyacente al sitio de integración (es decir, unión). Una señal de amplificación positiva de los cebadores que indica la presencia de un polinucleótido de inserción integrado se logra empleando un polinucleótido bloqueante que hibrida con una secuencia polinucleotídica diana que abarca la unión en ausencia de un polinucleótido de inserción integrado. Véase la Figura 2. Preferiblemente, el bloqueante no puede ser extendido por una polimerasa.

El polinucleótido bloqueante compite por la hibridación con la secuencia polinucleotídica diana con el primer cebador (es decir, "el cebador competidor", ya sea directo o inverso) usado para amplificar la secuencia polinucleotídica adyacente al sitio de integración. En ausencia de un polinucleótido de inserción integrado, el polinucleótido bloqueante tiene una temperatura de fusión de hibridación que es relativamente mayor que la temperatura de fusión de hibridación del primer cebador (es decir, competidor). Por lo tanto, en ausencia de un polinucleótido de inserción integrado, el polinucleótido bloqueante hibrida con la secuencia polinucleotídica diana y no se amplifica ninguna secuencia polinucleotídica, lo que indica la ausencia de un polinucleótido de inserción integrado. En presencia de un polinucleótido de inserción integrado, el polinucleótido bloqueante tiene una temperatura de fusión de hibridación que es relativamente menor que la temperatura de fusión de hibridación del primer cebador (es decir, competidor). Por lo tanto, en presencia de un polinucleótido de inserción integrado, el primer cebador (es decir, competidor) hibrida con la secuencia polinucleotídica diana y se amplifica un amplicón a partir del primer cebador (es decir, competidor) y el segundo cebador (es decir, no competidor), lo que indica la presencia de un polinucleótido de inserción integrado. Véase la Figura 2.

En algunas realizaciones, el primer cebador y el polinucleótido bloqueante compiten por la hibridación con una subsecuencia en la secuencia polinucleotídica diana que está en el mismo lado de la unión que el sitio de hibridación del segundo cebador. Refiriéndonos a la Figura 1, en esta realización, el primer cebador y el polinucleótido bloqueante compiten por la hibridación con una secuencia en la primera secuencia diana. El segundo cebador también hibrida con la primera secuencia diana. En presencia de un polinucleótido de inserción integrado, el amplicón no incluye la secuencia del polinucleótido de inserción integrado.

En algunas realizaciones, el primer cebador y el polinucleótido bloqueante compiten por la hibridación con una subsecuencia en la secuencia polinucleotídica diana que está en el lado opuesto de la unión del sitio de hibridación del segundo cebador. Refiriéndonos a la Figura 1, en esta realización, el primer cebador y el polinucleótido bloqueante compiten por la hibridación con una secuencia en la segunda secuencia diana mientras que el segundo cebador hibrida con la primera secuencia diana. En presencia de un polinucleótido de inserción integrado, el amplicón incluye la secuencia del polinucleótido de inserción integrado. En esta realización, la secuencia polinucleotídica de inserción tiene una longitud que puede amplificarse de manera factible, por ejemplo, menos de aproximadamente 2 kb.

Opcionalmente, la Tm relativa de hibridación del polinucleótido bloqueante y el primer cebador puede revertirse de manera que la amplificación ocurra cuando el polinucleótido de inserción integrado está ausente. En este caso, el primer cebador y el polinucleótido bloqueante hibridan con una secuencia común en la primera secuencia diana próxima a la unión, en la que el bloqueante tiene una Tm mayor para hibridar con la secuencia común que el primer cebador cuando el polinucleótido de inserción está integrado en la unión y el polinucleótido bloqueante tiene una Tm menor para hibridar con la secuencia común que el primer cebador cuando el polinucleótido de inserción integrado no está presente en la unión, permitiendo de esta manera la amplificación cuando la inserción integrada está ausente.

Métodos

Los métodos encuentran su uso en la determinación de la presencia o ausencia en una secuencia polinucleotídica diana de un polinucleótido de inserción integrado, incluyendo sin limitación un elemento genético móvil, un transposón, una secuencia de fusión translocacional (p. ej., un oncogén, una secuencia de fusión de marcador tumoral, un sitio de inserción de transgén, incluyendo un sitio CRE/LOX), o una secuencia genómica retroviral.

Secuencia Polinucleotídica Diana

La secuencia polinucleotídica diana comprende una unión de una primera secuencia diana y una segunda secuencia diana, y opcionalmente un polinucleótido de inserción (véase la Figura 1). En algunas realizaciones, el polinucleótido de inserción es del mismo genoma que la secuencia polinucleotídica diana (p. ej., un transposón, una secuencia de fusión translocacional). En algunas realizaciones, los métodos se usan para determinar la presencia o ausencia de una secuencia de fusión por translocación de un marcador tumoral, por ejemplo las variantes de corte y empalme del ARN de c-erb-B2; fusión bcr/abl; y translocaciones que afectan a Bcl-2 o Bcl-10.

En algunas realizaciones, el polinucleótido de inserción es de un genoma diferente que la secuencia polinucleotídica diana (p. ej., un elemento genético móvil, una secuencia genómica retroviral). El genoma diferente puede ser del mismo organismo o de un organismo diferente. En algunas realizaciones, los métodos se usan para determinar la presencia o ausencia de un elemento genético móvil integrado en un genoma anfitrión bacteriano que proporciona resistencia a antibiótico.

En algunas realizaciones, los métodos pueden llevarse a cabo para identificar la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado en un genoma anfitrión diana. El genoma anfitrión puede ser de cualquier fuente. El ADN genómico puede ser procariota o eucariota. Puede ser de bacterias, hongos, plantas o animales. El ADN genómico anfitrión puede ser de un patógeno de un anfitrión que sea una planta o animal, por ejemplo, viral, bacteriano, fúngico o parasítico. El ADN genómico puede ser, por ejemplo, de géneros bacterianos patogénicos para un anfitrión animal y capaz de desarrollar resistencia a agentes antimicrobianos, incluyendo Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia coli, Mycobacterium, Bacillus, Enterococcus, Enterobacter, Haemophilus, Pseudomonas, Klebsiella, Acinetobacter, Listeria, Helicobacter, Salmonella, Neisseria, Legionella, etc. En algunas realizaciones, el ADN genómico anfitrión es de una especie de Staphylococcus, por ejemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus vitulinus, Staphylococcus succinus, Staphylococcus simulans, Staphylococcus sciuri, etc.

El ADN genómico anfitrión puede ser de un anfitrión animal. El animal puede ser un ser humano o no humano, y puede ser un mamífero, incluyendo animales domésticos y animales agrícolas. Los animales domésticos incluyen canino, felino, roedor, lagomorpha, hámster, chinchilla, rattus, murino. Los animales agrícolas incluyen equino, bovino, ovino, porcino y pollos. El ADN genómico puede ensayarse de células o tejidos, según sea apropiado.

El ADN genómico anfitrión puede purificarse y/o aislarse según técnicas muy conocidas en la técnica, por ejemplo, las descritas en Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Edición, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press y Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, 1987-2007, John Wiley & Sons.

Polinucleótido de Inserción

El polinucleótido de inserción puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que pueda insertarse entre dos secuencias polinucleotídicas unidas. El polinucleótido de inserción puede contener, aunque no es indispensable, un rasgo fenotípico identificable en el anfitrión cuando se integra en la secuencia polinucleotídica diana. Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, el polinucleótido de inserción puede ser una secuencia genómica retroviral, un transposón, una secuencia de fusión translocacional o un elemento genético móvil.

En algunas realizaciones, el polinucleótido de inserción es un elemento genético móvil que confiere resistencia a agentes antimicrobianos. Los elementos genéticos móviles pueden transmitir resistencia a antibióticos a bacterias que los tienen integrados en su ADN genómico incluyendo los que codifican secuencias que neutralizan el mecanismo antibacteriano de los antibióticos beta-lactama y aminoglicósido.

Por ejemplo, un elemento genético móvil que codifica una proteína de unión a penicilina puede conferir resistencia bacteriana a los antibióticos beta lactama. Los antibióticos beta lactama ejemplificados incluyen meticilina, penicilinas (p. ej., penicilina G, penicilina V), amoxicilina, ampicilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, nafcilina, carbenicilina, ticarcilina, mezlocilina, azlocilina, piperacilina, y semejantes. Los antibióticos beta lactama se describen, por ejemplo, en el Capítulo 45 de Goodman and Gilman's Pharmacological Basis of Therapeutics, eds., Hardman y Limbird, 2001, McGraw-Hill. Un ejemplo de un elemento genético móvil que contiene resistencia a los antibióticos beta lactama es el complejo mecA, que codifica una proteína de unión a penicilina y confiere resistencia a meticilina, penicilinas y otros antibióticos beta lactama en bacterias cuando se integra en el genoma bacteriano anfitrión. Los números de registro de GenBank ejemplificados para las secuencias polipeptídicas de proteínas de unión a penicilina incluyen YP_252006; CAH17594, AAY60807; BAB07108; CAC95693; AAK39559; NP_716793; y AAU27457. Los números de registro de GenBank ejemplificados para secuencias nucleotídicas que codifican polipéptidos de proteínas de unión a a penicilina incluyen NC_007168 (GeneID 3482097); AY894415; AP006716; AM048803; Y13096; EFY17797; EFA290435; y AE17323. Las proteínas de unión a penicilina pueden caracterizarse por varios restos estructurales proteicos comunes, incluyendo MecA_N (pfam05223), PBP_dímero (pfam03717) y Transpeptidasa (pfam00905).

Un elemento genético móvil que codifica una aminoglicósido fosfotransferasa o una aminoglicósido acetiltransferasa puede conferir resistencia bacteriana a antibióticos aminoglicósido. Los antibióticos aminoglicósido ejemplificados incluyen gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, kanamicina, estreptomicina y neomicina. Los antibióticos aminoglicósido se describen, por ejemplo, en el Capítulo 46 de Goodman and Gilman's, supra. Los números de registro de GenBank ejemplificados para las secuencias polipeptídicas aminoglicósido fosfo o acetiltransferasa incluyen YP_253526; NP_115315; CAD60196; AAC53691; AAX82584; AAK63041; AAT61777; AAG13458; AAK63040; y CAH19071. Los números de registro de GenBank ejemplificados para las secuencias nucleotídicas que codifican polipéptidos aminoglicósido fosfo o acetiltransferasa incluyen NC_007168 (GeneID 3482424). Las aminoglicósido fosfo o acetiltransferasas pueden caracterizarse por restos estructurales proteicos comunes, incluyendo APH (familia de enzimas fosfotransferasa, pfam01636) y Acetiltransf_1 (familia acetiltransferasa (GNAT), pfam00583).

Un polinucleótido de inserción tiene una longitud de al menos 10 bases nucleotídicas, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 10, 20, 50, 100, 500, 1.000, 1.500, 2.000 bases nucleotídicas, o más.

Sitios de Integración

Una secuencia polinucleotídica diana que puede integrar un polinucleótido de inserción tendrá uno o más sitios de integración. El sitio de integración puede determinarse por la secuencia polinucleotídica diana o por la naturaleza del polinucleótido de inserción. Los métodos son generalmente apropiados para detectar secuencias de integración integradas en sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio (p. ej., integrasa Cre, Flip o PhiC31), incluyendo sin limitación loxP (p. ej., loxP2, loxP3, loxP23, loxP511, loxB, loxC2, loxL, loxR), frt, dif, flp y secuencias de integración diana att. Éstas son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Sorrell y Kolb, Biotechnol. Adv. (2005); véase también, Fluit y Schmitz, Clin Microbiol Infect (2004) 10:272).

En Staphylococcus, un sitio para la integración (es decir, sitio de unión) del complejo SCCmec que porta el gen mecA es el sitio attB en el marco de lectura abierto orfX. Las secuencias de marco de lectura abierto orfX de Staphylococcus ejemplificadas incluyen los números de registro de GenBank NC_007168 (GeneID 3482010); NC_002758 (GeneID 1119986) y NC_007350 (GeneID 3615252).

Cebadores

Los cebadores de la invención son capaces de actuar como un punto de inicio de la síntesis de ADN en condiciones que permiten la amplificación, en la que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador complementario a una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de cuatro diferentes nucleósidos trifosfato y un agente para la extensión (p. ej., una ADN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada (véanse, por ejemplo, Molecular Diagnostic PCR Handbook, Viljoen, et al., eds., 2005 Kluwer Academic Pub.; PCR Protocols, Bartlett et al., eds., 2003, Humana Press; y PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach, et al., eds., 2003, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Un cebador es preferiblemente un ADN monocatenario. La longitud apropiada de un cebador depende, por ejemplo, de la temperatura de fusión de hibridación (Tm) pretendida y la localización del cebador pero típicamente varía de 10 a 50 nucleótidos, preferiblemente de 15-35 ó 18-22 nucleótidos. Las moléculas de cebador cortas requieren generalmente temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del ácido nucleico molde, pero debe ser lo suficientemente complementario para hibridar con el molde. En algunas realizaciones, los cebadores de la invención pueden no tener emparejamientos erróneos, el mismo número de emparejamientos erróneos (p. ej., 0, 1, 2, 3, 4, 5, etc.) o menos emparejamientos erróneos en comparación con el polinucleótido bloqueante. Los cebadores de la invención también pueden carecer de emparejamientos erróneos para la hibridación. El diseño de cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia diana dada es muy conocido en la técnica y se describe, por ejemplo, en la bibliografía citada en la presente memoria.

Los primeros cebadores (directo o inverso) de la invención compiten con el polinucleótido bloqueante para hibridar con una secuencia común en la secuencia polinucleotídica diana (p. ej., desplazamiento competitivo basado en la Tm relativa). Los primeros cebadores se diseñan para tener una temperatura de fusión de hibridación relativamente menor en comparación con la temperatura de fusión de hibridación del polinucleótido bloqueante cuando no está presente ningún nucleótido de inserción. Los primeros cebadores se diseñan además para tener una temperatura de fusión de hibridación relativamente mayor en comparación con la temperatura de fusión de hibridación del polinucleótido bloqueante cuando está presente un polinucleótido de inserción.

En algunas realizaciones, la temperatura de fusión de hibridación del primer cebador (es decir, competidor) será entre aproximadamente 5ºC-15ºC mayor o menor en comparación con el polinucleótido bloqueante, según sea apropiado. En algunas realizaciones, la temperatura de fusión de hibridación del primer cebador es aproximadamente 5ºC, 6ºC, 7ºC, 8ºC, 9ºC, 10ºC, 11ºC, 12ºC, 13ºC, 14ºC ó 15ºC mayor o menor en comparación con el polinucleótido bloqueante, según sea apropiado. En algunas realizaciones, la diferencia en la temperatura de fusión de hibridación puede ser más o menos que este intervalo ejemplificado.

El primer y segundo cebadores de la invención pueden tener una temperatura de fusión de hibridación que varía de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 65ºC, entre aproximadamente 55ºC a aproximadamente 60ºC, por ejemplo. En algunas realizaciones, la temperatura de fusión de hibridación de un cebador es aproximadamente 50ºC, 51ºC, 52ºC, 53ºC, 54ºC, 55ºC, 56ºC, 57ºC, 58ºC, 59ºC, 60ºC, 61ºC, 62ºC, 63ºC, 64ºC ó 65ºC. Si embargo, la temperatura de fusión de hibridación del primer y segundo cebadores puede ser mayor o menor que este intervalo de temperatura.

Los métodos para diseñar un polinucleótido para que tenga una temperatura de fusión de hibridación deseada se aplican tanto a los cebadores como a los bloqueantes, y son conocidos en la técnica. La temperatura de fusión de hibridación puede ajustarse, por ejemplo, por el número de nucleósidos guanosina (G) o citidina, ajustando la longitud del polinucleótido, o incorporando una o más bases que tienen emparejamiento erróneo con la secuencia polinucleotídica diana. Generalmente, los polinucleótidos con un mayor número de nucleósidos G o C, de mayor longitud, o con un mayor número de nucleósidos con emparejamiento correcto tendrán temperaturas de fusión de hibridación mayores. En algunas realizaciones, las diferencias en la temperatura de fusión de hibridación entre el primer cebador y el bloqueante se ajustan por la introducción de un mayor número de bases con emparejamiento erróneo con el polinucleótido diana en la secuencia bloqueante en comparación con la secuencia del primer cebador. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el primer cebador no tiene bases con emparejamiento erróneo con la secuencia polinucleotídica diana y el bloqueante tiene una o más bases con emparejamiento erróneo con la secuencia polinucleotídica diana.

En algunas realizaciones, el polinucleótido bloqueante y el primer cebador hibridan con una secuencia común en la primera secuencia diana próxima o adyacente a la unión que incluye la longitud completa del primer cebador. En algunas realizaciones, el polinucleótido bloqueante y el primer cebador hibridan con una secuencia común adyacente a la unión que es complementaria a una parte del primer cebador, por ejemplo 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% del extremo 5' o el extremo 3' del primer cebador. La secuencia común con la que hibridan de manera competitiva el polinucleótido bloqueante y el primer cebador puede tener una longitud de 10-30 bases, por ejemplo, una longitud de 12-25 ó 15-20 bases, por ejemplo, una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 bases, o ser más larga o más corta.

Los primeros cebadores se diseñan para hibridar con una secuencia de ácido nucleico en la secuencia polinucleotídica diana que está próxima o adyacente al sitio de integración para el polinucleótido de inserción. En las realizaciones en las que el primer cebador y el polinucleótido bloqueante compiten para hibridar con una secuencia común en la primera secuencia diana, el extremo 5' del primer cebador puede hibridar, p. ej., en aproximadamente 30, 25 ó 20 posiciones de bases nucleotídicas del sitio de integración, por ejemplo, en aproximadamente 15, 10 ó 5 posiciones de bases nucleotídicas del sitio de integración, o algunas veces colindante con el sitio de integración. En las realizaciones en las que el primer cebador y el polinucleótido bloqueante compiten para hibridar con una secuencia común en la segunda secuencia diana, el extremo 5' del primer cebador puede hibridar, p. ej., en aproximadamente 40, 35 ó 30 posiciones de bases nucleotídicas del sitio de integración, por ejemplo, en aproximadamente 25, 20 ó 15 posiciones de bases nucleotídicas del sitio de integración. El segundo cebador hibrida con una secuencia de ácido nucleico en la secuencia polinucleotídica diana de manera que el amplicón amplificado desde el primer y segundo cebadores puede detectarse de manera fiable. En algunas realizaciones, el amplicón tendrá una longitud de aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800, 1.000, 1.500, 2.000 bases de ácido nucleico, o cualquier número entero de bases de ácido nucleico con una longitud de aproximadamente 100-2.000, pero puede ser más corto o más largo, según sea apropiado.

En algunas realizaciones, el primer y segundo cebadores hibridan con una secuencia génica orfX en una secuencia polinucleotídica diana de Staphylococcus. En algunas realizaciones, el primer cebador es un cebador inverso que comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en

5'-CTTATGATACGCTTCTCCTCGC-3' (SEQ ID NO:2)

5'-GCTTCTCCACGCATAATCTTAAATGCTCT-3' (SEQ ID NO:9); y

5'-TACTTATGATACGCTTCTCC-3' (SEQ ID NO:10). En algunas realizaciones, el segundo cebador es un cedabor directo que comprende la secuencia 5'-AGGGCAAAGCGACTTTGTATTC-3' (SEQ ID NO:1).

Los cebadores pueden incorporar características adicionales que permitan la detección o inmovilización del cebador pero que no alteren la propiedad básica del cebador, es decir, la de actuar como un punto de inicio de la síntesis de ADN. Por ejemplo, los cebadores pueden contener una secuencia de ácido nucleico adicional en el extremo 5' que no hibrida con el polinucleótido diana, pero que facilita la clonación del producto amplificado. La región del cebador que es suficientemente complementaria con el molde para hibridar se refiere en la presente memoria como la región de hibridación. En algunas realizaciones, el primer cebador y/o el segundo cebador comprenden aproximadamente 1-10 bases citosina o guanosina consecutivas (SEQ ID NO:11) en su extremo 5', por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 bases citosina o guanosina consecutivas que preceden a la región de hibridación en el extremo 5'.

El primer y segundo cebadores también pueden modificarse e incluir al menos un nucleótido que contenga un azúcar distinto de la 2'-desoxi-D-ribosa o D-ribosa convencional encontrada en el ADN y ARN naturales. De manera similar, tal y como se usa en la presente memoria, un "polinucleótido modificado" se refiere a un polinucleótido que contiene un azúcar distinto de la 2'-desoxi-D-ribosa o D-ribosa convencional encontrada en el ADN y ARN naturales, y engloba a los nucleótidos en los que el azúcar está modificado por la adición o sustitución de un grupo lateral, o en los que el azúcar es un estereoisómero de la 2'-desoxi-D-ribosa o D-ribosa convencional encontrada en el ADN y ARN naturales, o ambas. Los términos no se usan para indicar que un cebador o nucleótido modificado es el producto de un proceso de modificación, sino para indicar la presencia de diferencias en el núcleo del polinucleótido respecto al ADN o ARN natural. En particular, los cebadores de la presente invención pueden sintetizarse para contener un nucleótido modificado, aunque la modificación química de un cebador que inicialmente sólo contiene nucleótidos convencionales puede proporcionar una síntesis alternativa.

Polinucleótido Bloqueante

Los polinucleótidos bloqueantes o de bloqueo ("bloqueantes") de la invención no operan como un punto de extensión en condiciones de amplificación o extensión en las que el primer y segundo cebadores operan como un punto de extensión. En algunas realizaciones, esto es porque tienen un resto bloqueante unido a su extremo 3' o porque carecen de un resto nucleofílico unido a su extremo 3' (p. ej., un resto hidroxilo). Un polinucleótido bloqueante es, preferiblemente, un ADN monocatenario. La longitud apropiada de un polinucleótido bloqueante depende, por ejemplo, de la temperatura de fusión de hibridación (Tm) pretendida y de la localización del bloqueante pero típicamente varía de 25 a 60 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 30-50 ó 35-45 nucleótidos, o cualquier número entero de bases nucleotídicas en estos intervalos. Los polinucleótidos bloqueantes más cortos requieren generalmente temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Un polinucleótido bloqueante no necesita reflejar la secuencia exacta del ácido nucleico molde, pero debe ser suficientemente complementario para hibridar con el molde. Un polinucleótido bloqueante puede hibridar con un segmento de secuencia más largo o más corto de la primera secuencia diana respecto al primer cebador. Un polinucleótido bloqueante puede ser más largo o más corto que un primer cebador.

La Tm del polinucleótido bloqueante puede variarse ajustando uno o más de varios parámetros, incluyendo por ejemplo, su longitud, la localización y secuencia complementaria del polinucleótido diana con el que hibrida (es decir, condición de hibridación), y el número de emparejamientos erróneos interno. Los polinucleótidos bloqueantes de la invención pueden tener cero, una, dos, tres, cuatro o más bases nucleotídicas internas con emparejamiento erróneo con la secuencia polinucleotídica diana, por ejemplo. Las bases con emparejamiento erróneo están localizadas preferiblemente en la región del bloqueante que hibrida con la primera o segunda secuencia diana, es decir, la subsecuencia en la secuencia polinucleotídica diana en la que el primer cebador y el bloqueante compiten para hibridar. El diseño de las secuencias polinucleotídicas para hibridar con una secuencia nucleotídica diana es muy conocido en la técnica y se describe, por ejemplo, en la bibliografía citada en la presente memoria.

El polinucleótido bloqueante compite con el primer cebador de la invención para hibridar con una secuencia común en la primera o segunda subsecuencia diana en la secuencia polinucleotídica diana. Véanse las Figuras 1 y 2. La secuencia diana común hibridada de manera competitiva por el polinucleótido bloqueante y el primer cebador puede ser complementaria a la longitud completa del primer cebador o a una parte del primer cebador. Los polinucleótidos bloqueantes se diseñan para tener una temperatura de fusión de hibridación relativamente mayor en comparación con la temperatura de fusión de hibridación del primer cebador cuando no está presente ningún nucleótido de inserción. Los polinucleótidos bloqueantes se diseñan además para tener una temperatura de fusión de hibridación relativamente menor en comparación con la temperatura de fusión de hibridación del primer cebador cuando está presente un polinucleótido de inserción. En algunas realizaciones, la temperatura de fusión de hibridación del polinucleótido bloqueante será entre aproximadamente 5ºC-15ºC mayor o menor en comparación con el primer cebador, según sea apropiado. En algunas realizaciones, la temperatura de fusión de hibridación del polinucleótido bloqueante es aproximadamente 5ºC, 6ºC, 7ºC, 8ºC, 9ºC, 10ºC, 11ºC, 12ºC, 13ºC, 14ºC ó 15ºC mayor o menor en comparación con el primer cebador, según sea apropiado. En algunas realizaciones, la diferencia en la temperatura de fusión de hibridación puede ser más o menos que este intervalo ejemplificado.

Por ejemplo, los polinucleótidos bloqueantes de la invención pueden tener una temperatura de fusión de hibridación que varía de aproximadamente 60ºC a aproximadamente 75ºC, por ejemplo, entre aproximadamente 65ºC a aproximadamente 70ºC, cuando no está presente ningún nucleótido de inserción. En algunas realizaciones, la temperatura de fusión de hibridación de los polinucleótidos bloqueantes cuando no está presente ningún nucleótido de inserción es aproximadamente 60ºC, 61ºC, 62ºC, 63ºC, 64ºC, 65ºC, 66ºC, 67ºC, 68ºC, 69ºC, 70ºC, 71ºC, 72ºC, 73ºC, 74ºC ó 75ºC. Los polinucleótidos bloqueantes pueden tener una temperatura de fusión de hibridación que varía de aproximadamente 40ºC a aproximadamente 55ºC, por ejemplo, entre aproximadamente 45ºC a aproximadamente 50ºC, cuando está presente un nucleótido de inserción. En algunas realizaciones, la temperatura de fusión de hibridación de los polinucleótidos bloqueantes cuando está presente un nucleótido de inserción es aproximadamente 40ºC, 41ºC, 42ºC, 43ºC, 44ºC, 45ºC, 46ºC, 47ºC, 48ºC, 49ºC, 50ºC, 51ºC, 52ºC, 53ºC, 54ºC ó 55ºC.

Los polinucleótidos bloqueantes se diseñan para hibridar con una secuencia de ácido nucleico en la secuencia polinucleotídica diana que cubra el sitio de integración para el polinucleótido de inserción. Los polinucleótidos bloqueantes pueden hibridar aproximadamente 30, 25, 20, 15 ó 10 posiciones de bases nucleotídicas que se extienden a lo largo del sitio de integración o sitio de unión.

En algunas realizaciones, el polinucleótido bloqueante hibrida con una secuencia génica orfX en un genoma anfitrión de Staphylococcus, que flanquea un sitio de integración attB. En algunas realizaciones, el polinucleótido bloqueante comprende una o más secuencias polinucleotídicas seleccionadas del grupo que consiste en: 5'-CA
GAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGCCTCTCCTCGC-3' (SEQ ID NO:3); 5'-TAAAAAACTCCTCCGCTACT
TATGATACGCTTCTCCTCGC-3' (SEQ ID NO:4); 5'-CTCCTCATACAGAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGC
CTCTCCTCGC-3' (SEQ ID NO:6); 5'-CTCCTCATACAGAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGCCTCTCCACG
CATAATC-3' (SEQ ID NO:7); y 5'-CTCCTCATACAGAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGCCTCTCCACGCA
TAATCTTAAATGC-3' (SEQ ID NO:8).

Los pares ejemplificados de polinucleótidos bloqueantes y primeros cebadores (aquí, cebadores inversos) que hibridan con una secuencia de ácido nucleico común incluyen los listados en la Tabla 1, a continuación.

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TABLA 1

1

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Los polinucleótidos bloqueantes comprenden preferiblemente un resto bloqueante en su extremo 3', que evita su extensión. Los restos bloqueantes ejemplificados incluyen reemplazar el grupo hidroxilo 3'-terminal por un hidrógeno, un amino o un grupo fosfato. En algunas realizaciones, el resto bloqueante en el polinucleótido bloqueante es un fosfato o hexilamina.

Polinucleótidos Modificados

Tanto los cebadores como los polinucleótidos bloqueantes contendrán generalmente enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, como se indica en la presente memoria, pueden usarse análogos de ácidos nucleicos que pueden tener núcleos alternativos, incluyendo, por ejemplo y sin limitación, fosforamida (Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49(10):1925 y las referencias citadas en él; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81:579; Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids. Res. 14:3487; Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; y Pauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26:1419), fosforotioato (Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437; y Pat. de EEUU No. 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321), uniones O-metilfosforoamidita (véase Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992); y núcleo de ácido nucleico peptídico (PNA) y núcleos de ácido nucleico bloqueado (LNA) y uniones (véanse, Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895; Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008; Nielsen (1993) Nature 365:566; y Carlsson et al. (1996) Nature 380:207, Demidov, Trends Biotechnol (2003) 21:4-7; y Vester y Wengel, Biochemistry (2004) 43:13233-41.

Otros análogos de ácido nucleico incluyen aquellos con núcleos cargados positivamente (Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097); núcleos no iónicos (Pat. de EEUU Nos. 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 y 4.469.863; Angew (1991) Chem. Intl. Ed. English 30:423; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; Letsinger et al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597; Capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, Ed. Y.S. Sanghvi y P. Dan Cook; Mesmaeker et al. (1994) Biorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395; Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; y Tetrahedron Lett. 37:743 (1996) y núcleos sin ribosa, incluyendo los descritos en las Pat. de EEUU Nos. 5.235.033 y 5.034.506, y los Capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, Ed. Y.S. Sanghvi y P. Dan Cook, cada una de cuyas referencias se incorpora por referencia. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también están incluidos en la definición de ácidos nucleicos (véase Jenkins et al. (1995) Chem. Soc. Rev. p169-176). También se describen varios análogos de ácido nucleico, p. ej., en Rawls, C & E News Jun. 2, 1997 página 35, que se incorpora por referencia. Estas modificaciones del núcleo ribosa-fosfato pueden usarse para facilitar la adición de restos adicionales tales como marcadores, o para alterar la estabilidad y vida media de dichas moléculas en entornos fisiológicos.

Además de las bases heterocíclicas naturales que se encuentran típicamente en los ácidos nucleicos (p. ej., adenina, guanina, timina, citosina y uracilo), los análogos de ácidos nucleicos también pueden incluir las que tienen bases heterocíclicas o modificadas no naturales, muchas de las cuales se describen, o se refieren de otra manera, en la presente memoria. En particular, muchas bases no naturales se describen adicionalmente, por ejemplo, en Seela et al (1991) Helv. Chim. Acta 74:1790, Grein et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976, y Seela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640. Para ilustrar adicionalmente, se incluyen opcionalmente determinadas bases usadas en nucleótidos que actúan como modificadores de la temperatura de fusión (Tm). Por ejemplo, algunas de éstas incluyen 7-deazapurinas (p. ej., 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, etc.), pirazolo[3,4-d]pirimidinas, propinil-dN (p. ej., propinil-dU, propinil-dC, etc.). Véase la Pat. de EEUU No. 5.990.303. Otras bases heterocíclicas representativas incluyen, p. ej., hipoxantina, inosina, xantina; 8-aza derivados de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; 7-deaza-8-aza derivados de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; 6-azacitosina; 5-fluorocitosina; 5-clorocitosina; 5-yodocitosina; 5-bromocitosina; 5-metilcitosina; 5-propinilcitosina; 5-bromoviniluracilo; 5-fluorouracilo; 5-clorouracilo; 5-yodouracilo; 5-bromouracilo; 5-trifluorometiluracilo; 5-metoximetiluracilo; 5-etiniluracilo; 5-propiniluracilo. Los ejemplos de bases y nucleótidos modificados también se describen, p. ej., en las Pat. de EEUU Nos. 5.484.908, 5.645.985, 5.830.653, 6.639.059, 6.303.315 y Pub. de Solicitud de Pat. de EEUU No. 2003/0092905.

Reacciones de Amplificación

La amplificación de un molde de ARN o ADN usando reacciones es muy conocida (véanse las Pat. de EEUU Nos. 4.683.195 y 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)). Los métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR) pueden usarse para amplificar secuencias de ácido nucleico de secuencias de ADN diana directamente a a partir de ARNm, a partir de ADNc, a partir de bibliotecas genómicas o bibliotecas de ADNc. La reacción se lleva a cabo preferiblemente en un ciclador térmico para facilitar los tiempos de incubación a las temperaturas deseadas. Véase, p. ej., PCR PRIMER, A LABORATORY MANUAL (Dieffenbach, ed. 2003) Cold Spring Harbor Press.

Las condiciones de la reacción de PCR ejemplares que permiten la amplificación de un amplicón comprenden típicamente ciclos bien de dos o tres etapas. Los ciclos de dos etapas tienen una etapa de desnaturalización seguida de una etapa de hibridación/elongación. Los ciclos de tres etapas comprenden una etapa de desnaturalización seguida de una etapa de hibridación seguida de una etapa separada de elongación.

En algunas realizaciones, un amplicón amplificado en presencia de un polinucleótido de inserción integrado en el polinucleótido diana se detecta por PCR en tiempo real. La RT-PCR en tiempo real es un método que utiliza secuencias de ADN específicamente obtenidas por ingeniería (dos cebadores y una sonda marcada con fluorescencia) para detectar y cuantificar secuencias de ADN diana. La sonda contiene un marcador informador fluorescente en un extremo y un marcador de apantallamiento en el otro. Durante cada ciclo de amplificación, la sonda se une en primer lugar a la secuencia de ADN diana, seguido de la unión de los cebadores. Al copiarse la cadena de ADN, el marcador informador se libera de la sonda y emite una señal fluorescente. La cantidad de fluorescencia aumenta con cada ciclo de PCR en proporción a la cantidad de ADN diana. Esto resulta en la detección y cuantificación directa de la secuencia de ADN diana con un alto grado de especificidad, precisión y sensibilidad.

En algunas realizaciones, las reacciones de amplificación múltiple se llevan a cabo por PCR múltiple. Las reacciones de PCR múltiple se refieren a una reacción de PCR en la que más de un conjunto de cebadores se incluye en la mezcla de reacción lo que permite la amplificación de 2 o más ADN diana diferentes por PCR en un único tubo de reacción. La PCR múltiple puede ser cuantitativa y puede evaluarse en "tiempo real". Las reacciones de PCR múltiple son útiles para propósitos de validación, diagnóstico y pronóstico. Las reacciones de PCR múltiple pueden llevarse a cabo usando ciclado térmico manual o automático. Puede usarse cualquier ciclador térmico disponible comercialmente, tal como, p. ej., el ciclador Perkin-Elmer 9600. Usando PCR múltiple al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100
o más polinucleótidos diana pueden evaluarse para la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado.

Las reacciones de amplificación isotérmica también son conocidas y pueden usarse según los métodos de la invención. Los ejemplos de reacciones de amplificación isotérmica incluyen amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) (Walker, et al. Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6 (1992); Walker PCR Methods Appl 3(1):1-6 (1993)), amplificación mediada por transcripción (Phyffer, et al., J. Clin. Microbiol. 34:834-841 (1996); Vuorinen, et al., J. Clin. Microbiol. 33:1856-1859 (1995)), amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) (Compton, Nature 350(6313):91-2 (1991), amplificación por círculo rodante (RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12(1):75-99 (1999)); Hatch et al., Genet. Anal. 15(2):35-40 (1999)) y amplificación de la señal de ADN ramificado (bADN) (véase, p. ej., Iqbal et al., Mol. Cell Probes 13(4):315-320 (1999)). Otros métodos de amplificación conocidos por los expertos en la técnica incluyen CPR (Reacción de la Sonda Cíclica), SSR (Replicación de Secuencia Autosostenida), SOA (Amplificación por Desplazamiento de Cadena), QBR (Replicasa Q-Beta), Re-AMP (anteriormente RAMP), RCR (Reacción de Reparación de Cadena), TAS (Sistema de Amplificación Basado en Transorción), y HCS.

La concentración de la sal de magnesio en la mezcla de reacción puede ser importante cuando se intenta copiar diferentes secuencias de ADN diana. Así, alguna variación en la concentración de la sal de magnesio, p. ej., cloruro de magnesio, puede requerirse para optimizar la reacción para amplificar las secuencias polinucleotídicas diana de interés. Un experto en la técnica puede variar la concentración de la sal o ión de magnesio presente en la mezcla de reacción para conseguir las condiciones apropiadas para la amplificación.

En algunas realizaciones, se incluye un segundo par de cebadores en la reacción de amplificación que permite la amplificación de una secuencia control en el polinucleótido diana, por ejemplo, para cuantificar la cantidad de polinucleótido diana en un ensayo.

En algunas realizaciones, puede optimizarse la relación molar de uno o más de los polinucleótidos bloqueantes respecto al primer cebador competitivo en la reacción de amplificación. En algunas realizaciones, la relación molar de uno o más de los polinucleótidos bloqueantes respecto al primer cebador competitivo en la reacción de amplificación es mayor de una relación molar 1:1 de polinucleótido(s) bloqueante(s) respecto al primer cebador, por ejemplo, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 30:1, por ejemplo, aproximadamente una relación molar de 5:1, 10:1, 20:1, 25:1 ó 30:1 de polinucleótido(s) bloqueante(s) respecto al primer cebador.

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Detección de los Polinucleótidos Amplificados

Las secuencias de ácido nucleico amplificadas ("amplicones") pueden detectarse usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, los amplicones pueden detectarse en un gel de agarosa usando bromuro de etidio. La presencia de un polinucleótido de inserción se indica por la presencia de una señal de amplicón o la presencia incrementada de una señal de amplicón en comparación con una secuencia polinucleotídica diana control, por ejemplo, una secuencia polinucleotídica diana que se sabe que no tiene un polinucleótido de inserción, por ejemplo, un Staphylococcus aureus sensible a meticilina (MSSA).

En algunas realizaciones, los amplicones se detectan usando sondas que hibridan específicamente con el amplicón y son detectables después de la hibridación con el amplicón. Numerosos tipos de sondas son capaces de hibridar con y detectar una secuencia polinucleotídica particular. En algunos casos, la sonda también comprende un fluoróforo o una enzima, como se describe a continuación, lo que permite la detección de la unión de la sonda a su secuencia diana complementaria.

La concentración de la sonda debe ser suficiente para unirse a la cantidad de secuencias diana o control que se amplifican de manera que se proporciona una evaluación precisa de la cantidad de secuencia amplificada. Los expertos en la técnica reconocerán que la cantidad de concentración de sonda variará según la afinidad de unión de la sonda así como la cantidad de secuencia a unir. Las concentraciones de sonda típicas variarán de 0,01 \muM a 0,5 \muM. La longitud típica de la sonda variará de aproximadamente una longitud de 20-40 bases nucleotídicas, por ejemplo, aproximadamente una longitud de 25-35 bases nucleotídicas, o cualquier número entero de bases nucleotídicas en estos intervalos.

La presente invención puede emplear muchas clases diferentes de sondas de hibridación de ácidos nucleicos para la detección del amplicón. Típicamente, para la generación de la señal, las sondas utilizan un cambio en la fluorescencia de un fluoróforo debido a un cambio en su interacción con otra molécula o resto como consecuencia de un cambio en la distancia entre el fluoróforo y la molécula o resto que interacciona. Alternativamente, los amplicones pueden detectarse usando otros métodos, por ejemplo, usando sondas marcadas radiactivamente o marcadas enzimática-
mente.

En algunos casos, se emplean marcadores fluorescentes múltiples. En una realización preferida, se usan al menos dos marcadores fluorescentes que son miembros de una pareja de transferencia de energía resonante por fluorescencia (FRET). FRET es un fenómeno conocido en la técnica en el que la excitación de un marcador fluorescente se transfiere a otro sin la emisión de un fotón. Una pareja FRET consiste en un fluoróforo donante y un fluoróforo aceptor. El espectro de emisión de fluorescencia del donante y el espectro de absorción de fluorescencia del aceptor se superponen habitualmente, y las dos moléculas deben estar muy próximas. La distancia entre el donante y el aceptor a la que el 50% de los donantes está desactivado (transfiere energía al aceptor) se define por el radio de Forster (R_{o}) que es típicamente 10-100 \ring{A}. Los cambios en el espectro de emisión de fluorescencia que comprende las parejas FRET puede detectarse, indicando que están muy próximos (es decir, en 100 \ring{A} uno de otro). Esto resultará típicamente de la unión o disociación de dos moléculas, una de las cuales está marcada con un donante FRET y la otra de las cuales está marcada con un aceptor FRET, en el que dicha unión aproxima mucho la pareja FRET. La unión de dichas moléculas resultará en una emisión incrementada de la fluorescencia del aceptor y/o apantallamiento de la emisión de fluorescencia del donante.

Las parejas FRET (donante/aceptor) útiles en la invención incluyen, pero no están limitadas a, EDANS/fluoresceína, IAEDANS/fluoresceína, fluoresceína/tetrametilrodamina, fluoresceína/LC Red 640, fluoresceína/Cy 5, fluoresceína/Cy 5.5 y fluoresceína/LC Red 705.

En otro aspecto de FRET, puede emplearse una molécula donante fluorescente y una molécula aceptora no fluorescente ("apantallador"). En esta aplicación, la emisión fluorescente del donante se incrementará cuando el apantallador se desplace de la proximidad del donante y la emisión fluorescente disminuirá cuando el apantallador esté muy próximo al donante. Los apantalladores útiles incluyen, pero no están limitados a, DABCYL, QSY 7 y QSY 33. Las parejas donante/apantallador fluorescentes útiles incluyen, pero no están limitadas a EDANS/DABCYL, Texas Red/DABCYL, BODIPY/DABCYL, Lucifer yellow/DABCYL, cumarina/DABCYL y fluoresceína/marcador QSY 7.

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El experto en la técnica apreciará que FRET y el apantallamiento de la fluorescencia permiten la monitorización de la unión de moléculas marcadas en el tiempo, proporcionando una información dependiente de ciclo respecto al curso en el tiempo de las reacciones de unión.

En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico amplificada se detecta usando una sonda marcada en su extremo 5' con un fluoróforo y en su extremo 3' con un apantallador. En una realización adicional, el fluoróforo es fluoresceína (FAM) y el apantallador es QSY7. Alternativamente, el o los fluoróforos y/o el o los apantalladores pueden estar localizados en un sitio interno en la sonda.

En algunas realizaciones, la sonda detectable hibrida con un amplicón que corresponde con una secuencia orfX de Staphylococcus. En una realización adicional, la sonda detectable comprende la secuencia 5'-CGGCCTGCACAAG
GACGTCTTACAACGTAG-3' (SEQ ID NO:5).

Otro tipo de ensayo de sonda de hibridación con ácido nucleico utilizando una pareja FRET es el ensayo
"TaqMan®" descrito en Gelfand et al. Pat. de EUU No. 5.210.015 y Livak et al. Pat. de EEUU No. 5.538.848. La sonda es un polinucleótido monocatenario marcado con una pareja FRET. En un ensayo TaqMan®, una ADN polimerasa libera un único o múltiples nucleótidos por escisión de la sonda polinucleotídica cuando hibrida con una cadena diana. Esta liberación proporciona una manera para separar el marcador apantallador y el marcador fluoróforo de la pareja FRET.

Otro tipo más de ensayo de sonda de hibridación con ácido nucleico utilizando parejas FRET se describe en Tyagi et al. Pat. de EEUU No. 5.925.517, que utiliza sondas polinucleotídicas marcadas, que se refieren como "Balizas Moleculares". Véase Tyagi, S. y Kramer, F.R., Nature Biotechnology 14:303-308 (1996). Una sonda de baliza molecular es un polinucleótido cuyas regiones terminales hibridan entre sí para formar una horquilla en ausencia de diana pero que están separadas si la parte central de la sonda hibrida con su secuencia diana. Cuando la sonda hibrida con una diana, esto es, cuando la secuencia de reconocimiento de la diana hibrida con una secuencia diana complementaria, se forma una hélice relativamente rígida, causando que el híbrido precursor se desenrolle y que los brazos se
separen.

También pueden usarse sondas fluorescentes no FRET. Por ejemplo, los cambios en el espectro de absorción de la pareja marcadora pueden usarse como una señal detectable como una alternativa al cambio en la fluorescencia. Cuando se utiliza el cambio en la absorción, la pareja marcadora puede incluir dos cromóforos cualquiera, esto es, fluoróforos, apantalladores y otros cromóforos. La pareja marcadora puede incluso estar formada por cromóforos idénticos.

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Composiciones

La invención proporciona además composiciones, incluyendo por ejemplo, disoluciones, mezclas de reacción, y recipientes de reacción que comprenden el primer y segundo cebadores, polinucleótidos bloqueantes y opcionalmente sondas de detección, como se ha descrito anteriormente.

En algunas realizaciones, las composiciones comprenden el primer y segundo cebadores, y un polinucleótido bloqueante que cada uno hibrida con una secuencia orfX de Staphylococcus, en el que el primer cebador y el polinucleótido bloqueante compiten entre sí para hibridar con una subsecuencia común adyacente a un sitio de integración attB en la secuencia orfX. La hibridación del polinucleótido bloqueante se ve favorecida cuando no está presente el polinucleótido de inserción, y la hibridación del primer cebador se ve favorecida cuando está presente el polinucleótido de inserción (p. ej., un complejo SCCmec que comprende un gen mecA).

En algunas realizaciones, las composiciones incluyen una pluralidad de primer y segundo cebadores y/o una pluralidad de polinucleótidos bloqueantes, por ejemplo, para realizar PCR múltiple.

Las composiciones pueden incluir además una secuencia polinucleotídica diana (p. ej., una secuencia de ácido nucleico genómico de una célula anfitriona), bases nucleotídicas (dNTP incluyendo dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP), polimerasas, y tampones de reacción apropiados, sales e iones metálicos. El algunas realizaciones, la polimerasa es una Taq polimerasa, aunque puede incluirse cualquier polimerasa termoestable o ADN polimerasa adecuada para la amplificación de secuencias nucleotídicas o reacciones de extensión del ADN. Las polimerasas termoestables son muy conocidas en la técnica y están disponibles comercialmente (por ejemplo, de New England Biolabs, Ipswich, MA; Promega, Madison, WI; Stratagene, La Jolla, CA; Roche Applied Science, Indianapolis, IN). En algunas realizaciones, las composiciones incluyen además una o más sondas de detección para detectar la amplificación de un amplicón, por ejemplo, para la detección de la amplificación en tiempo real.

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Kits

La invención proporciona además kits que comprenden el primer y segundo cebadores, uno o más polinucleótidos bloqueantes y opcionalmente sondas de detección, como se ha descrito anteriormente para las composiciones y métodos. Los kits opcionalmente pueden comprender además un polinucleótido diana control, por ejemplo, una secuencia genómica control de una célula anfitriona que se sabe que tiene integrado o que se sabe que no tiene integrado un polinucleótido de inserción. Además, el kit puede incluir reactivos de amplificación, incluyendo nucleótidos (p. ej., A, C, G y T), una ADN polimerasa y tampones apropiados, sales y otros reactivos para facilitar las reacciones de amplificación. En algunas realizaciones, los kits incluyen además una o más sondas de detección para detectar la amplificación de un amplicón, por ejemplo, para la detección de la amplificación en tiempo real. En algunas realizaciones, los kits incluyen una pluralidad de primeros y segundos cebadores y/o una pluralidad de polinucleótidos bloqueantes, por ejemplo, para realizar PCR múltiple. Los kits también pueden incluir instrucciones escritas para el uso del kit para amplificar y controlar la amplificación de una muestra diana.

En algunas realizaciones, la invención proporciona kits que incluyen uno o más recipientes de reacción que tienen alicuotas de alguno o todos los componentes de la reacción de la invención en ellos. Las alicuotas pueden estar en forma líquida o seca. Los recipientes de reacción pueden incluir cartuchos para el procesamiento de las muestras u otros recipientes que permitan la contención, procesamiento y/o amplificación de las muestras en el mismo recipiente. En alguna realización, los kits comprenden además un sustrato multipocillo (p. ej., tira con múltiples recipientes, placa con múltiples recipientes), por ejemplo, para amplificar simultáneamente una pluralidad de polinucleótidos diana. Dichos kits permiten la detección fácil de los productos de la amplificación de la invención en dispositivos de amplificación estándar o portátiles.

En algunas realizaciones, los kits comprenden recipientes tales como cartuchos de procesamiento de las muestras útiles para la amplificación rápida de una muestra como se describe en Belgrader, P., et al., Biosensors and Bioelectronics 14:849-852 (2000); Belgrader, P., et al., Science, 284:449-450 (1999); y Northrup, M.A., et al., "A New Generation of PCR Instruments and Nucleic Acid Concentration Systems" en PCR PROTOCOLS (Sninsky, J.J. et al (eds.)) Academic, San Diego, Capítulo 8 (1998)).

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Ejemplos

Los ejemplos siguientes se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.

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Ejemplo 1 Detección de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) usando un polinucleótido bloqueante de la unión SCCmec

Las reacciones de RT-PCR en tiempo real (RT-PCR; ensayo de 5'-nucleasa) se realizaron para determinar la presencia o ausencia de un SCCmec integrado en el ADN genómico de aislados de MRSA y MSSA en el sitio de inserción. La reacción usó dos cebadores que hibridaban con secuencias orfX, una sonda marcada fluorescentemente y uno de dos polinucleótidos bloqueantes diseñados para acomodar polimorfismos de secuencia que se sabe que ocurren en la región orfX de S. aureus (a continuación).

cebador directo orfX (F1): 5'-AGGGCAAAGCGACTTTGTATTC-3'	(SEQ ID NO:1)
cebador inverso orfX (R11): 5'-CTTATGATACGCTTCTCCTCGC-3'	(SEQ ID NO:2)

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Se llevaron a cabo reacciones separadas en presencia de cada uno de las secuencias polinucleotídicas bloqueantes siguientes:

5'-CAGAATTTTTTAGTTTTACTTATGATACGCCTCTCCTCGC-PO_{3}-3'	(SEQ ID NO:12)
5'-TAAAAAACTCCTCCGCTACTTATGATACGCTTCTCCTCGC-PO_{3}-3'	(SEQ ID NO:13).

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Los resultados se muestran en la Tabla 2 y en la Figura 3.

TABLA 2

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2

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Como se puede ver en la Tabla, se amplificó una subsecuencia de la región orfX del ADN genómico de la cepa MSSA en ausencia del polinucleótido bloqueante. Sin embargo, la subsecuencia orfX no se amplificó cuando cualquiera de los dos polinucleótidos bloqueantes estaba presente en la reacción. Una diana en la región orfX se amplificó y se detectó con una señal positiva robusta del ADN genómico de MRSA en presencia o ausencia de cualquiera de los dos polinucleótidos bloqueantes.

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Ejemplo 2 Detección de orfX de ADN genómico de MRSA y MSSA en presencia o ausencia de un polinucleótido bloqueante de la unión SCCmec

Se realizó una RT-PCR para determinar el efecto de un polinucleótido bloqueante en la amplificación de un amplicón orfX de los genomas anfitriones de cepas MRSA y MSSA. Las reacciones de PCR se realizaron usando cebadores directos e inversos que hibridaban con orfX y la amplificación se detectó con una sonda marcada con FAM (a continuación).

cebador directo orfX (F1): 5'-AGGGCAAAGCGACTTTGTATTC-3'	(SEQ ID NO:1)
cebador inverso orfX (R11): 5'-CTTATGATACGCTTCTCCTCGC-3'	(SEQ ID NO:2)
sonda orfX: 5'-FAM-CGGCCTGCACAAGGACGTCTTACAACGTAG-Apantallador 3'	(SEQ ID NO:14)

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Los resultados se muestran en la Tabla 3 y en la Figura 4.

TABLA 3

3

Como puede verse en la Tabla 3, la subsecuencia orfX no se amplificó del ADN genómico de MSSA en presencia del polinucleótido bloqueante. En ausencia del bloqueante, se amplificó una subsecuencia orfX. La subsecuencia orfX se amplificó con una señal positiva robusta del ADN genómico de MRSA en presencia y ausencia de un polinucleótido bloqueante.

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Ejemplo 3 Ensayo del Bloqueante GCG49

En este ejemplo, el bloqueante GCG49 se ensayó para su capacidad de bloquear la amplificación de secuencias polinucleotídicas diana (orfX) en 80 aislados clínicos diferentes de MSSA. Las secuencias de las regiones orfX y attB de estos 80 aislados no se conocían, pero estos aislados se eligieron para representar una sección transversal de cepas de S. aureus que podrían encontrarse en el entorno clínico.

La secuencia nucleotídica de la cepa MSSA ATCC 35556 en la región orfX se muestra en la Tabla 4, junto con las secuencias del bloqueante, cebadores y sondas.

TABLA 4 Secuencias de MSSA Diana, Bloqueante GCG49 y Cebador de PCR

4

Procedimiento

Se obtuvieron extractos crudos de ADN de 80 aislados de MSSA en primer lugar sembrando en estrías estas cepas bacterianas en placas Petri que contienen medio agar. Se tomó una única colonia aislada de una cepa dada con un asa de inoculación, y se suspendió en un mililitro de agua de grado de biología molecular. Este proceso se repitió para los 80 aislados. Los tubos se cerraron, y se calentaron a 95ºC durante 10-15 minutos. Después de que se enfriaran las disoluciones, estos extractos de ADN se centrifugaron a 10.000 x g durante 5 minutos para eliminar los restos celulares. Se diluyó una alicuota de varios microlitros del sobrenadante que contiene el ADN 100 veces en un tampón Tris 10 mM (pH 8,3) que contiene 1 mM EDTA. Esta alicuota diluida de lisado se usó como la muestra de ADN de ensayo. La cantidad de ADN presente en estas muestras no se cuantificó. Debido al método sencillo usado para la preparación, era seguro que la cantidad de ADN variaba de preparación a preparación. Las muestras de ADN se sometieron a PCR cuantitativa en tiempo real con o sin la presencia del Bloqueante GCG49.

Los resultados se representan en las Figuras 5 y 6. En ausencia del polinucleótido bloqueante GCG49, OrfX se amplificó a partir del ADN genómico de las 80 cepas MSSA ensayadas. El valor C_{t} observado para estas RT-PCR es proporcional a la cantidad de ADN diana presente al comienzo de la reacción. El valor C_{t} será menor cuando está presente una cantidad mayor de ADN diana, y C_{t} será mayor cuando están presentes cantidades menores de ADN, es decir, cuando están presentes cantidades mayores de ADN la fluorescencia cruzará el umbral de detección en menos ciclos que cuando está presente una cantidad menor de ADN. Los valores C_{t} observados para estos aislados no bloqueados varió de 22 a 30. Esto sugiere que la cantidad de ADN genómico presente al comienzo de la reacción difería tanto como 256 veces de preparación a preparación.

El bloqueo se demuestra por un valor C_{t} incrementado para la detección de la subsecuencia orfX, cuando está presente el bloqueante, comparado con el C_{t} observado en ausencia del polinucleótido bloqueante. Este valor, el C_{t} delta (C_{t} de PCR con bloqueante presente-C_{t} de PCR sin bloqueante) indica la eficacia del polinucleótido bloqueante frente a una cepa dada. Sin embargo, el C_{t} delta no puede verse como un valor absoluto porque la cantidad de material de partida variaba significativamente de reacción a reacción.

Por ejemplo, un lisado que tiene un C_{t} de 30 en ausencia de bloqueante y un C_{t} de 45 en presencia de bloqueante, tiene un C_{t} delta de 15. En este ejemplo, un C_{t} delta de 15 indica la supresión completa de la amplificación de la subsecuencia orfX porque un C_{t} de 45 indica que no detectó producto de amplificación en 45 ciclos de PCR. Si el C_{t} de partida es 20 y el C_{t} delta es 15 esto no representaría una completa supresión de la señal orfX sino una reducción de \sim33.000 veces.

El impacto del polinucleótido bloqueante se demostró en todos los aislados ensayados aunque la eficacia del bloqueante mostró una variación considerable en los 80 aislados. En presencia del polinucleótido bloqueante, 35% de los aislados mostró una inhibición completa de la amplificación de orfX, 22% mostró una reducción de 1.000 a 16.000 veces en la amplificación de orfX, 15% mostró una reducción de 64 a 1.000 veces en la amplificación de orfX y 28% mostró una reducción de 8 a 64 veces en la amplificación de orfX.

Las secuencias publicadas de las regiones orfX y attB del genoma de S. aureus muestran que existen polimorfismos de secuencia entre cepas. Por lo tanto, es improbable que un único polinucleótido bloqueante sea eficaz para todas las cepas de MSSA. Se requerirán múltiples polinucleótidos bloqueantes para suprimir la amplificación de secuencias diana en las regiones orfX presentes en el rango de las cepas de MSSA encontradas. Por lo tanto, se espera que un polinucleótido bloqueante bien diseñado tenga un espectro de eficacia frente a un rango de cepas existentes, bloqueando eficazmente la amplificación de las secuencias orfX diana en un subconjunto particular de cepas con menos supresión completa de las secuencias orfX diana de otras cepas.

Por lo tanto, en determinados casos, será útil incluir una "mezcla" de dos o más bloqueantes para conseguir el bloqueo en un espectro amplio de polimorfismos en la secuencia polinucleotídica diana asociado con diferentes cepas de S. aureus.

Claims (15)

1. Un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado en un sitio de unión en una secuencia polinucleotídica diana, comprendiendo el método, poner en contacto el polinucleótido diana con un primer cebador, un segundo cebador, un polinucleótido bloqueante, una polimerasa, y uno o más nucleótidos trifosfato, en el que:

(i) el polinucleótido diana comprende una cadena polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana,

(ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el polinucleótido de inserción integrado está ausente,

(iii) el primer cebador hibrida con una primera región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de unión, de manera que

(iv) el segundo cebador hibrida con una segunda región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana,

de manera que cuando una secuencia de inserción integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, según lo cual se determina la presencia o ausencia del polinucleótido de inserción integrado en el sitio de unión en el polinucleótido diana.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la longitud completa del primer cebador hibrida con la primera secuencia diana de manera competitiva con el bloqueante, o en el que una parte del primer cebador hibrida con la primera secuencia diana de manera competitiva con el bloqueante.

3. El método de la reivindicación 1, en el que los nucleótidos trifosfato son nucleótidos dNTP, y/o en el que la polimerasa es una ADN polimerasa, y/o en el que la ADN polimerasa es una Taq polimerasa, y/o en el que el polinucleótido de inserción tiene una longitud de al menos 10 bases nucleotídicas.

4. El método de la reivindicación 1, (a) en el que el método se realiza en formato múltiple; y/o (b) que comprende además la etapa de exponer el polinucleótido diana a condiciones de amplificación.

5. El método de la reivindicación 4(b), en el que la amplificación se evalúa por PCR; o en el que la amplificación se evalúa por PCR en tiempo real.

6. Una mezcla de reacción para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado en un sitio de unión de una primera secuencia diana y una segunda secuencia diana en un polinucleótido diana, comprendiendo la mezcla de reacción, el polinucleótido diana, un primer cebador, un segundo cebador y un polinucleótido bloqueante, en el que:

(i) el polinucleótido diana comprende una cadena polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana,

(ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el polinucleótido de inserción integrado está ausente,

(iii) el primer cebador hibrida con una primera región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de unión, de manera que

(iv) el segundo cebador hibrida con una segunda región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana,

de manera que cuando una secuencia de inserción integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana.

7. La mezcla de reacción de la reivindicación 6, en la que el polinucleótido de inserción se integra en el sitio de unión, o en la que el polinucleótido de inserción no se integra en el sitio de unión.

8. La mezcla de reacción de la reivindicación 7, que comprende además nucleótidos dNTP; y/o que comprende además una ADN polimerasa, opcionalmente en la que la ADN polimerasa es una Taq polimerasa; y/o que comprende además una sonda para detectar el amplicón amplificado por PCR en tiempo real, y/o que comprende una pluralidad de bloqueantes para detectar un polinucleótido de inserción integrado en una pluralidad de diferentes polinucleótidos diana.

9. Un kit para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado en un sitio de unión de una primera secuencia diana y una segunda secuencia diana en un polinucleótido diana, comprendiendo el kit, un primer cebador, un segundo cebador y un polinucleótido bloqueante, en el que:

(i) el polinucleótido diana comprende una cadena polinucleotídica que comprende un sitio de unión que, cuando un polinucleótido de inserción integrado está ausente, abarca en un lado una primera secuencia diana y en el otro lado una segunda secuencia diana que es contigua a la primera secuencia diana,

(ii) el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas cuando el polinucleótido de inserción integrado está ausente,

(iii) el primer cebador hibrida con una primera región de la primera secuencia diana que está próxima al sitio de unión, de manera que

(iv) el segundo cebador hibrida con una segunda región de la primera secuencia diana que está lejos del sitio de unión, en el que el segundo cebador es capaz de cebar la síntesis de una copia de la primera secuencia diana que comprende la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana,

de manera que cuando una secuencia de inserción integrada está presente en el sitio de unión, el primer y segundo cebadores causan la amplificación exponencial de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana, y cuando una secuencia de inserción integrada está ausente del sitio de unión, el polinucleótido bloqueante hibrida con la primera y segunda secuencias diana contiguas de manera que se inhibe la amplificación de la primera y segunda regiones de la primera secuencia diana.

10. El método de la reivindicación 1, mezcla de reacción de la reivindicación 7 o kit de la reivindicación 9, en el que el primer cebador y el polinucleótido bloqueante son los dos sustancialmente complementarios a la primera región en el polinucleótido diana y el primer cebador tiene menos nucleótidos con emparejamiento erróneo que el polinucleótido bloqueante respecto a la primera región en el polinucleótido diana; o en el que el primer cebador es completamente complementario a la primera región en el polinucleótido diana y el polinucleótido bloqueante porta al menos un emparejamiento erróneo interno comparado con la primera región del polinucleótido diana.

11. El método de la reivindicación 1, mezcla de reacción de la reivindicación 7 o kit de la reivindicación 9, en el que la primera secuencia diana y la segunda secuencia diana son partes de orfX de Staphylococcus aureus, el sitio de unión es un sitio de integración attB, el polinucleótido de inserción es al menos una parte de un complejo SCCmec, y el polinucleótido diana es ADN de Staphylococcus aureus.

12. El método de la reivindicación 1, mezcla de reacción de la reivindicación 7 o kit de la reivindicación 9, en el que el polinucleótido bloqueante comprende un resto en su extremo 3' seleccionado del grupo que consiste en fosfato y hexilamina, o en el que el polinucleótido bloqueante comprende al menos una base análoga de ácido nucleico.

13. El kit de la reivindicación 9, que comprende además un polinucleótido diana control que comprende la primera secuencia diana y segunda secuencia diana.

14. El kit de la reivindicación 13, en el que el polinucleótido de inserción se integra en el sitio de unión, o en el que el polinucleótido de inserción no se integra en el sitio de unión.

15. El kit de la reivindicación 13, que comprende además una sonda para detectar el amplicón amplificado por PCR en tiempo real, y/o que comprende además un sustrato multipocillo.