ES2345965T3 - Metodo de prevencion de infeccion bacteriofaga de cultivos bacterianos. - Google Patents
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Abstract
Método para modificar un material de sustrato mediante un cultivo bacteriano que es capaz de ser metabólicamente activo en dicho sustrato, por lo cual el cultivo bacteriano no es susceptible al ataque por bacteriófagos, el método comprendiendo (i) aislar una cepa bacteriana que no es capaz de replicación de ADN en dicho material de sustrato pero es capaz de modificar metabólicamente el material de sustrato, en donde la cepa bacteriana es una cepa mutante que es auxotrófica con respecto a un compuesto que no está presente en el material de sustrato y que es requerido por la cepa para la replicación de ADN, (ii) propagar la cepa seleccionada en un medio en donde la cepa es capaz de replicarse para obtener un cultivo de dicha cepa, (iii) añadir el cultivo bacteriano obtenido al material de sustrato y mantener el material bajo condiciones donde el cultivo es metabólicamente activo, por lo cual, si el material de sustrato está contaminado con un bacteriófago, la actividad metabólica del cultivo bacteriano está sustancialmente sin afectar por el bacteriófago, y en donde el cultivo bacteriano es seleccionado del grupo que consiste en Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus, spp. Strepococcus spp., Propionibacterium spp., Bifidobacterium spp., Staphylococcus spp. Micrococcus spp., Bacillus, spp., Actinomycetes spp., Corynebacteríum spp. y Brevibacterium spp; y en donde el material de sustrato es un material iniciador para un producto comestible, el material es seleccionado del grupo que consiste en leche, un material vegetal, un producto cárnico, un mosto, un zumo de frutas, un vino, una masa y un rebozado; y en donde el cultivo bacteriano conforme es obtenido en el método se usa como un cultivo iniciador en la preparación de un producto seleccionado del grupo que consiste en un aroma lácteo, un producto aromatizante de queso, un producto alimenticio y un producto de pienso.
Description
Método de prevención de infección bacteriófaga
de cultivos bacterianos.
La presente invención se refiere al campo de
cultivos bacterianos que se usan industrialmente en la fabricación
de p. ej. productos alimenticios o productos de metabolito útiles.
En particular se proporcionan cepas bacterianas modificadas, que,
cuando son cultivadas en un material de sustrato seleccionado, no
son susceptibles al ataque por bacteriófagos, y han retenido su
capacidad de ser metabólicamente activas.
Los fallos de producción de cultivos bacterianos
provocados por infección por bacteriófagos se consideran como uno de
los problemas más importantes en el uso industrial de cultivos
bacterianos. Los bacteriófagos se han encontrado para muchas de las
cepas bacterianas usadas en la industria, tal como especies de
bacterias del ácido láctico p. ej. Lactococcus spp.,
Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., y
Estreptococcus spp., Propionibacterium spp., Bifidobacterium
spp., Staphylococcus spp. o Micrococcus spp. Además, las
infecciones por bacteriófagos también son bien conocidas en otras
especies industrialmente útiles tales como la Bacillus spp.,
Enterobacteriaceae spp. incluyendo E. coli,
Corynebacteríum spp., Actinomycetes spp. y Brevibacterium
spp.
En la industria alimentaria, los cultivos
iniciadores bacterianos del ácido láctico son usados ampliamente
para las fermentaciones alimenticias. Parece que entre los elementos
de las bacterias del ácido láctico Lactococcus spp. son las
más devastadas por infecciones por bacteriófagos. Un factor, que da
lugar a infecciones por bacteriófagos frecuentes en cultivos
iniciadores bacterianos del ácido láctico es el hecho de que las
condiciones de fermentación en la industria alimentaria incluyendo
la industria láctea son generalmente no estériles. Así, aún no ha
sido posible eliminar la contaminación por bacteriófagos bajo estas
condiciones industriales.
El desarrollo lítico de los fagos implica la
adsorción de los fagos a la superficie de la célula huésped,
inyección de ADN del fago en el interior de la célula, síntesis de
proteínas del fago, réplica del ADN del fago, ensamblaje de fagos de
la progenie y liberación de progenie del huésped. Mecanismos
mediados por células de interferencia con cualquiera de estos
eventos puede prevenir una infección por fago. La capacidad de los
cultivos bacterianos de resistir la infección por bacteriófagos
durante el uso industrial depende en gran parte de las
características de la cepa huésped afectando uno o más de los
mencionados mecanismos.
Así, se ha demostrado que los mecanismos de
resistencia o de defensa naturales a los bacteriófagos existen en
cepas bacterianas que aseguran un cierto nivel de protección contra
el ataque por bacteriófagos. Estos mecanismos de defensa natural
incluyen la inhibición de adsorción del fago, prevención de
penetración de ADN del fago, restricción del ADN del fago e
infección abortiva.
La prevención de contacto productivo entre fagos
y células bacterianas debido a los alterados receptores de la
superficie celular para fagos reduce inmensamente la capacidad de
los fagos de atacar las células. La adsorción de los fagos a la
superficie celular no es siempre suficiente para la translocación
del ADN del fago. Se ha demostrado que las proteínas de la membrana
celular de huésped específico están implicadas en la prevención de
penetración de ADN del fago.
La restricción/modificación es un mecanismo que
funciona por la cooperación de dos sistemas enzimáticos, una enzima
de restricción de clivaje del ADN y una enzima modificadora del ADN,
normalmente una metilasa. El mecanismo funciona por el clivaje del
ADN del fago, según entra en la célula.
La infección del fago abortivo se describe como
un mecanismo que interfiere con el desarrollo del fago después de
que la expresión en el fago haya iniciado. Esto puede eventualmente
llevar a un reducido nivel o terminación de la producción de la
progenie viable del fago.
No obstante, como muchos otros rasgos de las
cepas bacterianas que son importantes para el rendimiento
industrial, los mecanismos naturales de defensa del fago
anteriormente descritos han demostrado ser características
inestables, ya que pueden ser mediadas por plásmidos. Además, estos
mecanismos de defensa son frecuentemente específicos del fago, es
decir sólo son activos contra una gama limitada de tipos de
bacteriófagos. Por consiguiente, la técnica anterior no es
consciente de un mecanismo de resistencia asociado a la célula
huésped general y establemente mantenido contra la infección por
bacteriófagos.
En base de los mecanismos de los mencionados
mecanismos de defensa natural, la industria ha diseñado e
implementado estrategias para posiblemente reducir la infección por
bacteriófagos de cultivos bacterianos incluyendo cultivos
iniciadores para la fermentación de productos lácteos. Las
estrategias usadas actualmente incluyen el uso de cultivos
iniciadores mezclados y el uso alterno de cepas que tienen
diferentes perfiles de susceptibilidad al fago (rotación de
cepas).
\newpage
Tradicionalmente, los cultivos iniciadores en la
industria láctea son mezclas de cepas bacterianas del ácido láctico.
La composición compleja de los cultivos iniciadores mezclados
asegura que esté presente un cierto nivel de resistencia al ataque
en el fago. No obstante, un repetido subcultivo de cultivos de cepas
mezcladas da lugar a cambios imprevisibles en la distribución de
cepas individuales y finalmente la indeseada dominación de la cepa.
Esto a su vez puede llevar a una aumentada susceptibilidad al ataque
en el fago y riesgo de fallos de la fermentación.
La rotación de cepas bacterianas seleccionadas
que son sensibles a los diferentes fagos es otro enfoque para
limitar el desarrollo del fago. No obstante, es difícil e incómodo
identificar y seleccionar un número suficiente de cepas que tienen
perfiles de fago de diferentes tipos para proporcionar un programa
de rotación eficiente y confiable. Además, el uso continuado de
cepas requiere la monitorización cuidadosa por nuevos fagos
infecciosos y la necesidad de sustituir rápidamente una cepa que se
infecta por el bacteriófago nuevo por una cepa resistente al fago.
En plantas de fabricación donde se hacen grandes cantidades de
cultivos iniciadores en masa anticipadamente, una respuesta tan
rápida normalmente no es posible.
Estudios han demostrado que una capacidad de
crecimiento reducida de un cultivo bacteriano tal como una bacteria
de ácido láctico deficiente de proteinasa resulta en una
proliferación de fago reducida (Richardson et al., 1983,
1984). No obstante, tales cepas bacterianas están creciendo todavía
y son así aún susceptibles al ataque por fagos.
Así, la industria no tiene en su posesión
ninguna estrategia confiable para garantizar que los cultivos
bacterianos usados para fabricación industrial de productos
alimenticios u otros productos son resistentes contra ataques por
bacteriófagos. Además, ninguna de las estrategias actualmente usadas
previenen infecciones por cualquier tipo de bacteriófagos y ninguna
de estas estrategias son capaces de impedir que los bacteriófagos,
por un evento mutacional, eludan los mecanismos de resistencia de
las cepas de cultivo bacteriano.
Es por lo tanto un objetivo importante de la
presente invención proporcionar un método de prevenir la infección
por bacteriófagos de cultivos bacterianos que se usan en la
fabricación de productos alimenticios y otros productos, en donde
los cultivos son completamente resistentes al ataque por todo tipo
de bacteriófagos.
El artículo (Meagher et al, Cell, 1997,
Vol. 10, páginas 521-536) describe la expresión de
proteínas en minicelulas de E. coli por plásmidos
recombinantes.
El artículo (Helling et al, J.
Bacteriol., 1970, vol. 104, nº. 2, páginas
1027-1029) se refiere a los auxótrofos resistentes
al ácido nalidíxico de E. coli.
El artículo (Worland et al, Australian
Journal of Plant Physiology, 1999, 26(6), páginas
511-519) describe que los auxótrofos de purina de
Rhizobium, perturbados en nodulación, tienen múltiples cambios en la
síntesis de proteínas.
El artículo (Antón et al, J. Bacteriol
77(1): 117-8, 1959) describe una timina
"requiriendo" un variante de LAB (bacteria del ácido láctico).
No se dice en lugar alguno en este artículo que esta variante no es
replicante de ADN. Además, no hay nada descrito sobre la resistencia
al fago y uso para hacer un producto alimenticio/pienso.
El artículo (Ross et al, Appl Environ
Microbiol, 56(7): 2164-9, 1990) se refiere al
uso de thyA como marcador genético. No hay nada descrito
sobre la resistencia al fago y uso para hacer un alimento/producto
alimenticio.
El artículo (Pedersen et al, Appl Environ
Microbiol, 68(6):3010-23, 2002) fue publicado
en 2002.
El artículo (Deutch et al, J Bacteriol
106:197-203, 1971) describe cosas que pueden pasar
durante la incubación de un auxótrofo de timina de E.
Coli.
El artículo (Breheny et al, Aust J Diary
Technol, 30:145-148, 1975) describe las bacterias
del ácido láctico (LAB) " bloqueadas en la síntesis de
proteínas". Por consiguiente, en este artículo no están
divulgadas LAB que no son replicantes de ADN. Además, no hay nada
descrito sobre la resistencia al fago.
El artículo (Desjardins et al, J Dairy
Sci 73:1478-1484, 1990) describe algunos perfiles de
fermentación cinética de una LAB de tipo salvaje natural. Ya que es
de tipo salvaje es evidente que el artículo no divulga LAB que no
son replicantes de ADN. Además, no hay nada descrito sobre la
resistencia de fago.
WO95/10621 (Chr. Hansen) se refiere a los
mutantes supresores bacterianos del ácido láctico y su uso como
marcadores selectivos.
Por consiguiente, la invención proporciona en un
primer aspecto un método para modificar un material de sustrato
mediante un cultivo bacteriano que es capaz de ser metabólicamente
activo en dicho sustrato, por lo cual el cultivo bacteriano no es
susceptible al ataque por bacteriófagos, el método comprendiendo
- (i)
- aislar una cepa bacteriana que no es capaz de replicación de ADN, transcripción de ARN o síntesis de la proteína en dicho material de sustrato pero es capaz de modificar metabólicamente el material de sustrato,
- (ii)
- propagar la cepa seleccionada en un medio en donde la cepa es capaz de replicarse para obtener un cultivo de dicha cepa,
- (iii)
- añadir el cultivo bacteriano obtenido así al material de sustrato y mantener el material bajo condiciones donde el cultivo es metabólicamente activo,
por lo cual, si el material de sustrato se
contamina con un bacteriófago, la actividad metabólica del cultivo
bacteriano es sustancialmente inafectada por el bacteriófago, y en
donde el cultivo bacteriano es seleccionado del grupo que consiste
en Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp.,
Pediococcus, spp. Estreptococcus spp., Propionibacterium, spp.
Bifidobacterium spp., Estafilococcus spp., Micrococcus spp.,
Bacillus spp., Actinomycetes spp., Corinebacterium spp. y
Brevibacterium spp; y en donde el material de sustrato es un
material iniciador para un producto comestible, el material es
seleccionado del grupo que consiste en leche, un material vegetal,
un producto cárnico, un mosto, un zumo de frutas, un vino, una masa
y un rebozado; y en donde el cultivo bacteriano conforme se ha
obtenido en el método se usa como un cultivo iniciador en la
preparación de un producto seleccionado del grupo que consiste en un
aroma lácteo, un producto aromatizante de queso, un producto
alimenticio y un producto de pienso.
La invención está relacionada en otro aspecto al
uso de un cultivo conforme se ha obtenido en el método según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 como un cultivo iniciador
en la preparación de un producto seleccionado del grupo que consiste
en un aroma lácteo, un producto aromatizante de queso, un producto
alimenticio y un producto de pienso.
En un aspecto adicional, está proporcionada una
bacteria de ácido láctico mutante, en donde la cepa mutante es la
cepa thyA mutante de Lactococcus lactis MBP71
depositada bajo el número de registro DSM 12891.
Así, en su aspecto más amplio la invención
proporciona un método para modificar un material de sustrato
mediante un cultivo bacteriano que es capaz de ser metabólicamente
activo en dicho sustrato, por lo cual el cultivo bacteriano no es
susceptible al ataque por bacteriófagos, dicho método que comprende
las etapas (i) a (iii) según se ha mencionado anteriormente. Como se
utiliza en la presente, la expresión "modificar un material de
sustrato" se usa de forma intercambiable con el término
"fermentación" y se refiere a cualquier descomposición aeróbica
o anaeróbica de compuestos orgánicos por un cultivo bacteriano con
la producción de un producto final. Además, se apreciará que la
expresión "metabólicamente activo" se refiere a la capacidad
del cultivo bacteriano de convertir un material de sustrato tal como
p. ej. leche o un azúcar.
En el presente contexto, la expresión "no
susceptible al ataque por bacteriófagos" incluye la capacidad de
una célula huésped de ser metabólicamente activa aunque un
bacteriófago se adsorbe a la superficie de la célula huésped e
inyecta su ADN en la célula huésped. Como se utiliza en la presente,
el término "bacteriófagos" se refiere a cualquier variante de
virus que infecta bacterias, incluyendo el grupo de bacteriófagos
con cabeza alargada, bacteriófagos con cabeza isométrica y grupo
P335 de bacteriófagos.
Conforme a la invención, el método comprende en
un aspecto el aislamiento de una cepa bacteriana que no es capaz de
replicación de ADN, transcripción de ARN o síntesis de proteínas en
un material de sustrato específicamente definido, pero es capaz de
modificar metabólicamente dicho material. Se entenderá que en este
contexto la expresión "un material de sustrato específicamente
definido" se refiere a un material de sustrato que es limitado
con respecto a al menos un compuesto nutriente que es requerido por
la cepa bacteriana para la replicación de ADN, transcripción de ARN
o síntesis de proteínas. Evidentemente, fue un hallazgo muy
sorprendente que es posible proporcionar tales cepas bacterianas no
proliferantes que son incapaces de crecer en materiales de sustrato
específicamente definidos, pero que han retenido su capacidad de ser
metabólicamente activas. Como se utiliza en la presente, la
expresión "cepa bacteriana no proliferante" se refiere a una
cepa bacteriana que es incapaz de multiplicarse en un material de
sustrato específicamente definido.
En una forma de realización particularmente útil
de la presente invención, el mencionado material de sustrato
específico es limitado con respecto a al menos un compuesto
nutriente que es requerido por la cepa bacteriana para la
replicación de ADN, transcripción de ARN o síntesis de proteínas.
Tales compuestos incluyen aminoácidos o bases nitrógenosas tales
como las bases de purina y pirimidina.
Así, el crecimiento de la cepa bacteriana es
evitado debido a la falta de capacidad de las cepas de sintetizar el
compuesto específico con respecto al cual el sustrato es limitado.
Tal cepa mutante que ha perdido la capacidad de sintetizar de nuevo
tales compuestos esenciales también es referida en la técnica como
una "cepa auxotrófica". Por lo tanto, en formas de realización
preferidas, la cepa bacteriana es una cepa mutante que es
auxotrófica respecto a un compuesto que no está presente en el
material de sustrato y que es requerido por la cepa para la
replicación de ADN, transcripción de ARN o síntesis de
proteínas.
El material de sustrato usado en el método de la
invención puede en una forma adicional de realización útil contener
al menos un compuesto que inhibe la replicación de ADN,
transcripción de ARN o la síntesis de proteínas de la cepa
bacteriana. Ejemplos de tales compuestos incluyen cloranfenicol y
eritromicina que afectan los ribosomas de la célula bacteriana y así
inhiben la síntesis de proteínas.
Conforme a la invención, la propagación de la
cepa seleccionada antes de su uso en el presente método requiere un
medio en donde la cepa es capaz de replicarse para obtener un
cultivo de dicha cepa. Se supone que un medio conteniendo el
compuesto específico cuyo mutante es incapaz de sintetizar,
restaurará la capacidad de crecimiento del mutante, es decir
capacidad de replicación de ADN, transcripción de ARN y/o síntesis
de proteínas.
En una etapa del método adicional según la
invención, el mencionado cultivo bacteriano obtenido se añade al
mencionado material de sustrato y se mantiene bajo condiciones donde
el cultivo es metabólicamente activo. Se entenderá que en este
contexto, el término "condiciones" incluye la temperatura, pH,
composición apropiada del material de sustrato o presencia/ausencia
de una sustancia inductora, en la que la actividad metabólica del
cultivo bacteriano es óptima.
Los bacteriófagos requieren huéspedes con
replicación de ADN intacta, transcripción de ARN y síntesis de
proteínas a fin de proliferarse. Por consiguiente, los cultivos
bacterianos usados en el método de la invención son incapaces de
realizar una de las mencionadas actividades, que hacen tales
cultivos bacterianos sustancialmente completamente resistentes al
ataque por bacteriófagos. Así, la actividad metabólica del cultivo
bacteriano está sustancialmente sin afectar aún si el material de
sustrato se contamina con bacteriófagos. Como se utiliza en la
presente, la expresión "substancialmente sin afectar" indica
que usando métodos de detección convencionales, se no se puede
detectar ningún cambio o sólo cambios menores en la actividad
metabólica.
Se apreciará que tales bacterias auxotróficas
pueden ser proporcionadas sometiendo una cepa bacteriana de tipo
salvaje que, bajo condiciones apropiadas, es capaz de crecer en un
material de sustrato con o sin un compuesto específico necesario
para la replicación de ADN, transcripción de ARN o síntesis de
proteínas a un tratamiento de mutagenización y seleccionar una cepa
que es sustancialmente incapaz de crecimiento en la ausencia de
dicho compuesto específico.
Mutágenos adecuados incluyen mutágenos químicos
convencionales y luz UV. Así, como ejemplos, un mutágeno químico
puede ser seleccionado de (i) un mutágeno que se asocia con o se
incorpora en ADN tal como un análogo de base, p. ej.
2-aminopuririna o un agente interquelante tal como
ICR-19.1, (ii) un mutágeno que reacciona con el ADN
incluyendo agentes alquilantes tales como nitrosoguanidina o
hidroxilamina, o metil sulfonato de etano (EMS).
Como alternativa, la bacteria auxotrófica puede
ser proporcionada seleccionando mutantes que ocurren espontáneamente
que, en comparación con la cepa progenitora, tiene un requisito de
crecimiento para un compuesto necesario para la replicación de ADN,
transcripción de ARN o síntesis de proteínas.
Se entenderá que también es posible proporcionar
un muíante auxotrófico por muíagénesis dirigida, p. ej. usando
fécnicas de ADN recombinante, tales como técnicas de
"knock-out" (bloqueo) de genes, por las cuales
el gen específico es desestabilizado y se vuelve no funcional en la
bacteria. También es posible construir las cepas bacterianas mutadas
según el método de la presente invención por técnicas que implican
la pérdida de parte del cromosoma o una base o bases de nucleótidos
en la secuencia de ADN que vuelve el gen específico no funcional en
la bacteria. Un ejemplo ilustrativo de tal estrategia de eliminación
está descrito en detalle en los ejemplos a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
La mencionada cepa bacteriana progenitora de
tipo salvaje se puede seleccionar de cualquier especie bacteriana
industrialmente adecuada, es decir la cepa puede ser seleccionada
del grupo que consiste en Lactococcus spp. incluyendo L. lactis,
Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus, spp.
Estreptococcus spp., Propionibacterium spp., Bifídobacterium spp.,
Staphylococcus spp., Micrococcus spp., Bacillus, spp. Actinomycetes
spp., Enterobacteriaceae spp. incluyendo E. coli,
Corynebacterium spp. y Brevibacterium spp.
En una forma de realización específica del
método según la invención se usa un mutante Pur, incluyendo la cepa
de Lactococcus lactis DN105 (DSM 12289). Esta cepa bacteriana
DN105 acidificante es un mutante auxotrófico de purina capaz de
acidificar leche, aunque la cepa no es capaz de crecimiento debido a
su requisito de purina, que no está presente en la leche en
cantidades suficientes para soportar el crecimiento de tal bacteria.
Como se muestra en el ejemplo 1 a continuación, la cepa DN105 es
capaz de acidificar leche bajo condiciones de inanición de purina
incluso en la presencia de una alta concentración de
bacteriófagos.
En una forma útil de realización adicional del
método según la invención, se usa un mutante thyA, incluyendo
la cepa de Lactococcus lactis MBP71 (DSM12891),. Esta cepa
bacteriana MBP71 acidificante, es un mutante auxotrófico de
timidina, que es capaz de acidificar la leche, aunque la cepa no es
capaz de crecimiento, debido a su requisito de timidina, que no está
presente en la leche en cantidades suficientes para soportar el
crecimiento de tal mutante. Como se muestra en el ejemplo 2 a
continuación, la cepa MBP71 es capaz de acidificar la leche bajo
condiciones de inanición de timidina incluso en presencia de una
alta concentración de bacteriófagos.
Es conveniente proporcionar las mencionadas
cepas bacterianas tanto cuando se usa tanto como una cepa de
producción de alimentos o de piensos y como una cepa de producción
para metabolitos, como una composición comprendiendo la cepa
bacteriana seleccionada para el uso específico. Típicamente, tales
composiciones contienen la bacteria en forma concentrada p. ej. a
una concentración de células viables (unidades formadoras de
colonias, CFUs) que está en la gama de 10^{5} a 10^{13} por g de
la composición tal como en la gama de 10^{6} a 10^{12} por g. De
forma adicional, la composición del cultivo puede contener
componentes adicionales tales como nutrientes bacterianos,
crioprotectores u otras sustancias que aumentan la viabilidad del
ingrediente activo bacteriano durante el almacenamiento. La
composición puede p. ej. ser en forma de una composición líquida,
congelada o liofilizada.
Como se menciona anteriormente, una
característica del cultivo bacteriano según se usa en el método de
la invención, es que es capaz de modificar metabólicamente un
material de sustrato específicamente definido aunque la cepa es
incapaz de crecimiento en tal sustrato. Cuando se usa una bacteria
de ácido láctico en el método de la invención, el cultivo bacteriano
obtenido tiene típicamente una velocidad de acidificación en la
leche que es al menos un 10% de aquella de dicho cultivo cuando está
presente en un material de sustrato donde es capaz de replicación de
ADN, transcripción de ARN y/o síntesis de proteínas. En formas de
realización preferidas, la cepa bacteriana tiene una velocidad de
acidificación en la leche que es al menos un 1% incluyendo al menos
un 5%, tal como al menos un 10%, p. ej. al menos un 15%, tal como al
menos un 20%, incluyendo al menos un 25% de aquella del cultivo
cuando está presente en un material de sustrato donde es capaz de
replicación de ADN, transcripción de ARN y/o síntesis de
proteínas.
Típicamente, la cepa bacteriana usada en el
método de la invención se añade al material de sustrato a una
concentración en la gama de 10^{5} a 10^{9} CFU/ml o g del
material, tal como al menos 10^{5} CFU/ml o g del material,
incluyendo al menos 10^{6} CFU/ml o g del material, tal como al
menos 10^{7} CFU/ml o g del material, p. ej. al menos 10^{8}
CFU/mL o g del material, incluyendo al menos 10^{9} CFU/ml o g del
material.
Así, la obtención de un cultivo bacteriano que
es completamente resistente al ataque por bacteriófagos según el
método de la invención, se puede utilizar en todos los contextos
industriales donde la proliferación del cultivo en el material de
sustrato no es un requisito. Las fermentaciones lácteas de la leche
son un ejemplo de un proceso de fabricación industrial, puesto que
la proliferación de las bacterias del ácido láctico durante la
fermentación de leche no es un requisito, si se obtiene el deseado
aroma y acidificación del producto de fermentación. Por lo tanto, en
formas de realización útiles, el material de sustrato es un material
iniciador para un producto comestible incluyendo leche, un material
vegetal, un producto cárnico, un mosto, un zumo de frutas, un vino,
una masa y un rebozado.
En formas de realización adicionales, el
material de sustrato es un material iniciador para un pienso para
animales tal como ensilaje p. ej. hierba, material cereal,
guisantes, alfalfa u hoja de remolacha de azúcar, donde los cultivos
bacterianos se inoculan en la cosecha del pienso para ser ensilados
a fin de obtener una conservación del mismo, o en los productos de
desechos animales ricos en proteínas tales como despojos de la
matanza y despojos del pescado, también con los objetivos de
preservar estos despojos para propósitos de la alimentación
animal.
Todavía otra aplicación importante del método
según la presente invención es el uso de los cultivos bacterianos
denominados probióticos. Por el término "probióticos" se
entiende en el presente contexto un cultivo microbiano que, cuando
es ingerido en forma de células viables por humanos o animales,
confiere un estado de salud mejorado, p. ej. suprimiendo los
microorganismos nocivos en el tracto gastrointestinal, reforzando el
sistema inmunológico o contribuyendo a la digestión de
nutrientes.
Es, como se menciona anteriormente, un objetivo
importante de la presente invención proporcionar un método para
prevenir la infección por bacteriófagos de cultivos bacterianos que
son metabólicamente activos usando células bacterianas no
proliferantes. A fin de ser de interés industrial, tal actividad
metabólica debería resultar en la producción de una cantidad
sustancial del producto final deseado. Así, una posibilidad de
aumentar tal producción usando una célula no proliferante es un
incremento del flujo a través de las vías metabólicas.
Por consiguiente, en una forma de realización
útil, el cultivo bacteriano usado en el método de la invención
comprende una cepa genéticamente modificada que, con respecto a su
cepa progenitora, es aumenta en al menos una vía metabólica. Tal
actividad metabólica incrementada puede p. ej. ser obtenida a través
de una vía glicolítica incrementada y/o un flujo incrementado a
través de la vía de pentosa fosfato.
Un enfoque para estimular el flujo a través de
la vía glicolítica es aumentando la expresión de actividad de la
ATPasa, es decir una conversión incrementada de ATP a ADP, según se
describe en WO 98/10089. Así, en una forma de realización útil de la
invención, la cepa genéticamente modificada tiene, con respecto a su
cepa progenitora, una actividad incrementada de la ATPasa.
En una forma de realización interesante de la
presente invención, la cepa genéticamente modificada es una en donde
el gen que codifica para una ATPasa está bajo el control de un
promotor regulable. Como se utiliza en la presente, el término
"promotor regulable" se usa para describir una secuencia
promotora incluyendo posiblemente secuencias reguladoras para el
promotor, cuyo promotor es regulable por uno o más factores
presentes en el ambiente de la cepa. Tales factores incluyen el pH
del medio de crecimiento, la temperatura de crecimiento, un cambio
de temperatura suscitando la expresión de genes de choque térmico,
la composición del medio de crecimiento incluyendo el contenido de
resistencia iónica/NaCl y la fase de crecimiento/tasa de crecimiento
de la bacteria. Tal promotor regulable puede ser el promotor nativo
o puede ser un promotor insertado no relacionado naturalmente al gen
bien aislado de las mismas especies bacterianas o bien puede ser una
secuencia promotora heteróloga, es decir una secuencia derivada de
diferentes especies bacterianas.
\newpage
Las células tales como "células en descano"
o "células no divisibles" representan otros tipos de células no
proliferantes que son útiles en el método de la invención y en donde
el mencionado incremento del flujo a través de las vías metabólicas
es útil. Tales células son incapaces de mitosis o mitosis p. ej.
debido a la deficiencia de ADN, ARN y/o proteína necesaria para la
separación de la célula. Así, en una forma de realización
particularmente útil, el cultivo bacteriano es uno que comprende una
cepa bacteriana que es capaz de aumentar el tamaño de las células
sin mitosis.
Además, la invención abarca cepas no
proliferantes que bajo condiciones específicas son incapaces de
crecimiento. Así, en una forma de realización interesante, el
cultivo bacteriano comprende una cepa que es un mutante condicional,
es decir un mutante que bajo condiciones predeterminadas no realiza
al menos una actividad seleccionada del grupo que consiste en
replicación de ADN, transcripción de ARN y síntesis de proteínas.
Tales condiciones predeterminadas incluyen el pH, temperatura,
composición del material de sustrato y presencia/ausencia de
sustancias inductoras.
Un medio posible de suministrar tales mutantes
condicionales que son fermosensibles es sometiendo una cepa
bacteriana que bajo condiciones apropiadas es capaz de crecimiento
en un material de sustrato p. ej. a una temperatura por debajo de
30ºC a un tratamiento de mutagenización y seleccionando una cepa
mutante que es sustancialmente incapaz de crecimiento a temperaturas
por debajo de 30ºC, pero es capaz del crecimiento a temperaturas más
altas.
En un aspecto adicional de la invención se
proporciona una bacteria de ácido láctico modificada que se modifica
para hacerse incapaz de realizar la replicación de ADN,
transcripción de ARN o síntesis de proteínas en un material de
sustrato específicamente definido que es limitado con respecto a al
menos un compuesto que es requerido por la cepa bacteriana para la
replicación de ADN, transcripción de ARN o síntesis de proteínas,
dicha cepa bacteriana modificada es capaz de ser metabólicamente
activa en dicho material de sustrato, por lo cual la cepa no es
susceptible al ataque por bacteriófagos, sujeto a la limitación de
que la bacteria ácida láctica no sea la cepa DN105 (DSM 12289).
En formas de realización útiles, la bacteria
ácida láctica según la invención es una cepa mutante siendo
auxotrófica con respecto a un compuesto que no está presente en el
material de sustrato y que es requerida por la cepa para la
replicación.
Las bacterias del ácido láctico actualmente
preferidas según la invención son cepas mutantes que son mutantes
thyA incluyendo la cepa Lactococcus lactis MBP71
depositada bajo el número de registro DSM 12891.
La bacteria del ácido láctico modificada según
la invención es útil como un cultivo iniciador en la producción de
alimentos y de piensos. Por consiguiente, en un aspecto importante
adicional la invención se refiere a una composición de cultivo
iniciador comprendiendo la bacteria de ácido láctico según la
invención.
Como es normal en la producción de procesos de
fermentación bacteriana de ácido láctico para aplicar cultivos
mezclados a bacterias del ácido láctico, una composición en
determinadas formas de realización comprenderá una multiplicidad de
cepas bien pertenecientes a las mismas especies o pertenecientes a
diferentes especies. Por consiguiente, en un aspecto importante
adicional, la invención se refiere a una composición de cultivo
iniciador comprendiendo una bacteria de ácido láctico obtenible por
el método según la invención en combinación con al menos una
bacteria de ácido láctico adicional. Un ejemplo típico de tal
combinación útil de bacterias del ácido láctico en una composición
de cultivo iniciador es una mezcla de la bacteria obtenible por el
método según la invención y uno o más Lactococcus spp. tal
como Lactococcus lactis subesp. lactis o Lactococcus
lactis subesp. lactis biovar. diacetylactis o
Leuconostoc spp. Tal cultivo mezclado se puede usar en la
fabricación de productos lácteos fermentados tal como el suero de
leche y el queso.
En una forma de realización, la composición
según la invención, es una que de forma adicional comprende al menos
un componente que aumenta la viabilidad del ingrediente activo
bacteriano durante el almacenamiento incluido un nutriente
bacteriano o un crioprotector.
Es también un objetivo de la presente invención
proporcionar un método para fabricar un producto alimenticio o de
pienso a base del uso de la bacteria modificada de la invención.
Así, en su aspecto más amplio, tal método comprende añadir una
composición de cultivo iniciador según la invención a un material
iniciador de producto alimenticio o pienso y mantener el material
iniciador así inoculado bajo condiciones donde la bacteria del ácido
láctico es metabólicamente activa. En una forma de realización
particularmente útil, el material iniciador del producto alimenticio
es leche.
En aspectos adicionales, la invención se refiere
al uso de un cultivo como se obtiene en el método según la invención
como un cultivo iniciador en la preparación de un producto
seleccionado del grupo que consiste en un aroma lácteo, un producto
aromatizante de queso, un producto alimenticio y un producto de
pienso.
La invención se describirá ahora en detalles
adicionales en los siguientes ejemplos no limitativos y los dibujos
en donde
Fig. 1. muestra la acidificación de leche
desnatada reconstruida (RSM) por la cepa DN105. El pH se siguió
durante el tiempo en cultivos de RSM conteniendo la cepa de
Lactococcus lactis DN105 inoculada a 1%, 10%, 25% y 50%
vol/vol;
\newpage
Fig. 2 ilustra el desarrollo de pH en RSM cuando
se inocula con un 25% vol/vol de la cepa de Lactococcus
lactis CHCC373 o cepa de Lactococcus lactis DN105, en
presencia de la cepa de bacteriófago 836 a una concentración de al
menos 10^{8} PFU/ml;
Fig. 3A-3H ilustran el
desarrollo de pH en RSM cuando se inocula con un 25% vol/vol de la
cepa de Lactococcus lactis DN105 con o sin adición del
compuesto de purina hipoxantina al medio de cultivo, en presencia de
al menos 10^{8}Pfu/ml de los siguientes bacteriófagos: CHPC836
(3A); CHPC412 (3B); CHPC783 (3C); CHPC795 (3D); CHPC710 (3E); CHPC12
(3F); CHPC708 (3G); CHPC814 (3H);
Fig. 4. muestra la acidificación de RSM por la
cepa de Lactococcus lactis MBP71 inoculada a diferentes
concentraciones. El pH de cultivos RSM de 200 ml comprendiendo la
cepa MBP71 inoculada a un 1%, 5%, 10%, 25%, y 50% (v/v) se
monitorizó en línea; y
Fig. 5. muestra la acidificación de RSM,
comprendiendo bacteriófagos y/o timidina, por las cepas de
Lactococcus lactis MBP71 y CHCC373, que se inoculó a una
concentración del 25% (v/v) en un volumen de 100 ml de RSM. La
concentración de timidina fue de 20 mg/l y el bacteriófago CHPC733
se añadió a una concentración de 2x10^{8} Pfu/ml. El pH se
monitorizó por la colección de muestras de 2.5 mls.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de Lactococcus lactis DN105 es un
mutante auxotrófico de purina (PUR) derivado de la cepa de tipo
salvaje CHCC373 descrita en Nilsson y Lauridsen (1992). Una muestra
de la cepa de Lactococcus lactis DN105 está depositada con
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh,
Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania
el 30 de Junio de 1998 bajo el número de registro DSM 12289.
Se hizo crecer Lactococcus lactis en M17
(Terzaghi & Sandine, 1975) en el medio DN químicamente definido
(Dickely et al., 1995) o en leche desnatada reconstituida
(RSM) conteniendo un 9.5% (p/vol) de polvo de leche desnatada baja
en grasa a 30ºC. Para la propagación de la cepa DN105, el medio fue
suplementado con hipoxantina a una concentración final de
15-50 mg/l. El fenotipo Pur de la cepa DN 105 fue
probado por su capacidad de crecer en medio DN con y sin suplemento
de hipoxantina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los bacteriófagos fueron purificados por tres
fases de aislamiento de placa individuales. Los lisatos de
bacteriófagos de alto título fueron preparados por infecciones
consecutivas de la cepa huésped CHCC373 con el bacteriófago a una
MOI (multiplicidad de infección) de 0.1 a 1.0. Después de la
infección el cultivo se hizo crecer a 30ºC en M 17 suplementado con
10 mM de CaCl_{2} hasta que la lisis fue completada. Los lisatos
fueron centrifugados durante 15 min a 6.000 r.p.m. y el sobrenadante
estéril filtrado (0.45 \mum, Schleicher und Schuell).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Para la determinación de títulos de
bacteriófagos (unidades de formación de placas por ml) fue usado el
método de doble estrato de agar (Adams M.H., 1959; Interscience
Publishers, Inc., Nueva York). Los bacteriófagos usados para la
prueba de acidificación se catalogan a continuación en la tabla
1:
10-400 ml de un cultivo
excesivamente crecido de la cepa DN105 en M17 fue cosechado por
centrifugación, lavado dos veces con una solución estéril del 0.9%
de NaCl para eliminar compuestos residuales de purina y se
resuspendió en 10-400 ml de RSM para dar la misma
densidad celular como en el cultivo m 17 excesivamente crecido. El
material resuspendido fue usado para la inoculación de RSM fresco a
concentraciones de volumen/volumen típicamente en la gama del 10 al
100% (v/v). El pH fue monitorizado bien en línea o por medición del
pH de muestras de 3 ml recogidas en intervalos.
En general, las células bacterianas de ácido
láctico que no tienen replicación intacta de ADN, transcripción de
ARN y sistemas de síntesis de proteínas son incapaces de crecer y
acidificar la leche. Nilsson y Lauridsen (1992) demostraron que el
mutante auxotrófico de purina DN 105 es incapaz de crecer en un
medio sin purinas. También se ha informado que los mutantes
auxotróficos de purina de Lactococcus lactis no crecientes en
leche son incapaces de acidificar tal material de sustrato (Dickely
et al., 1995). Para probar la capacidad de la cepa DN105 de
acidificar un medio con base de leche, la cepa fue inoculada en
cantidades variables en RSM como se describe en Materiales y Métodos
y el pH del material de sustrato fue monitorizado (Fig. 1).
Los resultados mostrados en la Fig. 1 demuestran
claramente que la cepa DN 105 fue capaz de acidificar leche al menos
a pH 5.0 incluso bajo condiciones de inanición de purina.
Como es conocido generalmente, un bacteriófago
requiere una célula huésped susceptible que tiene replicación
intacta de ADN, transcripción de ARN y sistemas de síntesis de
proteínas para desarrollo. Si un huésped potencial no es capaz de
realizar al menos una de estas actividades, los bacteriófagos no se
pueden proliferar en la célula.
La Fig. 2 muestra el desarrollo de pH en RSM
cuando es inoculado con un 25% vol/vol de la cepa de tipo salvaje
CHCC373 o la cepa mutante DN105 en presencia del bacteriófago
CHPC836 a una concentración de al menos
10^{8} Pfu/ml.
10^{8} Pfu/ml.
En experimentos adicionales se estudió la
resistencia de la cepa DN105 contra varios bacteriófagos en RSM con
y sin la adición de hipoxantina. Los bacteriófagos fueron
adicionados a RSM a 10^{8} a 10^{9} bacteriófagos/ml.
La adición de hipoxantina fue usada como un
control positivo para la infección de bacteriófagos, ya que la
adición de este compuesto de purina habilitó el ataque por
bacteriófagos (Fig. 3 A-H). En todos los cultivos
sin hipoxantina la cepa añadida DN105 acidificó la leche hasta pH
alrededor de 5.0, mientras que con la adición de hipoxantina,
ninguno de los cultivos alcanzó un pH por debajo de 5.4.
Este ejemplo muestra que la inanición de una
cepa Pur de L. lactis para purinas causa la total resistencia
a una gama de bacteriófagos y que la cepa Pur de L. lactis es
capaz de acidificar eficazmente la leche en presencia de un gran
número de bacteriófagos para los cuales el correspondiente tipo
salvaje es susceptible.
Así, el presente ejemplo muestra que es posible
desarrollar cepas que bajo condiciones apropiadas seleccionadas,
donde las cepas son incapaces de crecimiento, son completamente
resistentes a los bacteriófagos y que tales cepas han retenido la
capacidad metabólica para acidificar la leche. Tal sistema de
resistencia a los bacteriófagos se puede introducir en el interior
de cualquier bacteria p. ej. Lactococcus spp.,
Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus, spp.,
Streptococcus spp., Propionibacterium, spp. Bifidobacterium spp.
Staphylococcus spp., Micrococcus spp., Bacillus spp., Actinomycetes
spp., Enterobacteriaceae spp. incluyendo E. coli,
Corynebacterium spp. y Brevibacterium spp. con respecto a
p. ej. la producción de un producto de fermentación bacteriana tal
como lactato, diacetilo, acetoína, metanotiol, etanol etc. si la
proliferación de las bacterias no es un requisito.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de Lactococcus lactis MBP71 es un
muíante auxotrófico de fimidina (thyA) derivado de la cepa de
tipo salvaje CHCC373 (véase el ejemplo 1). Una muestra de la cepa
MBP71 se ha depositado con Deutsche Sammlung von Mikroorganism und
Zellkulturen Gmbh, Mascheroden Weg 1b, D-38124
Braunschweig, Alemania el 25 de Junio de 1999 bajo el número de
registro DSM12891.
La cepa CHCC373 fue crecida rutinariamente a
30ºC en M17 (Terzaghi & Sandine, 1975) suplementada con 0.5% de
lactosa, o en leche desnatada reconstituida (RSM) conteniendo un
9.5% (p/v) de polvo de leche desnatada baja en grasa. Para la
propagación de la cepa MBP71 los medios fueron suplementados con 20
mg/l de timidina, ya que ni M17 ni RSM soportan el crecimiento del
fenotipo de ThyA. Durante las manipulaciones para construir la cepa
MBP71, 5 mg/l de eritromicina fue añadida a los medios M17 a base de
M17 para mantener el plásmido. También, cuando el crecimiento a 37ºC
fue requerido durante estas manipulaciones los medios a base de M17
fueron suplementados con 50 mM de NaCl para aumentar el crecimiento.
DH5\alpha de E. coli (Life Technologies Inc., EEUU) fueron
crecidas en medio LB suplementado con 100 mg/l de eritromicina para
mantener el plásmido transformado. El bacteriófago CHPC733 fue usado
en experimentos de crecimiento donde se probó la resistencia al fago
de la cepa MBP71. Para la manipulación del bacteriófago y
determinación de títulos véase el ejemplo 1.
Un fragmento de aproximadamente 800 bp aguas
arriba de thyA de la cepa CHCC373 se obtuvo por PCR en ADN
cromosómico usando los cebadores
| TATAATCTGCAGGGTCACACTATCAGTAATTG | (SEC ID NO:1) y |
| TATTTTAAGCTTCACAGTCTGCTATTTTGATTC | (SEC ID NO:2), |
que introducen además un sitio PstI y
HindIII, respectivamente, en los extremos del fragmento. El
resultante fragmento incluye la caja -35 del promotor thyA,
pero no la caja -10. Otro fragmento de aproximadamente 800 bp
comprendiendo una parte interna de la región codificante de
thyA se obtuvo por PCR en ADN cromosómico usando los
cebadores
| TAAATTAAGCTTCGCAGACAAGATTTTTAAAC | (SEC ID NO:3) y |
| ATTTAAGTCGACGGCTCATAGTCCACAAGTTC | (SEC ID NO:4), |
que introducen un sitio HindIII y
SalI, respectivamente. El resultante fragmento incluye la
región codificante íntegra de ThyA excepto la primera 8 bp y
la última 34 bp. Los dos fragmentos de PCR fueron purificados usando
el kit de purificación QIAquick PCR (QIAGEN Gmbh, Alemania),
cortados con las enzimas indicadas, y purificados otra vez. El
vector pGhost9 (Maguin et al., 1996) fue cortado con las
enzimas de restricción PstI y SalI y purificado. A
partir de entonces, aproximadamente 150 ng del vector y
aproximadamente 50 ng de cada uno de los dos fragmentos fueron
ligados durante toda la noche a 16ºC en un volumen total de 20
\mul. De esta mezcla 10 \mul fueron usados para transformar
DH5\alpha de E. coli. ADN del plásmido fue aislado de
posibles clones creciendo durante toda la noche en medio LB con 100
mg/l de eritromicina y usando posteriormente 1.5 ml de estos
cultivos con el protocolo del kit minprep spin QIAprep (QIAGEN Gmbh,
Alemania). El ADN purificado del plásmido fue cortado con PstI y
SalI y uno de éstos, pMBP63, dio una banda de aprox. 1600 bp. Esta
construcción fue verificada de forma adicional por PCR con los
cebadores que fueron usados para producir los dos fragmentos, y
también con los dos cebadores externos. Finalmente, la construcción
fue verificada por la secuenciación de ambas hebras a través de la
región de la deleción con los dos cebadores
| GACTGTTGCCCCATAGCG | (ID de la SEC NO:5) y |
| GCTTCGATTTTAGTATATGG | (ID de la SEC NO:6). |
Todos los cebadores fueron de TAG Copenhagen
A/S, Copenhagen, Dinamarca.
Aproximadamente 200 ng de pMBP63 fue usado para
transformar la cepa CHCC373. Empleando la característica de
sustitución de genes (Biswas et al., 1993) del vector
pGhost9, el gen cromosómico thyA de la cepa CHCC373 fue a
partir de entonces inactivado exitosamente. La resultante cepa,
MBP71, demostró ser un mutante auxotrófico de timidina.
Cultivos durante toda la noche de M17 con 0.5%
de lactosa y 20 mg/l de timidina fueron lavados dos veces en una
solución isotónica del mismo volumen que el cultivo durante toda la
noche para eliminar la timidina residual. Las células fueron
resuspendidas en una solución isotónica fresca de un volumen que fue
1/20 del cultivo durante toda la noche. Estas células resuspendidas
fueron usadas para inocular RSM a un determinado volumen
identificado por el porcentaje de volumen del cultivo durante toda
la noche, es decir una inoculación del 100% (v/v) indica que 5 ml de
las células resuspendidas se han usado para inocular 100 ml de RSM.
El pH fue monitorizado bien en línea o por medición del pH de
muestras de 2.5 ml.
Para probar la acidificación de RSM por la cepa
MBP71 esta cepa fue inoculada en cantidades variables como se
describe en Materiales y métodos. El pH del material de sustrato
entonces fue monitorizado en línea durante un periodo de 20 horas.
Los resultados mostrados en la Fig. 4 demuestran claramente que
MBP71 es capaz de acidificar la leche hasta al menos pH 4.5 bajo
condiciones de inanición de timidina. Cuando fue añadida timidina al
RSM, la cepa MBP71 acidificó el material de sustrato de forma
similar a la cepa CHCC373 (detalles no mostrados).
Como se describe anteriormente, un bacteriófago
requiere una célula huésped susceptible, que tiene replicación
intacta de ADN, transcripción de ARN y sistemas de síntesis de
proteínas, para el desarrollo. Si un huésped potencial no es capaz
de realizar sólo una de estas actividades, los bacteriófagos no
pueden proliferar en la célula. La cepa auxotrófica de timidina
MBP71 es capaz sólo de la replicación de ADN en la presencia de
timidina, u otro precursor adecuado para dTTP. Ninguno de estos
precursores están presentes en RSM, y la cepa MBP71 no es por lo
tanto susceptible al ataque por bacteriófagos bajo estas
condiciones.
La Fig. 5 muestra el desarrollo de pH en 100 ml
de RSM inoculados con la cepa MBP71 a una concentración del 25%
(v/v). Cuando estaba presente la timidina, fue añadida a una
concentración final de 20 mg/l. Cuando el bacteriófago CHPC733
estaba presente, fue añadido a una concentración de 2x10^{8}
PFU/ml media hora después de la inoculación de la célula. Esto da
una MOI (multiplicidad de infección) de 0.2. Los resultados en la
Fig. 5 demuestran claramente que la cepa MBP71 acidifica RSM sin
timidina hasta al menos pH 4.6 incluso en la presencia de
bacteriófagos. No obstante, cuando se añade timidina a RSM la cepa
MBP71 se vuelve susceptible al ataque por bacteriófagos y la leche
sólo es acidificada hasta pH 5.5, que también está cerca del pH que
se alcanza para la cepa de tipo salvaje CHCC373 en presencia de
bacteriófagos. Si los bacteriófagos son omitidos, pero se añade
timidina, la cepa MBP71 acidifica la RSM de forma similar a la cepa
CHCC373 (véase la Fig. 5, detalles no mostrados).
Este ejemplo muestra que la inanición de una
cepa thyA de L. lactis para timidina causa la
resistencia total al bacteriófago CHPC733 y que la cepa ThyA
de L. lactis es capaz de acidificar eficazmente la leche bajo
estas condiciones. Esto es lo contrario al tipo salvaje, que no es
capaz de acidificar la leche a un nivel aceptable bajo las mismas
condiciones. A pesar de que la cepa MBP71 sólo se ha probado por
resistencia al bacteriófago para un bacteriófago se cree que la cepa
MBP71 es resistente a todos, o la mayoría, de los tipos de
bacteriófagos.
1. Biswas, I., A. Gruss, S.D.
Ehrlich and E. Maguin. 1993.
High-efficiency gene inactivation and replacement
system for gram-positive bacteria. J.
Bacteriol. 175:3628-3635.
2. Dickely, F., D. Nilsson, E. B.
Hansen and E. Johansen. 1995. Isolation of
Lactococcus lactis nonsense suppressors and construction of a
food-grade cloning vector. Mol. Microbiol.
15:839-847.
3. Maguin, E., H. Prévost, S.D.
Ehrlich and A. Gruss. 1996. Efficient
insertional mutagenesis in Lactococci and other
gram-positive bacteria. J. Bacteriol.
178:931-935.
4. Nilsson, D., and A. A.
Lauridsen. 1992. Isolation of purine auxothrophic
mutants of Lactococcus lactis and characterisation of the
gene hpt encoding hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase.
Mol. Gen. Genet. 235:359-364.
5. Richardson, G.H., C.A.
Ernstrom, J.M. Kim and C. Daly. 1983.
Proteinase negative variants of Streptococcus cremoris for
cheese starters. J. Dairy Sci.
66:2278-2286.
6. Richardson, G.H., A.Y. Gamay,
M.A. Shelaih, J.M. Kim and C.L. Hansen.
1984. Paired and single strain protease negative lactic
Streptococci for cheese manufacturing. J. Dairy Sci.
67:518-521.
7. Terzaghi, B. E., and W. E.
Sandine. 1975. Improved médium for lactic streptococci
and their bacteriophages. Appl. Microbiol.
29:807-813.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
\bullet WO 9510621 A [0025]
\bullet WO 9810089 A [0053]
\bullet US 60091735 B [0091]
\bulletMeagher et al. Cell,
1997, vol. 10, 521-536 [0016]
\bulletHelling et al. J.
Bacteriol., 1970, vol. 104 (2), 1027-1029
[0017]
\bulletWorland et al. Australian
Journal of Plant Physiology, 1999, vol. 26 (6),
511-519 [0018]
\bulletAntón et al. J.
Bacteriol, 1959, vol. 77(1), 117-8
[0019]
\bulletRoss et al. Appl Environ
Microbiol, 1990, vol. 56 (7), 2164-9
[0020]
\bulletPedersen et al. Appl Environ
Microbiol, 2002, vol. 68 (6), 3010-23
[0021]
\bulletDeutch et al. J
Bacteriol, 1971, vol. 106, 197-203
[0022]
\bulletBreheny et al. Aust J Diary
Technol, 1975, vol. 30, 145-148
[0023]
\bulletDesjardins et al. J Dairy
Sci, 1990, vol. 73, 1478-1484 [0024]
\bulletBiswas, I.; A. Gruss;
S.D. Ehrlich; E. Maguin.
High-efficiency gene inactivation and replacement
system for gram-positive bacteria. J.
Bacteriol., 1993, vol. 175, 3628-3635
[0090]
\bulletDickely, F.; D. Nilsson;
E. B. Hansen; E. Johansen. Isolation of Lactococcus
lactis nonsense suppressors and construction of a
food-grade cloning vector. Mol. Microbiol.,
1995, vol. 15, 839-847 [0090]
\bulletMaguin, E.; H. Prévost;
S.D. Ehrlich; A. Gruss. Efficient insertional
mutagenesis in Lactococci and other gram-positive
bacteria. J. Bacteriol., 1996, vol. 178,
931-935 [0090]
\bulletNilsson, D.; A. A.
Lauridsen. Isolation of purine auxothrophic mutants of
Lactococcus lactis and characterisation of the gene hpt
encoding hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase. Mol.
Gen. Genet., 1992, vol. 235, 359-364
[0090]
\bulletRichardson, G.H.; C.A.
Ernstrom; J.M. Kim; C. Daly. Proteinase
negative variants of Streptococcus cremoris for cheese
starters. J. Dairy Sci., 1983, vol. 66,
2278-2286 [0090]
\bulletRichardson, G.H.; A.Y.
Gamay; M.A. Shelaih; J.M. Kim; C.L.
Hansen. Paired and single strain protease negative lactic
Streptococci for cheese manufacturing. J. Dairy Sci.,
1984, vol. 67, 518-521 [0090]
\bulletTerzaghi, B. E.; W. E.
Sandine. Improved médium for lactic streptococci and their
bacteriophages. Appl. Microbiol., 1975, vol. 29,
807-813 [0090].
<110> Dan Nilsson
\hskip1cmThomas Janzen
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método de prevención de infección
por bacteriófagos de cultivos bacterianos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21134 PC 1
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PA 1998 00878
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-07-03
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/091,735
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-07-06
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<160> 6
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<170> FastSEQ para Windows versión 3.0
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<210> 1
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de PCR para la construcción
de plásmidos con deleción en thyA de la cepa CHCC373
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de PCR para la construcción
de plásmidos con deleción en thyA de la cepa CHCC373
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<212> ADN
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<223> Cebador de PCR para la construcción
de plásmidos con deleción en thyA de la cepa CHCC373
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de PCR para la construcción
de plásmido con deleción en thyA de la cepa CHCC373
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de secuenciación usado para
la verificación de la construcción de plásmidos con deleción en
thyA de la cepa CHCC373.
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de secuenciación usado para
la verificación de la construcción de plásmidos con deleción en
thyA de la cepa CHCC373.
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\hfill20
Claims (13)
1. Método para modificar un material de sustrato
mediante un cultivo bacteriano que es capaz de ser metabólicamente
activo en dicho sustrato, por lo cual el cultivo bacteriano no es
susceptible al ataque por bacteriófagos, el método comprendiendo
(i) aislar una cepa bacteriana que no es capaz
de replicación de ADN en dicho material de sustrato pero es capaz de
modificar metabólicamente el material de sustrato, en donde la cepa
bacteriana es una cepa mutante que es auxotrófica con respecto a un
compuesto que no está presente en el material de sustrato y que es
requerido por la cepa para la replicación de ADN,
(ii) propagar la cepa seleccionada en un medio
en donde la cepa es capaz de replicarse para obtener un cultivo de
dicha cepa,
(iii) añadir el cultivo bacteriano obtenido al
material de sustrato y mantener el material bajo condiciones donde
el cultivo es metabólicamente activo,
por lo cual, si el material de sustrato está
contaminado con un bacteriófago, la actividad metabólica del cultivo
bacteriano está sustancialmente sin afectar por el bacteriófago, y
en donde el cultivo bacteriano es seleccionado del grupo que
consiste en Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc
spp., Pediococcus, spp. Strepococcus spp., Propionibacterium spp.,
Bifidobacterium spp., Staphylococcus spp. Micrococcus spp.,
Bacillus, spp., Actinomycetes spp., Corynebacteríum spp. y
Brevibacterium spp; y en donde el material de sustrato es un
material iniciador para un producto comestible, el material es
seleccionado del grupo que consiste en leche, un material vegetal,
un producto cárnico, un mosto, un zumo de frutas, un vino, una masa
y un rebozado; y en donde el cultivo bacteriano conforme es obtenido
en el método se usa como un cultivo iniciador en la preparación de
un producto seleccionado del grupo que consiste en un aroma lácteo,
un producto aromatizante de queso, un producto alimenticio y un
producto de pienso.
2. Método según la reivindicación 1, en donde la
cepa mutante es un mutante Por que incluye la cepa de Lactococcus
lactis DN105 depositada bajo el número de registro DSM
12289.
3. Método según la reivindicación 1, en donde la
cepa mutante es un mutante thyA que incluye la cepa de
Lactococcus lactis MBP71 depositada bajo el número de
registro DSM12891.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde el cultivo bacteriano es de
Lactococcus lactis.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde la cepa bacteriana es añadida al
material de sustrato a una concentración en la gama de 10^{5} a
10^{9} CFU/mL o g del material.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde el cultivo comprende una cepa
genéticamente modificada que, con respecto a su cepa progenitora es
incrementada en al menos una vía metabólica.
7. Método según la reivindicación 6, en donde la
cepa modificada genéticamente tiene, con respecto a su cepa
progenitora, una actividad metabólica incrementada seleccionada del
grupo que consiste en flujo glicolítico incrementado y flujo
incrementado a través de la vía de pentosa fosfato.
8. Método según la reivindicación 7, en donde la
cepa modificada genéticamente tiene, con respecto a su cepa
progenitora, una actividad de ATPasa incrementada.
9. Método según la reivindicación 1, en donde el
cultivo bacteriano comprende una cepa que es un mutante condicional,
que a una condición predeterminada no realiza la replicación de
ADN.
10. Método según la reivindicación 9, en donde
la predeterminada condición es seleccionada del grupo que consiste
en pH, temperatura, composición del material de sustrato y
presencia/ausencia de una sustancia inductora.
11. Método según la reivindicación 1, en donde
el cultivo comprende una cepa bacteriana que es capaz de aumentar el
tamaño de las células sin mitosis.
12. Uso de un cultivo conforme se obtiene en el
método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 como un
cultivo iniciador en la preparación de un producto seleccionado del
grupo que consiste en un aroma lácteo, un producto aromatizante de
queso, un producto alimenticio y un producto de pienso.
13. Bacteria de ácido láctico mutante, en donde
la cepa mutante es la cepa de Lactococcus lactis MBP71 del
mutante thyA depositada bajo el número de registro
DSM12891.
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| DKPA199800878 | 1998-07-03 | ||
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