ES2346043T3 - Identificacion de las regiones rd1 y rd5 asociadas con la virulencia que permite el desarrollo de vacunas mejoradas de m. bovis bcg y m. microti. - Google Patents
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Abstract
Cepa de M. bovis BCG::RD1 que tiene integrado el fragmento RD1-2F9 (∼32 kb) según se clona en el cósmido aquí denominado como RD1-2F9 contenido en la cepa de E. coli depositada en el CNCM con el número de acceso 1-2831.
Description
Identificación de las regiones RD1 y RD5
asociadas con la virulencia que permite el desarrollo de vacunas
mejoradas de M. bovis BCG y M. microti.
Desde hace tiempo se buscan las regiones
asociadas con la virulencia en Mycobacterium. La presente
descripción se refiere a la identificación de dos regiones genómicas
que se muestra que están asociadas con un fenotipo virulento en
Mycobacteria, y particularmente en M. tuberculosis y
en M. leprae.
Las dos regiones son conocidas como RD1 y RD5,
como se describe en Molecular Microbiology (1999), vol. 32, páginas
643 a 655 (Gordon S.V. et al.). Estas dos regiones, o al
menos una de ellas, están ausentes en las cepas de vacunas de M.
bovis BCG y en cepas de M. microti implicadas y usadas
como vacunas vivas en los años
1960.
1960.
Otras aplicaciones que están relacionadas con la
presente descripción se refieren al uso de todas o parte de dichas
regiones para detectar cepas virulentas de Mycobacteria y
particularmente M. tuberculosis en seres humanos y animales.
La RD1 y RD5 son consideradas como marcadores de la virulencia en la
presente invención.
Las micobacterias recombinantes, y
particularmente M. bovis BGG, después de la modificación de
su genoma mediante introducción de toda o parte de la región RD1 y/o
de la región RD5 en dicho genoma, se pueden usar para el sistema
inmunitario de pacientes afectados con un cáncer, como por ejemplo
un cáncer de vejiga.
La presente invención se refiere a una cepa de
M. bovis BCG en la que dicha cepa tiene integrado el
fragmento RD1-2F9 (\sim32 kb) que cubre la región
del genoma AL123456 de M. tuberculosis desde 4.337 kb a 4.369
kb responsable de la inmunogenicidad mejorada frente a los bacilos
de la tuberculosis. Esta cepa se denominará como la cepa de M.
bobis BCG::RD1, y es útil como una nueva vacuna mejorada para la
prevención de infecciones de tuberculosis, y para tratar cáncer de
vejiga superficial.
Mycobacterium bovis BCG (bacilo
Calmette-Guérin) se ha usado desde 1921 para
prevenir la tuberculosis, aunque tiene una eficacia limitada frente
a la enfermedad pulmonar de adulto en áreas muy endémicas.
Mycobacterium microti, otro miembro del complejo de
Mycobacterium tuberculosis, se describió originalmente como
el agente infeccioso de una enfermedad similar a la tuberculosis en
topillos (Microtus agrestis) en los años 1930 (Wells, A. Q.
1937. Tuberculosis in wild voles. Lancet 1221 y Wells, A. Q. 1946.
The murine type of tubercle bacillus. Medical Research council
special report series 259:1-42.). Hasta hace poco,
se pensaba que las cepas de M. microti eran patógenas sólo
para topillos, pero no para seres humanos, e incluso algunas se
usaron como una vacuna viva. De hecho, el bacilo del topillo
demostró ser seguro y eficaz previniendo la tuberculosis clínica en
un ensayo que implicó aproximadamente 10.000 adolescentes en el
Reino Unido en los años 1950 (Hart; P. D. a.; e I. Sutherland.
1977. BCG y vole bacillus vaccines in the prevention of tuberculosis
in adolescence and early adult life. British Medical Journal 2:
293-295). Sobre la misma fecha, se administró con
éxito otra cepa, OV166, a medio millón de neonatos en Praga,
antigua Checoslovaquia, sin ninguna complicación grave (Sula, L., e
I. Radkovsky. 1976. Protective effects of M. microti vaccine against
tuberculosis. J. Hyg. Epid. Microbiol. Immunol.
20:1-6). Desde entonces, la vacunación con M.
microti se ha descontinuado debido a que no era más eficaz que
la vacuna de BCG empleada frecuentemente. Como resultado, son
necesarias vacunas mejoradas para prevenir y tratar la
tuberculosis.
El problema para intentar mejorar esta vacuna
viva es que el mecanismo molecular tanto de la atenuación como de
la inmunogenicidad de BCG todavía sigue sin comprenderse bien.
Estudios genómicos comparativos de los seis miembros del complejo
de M. tuberculosis han identificado más de 140 genes, cuya
presencia es facultativa, que pueden conferir diferencias en
fenotipo, intervalo de hospedantes y virulencia. Con relación al
genoma de la cepa paradigmática, M. tuberculosis H37Rv (S. T
Cole, et al., Nature 393, 537 (1998)), muchos de estos genes
se producen en regiones cromosómicas que han sido suprimidas de
ciertas especies (RD1-16, RvD1-5),
M. A. Behr, et al., Science 284; 1520 (1999); R. Brosch,
et al., Infection Immun. 66, 2221 (1998); S. V. Gordon,
et al., Molec Microbiol 32, 643 (1999); H. Salamon, et
al, Genome Res 10; 2044 (2000), G. G. Mahairas et al, J.
Bacteriol. 178, 1274 (1996) y R. Brosch, et al., Proc Natl
Acad Sci USA 99, 3684 (2002).
En relación con la invención y basándose en su
distribución entre bacilos de la tuberculosis y su potencial para
codificar funciones de la virulencia, se le dio la máxima prioridad
a RD1, RD3-5, RD7 y RD9 (Fig. 1A, B) para el
análisis genómico funcional usando "informaciones genéticas
insertadas" ("knock-ins") de M. bovis
BCG para evaluar su contribución potencial al proceso de
atenuación. Los clones que abarcan estas regiones RD se
seleccionaron a partir de una librería de M. tuberculosis
H37Rv ordenada de cósmidos lanzadera integrantes (S. T. Cole; et
al., Nature 393, 537 (1998) y W. R. Bange, et al, Tuber.
Lung Dis. 79, 171 (1999)), y se electroporaron individualmente en
BCG Pasteur, donde se insertaron de forma estable en el sitio
attB (M. H. Lee, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
3111 (1991)).
Se ha descubierto que sólo la reintroducción de
RD1 condujo a una alteración fenotípica profunda. Sorprendentemente,
la "información genética insertada"
("knock-in") de BCG::RD1 creció de forma más
vigorosa que los controles de BCG en ratones inmunodeficientes,
induciendo esplenomegalia extendida y formación de granuloma.
\newpage
RD1 está restringida a las cepas avirulentas
M. bovis BCG y M. microti. Aunque los puntos finales
no son idénticos, las supresiones han eliminado de ambas cepas de
vacunas un conjunto de seis genes (Rv3871-Rv3876)
que son parte del locus ESAT-6 (Fig. 1A (S. T. Cole,
et al., Nature 393, 537 (1998) y F. Tekaia, et al.,
Tubercle Lung Disease 79, 329 (1999)).
Entre los productos perdidos se encuentran
miembros de las familias de proteínas PE (Rv3872), PPE (Rv3873), y
ESAT-6 (Rv3874, Rv3875) micobacterianas. A pesar de
carecer de señales de secreción obvias, ESAT-6
(Rv3875) y la proteína relacionada CFP-10 (Rv3874)
son componentes abundantes del filtrado de cultivo a corto plazo,
actuando como antígenos de células T inmunodominantes que inducen
potentes respuestas de Th1 (F. Tekaia, et al., Tubercle Lung
Disease 79, 329 (1999); A. L. Sorensen, et al, Infect. Immun.
63, 1710 (1995) y R. Colangelli, et al., Infect. Immun. 68,
990 (2000)).
En resumen, se ha descubierto que la
restauración de RD1 en M. bovis BCG conduce a un aumento de
la persistencia en ratones inmunocompetentes. La cepa de M.
bovis BCG::RD1 induce respuestas inmunitarias específicas de la
RD1 del tipo Th1, tiene una inmunogenicidad potenciada y confiere
una protección mejor que M. bovis BCG sola en el modelo de
tuberculosis de ratón. La vacuna de M. bovis BCG::RD1 es
significativamente más virulenta que M. bovis BCG en ratones
inmunodeficientes, pero considerablemente menos virulenta que M.
tuberculosis.
Además, se muestra que M. microti carece
de una parte diferente pero solapante de la región RD1 (RD1^{mic})
con respecto a M. bovis BCG, y los resultados indican que la
reintroducción de RD1 confiere un aumento de la virulencia de
BCG::RD1 en ratones inmunodeficientes. Las raras cepas de M.
microti que están asociadas con la enfermedad humana contienen
una región denominada RD5^{mic}, mientras que aquellas de los
topillos no la tienen.
La vacuna de M. bovis BCG se podría
mejorar reintroduciendo otros genes que codifican miembros de la
familia de ESAT-6 que se han perdido, principalmente
los encontrados en los loci de RD8 y RD5 de M. tuberculosis.
Estas regiones también codifican antígenos de células T
adicionales.
M. bovis BCG::RD1 se podría mejorar
reintroduciendo los loci de RD8 y RD5 de M. tuberculosis.
La vacuna de M. bovis BCG se podría
mejorar sobreexpresando los genes contenidos en las regiones RD1,
RD5 y RD8.
En consecuencia, estas nuevas cepas, que
muestran una mayor persistencia e inmunogenicidad potenciada,
representan una vacuna mejorada para prevenir la tuberculosis y
tratar el cáncer de vejiga.
Además, la mayor persistencia de estas cepas
recombinantes es una ventaja para la presentación de otros
antígenos, por ejemplo del VIH en seres humanos, y a fin de inducir
respuestas inmunitarias de protección. Aquellas cepas mejoradas
también se pueden usar en medicina veterinaria, por ejemplo para
prevenir la tuberculosis bovina.
\vskip1.000000\baselineskip
Por lo tanto, la presente invención está
dirigida a una cepa de M. bovis BCG en la que dicha cepa
tiene integrado el fragmento RD1-2F9 (\sim 32 kb)
que cubre la región del genoma AL123456 de M. tuberculosis
desde 4.337 kb hasta 4.369 kb responsable de la inmunogenicidad
potenciada frente a los bacilos de la tuberculosis. Esta cepa se
denominará como la cepa M. bovis BCG::RD1.
Esta región comprende los genes Rv3871, Rv3872
(SEC ID nº 2, PE micobacteriana), Rv3873 (SEC ID nº 3, PPE), Rv3874
(SEC ID nº 4, CFP-10), Rv3875 (SEC ID nº 5,
ESAT-6), y Rv3876.
Estos genes se pueden mutar (supresión,
inserción o modificación de bases) para mantener la inmunogenicidad
mejorada, a la vez que se disminuye la virulencia de las cepas.
Usando un procedimiento habitual, el experto en la materia puede
seleccionar las cepas de M. bovis BCG::RD1 o M.
microti::RD1, en las que se ha integrado un gen mutado,
mostrando inmunogenicidad mejorada y menor virulencia.
Se ha mostrado en este caso que la introducción
de la región RD1 hace que las cepas de vacunas induzcan una
respuesta inmunitaria más eficaz frente a una exposición con M.
tuberculosis. Sin embargo, esta primera generación de
constructos puede ser seguida por otras generaciones de constructos
ajustadas de forma más fina ya que la cepa de vacuna de BCG::RD1
complementada también mostró un fenotipo más virulento en ratones
gravemente inmunodeprimidos (SCID). Por lo tanto, los constructos
de BCG RD1+ se pueden modificar para que sean aplicables como cepas
de vacunas, a la vez que son seguros para individuos
inmunodeprimidos.
Con esta perspectiva, el experto en la materia
puede adaptar la cepa de BCG::RD1 mediante la concepción de cepas
de vacunas de BCG que sólo tienen partes de los genes que codifican
ESAT-6 o CFP-10 en un vector de
expresión micobacteriano (por ejemplo pSM81) bajo el control de un
promotor, más particularmente un promotor de hsp60. Por ejemplo, al
menos una porción del gen esat-6 que codifica
péptidos de 20-mer inmunógenos de
ESAT-6 activos como epítopos de células T (Mustafa
AS, Oftung F, Amoudy HA, Madi NM, Abal AT, Shaban F, Rosen Krands
I, y Andersen P. (2000) Multiple epitopes from the Mycobacterium
tuberculosis ESAT-6 antigen are recognized by
antigen-specific human T cell lines. Clin Infect
Dis. 30 Supl 3:S201-5, los péptidos P1 a P8 se
incorporan aquí en la descripción) se podría clonar en este vector
y electroporar en BCG, dando como resultado una cepa de BCG que
produce estos epítopos.
Como alternativa los genes que codifican
ESAT-6 y CFP-10 (por ejemplo en el
plásmido RD1-AP34 y/o RD1-2F9) se
podrían alterar mediante mutagénesis dirigida (usando por ejemplo el
kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange de Stratagen) en una
forma en la que la mayoría de los péptidos inmunógenos de
ESAT-6 permanezcan intactos, pero que se pierda la
funcionalidad biológica de ESAT-6.
Este enfoque podría dar como resultado una
vacuna de BCG más protectora, sin incrementar la virulencia del
constructo de BCG recombinante.
Por lo tanto, la descripción también está
dirigida a un método para preparar y seleccionar la cepa de M.
bovis BCG, que comprende una etapa que consiste en modificar la
cepa de M. bovis BCG::RD1 como se define anteriormente
mediante inserción, supresión o mutación en la región RD1 integrada,
más particularmente en el gen de esat-6 o
CFP-10, conduciendo dicho método a cepas que son
menos virulentas para individuos inmunodeprimidos. Juntos, estos
métodos permitirían explicar qué provoca el efecto que se observa
con la cepa de BCG::RD1 (dando la presencia de epítopos de células
T adicionales de ESAT-6 y CFP10 como resultado una
inmunogenicidad incrementada), o, si el efecto está provocado por
una mejor aptitud de los clones de BCG::RD1 recombinantes, dando
como resultado un tiempo de exposición más prolongado del sistema
inmunitario a la vacuna, o mediante un efecto combinatorio de ambos
factores.
En una forma de realización preferida, la
invención se refiere a las cepas de M. bovis BCG::RD1, que
tienen integradas un cósmido denominado aquí como
RD1-2F9 contenido en las cepas de E. coli
depositadas el 2 de abril de 2002 en el CNCM (Institut Pasteur, 25,
rue du Docteur Roux, 75724 París cedex 15, Francia) con el número
de acceso I-2831. El RD1-2F9 es un
cósmido que comprende una porción del genoma de Mycobacterium
tuberculosis H37Rv que abarca la región RD1 y el gen de
resistencia a higromicina. El RD1-AP34 es un cósmido
que comprende una porción del ADN de Mycobacterium
tuberculosis que contiene dos genes que codifican
ESAT-6 y CFP-10, así como un gen que
confiere resistencia a canamicina.
El constructo RD1-AP34 contiene
un fragmento de 3909 pb del genoma de M. tuberculosis H37Rv
de la región 4350459 pb a 4354367 pb clonado en un vector integrante
pKint (SEC ID nº 1). El número de acceso del segmento 160 del genoma
de M. tuberculosis H37Rv que contiene esta región es
AL022120.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia del fragmento
RD1-2F9 (\sim 32 kb) cubre la región del genoma
AL123456 de M. tuberculosis desde 4337 kb hasta 4369 kb, y también
contiene la secuencia descrita anteriormente.
Tal cepa satisface el objetivo de la invención,
el cual es proporcionar una vacuna mejorada contra la tuberculosis o
un agente profiláctico o terapéutico basado en M. bovis BCG
para estos fines.
La cepa M. bovis BCG::RD1 descrita
anteriormente es una vacuna contra la tuberculosis mejor que M.
bovis BCG. Esta cepa también se puede mejorar reintroduciendo
otros genes encontrados en los loci RD8 y RD5 de M.
tuberculosis. Estas regiones codifican antígenos de células T
adicionales. Como se ha indicado, la sobreexpresión de los genes
contenidos en las regiones RD1, RD5 y RD8 por medio de promotores
exógenos está englobada por la invención.
En una segunda forma de realización, la
invención se refiere a un cósmido o un plásmido que comprende el
fragmento RD1-2F9 (\sim 32 kb), que cubre la
región del genoma AL123456 de M. tuberculosis desde 4.337 kb hasta
4.369 kb, comprendiendo dicha región los genes Rv3871, Rv3872 (PE
micobacteriana), Rv3873 (PPE), Pv3874 (CFP-10),
Rv3875 (ESAT-6), y Rv3876. La invención también se
refiere al uso de estos cósmidos o plásmidos para transformar cepas
de M. bovis BCG. Como se ha indicado anteriormente, estos
cósmidos o plásmidos pueden comprender un gen mutado seleccionado
de Rv3871 a RV3876, siendo dicho gen mutado responsable de la
inmunogenicidad mejorada y virulencia reducida.
En otra forma de realización, la invención
comprende una composición farmacéutica que comprende una cepa como
se representa anteriormente y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Además de las cepas, estas composiciones
farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables
que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el
procesamiento de la vacuna viva en preparaciones que se pueden usar
farmacéuticamente. Otros detalles sobre técnicas para la formulación
y administración se pueden encontrar en la última edición de
Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publising Co., Easton,
Pa.).
Preferentemente, tal composición es adecuada
para la administración oral, intravenosa o subcutánea.
La determinación de la dosis eficaz está
perfectamente dentro de la capacidad de los expertos en la materia.
Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad de
ingrediente activo, es decir, el número de cepas administradas, que
mejora los síntomas o afección. La eficacia terapéutica y la
toxicidad se pueden determinar mediante procedimientos
farmacéuticos estándar en animales experimentales, por ejemplo ED50
(la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y LD50
(la dosis letal para el 50% de la población). La relación de dosis
de efectos tóxicos a terapéuticos es el índice terapéutico, y se
puede expresar como la relación LD50/ED50. Se prefieren
composiciones farmacéuticas que muestren grandes índices
terapéuticos. Por supuesto, la ED50 se ha de modular según el
mamífero a tratar o vacunar. A este respecto, la invención contempla
una composición adecuada para la administración a seres humanos así
como una composición veterinaria.
La descripción también está dirigida a una
vacuna que comprende una cepa de M. bovis BCG::RD1 como se
representa anteriormente y un vehículo adecuado. Esta vacuna es
especialmente útil para prevenir la tuberculosis. También se puede
usar para tratar el cáncer de vejiga.
La descripción también se refiere a un producto
que comprende una cepa como se representa anteriormente y al menos
una proteína seleccionada de ESAT-6 y
CFP-10 o un epítopo derivado de la misma, para un
uso separado, simultáneo o secuencial para tratar tuberculosis.
En todavía otra forma de realización, la
descripción se refiere al uso de una cepa de M. bovis
BCG::RD1 como se representa anteriormente para prevenir o tratar la
tuberculosis.
También se refiere al uso de una cepa de M.
bovis BCG::RD1 como un adyuvante/inmunomodulador poderoso usado
en el tratamiento de cáncer de vejiga superficial.
La invención se detalla adicionalmente a
continuación y se ilustrará con las siguientes figuras.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: M. bovis BCG y M.
microti tienen una supresión cromosómica, RD1, que abarca el
locus cfp10-esat6 .
- (A)
- Mapa de la región de cfp10-esat6 que muestra los seis marcos de lectura posibles y las predicciones del gen de H37Rv de M. tuberculosis. Este mapa también está disponible en: (http://genolist.pasteur.fr/fubercuList/).
- Las regiones suprimidas se muestran para BCG (rojo) y M. microti (azul) con sus coordenadas del genoma H37Rv respectivas, y la extensión del locus de ESAT-6 conservado (F. Tekaia, et al., Tubercle Lung Disease 79, 329 (1999)), se indica por la barra gris.
- (B)
- Tabla que muestra las características de regiones suprimidas seleccionadas para el análisis de complementación. Se muestran los factores de virulencia potencial y sus funciones putativas interrumpidas por cada supresión. Las coordenadas son para el genoma de H37Rv de M. tuberculosis.
- (C)
- Clones usados para complementar BCG. Clones individuales que abarcan las regiones RD1 (RD1-I106 y RD1-2F9) se seleccionaron de una librería genómica de M. tuberculosis ordenada (R.B. sin publicar) en pYUB412 (S. T. Cole, et al., Nature 393, 537 (1998) y W. R. Bange, F. M. Collins, W. R. Jacobs, Jr., Tuber. Lung Dis. 79, 171 (1999)) y se electroporaron en cepas de M. bovis BCG, o M. microti. Transformantes resistentes a higromicina se verificaron usando PCR específica para los genes correspondientes. pAP35 se derivó de RD1-2F9 mediante escisión de un fragmento AflII. pAP34 se construyó subclonando un fragmento EcoRI-XbaI en el vector integrante pKINT. Los extremos de cada fragmento están relacionados con la supresión de BCG RD1 (caja sombreada) con líneas en negro, y las coordinadas de H37Rv para los otros extremos de los fragmentos se dan en kilobases.
- (D)
- Análisis de inmunotransferencia, usando un anticuerpo monoclonal anti-ESAT-6, de extractos proteicos de célula completa a partir de cultivos en fase logarítmica de H37Rv (S. T. Cole, et al., Nature 393, 537 (1998)), BCG::pYUB412 (M. A. Behr, et al., Science 284, 1520 (1999)), BCG::RD1-I106 (R. Brosch, et al., Infection Immun. 66, 2221 (1998)), BCG::RD1-2F9 (S. V. Gordon, et al., Molec Microbiol 32, 643 (1999)), M. bovis (H. Salamon et al, Genome Res 10, 2044 (2000)), Mycobacterium smegmatis (G. G. Mahairas, et al, J. Bacteriol. 178, 1274 (1996)), M. smegmatis::pYUB412, y M. smegmatis::RD1-2F9 (R. Brosch, et al., Proc Natl Acad Sci USA 99, 3684 (2002)).
Figura 2: La complementación de BCG Pasteur
con la región RD1 altera la morfología de la colonia y conduce a la
acumulación de Rv3873 y ESAT-6 en la pared
celular.
- (A)
- Diluciones en serie de cultivos de 3 semanas de BCG::pYUB412, BCG::I106 o BCG::RD1-2F9 que se hicieron crecer en placas de agar Middle-brook 7H10. El cuadrado blanco muestra el área de la placa aumentada en la imagen a la derecha.
- (B)
- Imagen con el microscopio de luz a un aumento de cincuenta veces de las colonias de BCG::pYUB412 y BCG::RD1-2F9. Se añadieron adyacentemente 5 \mul gotas de suspensiones bacterianas de cada cepa sobre placas 7H10 y se obtuvo la imagen después de 10 días de crecimiento, iluminando las colonias a través del agar.
- (C)
- Análisis de inmunotransferencia de diferentes fracciones celulares de H37Rv obtenidas a partir de http://www.cvmbs.colostate.edu/microbiology/tb/ResearchMA.html usando un anticuerpo anti-ESAT-6 o
- (D)
- suero de conejo anti-Rv3873 (PPE). H37Rv y BCG significan extractos de células completas procedentes de las bacterias respectivas, y Cyt, Mem y CW corresponden a las fracciones citosólica, membranaria y de pared celular de M. tuberculosis H37Rv.
Figura 3: La complementación de BCG Pasteur
con la región RD1 incrementa la persistencia bacteriana y la
patogenicidad en ratones.
- (A)
- Bacterias en el bazo y pulmones de ratones BALB/c tras la infección intravenosa (i.v.) vía la vena de la cola lateral con 10^{6} unidades formadoras de colonias (cfu) de M tuberculosis H37Rv (rojo) o 10^{7} cfu de BCG::pYUB412 (amarillo) o BCG::RD1-I106 (verde).
- (B)
- Persistencia bacteriana en el bazo y pulmones de ratones C57BL/6 tras la infección i.v. con 10^{5} cfu de BCG::pYUB412 (amarillo), BCG::RD1-I106 (verde) o BCG::RD1-2F9 (azul).
- (C)
- Multiplicación bacteriana tras la infección i.v. con 10^{6} cfu de BCG::pYUB412 (amarillo) y BCG::RD1-2F9 (azul) en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID). Para A, B, y C, cada punto de tiempo es la media de 3 a 4 ratones, y las barras de error representan desviaciones estándar.
\newpage
- (D)
- Bazos de ratones SCID tres semanas después de la infección i.v. con 10^{6} cfu de BCG::pYUB412, BCG::RD1-2F9 o BCG::I301 (una "información genética insertada" de RD3, Fig. 1B). La escala está en cm.
Figura 4: La inmunización de ratones con
BCG::RD1 genera respuestas importantes de células T específicas de
ESAT-6 y una protección potenciada frente a una
exposición con M. tuberculosis .
- (A)
- Respuesta proliferativa de esplenocitos de ratones C57BL/6 inmunizados subcutáneamente (s.c.) con 106 CFU de BCG::pYUB412 (cuadrados en blanco) o BCG::RD1-2F9 (cuadrados oscuros) frente a la estimulación in vitro con diversas concentraciones de péptidos sintéticos a partir de una proteína de cápside de tipo 1 de poliovirus VP1, ESAT-6 o Ag85A (K. Huygen, et al., Infect. Immun. 62, 363 (1994), L. Brandt, J. Immunol. 157, 3527 (1996) y C. Leclerc et al, J. Virol. 65, 711 (1991)).
- (B)
- Proliferación de esplenocitos de ratones inmunizados con BCG::RD1-2F9 en ausencia o presencia de 10 \mug/ml de péptido ESAT-6 1-20, con o sin 1 \mug/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD4 (GK1.5) o anti-CD8 (H35-17-2). Los resultados se expresan como media y desviación estándar de incorporación de ^{3}H-timidina a partir de pocillos duplicados.
- (C)
- Concentración de IFN-\gamma en sobrenadantes de cultivos de esplenocitos de ratones C57BL/6 estimulados durante 72 h con péptidos o PPD tras la inmunización s.c. o i.v. con BCG::pYUB412 (rojo y amarillo) o BCG::RD1-2F9 (verde y azul). Los ratones se inocularon con 10^{6} (amarillo y verde) o 10^{7} (rojo y azul) cfu. Los niveles de IFN-\gamma se cuantificaron usando un ELISA de sándwich (límite de detección de 500 pg/ml) con los mAbs R4-6A2 y XMG1.2 conjugado con biotina. Los resultados se expresan como la media y desviación estándar de pocillos de cultivo duplicados.
- (D)
- Recuentos bacterianos en el bazo y pulmones de ratones BALB/C vacunados y no vacunados 2 meses después de una exposición i.v. con M. tuberculosis H37Rv. Los ratones se expusieron 2 meses tras la inoculación i.v. con 10^{6} cfu de BCG::pYUB412 o BCG::RD1-2F9. Se colocaron en placas homogenados de órganos para la enumeración bacteriana en medio 7H11, con o sin higromicina, para diferenciar M. tuberculosis de colonias residuales de BCG. Los resultados se expresan como la media y desviación estándar de 4 a 5 ratones, y los niveles de significancia se derivaron usando la prueba de la suma de rangos de Wilcoxon.
Figura 5: Mapa BAC de la cepa OV254 de
Mycobacterium microti (denominado MiXXX), superpuesto sobre
los mapas BAC de M. tuberculosis H37Rv (denominado RvXXX) y
M. bovis AF2122/97 (denominado MbXXX). Las barras de escala
indican la posición en el genoma de M. tuberculosis.
Figura 6: Diferencia en la región
4340-4360 kb entre la supresión en BCG RD1^{bcg}
(A) y en M. microti RD1^{mic} (C) con relación a M.
tuberculosis H37Rv (B).
Figura 7: Diferencia en la región
3121-3127 kb entre M. tuberculosis H37Rv (A)
y M. microti OV254 (B). Las cajas en gris representan las
repeticiones directas (DR), las negras representan las secuencias
espaciadoras numeradas únicas. * Secuencia espaciadora idéntica a la
del espaciador 58 dado a conocer por van Embden et al. (42).
Obsérvese que los espaciadores 33-36 y
20-22 no se muestran debido a que H37Rv carece de
estos espaciadores.
Figura 8: A) Perfiles de PFGE de AseI de
diversas cepas de M. microti; hibridación con B) sonda
esat-6 radiomarcada; C) sonda de la región
que flanquea a RD1^{mic}; D) sonda plcA. 1. M. bovis
AF2122/97, 2. M. canetti, 3. M. bovis BCG Pasteur, 4. M.
tuberculosis H37Rv, 5. M. microti OV254, 6. M.
microti Myc 94-2272, 7. M. microti B3
tipo ratón, 8. M. microti B4 tipo ratón , 9. M.
microti B2 tipo llama, 10. M. microti B1 tipo llama, 11.
M. microti ATCC 35782. M: Marcador de PFGE de bajo rango
(NEB).
Figura 9: Productos de PCR obtenidos a partir de
diversas cepas de M. microti usando cebadores que flanquean
la región RD1^{mic}, para amplificar el antígeno de
ESAT-6, que flanquean la región MiD2. 1. M.
microti B1 tipo llama, 2. M. microti B4 tipo ratón, 3.
M. microti B3 tipo ratón, 4. M. microti B2 tipo llama,
5. M. microti ATCC 35782, 6. M. microti OV254, 7.
M. microti Myc 94-2272, 8. M.
tuberculosis H37Rv.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha mencionado anteriormente, se ha
encontrado que la complementación con RD1 se logró mediante un
cambio en el aspecto colonial ya que las cepas de "información
genética insertada" de BCG Pasteur desarrollaron un morfotipo
sorprendentemente diferente (Fig. 2A). Las cepas complementadas con
RD1 adoptaron una morfología que se extiende, menos rugosa, que es
característica de M. bovis, y esto fue más manifiesto cuando
las colonias se inspeccionaron mediante microscopio de luz (Fig.
2B). Se muestran los mapas de los clones usados (Fig. 1C). Estos
cambios se observaron tras la complementación con todos los
constructos de RD1 (Fig. 1C) y al complementar M. microti
(datos no mostrados). Pertinentemente, Calmette y Guérin (A.
Calmette, La vaccination preventive contre la tuberculose. (Masson
et al., París, 1927)) observaron un cambio en la morfología
de la colonia durante su paso inicial de M. bovis, y nuestros
experimentos demuestran ahora que este cambio, que corresponde a la
pérdida de RD1, contribuyó directamente a atenuar esta cepa
virulenta. Se sabe que la integridad de la pared celular es un
determinante clave de la virulencia para M. tuberculosis (C.
E. Barry, Trends Microbiol 9, 237 (2001)), y se ha demostrado que
los cambios tanto en los lípidos (M. S. Glickman, J. S. Cox, W. R.
Jacobs, Jr., Mol Cell 5, 717 (2000)) como en las proteínas (F. X.
Berthet, et al., Science 282, 759 (1998)) de la pared
celular alteran la morfología de la colonia y disminuyen la
persistencia en modelos de animales.
Para determinar qué genes estaban implicados en
estos cambios morfológicos, se usaron anticuerpos que reconocen
tres proteínas de RD1 (Rv3873, CFP10 y ESAT-6) en
análisis de fraccionamiento inmunocitológico y subcelular. Cuando
las diferentes fracciones celulares procedentes de M.
tuberculosis se inmunotransfirieron, las tres proteínas se
localizaron en la fracción de la pared celular (Fig. 2C), aunque
también se detectaron cantidades significativas de Rv3873, una
proteína de PPE, en las fracciones membranaria y citosólica (Fig.
2D). Usando tinción con inmuno-oro y microscopía
electrónica, se confirmó la presencia de ESAT-6 en
la cubierta de M. tuberculosis, pero no se pudo detectar
ninguna alteración en la ultraestructura capsular (datos no
mostrados). Previamente, CFP-10 y
ESAT-6 se han considerado como proteínas segregadas
(F. X. Berthet et al, Microbiology 144, 3195 (1998)), pero
nuestros resultados sugieren que sus funciones biológicas están
enlazadas directamente con la pared celular.
Los cambios en la morfología colonial van
acompañados a menudo por una virulencia bacteriana alterada. La
evaluación inicial del crecimiento de diferentes "informaciones
genéticas insertadas" de BCG::RD1 en ratones C57BL/6 o BALB/c
tras la infección intravenosa reveló que la complementación no
restauró los niveles de virulencia hasta aquellos de la cepa de
referencia M. tuberculosis H37Rv (Fig. 3A). En experimentos a
un plazo más largo, se detectaron diferencias modestas pero
significativas en la persistencia de las "informaciones genéticas
insertadas" de BCG::RD1 en comparación con los controles de BCG.
Tras la infección intravenosa de ratones C57BL/6, sólo las
"informaciones genéticas insertadas" de RD1 todavía eran
detectables en los pulmones tras 106 días (Fig. 3B). Esta
diferencia en virulencia entre los recombinantes de RD1 y el control
del vector de BCG fue más pronunciada en ratones con
inmunodeficiencia combinada severa (SCID) (Fig. 3C). La
"información genética insertada" de BCG::RD1 fue notablemente
más virulenta, según se evidencia mediante la tasa de crecimiento
en pulmones y bazo y también por un grado aumentado de
esplenomegalia (Fig. 3D). El examen citológico reveló numerosos
bacilos, infiltración celular importante y formación de granuloma.
Estos incrementos en la virulencia tras la complementación con la
región RD1 demuestran que la pérdida de este locus genómico
contribuyó a la atenuación de BCG.
La incapacidad para restaurar la total
virulencia a BCG Pasteur no fue debida a inestabilidad de nuestros
constructos ni a la cepa usada (datos no mostrados). Se obtuvieron
resultados esencialmente idénticos al complementar BCG Rusia, una
cepa que se hizo pasar menos veces que BCG Pasteur y que se
presupone, por lo tanto, que está más próxima al ancestro original
(M. A. Behr, et al., Science 284, 1520 (1999)). Esto indica
que la atenuación de BCG fue un proceso polimutacional y la pérdida
de virulencia residual para los animales se documentó a finales de
los años 1920 (T. Oettinger, et al, Tuber Lung Dis 79, 243
(1999)). Usando la misma estrategia experimental, también se
ensayaron los efectos de la complementación con
RD3-5, RD7 y RD9 (S. T. Cole, et al., Nature
393, 537 (1998); M. A. Behr, et al., Science 284, 1520
(1999); R. Brosch, et al., Infection Immun. 66, 2221 (1998)
y S. V. Gordon et al., Molec Microbiol 32, 643 (1999)) que
codifican factores de virulencia putativos (Fig. 1B). La
reintroducción de estas regiones, que no están restringidas a cepas
avirulentas, no afectó a la virulencia en ratones
inmunocompetentes. Aunque es posible que los efectos de la supresión
actúen sinérgicamente, parece más plausible que estén implicados
otros mecanismos atenuantes.
Puesto que RD1 codifica al menos dos antígenos
de células T potentes (R. Colangelli, et al., Infect. Immun.
68, 990 (2000), M. Harboe, et al., Infect. Immun. 66, 717
(1998) y R. L. V. SkjØt, et al., Infect. Immun. 68, 214
(2000)), se investigó si su restauración indujo respuestas
inmunitarias frente a estos antígenos o incluso mejoró la capacidad
protectora de BCG. Tres semanas tras la inoculación intravenosa o
subcutánea con BCG::RD1 o controles de BCG, se observó una
proliferación similar de esplenocitos frente a un péptido Ag85A
(una proteína de BCG antigénica) (K. Huygen, et al., Infect.
Immun. 62, 363 (1994)), pero no frente a un péptido vírico de
control (Fig. 4A). Además, BCG::RD1 generó potentes respuestas de
células T CD4^{+} frente al péptido de ESAT-6,
como se muestra mediante la proliferación de esplenocitos (Fig. 4A,
B) y la fuerte producción de IFN-\gamma (Fig.
4C). Por el contrario, el control de BCG::pYUB412 no estimuló
respuestas de células T específicas para ESAT-6,
indicando así que éstas estaban mediadas por el locus de RD1. Por lo
tanto, ESAT-6 es muy inmunógena en ratones en el
contexto de BCG recombinante.
Cuando se usa como una vacuna subunitaria,
ESAT-6 provoca respuestas de células T e induce
niveles de protección más débiles que pero parecidos a los de BCG
(L. Brandt et al, Infect. Immun. 68, 791 (2000)). Se llevaron
a cabo experimentos de exposición para determinar si la inducción
de respuestas inmunitarias frente a antígenos codificados por
BCG::RD1, tales como ESAT-6, podría mejorar la
protección frente a una infección con M. tuberculosis.
Grupos de ratones inoculados con BCG::pYUB412 o BCG::RD1 se
infectaron subsiguientemente de forma intravenosa con M.
tuberculosis H37Rv. Estos experimentos mostraron que la
inmunización con la "información genética insertada" de
BCG::RD1 inhibió el crecimiento de M. tuberculosis tanto en
ratones BALB/c (Fig. 4D) como C57BL/6 cuando se compara con la
inoculación con BCG sola.
Aunque los incrementos en la protección inducida
por BCG::RD1 y el control de BCG son modestos, demuestran
convincentemente que se han desarrollado diferencias genéticas entre
la vacuna viva y el patógeno que han debilitado la capacidad
protectora de BCG. Por lo tanto, este estudio define la base
genética de un compromiso que ha ocurrido, durante el proceso de
atenuación, entre la pérdida de virulencia y la protección reducida
(M. A. Behr, P. M. Small, Nature 389, 133 (1997)). Las BCG
recombinantes presentadas aquí pueden no ser apropiadas en su forma
actual como candidatos de vacunas debido a la incertidumbre sobre su
seguridad. Sin embargo, la estrategia de reintroducir, o incluso
sobreproducir (M. A. Horwitz et al, Proc Natl Acad Sci U S A
97, 13853 (2000)), los antígenos inmunodominantes perdidos de M.
tuberculosis en BCG se podría combinar con una mutación
atenuante inmunoneutra para crear una vacuna más eficaz contra la
tuberculosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se buscó cualquier diferencia genética entre
aislados humanos y de topillos que pudiese explicar su diferente
grado de virulencia y preferencia por el hospedante, y qué hace que
los aislados de topillos sean perjudiciales para seres humanos. A
este respecto, se emplearon métodos de genómica comparativa en
relación con la presente invención para identificar diferencias
principales que puedan existir entre la cepa de referencia OV254 de
M. microti y las cepas completamente secuenciadas de M.
tuberculosis H37Rv (10) o M. bovis AF2122/97 (14). Se
construyó una librería ordenada de cromosoma artificial bacteriano
(BAC) de M. microti OV254 y se llevó a cabo una comparación
individual de BAC a BAC de un conjunto mínimo de estos clones con
los clones de BAC procedentes de librerías previamente construidas
de M. tuberculosis H37Rv y M. bovis AF2122/97.
Se detectaron diez regiones en M. microti
que fueron diferentes de las regiones genómicas correspondientes en
M. tuberculosis y M. bovis. Para investigar si estas
regiones estaban asociadas con la capacidad de las cepas de M.
microti para infectar seres humanos, se estudió su organización
genética en 8 cepas de M. microti adicionales, incluyendo
aquellas aisladas recientemente de pacientes con tuberculosis
pulmonar. Este análisis identificó algunas regiones que estaban
específicamente ausentes de todas las cepas de M. microti
ensayadas, pero que estaban presentes en todos los otros miembros
del complejo de M. tuberculosis, y otras regiones que sólo
estaban ausentes de los aislados de topillo de M.
microti.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepas bacterianas y plásmidos. M. microti
OV254 que se aisló originalmente de topillos en el Reino Unido en
los años 1930 fue suministrado amablemente por MJ Colston (45). Se
incluyó ADN procedente de M. microti OV216 y OV183 en un
conjunto de cepas usadas durante un estudio multicentro (26). M.
microti Myc 94-2272 se aisló en 1988 a partir
del fluido de perfusión de un paciente de diálisis de 41 años de
edad (43) y fue proporcionada amablemente por L. M. Parsons. M.
microti 35782 fue adquirida a partir de la American Type
Culture Collection (denominación TMC 1608 (M.P. Prague)). M.
microti B1 tipo llama, B2 tipo llama, B3 tipo ratón y B4 tipo
ratón se obtuvieron a partir de la colección del National Reference
Center for Mycobacteria, Forschungszentrum Borstel, Alemania. La
cepa AF2122/97 de M. bovis, espoligotipo 9, fue responsable
de una epidemia de manada en Devon en el Reino Unido, y se ha
aislado de lesiones tanto en ganado vacuno como en tejones.
Típicamente, las micobacterias se hicieron crecer en medio líquido
Middlebrook 7H9 (Difco) que contiene 10% de ácido
oleico-dextrosa-catalasa (Difco),
0,2% de ácido pirúvico y 0,05% de Tween 80.
Construcción de la librería, preparación de
ADN de BAC, y reacciones de secuenciación. La preparación de ADN
genómico embebido en agarosa a partir de la cepa OV254 de M
microti, H37Rv de M. tuberculosis, BCG de M.
bovis se llevó a cabo como se describe en Brosch et al.
(5). La librería de M. microti se construyó mediante
ligación de fragmentos HindIII parcialmente digeridos
(50-125 kb) en pBeloBAC11. A partir de los 10.000
clones que se obtuvieron, se recogieron 2.000 en placas de 96
pocillos y se almacenaron a -80ºC. Las preparaciones plasmídicas de
clones recombinantes para reacciones de secuenciación se obtuvieron
reuniendo ocho copias de placas de 96 pocillos, conteniendo cada
pocillo un cultivo durante toda la noche en 250 \mul de medio 2YT
con 12,5 \mug.ml^{-1} de cloranfenicol. Después de 5 minutos de
centrifugación a 3000 rpm, los peletes bacterianos se
resuspendieron en 25 \mul de disolución A (25 mM de Tris, pH 8,0,
50 mM de glucosa y 10 mM de EDTA), las células se lisaron añadiendo
25 \mul de tampón B (NaOH 0,2 M, SDS 0,2%). Después se añadieron
20 \mul de acetato de sodio 3 M frío, pH 4,8, y se mantuvo en
hielo durante 30 minutos. Tras la centrifugación a 3000 rpm durante
30 minutos, los sobrenadantes reunidos (140 \mul) se transfirieron
a nuevas placas. Se añadieron 130 \mul de isopropanol, y después
de 30 minutos en hielo el ADN se peletizó mediante centrifugación a
3500 rpm durante 15 minutos. El sobrenadante se desechó, y el pelete
se resuspendió en 50 \mul de una disolución ARNasa A 10 \mug/ml
(en Tris 10 mM pH 7,5/EDTA 10 mM) y se incubó a 64ºC durante 15
minutos. Tras la precipitación (2,5 \mul de acetato de sodio 3 M,
pH 7, y 200 \mul de etanol absoluto), los peletes se enjuagaron
con 200 \mul de etanol al 70%, se secaron al aire y finalmente se
suspendieron en 20 \mul de tampón de TE.
Se llevaron a cabo reacciones de secuenciación
terminal con un kit de secuenciación de ciclo terminador Taq
DyeDeoxy Terminator (Applied Biosystems) usando una mezcla de 13
\mul de una disolución de ADN, 2 \mul de cebador (2 \muM)
(SP6-BAC1, AGTTAGCTCACTCATTAGGCA (SEC ID nº 7), o
T7-BAC1, GGATGTGCTGCAAGGCGATTA (SEC ID nº 8)), 2,5
\mul de Big Dye y 2,5 \mul de un tampón 5X (50 mM de MgCl_{2,}
50 mM de Tris). La ciclación térmica se llevó a cabo en un
amplificador PTC-100 (MJ Inc.) con una etapa de
desnaturalización inicial de 60 s a 95ºC, seguido de 90 ciclos de
15 s a 95ºC, 15 s a 56ºC, 4 min. a 60ºC. El ADN se precipitó
entonces con 80 \mul de etanol al 76% y se centrifugó a 3000 rpm
durante 30 minutos. Después de desechar el sobrenadante, el ADN se
enjuagó finalmente con 80 \mul de etanol al 70% y se resuspendió
en tampones apropiados dependiendo del tipo de secuenciador
automatizado usado (ABI 377 o ABI 3700). Los datos de secuencias se
transfirieron a estaciones de trabajo digitales y se evitaron
usando el software TED del paquete Staden (37). Las secuencias
editadas se compararon frente a la base de datos de M.
tuberculosis H37Rv (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/),
el servidor BLAST de M. bovis
(\underbar{http://www.sanger.ac.uk/Projects/M\_bovis/blast\_server.shtml}),
y las bases de datos domésticas, para determinar las posiciones
relativas de las secuencias finales de M. microti OV254
BAC.
Preparación de ADN de BAC a partir de
recombinantes y comparación de los perfiles de digestión de BAC.
El ADN para la digestión se preparó como se describe previamente
(4). Se digirió ADN (1 \mug) con HindIII (Boehringer) y
los productos de restricción se separaron mediante electroforesis en
gel de campo pulsado (PFGE) en un sistema Biorad
CHEF-DR III usando un gel de agarosa al 1% (p/v) y
un pulso de 3,5 s durante 17 h a 6 V.cm^{-1}. Como patrones de
tamaño, se usaron marcadores de PFGE de bajo rango (NEB). Los
tamaños de los insertos se estimaron tras teñir con bromuro de
etidio y visualizar con luz UV. Se hicieron diferentes comparaciones
con clones que solapan procedentes de las librerías de M.
microti OV254, M. bovis AF2122/97, y M.
tuberculosis H37Rv pBeloBAC11.
Análisis de PCR para determinar la presencia
de genes en diferentes cepas de M. microti . Las
reacciones contenían 5 \mul de tampón de PCR 10X (100 mM de
\beta-mercaptoetanol, 600 mM de
Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM de MgCl_{2}, 170 mM de
(NH_{4})_{2}SO4, 20 mM de mezcla nucleotídica dNTP), 2,5
\mul de cada cebador a 2 \muM, 10 ng de ADN molde, 10% de DMSO
y 0,5 unidades de Taq polimerasa, en un volumen final de 12,5
\mul. La ciclación térmica se llevó a cabo en un amplificador
PTC-100 (MJ Inc.) con una etapa de desnaturalización
inicial de 60 s a 95ºC, seguido de 35 ciclos de 45 s a 95ºC, 1 min.
a 60ºC y 2 min. a 72ºC.
Análisis de RFLP. De forma breve, tarugos
en agarosa de ADN genómico preparado como se describe previamente
(5) se digirieron con AseI, DraI o XbaI (NEB),
después se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1%, y
finalmente se transfirieron a membranas de nitrocelulosa
Hybond-C extra (Amersham). Se amplificaron
diferentes sondas mediante PCR a partir de la cepa OV254 de M.
microti o H37Rv de M. tuberculosis usando cebadores
para:
- esat-6 (esat-6F GTCACGTCCATTCATTCCCT (SEC ID nº 9);
- esat-6R ATCCCAGTGACGTTGCCTT) (SEC ID nº 10),
- la región de flanqueo de RD1^{mic} (4340, 209F GCAGTGCAAAGGTGCAGATA (SEC ID nº 11); 4354, 701R GATTGAGACACTTGCCACGA (SEC ID nº 12)), o
- plcA (plcA.int.F CAAGTTGGGTCTGGTCGAAT (SEC ID nº 13); plcA.int.R GCTACCCAAGGTCTCCTGGT (SEC ID nº 14)). Los productos de la amplificación se radiomarcaron usando el kit Stratagene Prime-It II (Stratagene). Las hibridaciones se llevaron a cabo a 65ºC en una disolución que contiene NaCl 0,8 M, EDTA pH 8, 5 mM, fosfato de sodio 50 mM pH 8, 2% de SDS, 1X de reactivo de Denhardt y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón (Genaxis). Las membranas se expusieron a pantallas de formación de fosfoimágenes, y las imágenes se digitalizaron usando un aparato formador de fosfoimágenes STORM.
- Números de acceso de las secuencias de ADN. Las secuencias nucleotídicas que flanquean MiD1, MiD2, MiD3, así como la secuencia de unión de RD1^{mic}, se han depositado en la base de datos de EMBL. Los números de acceso son AJ345005, AJ345006, AJ315556 y AJ315557, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Establecimiento de una librería de BAC
ordenada completa de M. microti OV254. La electroporación
de pBeloBAC11 que contiene digestiones parciales de HindIII
de ADN de M. microti OV254 en Escherichia coli DH10B
produjo aproximadamente 10.000 clones recombinantes, a partir de los
cuales se aislaron 2.000 y se almacenaron en placas de 96 pocillos.
Usando la secuencia completa del genoma de M. tuberculosis
H37Rv como armazón, la secuenciación terminal de 384 clones de
M. microti BAC escogidos al azar permitió seleccionar
suficientes clones para cubrir casi todo el cromosoma de 4,4 Mb.
Unos pocos clones raros que abarcaron regiones que no fueron
cubiertas por este enfoque se identificaron mediante detección
sistemática por PCR de conjuntos como se describe previamente (4).
Esto dio como resultado un conjunto mínimo de 50 BAC, que cubre
alrededor de 99,9% del genoma de M. microti OV254, cuyas
posiciones relativas frente a M. tuberculosis H37Rv se
muestran en la Figura 5. El tamaño de los insertos osciló entre 50 y
125 kb, y los clones recombinantes fueron estables. Comparada con
otras librerías de BAC a partir de bacilos de la tuberculosis (4,
13), la librería de BAC de M. microti OV254 contenía clones
que fueron generalmente mayores que los obtenidos previamente, lo
que facilitó el enfoque de genómica comparativa, descrito más
abajo.
Identificación de supresiones de ADN en M.
microti OV254 con relación a M. tuberculosis H37Rv
mediante genómica comparativa. El conjunto solapante mínimo de
50 clones de BAC, junto con la disponibilidad de otras tres
librerías de BAC ordenadas procedentes de M. tuberculosis
H37Rv, M. bovis BCG Pasteur 1173P2 (5, 13) y M. bovis
AF2122/97 (14) permitió llevar a cabo la comparación directa de BAC
a BAC de clones que abarcan las mismas regiones genómicas.
Diferencias de tamaño de fragmentos de restricción de HindIII
separados mediante PFGE a partir de los BAC de M. microti
OV254, con relación a los fragmentos de restricción de los clones
de BAC de M. bovis y/o M. tuberculosis, identificaron
loci que difirieron entre las cepas ensayadas. Fueron fácilmente
detectables variaciones de tamaños de al menos 2 kb, y se
identificaron 10 regiones suprimidas, distribuidas uniformemente
alrededor del genoma, y que contienen más de 60 marcos de lectura
abiertos (ORF). Estas regiones representan alrededor de 60 kb que
están ausentes de la cepa de OV254 de M. microti en
comparación con H37Rv de M. tuberculosis. En primer lugar, se
encontró que phiRv2 (RD11), uno de los dos profagos de M.
tuberculosis H37Rv, estaba presente en M. microti OV254,
mientras que phiRv1, también denominado como RD3 (29), estaba
ausente. En segundo lugar, se encontró que M. microti carece
de cuatro de las regiones genómicas que también estaban ausentes en
M. bovis BCG. De hecho, estas cuatro regiones de diferencia
denominadas RD7, RD8, RD9 y RD10 están ausentes de todos los
miembros del complejo de M. tuberculosis con la excepción de
M. tuberculosis y M. canettii, y parece que se han
perdido de una cepa progenitora común de M. africanum, M.
microti y M. bovis (3). Como tal, los resultados
obtenidos con las comparaciones individuales BAC a BAC muestran que
M. microti es parte de esta estirpe no M.
tuberculosis de los bacilos de la tuberculosis, y esta
suposición se confirmó adicionalmente secuenciando las regiones de
unión de RD7-RD10 en M. microti OV254. Las
secuencias obtenidas fueron idénticas a las de las cepas de M.
africanum, M. bovis y M. bovis BCG. Aparte de estas
cuatro regiones conservadas de diferencia, y phiRv1 (RD3), M.
microti OV254 no mostró ninguna otra RD con regiones de unión
idénticas a M. bovis BCG Pasteur, que pierde al menos 17 RD
con relación a M. tuberculosis H37Rv (1, 13, 35). Sin
embargo, se identificaron otras cinco regiones perdidas del genoma
de M. microti OV254 con relación a M. tuberculosis
H37Rv (RD1^{mic}, RD5^{mic}, MiD1, MiD2, MiD3). Tales regiones
son específicas para la cepa OV254 o para las cepas de M.
microti en general. De forma interesante, dos de estas regiones,
RD1^{mic}, RD5^{mic}, solapan parcialmente las RD de la M.
bovis BCG.
Los antígenos ESAT-6 y
CFP-10 están ausentes de M. microti . Uno
de los hallazgos más interesantes de la comparación de BAC a BAC
fue una nueva supresión en la región genómica próxima al origen de
replicación (figura 5). La PCR detallada y el análisis de
secuencias de esta región en M. microti OV254 mostró que
faltaba un segmento de 14 kb (equivalente a M. tuberculosis
H37Rv de 4340,4 a 4354,5 kb) que solapó parcialmente RD1^{bcg}
ausente de M. bovis BCG. De forma más precisa, los ORF Rv3864
y Rv3876 están truncados en M. microti OV254 y los ORF
Rv3865 a Rv3875 están ausentes (figura 6). Esta observación es
particularmente interesante ya que el análisis genómico comparativo
previo identificó RD1^{bcg} como la única región de RD que está
ausente específicamente de todas las subcepas de BCG, pero que está
presente en todos los otros miembros del complejo de M.
tuberculosis (1, 4, 13, 29, 35). Como se muestra en la Figura 6,
en M. microti OV254 la supresión de RD1^{mic} es
responsable de la pérdida de una gran porción de la región central
de la familia ESAT-6 conservada (40), incluyendo
los genes que codifican los antígenos de células T principales
ESAT-6 y CFP-10 (2, 15). El hecho de
que protocolos de identificación de supresión previos emplearan
secuencias de cebadores que se diseñaron para la porción de la mano
derecha de la región de RD1^{bcg} (es decir, gen Rv3878) (6, 39)
explica por qué la supresión de RD1^{mic} no se detectó antes
mediante estas investigaciones. La Figura 6 muestra que RD1^{mic}
no afecta a los genes Rv3877, Rv3878 y Rv3879 que son parte de la
supresión de RD1^{bcg}.
Supresión de los genes de fosfolipasa C en
M. microti OV254. RD5^{mic}, la otra región ausente de
M. microti OV254, que solapó parcialmente una región RD de
BCG, se reveló mediante comparación del clon de BAC Mi18A5 con BAC
Rv143 (figura 5). El análisis mediante PCR y la secuenciación de la
región de unión reveló que RD5^{mic} fue más pequeño que la
supresión de RD5 en BCG (Tabla 1 y 2 más abajo).
De hecho, M. microti OV254 carece de los
genes plcA, plcB, plcC y de dos genes codificantes de la
proteína PPE-específicos (Rv2352, Rv2353). Esto se
confirmó por la ausencia de una banda clara en una transferencia
Southern de ADN genómico digerido mediante AseI a partir de
M. microti OV254 hibridado con una sonda de plcA. Sin
embargo, los genes Rv2346c y Rv2347c, miembros de la familia de
esat-6, y Rv2348c, que faltan en las cepas
de M. bovis y BCG (3) todavía están presentes en M.
microti OV254. La presencia de un elemento IS6110 en
este segmento sugiere que la recombinación entre dos elementos
IS6110 podría haber estado implicada en la pérdida de
RD5^{mic}, y esto está apoyado por el hallazgo de que la copia que
queda de IS6110 no muestra una repetición directa de 3 pares
de bases en la cepa OV254 (Tabla 2).
La falta de MiD1 proporciona una pista
genómica para el espoligotipo característico de M. microti
OV254. MiD1 comprende los tres ORF Rv2816, Rv2817 y Rv2818 que
codifican proteínas putativas cuyas funciones todavía no se
conocen, y ha aparecido en la región de repetición directa (DR), un
locus polimórfico en los genomas de los bacilos de la tuberculosis
que contiene un racimo de repeticiones directas de 36 pb, separadas
por secuencias espaciadoras únicas de 36 a 41 pb (17), (figura 7).
La presencia o ausencia de 43 secuencias espaciadoras únicas que
intercalan las secuencias de DR es la base del oligotipado del
espaciador, un método de tipaje poderoso para cepas procedentes del
complejo de M. tuberculosis (23). Los aislados de M.
microti muestran un espoligotipo característico con un racimo
de DR inusualmente pequeño, debido a la presencia de sólo
espaciadores 37 y 38 (43). En M. microti OV254, la ausencia
de los espaciadores 1 a 36, que están presentes en muchas otras
cepas del complejo de M. tuberculosis, parece resultar de una
supresión de 636 pb de la región de DR mediada por IS6110.
La amplificación y el análisis de restricción mediante PvuII
de un fragmento de 2,8 kb obtenido con cebadores localizados en los
genes que flanquean la región DR (Rv2813c y Rv2819) mostró que sólo
hay una copia de IS6110 que queda en esta región (figura 7).
Este elemento IS6110 se inserta en el ORF Rv2819 en la
posición 3.119.932 con relación al genoma de M. tuberculosis
H37Rv. Al igual que para otros elementos de IS6110 que
resultan de la recombinación homóloga entre dos copias (7), no se
encontraron repeticiones directas de 3 pares de bases para esta
copia de IS6110 en la región DR. Con respecto a la ausencia
de los espaciadores 39-43 (figura 7), se encontró
que M. microti mostró una organización de este locus
ligeramente diferente que las cepas de M. bovis, que también
carecen característicamente de los espaciadores
39-43. En M. microti OV254, se encontró un
espaciador extra de 36 pb que no estaba presente en M. bovis
ni en M. tuberculosis H37Rv. La secuencia de este espaciador
específico fue idéntica a la del espaciador 58 dado a conocer por
van Embden y colegas (42). En su estudio de la región DR en muchas
cepas procedentes del complejo de M. tuberculosis, este
espaciador se encontró sólo en la cepa NLA000016240 de M.
microti (AF189828) y en algunas cepas de M. tuberculosis
ancestrales (3, 42). Al igual que MiD1, muy probablemente MiD2
resulta de una supresión de dos genes (Rv3188, Rv3189) que codifican
proteínas putativas cuya función es desconocida (Tabla 2 más arriba
y Tabla 3 a continuación).
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Ausencia de algunos miembros de la familia
PPE en M. microti . MiD3 se identificó mediante la
ausencia de dos sitios HindIII en BAC Mi4B9 que existen en
las posiciones 3749 kb y 3754 kb en el cromosoma de M.
tuberculosis H37Rv. Mediante PCR y análisis de secuencias, se
determinó que MiD3 corresponde a una supresión de 12 kb que ha
truncado o eliminado cinco genes ortólogos a
Rv3345c-Rv3349c. Rv3347c codifica una proteína de
3157 aminoácidos que pertenece a la familia PPE, y Rv3346c codifica
una proteína conservada que también está presente en M.
leprae. La función de estas dos proteínas putativas es
desconocida, mientras que Rv3348 y Rv3349 son parte de un elemento
de inserción (Tabla 1). Actualmente, las consecuencias de las
supresiones de MiD3 para la biología de M. microti sigue
siendo totalmente desconocida.
ADN extra en M. microti OV254 con
relación a M. tuberculosis H37Rv. M. microti OV254 posee
las seis regiones RvD1 a RvD5 y TBDI que están ausentes de la cepa
secuenciada M. tuberculosis H37Rv, pero que se ha demostrado
que están presentes en otros miembros del complejo de M.
tuberculosis como M. canettii, M. africanum, M. bovis, y
M. bovis BCG (3, 7, 13). En M. tuberculosis H37Rv,
cuatro de estas regiones (RvD2-5) contienen una
copia de IS6110 que no está flanqueada por una repetición
directa, sugiriendo que la recombinación de dos elementos de
IS6110 estaba implicada en la supresión de las regiones
genómicas que intervienen (7). En consecuencia, parece plausible
que estas regiones se suprimieron del genoma de M.
tuberculosis H37Rv en vez de ser adquiridas específicamente por
M. microti. Además, también se han encontrado otras tres
pequeñas inserciones, y son debidas a la presencia de un elemento
IS6110 en una localización diferente de aquella en M.
tuberculosis H37Rv y M. bovis AF2122/97. De hecho, el
análisis de RFLP mediante PvuII de M. microti OV254
revela 13 elementos IS6110 (datos no mostrados).
Diversidad genómica de las cepas de M.
microti . A fin de obtener una foto más global de la
organización genética del taxón M. microti, se evaluó la
presencia o ausencia de las regiones variables encontradas en la
cepa OV254 en otras ocho cepas de M. microti. Estas cepas que
se aislaron de seres humanos y topillos se han designado como M.
microti principalmente en base a su espoligotipo específico (26,
32, 43), y se pueden dividir adicionalmente en subgrupos según el
hospedante, tales como topillos, llama y seres humanos (Tabla 3).
Como se señala en la introducción, M. microti se encuentra
raramente en seres humanos, a diferencia de M. tuberculosis.
Así, la disponibilidad de 9 cepas procedentes de fuentes variables
para la caracterización genética es una fuente excepcional. Entre
ellas estaba una cepa (Myc 94-2272) procedente de un
individuo gravemente inmunocomprometido (43), y cuatro cepas se
aislaron de seres humanos positivos a VIH o negativos a VIH con
espoligotipos típicos de aislados de llama y de ratón. Para una
cepa, ATCC 35872/M.P. Praga, no se pudo identificar con certeza el
hospedante original a partir del cual se aisló la cepa, ni si esta
cepa corresponde a M. microti OV166, que se recibió por Dr.
Sula de Dr. Wells y se usó después para el programa de vacunación en
Praga en los años 1960 (38).
En primer lugar, interesaba saber si estas nueve
cepas designadas como M. microti en base a sus espoligotipos
también se asemejan entre sí por otros criterios de tipaje
molecular. Puesto que RFLP de AND cromosómico separado mediante el
gel en campo pulsado representa probablemente la estrategia de
tipaje molecular más exacta para aislados bacterianos, se
determinaron los perfiles de AseI de las cepas de M.
microti disponibles, y se encontró que los perfiles se
asemejaban entre sí estrechamente pero diferían significativamente
de los patrones de macrorrestricción de las cepas de M.
tuberculosis, M. bovis y M bovis BCG usadas como
controles. Sin embargo, como se representa en la Figura 8A, los
patrones no fueron idénticos entre sí, y cada cepa de M.
microti mostró diferencias sutiles, sugiriendo que no estaban
epidemiológicamente relacionadas. Se hizo una observación similar
con otras enzimas de restricción de corte raras, como DraI o
XbaI (datos no mostrados).
Características comunes y divergentes de las
cepas de M. microti . Se usaron dos estrategias para
ensayar la presencia o ausencia de regiones variables en estas
cepas para las cuales no se tienen librerías BAC ordenadas. En
primer lugar, se emplearon PCR usando cebadores internos y de
flanqueo de las regiones variables, y se amplificaron los productos
de amplificación de las regiones de unión. En segundo lugar, se
obtuvieron sondas procedentes de la porción interna de las regiones
variables ausentes de M. microti OV254 mediante amplificación
de ADN de M. tuberculosis H37Rv usando cebadores
específicos. La hibridación con estas sondas radiomarcadas se llevó
a cabo sobre transferencias procedentes de digestiones de
restricción mediante AseI separadas mediante PFGE de las
cepas de M. microti. Además, se confirmaron los hallazgos
obtenidos mediante estas dos técnicas usando un macrochip enfocado,
que contiene alguno de los genes identificados hasta la fecha en
regiones variables de los bacilos de la tuberculosis (datos no
mostrados).
Esto condujo al hallazgo de que la supresión
de RD1^{mic} es específica para todas las cepas de M.
microti ensayadas.
De hecho, ninguna de las digestiones de ADN de
M. microti se hibridó con la sonda de
esat-6 radiomarcada (Fig. 8B), sino con la
región de flanqueo de RD1^{mic} (Fig. 8C). Además, la
amplificación mediante PCR usando cebadores que flanquean la región
de RD1^{mic} (Tabla 2) produjo fragmentos del mismo tamaño para
cepas de M. microti, mientras que no se obtuvieron productos
para las cepas de M. tuberculosis, M. bovis y M.
bovis BCG (Fig. 9). Además, la secuencia de la región de unión
se encontró idéntica entre las cepas, lo que confirma que la
organización genómica del locus de RD1^{mic} fue la misma en todas
las cepas de M. microti ensayadas (Tabla 3). Esto demuestra
claramente que M. microti carece de la región central de la
familia ESAT-6 conservada que abarcan en otros
miembros del complejo de M. tuberculosis desde Rv3864 a
Rv3876 y, como tal, representa un taxón de mutantes de supresión de
ESAT-6/CFP-10 de origen natural.
Al igual que RD1^{mic}, se encontró que MiD3
estaba ausente en las nueve cepas de M. microti ensayadas, y
por lo tanto parece que es un marcador genético específico que está
restringido en las cepas de M. microti (Tabla 3). Sin
embargo, la amplificación mediante PCR mostró que RD5^{mic} está
ausente sólo en los aislados OV254, OV216 y OV183 de topillos, pero
está presente en las cepas de M. microti aisladas de ser
humano y de otros orígenes (Tabla 3). Esto se confirmó por la
presencia de bandas individuales pero de tamaños diferentes en una
transferencia Southern hibridada con una sonda plcA para
todas las cepas de M. microti ensayadas, excepto OV254 (Fig.
8D). De forma interesante, la presencia o ausencia de RD5^{mic} se
correlaciona con la similitud de los perfiles de RFLP de IS6110.
Los perfiles de las tres cepas de M. microti aisladas de
topillos en Reino Unido difirieron considerablemente de los patrones
de RFLP de IS6110 de aislados humanos (43). Tomados en
conjunto, estos resultados subrayan la implicación propuesta de la
supresión mediada por IS6110 de la región RD5, y sugieren
además que RD5 puede estar implicada en el potencial variable de
las cepas de M. microti para provocar una enfermedad en seres
humanos. De forma similar, se encontró que MiD1 estaba ausente sólo
de los aislados OV254, OV216 y OV183 de topillos, que presentan el
mismo espoligotipo (43), confirmando las observaciones de que MiD1
confiere el espoligotipo particular de un grupo de cepas de M.
microti aisladas de topillo. Por el contrario, el análisis
mediante PCR reveló que MiD1 está sólo parcialmente suprimido de
las cepas B3 y B4 caracterizadas ambas por el espoligotipo de ratón
y el aislado humano M. microti Myc 94-2272
(Tabla 3). Para la cepa ATCC 35782, no se observó la supresión de la
región de MiD1. Estos hallazgos se correlacionan con los
espoligotipos descritos de los diferentes estados, puesto que las
cepas que tuvieron regiones MiD1 intactas o parcialmente suprimidas
tuvieron más espaciadores presentes que los aislados de topillos que
sólo mostraron los espaciadores 37 y 38.
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Se han buscado variaciones genómicas
importantes, debidas a sucesos de
inserción-supresión, entre el patógeno del topillo,
M. microti, y el patógeno del ser humano, M.
tuberculosis. La genómica comparativa a base de BAC condujo a
la identificación de 10 regiones ausentes del genoma del bacilo del
topillo M. microti OV254 y varias inserciones debidas a
IS6110. Siete de estas regiones de supresión también estaban
ausentes de otras ocho cepas de M. microti, aisladas de
topillos o de seres humanos, y dan cuenta de más de 60 kb de ADN
genómico. De estas regiones, RD1^{mic} es de particular interés,
debido a que se ha encontrado que la ausencia de parte de esta
región está restringida hasta la fecha a las cepas de la vacuna de
BCG. Puesto que M. microti se describió originalmente como
no patógena para seres humanos, se propone aquí que los genes de
RD1 están implicados en la patogenicidad para seres humanos. Esto
está reforzado por el hecho de que RD1^{bcg} (29) tiene ORF
putativos perdidos que pertenecen al racimo de genes de
esat-6, incluyendo los genes que codifican
ESAT-6 y CFP-10 (Fig. 6) (40). Se ha
demostrado que ambos polipéptidos actúan como estimuladores
potentes del sistema inmunitario y son antígenos reconocidos durante
las etapas tempranas de infección (8, 12, 20, 34). Además, la
importancia biológica de esta región RD1 para micobacterias está
subrayada por el hecho de que también está conservada en M.
leprae, en la que los genes ML0047-ML0056
muestran similitudes elevadas en su secuencia y organización de
operones frente a los genes en la región central de
esat-6 de los bacilos de la tuberculosis
(11). A pesar del decaimiento génico radical observado en M.
leprae, el operón de esat-6 aparentemente
ha conservado su funcionalidad en este organismo.
Sin embargo, la supresión de RD1 puede no ser la
única razón por la que el bacilo del topillo está atenuado para
seres humanos. De hecho, sigue no estando claro por qué ciertas
cepas de M. microti incluidas en el presente estudio, que
muestran exactamente la misma supresión de RD1^{mic} que los
aislados de topillos, se han encontrado como agentes causales de la
tuberculosis humana. Puesto que los casos de M. microti
humanos son extremadamente raros, la explicación más plausible para
este fenómeno sería que las personas infectadas fuesen
particularmente susceptibles a las infecciones micobacterianas en
general. Esto podría haber sido debido a una inmunodeficiencia (32,
43) o una predisposición genética rara del hospedante tal como
modificación del receptor de interferón gamma o de
IL-12 (22).
Además, el hallazgo de que los aislados de M.
microti humanos difirieron de los aislados de topillos por la
presencia de la región RD5^{mic} también puede tener un impacto
sobre el potencial incrementado de los aislados de M.
microti humanos para provocar la enfermedad. De forma
intrigante, BCG y el bacilo de los topillos carecen de porciones
solapantes de esta región cromosómica que engloba tres (plcA,
plcB, plcC) de los cuatro genes que codifican fosfolipasa C
(PLC) en M. tuberculosis. La PLC se ha reconocido como un
factor de virulencia importante en numerosas bacterias, incluyendo
Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes y
Pseudomonas aeruginosa, en las que desempeña un papel en la
extensión célula a célula de bacterias, supervivencia intracelular,
y citolisis (36, 41). Hasta la fecha, el papel exacto de PLC para
los bacilos de la tuberculosis sigue siendo incierto. plcA
codifica el antígeno mtp40 que se ha demostrado previamente que
está ausente de siete aislados de topillo e hyrax ensayados (28). Se
ha dado a conocer (21, 47) la actividad de fosfolipasa C en M.
tuberculosis, M. microti y M. bovis, pero no en M.
bovis BCG. Sin embargo, las actividades de PLC y
esfingomielinasa se han encontrado asociadas con las especies
micobacterianas más virulentas (21). Los niveles de actividad de
fosfolipasa C detectados en M. bovis fueron mucho menores
que aquellos observados en M. tuberculosis, consistente con
la pérdida de plcABC. Es probable que plcD sea
responsable de la actividad de fosfolipasa C residual en cepas que
carecen de RD5, tal como M. bovis y M. microti OV254.
De hecho, el gen de plcD está localizado en la región RvD2
que está presente en algunos pero no en todos los bacilos de la
tuberculosis (13, 18). Los genes que codifican la fosfolipasa se
han reconocido como puntos calientes para la integración de
IS6110 y parece que las regiones RD5 y RvD2 sufren procesos
de supresión independientes más frecuentemente que cualquier otra
región genómica (44). De este modo, la virulencia de algunas cepas
de M. microti puede ser debida a una combinación de genes que
codifican fosfolipasa C funcionales (7, 25, 26, 29).
Otro detalle intrigante revelado por este
estudio es que entre los genes suprimidos siete codifican miembros
de la familia PPE de proteínas ricas en Gly, Ala, Asn. Un vistazo
más concienzudo de las secuencias de estos genes mostró que en
algunos casos fueron proteínas pequeñas con secuencias únicas, como
por ejemplo Rv3873, localizada en la región de RD1^{mic}, o
Rv2352c y Rv2353c localizadas en la región de RD5^{mic}. Otras,
como Rv3347c, localizadas en la región de MiD3, codifican una
proteína PPE mucho más grande (3157 aa). En este caso, un gen
vecino (Rv3345c), que pertenece a otra familia multigénica, la
familia PE-PGRS, se vio parcialmente afectado por
la supresión de MiD3. Mientras que la función de las proteínas
PE/PPE actualmente es desconocida, su abundancia predicha en el
proteoma de M. tuberculosis sugiere que pueden desempeñar un
papel importante en el ciclo vital de los bacilos de la
tuberculosis. De hecho, recientemente se demostró que algunas de
ellas estaban implicadas en la patogenicidad de las cepas de M.
tuberculosis (9). La complementación de tales regiones
genómicas en M. microti OV254 debería permitirnos llevar a
cabo estudios proteómicos y de virulencia en animales a fin de
comprender el papel de tales ORF en la patogénesis.
En conclusión, este estudio ha demostrado que
M. microti, un taxón originalmente nombrado después de su
hospedante principal Microtus agrestis, el topillo común,
representa un grupo relativamente homogéneo de bacilos de la
tuberculosis. Aunque todas las cepas ensayadas mostraron patrones de
macrorrestricción de PFGE únicos que difirieron ligeramente entre
sí, se han identificado supresiones que fueron comunes para todos
los aislados de M. microti (RD7-RD10, MiD3,
RD1^{mic}). La naturaleza conservada de estas supresiones sugiere
que estas cepas derivan de un precursor común que ha perdido estas
regiones, y su pérdida puede dar cuenta de algunas de las
propiedades fenotípicas comunes observadas de M. microti,
como el crecimiento muy lento sobre medios sólidos y la formación
de colonias minúsculas. Este hallazgo es consistente con los
resultados de un estudio reciente que mostró que las cepas de M.
microti poseen una mutación particular en el gen gyrB
(31).
De particular interés, algunos de estos rasgos
comunes (por ejemplo las regiones de flanqueo de RD1^{mic}, o
MiD3) se podrían explotar para un ensayo de identificación mediante
PCR de fácil realización, similar al propuesto para un intervalo de
bacilos de la tuberculosis (33). Este ensayo permite la
identificación unívoca y rápida de aislados de M. microti a
fin de obtener una mejor estimación de la tasa global de infecciones
por M. microti en seres humanos y en otras especies de
mamíferos.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Behr, M. A., M. A. Wilson, W.
P. Gill, H. Salamon, G. K. Schoolnik, S.
Rane, y P. M. Small. 1999. Comparative genomics
of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray.
Science 284: 1520-1523.
\newpage
2. Berthet, F.-X., P. B. Rasmusse,
I. Rosenkrands, P. Andersen, y B. Gicquel.
1998. A Mycobacterium tuberculosis operon encoding
ESAT-6 and a novel
low-molecular-mass culture filtrate
protein (CFP-10). Microbiology 144:
3195-3203.
3. Brosch, R., S. V. Gordon, M.
Marmiesse, P. Brodin, C. Buchrieser, K.
Eiglmeier, T. Garnier, C. Gutierrez, G.
Hewinson, K. Kremer, L. M. Parsons, A. S.
Pym, S. Samper, D. van Soolingen, y S. T.
Cole. 2002. A new evolutionary scenario for the
Mycobacterium tuberculosis complex. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 99: 3684-3689.
4. Brosch, R., S. V. Gordon, A.
Billault, T. Garnier, K. Eiglmeier, C.
Soravito, B. G. Barrell, y S. T. Cole.
1998. Use of a Mycobacterium tuberculosis H37Rv
bacterial artificial chromosome library for genome mapping,
sequencing, and comparative genomics. Infect. Immun.
66: 2221-2229.
5. Brosch, R., S. V. Gordon, C.
Buchrieser, A. S. Pym, T. Garnier, y S. T.
Cole. 2000. Comparative genomics uncovers large tandem
chromosomal duplications in Mycobacterium bovis BCG Pasteur.
Comp. Funct. Genom. (Yeast) 17:
111-123.
6. Brosch, R., S. V. Gordon, A.
Pym, K. Eiglmeier, T. Garnier, y S. T.
Cole. 2000. Comparative genomics of the mycobacteria.
Int. J. Med. Microbiol. 290:
143-152.
7. Brosch, R., W. J. Philipp, E.
Stavropoulos, M. J. Colston, S. T. Cole, y S.
V. Gordon. 1999. Genomic analysis reveals variation
between Mycobacterium tuberculosis H37Rv and the attenuated
M. tuberculosis H37Ra strain. Infect. Immun.
67: 5768-5774.
8. Brusasca, P. N., R. Colangeli,
K. P. Lyashchenko, X. Zhao, M. Vogelstein, J.
S. Spencer, D. N. McMurray, y M. L. Gennaro.
2001. Immunological characterization of antigens encoded by
the RD1 region of the Mycobacterium tuberculosis genome.
Scand. J. Immunol. 54: 448-452.
9. Camacho, L. R., D. Ensergueix,
E. Perez, B. Gicquel, y C. Guilhot.
1999. Identification of a virulence gene cluster of
Mycobacterium tuberculosis by
signature-tagged transposon mutagenesis. Mol.
Microbiol. 34: 257-267.
10. Cole, S. T., R. Brosch, J.
Parkhill, T. Garnier, C. Churcher, D.
Harris, S. V. Gordon, K. Eiglmeier, S. Gas,
Barry C E, III, F. Tekaia, K. Badcock, D.
Basham, D. Brown, T. Chillingworth, R.
Connor, R. Davies, K. Devlin, T.
Feltvvell, S. Gentles, N. Hamlin, S.
Holroyd, T. Hornsby, K. Jagels, A.
Krogh, J. McLeah, S. Moule, L. Murphy,
K. Oliver, J. Osborne, M. A. Quail, M. A.
Rajandream, J. Rogers, S. Rutter, K.
Soeger, J. Skelton, R. Squares, S.
Squares, J. E. Sulston, K. Taylor, S.
Whitehead, y B. G. Barrell. 1998. Deciphering
the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete
genome sequence. Nature 393:
537-544.
11. Cole, S. T., K. Eiglmeier, J.
Parkhill, K. D. James, N. R. Thomson, P. R.
Wheeler, N. Honore, T. Garnier, C.
Churcher, D. Harris, K. Mungall, D.
Basham, D. Brown, T. Chillingworth, R.
Connor, R. M. Davies, K. Devlin, S.
Duthoy, T. Feltwell, A. Fraser, N.
Hamlin, S. Holroyd, T. Hornsby, K.
Jagels, C. Lacroix, J. Maclean, S.
Moule, L. Murphy, K. Oliver, M. A.
Quail, M. A. Rajandream, K. M. Rutherford, S.
Rutter, K. Seeger, S. Simon, M.
Simmonds, J. Skelton, R. Squares, S.
Squares, K. Stevens, K. Taylor, S.
Whitehead, J. R. Woodward, y B. G. Barrell.
2001. Massive gene decay in the leprosy bacillus.
Nature 409: 1007-1011.
12. Elhay, M. J., T. Oettinger, y
P. Andersen. 1998. Delayed-type
hypersensitivity responses to ESAT-6 and MPT64 from
Mycobacterium tuberculosis in the guinea pig. Infect.
Immun. 66: 3454-3456.
13. Gordon, S. V., R. Brosch, A.
Billault, T. Garnier, K. Eiglmeier, y S. T.
Cole. 1999. Identification of variable regions in the
genomes of tubercle bacilli using bacterial artificial chromosome
arrays. Mol. Microbiol. 32:
643-655.
14. Gordon, S. V., K. Eiglmeier,
T. Garnier, R. Brosch, J. Parkhill, B.
Barrell, S. T. Cole, y R. G. Hewinson.
2001. Genomics of Mycobacterium bovis. Tuberculosis
(Edinb) 81: 157-163.
15. Harboe, M., A. S. Malin, H. S.
Dockrell, H. G. Wiker, G. Ulvund, A.
Holm, M. C. Jorgensen, y P. Andersen.
1998. B-cell epitopes and quantification of
the ESAT-6 protein of Mycobacterium tuberculosis.
Infect. Immun. 66: 717-723.
16. Hart, P. D. a., y I.
Sutherland. 1977. BCG and vole bacillus vaccines in
the prevention of tuberculosis in adolescence and early adult life.
British Medical Journal 2:
293-295.
17. Hermans, P. W. M., D. Van
Soolingen, E. M. Bik, P. E. W. De Haas, J. W.
Dale, y J. D. A. van Embden. 1991. Insertion
element IS987 from Mycobacterium bovis BCG is located
in a hot-spot integration region for insertion
elements in Mycobacterium tuberculosis complex strains.
Infect. Immun. 59: 2695-2705.
18. Ho, T. B., B. D. Robertson, G.
M. Taylor, R. J. Shaw, y D. B. Young.
2000. Comparison of Mycobacterium tuberculosis genomes
reveals frequent deletions in a 20 kb variable region in clinical
isolates. Comp. Funct. Genom. (Yeast) 17:
272-282.
19. Horstkotte, M. A., I.
Sobottka, K. Schewe Carl, P. Schaefer, R.
Laufs, S. Ruesch-Gerdes, y S.
Niemann. 2001. Mycobacterium microti
llama-type infection presenting as pulmonary
tuberculosis in a human immunodeficiency
virus-positive patient. J. Clin. Microbiol.
39: 406-407.
20. Horwitz, M. A., B. W. Lee, B.
J. Dillon, y G. Harth. 1995. Protective
immunity against tuberculosis induced by vaccination with major
extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92: 1530-1534.
21. Johansen, K. A., R. E. Gill, y
M. L. Vasin. 1996. Biochemical and molecular analysis
of phospholipase C and phospholipase D activity in mycobacteria.
Infect. Immun. 64: 3259-3266.
22. Jouanguy, E., R. Doffinger, S.
Dupuis, A. Pallier, F. Altare, y J. L.
Casanova. 1999. IL-12 and
IFN-gamma in host defense against mycobacteria and
salmonella in mice and men. Curr. Opin. Immunol. 11:
346-351.
23. Kamerbeek, J., L. Schouls, A.
Kolk, M. Van Agterveld, D. Van Soolingen, S.
Kuijper, A. Bunschoten, H. Molhuizen, R.
Shaw, M. Goyal, y J. Van Embden. 1997.
Simultaneous detection and strain differentiation of
Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology.
J. Clin. Microbiol. 35: 907-914.
24. Kato-Maeda, M., J. T.
Rhee, T. R. Gingeras, H. Salamon, J.
Drenkow, N. Smittipat, y P. M. Small.
2001. Comparing genomes within the species Mycobacterium
tuberculosis. Genome Res. 11:
547-554.
25. Kremer, K, van Soolingen, D.,
van Embden, J., Hughes, S., Inwald, J., y G.
Hewinson. 1998. Mycobacterium microti: more
widespread than previously thought. J. Clin. Microbiol.
36: 2793-2794.
26. Kremer, K., D. van Soolingen,
R. Frothingham, W. H. Haas, P. W. Hermans, C.
Martin, P. Palittapongarnpim, B. B. Plikaytis,
L. W. Riley, M. A. Yakrus, J. M. Musser, y J.
D. van Embden. 1999. Comparison of methods based on
different molecular epidemiological markers for typing of
Mycobacterium tuberculosis complex strains: interlaboratory
study of discriminatory power and reproducibility. J. Clin.
Microbiol. 37: 2607-2618.
27. Levy Frebault, V., y F.
Portaels. 1992. Proposed minimal standards for the
genus Mycobacterium and for description of new slowly growing
Mycobacterium spp. Int. J. Syst. Bact. 42:
315-323.
28. Liebana, E., A. Aranaz, B.
Francis, y D. Cousins. 1996. Assessment of
genetic rnarkers for species differentiation within the
Mycobacterium tuberculosis complex. J. Clin.
Microbiol. 34: 933-938.
29. Mahairas, G. G., P. J. Sabo,
M. J. Hickey, D. C. Singh, y C. K. Stover.
1996. Molecular analysis of genetic differences between
Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis. J.
Bact. 178: 1274-1282.
30. Manabe, Y. C., Scott, C. P., y
W. R. Bishai. 2002 Naturally attenuated, orally
administered Mycobacterium microti as a tuberculosis vaccine
is better than subcutaneous Mycobacterium bovis BCG.
Infect Immun. 70: 1566-1570.
31. Niemann, S., Harmsen, D.,
Rusch-Gerdes, S., y E. Richter.
2000. Differentiation of clinical Mycobacterium
tuberculosis complex isolates by gyrB DNA sequence
polymorphism analysis. J. Clin. Microbiol. 38:
3231-3234.
32. Niemann, S., E. Richter, H.
Daluegge-Tamm, H. Schlesinger, D.
Graupner, B. Koenigstein, G. Gurath, U.
Greinert, y S. Ruesch-Gerdes.
2000. Two cases of Mycobacterium microti-derived
tuberculosis in HIV-negative immunocompetent
patients. Emerg. Infect. Dis. 6:
539-542.
33. Parsons, L. M., Brosch, R.,
Cole, S. T., Somoskovi, A., Loder, A.,
Britzel, G., van Soolingen, D., Hale, Y.,
Salfinger, M. 2002. Rapid and
easy-to-perform identification of
Mycobacterium tuberculosis complex isolates using
PCR-based genomic deletion analysis. J. Clin.
Microbiol. presentado, y descripción de la Solicitud de Patente
Europea Nº 02 290 458.2 presentada el 25 de febrero de 2002
(Instituto Pasteur).
34. Rosenkrands, I., P. B.
Rasmussen, M. Carnio, S. Jacobsen, M.
Theisen, y P. Andersen. 1998. Identification
and characterization of a 29-kilodalton protein from
Mycobacterium tuberculosis culture filtrate recognized by
mouse memory effector cells. Infect. Immun. 66:
2728-2735.
35. Salamon, H., M.
Kato-Maeda, P. M. Small, J.
Drenkow, y T. R. Gingeras. 2000. Detection of
deleted genomic DNA using a semiautomated computational analysis of
GeneChip data. Genome Res. 10:
2044-2054.
36. Songer, J. G., 1997. Bacterial
phospholipases and their role in virulence. Trends Microbiol.
5: 156-161.
37. Staden, R. 1996. The Staden
sequence analysis package. Mol. Biotechnol. 5:
233-241.
38. Sula, L., y I. Radkovsky.
1976. Protective effects of M. microti vaccine against
tuberculosis. J. Hyg. Epid. Microbiol. hnmunol. 20:
1-6.
39. Talbot, E. A., D. L. Williams,
y R. Frothingham. 1997. PCR identification of
Mycobacterium bovis BCG. J. Clin. Microbiol.
35: 566-569.
40. Tekaia, F., S. V. Gordon, T.
Garnier, R. Brosch, B. G. Barrell, y S. T.
Cole. 1999. Analysis of the proteome of
Mycobacterium tuberculosis in silico. Tubercle & Lung
Disease 79: 329-342.
41. Titball, R. W. 1998. Bacterial
phospholipases. Soc. Appl. Bacteriol. Symp. Ser. 27:
127-137.
42. Van Embden, J. D., T. van
Gorkom, K. Kremer, R. Jansen, B. A. van Der
Zeie, y L. M. Schouls. 2000. Genetic variation
and evolutionary origin of the direct repeat locus of
Mycobacterium tuberculosis complex bacteria. J.
Bacteriol. 182: 2393-2401.
43. Van Soolingen, D., A. G. M. Van Der
Zanden, P. E. W. De Haas, G. T. Noordhoek, A.
Kiers, N. A. Foudraine, F. Portaels, A. H. J.
Kolk, K. Kremer, y J. D. A. Van Embden.
1998. Diagnosis of Mycobacterium microti infections
among humans by using novel genetic markers. J. Clin.
Microbiol. 36: 1840-1845.
44. Vera-Cabrera, L., M.
A. Hernandez-Vera, O. Welsh, W. M.
Johnson, y J. Castro-Garza.
2001. Phospholipase region of Mycobacterium
tuberculosis is a preferential locus for IS6110
transposition. J. Clin. Microbiol. 39:
3499-3504.
45. Wells, A. Q. 1937.
Tuberculosis in wild voles. Lancet 1221.
46. Wells, A. Q. 1946. The murine
type of tubercle bacillus. Medical Research council special report
series 259: 1-42.
47. Wheeler, P. R., y C. Ratledge.
1992. Control and location of
acyl-hydrolysing phospholipase activity in
pathogenic mycobacteria. J. Gen. Microbiol. 138:
825-830.
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Claims (4)
1. Cepa de M. bovis BCG::RD1 que tiene
integrado el fragmento RD1-2F9 (\sim32 kb) según
se clona en el cósmido aquí denominado como RD1-2F9
contenido en la cepa de E. coli depositada en el CNCM con el
número de acceso 1-2831.
2. Uso de un cósmido denominado en el presente
documento RD1-2F9 contenido en la cepa de E.
coli depositado en el CNCM con el número de acceso
1-2831 para transformar M. bovis BCG.
3. Composición farmacéutica que comprende una
cepa según la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
4. Composición farmacéutica según la
reivindicación 3, que contiene vehículos adecuados farmacéuticamente
aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el
procesamiento de la vacuna viva en preparaciones que se pueden usar
farmacéuticamente.
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| TR201101874A2 (tr) * | 2011-02-25 | 2011-08-22 | Leyla A�An Nac�Ye | Yüzeyel mesane tümorü tedavisinde kullanılabilecek mycobacterıum(mikobakteri) brumae hücre duvarı ekstreleri. |
| GR20120100415A (el) * | 2012-08-08 | 2014-03-17 | Νικολαος Χρηστου Πουλακης | Μεθοδος αμεσης ανιχνευσης του μυκοβακτηριδιου της φυματιωσης |
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Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6096879A (en) | 1978-12-18 | 2000-08-01 | Institut Pasteur | Nucleotide sequence comprising the genome of hepatitis B virus, nucleotide sequence coding the surface antigen of the hepatitis B virus, vectors containing the nucleotide sequences, process for the preparation thereof, and antigen obtained thereby |
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| EP0387915B1 (en) | 1984-10-18 | 1993-03-10 | Institut Pasteur | F antigens of the human immunodeficiency virus, and their applications |
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| FR2735478B1 (fr) | 1995-06-13 | 1997-08-22 | Pasteur Institut | Molecules polypeptidiques de stade pre-erythrocytaire du paludisme |
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| EP1003870A1 (en) * | 1997-07-16 | 2000-05-31 | Institut Pasteur | A polynucleotide functionally coding for the lhp protein from mycobacterium tuberculosis, its biologically active derivative fragments, as well as methods using the same |
| WO1999045119A2 (en) * | 1998-03-06 | 1999-09-10 | Statens Serum Institut | Production of mycobacterial polypeptides by lactic acid bacteria |
| US6294328B1 (en) * | 1998-06-24 | 2001-09-25 | The Institute For Genomic Research | DNA sequences for strain analysis in Mycobacterium tuberculosis |
| EP2087906A1 (en) * | 1999-05-04 | 2009-08-12 | The University of Medicine and Dentistry of New Jersey | Proteins expressed by Mycobacterium tuberculosis and not by BCG and their use as diagnostic reagents and vaccines |
| DE60219589T2 (de) | 2002-02-25 | 2008-02-14 | Institut Pasteur | Spezifisch vom Genom von Mycobacterium tuberculosis deletierte Sequenzen und deren Verwendung in der Diagnostik und als Vakzine |
-
2002
- 2002-04-05 AT AT07122295T patent/ATE535600T1/de active
- 2002-04-05 DK DK02290864.4T patent/DK1350839T3/da active
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