ES2346064T3 - Vacuna subunidad de lawsonia intracellularis. - Google Patents
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Abstract
Un ácido nucleico que codifica una proteína de Lawsonia intracellularis de 75 kD o una porción de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicho ácido nucleico o dicha porción del mismo una homología de al menos 90% con un ácido nucleico que tiene una secuencia como se representa en el SEQ ID NO: 1.
Description
Vacuna subunidad de Lawsonia
intracellularis.
La presente invención se refiere entre otros a
ácidos nucleicos que codifican proteínas de Lawsonia
intracellularis novedosas, a fragmentos de ADN, a moléculas de
ADN recombinante y a portadores recombinantes vivos que comprenden
estas secuencias, a células anfitrionas que comprenden tales ácidos
nucleicos, fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante y
portadores recombinantes vivos, a proteínas codificadas por estas
secuencias de nucleótidos y a su uso para la fabricación de
vacunas, a vacunas para combatir las infecciones por Lawsonia
intracellularis y a los métodos para su preparación y a ensayos
de diagnóstico para la detección de antígenos de Lawsonia
intracellularis y para la detección de anticuerpos contra
Lawsonia intracellularis.
La enteropatía proliferativa porcina (EPP o EP)
se ha convertido en una importante enfermedad de la industria
porcina moderna en todo el mundo. La enfermedad afecta del 15% al
50% de las piaras en desarrollo y hasta el 30% de los animales
individuales en piaras establecidas con problemas. Actualmente las
pérdidas económicas anuales se han estimado en 5-10
dólares americanos en alimentación extra y costes de tiempo en las
instalaciones por cerdo afectado. La EPP es un grupo de afecciones
crónicas y agudas de signos clínicos que difieren ampliamente
(muerte, animales pálidos y anémicos, diarrea acuosa de color oscuro
o rojo brillante, depresión, apetito reducido y renuencia al
movimiento, retraso en el crecimiento y aumento de FCR). No obstante
existen dos rasgos constantes. El primero, un cambio patológico
solamente visible en la necropsia, es un engrosamiento de la mucosa
del intestino delgado y del colon. El segundo es la aparición de
pequeñas bacterias curvadas intracitoplasmáticas en los enterocitos
del intestino afectado. Estas bacterias se han establecido ahora
como agente etiológico de la EPP y se han denominado Lawsonia
intracellularis.
A lo largo de los años se ha descubierto que
Lawsonia intracellularis afecta a un gran grupo de animales
incluyendo monos, conejos, hurones, hámsters, zorros, caballos, y
otros animales tan diversos como avestruces y emúes. Lawsonia
intracellularis es una bacteria flagelada, gram negativa que se
multiplica solamente en los enterocitos eucarióticos y no se ha
descrito en ningún cultivo sin células. Con el fin de perdurar y
multiplicarse en la célula Lawsonia intracellularis debe
penetrar en las células de las criptas en división. La bacteria se
asocia con la membrana celular y entra rápidamente en el enterocito
a través de una vacuola de entrada. Ésta se rompe rápidamente (en 3
horas) y la bacteria prospera y se multiplica libremente en el
citoplasma. Los mecanismos por medio de los cuales la bacteria hace
que las células infectadas no logren madurar, continúen
experimentando mitosis y formen criptas hipoplásticas todavía no se
conocen. El conocimiento actual de la infección por Lawsonia
intracellularis, el tratamiento y control de la enfermedad han
estado impedidos por el hecho de que Lawsonia
intracellularis no puede ser cultivada en medios sin células.
Aunque existen informes de cultivos simultáneos satisfactorios de
Lawsonia intracellularis en enterocitos de rata esto no ha
conducido al desarrollo de vacunas inactivadas para combatir
Lawsonia intracellularis, aunque existe claramente la
necesidad de tales vacunas.
Se observa que el documento
EP-A-1 219 711 describe secuencias
de ácido nucleico que codifican proteínas de la membrana externa de
Lawsonia intracellularis y fragmentos inmunogénicos para su
uso como vacunas contra Lawsonia intracellularis. El
documento WO-A-0 226 250 describe
vacunas contra la ileitis proliferativa que contiene subunidades
inmunogénicas protectoras de Lawsonia intracellularis.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar una vacuna para combatir la infección por Lawsonia
intracellularis. Se ha descubierto ahora sorprendentemente, que
Lawsonia intracellularis produce una proteína novedosa que
es capaz, por separado o combinada con otra cualquiera de ocho
proteínas novedosas encontradas, de inducir inmunidad protectora
contra Lawsonia intracellularis.
La primera de estas nueve proteínas novedosas,
que es la proteína de la invención, será referida como la proteína
de 75 kD. La secuencia de aminoácidos de la proteína novedosa se
presenta en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 2. El gen que
codifica esta proteína ha sido secuenciado y su secuencia de ácido
nucleico se muestra en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 1.
El gen también será referido en los Ejemplos como "gen 5074".
La segunda de estas nueve proteínas novedosas será referida como la
proteína de 27kD. La secuencia de aminoácidos de la proteína
novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 4.
El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y su
secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de
secuencia SEQ ID NO: 3. El gen también será referido en los
Ejemplos como "gen 5669".
La tercera de estas nueve proteínas novedosas
será referida como la proteína de 62 kD.
La secuencia de aminoácidos de la proteína
novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 6.
El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y su secuencia
de ácido nucleico se muestra en el identificador de secuencia SEQ
ID NO: 5. El gen también será referido en los Ejemplos como "gen
4423".
La cuarta de estas nueve proteínas será referida
como la proteína de 57 kD. La secuencia de aminoácidos de la
proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ
ID NO: 8. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y
su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de
secuencia SEQ ID NO: 7. El gen también será referido en los
Ejemplos como "gen 3123".
La quinta de estas nueve proteínas será referida
como la proteína de 74 kD. La secuencia de aminoácidos de la
proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ
ID NO: 10. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y
su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de
secuencia SEQ ID NO: 9. El gen también será referido en los
Ejemplos como "gen 5293".
La sexta de estas nueve proteínas será referida
como la proteína de 44 kD. La secuencia de aminoácidos de la
proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ
ID NO: 12. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y
su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de
secuencia SEQ ID NO: 11. El gen también será referido en los
Ejemplos como "gen 5464".
La séptima de estas nueve proteínas será
referida como la proteína de 43 kD. La secuencia de aminoácidos de
la proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia
SEQ ID NO: 14. El gen que codifica esta proteína ha sido
secuenciado y su secuencia de ácido nucleico se muestra en el
identificador de secuencia SEQ ID NO: 13. El gen también será
referido en los Ejemplos como "gen 5473".
La octava de estas nueve proteínas será referida
como la proteína de 26/31 kD. La secuencia de aminoácidos de la
proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ
ID NO: 16. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y
su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de
secuencia SEQ ID NO: 15. El gen también será referido en los
Ejemplos como "gen 4320".
La novena de estas nueve proteínas será referida
como la proteína de 101 kD. La secuencia de aminoácidos de la
proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ
ID NO: 18. El gen que codifica esta proteína ha sido secuenciado y
su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de
secuencia SEQ ID NO: 17. El gen también será referido en los
Ejemplos como "gen 2008".
Es bien sabido en la técnica, que muchas
secuencias de ácido nucleico diferentes pueden codificar la misma
proteína. Este fenómeno es conocido comúnmente como tambaleo en la
segunda y especialmente la tercera base de cada triplete que
codifica un aminoácido. Este fenómeno puede dar como resultado una
heterología de aproximadamente 30% para dos secuencias de ácido
nucleico que todavía codifican la misma proteína. Por lo tanto, dos
secuencias de ácido nucleico que tienen una homología de secuencia
de aproximadamente 70% todavía pueden codificar una y la misma
proteína.
De este modo, una realización hace referencia a
ácidos nucleicos que codifican una proteína de Lawsonia
intracellularis y a porciones de ese ácido nucleico que
codifican un fragmento inmunogénico de esa proteína, donde esos
ácidos nucleicos o sus porciones tienen un nivel de homología con el
ácido nucleico del cual se da la secuencia en el SEQ ID NO: 1 de al
menos 90%.
Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica
esta proteína de Lawsonia intracellularis o la porción de
dicho ácido nucleico tiene una homología de al menos 92%,
preferiblemente 94%, más preferiblemente 95% e incluso más
preferiblemente 96% con el ácido nucleico que tiene la secuencia
dada en el SEQ ID NO: 1. Es incluso más preferido un nivel de
homología de 98% o incluso 100%.
El nivel de homología de nucleótidos se puede
determinar con el programa de ordenador "BLAST 2 SEQUENCES"
seleccionando el sub-programa: "BLASTN" que se
puede encontrar en www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2sep/
bl2.html.
bl2.html.
Una referencia para este programa es Tatiana A.
Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174:
247-250 (1999). Los parámetros utilizados son los
parámetros por defecto: recompensa para un emparejamiento: +1.
Penalización para un emparejamiento erróneo: -2. Espacio abierto:
5. Extensión de espacio: 2. Espacio x_dropoff: 50.
Otro enfoque para decidir si un cierto ácido
nucleico es o no un ácido nucleico de acuerdo con la invención hace
referencia a la cuestión de si cierto ácido nucleico hibrida en
condiciones restrictivas con ácidos nucleicos que tiene la
secuencia de nucleótidos representada en el SEQ ID NO: 1.
Si el ácido nucleico hibrida en condiciones
restrictivas con la secuencia de nucleótidos representada en el SEQ
ID NO: 1, se considera que es un ácido nucleico de acuerdo con la
invención.
La definición de las condiciones restrictivas se
deduce de la fórmula de Meinkoth y Wahl (1984. Hybridization of
nucleic acids immobilized on solid supports. Anal. Biochem. 138:
267-284).
En esta fórmula, M es la molaridad de los
cationes monovalentes; %GC es el porcentaje de nucleótidos de
guanosina y citosina del ADN; L es la longitud del híbrido en pares
de bases.
Las condiciones restrictivas son aquellas
condiciones en las cuales los ácidos nucleicos o sus fragmentos
todavía hibridan, si tienen un emparejamiento erróneo del 10% a lo
sumo, con el ácido nucleico que tiene la secuencia representada en
el SEQ ID NO: 1.
Puesto que la presente invención describe ácidos
nucleicos que codifican proteínas de Lawsonia intracellularis
novedosas, ahora es posible por primera vez obtener estas proteínas
en cantidades suficientes. Esto se puede realizar por ejemplo
utilizando sistemas de expresión para expresar los genes que
codifican las proteínas.
Por lo tanto, en una realización más preferida,
la invención se refiere a fragmentos de ADN que comprenden un ácido
nucleico de acuerdo con la invención. Tales fragmentos de ADN pueden
ser por ejemplo plásmidos, en los cuales se clona un ácido nucleico
de acuerdo con la invención. Tales fragmentos de ADN son útiles por
ejemplo para aumentar la cantidad de ADN para su uso como cebador,
como se describe más abajo.
Un requerimiento esencial para la expresión del
ácido nucleico es un promotor adecuado conectado funcionalmente al
ácido nucleico, de manera que el ácido nucleico está bajo el control
del promotor. Resulta obvio para los expertos en la técnica que la
elección de un promotor se extiende a cualquier promotor
eucariótico, procariótico o viral capaz de dirigir la transcripción
génica en las células utilizadas como células anfitrionas para la
expresión de la proteína.
Por lo tanto, una forma incluso más preferida de
esta realización hace referencia a una molécula de ADN recombinante
que comprende un fragmento de ADN o un ácido nucleico de acuerdo con
la invención que está situado bajo el control de un promotor
conectado funcionalmente. Esto se puede completar por ejemplo, por
medio de técnicas de biología molecular convencionales. (Sambrook,
J. y Russell, D.W., Molecular cloning: a laboratory manual, 2001.
ISBN 0-87969-577-3).
Los promotores conectados funcionalmente son promotores que son
capaces de controlar la transcripción de los ácidos nucleicos a los
cuales están conectados.
Semejante promotor puede ser un promotor de
Lawsonia por ejemplo el promotor implicado en la expresión in
vivo de cualquiera de los genes que codifican las nueve
proteínas novedosas, siempre que el promotor sea funcional en la
célula utilizada para la expresión. Éste puede ser un promotor
heterólogo. Cuando las células anfitrionas son bacterias, las
secuencias de control de la expresión útiles que se pueden utilizar
incluyen el promotor y el operador Trp (Goeddel, et al.,
Nucl. Acids Res., 8, 4057, 1980); el promotor y el operador lac
(Chang, et al., Nature, 275, 615, 1978); el promotor de la
proteína de la membrana externa (Nakamura, K. e Inouge, M., EMBO
J., 1, 771-775, 1982); los promotores y operadores
del bacteriófago lambda (Remaut, E. et al., Nucl. Acids
Res., 11, 4677-4688, 1983); el promotor y el
operador de \alpha-amilasa (B. subtilis), las
secuencias de terminación y otras secuencias de intensificación y
control de la expresión compatibles con la célula anfitriona
seleccionada. Cuando la célula anfitriona es una levadura, las
secuencias de control de la expresión útiles incluyen, p. ej., el
factor de apareamiento \alpha. Para las células de insecto se
pueden utilizar los promotores de polihedrina o p10 de baculovirus
(Smith, G.E. et al., Mol. Cell. Biol. 3,
2156-65, 1983). Cuando la célula anfitriona es de
mamífero, las secuencias de control de la expresión útiles
ilustrativas incluyen el promotor de SV-40 (Berman,
P.W. et al., Science, 222, 524-527, 1983) o
el promotor de metalotioneína (Brinster, R.L., Nature, 296,
39-42, 1982) o un promotor de choque térmico
(Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,
4949-53, 1985).
Los sistemas de expresión de células
bacterianas, de levadura, de hongos, de insectos y de mamíferos son
sistemas utilizados muy frecuentemente. Tales sistemas son bien
conocidos en la técnica y están generalmente disponibles, p. ej.,
comercialmente a través de Invitrogen (www.invitrogen.com),
Novagen (www.merckbiosciences.de) o Clontech Laboratories,
Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto, California
94303-4607, USA. Junto a estos sistemas de
expresión, los sistemas de expresión basados en parásitos son
sistemas de expresión muy atractivos. Tales sistemas se describen
p. ej. en la Solicitud de Patente Francesa número 2 714 074, y en la
Publicación US NTIS Núm. US 08/043109 (Hoffman, S. y Rogers, W.:
Fecha de Public. 1 de Diciembre de 1993).
Una forma aún más preferida de esta realización
de la invención hace referencia a Portadores Recombinantes Vivos
(LRC por sus siglas en inglés) que comprenden un ácido nucleico que
codifica cualquiera de los genes que codifican las nueve proteínas
novedosas o uno de sus fragmentos inmunogénicos de acuerdo con la
invención, un fragmento de ADN de acuerdo con la invención o una
molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención. Tales
portadores son p. ej. bacterias y virus. Estos LRC son
microorganismos o virus en los cuales ha sido clonada información
genética adicional, en este caso un ácido nucleico que codifica
cualquiera de los genes que codifican las nueve proteínas novedosas
o uno de sus fragmentos inmunogénicos de acuerdo con la invención.
Los animales infectados con tales LRC producirán una respuesta
inmunogénica no solamente contra los inmunógenos del portador, si
no también contra las porciones inmunogénicas de la proteína o las
proteínas para las cuales el código genético es clonado
adicionalmente en el LRC, p. ej. la proteína de 75 kD o cualquiera
de las otras proteínas de acuerdo con la invención.
Como ejemplo de LCR bacteriano, se pueden
utilizar de forma atractiva cepas de Salmonella atenuadas conocidas
en la técnica. Los parásitos portadores recombinantes vivos han sido
descritos, entre otros, por Vermeul en, A. N. (Int. Journ.
Parasitol. 28: 1121-1130 (1998)).
Asimismo, se pueden utilizar virus LRC como modo
de transporte del ácido nucleico a una célula diana. Los virus
portadores recombinantes vivos también son denominados virus
vectores. Los virus utilizados a menudo como vectores son los virus
Vaccinia (Panicali et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:
4927 (1982), los Herpesvirus (E.P.A. 0473210A2), y los Retrovirus
(Valerio, D. et al; in Baum, S.J., Dicke, K.A., Lotzova, E. y
Pluznik, D.H. (Eds.), Experimental Haematology today - 1988.
Springer Verlag, Nueva York: págs. 92-99
(1989)).
La técnica de recombinación homóloga in
vivo, bien conocida en la técnica, se puede utilizar para
introducir un ácido nucleico recombinante en el genoma de una
bacteria, parásito o virus de elección, capaz de inducir la
expresión del ácido nucleico insertado de acuerdo con la invención
en el animal anfitrión.
Finalmente otra forma de esta realización de la
invención hace referencia a una célula anfitriona que comprende un
ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la
invención, un fragmento de ADN que comprende semejante ácido
nucleico o una molécula de ADN recombinante que comprende semejante
ácido nucleico bajo el control de un promotor conectado
funcionalmente. Esta forma también hace referencia a una célula
anfitriona que contiene un portador recombinante vivo que contiene
una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de los genes
que codifican las nueve proteínas novedosas o uno de sus fragmentos
de acuerdo con la inven-
ción.
ción.
Una célula anfitriona puede ser una célula de
origen bacteriano, p. ej. Escherichia coli, Bacillus subtilis
y especies de Lactobacillus, combinada con plásmidos basados
en bacterias como pBR322, o vectores de expresión bacteriana como
pGEX, o con bacteriófagos. La célula anfitriona también puede ser de
origen eucariótico, p. ej. células de levadura combinadas con
moléculas vectoras específicas de levadura, o células eucarióticas
superiores como células de insecto (Luckow et al;
Bio-technology 6: 47-55 (1988))
combinadas con vectores o baculovirus recombinantes, células de
plantas combinadas p. ej. con vectores basados en el plásmido Ti o
vectores virales de plantas (Barton, K.A. et al; Cell 32:
1033 (1983), células de mamífero como células Hela, células de
Ovario de Hámster Chino (CHO) o células Crandell de Riñón Felino,
asimismo con vectores o virus recombinantes.
Otra realización de la invención hace referencia
a las proteínas novedosas y a sus fragmentos inmunogénicos de
acuerdo con la invención.
El concepto de fragmentos inmunogénicos se
definirá más abajo.
Una forma de esta realización hace referencia
entre otras a proteínas de Lawsonia intracellularis que
tienen una secuencia de aminoácidos que es homóloga al menos en 90%
a la secuencia de aminoácidos representada en el SEQ ID NO: 2 y a
fragmentos inmunogénicos de dicha proteína.
En una forma preferida, la realización hace
referencia a tales proteínas de Lawsonia intracellularis que
tienen una homología de secuencia de al menos 92%, preferiblemente
94%, más preferiblemente una homología de 96% con la secuencia de
aminoácidos representada en el SEQ ID NO: 2 y a fragmentos
inmunogénicos de tales proteínas.
Es incluso más preferible un nivel de homología
de 98% o incluso 100%.
El nivel de homología de las proteínas se puede
determinar con el programa informático "BLAST 2 SEQUENCES"
seleccionando el sub-programa: "BLASTP", que se
puede encontrar en
www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2sea/bl2.html.
Una referencia para este programa es Tatiana A.
Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174:
247-250 (1999). Matriz utilizada: "blosum62".
Los parámetros utilizados son los parámetros por defecto:
Espacio abierto: 11. Extensión del espacio: 1.
Espacio x_dropoff: 50.
Se entenderá que, para las proteínas concretas
incluidas en la presente memoria, pueden existir variaciones
naturales entre las cepas de Lawsonia intracellularis
individuales. Estas variaciones pueden ser demostradas por una o
varias diferencias de aminoácidos en la secuencia global o por
deleciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de
uno o varios aminoácidos en dicha secuencia. Neurath et al en
"The Proteins" Academic Press Nueva York (1979) han descrito
sustituciones de aminoácidos que no alteran esencialmente las
actividades biológicas e inmunológicas. Las sustituciones de
aminoácidos entre aminoácidos relacionados o las sustituciones que
se han producido frecuentemente en la evolución son, entre otras,
Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (véase Dayhof, M.D.,
Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found.,
Washington D.C., 1978, vol. 5, supl. 3). Otras sustituciones de
aminoácidos incluyen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn,
Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val y Ala/Glu.
Basándose en esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un
método para la comparación rápida y sensible de proteínas (Science,
227, 1435-1441, 1985) y la determinación de la
similitud funcional entre proteínas homólogas. Tales sustituciones
de aminoácidos de la realización ilustrativa de esta invención, así
como las variaciones que tienen deleciones y/o inserciones están
dentro del alcance de la invención con tal que las proteínas
resultantes conserven su reactividad inmunitaria.
Esto explica por qué las proteínas de
Lawsonia intracellularis de acuerdo con la invención, cuando
se aíslan de productos aislados de campos diferentes, pueden tener
niveles de homología de aproximadamente 90%, a la vez que
representan todavía la misma proteína con las mismas características
inmunológicas.
Se considera que esas variaciones en la
secuencia de aminoácidos de una cierta proteína de acuerdo con la
invención que todavía proporcionan una proteína capaz de inducir una
respuesta inmunitaria frente a la infección por Lawsonia
intracellularis o al menos contra las manifestaciones clínicas
de la infección no "influyen esencialmente en la
inmunogenicidad".
Cuando se utiliza una proteína por ejemplo para
vacunación o para originar anticuerpos, no es necesario sin embargo
utilizar la proteína completa. También es posible utilizar un
fragmento de esa proteína que sea capaz, tal cual o acoplada a un
portador tal como, p. ej., KLH, de inducir una respuesta inmunitaria
contra esa proteína, un fragmento denominado inmunogénico. Se
entiende que un "fragmento inmunogénico" es un fragmento de la
proteína completa que todavía conserva su capacidad para inducir
una respuesta inmunitaria en el anfitrión, esto es, comprende un
epítopo de célula B o T. En este momento, se encuentran disponibles
una variedad de técnicas para identificar fácilmente fragmentos de
ADN que codifican fragmentos antigénicos (determinantes). El método
descrito por Geysen et al. (Solicitud de Patente WO 84/03564,
Solicitud de Patente WO 86/06487, Patente de los Estados Unidos
Núm. 4.833.092, Proc. Natl Acad. Sci. 81: 3998-4002
(1984), J. Imm. Meth. 102, 259-274 (1987), el
método denominado PEPSCAN es un método fácil de realizar, rápido y
bien establecido para la detección de epítopos; las regiones
inmunológicamente importantes de la proteína. El método es utilizado
en todo el mundo y como tal es bien conocido por los expertos en la
técnica. Este método (empírico) es especialmente adecuado para la
detección de epítopos de las células B. Asimismo, dada la secuencia
del gen que codifica cualquier proteína, los algoritmos
informáticos son capaces de designar fragmentos de proteína
específicos como los epítopos inmunológicamente importantes
basándose en su coincidencia secuencial y/o estructural con los
epítopos que son conocidos ahora. La determinación de estas regiones
se basa en una combinación de los criterios de carácter hidrófilo
de acuerdo con Hopp y Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78:
38248-3828 (1981)), y los aspectos de la estructura
secundaria de acuerdo con Chou y Fasman (Advances in Enzymology 47:
45-148 (1987) y Patente de los Estados Unidos
4.554.101). Los epítopos de las células T pueden ser pronosticados
del mismo modo a partir de la secuencia por medio de un ordenador
con la ayuda del criterio del carácter anfífilo de Berzofsky
(Science 235, 1059-1062 (1987) y solicitud de
Patente de los Estados Unidos NTIS US 07/005.885). Una visión
global resumida se encuentra en: Shan Lu en Common principles:
Tibtech 9: 238-242 (1991), Good et al en
Malaria epitopes; Science 235: 1059-1062 (1987), Lu
para una revisión; Vaccine 10: 3-7 (1992), Berzowsky
for HIV-epitopes; The FASEB Journal
5:2412-2418 (1991).
Por lo tanto, una forma de otra realización más
de la invención hace referencia a vacunas capaces de proteger a los
cerdos frente a la infección por Lawsonia intracellularis,
que comprenden una proteína o uno de sus fragmentos inmunogénicos,
de acuerdo con la invención como se ha descrito antes junto con un
portador farmacéuticamente aceptable.
Otra realización más de la presente invención
hace referencia a las proteínas de acuerdo con la invención para su
uso en una vacuna.
Otra realización más hace referencia al uso de
una proteína de acuerdo con la invención para la fabricación de una
vacuna para combatir las infecciones por Lawsonia
intracellularis.
Un modo de elaborar una vacuna de acuerdo con la
invención es mediante purificación bioquímica de las proteínas o
sus fragmentos inmunogénicos de acuerdo con la invención a partir de
bacterias obtenidas de raspados de mucosa tomados de la pared del
intestino infectado. No obstante este es un modo de elaborar una
vacuna que lleva mucho tiempo.
Por lo tanto es mucho más conveniente utilizar
los productos de expresión de los genes que codifican las proteínas
o sus fragmentos inmunogénicos de acuerdo con la invención en las
vacunas. Las secuencias de ácido nucleico de los genes que
codifican las nueve proteínas novedosas se proporcionan en la
presente invención.
Tales vacunas basadas en los productos de
expresión de estos genes se pueden elaborar fácilmente mezclando
una proteína de acuerdo con la invención o uno de sus fragmentos
inmunogénicos de acuerdo con la invención con un portador
farmacéuticamente aceptable como se describe más abajo.
Alternativamente, una vacuna de acuerdo con la
invención puede comprender portadores recombinantes vivos como se
ha descrito antes, capaces de expresar las proteínas de acuerdo con
la invención o sus fragmentos inmunogénicos de acuerdo con la
invención. Tales vacunas, p. ej., basadas en un portador de
Salmonella o un portador viral que infecta el epitelio entérico, o
p. ej. el epitelio respiratorio tienen la ventaja sobre las vacunas
de subunidades de que imitan mejor el modo natural de infección de
Lawsonia intracellularis. Por otra parte, su
auto-propagación es una ventaja puesto que solamente
son necesarias bajas cantidades del portador recombinante para la
inmuniza-
ción.
ción.
Las vacunas descritas más arriba contribuyen
todas a la vacunación activa, esto es, el sistema inmunitario del
anfitrión es detonado por una proteína de acuerdo con la invención o
uno de sus fragmentos inmunogénicos, para elaborar anticuerpos
contra estas proteínas.
Alternativamente, tales anticuerpos pueden ser
originados p. ej. en conejos o pueden ser obtenidos a partir de
líneas celulares productoras de anticuerpos como se describe más
abajo. Tales anticuerpos pueden ser administrados después al animal
anfitrión. Este método de vacunación, vacunación pasiva, es la
vacunación de elección cuando un animal ya está infectado, y no hay
tiempo para permitir que se desencadene la respuesta inmunitaria
natural. También es el método preferido para vacunar animales
inmuno-comprometidos. En estos casos los anticuerpos
administrados contra Lawsonia intracellularis pueden unirse
directamente a la bacteria. Esto tiene la ventaja de que
inmediatamente disminuye o se detiene el crecimiento de Lawsonia
intracellularis.
Por lo tanto, otra forma de esta realización de
la invención hace referencia a vacunas que comprenden anticuerpos
contra al menos una de las proteínas novedosas de Lawsonia
intracellularis de acuerdo con la invención.
Las vacunas también pueden basarse en células
anfitrionas como las descritas más arriba, que comprenden las
proteínas o sus fragmentos inmunogénicos de acuerdo con la
invención.
Un modo de vacunación alternativo y eficaz es la
vacunación directa con ADN que codifica el antígeno relevante. La
vacunación directa con ADN que codifica las proteínas ha sido
satisfactoria para muchas proteínas diferentes. (Revisado p. ej.,
por Donnelly et al., en The Immunologist 2:
20-26 (1993)).
Este modo de vacunación es muy atractivo para la
vacunación de cerdos contra la infección por Lawsonia
intracellularis.
Por lo tanto, otras formas más de esta
realización de la invención hacen referencia a vacunas que
comprenden ácidos nucleicos que codifican una proteína de acuerdo
con la invención o sus fragmentos inmunogénicos de acuerdo con la
invención, y a vacunas que comprenden fragmentos de ADN que
comprenden tales ácidos nucleicos.
Otras formas más de esta realización hacen
referencia a vacunas que comprenden moléculas de ADN recombinante
de acuerdo con la invención.
Las vacunas de ADN pueden ser administradas
fácilmente por medio de aplicación intradérmica p. ej. utilizando
un inyector sin aguja. Este modo de administración libera el ADN
directamente en las células del animal que se va a vacunar.
Cantidades de ADN en el intervalo entre 1 y 100 microgramos
proporcionan muy buenos resultados.
En una realización alternativa, la vacuna de
acuerdo con la presente invención comprende adicionalmente uno o
más antígenos derivados de otros organismos y virus patogénicos para
los cerdos, o la información genética que codifica tales
antígenos.
Tales organismos y virus se seleccionan
preferiblemente del grupo del virus de la Pseudorrabia, el virus de
la Influenza porcina, el Parvovirus porcino, el virus de la
Gastroenteritis transmisible, Rotavirus, Escherichia coli,
Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella
cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida,
Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae, Brachyspira
hyodysenteriae y Actinobacillus pleuropneumoniae.
Todas las vacunas de acuerdo con la presente
invención comprenden un portador farmacéuticamente aceptable. Un
portador farmacéuticamente aceptable puede ser, p. ej. agua estéril
o una solución salina fisiológica estéril. En una forma más
compleja el portador puede ser un tampón.
Los métodos para la preparación de una vacuna
comprenden la mezcla de una proteína de acuerdo con la invención, o
uno de sus fragmentos inmunogénicos, y un portador farmacéuticamente
aceptable.
Las vacunas de acuerdo con la presente invención
en una presentación preferida también pueden contener un
coadyuvante. Los coadyuvantes en general comprenden sustancias que
refuerzan la respuesta inmunitaria del anfitrión de una manera no
específica. Se conocen en la técnica numerosos coadyuvantes
diferentes. Los ejemplos de los coadyuvantes son los coadyuvantes
Completo e Incompleto de Freund, la vitamina E, los polímeros de
bloques no iónicos, los muramildipéptidos, Quill A®, los aceites
minerales p. ej Bayol® o Markol®, los aceites vegetales, y
Carbopol® (un homopolímero), o Diluvac® Forte.
La vacuna también puede comprender lo que se
denomina un "vehículo". Un vehículo es un compuesto al cual se
adhiere el polipéptido, sin estar unido covalentemente a él. A
menudo los compuestos vehículo utilizados son p. ej. hidróxido,
fosfato u óxido de aluminio, sílice, Caolín, y Bentonita.
Una forma especial de semejante vehículo, en la
cual el antígeno está parcialmente embebido en el vehículo, es la
denominada ISCOM (documentos EP 109.942, EP 180.564, EP
242.380).
Además, la vacuna puede comprender uno o más
compuestos tensioactivos o emulsionantes adecuados, p. ej. Span o
Tween.
A menudo, la vacuna se mezcla con
estabilizadores, p. ej. para proteger a los polipéptidos con
propensión a la degradación de ser degradados, para intensificar la
vida en el estante de la vacuna, o para mejorar la eficacia de
liofilización. Los estabilizadores útiles son, entre otros, SPGA
(Bovarnik et al; J. Bacteriology 59: 509 (1950)),
carbohidratos por ejemplo, sorbitol, manitol, trehalosa, almidón,
sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o
caseína o sus productos de degradación, y tampones, tales como
fosfatos de metales alcalinos.
Además, la vacuna puede ser suspendida en un
diluyente fisiológicamente aceptable.
No es necesario decir, que también están
incluidas en la presente invención otras formas de adyuvar, añadir
compuestos vehículo o diluyentes, emulsionar o estabilizar un
polipéptido.
Las vacunas de acuerdo con la invención se
pueden administrar muy adecuadamente en cantidades que oscilan
entre 1 y 100 microgramos, aunque en principio se pueden utilizar
dosis más pequeñas.
Una dosis que exceda de 100 microgramos será,
aunque muy adecuada inmunológicamente, menos atractiva por razones
comerciales.
Las vacunas basadas en portadores recombinantes
atenuados vivos, tales como virus LRC y bacterias descritos más
arriba se pueden administrar a dosis mucho menores, debido a que se
multiplican durante la infección. Por lo tanto, las cantidades muy
adecuadas oscilarían entre 10^{3} y 10^{9} CFU/PFU
respectivamente para bacterias y virus.
Se pueden aplicar muchos modos de
administración. La aplicación oral es un modo de administración muy
atractivo, porque la infección es una infección del tracto
digestivo. Un modo preferido de administración oral es el
empaquetado de la vacuna en cápsulas, conocido y utilizado
frecuentemente en la técnica, que solamente se desintegra después
de haber pasado el entorno altamente ácido del estómago. Asimismo,
la vacuna se podría mezclar con compuestos conocidos en la técnica
para aumentar temporalmente el pH del estómago.
La aplicación sistémica también es adecuada, p.
ej., mediante administración intramuscular de la vacuna. Si se
sigue esta ruta, son adecuados los procedimientos convencionales
conocidos en la técnica para la aplicación sistémica.
Desde el punto de vista de la protección frente
a una enfermedad, es importante una diagnosis rápida y correcta de
la infección por Lawsonia intracellularis.
Por lo tanto otro objetivo de esta invención es
proporcionar herramientas de diagnóstico adecuadas para la
detección de la infección por Lawsonia intracellularis.
Un ensayo diagnóstico para la detección de
anticuerpos de Lawsonia intracellularis en suero puede ser
p. ej. un simple ensayo sándwich-ELISA convencional
en el que cualquiera de las proteínas novedosas de acuerdo con la
invención o sus fragmentos antigénicos de acuerdo con la invención
están recubriendo las paredes de los pocillos de una placa de
ELISA. Un método para la detección de tales anticuerpos es p. ej. la
incubación de la proteína de 75 kD (o cualquier otra proteína de
acuerdo con la invención) o sus fragmentos antigénicos con sueros
de los mamíferos que se van a someter a ensayo, seguido p. ej. de
incubación con un anticuerpo marcado contra el anticuerpo de
mamífero relevante. Una reacción coloreada puede revelar después la
presencia o ausencia de anticuerpos contra Lawsonia
intracellularis. Otro ejemplo de sistema de ensayo diagnóstico
es p. ej. la incubación de una transferencia Western que comprende
la proteína de 75 kD o uno de sus fragmentos antigénicos de acuerdo
con la invención, con los sueros de los mamíferos que se van a
someter a ensayo, seguido del análisis de la transferencia.
De este modo, otra realización de la presente
invención hace referencia a ensayos de diagnóstico para la detección
de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis. Tales
ensayos comprenden una proteína o uno de sus fragmentos de acuerdo
con la invención.
Un ensayo de diagnóstico basado en la detección
de material antigénico de cualquiera de las nueve proteínas de los
antígenos de Lawsonia intracellularis y por lo tanto
adecuados para la detección de la infección por Lawsonia
intracellularis también puede ser un ensayo ELISA convencional.
En un ejemplo de semejante ensayo se cubren las paredes de los
pocillos de una placa de ELISA con anticuerpos dirigidos contra la
proteína de 75 kD (o cualquier otra proteína de acuerdo con la
invención). Tras la incubación con el material que se va a someter
a ensayo, se añaden a los pocillos los anticuerpos
anti-Lawsonia intracellularis marcados. Una
reacción coloreada revela entonces la presencia de material
antigénico de Lawsonia intracellularis.
Por lo tanto, otra realización más de la
presente invención hace referencia a ensayos de diagnóstico para la
detección de material antigénico de Lawsonia intracellularis.
Tales ensayos comprenden anticuerpos contra una proteína o uno de
sus fragmentos de acuerdo con la invención.
Los polipéptidos o sus fragmentos inmunogénicos
de acuerdo con la invención expresados como se ha caracterizado más
arriba se pueden utilizar para producir anticuerpos, que pueden ser
policlonales, monoespecíficos o monoclonales (o sus derivados). Si
se desean anticuerpos policlonales, los mecanismos para producir y
procesar sueros policlonales son bien conocidas en la técnica (p.
ej., Mayer y Walter, eds. Immunochemical Methods in Cell and
Molecular Biology, Academic Press, Londres, 1987).
Los anticuerpos monoclonales, reactivos contra
el polipéptido de acuerdo con la invención (o sus variantes o
fragmentos) de acuerdo con la presente invención, se pueden preparar
inmunizando ratones endogámicos mediante mecanismos también
conocidos en la técnica (Kohler y Milstein, Nature, 256,
495-497, 1975).
Los métodos para la producción a gran escala de
anticuerpos de acuerdo con la invención también son conocidos en la
técnica. Tales métodos cuentan con la clonación de (fragmentos de)
la información genética que codifica la proteína de acuerdo con la
invención en un fago filamentoso para la presentación en fagos.
Tales mecanismos se describen entre otros en "Antibody
Engineering Page" en "presentación en fagos filamentosos" en
http://aximtl.imt.unimarburg.de/
\simrek/aepphage.html., y en las publicaciones de revisión de Cortese, R. et al., (1994) en Trends Biotechn. 12: 262-267., por Clackson, T. & Wells, J.A. (1994) en Trends Biotechn. 12: 173-183, por Marks, J.D. et al., (1992) en J. Biol. Chem. 267: 16007-16010, por Winter, G. et al., (1994) en Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455, y por Little, M. et al., (1994) Biotechn. Adv. 12: 539-555. Los fagos se utilizan con posterioridad para escrutar genotecas de expresión de camélidos que expresan anticuerpos de cadena pesada de camélidos. (Muyldermans, S. y Lauwereys, M., Journ. Molec. Recogn. 12: 131-140 (1999) y Ghahroudi, M.A. et al., FEBS Letters 414: 512-526 (1997)). Las células de la genoteca que expresan los anticuerpos deseados pueden ser replicadas y con posterioridad utilizadas para la expresión de anticuerpos a gran escala.
\simrek/aepphage.html., y en las publicaciones de revisión de Cortese, R. et al., (1994) en Trends Biotechn. 12: 262-267., por Clackson, T. & Wells, J.A. (1994) en Trends Biotechn. 12: 173-183, por Marks, J.D. et al., (1992) en J. Biol. Chem. 267: 16007-16010, por Winter, G. et al., (1994) en Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455, y por Little, M. et al., (1994) Biotechn. Adv. 12: 539-555. Los fagos se utilizan con posterioridad para escrutar genotecas de expresión de camélidos que expresan anticuerpos de cadena pesada de camélidos. (Muyldermans, S. y Lauwereys, M., Journ. Molec. Recogn. 12: 131-140 (1999) y Ghahroudi, M.A. et al., FEBS Letters 414: 512-526 (1997)). Las células de la genoteca que expresan los anticuerpos deseados pueden ser replicadas y con posterioridad utilizadas para la expresión de anticuerpos a gran escala.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se recogieron íleones infectados con L.
intracellularis, se confirmaron mediante histopatología y
tinción rápida de Ziehl-Neelsen
ácido-resistente de cerdos muertos con EP, y se
almacenaron a -80ºC. Después de descongelar se aislaron las
bacterias L. intracellularis de raspados de la mucosa tomados
de la pared intestinal infectada. Los raspados ileales se
homogeneizaron repetidamente en PBS en un Omni Mixer para liberar la
bacteria intracelular como han descrito Lawson et al. (Vet.
Microbiol. 10: 303-323 (1985)). El sobrenadante
obtenido después de la centrifugación a baja velocidad para separar
los residuos celulares se filtró a través de filtros de 5,0, 3,0,
1,2, y 0,8 \mum (Millipore). El producto filtrado se centrifugó
con posterioridad a 8.000 g durante 30 min, dando un pequeño
sedimento de bacteria L. intracellularis. Estas bacterias se
purificaron adicionalmente utilizando un gradiente Percoll. La
identidad de la bacteria purificada se evaluó mediante PCR (Jones
et al., J. Clin. Microbiol. 31: 2611-2615
(1993)) mientras la pureza de la bacteria aislada (>95%) se
evaluó mediante microscopía de contraste de fases para revelar
cualquier bacteria contaminante o residuo de intestino presente.
Se aislaron células de L. intracellularis
de material de íleon infectado como se ha descrito antes. Se
adquirieron la cepa anfitriona Escherichia coli BL21
Star(DE3) que contenía el vector pLysSrare y el plásmido
pET-His-1 de Novagen (Madison,
Wisconsin, USA). La cepa de E. coli TOP10F' se adquirió de
Invitrogen (Groningen, Países Bajos). Las soluciones de partida de
todas las cepas bacterianas, que contenían glicerol al 30% se
almacenaron a -70ºC.
Se prepararon caldo Luria Bertani (LB) placas LB
de acuerdo con los procedimientos convencionales.
Con el fin de obtener ADN de L.
intracellularis altamente purificado, se preparó ADN a partir de
células bacterianas utilizando un kit de aislamiento de ADN
cromosómico Biorad (Biorad, Veenendaal, Países Bajos). El ADN
plasmídico se aisló utilizando productos de Qiagen.
La amplificación por PCR se realizó utilizando
una mezcla de PCR que contenía 52 U/ml de Expand High Fidelity
Enzyme Mix (Roche Applied BioSciences), tampón Expand HF con
MgCl_{2} 2,5 mM, dNTP 16 mM (Promega, Wisconsin, USA), 20 pmoles
de cebadores y 15 ng de ADN cromosómico de L. intracellularis
como molde.
Para las aplicaciones convencionales (esto es
PCR de colonias) la mezcla de PCR contenía 20 U/ml de Supertaq y
tampón Supertaq (HT Biotechnology Ltd, Cambridge, Reino Unido),
conteniendo dNTP 8 mM (Promega, Wisconsin, USA), 10 pmoles de
cebadores y 15 ng de molde.
Las ligaciones se realizaron en 1 x tampón de
ligación con 1 unidad de enzima de ligación (Gibco BRL Life
Technologies Inc., USA) a 16ºC durante la noche. Se transformó 1
\mul de la reacción de ligación en células competentes de E.
coli mediante choque térmico. Las células competentes de E.
coli BL21star(DE3) y las células competentes de E.
coli TOP10F' se volvieron competentes utilizando métodos
convencionales.
Para el gen de 75 kD, 27 kD, 62 kD y 57 kD, se
utilizó el siguiente método de expresión. La secuencia de ADN del
vector de expresión se confirmó mediante técnicas de secuenciación
convencionales antes de que el vector de expresión se transformara
en BL21star(DE3) que contenía pLysSrare. La cepa resultante
se hizo crecer durante la noche a 37ºC a 200 rpm en 5 ml de LB con
100 \mug/ml de ampicilina. El cultivo durante la noche se diluyó
1:100 en 50 ml de LB con 100 \mug/ml de ampicilina. Este cultivo
se hizo crecer en las mismas condiciones hasta que se alcanzó una
DO_{600} de 0,5. El cultivo fue inducido con IPTG a una
concentración final 1 mM y continuó creciendo durante las 3 horas
siguientes. Se tomaron muestras de 100 \mul para su análisis. La
cepa de E. coli BL21star(DE3) que contenía pLysSrare
se hizo crecer y se indujo en las mismas condiciones y se tomaron
muestras como control negativo. Las muestras se analizaron mediante
SDS PAGE.
Para el gen de 74 kD, 44 kD, 43 kD, 26/31 kD y
101 kD, se siguió el siguiente método de expresión. Se realizaron
la transcripción y la traducción in vitro utilizando el
Sistema de Traducción Rápida de Roche Applied Science (Mannheim,
FRG) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
En resumen, primero se utilizó la herramienta de
optimización de la secuencia basada en el conocimiento ProteoExpert
RTS. Se utilizó E. coli HY para diseñar variantes de elevado
rendimiento del gen original. Este programa optimiza el molde de
ADN para la etapa de traducción sugiriendo mutaciones en la
secuencia de ADN. Solamente se permitieron mutaciones silenciosas,
conduciendo a secuencias de aminoácidos idénticas a nivel de
proteína. Sin embargo, fueron propuestos cambios de hasta 8
nucleótidos en los 6 primeros codones por el servicio ProteoExper
para proporcionar mejores resultados de expresión.
Se utilizaron diez cebadores efectores y un
antisentido universal, que contenían una región solapante 5' de 20
nucleótidos y 30-38 nucleótidos específicos del gen
adicionales en 10 reacciones de PCR diferentes para amplificar
estas variantes con ADN cromosómico de L. intracellularis
purificado como molde. Los amplicones obtenidos se purificaron del
gel y se utilizaron para la generación de constructos de expresión
lineales para la expresión de proteína sin células utilizando RTS
E. coli Linear Template Generation Set,
His-tag, para introducir los elementos reguladores
de T7 necesarios.
De nuevo los amplicones obtenidos se purificaron
en gel, y después de la cuantificación, se utilizó la cantidad
apropiada de ADN para el análisis de la expresión de la proteína en
una mezcla de reacción RTS 100 E. coli HY de 50 \mul. La
expresión se analizó utilizando la transferencia Western con un
anticuerpo monoclonal anti-polihistidina.
El constructo que dio los rendimientos de
proteína más elevados se ligó al vector pCR2.1 TOPO TA utilizando
el kit de clonación TOPO TA. El plásmido obtenido se utilizó para la
producción de proteína a escala media utilizando el kit RTS 500
E. coli HY. Las muestras se analizaron mediante SDS PAGE y
mediante transferencia Western.
La secuencia de ADN del vector de expresión se
confirmó utilizando un secuenciador automático ABI 310 (Applied
Biosystems, California, USA).
Cuando fue necesario la proteína se purificó
utilizando una resina para cromatografía de afinidad por metal
inmovilizado TALON de acuerdo con el protocolo del fabricante para
la purificación utilizando condiciones desnaturalizantes. Con
posterioridad, la fracción de proteína purificada se sometió a
diálisis frente a PBS para separar la urea de la muestra.
Se realizó la SDS-PAGE
utilizando geles Bis-Tris al 4-12%
del sistema de electroforesis NuPAGE (Invitrogen,
www.invitrogen.com). La transferencia Western se realizó utilizando
procedimientos de transferencia semi-secos. Las
transferencias Western se revelaron utilizando suero policlonal
anti-Lawsonia de pollo que se había originado
contra una preparación de células completas en emulsión de
agua:aceite=45:55 o utilizando suero de cerdo que había sido
obtenido de un animal que se había sensibilizado oralmente con
células de L. intracellularis purificadas y que había
desarrollado de signos clínicos y lesiones
post-mortem típicas de infección por L.
intracellularis. Los sueros fueron
pre-adsorbidos utilizando un volumen igual de
extractos celulares brutos de BL21star(DE3) que contenía el
vector pLysSrare a 4ºC durante 4 horas.
Se amplificó el gen 5074 utilizando el cebador
2075 (CATGCCATGGCTAGTCTTACAGCAGGAATGTG) y el 2076
(CCGCTCGAGACACGCTTCATATTTACAACTG). En el procedimiento se
introdujeron un sitio 5' NcoI 3' XhoI en el producto de la PCR. El
producto de la PCR obtenido se digirió utilizando las enzimas de
restricción NcoI y XhoI. El producto de la PCR digerido se ligó con
posterioridad a pET22b que había sido cortado con las mismas dos
enzimas de restricción. La mezcla de ligación se transformó en
E. coli TOP10F y se incubó durante la noche a 37ºC. Se
verificó el plásmido correcto en los supuestos transformantes,
utilizando la PCR de colonias. Los insertos plasmídicos, de
transformantes positivos para la PCR de colonias, se verificaron
mediante análisis de la secuencia de nucleótidos. Uno de los clones
que contenía una secuencia como la esperada basándose en la
estrategia de clonación se eligió y se designó pET5074.
El plásmido pET5074 se transformó en
BL21Star(DE3)pLysSrare. La cepa resultante se sometió
a ensayo en busca de producción de proteína recombinante como se ha
descrito antes. Las muestras del cultivo inducido y las muestras de
control se analizaron mediante electroforesis en gel
SDS-PAGE (Fig. 1A). Se observó una banda clara de
proteína de aproximadamente 75 kD en la muestra que se había tomado
después de 3 horas de inducción (Fig. 1A, calle 3) en comparación
con la muestra no inducida (Fig. 1A, calle 2).
También se analizaron las mismas muestras
mediante transferencia western utilizando el suero de cerdo y pollo.
Se observó una reacción con la proteína de 75 kD utilizando el
suero del cerdo que había sido sensibilizado oralmente con células
de L. intracellularis purificadas (Fig 1B, calle 3), y con el
suero anti-L. intracellularis de pollo (Fig 1C, calle
3).
Conclusión: el componente de la vacuna de
75 kD pudo ser expresado satisfactoriamente en grandes cantidades y
en efecto es claramente reconocido tanto por el suero anti-L.
intracellularis de cerdo sensibilizado oralmente como por el
suero anti-L. intracellularis de pollo.
Se amplificó el gen 5669 utilizando el cebador
2185 (CATGCCATGGATGCACTTGAGTTCATACAAGA) y 2186
(CCGCTCGAGATGAATTTGGATTTCAATTT). En el procedimiento se
introdujeron un sitio 5' NcoI y uno 3' XhoI en el producto de la
PCR. El producto obtenido de la PCR se digirió utilizando las
enzimas de restricción NcoI y XhoI. El producto de la PCR digerido
se ligó con posterioridad a pET22b que había sido cortado con las
mismas dos enzimas de restricción. La mezcla de ligación se
transformó en E. coli TOP1 OF y se incubó a 37ºC durante la
noche. Se verificó el plásmido correcto en los supuestos
transformantes, utilizando la PCR de colonias. Los insertos
plasmídicos, de los transformantes positivos para la PCR de
colonias fueron verificados mediante análisis de la secuencia de
nucleótidos. Uno de los clones que contenía una secuencia como la
esperada basándose en la estrategia de colonias fue seleccionado y
denominado pET5669.
Se transformó el plásmido pET5669 en
BL21Star(DE3)pLysSrare. La cepa resultante se sometió
a ensayo en busca de la producción de proteína recombinante como se
ha descrito antes. Las muestras del cultivo inducido y las muestras
de control se analizaron mediante electroforesis en gel de
SDS-PAGE (Fig. 2A). Se observó una banda de
proteína clara de aproximadamente 27 kDa en la muestra que había
sido tomada después de 3 horas de inducción (Fig. 2A, calle 3) en
comparación con la muestra no inducida (Fig. 2A, calle 2).
Las mismas muestras también fueron analizadas
mediante transferencia western utilizando el suero de cerdo y
pollo. Se observó una reacción con la proteína de 27 kD utilizando
el suero de cerdo que había sido sensibilizado oralmente con
células de L. intracellularis purificadas (Fig 2B, calle 3),
y con suero anti-L. intracellularis de pollo (Fig 2C, calle
3).
Conclusión: el componente de la vacuna de
27 kD pudo ser expresado satisfactoriamente en grandes cantidades y
en efecto es claramente reconocido tanto por el suero anti-L.
intracellularis de cerdo sensibilizado oralmente como por el
suero anti-L. intracellularis de pollo.
Se amplificó el gen 4423 utilizando el cebador
2171 (CATGCCATGGATGCTAGCTATGTGGTTTTGCC) y 2172
(CCGCTCGAGGTTATCTTCAACAGCCTTAG). En el procedimiento se
introdujeron un sitio 5' NcoI y uno 3' XhoI en el producto de la
PCR. El producto obtenido de la PCR fue digerido utilizando las
enzimas de restricción NcoI y XhoI. El producto de la PCR digerido
se ligó con posterioridad a pET22b que había sido cortado con las
mismas dos enzimas de restricción. La mezcla de ligación se
transformó en E. coli TOP10F y se incubó a 37ºC
durante la noche. Se verificó el plásmido correcto en los supuestos
transformantes, utilizando la PCR de colonias. Los insertos
plasmídicos de los transformantes positivos para la PCR de colonias
se verificaron mediante análisis de la secuencia de nucleótidos. Uno
de los clones que contenía una secuencia como la esperada basándose
en la estrategia de clonación fue seleccionado y denominado
pET4423.
Se transformó el plásmido pET4423 en BL21
Star(DE3)pLysSrare. La cepa resultante se sometió a
ensayo en busca de la producción de proteína recombinante como se
ha descrito antes. Las muestras del cultivo inducido y las muestras
de control se analizaron mediante electroforesis en gel de
SDS-PAGE (Fig. 3A).
Se observó una banda de proteína clara de
aproximadamente 62 kDa en la muestra que había sido tomada después
de 3 horas de inducción (Fig. 3A, calle 3) en comparación con la
muestra no inducida (Fig. 3A, calle 2).
\newpage
También se analizaron las mismas muestras
mediante transferencia western utilizando el suero de cerdo. Se
observó una reacción con la proteína de 62 kD utilizando el suero
del cerdo que había sido sensibilizado oralmente con células de
L. intracellularis purificadas (Fig 3B, calle 3).
Conclusión: el componente de la vacuna de
62 kD pudo ser expresado satisfactoriamente en grandes cantidades y
es reconocido en efecto por el suero anti-L. intracellularis
de cerdo sensiblizado oralmente.
Se amplificó el gen 3123 utilizando el cebador
2167 (CATGCCATGGATCAGTTTAATAAACCCTCTTT) y el 2168
(CCGCTCGAGGGTTCGACCATGTACAAACT). En el procedimiento se
introdujeron un sitio 5' NcoI y uno 3' XhoI en el producto de la
PCR. El producto obtenido de la PCR se digirió utilizando las
enzimas de restricción NcoI y XhoI. El producto de la PCR digerido
se ligó con posterioridad a pET22b que había sido cortado con las
mismas dos enzimas de restricción. La mezcla de ligación se
transformó en E. coli TOP10F y se incubó a 37ºC durante la
noche. Se verificó el plásmido correcto en los supuestos
transformantes, utilizando la PCR de colonias. Los insertos
plasmídicos, de los transformantes positivos para la PCR de
colonias, fueron verificados mediante análisis de la secuencia de
nucleótidos. Uno de los clones que contenía una secuencia como la
esperada basándose en la estrategia de clonación fue seleccionado y
denominado pET3123.
El plásmido pET3123 se transformó en BL21
Star(DE3)pLysSrare. La cepa resultante se sometió a
ensayo en busca de la producción de proteína recombinante como se
ha descrito antes. Las muestras del cultivo inducido y las muestras
de control se analizaron mediante electroforesis en gel de
SDS-PAGE (Fig. 4A). Se observó una banda de
proteína de aproximadamente 57 kDa en la muestra que había sido
tomada después de 3 horas de inducción (Fig. 4A, calle 3) en
comparación con la muestra no inducida (Fig. 4A, calle 2).
Las mismas muestras también fueron analizadas
mediante transferencia western utilizando el suero de cerdo. Se
observó una reacción con la proteína de 57 kD utilizando el suero
del cerdo que había sido sensibilizado oralmente con células de
L. intracellularis purificadas (Fig 4B, calle 3).
Conclusión: el componente de la vacuna de
57 kD pudo ser expresado satisfactoriamente en grandes cantidades y
en efecto es reconocido claramente por el suero anti-L.
intracellularis de cerdo vacunado con células completas.
Para la evaluación de las sugerencias de
ProteoExpert, se generaron moldes de ADN lineal por medio de PCR
utilizando RTS Linear Template Generation Set. Los cebadores
utilizados en estos experimentos también introdujeron una etiqueta
His6 en el extremo C para la detección y purificación.
Los moldes generados mediante PCR se examinaron
en busca del funcionamiento de la expresión utilizando el Kit RTS
100 E. coli HY. La secuencia de ADN sugerida que daba los
rendimientos más elevados fue construida utilizando los cebadores
5293A5 y 5293B (Tabla 1) de la primera PCR.
El constructo de expresión obtenido fue ligado
al vector pCR2.1 TOPO TA y el vector resultante fue transformado en
E. coli TOP10F e incubado a 37ºC durante la noche. Se
verificó el plásmido correcto en los supuestos transformantes,
utilizando la PCR de colonias. Los insertos plasmídicos, de los
transformantes positivos para la PCR de colonias, fueron
verificados mediante análisis de la secuencia de nucleótidos. Uno de
los clones que contenía una secuencia como la esperada basándose en
la estrategia de clonación fue seleccionado y denominado
pTOPO5293.
Se purificó el plásmido pTOPO5293 a partir de
E. coli TOP1 OF y se añadió la cantidad apropiada de ADN a
un vial de RTS500. Después de incubar conforme al protocolo del
fabricante, se tomó una muestra para el análisis utilizando la
electroforesis en gel de SDS-PAGE (Fig. 5A). Se
observó una banda de proteína clara de aproximadamente 74 kDa en la
muestra que había sido tomada después de 30 horas de inducción (Fig.
5A, calle 3) en comparación con la muestra de control (Fig. 5A,
calle 2).
Las mismas muestras también fueron analizadas
mediante transferencia western utilizando suero de cerdo. La
proteína de 74 kD fue reconocida específicamente por el suero de
cerdo policlonal utilizado en este experimento (Fig 5B, calle
3).
Conclusión: La proteína de 74 kD de
acuerdo con la invención puede ser expresada eficazmente y es
reconocida específicamente por el suero de cerdo policlonal. La
proteína de 74 kD es un componente importante de la vacuna para la
protección de los cerdos frente a la infección por Lawsonia
intracellularis.
Para la evaluación de las sugerencias de
ProteoExpert, se generaron moldes de ADN lineal por medio de PCR
utilizando RTS Linear Template Generation Set. Los cebadores
utilizados en estos experimentos también introdujeron una etiqueta
His_{6} en el extremo C para la detección y purificación. Los
moldes generados mediante PCR fueron examinados en busca de su
funcionamiento de expresión utilizando el Kit RTS 100 E. coli
HY. La secuencia de ADN sugerida que tenía los rendimientos más
elevados fue construida utilizando los cebadores 5464A5 y 5464B
(Tabla 2) en la primera PCR.
El constructo de expresión obtenido fue ligado
al vector pCR2.1 TOPO TA y el vector resultante fue transformado en
E. coli TOP10F e incubado a 37ºC durante la noche. Se
verificó el plásmido correcto en los supuestos transformantes,
utilizando la PCR de colonias. Los insertos plasmídicos de los
transformantes positivos para la PCR de colonias, fueron
verificados mediante análisis de la secuencia de nucleótidos. Uno de
los clones que contenía una secuencia como la esperada basándose en
la estrategia de clonación fue seleccionado y denominado
pTOPO5464.
\vskip1.000000\baselineskip
Se purificó el plásmido pTOPO5464 a partir de
E. coli TOP10F y se añadió la cantidad apropiada de ADN a un
vial RTS500. Después de incubar conforme al protocolo del
fabricante, se tomó una muestra para su análisis utilizando
electroforesis en gen de SDS-PAGE (Fig. 6A). Se
observó una banda de proteína clara de aproximadamente 44 kDa en la
muestra que había sido tomada después de 30 horas de inducción (Fig.
6A, calle 3) en comparación con la muestra de control (Fig. 6A,
calle 2). Utilizando el anticuerpo monoclonal
anti-polihistidina en la transferencia Western se
reveló una segunda proteína reactiva sugiriendo la presencia de un
sitio de inicio de la traducción interno en el gen o modificación
post-traduccional de la proteína madura (Fig 6B,
calle 3).
Se originó un suero policlonal contra la
proteína de 44 kD purificada. En el ELISA este suero reconocía
específicamente las células de L. intracellularis completas
purificadas que se utilizaban como material de recubrimiento con un
título razonable (>2log9). Se midieron títulos bajos utilizando
un suero de control (<2log3).
Conclusión: La proteína de 44 kD de
acuerdo con la invención puede ser expresada eficazmente.
Por otra parte, el antisuero originado contra la
proteína expresada es perfectamente capaz de reconocer las células
de Lawsonia intracellularis. La proteína de 44 kD es un
componente importante de la vacuna para la protección de los cerdos
contra la infección por Lawsonia intracellularis.
Para la evaluación de las sugerencias de
ProteoExpert, se generaron moldes de ADN lineal por medio de PCR
utilizando RTS Linear Template Generation Set. Los cebadores
utilizados en estos experimentos también introdujeron una etiqueta
His6 en el extremo C para su detección y purificación.
Las muestras generadas por PCR fueron examinadas
en busca de su funcionamiento de expresión utilizando el Kit RTS
100 E. coli HY. La secuencia de ADN sugerida que tenía los
rendimientos más elevados fue construida utilizando los cebadores
5473A2 y 5473B (Tabla 3) en la primera PCR.
El constructo de expresión obtenido fue ligado
al vector pCR2.1 TOPO TA y el vector resultante fue transformado en
E. coli TOP10F e incubado a 37ºC durante la noche. Se
verificó el plásmido correcto en los supuestos transformantes,
utilizando la PCR de colonias. Los insertos plasmídicos, de los
transformantes positivos para la PCR de colonias, fueron
verificados mediante análisis de la secuencia de nucleótidos. Uno de
los clones que contenía una secuencia como la esperada basándose en
la estrategia de clonación fue seleccionado y denominado
pTOPO5473.
Se purificó el plásmido pTOPO5473 a partir de
E. coli TOP10F y se añadió la cantidad apropiada de ADN a un
vial RTS500. Después de incubar conforme al protocolo del
fabricante, se tomó una muestra apara su análisis utilizando
electroforesis en gel de SDS-PAGE (Fig. 7A). No
obstante, fue imposible ver si la mezcla de reacción había
producido una proteína de alrededor de 40 kDa debido a que la mezcla
ya contiene una proteína dominante de alrededor de 40 kDa (Fig. 7A,
calle 2 y 4). La reacción RTS 500 que contenía pTOPO5473 y la mezcla
de control se cargaron en una columna IMAC y las proteínas que se
habían unido a la columna fueron analizadas utilizando
SDS-PAGE. Del gel parecía que eluía una proteína de
43 kDa desde la columna (Fig 7A, calle 5) que no estaba purificada
de la muestra de control (Fig. 7A, calle 3), de manera que la
proteína era expresada.
Las mismas muestras también fueron analizadas
mediante transferencia Western utilizando anti-suero
contra L. intracellularis derivado de cerdo y derivado de
pollo. Se observó una reacción con la proteína de 43 kD tanto
utilizando suero de cerdos vacunados con bacterias L.
intracellularis (Fig 7B, calle 5) como pollos (Fig 7C, calle
5).
Conclusión: La proteína de 43 kD de
acuerdo con la invención puede ser expresada eficazmente. Por otra
parte, el antisuero originado contra las células de Lawsonia
intracellularis tanto de pollos como de cerdos reconoce la
proteína expresada. La proteína de 43 kD es un componente importante
de la vacuna para la protección de cerdos contra la infección por
Lawsonia intracellularis.
Para la evaluación de las sugerencias de
ProteoExpert, se generaron moldes de ADN lineal por medio de la PCR
utilizando RTS Linear Template Generation Set. Los cebadores
utilizados en estos experimentos también introducían una etiqueta
His_{6} en el extremo C para la detección y purificación. Los
moldes generados mediante PCR fueron examinados en busca de su
funcionamiento de expresión utilizando el Kit RTS 100 E. coli
HY. La secuencia de ADN sugerida que tenía los rendimientos más
elevados fue construida utilizando los cebadores 4320A8 y 4320B
(Tabla 4) en la primera PCR.
El constructo de expresión obtenido se ligó al
vector pCR2.1 TOPO TA y el vector resultante se transformó en E.
coli TOP10F y se incubó a 37ºC durante la noche. Se verificó el
plásmido correcto en los supuestos transformantes, utilizando la
PCR de colonias. Los insertos plasmídicos, de los transformantes
positivos para la PCR de colonias, fueron verificados mediante
análisis de la secuencia de nucleótidos. Uno de los clones que
contenía una secuencia como la esperada basándose en la estrategia
de clonación fue seleccionado y denominado pTOPO4320.
Se purificó el plásmido pTOPO4320 a partir de
E. coli TOP10F y se añadió la cantidad apropiada de ADN a un
vial RTS500. Después de incubar conforme al protocolo del
fabricante, se tomó una muestra para su análisis utilizando
electroforesis en gel SDS-PAGE (Fig. 8A). Se
observaron dos bandas de proteína claras de aproximadamente 31 y 26
kDa en la muestra que había sido tomada después de 30 horas de
inducción (Fig. 8A, calle 3) en comparación con la muestra de
control (Fig. 8A, calle 2). Ambas bandas reaccionaron con un
anticuerpo monoclonal anti-polihistidina sugiriendo
la presencia de un sitio de inicio de la traducción interno en el
gen o una modificación post-traduccional de la
proteína madura (Fig 8B, calle 2). Utilizando sueros de cerdo y
pollo policlonales, se observaron títulos elevados (>2log10) en
el ELISA utilizando la proteína de 26/31 kD purificada y células de
L. intracellularis completas purificadas como material de
recubrimiento.
Utilizando IHC los autores de la presente
invención descubrieron que el anticuerpo
anti-proteína 26/31 policlonal reconocía
específicamente los enterocitos infectados con L.
intracellularis, mientras no se observaba reacción en
secciones cortadas del íleon de cerdos sanos. El suero utilizado en
IHC también proporcionó títulos elevados (>2loge15) frente a
células de L. intracellularis completas en el ELISA.
Conclusión: La proteína de 26/31 kD de
acuerdo con la invención puede ser expresada eficazmente. Por otra
parte, el antisuero originado contra las células de Lawsonia
intracellularis tanto de pollos como de cerdos reconoce la
proteína expresada en ensayos ELISA, donde los pocillos estaban
recubiertos con la proteína de 26/31 kD.
Por otra parte, el antisuero policlonal
originado contra la proteína de 26/31 kD reconocía específicamente
los enterocitos infectados con L. intracellularis.
La proteína de 26/31 kD es un componente
importante de la vacuna para la protección de cerdos contra la
infección por Lawsonia intracellularis.
El análisis de la secuencia del gen 2008 ha
revelado que el gen codificaba una supuesta señal
N-terminal y una estructura en barril beta
C-terminal. Ambas estructuras son conocidas por ser
muy hidrófobas. Debido a que se ha encontrado que el sistema RTS es
inadecuado para la expresión de proteínas que contienen grandes
regiones hidrófobas se decidió amplificar el gen 2008 desde la base
37 a la 1958. La expresión de este fragmento génico dio como
resultado una proteína de 63 kD. Para la evaluación de las
sugerencias de ProteoExpert, se generaron moldes de ADN lineal por
medio de PCR utilizando RTS Linear Template Generation Set. Los
cebadores utilizados en estos experimentos también introdujeron una
etiqueta His_{6} en el extremo C para la detección y
purificación. Los moldes generados mediante PCR se examinaron en
busca de su funcionamiento de expresión utilizando el Kit RTS 100
E. coli HY. La secuencia de ADN sugerida que daba los
rendimientos más elevados fue construida utilizando los cebadores
2008A6 y 2008B (Tabla 5) en la primera PCR.
El constructo de expresión lineal se ligó a un
vector pCR2.1 TOPO TA y el vector resultante se transformó en E.
coli TOP10F y se incubó a 37ºC durante la noche. Se verificó el
plásmido correcto en los supuestos transformantes, utilizando la
PCR de colonias. Los insertos plasmídicos de los transformantes
positivos para la PCR de colonias, fueron verificados mediante
análisis de la secuencia de nucleótidos. Uno de los clones que
contenía una secuencia como la esperada basándose en la estrategia
de clonación fue seleccionado y denominado pTOPO2008.
El plásmido pTOPO2008 fue purificado a partir de
E. coli TOP10F y la cantidad apropiada de ADN fue añadida a
un vial RTS500. Después de incubar conforme al protocolo del
fabricante, se tomó una muestra para su análisis utilizando
electroforesis en gel de SDS-PAGE (Fig. 9A). Se
observó una banda de proteína clara de aproximadamente 63 kDa en
una muestra que había sido tomada después de 30 horas de inducción
(Fig. 9A, calle 3) en comparación con la muestra de control (Fig.
9A, calle 2).
Las mismas muestras también se analizaron
mediante transferencia western utilizando antisuero tanto de cerdo
como de pollo. Se observó una fuerte reacción con la proteína de 63
kD utilizando el suero policlonal tanto de cerdo (Fig 9B, calle 3)
como de pollo (Fig 9C, calle 3).
Conclusion: el fragmento de 63 kD de la
proteína de acuerdo con la invención puede ser expresada
eficazmente. Por otra parte, el fragmento de la proteína de 63 kD
es fuertemente e igualmente bien reconocido por antisuero tanto de
pollo como de cerdo contra células de Lawsonia
intracellularis.
La proteína de 101 kD de acuerdo con la
invención y el fragmento de la proteína de 63 kD de la misma son
importantes componentes de la vacuna para la protección de los
cerdos contra la infección por Lawsonia intracellularis.
Ejemplo
2
El objetivo de este experimento fue someter a
ensayo la protección activa en cerdos inducida por la vacuna de
subunidades combi recombinante de Lawsonia Experimental que
comprende la proteína de 75 kD, 44 kD, 26/31 kD y 27 kD.
Vacuna combi de subunidades recombinantes
inactivadas en micro-Diluvac Forte.
Se incorporaron los siguientes antígenos:
proteína de 75 kD, 44 kD, 26/31 kD y 27 kD. La mezcla de antígenos
recombinantes se sometió a diálisis frente un tampón de diálisis
(Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM,
glutatión oxidado 1 mM, glutatión reducido 3 mM, CHAPS 10 mM) y se
concentró utilizando PEG 20.000. La concentración de todos los
antígenos se estimó a partir de gel NuPage teñido con Coomassie
utilizando el soporte lógico Gene Tools (Syngene, Cambridge,
Inglaterra). Los antígenos fueron formulados en la vacuna a una
concentración de 50 \mug de cada antígeno individual por ml.
Se utilizaron dieciocho cerdos SPF de 6 semanas
de edad (3 grupos de 6 cerdos) para el experimento. Los cerdos del
grupo 1 se vacunaron intramuscularmente (cuello) con 2 ml de vacuna
de subunidades combi recombinantes a T=0 y T=4s. El grupo 2 se dejó
como grupo de control de sensibilización no vacunado. El Grupo 3 era
un grupo de control de comportamiento no tratado.
A T=6s (12 semanas de edad) los grupos 1 y 2
fueron sensibilizados oralmente con mucosa infectada homogeneizada.
Con posterioridad todos los cerdos fueron observados diariamente en
busca de signos clínicos de Enteropatía Proliferativa Porcina (EPP)
durante 3 semanas.
A T=9s (15-semanas de edad)
todos los cerdos restantes se sometieron a eutanasia y se examinaron
post-mortem. Se examinaron los intestinos (íleon)
en busca de cambios macroscópicos típicos de infección por
Lawsonia intracellularis y se tomaron muestras para su
examen histológico.
Se preparó material de sensibilización raspando
la mucosa del íleon de casos de EPP confirmados. El material se
almacenó en lotes de 200 gramos a -20ºC hasta su uso adicional. Poco
antes de la sensibilización, se descongelaron 200 gramos de la
mucosa infectada y se mezclaron con 200 ml de solución salina
fisiológica. Esta mezcla se homogeneizó en un Omnimixer durante un
minuto a toda velocidad y después se diluyó adicionalmente con 400
ml de solución salina fisiológica (hasta 800 ml).
Los cerdos fueron asignados a 3 grupos de
tratamiento como se describe más abajo.
Los grupos 1 y 2 fueron sensibilizados oralmente
con 20 ml de inóculo de sensibilización a T=6s (12 semanas de
edad). El grupo 3 se dejó como grupo de control no tratado.
Todos los cerdos fueron sacrificados a T=9s (15
semanas de edad, 3 semanas después de la sensibilización) y
sometidos a examen post-mortem para evaluar la
eficacia de las diferentes vacunas.
De cada cerdo se tomó al menos una muestra del
íleon (si está presente de una zona afectada) para la histología.
La puntuación histológica de las muestras del íleon se basó en:
a) Presencia de bacterias L.
intracellularis en los portas: se realizó una tinción Warthin
Starry para la detección de bacterias.
b) Evaluación de lesiones histológicas en portas
con Hematoxilina/Eosina: Se puntuó la gravedad de las lesiones
específicas de L. intracellularis (proliferación
glandular adenomatosa).
Se describen otras lesiones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se registraron todos los datos de cada cerdo
individualmente. La puntuación media por grupo se calculó para los
parámetros de la puntuación histopatológica y de la puntuación
post-mortem. Partiendo de la puntuación del grupo
de control de la sensibilización, se calculó el % de protección en
los vacunados. Las puntuaciones de la patología se compararon
utilizando el test U de Mann-Whitney para dos
muestras.
Los resultados post-mortem tras
la sensibilización se muestran en la Tabla 1. Las puntuaciones
histopatológicas mostraron resultados de corte claros. Solamente
los cerdos de control mostraron las lesiones histopatológicas
típicas (=proliferación glandular adenomatosa difusa grave) y
solamente los enterocitos de los portas de la histopatología de
control contenían numerosas bacterias Lawsonia, mientras no
se observaban bacterias en los enterocitos de los animales
vacunados y no sensibilizados.
El examen post-mortem e
histopatológico dio resultados de corte claros. La vacuna de
subunidades sometida a ensayo parecía inducir una protección de
100% frente a las lesiones histopatológicas y la aparición de
Lawsonia en los enterocitos (=frente a la infección).
Fig. 1. Análisis de la expresión en exceso del
gen 5074 de Lawsonia intracellularis en Escherichia
coli
BL21STAR/pLysSRARE mediante SDS-PAGE (A) y transferencia Western con suero de cerdo policlonal (B) suero de pollo policlonal (C). Calle 1, marcador de peso molecular; calle 2, pET5074 T=0; calle 3, pET5074 T=3. Las flechas indican la localización del producto de expresión.
BL21STAR/pLysSRARE mediante SDS-PAGE (A) y transferencia Western con suero de cerdo policlonal (B) suero de pollo policlonal (C). Calle 1, marcador de peso molecular; calle 2, pET5074 T=0; calle 3, pET5074 T=3. Las flechas indican la localización del producto de expresión.
Fig. 2. Análisis de la expresión en exceso del
gen 5669 de Lawsonia intracellularis en Escherichia
coli
BL21STAR/pLysSRARE mediante SDS-PAGE (A) y transferencia Western con suero de cerdo policlonal (B) y suero de pollo policlonal (C). Calle 1, marcador de peso molecular; calle 2, pET5669 T=0; calle 3, pET5669 T=3. Las flechas indican la localización del producto de expresión.
BL21STAR/pLysSRARE mediante SDS-PAGE (A) y transferencia Western con suero de cerdo policlonal (B) y suero de pollo policlonal (C). Calle 1, marcador de peso molecular; calle 2, pET5669 T=0; calle 3, pET5669 T=3. Las flechas indican la localización del producto de expresión.
Fig. 3. Análisis de la expresión en exceso del
gen 4423 de Lawsonia intracellularis en Escherichia
coli
BL21STAR/pLysSRARE mediante SDS-PAGE (A) y transferencia Western con suero de cerdo policlonal (B). Calle 1, marcador de peso molecular; calle 2, pET4423 T=0; calle 3, pET4423 T=3. Las flechas indican la localización del producto de expresión.
BL21STAR/pLysSRARE mediante SDS-PAGE (A) y transferencia Western con suero de cerdo policlonal (B). Calle 1, marcador de peso molecular; calle 2, pET4423 T=0; calle 3, pET4423 T=3. Las flechas indican la localización del producto de expresión.
Fig. 4. Análisis de la expresión en exceso del
gen 3123 de Lawsonia intracellularis en Escherichia
coli
BL21STAR/pLysSRARE mediante SDS-PAGE (A) y transferencia Western con suero de cerdo policlonal (B). Calle 1, marcador de peso molecular; calle 2, pET3123 T=0; calle 3, pET3123 T=3. Las flechas indican la localización del producto de expresión.
BL21STAR/pLysSRARE mediante SDS-PAGE (A) y transferencia Western con suero de cerdo policlonal (B). Calle 1, marcador de peso molecular; calle 2, pET3123 T=0; calle 3, pET3123 T=3. Las flechas indican la localización del producto de expresión.
Fig. 5. Análisis de la expresión del gen 5293 de
Lawsonia intracellularis utilizando la tecnología RTS500
mediante SDS-PAGE (A) y transferencia Western con
suero de cerdo policlonal (B). Calle 1, marcador de peso molecular;
calle 2, control; calle 3, pET5293.
Las flechas indican la localización del producto
de expresión.
Fig. 6. Análisis de la expresión del gen 5464 de
Lawsonia intracellularis utilizando la tecnología RTS500
mediante SDS-PAGE (A) y transferencia Western
utilizando anticuerpo monoclonal anti-polihistidina
(B). Calle 1, marcador de peso molecular; calle 2, control; calle
3, pET5464.
Las flechas indican la localización del producto
de expresión.
Fig. 7. Análisis de la expresión del gen 5473 de
Lawsonia intracellularis utilizando la tecnología RTS500
mediante SDS-PAGE (A) y transferencia Western con
suero de cerdo policlonal (B) y suero de pollo policlonal (C).
Calle 1, marcador de peso molecular; calle 2, control; calle 3,
muestra de control de la purificación por IMAC de la fracción de
proteína unida; calle 4 pET5473; calle 5, purificación por IMAC de
la fracción de proteína unida pET5473.
Las flechas indican la localización del producto
de expresión.
Fig. 8. Análisis de la expresión del gen 4320 de
Lawsonia intracellularis utilizando la tecnología RTS5 00
mediante SDS-PAGE (A) y transferencia Western
utilizando anticuerpo monoclonal anti-polihistidina
(B). Calle 1, marcador de peso molecular; calle 2, control; calle
3, pET4320
Las flechas indican la localización del producto
de expresión.
Fig. 9. Análisis de la expresión del gen 2008 de
Lawsonia intracellularis utilizando la tecnología RTS500
mediante SDS-PAGE (A) y transferencia Western con
suero de cerdo policlonal (B). Calle 1, marcador de peso molecular;
calle 2, control; calle 3, pET2008
Las flechas indican la localización del producto
de expresión.
<110> AKZO Nobel N.V.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacunas de subunidades de
Lawsonia intracellularis.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2004.001
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2088
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(2085)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 690
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 751
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(715)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1715
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(1677)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 547
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1564
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (41)..(1522)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 493
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Lawsonia intracellularis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 2096
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(2096)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 694
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1200
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(1200)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 395
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(1222)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 894
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)..(894)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 293
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lawsonia intracellularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2848
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Lawsonia intracellularis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)..(2848)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
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<210> 18
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<211> 939
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<212> PRT
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<213> Lawsonia intracellularis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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Claims (15)
1. Un ácido nucleico que codifica una proteína
de Lawsonia intracellularis de 75 kD o una porción de dicho
ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha
proteína, teniendo dicho ácido nucleico o dicha porción del mismo
una homología de al menos 90% con un ácido nucleico que tiene una
secuencia como se representa en el SEQ ID NO: 1.
2. Un fragmento de ADN que comprende un ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Una molécula de ADN recombinante que
comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o un
fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, bajo el control
de un promotor conectado funcionalmente.
4. Un portador recombinante vivo que comprende
un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, un fragmento
de ADN de acuerdo con la reivindicación 2 o una molécula de ADN
recombinante de acuerdo con la reivindicación 3.
5. Una célula anfitriona que comprende un ácido
nucleico de acuerdo con las reivindicación 1, un fragmento de ADN
de acuerdo con la reivindicación 2, una molécula de ADN recombinante
de acuerdo con la reivindicación 3 o un portador recombinante vivo
de acuerdo con la reivindicación 4.
6. Una proteína de Lawsonia
intracellularis de 75 kD, comprendiendo dicha proteína una
secuencia de aminoácidos que es homóloga al menos en 90% a la
secuencia de aminoácidos representada en el SEQ ID NO: 2, o un
fragmento inmunogénico de dicha proteína.
7. Una proteína de Lawsonia
intracellularis de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso
en una vacuna.
8. El uso de una proteína de Lawsonia
intracellularis de acuerdo con la reivindicación 6 para la
fabricación de una vacuna para combatir las infecciones por
Lawsonia intracellularis.
9. Una vacuna para combatir las infecciones por
Lawsonia intracellularis, caracterizada porque
comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, un
fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 2, una molécula
de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, un portador
recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 4, una célula
anfitriona de acuerdo con la reivindicación 5 o una proteína de
acuerdo con la reivindicación 6, y un portador farmacéuticamente
aceptable.
10. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
9, caracterizada porque comprende un coadyuvante.
11. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
9 o 10, caracterizada porque comprende un antígeno adicional
derivado de un virus o un microorganismo patogénico para cerdos o
información genética que codifica dicho antígeno.
12. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
11, caracterizada porque dicho virus o microorganismo
patogénico para cerdos se selecciona del grupo del virus de la
Pseudorrabia, virus de la Influenza porcina, Parvovirus porcino,
virus de la Gastroenteritis transmisible, Rotavirus, Escherichia
coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica,
Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida,
Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae, Brachyspira
hyodysenteriae y Actinobacillus pleuropneumoniae.
13. Una vacuna para combatir las infecciones por
Lawsonia intracellularis, caracterizada porque
comprende anticuerpos contra una proteína de acuerdo con la
reivindicación 6.
14. Un ensayo diagnóstico para la detección de
anticuerpos contra Lawsonia intracellularis,
caracterizado porque dicho ensayo comprende una proteína o
uno de sus fragmentos como se define en la reivindicación 6.
15. Un ensayo diagnóstico para la detección de
material antigénico de Lawsonia intracellularis,
caracterizado porque dicho ensayo comprende anticuerpos
contra una proteína o uno de sus fragmentos como se define en la
reivindicación 6.
Applications Claiming Priority (17)
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| EP04100208 | 2004-01-22 | ||
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| EP04100209 | 2004-01-22 | ||
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| EP04100211 | 2004-01-22 | ||
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| EP04100210 | 2004-01-22 | ||
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| ES2346064T3 true ES2346064T3 (es) | 2010-10-08 |
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ID=42760674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05701094T Expired - Lifetime ES2346064T3 (es) | 2004-01-22 | 2005-01-18 | Vacuna subunidad de lawsonia intracellularis. |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| ES (1) | ES2346064T3 (es) |
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2005
- 2005-01-18 ES ES05701094T patent/ES2346064T3/es not_active Expired - Lifetime
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