ES2208519T3 - Vacuna con el helicobacter felis. - Google Patents
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Abstract
Un ácido nucleico aislado que codifica dos polipéptidos de las subunidades de un complejo de ureasa tal como el expresado por Helicobacter felis, teniendo dicha secuencia de ácido nucleico una homología de al menos el 85% con la SEC ID NUM: 1, o una parte de la misma que codifica al menos un fragmento inmunogénico de una de dichas subunidades, teniendo dicha parte una longitud de al menos 40, preferiblemente 45, más preferiblemente 50 nucleótidos.
Description
Vacuna con el Helicobacter felis.
La presente invención se refiere a polipéptidos
de la subunidad ureasa de Helicobacter novedosos, a las
secuencias de ácido nucleico que codifican estos polipéptidos, a los
polipéptidos para su uso en vacunas y al uso en la fabricación de
las mismas, a vacunas que comprenden dichos polipéptidos y a los
métodos para la preparación de semejantes vacunas. Adicionalmente,
la invención hace referencia a métodos de diagnóstico para la
detección de las secuencias de ácido nucleico, los polipéptidos y
los anticuerpos contra los polipéptidos.
Algunas especies de Helicobacter son la
causa de patogénesis del epitelio gástrico. Helicobater
pylori, y en menor grado H. heilmannii son conocidos por
causar gastritis, un factor importante en el desarrollo de las
úlceras pépticas y el linfoma gástrico en humanos. Helicobacter
felis es muy probablemente la causa de infecciones gástricas
tanto en gatos como en perros. Con el fin de sobrevivir al medio
altamente ácido del estómago, los miembros de la familia
Helicobacter producen una ureasa que es capaz de hidrolizar
la urea presente el jugo gástrico. Esta hidrolización deja libre una
cantidad de NH_{4}OH que basta para neutralizar el medio de la
bacteria. Se sabe, que la ureasa juega un papel en la colonización
de la bacteria así como en su patogénesis.
Los genes que codifican la ureasa han sido
descritas y secuenciados tanto para Helicobacter pylori
(Labigne y col., J. Bacteriol. 173: 1920-1931
(1.991)) como para Helicobacter felis (Ferrero y col.,
Molec. Microbiol. 9, 323-333 (1.993)). De los siete
genes implicados en la expresión y la secreción de la ureasa, sólo
dos genes codifican las dos subunidades estructurales ureasa A y B
de la enzima ureasa; ureA y ureB. Estos dos polipéptidos forman un
polipéptido complejo que tiene actividad ureasa.
Se han elaborado vacunas contra las infecciones
causadas tanto por H. pylory como felis y han sido el
sujeto inter alia de las Solicitudes de Patente
Internacionales WO 94/09823 y WO 96/34624. Se han realizado
numerosos intentos, para utilizar la ureasa de H. pylori
como componente de vacuna para la protección de gatos contra la
infección por H. felis. Aunque de hecho se puede obtener un
cierto nivel de protección, los resultados están lejos del 100% de
protección que sería deseable. A partir de los experimentos
animales publicados hasta ahora queda claro que un número
significativo de animales vacunados con H. pylori no está
protegido en absoluto contra la posterior sensibilización con H.
felis. La protección de gatos vacunados con ureasa purificada o
bien de H. felis o bien pylori no ha sido descrita.
Vacunar a los gatos con productos de la lisis celular completa de
H. felis podría ser factible teóricamente pero no es una
opción práctica. Esto es porque a pesar de los muchos intentos para
mejorar, H. felis es difícil de desarrollar. Existe una
clara necesidad de una vacuna eficaz, basada en componentes
homólogos, y está claro que la ureasa de H. felis conocida no
confiere una protección total.
Un objeto de la presente invención es inter
alia proporcionar una ureasa de H. felis que sea capaz
de inducir protección contra la infección por Helicobacter
felis en perros y gatos. Se ha descubierto sorprendentemente
ahora, que en H. felis existe una segunda ureasa, de la cual
los genes que codifican las subunidades estructurales comparten
solamente una baja homología con los genes ureA y ureB de H.
felis conocidos. La ureasa novedosa se denomina ureasaXY, con
el fin de diferenciarla de la proteasa AB conocida. La ureasa
recién encontrada ha sido descubierta en H. felis, y no está
presente en H. pylori.
La estructura genética global de los genes que
codifican las dos subunidades de la ureasa estructurales, ureX y
ureY es comparable a la de UreA y B conocidos en H. felis y
H. pylori. La homología de la secuencia es sin embargo
sorprendentemente baja. Se encontró aún más sorprendentemente, que
la homología entre los genes ureA y B y los genes novedosos ureX e
Y en una única cepa de H. felis es incluso notablemente
inferior que la homología entre los diferentes genes ureA y B de las
diversas especies de Helicobacter.
En la Tabla 1a, 1b y 1c se muestra la comparación
del gen ureX e Y y los polipéptidos que codifican de cinco especies
diferentes de Helicobacter felis, con los genes ureA y B y
los polipéptidos de Helicobacter felis, pylori y
heilmannii.
El nivel de homología de los genes que codifican
las subunidades X e Y de la ureasa estructural novedosa y los
polipéptidos que codifican en comparación con el de los genes ureA
y B conocidos y las subunidades polipeptídicas se presenta en la
tabla 1a, b y c.
| Molécula de referencia: ureX CS1 de H. felis | a.a. | n.a. |
| ureA de H. felis | 50% | 57% |
| ureA de H.pylori | 52% | 60% |
| ureA de H. heilmannii | 54% | 62% |
| ureX cepa Kukka de H. felis | 100% | 91% |
| ureX cepa Ds4 de H. felis | 99% | 91% |
| ureX cepa 2301 de H. felis | 99% | 91% |
| ureX cepa 390 de H. felis | 99% | 91% |
| Molécula de referencia: ureY CS1 de H. felis | a.a. | n.a. |
| ureB de H. felis | 73% | 71% |
| ureB de H.pylori | 73% | 70% |
| ureB de H. heilmannii | 74% | 71% |
| ureY cepa Kukka de H. felis | 99% | 95% |
| ureY cepa Ds4 de H. felis | 98% | 94% |
| ureY cepa 2301 de H. felis | 99% | 95% |
| Molécula de referencia: ureXY CS1 de H. felis | n.a. |
| ureAB de H. felis | 67% |
| ureAB de H.pylori | 67% |
| ureAB de H. heilmannii | 68% |
| ureXY cepa Kukka de H. felis | 94% |
| ureXY cepa Ds4 de H. felis | 94% |
| ureXY cepa 2301 de H. felis | 94% |
De ese modo una realización de la invención hace
referencia a los ácidos nucleicos que codifican las subunidades X e
Y de la ureasa novedosa.
En primer lugar, esta realización de la invención
hace referencia a los ácidos nucleicos que codifican dos subunidades
de un complejo de ureasa tal como el expresado por Helicobacter
felis, que tienen una homología de al menos el 85% con la SEC
ID Núm: 1, o a partes del mismo con una longitud de al menos 40,
preferiblemente 45, más preferiblemente 50 nucleótidos que codifican
al menos un fragmento inmunogénico de una de las subunidades.
Fragmentos aún más largos, con una longitud de al menos 55, 60 ó 70
ácidos nucleicos son aún más preferidos en este orden.
Una forma preferida de esta realización hace
referencia a los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de
la subunidad X de la ureasa o el polipéptido de la subunidad Y de
la ureasa y que tienen una homología de al menos el 85% con la SEC
ID Núm: 1, o a partes del mismo con una longitud de al menos 40,
preferiblemente 45, más preferiblemente 50 nucleótidos que
codifican al menos un fragmento inmunogénico del polipéptido de la
subunidad X de la ureasa o el polipéptido de la subunidad Y de la
ureasa. Méramente como ejemplo: la secuencia de ácido nucléico que
codifica la subunidad X de la ureasa de la cepa CS1 de
Helicobacter felis empieza en la posición 206/207/208 (GTG)
(ver figura 1a(1)) y termina en la posición 884/885/886
(TAA). La secuencia de ácido nucleico que codifica la subunidad Y
de la ureasa de la cepa CS1 de Helicobacter felis empieza en
la posición 897/898/899 (ATG) y termina en la posición
2.601/2.602/2.603 (TAG).
Fragmentos aún más largos, con una longitud de al
menos 55, 60 ó 70 nucleótidos son aún más preferidos en este
orden.
Una forma más preferida de esta realización hace
referencia a los ácidos nucleicos que tienen una homología con la
SEC ID Núm: 1 de al menos el 90%, preferiblemente el 94%, más
preferiblemente el 97%.
La determinación de los porcentajes de homología
se realizó con el programa de ordenador Align Plus de Windows,
asequible de Scientific and Educational Software, P.O. Box 72045
Durham, NC 27722-2045, USA. Los ajustes utilizados
para las comparaciones de ácidos nucleicos se indican en las
figuras 1a, 1b y 1c.
Puesto que la presente invención describe
secuencias de ácido nucleico que codifican las subunidades de la
ureasa de Helicobacter felis estructurales novedosas, es
posible ahora por primera vez obtener semejantes polipéptidos en
cantidades suficientes. Esto se puede realizar, v.g. utilizando
sistemas de expresión para expresar los genes que codifican las
subunidades UreX y UreY.
Por lo tanto, en una realización más preferida,
la invención hace referencia a fragmentos de ADN que comprenden una
secuencia de ácido nucleico según la invención. Semejantes
fragmentos de ADN pueden ser v.g. plásmidos, en los cuales se clona
un ácido nucleico según la invención. Semejantes fragmentos de ADN
son útiles v.g. para intensificar la cantidad de ADN para su uso
como sonda, como se describe más abajo.
Un requerimiento esencial para la expresión de la
secuencia de ácido nucleico es un promotor adecuado conectado
operablemente al ácido nucleico. Resulta obvio para los expertos en
la técnica que la elección de un promotor abarca cualquier promotor
eucariota, procariota o viral capaz de dirigir la transcripción del
gen en células utilizadas como células huésped para la expresión de
proteínas.
Por lo tanto, una forma incluso más preferida de
esta realización hace referencia a una molécula de ADN recombinante
que comprende un fragmento de ADN o una secuencia de ácido nucleico
según la invención que está colocada bajo el control de un promotor
conectado funcionalmente. Esto se puede obtener v.g. por medio de
mecanismos de biología molecular normalizados. (Maniatis/Sambrook
Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual, 1.989. ISBN
0-87969-309-6).
Los promotores conectados funcionalmente son
promotores que son capaces de controlar la transcripción de las
secuencias de ácido nucleico a las cuales están conectados.
Cuando las células huésped son bacterias, entre
las secuencias de control útiles que pueden ser utilizadas se
incluyen el promotor y el operador Trp (Goeddel, y col., Nucl.
Acids Res., 8, 4057,1980); el promotor y operador lac (Chang, y
col., Nature, 275, 615, 1.978); el promotor de la proteína de la
membrana externa (Nakamura, K. e Inouge, M., EMBO J., 1,
771-775, 1.982); los promotores y operadores del
bacteriófago lambda (Remaut, E. y col., Nucl. Acids Res., 11,
4677-4688, 1.983); el promotor y el operador de la
\alpha-amilasa (B. subtilis), las
secuencias de terminación y otras secuencias intensificadoras y de
control de la expresión compatibles con la célula huésped
seleccionada.
Cuando la célula huésped es levadura, entre las
secuencias de control útiles se incluyen, v.g. el factor de
emparejamiento \alpha. Para las células de insectos se pueden
utilizar los promotores de la polihedrina o p10 de baculovirus
(Smith, G.E. y col., Mol. Cel. Biol. 3, 2156-65,
1.983). Cuando la célula huésped es de origen mamífero entre las
secuencias de control de la expresión útiles ilustrativas se
incluyen el promotor de SV-40 (Berman, P.W. y col.,
Science, 222, 524-527, 1.983) o el promotor de la
metalotioneína (Brinster, R.L., Nature, 296, 39-42,
1.982) o un promotor de choque térmico (Voellmy y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1.985).
Los sistemas de expresión de células bacterianas,
de levaduras, fúngicas, de insectos y de mamíferos son sistemas
utilizados muy frecuentemente. Tales sistemas son bien conocidos en
la técnica y son asequibles generalmente, v.g. comercialmente por
medio de Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto,
California 94303-4607, USA. Después de estos
sistemas de expresión, son sistemas de expresión muy atractivos los
sistemas de expresión basados en parásitos. Tales sistemas se
describen v.g. en la Solicitud de Patente Francesa con el Número de
Publicación 2.714.074, y en US NTIS Publication Núm. US 08/043109
(Hoffman, S. y Rogers, W.: Fecha de Publicación 1 de Diciembre de
1.993).
Así, una forma aún más preferida de esta
realización de la invención hace referencia a microorganismos
Portadores Recombinantes Vivos (LRC en sus siglas en inglés) que
comprenden un gen que codifica el polipéptido UreX o UreY o un
fragmento inmunogénico del mismo según la invención. Tales
microorganismos son v.g. bacterias y virus. Estos microorganismos
LRC son microorganismos en los cuales ha sido clonada información
genética adicional, en este caso un gen que codifica el polipéptido
UreX o UreY o un fragmento inmunogénico del mismo según la
invención. Los animales infectados con semejantes LRC producirán una
respuesta inmunogénica no sólo contra los inmunógenos del vector,
sino también contra las partes inmunogénicas del polipéptido o los
polipéptidos para los cuales el código genético es adicionalmente
clonado en el LRC, v.g. el gen UreX o Y.
Como ejemplo de los LRC bacterianos, se pueden
utilizar atractivamente cepas de Salmonella atenuadas conocidas en
la técnica.
Han descrito parásitos portadores recombinantes
vivos inter alia Vermeulen, A.N. (Int. Journ. Parasitol.
28:1121-1130 (1.998)).
Asimismo, se pueden utilizar virus LRC como modo
de transporte de la secuencia de ácido nucleico en una célula diana.
Los virus portadores recombinantes vivos también son denominados
virus vectores. El sitio de integración del gen que codifica un
polipéptido UreX o Y puede ser un sitio de un gen viral que no sea
esencial para el virus, o un sitio en una región intergénica. Los
virus utilizados a menudo como vectores son los virus Vaccinia
(Panicali y col; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79; 4927 (1.982); los
Herpesvirus (E.P.A. 0473210A2), y los Retrovirus (Valerio, D. y
col., en Baum, S.J., Dicke, K.A., Lotzova, E, y Pluznik, D.H.
(Eds.), Experimental Haematology today - 1988. Springer Verlag,
Nueva York: págs. 92-99 (1.989)).
La técnica de la recombinación homóloga in
vivo, bien conocida en la técnica, puede ser utilizada para
introducir una secuencia de ácido nucleico recombinante en el
genoma de una bacteria, parásito o virus de elección, capaz de
inducir la expresión de la secuencia de ácido nucleico insertada
según la invención en el animal huésped.
Finalmente otra forma de esta realización de la
invención hace referencia a una célula huésped que comprende un
ácido nucleico que codifica un polipéptido según la invención, un
fragmento de ADN que comprende semejante secuencia de ácido
nucleico bajo el control de un promotor conectado funcionalmente.
Esta forma también hace referencia a una célula huésped que contiene
un portador recombinante vivo que contiene una molécula de ácido
nucleico que codifica un polipéptido UreX o Y o un fragmento
inmunogénico del mismo según la invención.
Una célula huésped puede ser una célula de origen
bacteriano, v.g. Escherichia coli, Bacillus subtilis
y especies de Lactobacillus, combinada con plásmidos basados
en bacterias como pBR322, o vectores de expresión bacterianos como
pGEX, o con bacteriófagos. La célula huésped también puede ser de
origen eucariótico, v.g. células de levadura combinadas con
moléculas vectoras específicas de levaduras, o células eucariotas
superiores como células de insectos (Luckow y col:
Bio-technology 6: 47-55 (1.988))
combinadas con baculovirus vectores o recombinantes, células
vegetales combinadas v.g. con vectores basados en el plásmido Ti o
vectores virales vegetales (Barton, K.A. y col., Cell 32: 1033
(1.983), células de mamífero como células Hela, células de Ovario
de Hámster Chino (CHO) o células de Riñón Felino de Crandell,
también con virus vectores o recombinantes apropiados.
Otra realización de la invención hace referencia
a los polipéptidos codificados por las secuencias de ácidos
nucleicos, es decir, la subunidad ureasa X y la subunidad ureasa Y
y a los fragmentos inmunogénicos de las mismas según la
invención.
Por lo tanto, esta realización de la invención
hace referencia al polipéptido ureasa X de Helicobacter
felis, teniendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos
que es homóloga a la SEC ID Núm. 2 al menos en un 85% o a un
fragmento inmunogénico de ese polipéptido con una longitud de al
menos 40 aminoácidos que es capaz de inducir una respuesta inmune
contra la ureasaXY. Preferiblemente, la longitud de ese fragmento
es de más de 40 aminoácidos, más preferiblemente al menos 45, 50,
55, 60 ó 70 aminoácidos en ese orden o preferencia.
Preferiblemente esta realización hace referencia
a semejantes polipéptidos que tienen una homología de secuencia de
al menos el 90%, más preferiblemente el 94%, aún más
preferiblemente una homología del 97% con la SEC ID Núm. 2, o un
fragmento inmunogénico de ese polipéptido con una longitud de al
menos 40 aminoácidos, más preferiblemente al menos 45, 50, 55, 60 ó
70 aminoácidos en ese orden o preferencia que sea capaz de inducir
una respuesta inmune contra la ureasaXY.
Esta realización de la invención también hace
referencia al polipéptido ureasa Y de Helicobacter felis,
teniendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que es
homóloga a la SEC ID Núm. 3 al menos en un 85% o a un fragmento
inmunogénico de ese polipéptido con una longitud de al menos 40
aminoácidos que es capaz de inducir una respuesta inmune contra la
ureasaXY. Preferiblemente, la longitud de ese fragmento es de más de
40 aminoácidos, más preferiblemente al menos 45, 50, 55, 60 ó 70
aminoácidos en ese orden o preferencia.
Preferiblemente esta realización hace referencia
a semejantes polipéptidos que tienen una homología de secuencia de
al menos el 90%, más preferiblemente el 94%, aún más
preferiblemente una homología del 97% con la SEC ID Núm. 3, o un
fragmento inmunogénico de ese polipéptido con una longitud de al
menos 40 aminoácidos, más preferiblemente al menos 45, 50, 55, 60 ó
70 aminoácidos en ese orden o preferencia que sea capaz de inducir
una respuesta inmune contra la ureasaXY.
Como para la comparación de las secuencias de
nucleótidos, la comparación entre las diversas secuencias de
aminoácidos se realizó utilizando Align Plus para Windows,
asequible de Scientific and Educational Software, P.O. Box 72045
Durham, NC 27722-2045, USA. Los ajustes utilizados
para las comparaciones de aminoácidos se indican en las figuras 1a,
1b y 1c.
Se entenderá que, para los polipéptidos concretos
abarcados aquí, pueden existir variaciones naturales entre las cepas
de Helicobacter felis individuales. Estas variaciones pueden
ser demostradas por una o varias diferencias de aminoácidos en la
secuencia global o mediante deleciones, sustituciones, inserciones,
inversiones o adiciones de uno o varios aminoácidos en dicha
secuencia. Las sustituciones de aminoácidos que no alteran
esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas, han sido
descritas, v.g. por Neurath y col., en "The Proteins" Academic
Press Nueva York (1.979). Las reposiciones de aminoácidos entre
aminoácidos relacionados o las reposiciones que se han producido
frecuentemente en la evolución son, inter alia, Ser/Ala,
Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (ver Dayhof, M.D., Atlas of
protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found.,
Washington D.C., 1.978, vol. 5, supl. 3). Entre otras sustituciones
de aminoácidos se incluyen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr,
Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val y
Ala/Glu. Basándose en esta información, Lipman y Pearson
desarrollaron un método para una comparación de proteínas rápida y
sensible (Science, 227, 1435-1441, 1.985) y
determinar la similitud funcional entre proteínas homólogas.
Semejantes sustituciones de aminoácidos de las realizaciones
ejemplares de esta invención, así como las variaciones que tienen
deleciones y/o inserciones en ellas están dentro del alcance de la
invención con tal que los polipéptidos resultantes conserven su
inmunorreactividad. Así, se considera que las variaciones que no
influían esencialmente en la inmunogenicidad del polipéptido en
comparación con el polipéptido de tipo salvaje representado por la
SEC ID Núm. 2 ó 3 están dentro del alcance de la invención. Se
considera que aquellas variaciones de la secuencia de aminoácidos de
una cierta subunidad estructural X o Y según la invención que
todavía proporcionan un polipéptido capaz de inducir una respuesta
inmune contra la infección por H. felis o al menos contra
las manifestaciones clínicas de la infección "no influyen
esencialmente en la inmunogenicidad".
Cuando se utiliza un polipéptido v.g. con fines
de vacunación o para aumentar los anticuerpos, no es necesario sin
embargo utilizar el polipéptido completo. También es posible
utilizar un fragmento de ese polipéptido que sea capaz, tal cual o
acoplado a un portador tal como v.g. KLH, de inducir una respuesta
inmune contra ese polipéptido, un denominado fragmento
inmunogénico. Se entiende que un "fragmento inmunogénico" es
un fragmento del polipéptido en toda su longitud de la subunidad X o
Y estructural, que todavía conserva su capacidad para inducir una
respuesta inmune en el huésped, es decir, comprende un epítopo para
las células B o T. En este momento, se encuentra disponible una
variedad de mecanismos para identificar fácilmente fragmentos de ADN
que codifican fragmentos antigénicos (determinantes). El método
descrito por Geysen y col. (Solicitud de Patente WO 84/03564,
Solicitud de Patente WO 86/06487, Patente de los Estados Unidos NR.
4.833.092, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3998-4002
(1.984), J. Imm. Meth. 102, 259-274 (1.987), el
denominado método PEPSCAN es un método fácil de realizar, rápido y
bien establecido para la detección de epítopos; las regiones
inmunológicamente importantes del polipéptido. El método se utiliza
en todo el mundo y como tal es bien conocido por los expertos en la
técnica. Este método (empírico) es especialmente adecuado para la
detección de epítopos para las células B. Asimismo, dada la
secuencia del gen que codifica cualquier proteína, los algoritmos
de ordenador son capaces de diseñar fragmentos polipeptídicos
específicos como epítopos inmunológicamente importantes basándose
en su coincidencia secuencial y/o estructural con los epítopos que
son conocidos ahora. La determinación de estas regiones está basada
en una combinación de los criterios de carácter hidrófilo según
Hopp y Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 38248-3828
(1.981)), y los aspectos de la estructura secundaria según Chou y
Fasman (Advances in Enzimology 47: 45-148 (1.987) y
Patentes de los Estados Unidos 4.554.101). Los epítopos para las
células T pueden ser pronosticados del mismo modo a partir de la
secuencia por ordenador con la ayuda del criterio de carácter
anfífilo de Berzofsky (Science 235, 1059-1062
(1.987) y solicitud de Patente de los Estados Unidos NTIS US
07/005.885). Se encuentra una visión de conjunto condensada en:
Shan Lu en los principios comunes: Tibtech 9:
238-242 (1.991), Good y col. en epítopos para la
Malaria; Science 235: 1059-1062 (1.987), Lu para
una revisión; Vaccines 10: 3-7 (1.992), Berzowsky
para los epítopos de VIH; The FASEB Journal
5:2412-2418 (1.991).
Las vacunas v.g. contra Helicobacter
pylori, que tiene sólo una ureasa, pueden ser elaboradas
basándose en esta ureasa, como se ha descrito antes. En el caso
específico de Helicobacter felis sin embargo una vacuna
basada en las subunidades estructurales de Helicobacter
felis conocidas ureA y B no es capaz de proporcionar suficiente
protección contra la infección por Helicobacter felis: la
inmunidad contra las subunidades estructurales ureA y B
supuestamente no neutraliza la actividad ureasa de las subunidades
estructurales heterólogas recién encontradas UreX e Y.
Por lo tanto, las vacunas para la protección de
los animales contra la infección por Helicobacter felis
deben estar dirigidas al menos contra la ureasa novedosa XY.
Por lo tanto, una forma de otra realización más
de la invención hace referencia a vacunas capaces de proteger a los
mamíferos tales como perros y gatos contra la infección por
Helicobacter felis, que comprende la subunidad estructural X
o Y, preferiblemente X e Y, más preferiblemente X, Y, A y B, o un
fragmento inmunogénico de X y/o Y según la invención junto con un
portador farmacéuticamente aceptable.
Otra realización más de la presente invención
hace referencia a los polipéptidos según la invención para su uso en
una vacuna.
Otra realización más hace referencia al uso del
polipéptido según la invención en la fabricación de una vacuna para
combatir las infecciones por Helicobacter felis.
Una manera de elaborar una vacuna según la
invención es mediante purificación bioquímica del polipéptido
ureasaXY o sus subunidades a partir de un cultivo bacteriano. Esto
se puede realizar, v.g. mediante centrifugación de la bacteria, y el
uso de columnas de filtración en gel para la separación del
polipéptido ureasa o sus subunidades de los otros componentes. La
purificación adicional se puede realizar v.g. mediante
precipitación selectiva en sulfato de amonio, seguido de
centrifugación, electroforesis en gel y, si se desea, separación de
las subunidades de la ureasa AB y disolución del sedimento en un
tampón adecuado. Esta es no obstante una manera de elaborar una
vacuna que lleva tiempo, especialmente cuando es difícil hacer
crecer Helicobacter felis.
Por lo tanto es mucho más conveniente utilizar
los productos de expresión de los genes que codifican las
subunidades de la ureasa X e Y según la invención en vacunas. Tales
vacunas pueden ser elaboradas fácilmente mezclando la ureasaXY o una
subunidad UreX o Y o un fragmento inmunológico de la misma según la
invención con un portador farmacéuticamente aceptable como se
describe más abajo.
Además las vacunas pueden comprender portadores
recombinantes vivos como se ha descrito antes, capaces de expresar
la ureasaXY, una subunidad UreX o Y o fragmentos inmunogénicos de
las mismas según la invención. Tales vacunas, v.g. basadas en un
portador de Salmonella o un portador viral que infecta el epitelio
gástrico tienen la ventaja sobre las vacunas de subunidades de que
imitan mejor el modo natural de infección de Helicobacter
felis.
Por otra parte, la
auto-propagación es una ventaja puesto que sólo son
necesarias pequeñas cantidades del portador recombinante para la
inmunización.
Las vacunas descritas antes contribuyen todas a
la vacunación activa, es decir, el sistema inmune del huésped es
disparado por el polipéptido UreX y/o Y o fragmentos inmunogénicos
del mismo, para elaborar anticuerpos contra estos polipéptidos.
Alternativamente, tales anticuerpos pueden ser
originados v.g. en conejos o pueden ser obtenidos de líneas
celulares productoras de anticuerpos como se describe más abajo.
Tales anticuerpos pueden ser administrados después al animal
huésped. Este método de vacunación, vacunación pasiva, es la
vacunación de elección cuando un animal ya está infectado, y no hay
tiempo para permitir que la respuesta inmune natural se
desencadene. Asimismo es el método preferido para vacunar animales
inmunocomprometidos. Los anticuerpos administrados contra UreX o
UreY de Helicobacter pueden en estos casos unirse
directamente a la ureasa excretada por la bacteria. Esto tiene la
ventaja de que la actividad ureasa es eliminada directamente, dando
como resultado de ese modo una acidulación del medio y una
disminución o detención del crecimiento de Helicobacter.
Por lo tanto, una forma distinta de esta
realización de la invención hace referencia a vacunas que
comprenden anticuerpos contra los polipéptidos ureasa X de
Helicobacter felis que tienen una secuencia de aminoácidos
que es homóloga al menos en un 85% a la SEC ID Núm. 2 o fragmentos
inmunogénicos de ese polipéptido con una longitud de al menos 40
aminoácidos que sean capaces de inducir una respuesta inmune contra
la ureasaXY o anticuerpos contra los polipéptidos ureasa Y de
Helicobacter felis que tengan una secuencia de aminoácidos
que sea homóloga al menos en un 85% a la SEC ID Núm. 3 o fragmentos
inmunogénicos de ese polipéptido con una longitud de al menos 40
aminoácidos que sean capaces de inducir una respuesta inmune contra
la ureasaXY.
Las vacunas también pueden estar basadas en
células huésped como se ha descrito antes, que comprenden ureasaXY,
una subunidad UreX o UreY o fragmentos inmunogénicos de las mismas
según la invención.
Un modo alternativo y eficaz de vacunación es la
vacunación directa con ADN que codifique el antígeno relevante. La
vacunación directa con ADN que codifique polipéptidos ha sido
lograda para muchos polipéptidos diferentes. (Como revisan v.g.
Donnelly y col., The Immunologist 2:20-26
(1.993)).
Este modo de vacunación es muy atractivo para la
vacunación tanto de gatos como de perros contra la infección por
Helicobacter felis.
Por lo tanto, otras formas más de esta
realización de la invención hacen referencia a vacunas que
comprenden ácidos nucleicos que codifican un polipéptido según la
invención o fragmentos inmunogénicos del mismo según la invención, y
a las vacunas que comprenden fragmentos de ADN que comprenden
semejantes secuencias de ácido nucleico.
Otras formas más de esta invención hacen
referencia a vacunas que comprenden moléculas de ADN recombinante
según la invención.
Las vacunas de ADN pueden ser fácilmente
administradas por medio de la aplicación intradérmica v.g.
utilizando un inyector sin aguja. Este modo de administración
libera el ADN directamente en las células del animal que va a ser
vacunado. La cantidad de ADN en el intervalo en microgramos entre 1
y 100 \mug proporciona muy buenos resultados.
En una realización adicional, la vacuna según la
presente invención también comprende antígenos para otros organismos
y virus patógenos de perros o gatos, o información genética que
codifique semejantes antígenos. Tales organismos y virus son v.g.
el virus de la Peritonitis Infecciosa Felina, el virus de la
Inmunodeficiencia Felina, el Parvovirus Canino y Felino, el virus
del Moquillo, Adenovirus, Calicivirus, Bordetella
bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Leptospira interrogans,
Chlamydia y Bartonella henseli.
Asimismo, la presente invención hace referencia a
los polipéptidos según la invención para su uso en la fabricación de
una vacuna para combatir las infecciones por Helicobacter
felis.
Todas las vacunas según la presente invención
comprenden un portador farmacéuticamente aceptable. Un portador
farmacéuticamente aceptable puede ser v.g. agua estéril o solución
salina fisiológica estéril. En una forma más compleja el portador
puede ser v.g. un tampón.
Las vacunas según la presente invención también
pueden contener en una presentación preferida un coadyuvante. Los
coadyuvantes en general comprenden sustancias que refuerzan la
respuesta inmune del huésped de una manera no específica. Se
conocen numerosos coadyuvantes diferentes en la técnica. Los
ejemplos de los coadyuvantes son el coadyuvante Completo e
Incompleto de Freund, la vitamina E, los polímeros de bloques no
iónicos, los muramildipéptidos, Quill A®, aceite mineral v.g.
Bayol® o Markol®, aceite vegetal, y Carbopol® (un homopolímero), o
Diluvac® Forte. La vacuna también puede comprender un denominado
"vehículo". Un vehículo es un compuesto al que se adhiere el
polipéptido, sin estar unido covalentemente a él. A menudo los
compuestos vehículo utilizados son v.g. hidróxido, fosfato u óxido
de aluminio, sílice, Kaolín, y Bentonita.
Una forma especial de semejante vehículo, en la
cual el antígeno está parcialmente embebido en el vehículo, es el
denominado ISCOM (EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380).
Además, la vacuna puede comprender uno o más
compuestos tensioactivos adecuados o emulsionantes, v.g. Span o
Tween.
A menudo, la vacuna se mezcla con
estabilizadores, v.g. para proteger los polipéptidos propensos a la
degradación de ser degradados, para intensificar la vida media en
el estante de la vacuna, o para mejorar la eficacia de la
liofilización. Los estabilizadores útiles son inter alia SPGA
(Bovarnik y col.; J. Bacteriology 59:509 (1.950)), los
carbohidratos v.g. sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa,
dextrano o glucosa, las proteínas tales como albúmina o caseína o
los productos de la degradación de las mismas, y los tampones,
tales como los fosfatos de metales alcalinos.
Además, la vacuna puede ser suspendida en un
diluyente fisiológicamente aceptable. Ni que decir tiene, que otros
modos de coadyuvar, añadir compuestos vehículo o diluyentes,
emulsionar o estabilizar un polipéptido también se incorporan en la
presente invención.
Las vacunas según la invención que comprenden el
polipéptido de la subunidad UreX o UreY pueden ser administradas
adecuadamente en cantidades que oscilan entre 1 y 100 microgramos,
aunque en principio se pueden utilizar dosis más pequeñas. Una
dosis que exceda de 100 microgramos será, aunque inmunológicamente
muy adecuada, menos atractiva por razones comerciales.
Las vacunas basadas en portadores recombinantes
atenuados, tales como los virus y bacterias LRC descritos antes
pueden ser administradas en dosis muy inferiores, debido a que se
multiplican durante la infección. Por lo tanto, las cantidades muy
adecuadas oscilarían entre 10^{3} y 10^{9} CFU/PFU para
bacterias y virus respectivamente.
Se pueden aplicar muchos modos de administración.
La aplicación intranasal es un modo de administración de la vacuna
utilizado frecuentemente. La aplicación oral es también un modo
atractivo de administración, debido a que la infección está
localizada a menudo en el tracto digestivo superior. Un modo de
administración oral preferido es el envasado de la vacuna en
cápsulas, conocido y utilizado frecuentemente en la técnica, que
sólo se disgregan en el medio altamente ácido del estómago.
Asimismo, la vacuna podría ser mezclada con compuestos conocidos en
la técnica para intensificar temporalmente el pH del estómago.
La aplicación sistémica también es adecuada, v.g.
mediante la aplicación intramuscular de la vacuna. Si se sigue esta
ruta, se adaptan bien los procedimientos normalizados conocidos en
la técnica para la aplicación sistémica.
Otra realización de la invención hace referencia
a ensayos de diagnóstico para la detección de la infección por
H. felis. Se sabe que numerosas especies de
Helicobacter tales como H. bizzozeronii, H. felis y
H. salomonis son capaces de infectar tanto gatos como
perros. De estos tres, H. felis es la especie de la que se
sospecha que causa la mayor parte de la patología, aunque a menudo
es superada por H. bizzozeronii y H. salomonis. Así,
una rápida y correcta diagnosis de la enfermedad, tanto en gatos
como en perros, causada por Helicobacter felis es
importante. Sin embargo ha sido muy difícil discriminar entre estas
tres especies debido al hecho de que están muy íntimamente
relacionadas.
Por lo tanto otro objetivo de esta invención es
proporcionar tales herramientas de diagnóstico adecuadas para
discriminar H. felis de otras especies de
Helicobacter.
Basándose en los polipéptidos de ureasa novedosos
y en los genes que codifican los polipéptidos de ureasa, se
desarrollaron al menos tres ensayos de diagnóstico diferentes,
específicamente adecuados para la discriminación de H. felis
de otros miembros de la familia Helicobacter:
1) un ensayo de diagnóstico basado en la
presencia o ausencia de ADN que codifica las subunidades
estructurales UreX y UreY específicas
2) un ensayo de diagnóstico basado en la
detección de anticuerpos contra las subunidades estructurales UreX y
UreY específicas
3) un ensayo de diagnóstico basado en la
detección de un material antigénico de las subunidades
estructurales UreX y UreY específicas
Un ensayo de diagnóstico según 1) se basa v.g. en
la reacción del ADN bacteriano aislado del animal que va a ser
sometido a ensayo, con sondas específicas o cebadores para PCR
basados en la secuencia de los genes ureX e Y. Si el ADN de H.
felis está presente en el animal, este se unirá específicamente
v.g. a los cebadores de la PCR específicos de ureX o Y y con
posterioridad será amplificado en la reacción de la PCR. El producto
de la reacción de la PCR puede ser detectado fácilmente en una
electroforesis en gel del ADN.
El ADN puede ser aislado muy fácilmente de los
microorganismos presentes en escobillones del tracto digestivo
superior o en la saliva del animal que va a ser sometido a ensayo.
Se pueden seleccionar cebadores específicos de muchas regiones de
las secuencias codificadoras de ureX y ureY y la secuencia
intergénica no codificadora que difiere en la secuencia de las
regiones comparables de las secuencias codificadoras de ureAB. Uno
de los muchos algoritmos adecuados para la determinación del nivel
de homología de los ácidos nucleicos y para la comparación de
secuencias de nucleótidos en general es conocido como "Clustal
W". Ha sido descrito por Thompson y col., en Nucleic Acid
Research 22: 4673-4680 (1.994). El programa puede
ser encontrado en numerosos sitios de Internet. Una alternativa más
reciente para este programa es v.g. Align Plus para Windows,
asequible de Scientific and Educational Software, P.O. Box 72045
Durham, NC 27722-2045, USA.
Como resulta de la figura 1, se puede encontrar
un gran número de posibles cebadores para PCR que son específicos
para ureX o ureY. Un par de sondas para PCR extremadamente
específico está formado v.g. por la secuencia localizada en 5'
CATGCACTTTTTGAAAAAAGA (SEC ID NUM: 16) y la secuencia localizada en
3' TATGGTGGTCTTCTCT (SEC ID NUM: 17). Por supuesto son adecuadas
muchas otras secuencias que son específicas para ureX o Y o la
región intergénica. Los libros de texto sobre la PCR normalizados
proporcionan métodos para determinar la idoneidad de las sondas
para reacciones de PCR selectivas con ureX o ureY. Las técnicas de
PCR se describen extensamente en (Dieffenbach & Dreksler; PCR
primers, a laboratory manual. ISBN
0-87969-447-5
(1.995)).
Otro ensayo se basa en el ADN tras el crecimiento
del material bacteriano obtenido del escobillón, seguido de la
clásica purificación de ADN mediante hibridación clásica con
fragmentos de ADN específicos de ureXY marcados radiactivamente o
con color. Dada la muy escasa homología entre las regiones
codificadoras de ureXY y las regiones codificadoras de AB tanto de
H. felis como de otras especies de Helicobacter, la
hibridación indica inequívocamente la presencia o ausencia de H.
felis. Tanto las reacciones de PCR como las reacciones de
hibridación son bien conocidas en la técnica y se describen
inter alia en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. y col.
Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN
0-87969-309-6).
La detección selectiva con cebadores de PCR o con
una hibridación clásica con fragmentos de ADN específicos de ureXY
se puede realizar con fragmentos que son preferiblemente cortos,
pero por razones prácticas consta de un tramo de al menos 10
nucleótidos contiguos de la SEC ID NUM: 1. Esta claro que para los
experimentos de hibridación se necesita seleccionar una sonda que
tenga una homología superior con la SEC ID NUM: 1, que con las
secuencias que codifican la subunidad ureA o ureB de
Helicobacter. Semejante sonda puede ser fácilmente
seleccionada con la ayuda del programa Align Plus para Windows o el
programa Clustal W comentados antes. En un experimento de
hibridación comparativo el ADN que va a ser diagnosticado puede ser
sometido a ensayo v.g. después de ADN de H. pylori. La sonda
según la invención, que tiene una homología superior con la SEC ID
NUM:1 que con el gen que codifica ureAB, se uniría mejor al ADN de
H. felis (si estuviera presente en la muestra) que al ADN de
otra especie de Helicobacter revelando de ese modo
específicamente la presencia de ADN de H. felis en la
muestra que se va a someter a ensayo. Las secuencias SEC ID NUM: 16
ó 17 mencionadas antes son meros ejemplos de sondas muy adecuadas
para el marcaje y posterior uso en los análisis de hibridación
específicos de H. felis descritos.
Así, una realización de la invención hace
referencia a un ensayo de diagnóstico para la detección de ADN que
codifica los polipéptidos de la subunidad UreX y UreY de
Helicobacter específicos. Semejante ensayo comprende una
secuencia de ácido nucleico según la invención o un fragmento de la
misma que es específica para el ADN que codifica UreX o UreY o la
región intergénica entre UreX y UreY. Un fragmento que es
específico para ese ADN es un fragmento que se une mejor al ADN que
codifica UreX y UReY o la región intergénica entre UreX y UreY que
al ADN que codifica UreA y UreB o la región intergénica entre UreA
y UreB.
Los métodos para la detección del ADN de
Helicobacter felis comprende la hibridación del ADN que se va
a someter a ensayo con ADN de UreX o Y, o reacción PCR del ADN que
se va a someter a ensayo con sondas específicas de ADN de UreX o
Y.
Un ensayo de diagnóstico según 2) para la
detección de anticuerpos de Helicobacter felis en suero
puede ser v.g. un simple ensayo sandwich-ELISA en
el que las paredes de los pocillos de una placa de ELISA son
revestidas con los polipéptidos de las subunidades UreX o UreY
purificados o los fragmentos antigénicos de los mismos según la
invención. Un método para la detección de semejantes anticuerpos es
v.g. la incubación del polipéptido UreX o Y purificado con suero de
los animales que van a ser sometidos a ensayo, seguido v.g. de
incubación con un anticuerpo marcado contra el anticuerpo de
mamífero relevante. Después una reacción de color puede revelar la
presencia o ausencia de anticuerpos contra ureasa XY de
Helicobacter felis. Dependiendo de los anticuerpos marcados
utilizados, la selectividad de este sistema puede ser mejorada
mediante pre-incubación del suero que se va a
someter a ensayo con ureasa AB seguido de centrifugación del
producto precipitado, con el fin de evitar las reacciones no
específicas de XY.
Si los fragmentos antigénicos de las subunidades
estructurales UreX o UreY según la invención se utilizan para el
revestimiento, esta etapa de pre-incubación puede
ser omitida.
Otro ejemplo de un sistema de ensayo de
diagnóstico es v.g. la incubación de una transferencia Western que
comprende el polipéptido UreX o UreY o un fragmento antigénico del
mismo según la invención, con suero de los mamíferos que se vayan a
someter a ensayo, seguido de análisis de la transferencia. Las
subunidades estructurales UreX y UreY purificadas o los fragmentos
antigénicos de las mismas según la invención, adecuados para
revestir las placas de ELISA o para la transferencia Western pueden
ser obtenidos fácilmente mediante la expresión de los genes ureX y
ureY como describió Ferrero para ureA y ureB (Ferrero y col.,
Molec. Microbiol. 9, 323-333 (1.993)).
Asimismo, la invención hace referencia a los
métodos para la detección en suero de los anticuerpos contra los
anticuerpos de Helicobacter felis en los que el método
comprende la incubación del suero con el polipéptido UreX o UreY o
un fragmento antigénico del mismo según la invención.
Un ensayo de diagnóstico según 3) basado en la
detección de material antigénico de las subunidades estructurales
UreX y UreY específicas de los antígenos de Helicobacter
felis y por lo tanto adecuado para la detección de la infección
por Helicobacter felis también puede ser v.g. un ensayo
ELISA normalizado. En un ejemplo de semejante ensayo las paredes de
los pocillos de una placa ELISA son revestidas con anticuerpos
dirigidos contra las subunidades estructurales UreX y UreY
específicas de Helicobacter felis. El material antigénico
que se va a someter a ensayo puede ser pre-incubado
si es necesario con anticuerpos contra UreA y B. Esto dejará sin
cubrir los epítopos específicos de UreX e Y y por lo tanto las
especies de Helicobacter pre-incubadas se
unirán a la placa de ELISA sólo si éste comprende UreX o Y, es
decir, si es específicamente Helicobacter felis.
El uso de anticuerpos monoclonales específicos
para UreX o Y y que no reaccionan con UreA o B son los anticuerpos
preferidos en semejantes ensayos, debido a que hacen superflua la
etapa de pre-incubación. Semejantes anticuerpos
monoclonales pueden ser obtenidos fácilmente inmunizando ratones
endogámicos con fragmentos inmunizadores de UreX o Y según la
invención, mediante mecanismos también conocidos en la técnica (Ver
más abajo: Kohler y Milstein).
Los polipéptidos o fragmentos inmunogénicos de
los mismos según la invención expresados como se ha caracterizado
antes pueden ser utilizados para producir anticuerpos, que pueden
ser policlonales, monoespecíficos o monoclonales (o derivados de los
mismos). Si se desean anticuerpos policlonales, los mecanismos para
producir y procesar suero policlonal son bien conocidos en la
técnica (v.g. Mayer y Walter, eds. Immunochemical Methods in
Cell and Molecular Biology, Academic Press, Londres, 1.987).
Los anticuerpos monoclonales, reactivos contra el
polipéptido según la invención (o variantes o fragmentos del mismo)
según la presente invención, pueden ser preparados inmunizando
ratones endogámicos mediante mecanismos también conocidos en la
técnica (Kohler y Milstein, Nature, 256,
495-497, 1.975).
Finalmente, la invención hace referencia a los
métodos para la detección de material antigénico de Helicobacter
felis en los cuales el método comprende la incubación de suero,
tejido o fluidos corporales con anticuerpos contra el polipéptido
UreX o UreY o un fragmento antigénico del mismo según la
invención.
Los genes ureX y ureY de las cepa CS1 de
Helicobacter felis fueron clonados en forma de un operón en
el vector de expresión T7 de E. coli, pET3a, como sigue:
Para la apropiada expresión de las proteínas UreX
e Y en pET3a (Novagen, 601 Science Drive, Madison WI, USA) los genes
fueron clonados en forma de un fragmento de ADN
NdeI-BamHI en lo sitios NdeI-BamHI
de este vector. El operón de ureasaXY contiene un sitio NdeI interno
que fue mutado mediante PCR de
solapamiento-extensión de 2 fragmentos de PCR. Para
este fin se amplificaron dos fragmentos de la PCR (los productos 5'
y 3') utilizando ADN cromosómico de H. felis CS1 como molde.
El producto de la PCR 5' contenía el gen ureX completo y la primera
parte del gen ureY. El cebador directo contenía un sitio de
restricción NdeI y el codón de iniciación de ureX
(GGAGTAACATATGAAACTCACA CCCAAAGAGC) (SEC ID NUM: 18), y el cebador
inverso contiene una mutación puntual (CACACCC ACGACCATGTGAGGGCTTAC)
(SEC ID NUM: 19). El segundo, producto de la PCR 3' constaba del
extremo 3' del gen ureY. Este cebador directo es complementario al
cebador inverso del primer producto de la PCR y también contiene la
misma mutación puntual (GTAAGCC CTCACATGGTCGTGGGTGTG) (SEC ID NUM:
20), y el cebador inverso contenía un sitio de restricción BamHI
justo aguas abajo del codón de terminación del gen ureY (CGAATT
CGGATCCTAGAAGAAAGTGTA GCGCTGG) (SEC ID NUM: 21). La mutación de los
cebadores complementarios se realiza para suprimir el sitio N de I
interno de ureY, remplaza CATATG (His-Met)
por CACATG (His-Met).
Tras la amplificación de ambos productos de la
PCR, se obtuvo el operón completo mediante PCR de
solapamiento-extensión con el cebador directo de
ureX y el cebador inverso de ureY utilizando ambos productos de la
PCR como moldes. El producto de la PCR resultante fue clonado en
PCR-bluntII-TOPO (Invitrogen, P.O.
Box 2312, 9704 CH Groningen, Holanda) y transformado en células
E. coli TOP10F' (Invitrogen). Los clones positivos fueron
aislados y los genes ureasaXY fueron subclonados en pET3a con
NdeI-BamHI. El plásmido obtenido fue denominado
pUreXY-1 y fue transformado en la cepa de expresión
HMS174(DE3)/pLysS (Novagen).
Los genes ureX y ureY de pUreXY fueron expresados
en HMS174(DE3)/pLysS como sigue: un cultivo realizado durante
la noche se diluyó 1/100 en TB Amp^{100} Cam^{25}; este cultivo
fue incubado durante 3 horas a 37ºC a 200 rpm; el cultivo fue
inducido añadiendo 1 mM de IPTG e incubado durante otras 3 horas a
37ºC a 200 rpm. La inducción se realizó dos veces, una vez a pequeña
escala y una vez a gran escala.
Las muestras inducidas fueron analizadas en un
gel SDS-PAGE (fig. 2). Como se puede observar
claramente a partir de la calle 9, la expresión de UreX y UreY,
cuando es inducida proporciona las dos subunidades estructurales en
forma de bandas de polipéptido con un peso molecular de 25 kDa para
la subunidad UreX y de 62 kDa para la subunidad UreY.
Figura 1a: comparación de la secuencia de ácido
nucleico que codifica UreX e Y, incluyendo la región no codificadora
corta que une mediante puente las dos secuencias codificadoras, de
las especies CS1, Kukka, Ds4, 2301 y 390 de Helicobacter
felis con la secuencia de ácido nucleico que codifica UreA y B,
incluyendo una región no codificadora corta que une mediante puente
las dos secuencias codificadoras, de Helicobacter felis, pylori
y heilmannii.
Figura 1b: Comparación de la secuencia de
aminoácidos de UreX de las especies CS1, Kukka, Ds4, 2301 y 390 de
Helicobacter felis con la secuencia de aminoácidos que
codifica UreB de Helicobacter felis, pylori y
heilmannii.
Figura 1c: Comparación de la secuencia de
aminoácidos de UreY de las especies CS1, Kukka, Ds4, 2301 y 390 de
Helicobacter felis con la secuencia de aminoácidos que
codifica UreB de Helicobacter felis, pylori y
heilmannii.
Figura 2: Gel de poliacrilamida de los productos
de expresión UreX y UreY
| Calle 7 | : | Marcador de intervalo amplio de Biorad |
| Calle 8 | : | Cultivo celular completo antes de la inducción (cultivo a pequeña escala) |
| Calle 9 | : | Cultivo celular completo después de la inducción (cultivo a pequeña escala) |
| Calle 10 | : | Cultivo celular completo después de la inducción (cultivo a gran escala) |
| Calle 11 | : | Sobrenadante después de la inducción cultivo a gran escala) |
| Calle 12 | : | Marcador coloreado previamente de Biorad |
\vskip0.333000\baselineskip
<110> AKZO Nobel N.V.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<120> Helicobacter vaccine
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<130> Degoedesenquenties
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<140>
\vskip0.333000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
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<160> 21
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<211> 2883
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<212> DNA
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<213> Helicobacter felis
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<220>
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<221> CDS
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<222> (206)..(886)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (897)..(2603)
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<211> 226
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<212> PRT
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<213> Helicobacter felis
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<400> 2
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<213> Helicobacter felis
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<211> 2405
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<212> DNA
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<213> Helicobacter felis
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(681)
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<221> CDS
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<222> (692)..(2398)
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<220>
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<212> DNA
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<213> Helicobacter felis
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<220>
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<221> CDS
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<222> (2)..(682)
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<222> (693)..(2399)
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<211> 2452
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<212> DNA
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<213> Helicobacter felis
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<220>
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<221> CDS
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<222> (48)..(728)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (739)..(2445)
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<213> Helicobacter felis
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\hfill27
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\hskip-.1em\dddseqskipcgaattcgga tcctagaaga aagtgtagcg ctgg
\hfill34
Claims (22)
1. Un ácido nucleico aislado que codifica dos
polipéptidos de las subunidades de un complejo de ureasa tal como el
expresado por Helicobacter felis, teniendo dicha secuencia de
ácido nucleico una homología de al menos el 85% con la SEC ID NUM:
1, o una parte de la misma que codifica al menos un fragmento
inmunogénico de una de dichas subunidades, teniendo dicha parte una
longitud de al menos 40, preferiblemente 45, más preferiblemente 50
nucleótidos.
2. Un ácido nucleico aislado según la
reivindicación 1, caracterizado porque codifica el
polipéptido de la subunidad ureasa X o el polipéptido de la
subunidad ureasa Y.
3. Un ácido nucleico aislado según la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la secuencia tiene
una homología de al menos el 90%, preferiblemente el 94%, más
preferiblemente el 97% con la SEC ID NUM: 1.
4. Un fragmento de ADN que comprende un ácido
nucleico según las reivindicaciones 1-3.
5. Una molécula de ADN recombinante que comprende
un ácido nucleico según las reivindicaciones 1-3 o
un fragmento de ADN según la reivindicación 4, bajo el control de un
promotor conectado funcionalmente.
6. Un portador recombinante vivo que comprende
una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 5.
7. Una célula huésped que comprende un ácido
nucleico según las reivindicaciones 1-3, un
fragmento de ADN según la reivindicación 4, una molécula de ADN
recombinante según la reivindicación 5 o un portador recombinante
vivo según la reivindicación 6.
8. El polipéptido de la subunidad ureasa X de
Helicobacter felis, teniendo dicho polipéptido una secuencia
de aminoácidos que es homóloga al menos en un 85% a la SEC ID NUM: 2
o un fragmento inmunogénico de dicho polipéptido con una longitud de
al menos 40, preferiblemente 45, más preferiblemente 50 aminoácidos,
siendo dicho fragmento inmunogénico capaz de inducir una respuesta
inmune contra la ureasaXY.
9. El polipéptido según la reivindicación 8, que
tiene una homología de secuencia de al menos el 90%, preferiblemente
el 94%, más preferiblemente una homología del 97% con la SEC ID NUM:
2, o un fragmento inmunogénico de dicho polipéptido capaz de inducir
una respuesta inmune contra la ureasaXY.
10. El polipéptido de la subunidad ureasa Y de
Helicobacter felis, teniendo dicho polipéptido una secuencia
de aminoácidos que es homóloga al menos en un 85% a la SEC ID NUM: 3
o un fragmento inmunogénico de dicho polipéptido con una longitud de
al menos 40, preferiblemente 45, más preferiblemente 50 aminoácidos,
siendo dicho fragmento inmunogénico capaz de inducir una respuesta
inmune contra la ureasaXY.
11. El polipéptido según la reivindicación 10,
que tiene una homología de secuencia de al menos el 90%,
preferiblemente el 94%, más preferiblemente una homología del 97%
con la SEC ID NUM: 3, o un fragmento inmunogénico de dicho
polipéptido capaz de inducir una respuesta inmune contra la
ureasaXY.
12. Un polipéptido según las reivindicaciones
8-11 para su uso en una vacuna.
13. El uso de un polipéptido según las
reivindicaciones 8-11 en la fabricación de una
vacuna para combatir las infecciones por Helicobacter
felis.
14. Una vacuna para combatir las infecciones por
Helicobacter felis, caracterizada porque comprende un
ácido nucleico según las reivindicaciones 1-3, un
fragmento de ADN según la reivindicación 4, una molécula de ADN
recombinante según la reivindicación 5, un portador recombinante
vivo según la reivindicación 6, una célula huésped según la
reivindicación 7 o un polipéptido según las reivindicaciones
8-11, y un portador farmacéuticamente aceptable.
15. Una vacuna según la reivindicación 14,
caracterizada porque comprende un coadyuvante.
16. Una vacuna según la reivindicación 14 ó 15,
caracterizada porque comprende un antígeno adicional derivado
de un virus o un microorganismo patógeno para mamíferos o
información genética que codifica dicho antígeno.
17. Una vacuna según la reivindicación 16,
caracterizada porque dicho virus o microorganismo patógeno
para mamíferos se selecciona del grupo del virus de la Peritonitis
Infecciosa Felina, el virus de la Inmunodeficiencia Felina, el
Parvovirus Canino y Felino, el virus del Moquillo, Adenovirus,
Calicivirus, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi,
Leptospira interrogans, Chlamydia y Bartonella
henseli.
18. Una vacuna para combatir las infecciones por
Helicobacter felis, caracterizada porque comprende
anticuerpos contra un polipéptido según las reivindicaciones
8-11.
19. Un método para la preparación de una vacuna
según las reivindicaciones 14-17, comprendiendo
dicho método mezclar un polipéptido según las reivindicaciones
8-11 y un portador farmacéuticamente aceptable.
20. Un ensayo de diagnóstico para la detección de
ADN específico de Helicobacter felis caracterizado
porque el ensayo comprende un ácido nucleico o una parte del mismo
según las reivindicaciones 1-3.
21. Un ensayo de diagnóstico para la detección de
anticuerpos contra Helicobacter felis, caracterizado
porque dicho ensayo comprende un polipéptido o un fragmento del
mismo como se describe en las reivindicaciones
8-11.
22. Un ensayo de diagnóstico para la detección de
material antigénico de Helicobacter felis,
caracterizado
porque dicho ensayo comprende anticuerpos contra un polipéptido o un fragmento del mismo como se describe en las reivindicaciones 8-11.
porque dicho ensayo comprende anticuerpos contra un polipéptido o un fragmento del mismo como se describe en las reivindicaciones 8-11.
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