ES2346079T3 - Composicion farmaceutica que comprende microcapsulas rellenas con un gas, para un suministro mediado por ultrasonidos. - Google Patents
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Abstract
Una suspensión acuosa que comprende un agente bioactivo y unas microcápsulas rellenas con un gas, que tienen una envoltura polimérica y/o de lípido, en la que dichas microcápsulas tienen una resistencia a un índice mecánico (MI) de una onda de ultrasonidos aplicada de por lo menos 0,15 y dicho agente bioactivo está sustancialmente sin unir con dicha envoltura y dispersado libremente en dicha suspensión.
Description
Composición farmacéutica que comprende
microcápsulas rellenas con un gas, para un suministro mediado por
ultrasonidos.
El presente invento se refiere al uso de una
composición que comprende unas microcápsulas rellenas con un gas y
un agente bioactivo para preparar una formulación para el suministro
mediado por ultrasonidos de un agente bioactivo, y a un método para
el suministro de un agente bioactivo, que comprende administrar una
cantidad efectiva de dicho medicamento a un paciente que necesita
del mismo.
Los agentes de contraste por ultrasonidos (UCA,
acrónimo de ultrasound contrast agents) se han usado ampliamente en
aplicaciones de diagnóstico en investigación médica y en la práctica
clínica. Típicamente, dichos UCA están en la forma de unas burbujas
gaseosas estabilizadas, también conocidas como microvesículas
rellenas con un gas. Las microvesículas rellenas con un gas se
dividen en general en dos categorías principales, a saber
microburbujas y microcápsulas (o microglobos).
Las microburbujas incluyen unas suspensiones
acuosas en las que las burbujas de un gas están delimitadas en la
interfaz entre el gas y el líquido por una delgada envoltura
(película) que implica a un material anfífilo estabilizador
dispuesto en la interfaz entre gas y líquido. Las suspensiones de
microburbujas se preparan típicamente poniendo en contacto unos
materiales anfífilos pulverulentos, p. ej. unos liposomas
previamente formados y liofilizados (es decir secados por
congelación) o unas soluciones de fosfolípidos, liofilizadas o
secadas por atomización, con aire o con otro gas y luego con un
vehículo acuoso, mientras que se agita para generar una suspensión
de microburbujas, que entonces se puede administrar, de manera
preferible brevemente después de su preparación. Ejemplos de una
suspensión acuosa de microburbujas de gas y de su preparación se
describen, ilustrativamente, en los documentos de patentes de los
EE.UU. US 5.271.928, US 5.445.813, US 5.413.774, US 5.556.610, US
5.597.549, US 5.827.504 y en el documento de solicitud de patente
internacional WO 04/069284.
Las microcápsulas (o microglobos) incluyen unas
suspensiones en las que las burbujas de un gas están rodeadas por
una envoltura de un material sólido a base de un lípido o de
polímeros naturales o sintéticos. El espesor de la envoltura de las
microcápsulas puede variar desde unos pocos nanómetros hasta unos
pocos cientos de nanómetros. Ejemplo de microcápsulas y de su
preparación se describen, por ejemplo, en los documentos US
5.711.933 y US 6.333.021.
Recientemente, estos UCA han sido aprovechados
en el suministro de genes mediado por ultrasonidos. Este nuevo
enfoque usa los efectos de cavitación acústica de unas
microvesículas de un gas para inducir una permeabilización
transitoria de la membrana al nivel celular (también conocida como
"sonoporación"), facilitando de esta manera la transferencia
de fármacos o materiales genéticos dentro de la célula. De esta
manera, se han desarrollado unas composiciones de microvesículas
rellenas con un gas, en que las microvesículas contienen, o bien en
su parte vacía interna o embebido dentro de la envoltura
estabilizadora, un compuesto terapéutico. Por ejemplo, el documento
de patente de los EE.UU. nº 6.416.740 describe un sistema
terapéutico dirigido a una diana, que comprende microesferas
rellenas con un gas que incorporan un compuesto terapéutico.
Similarmente, la solicitud de patente de los EE.UU. nº 2004/0258760
se refiere a unas microcápsulas poliméricas cargadas con un
compuesto bioactivo. Sin embargo, esta solución al problema tiene
la desventaja de que el compuesto terapéutico ha de ser de algún
modo introducido dentro de la microvesícula o fijado a la
microvesícula rellena con un gas, implicando de esta manera unos
complicados procesos de producción. Además, el hecho de que algunas
microvesículas que llevan los compuestos terapéuticos deberán ser
sometidas a los efectos de cavitación para proporcionar la
necesaria permeabilización celular, hace bastante ineficaz a todo el
sistema. Además, puesto que el compuesto terapéutico es en general
hidrófobo o ha de ser hecho hidrófobo (p. ej. en el caso de un
material genético) para que él sea compatible con el material que
forma las microvesículas, la liberación del compuesto terapéutico
puede ser menos efectiva en el entorno hidrófilo de la circulación
sanguínea de las células.
La entidad solicitante ha encontrado ahora que
el uso de una composición que comprende unas microcápsulas rellenas
con un gas, que tienen una resistencia predeterminada al índice
mecánico de la onda de ultrasonidos aplicada, acrecienta
notablemente la efectividad del suministro de compuestos
terapéuticos (tales como un material genético) dentro de la célula,
particularmente cuando dicho material de compuestos terapéuticos
está sustancialmente exento de cualquier unión estable con la
envoltura de dichas microcápsulas.
Un aspecto del presente invento se refiere a una
suspensión acuosa que comprende un agente bioactivo y unas
microcápsulas rellenas con un gas, que tienen una envoltura
polimérica y/o de lípido, en que dichas microcápsulas tienen una
resistencia a un índice mecánico (MI, acrónimo de mechanical index)
de al menos 0,15 y dicho agente bioactivo está sustancialmente sin
unir con dicha envoltura y libremente dispersado en dicha
dispersión.
\newpage
El término "resistencia a un MI" significa
que las microcápsulas de una composición del invento pueden resistir
a un valor de umbral predeterminado de presión acústica aplicada a
una frecuencia predeterminada sin sufrir daños sustanciales. En
particular, menos de un 50% del número total de las microcápsulas,
de manera preferible menos de un 30% e incluso de manera más
preferible menos de un 20% de dicha microcápsulas, se destruye
después de una aplicación de dicho valor de umbral predeterminado
de presión acústica. El término "destrucción" de microcápsulas
significa que por lo menos una parte de la envoltura de la
microcápsula es destruida, para liberar el gas contenido dentro de
ella.
El índice mecánico (MI) tal como se usa aquí es
adimensional, siendo definido como:
en que P es la presión acústica
negativa de pico (en MPa, medida en agua), f es la frecuencia (en
MHz) de la onda de ultrasonido aplicada y C_{MI} es una constante
de normalización que es igual a 1
MPa\cdotMHz^{-1/2}.
\vskip1.000000\baselineskip
El termino "sustancialmente no unido" como
se usa aquí, indica que el agente bioactivo no tiene ninguna
interacción estable (p. ej. de tipo covalente o iónico) con las
moléculas que forman la envoltura de la microcápsula y, por lo
tanto, está libremente dispersado en la suspensión (fuera de la
envoltura estabilizadora de la microvesícula). En particular, una
composición de acuerdo con el invento es una suspensión acuosa que
comprende microcápsulas y un agente bioactivo (opcionalmente
asociado con un vehículo), estando disociada la mayoría de dicho
agente bioactivo (es decir, más del 50%) con respecto de la
envoltura de microcápsula. Preferiblemente, un 75%, más
preferiblemente por lo menos un 90% de la cantidad total de dicho
agente bioactivo está dispersado libremente (es decir no está unido
establemente a las microcápsulas y no está incorporado dentro de
ellas) en dicha suspensión.
Preferiblemente, dichas microcápsulas tienen una
resistencia a un índice mecánico de por lo menos 0,18 y más
preferiblemente de por lo menos 0,20. En particular, dichas
microcápsulas tienen una resistencia a una presión acústica de por
lo menos aproximadamente 200 kPa a 1,15 MHz o de por lo menos
aproximadamente 300 kPa a 2,25 MHz.
Preferiblemente, las microcápsulas de la
composición tienen una rigidez de por lo menos 5 N/m, más
preferiblemente de por lo menos 8 N/m.
De acuerdo con una forma preferida de
realización, dicho agente bioactivo está incorporado en un vehículo.
Preferiblemente, dicho vehículo comprende un lípido o polímero
cargado positivamente. Más preferiblemente, dicho vehículo está en
la forma de una micela o de un liposoma.
De acuerdo con una forma de realización
preferida adicional, dicho vehículo comprende además un ligando para
dirección a una diana.
Otro aspecto del invento se refiere al uso de
una composición que comprende un agente bioactivo y unas
microcápsulas rellenas con un gas que tienen una envoltura
polimérica y/o de lípido, para preparar una formulación destinada
al suministro, mediado por ultrasonidos, de dicho agente bioactivo,
en que dichas microcápsulas tienen una resistencia a un índice
mecánico (MI) de por lo menos 0,15 y dicho agente bioactivo está
sustancialmente sin unir con dicha envoltura.
Un aspecto adicional del invento se refiere a un
estuche farmacéutico que comprende un agente bioactivo y unas
microcápsulas rellenas con un gas como antes se han definido.
Todavía otro aspecto adicional del invento se
refiere a un método para suministrar un agente bioactivo dentro de
una célula, que comprende:
- administrar una composición, que comprende un
agente bioactivo y una pluralidad de microcápsulas rellenas con un
gas, que tienen una envoltura polimérica y/o de lípido, a una parte
del cuerpo que comprende dicha célula en un paciente que necesita
de ella, teniendo dichas microcápsulas una resistencia a un índice
mecánico de por lo menos 0,15 y estando dicho agente bioactivo
sustancialmente sin unir con dicha envoltura; y
- aplicar una onda de ultrasonidos a dicha parte
del cuerpo, teniendo dicha onda una presión acústica capaz de
destruir a una parte de dichas microcápsulas, para suministrar de
una manera efectiva dicho agente bioactivo a dicha célula.
\vskip1.000000\baselineskip
La parte de microcápsulas destruidas puede ser
también bastante baja, por ejemplo de 1% o menos del número total de
microcápsulas, (p. ej. cuando éstas se administran en altas
concentraciones, p. ej. de 10^{9} microcápsulas por ml de la
suspensión). Preferiblemente, la cantidad de microcápsulas
destruidas es de por lo menos 5%, de manera más preferible de por lo
menos 10% e incluso de manera más preferible de 50%.
Las Figuras 1a y 1b muestran el % (tanto por
ciento) de células positivas para GFP y las intensidades medias de
fluorescencia de células positivas, medidas después de un suministro
de genes mediado por ultrasonidos, por uso de unas composiciones que
contienen microburbujas o microcápsulas a 2,25 MHz.
Las Figuras 2a y 2b muestran el % de células
positivas para GFP y las intensidades medias de fluorescencia de
células positivas, medidas después de un suministro de genes mediado
por ultrasonidos, por uso de unas composiciones que contienen
microburbujas o microcápsulas a 1,15 MHz.
La Figura 3 muestra las intensidades medias de
fluorescencia de células positivas para GFP, medidas después de un
suministro de genes mediado por ultrasonidos, por uso de unas
composiciones que contienen microcápsulas hechas de polímeros de
diferentes pesos moleculares.
La Figura 4 muestra las intensidades medias de
fluorescencia de células positivas para GFP, medidas después de un
suministro de genes mediado por ultrasonidos, por uso de unas
composiciones que contienen microcápsulas rellenas con diferentes
gases.
La composición farmacéuticamente activa del
invento se puede usar para suministrar de una manera efectiva un
agente bioactivo dentro de una célula, por aplicación de ondas de
ultrasonidos, que tienen una presión acústica y una frecuencia
predeterminadas, capaces de romper por lo menos a una parte de las
microcápsulas de la composición.
El término "composición farmacéuticamente
activa" incluye dentro de su significado cualquier formulación,
o precursora de la misma, que incluye formulaciones bioactivas y/o
activas terapéuticamente, que es capaz de ejercer un efecto
farmacéutico (p. ej. un efecto bioactivo y/o terapéutico) cuando se
administra en una cantidad efectiva a un paciente que necesita de
la misma. Similarmente, el término "farmacéuticamente activo"
cuando se refiere a un compuesto, a un agente o un estuche, incluye
dentro de su significado a compuestos, agentes o estuches
diagnósticos, bioactivos y/o terapéuticos.
El término "agente bioactivo" incluye
dentro de su significado a cualquier sustancia, composición o
partícula que sea capaz de ser usada en un tratamiento (incluyendo
el diagnóstico, la prevención, el alivio, el alivio del dolor o la
curación) de cualquier estado patológico en un paciente (incluyendo
una enfermedad, una aflicción, una lesión o un daño causado por
enfermedad), que incluye compuestos de formulaciones se pueden usar
en cualquier aplicación terapéutica, tal como en métodos para el
tratamiento de una enfermedad en un paciente, así como cualquier
sustancia que sea capaz de ejercer o sea responsable de ejercer un
efecto biológico in vitro y/o in vivo. Ejemplos de
agentes bioactivos son fármacos, productos farmacéuticos, proteínas,
péptidos naturales o sintéticos, incluyendo oligopéptidos y
polipéptidos, vitaminas, esteroides, y un material genético,
incluyendo nucleósidos, nucleótidos y polinucleótidos. Un método o
tratamiento terapéutico de un paciente incluye típicamente el uso de
un agente bioactivo, que está incluido típicamente dentro de una
composición farmacéuticamente activa.
Tal como se ha observado por la Entidad
solicitante, el uso de microcápsulas con una envoltura sólida hecha
de un material polimérico y/o lipídico (particularmente las que
tienen un espesor de la envoltura de por lo menos 50 nm,
preferiblemente de por lo menos 100 nm) permite un suministro más
efectivo del material genético dentro de la célula, en comparación
con el uso de microburbujas estabilizadas por delgadas películas (p.
ej. de menos que 10 nm) de un material.
La envoltura de microcápsulas rellenas con un
gas, de una composición del invento, es preferiblemente una
envoltura polimérica, que comprende preferiblemente un polímero
biodegradable, o una envoltura que comprende lípidos
biodegradables, insolubles en agua. Ejemplo de microcápsulas
apropiadas y de la preparación de las mismas se describen, por
ejemplo, en los documentos US 5.711.933, US 6.333.021, US 5.837.221
o US 6.045.777. Se pueden emplear también unas microcápsulas que
tienen una envoltura proteínica, es decir hecha de proteínas
naturales (una albúmina, hemoglobina), tales como las que se
describen en los documentos de patente de los EE. UU.
US-A-4.276.885 o
EP-A-0 324 938.
Los polímeros que forman la envoltura de las
microcápsulas inyectables son preferiblemente unos polímeros
hidrófilos, biodegradables, compatibles fisiológicamente. Ejemplos
de tales polímeros, que pueden ser naturales o sintéticos, son unos
polisacáridos sustancialmente insolubles (p. ej. quitosano o
quitina), poli(cianoacrilatos), poli(lactidas) y
poli(glicolidas) y sus copolímeros, copolímeros de lactidas y
lactonas tales como \gamma-caprolactona o
\delta-valerolactona, copolímeros de óxido de
etileno y de lactidas, poli(etileniminas), polipéptidos, y
proteínas tales como gelatina, colágeno, globulinas o albúminas.
Otros polímeros apropiados, mencionados en el documento US
5.711.933 antes citado, incluyen poli-(orto)ésteres, poli(ácido
láctico) y poli(ácido glicólico) y sus copolímeros (p. ej. DEXON®,
Davis & Geck, Montreal, Canadá);
poli(DL-lactida-co-\gamma-caprolactona),
poli(DL-lactida-co-\delta-valerolactona),
poli(DL-lactida-co-\gamma-butirolactona),
poli(cianoacrilatos de alquilo); poliamidas, un
poli(hidroxibutirato); una poli(dioxanona);
poli-(\beta-aminocetonas); poli-(fosfazenos); y
poli(anhídridos). Unos poli(aminoácidos) tales como
los poli(ácidos glutámicos) y poli(ácidos aspárticos), se pueden
usar también, al igual que sus derivados, tales como ésteres
parciales con alcoholes inferiores o glicoles. Se pueden usar
también unos copolímeros con otros aminoácidos tales como metionina,
leucina, valina, prolina, glicina, alanina, etc. Se pueden usar
también derivados de poli(ácidos glutámicos) y poli(ácidos
aspárticos) con una biodegradabilidad controlada (tales como los que
se describen en los documentos WO87/03891, US 4.888.398 o EP
130935). Estos polímeros (y copolímeros con otros aminoácidos)
tienen fórmulas de los siguiente tipos:
-(NH-CHA-CO)_{w},
-(NH-CHX-CO)_{y}, en que X
designa a la cadena lateral de un residuo de aminoácido (p. ej.
metilo, isopropilo, isobutilo o bencilo); A es un grupo de las
fórmulas
-(CH_{2})_{n}COOR^{1}R^{2}-OCOR,
-(CH_{2})_{n} COO-CHR^{1}COOR,
-(CH_{2})_{n}CO(NH-CHX-CO)_{m}
NH-CH(COOH)-(CH_{2})_{p}COOH, o
los respectivos anhídridos de las mismas, en las que R^{1} y
R^{2} representan H o alquilos inferiores, y R representa alquilo
o arilo; o R y R^{1} están conectados conjuntamente por un enlace
sustituido o sin sustituir para proporcionar anillos de 5 ó 6
miembros; n, m y p son números enteros inferiores, que no superan el
valor de 5; y w e y son números enteros seleccionados por tener
unos pesos moleculares no situados por debajo de 5.000.
Se pueden usar también unos polímeros no
biodegradables (p. ej. para producir unas microcápsulas que se han
de usar en el tracto digestivo), opcionalmente en combinación con
los anteriores polímeros biodegradables. Éstos se pueden
seleccionar unos polímeros biorresistentes, fisiológicamente
aceptables, en su mayor parte insolubles en agua, por ejemplo
poliolefinas (un poliestireno), resinas acrílicas (poliacrilatos, un
poli(acrilonitrilo)), poliésteres (policarbonatos),
poliuretanos, poliureas y sus copolímeros. El ABS (acrónimo de
acrilonitrilo, butadieno y estireno) es un copolímero preferido.
Ventajosamente, se pueden usar también unos
polímeros iónicos (es decir unos polímeros que llevan unos restos
iónicos en su estructura), preferiblemente polímeros iónicos
biodegradables, para formar la envoltura estabilizadora de las
microcápsulas, confiriendo de esta manera una carga neta global a
las mismas. Los polímeros iónicos se pueden usar como componentes
principales de la envoltura estabilizadora, o se pueden mezclar en
diversas proporciones (p. ej. de 2 a 80% en peso) con polímeros no
iónicos. Unos apropiados polímeros iónicos son, por ejemplo, unos
polímeros que comprenden un átomo de nitrógeno cuaternizado tales
como aminas cuaternizadas o unos polímeros cuaternizados que
comprenden restos carboxílicos, o de sulfato, sulfonato o fosfonato.
Ejemplos de apropiados polímeros iónicos incluyen sin ninguna
limitación, un poli(cloruro de
dialil-dimetil-amonio), un
poli{bis(2-cloro-etil)éter-alt-1,3-bis[3-(dimetilamino)propil]urea}
cuaternizado (Poliquaternium®-2), un poli(tribromuro de
4-vinil-piridinio), un compuesto
etoxilado cuaternizado de hidroxietil-celulosa
(Poliquaternium®-4, un poli(cloruro de
p-xileno tetrahidrotiofenio), una
poli(L-lisina), quitina, un dietilenaminoetil
dextrano, un poli(ácido acrilic), un poli(ácido metacrílico), un
poli(estireno-alt-ácido maleico),
poli(aminoácidos), ácido algínico, un poli(ácido uridílico),
un ácido hialurónico, es decir una poli(\beta-ácido
glucurónico-alt-\beta-N-acetil-glucosamida),
un poli(ácido galacturónico), un poli(acetato de
vinilo-co-ácido crotónico), una
poli(dianhídrido de ácido
3,3',4,4'-benzofenonatetracarboxílico-co-4,4'-oxidianilina),
un poli(isopreno-injerto-éter monometílico de
ácido maleico), un copolímero de ácido glutámico con un glutamato
de alquilo, heparina, un poli(estireno sulfonato), un
poli(ácido isoftálico) sulfonado, un poli(vinil sulfonato,
sal de potasio), un poli(vinil sulfato, sal de potasio),
sulfato de condroitina A, sulfato de dextrano, fucoidano, un ácido
polifosfórico, un polifosfato de sodio, un
poli(vinil-fosfonato de sodio), quitosano,
sulfato de quitosano, un alginato de sodio, un ácido algínico y un
lignina-sulfonato.
Los lípidos biodegradables, insolubles en agua,
que son útiles para formar microcápsulas para una composición de
acuerdo con el invento, comprenden, por ejemplo, mono-, di- o
tri-glicéridos sólidos, insolubles en agua, ácidos
grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroles tales como colesterol,
ceras y mezclas de las mismas. Los mono-, di- y
tri-glicéridos incluyen principalmente los
compuestos mono-, di- y tri-laurina, así como los
correspondientes derivados de miristina, palmitina, araquidina y
behenina. Son particularmente útiles los compuestos mono-, di- y
tri-miristina, -palmítina, -estearina y
triglicéridos mixtos tales como el
dipalmitoíl-monooleil glicérido; se prefieren
tripalmitina y triestearina. Los ácidos grasos incluyen unos ácidos
grasos sólidos (a la temperatura ambiente, aproximadamente
18-25ºC) (preferiblemente saturados) que tienen 12
o más átomos de carbono, incluyendo, por ejemplo los ácidos láurico,
araquídico, behénico, palmítico, esteárico, sebácico, mirístico,
cerotínico, melísico y erúcico y los ésteres de ácidos grasos de los
mismos. Preferiblemente, los ácidos grasos y sus ésteres se usan en
mezcla con otros glicéridos.
Los esteroles se usan preferiblemente en mezcla
con los otros glicéricos y/o ácidos grasos, y se seleccionan entre
colesterol, fitosterol, lanosterol, ergosterol, etc. y ésteres de
los esteroles con los ácidos grasos antes mencionados; sin embargo,
se prefiere el colesterol.
Los preferidos lípidos biodegradables son
triglicéridos tales como tripalmitina, triestearina o mezclas de los
triglicéridos antes mencionados.
Opcionalmente, hasta un 75% en peso de un
polímero biodegradable, tal como los que se han enumerado con
anterioridad, se puede mezclar conjuntamente con el lípido
biodegradable, insoluble en agua, que forma la envoltura de la
microcápsula.
Se pueden incorporar también unos aditivos
convencionales dentro de la envoltura de las microcápsulas, con el
fin de modificar las propiedades físicas de las mismas, tales como
la dispersabilidad, la elasticidad y la permeabilidad al agua. En
particular, unas cantidades efectivas de materiales anfífilos tales
como lípidos, fosfolípidos o fosfolípidos modificados, se pueden
añadir a la emulsión preparada para la producción de dichas
microcápsulas, con el fin de aumentar la estabilidad de las
mismas.
\newpage
Otros excipientes o aditivos, usados en
particular para la preparación de microcápsulas, se pueden
incorporar dentro de la envoltura, tales como agentes
redispersantes intensificadores de la viscosidad.
Se pueden preparar unas microcápsulas que
contienen polímeros biodegradables, por ejemplo, de acuerdo con el
procedimiento descrito en el documento US 5.711.933, el cual
comprende (a) emulsionar una fase orgánica hidrófoba dentro de una
fase acuosa de manera tal que se obtengan gotitas de dicha fase
hidrófoba como una emulsión del tipo de aceite en agua en dicha
fase acuosa; (b) añadir a dicha emulsión una solución de por lo
menos un polímero en un disolvente volátil que es insoluble en la
fase acuosa, de manera tal que dicho polímero forme una capa
alrededor de dichas gotitas; (c) evaporar dicho disolvente volátil
de manera tal que el polímero se deposite por precipitación
interfacial alrededor de las gotitas que entonces formen unas perlas
con un núcleo de dicha fase hidrófoba encapsulada por una membrana
de dicho polímero, estando dichas perlas en suspensión en dicha
fase acuosa; (d) eliminar dicha fase hidrófoba encapsulada por
evaporación sometiendo dicha suspensión a una presión reducida, y
(e) reemplazar dicha fase hidrófoba evaporada por un gas
soluble.
Unas microcápsulas que contienen lípidos
biodegradables se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el
procedimiento que se describe en el documento US 6.333.021, por
dispersamiento de una mezcla de uno o más de los constituyentes
sólidos de la envoltura de microcápsulas, disueltos en un disolvente
orgánico, en una fase acuosa de vehículo, de manera tal que se
produzca una emulsión del tipo de aceite en agua. La fase acuosa de
la emulsión puede contener una cantidad efectiva de materiales
anfífilos, que se usan para estabilizar a la emulsión.
Una cierta cantidad de un agente redispersante
y/o de un agente crioprotector o lioprotector se añade luego a la
emulsión de diminutas gotitas de la solución orgánica en la fase
acuosa, antes de congelar a una temperatura situada por debajo de
-30ºC. Se puede usar cualquier conveniente agente redispersante, se
prefieren agentes redispersantes seleccionados entre azúcares, una
albúmina, una gelatina, una
poli(vinil-pirrolidona) (PVP), un poli
(alcohol vinílico) (PVA), un poli(etilenglicol) (PEG) y un
copolímero de bloques de óxido de etileno y óxido de propileno (p.
ej. Pluronic®, o Synperonic®) o mezclas de los mismos. Los agentes
redispersantes que se añaden para evitar la aglomeración de las
partículas son particularmente útiles cuando las microcápsulas
están en la forma de polvos no coalescentes, secos y dispersables
instantáneamente. Ejemplos de un agente crioprotector o
lioprotector son, por ejemplo, aminoácidos, tales como glicina;
hidratos de carbono; p. ej., un azúcar, tal como sacarosa, manitol,
maltosa, trehalosa, glucosa o una ciclodextrina, o polisacáridos,
tales como dextrano; o poliglicoles, tales como un
poli(etilenglicol).
Luego la emulsión congelada es sometida a una
presión reducida con el fin de efectuar la liofilización, es decir,
la eliminación por sublimación del disolvente orgánico a partir de
las gotitas y del agua de la fase de vehículo, y el producto
liofilizado se pone en contacto luego con el gas deseado.
Las microcápsulas que son apropiadas para una
composición del invento tienen típicamente una envoltura con un
espesor de por lo menos 50 nm, de manera preferible de por lo menos
100 nm, hasta de unos pocos cientos de nanómetros (p. ej. de
aproximadamente 600 nm). Tal como se ha observado por la entidad
solicitante, el espesor de la envoltura es un parámetro que puede
ser modulado para conferir a dicha microcápsula la deseada
resistencia a unos altos valores de MI.
Se ha observado además que las deseadas
propiedades de las microcápsulas pueden también ser moduladas
mediante una selección apropiada del material que forma la
envoltura, basándose en el conocimiento de los expertos en la
especialidad a la vista de la presente memoria descriptiva. Por
ejemplo, cuando el material que forma la envoltura es un polímero,
las deseadas propiedades se pueden obtener seleccionando un peso
molecular apropiado de dicho polímero; típicamente, dicho peso
molecular deberá ser preferiblemente de por lo menos 30 kDa
(kiloDaltons), más preferiblemente de por lo menos 100 KDa e
incluso más preferiblemente de por lo menos 300 kDa.
Alternativamente, o además de ello, la resistencia a un MI
predeterminado se puede aumentar por reticulación de las moléculas
del material que forma la envoltura (p. ej. un lípido o un polímero
de bajo peso molecular) y/o aumentando de manera apropiada el
espesor de la envoltura.
En general, puede ser ventajoso utilizar para la
envoltura unos materiales que son capaces de conferir una cierta
rigidez a las microcápsulas.
La rigidez proporcionada por la envoltura,
S_{p,} puede ser determinada por un análisis del mejor ajuste
entre los espectros de atenuación medidos y calculados de las
microvesículas (microburbujas o microcápsulas). Una atenuación es
el resultado de una disipación de energía debida a una absorción y
una diseminación mediante la propagación de la onda de ultrasonidos
a través de un volumen relleno con una suspensión de microvesículas.
Los espectros de atenuación se miden corrientemente usando la
técnica de sustitución, como se ha descrito, por ejemplo, por Gorce
JM, Arditi M y Schneider M. "Influence of bubbles size
distribution of the echogenicity of ultrasound contrast agents: A
study of SonoVue" [influencia de la distribución de tamaños de
burbujas de la ecogenicidad de agentes de contraste por
ultrasonidos: un estudio de SonoVue], Invest. Radiol., vol
35(11), páginas 661-671, 2000. Dicho
brevemente, se mide la respuesta acústica de un reflector plano, p.
ej. la pared trasera de un recipiente relleno con NaCl al 0,9%, y
se usa como eco de referencia, I_{ref}(\omega).
Seguidamente el NaCl al 0,9% existente en el recipiente, es
reemplazado por una suspensión con las microvesículas y se mide de
nuevo la respuesta de la pared trasera,
I_{atten}(\omega). La relación de los dos resultados de
mediciones da como resultado la atenuación determinada
experimentalmente como una función de la frecuencia:
Los espectros de atenuación se pueden calcular
usando modelos teóricos que son bien conocidos y han sido
extensamente descritos en la bibliografía (p. ej. en la referencia
antes citada de Gorce y colaboradores). Dicho brevemente, basándose
en una medición de la distribución de tamaños de las microvesículas,
p. ej. con un aparato Coulter Multisizer II (Coulter Electronics
Ltd., Luton, Reino Unido), se calcula el espectro de atenuación para
un valor inicial de S_{p}. Un criterio de error para el análisis
del mejor ajuste es calculado luego como el error medio cuadrático
(RMS acrónimo de Root Mean Square) entre espectros de atenuación
experimentales y teóricos. Este error de atenuación se puede
escribir como
en donde \omega_{i} =
[\omega_{1}, ..., \omega_{N}] son las frecuencias
muestreadas que se usan para el ajuste y
\alpha_{th}(\omega) es la atenuación calculada en
función de la frecuencia. La S_{p} que produce un error RMS mínimo
para la distribución dada de tamaños se considera como la mejor
estimación.
De acuerdo con el presente invento, las
microcápsulas preferidas son las que tienen un valor de S_{p} de
por lo menos aproximadamente 5 N/m, de manera preferible de por lo
menos aproximadamente 8 N/m.
Para las mediciones de la atenuación, se puede
usar la siguiente disposición. Dos transductores de elementos
únicos, de 7,5 MHz y 20 MHz (V3640 y V316, de Panametrics Inc.,
Waltham, MA) son propulsados por un pulsador
ultrasónico-receptor (5800PR, de Panametrics Inc.,
Waltham, MA) en el modo de pulso - eco (transmisión y recepción).
De esta manera, se cubre una banda de frecuencias que fluctúan entre
5 y 25 MHz. La salida del pulsador-receptor es
conectada a una entrada de 50 \Omega de un osciloscopio digital
(modelo DL4100, 10bit, 100MS/s, de Yokogawa Electric Corp, Tokio,
Japón). El pulsador-receptor y el osciloscopio se
controlan a través de una conexión GPIB por un ordenador personal
(PC, acrónimo de Personal Computer). De esta manera, todas las
etapas de la adquisición se controlan por un programa lógico
software (desarrollado internamente usando Delphi 4, Inprise Corp,
Scotts Valley, CA). Los espectros de Fourier de las señales
adquiridas, el promediado y los cálculos de espectros de atenuación
son realizados también por este software. Los resultados y todos los
parámetros de adquisición son guardados en el PC. Todos los
cálculos de modelación y el análisis del mejor ajuste se realizan
con el programa lógico MATLAB© software (v7.04, The Math Works Inc.,
Natick, MA).
Cualquiera que sea el material que forma la
envolvente de cáscara rígida, la solicitante ha observado que, con
el fin de proporcionar una penetración efectiva del material
genético dentro la célula, las microcápsulas de una composición de
acuerdo con el invento deberán tener una resistencia a un índice
mecánico de 0,15, de manera preferible de por lo menos 0,18 y de
manera incluso más preferible de por lo menos 0,20. Preferiblemente,
las microcápsulas no se resisten a unos índices mecánicos más altos
que aproximadamente 10, con el fin de evitar la necesidad de tener
que aplicar unas presiones acústicas que pueden causar un efecto
excesivamente negativo sobre la viabilidad de las células sometidas
a dichas ondas de ultrasonidos.
Cualquier gas biocompatible, precursor de gas o
mezcla de los mismos se puede emplear para rellenar las
microcápsulas de una composición del invento.
El gas puede comprender, por ejemplo, aire;
nitrógeno; oxígeno; dióxido de carbono; hidrógeno; óxido nitroso;
un gas noble o inerte, tal como helio, argón, xenón o criptón; un
gas radiactivo tal como Xe^{133} o Kr^{81}; un gas noble
hiperpolarizado tal como helio hiperpolarizado, xenón
hiperpolarizado o neón hiperpolarizado; un hidrocarburo de bajo
peso molecular (que contiene, p. ej., hasta 7 átomos de carbono),
por ejemplo un alcano tal como metano, etano, propano, butano,
isobutano, pentano o isopentano, un cicloalcano tal como ciclobutano
o ciclopentano, un alqueno tal como propeno, buteno o isobuteno, o
un alquino tal como acetileno; un éter; una cetona; un éster, gases
halogenados, preferiblemente gases fluorados; tales como
hidrocarburos de bajo peso molecular como tales o halogenados,
fluorados o perfluorados (que contienen p. ej. hasta 7 átomos de
carbono); o una mezcla de cualquiera de los precedentes. Cuando se
usa un hidrocarburo halogenado, preferiblemente por lo menos alguno,
más preferiblemente la totalidad, de los átomos de halógeno en dicho
compuesto son átomos de flúor.
Se prefieren gases fluorados, en particular
gases perfluorados. Los gases fluorados incluyen unos materiales
que contienen por lo menos un átomo de flúor, tales como, por
ejemplo, hidrocarburos fluorados (compuestos orgánicos que
contienen uno o más átomos de carbono y de flúor); hexafluoruro de
azufre; cetonas fluoradas, preferiblemente perfluoradas, tales como
perfluoroacetona; y éteres fluorados, preferiblemente perfluorados,
tal como dietil-éter perfluorado. Compuestos preferidos son unos
gases perfluorados, tales como SF_{6} o perfluorocarbonos
(hidrocarburos perfluorados), es decir unos hidrocarburos en los que
la totalidad de los átomos de hidrógeno han sido reemplazados por
átomos de flúor, de los que se conoce que forman unas suspensiones
de microburbujas particularmente estables, tal como se describe, por
ejemplo en el documento de patente europea EP 0554 213.
El término perfluorocarbono incluye
perfluorocarbonos saturados, insaturados y cíclicos. Ejemplos de
perfluorocarbonos biocompatibles y fisiológicamente aceptables son:
perfluoroalcanos, tales como perfluorometano, perfluoroetano,
perfluoropropanos, perfluorobutanos (p. ej.
perfluoro-n-butano, opcionalmente en
mezcla con otros isómeros tales como
perfluoro-isobutano), perfluoropentanos,
perfluorohexanos o perfluoroheptanos; perfluoroalquenos, tales como
perfluoropropeno, perfluorobutenos (p. ej.
perfluorobut-2-eno) o
perfluorobutadieno; perfluoroalquinos (p. ej.
perfluoro-but-2-ino);
y perfluorocicloalcanos (p. ej. perfluorociclobutano,
perfluorometilciclobutano, perfluorodimetilciclobutanos,
perfluorotrimetilciclobutanos, perfluorociclopentano,
perfluorometilciclopentano, perfluorodimetilciclopentanos,
perfluorociclohexano, perfluorometilciclohexano y
perfluorocicloheptano). Los perfluorocarbonos preferidos tienen la
fórmula C_{n}F_{2n+2}, en la que n es de 1 a 12, de manera
preferible de 2 a 10, de manera sumamente preferible de 3 a 8 y de
manera incluso más preferible de 3 a 6. Los perfluorocarbonos
apropiados incluyen, por ejemplo, CF_{4}, C_{2}F_{6},
C_{3}F_{8}, C_{4}F_{8}, C_{4}F_{10}, C_{5}F_{12},
C_{6}F_{12}, C_{6}F_{14}, C_{7}F_{14}, C_{7}F_{16},
C_{8}F_{18}, y C_{9}F_{20}.
Gases particularmente preferidos son SF_{6} o
perfluorocarbonos seleccionados entre CF_{4}, C_{2}F_{6},
C_{3}F_{8}, C_{4}F_{8}, C_{4}F_{10} o mezclas de los
mismos; se prefieren particularmente SF_{6}, C_{3}F_{8} o
C_{4}F_{10}.
También puede ser ventajoso usar una mezcla de
cualquiera de los anteriores gases en cualquier relación. Por
ejemplo, la mezcla puede comprender un gas convencional, tal como
nitrógeno, aire o dióxido de carbono y un gas fluorado, tal como
hexafluoruro de azufre o un perfluorocarbono tal como arriba se ha
indicado. Ejemplos de apropiadas mezclas de gases se pueden
encontrar, por ejemplo, en el documento WO 94/09829. Se prefieren
particularmente las siguientes combinaciones: una mezcla de los
gases (A) y (B), en la que el gas (B) es un gas fluorado,
seleccionado preferiblemente entre SF_{6}, CF_{4},
C_{2}F_{6}, C_{3}F_{6}, C_{3}F_{8}, C_{4}F_{6},
C_{4}F_{8}, C_{4}F_{10}, C_{5}F_{10}, C_{5}F_{12} o
sus mezclas, y (A) se selecciona entre aire, oxígeno, nitrógeno,
dióxido de carbono o mezclas de los mismos. La cantidad del gas (B)
puede representar desde aproximadamente 0,5% hasta aproximadamente
95% v/v (volumen/volumen) de la mezcla total, de manera preferible
de aproximadamente 5% a 80%.
En ciertas circunstancias puede ser deseable
incluir un precursor de una sustancia gaseosa (es decir, un material
que es capaz de ser convertido en un gas in vivo).
Preferiblemente, el precursor gaseoso y el gas que se deriva del
mismo son fisiológicamente aceptables. El precursor gaseoso puede
ser activado por el pH, foto-activado, activado por
las temperaturas, etc. Por ejemplo, ciertos perfluorocarbonos se
pueden usar como precursores gaseosos activados por las
temperaturas. Estos perfluorocarbonos, tales como perfluoropentano o
perfluorohexano, tienen una temperatura de transición de fases
líquida/gaseosa situada por encima de la temperatura ambiente (o la
temperatura a la que los agentes son producidos y/o almacenados)
pero por debajo de la temperatura corporal; por lo tanto, ellos
experimentan una transición de fases líquida/gaseosa y son
convertidos en un gas dentro del cuerpo humano.
La formulación del invento comprende además un
agente bioactivo tal como antes se ha definido.
De acuerdo con una forma preferida de
realización, el agente bioactivo comprendido en una composición del
invento es un material genético. El término de material genético
incluye dentro de su significado cualquier ácido nucleico (o
secuencia de nucleótidos) que se puede usar o bien como tal o para
expresar un/una correspondiente aminoácido, péptido o proteína, una
vez que ha sido suministrado dentro de una célula. El material
genético suministrado de acuerdo con el método del invento incluye
en particular ácidos nucleicos, ARN (ácidos ribonucleicos) y ADN
(ácidos desoxirribonucleicos), de origen ya sea natural o sintético,
incluyendo ARN y ADN recombinantes, ARN antisentido o de antígeno.
El término se refiere tanto a la secuencia de nucleótidos (gen) como
tal o preferiblemente al gen incorporado dentro de un vehículo
apropiado. Vehículos apropiados para soportar y llevar los genes
incluyen vectores de expresión tales como plásmidos, fagémidos,
cósmidos, cromosomas artificiales de levaduras (YAC, acrónimo de
Yeast Artificial Chromosomes), cromosomas artificiales bacterianos
(BAC, acrónimo de Bacterial Artificial Chromosomes), cromosomas
artificiales humanos (HAC, acrónimo de Human Artificial
Chromosomes), un oligonucleótido quimérico que comprende residuos
de ARN y ADN en una conformación de dúplex, una ribozima de
horquilla de pelo o de cabeza de martillo, un ARN interferente
pequeño (siRNA acrónimo de small interfering RNA), casetes de
expresión de ARN interferente pequeño, ribonucleasas de ADN, un
transposón, ARN y ADN de hebras tanto únicas como dobles y
compuestos análogos a los mismos, tales como un fosforotioato o un
fosforoditioato oligodesoxinucleótido.
Dicho material genético se puede usar, por
ejemplo, para reemplazar genes ausentes o en defecto, para catalizar
la destrucción de células cancerosas o causar que las células
cancerosas se reviertan de retorno a la forma de un tejido normal,
para intensificar o estimular una respuesta inmunitaria, para
promover el crecimiento de un nuevo tejido o estimular la
regeneración de un tejido dañado, para hacer posible la reparación
de genes mutados o dañados, para catalizar una disociación
endorribonucleolítica, para bloquear la expresión de genes por
formación de un triplex o para bloquear la traducción de un ARNm
(ARN mensajero).
Ejemplos de un material genético que se puede
suministrar usando las microcápsulas del presente invento incluyen
un ADN que codifica por lo menos una parte de los siguientes genes;
el regulador de la conductancia transmembranal de la fibrosis
quística destinado a tratar la fibrosis quística (CFTR, acrónimo de
cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, que regula el
cloruro intracelular), distrofina para tratar la distrofia muscular,
adenosina desaminasa para tratar una inmunodeficiencia grave,
receptores de HDL (lipoproteínas de alta densidad) para el
tratamiento de hipercolesterolemia, ApoE para el tratamiento de la
aterosclerosis, el Factor VIII (de hemofilia A, que regula la
coagulación de la sangre), el Factor IX (de hemofilia B, que regula
la coagulación de la sangre), un gen que expresa citocinas tales
como la interleucina-2 o la
interleucina-4 o la interleucina-7,
o la interleucina-12, o el factor de necrosis de
tumores \alpha (TNF\alpha) o linfocitos que se infiltran en
tumores (TIL, acrónimo de tumor-infiltrating
lymphocytes), o el HLA-B7, para estimular el sistema
inmunitario con el fin de aniquilar células cancerosas, o el
supresor de tumores p53 o timidina cinasa del virus del herpes
simple (HSV-TK, acrónimo de herpes simplex virus
thymidine kinase) se pueden proporcionar para tratar un cáncer
haciendo que las células cancerosas experimenten una muerte celular,
el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, acrónimo de
vascular endothelial growth factor) o el factor de crecimiento de
hepatocitos (HGF, acrónimo de hepatocyte growth factor) o el factor
de crecimiento de fibroblastos (FGF, acrónimo de fibroblast growth
factor) se pueden proporcionar para tratar enfermedades
cardiovasculares por promoción de una angiogénesis, y la
alfa-hormona estimuladora de melanocitos
(alfa-MSH, acrónimo de
melanocyte-stimulating hormone) se puede
proporcionar para tratar una inflamación, la hormona concentradora
de melanina para la terapia contra la obesidad y el VIH env (de
envoltura) o la interferencia de ARN se puede proporcionar para
tratar una infección por VIH (virus de la inmunodeficiencia
humana). La formulación "por lo menos una parte de" tal como se
utiliza en el presente contexto, significa que el gen entero no
necesita ser representado por el oligonucleótido, siempre y cuando
que la parte representada del gen proporcione un bloque efectivo
para la expresión de genes. Si se desea, se puede suministrar más
de un material genético usando las microcápsulas. Además, para
algunas aplicaciones, un ácido nucleico puede ser conjugado con una
señal de localización nuclear (NLS, acrónimo de nuclear
localization signal) con el fin de intensificar el suministro
nuclear de ADN plasmídico.
Un material genético se puede usar o bien como
tal en una composición del invento o puede ser asociado con unos
apropiados vehículos víricos o no víricos (p. ej. para limitar o
evitar la degradación por nucleasas de un ácido nucleico en el
torrente sanguíneo). Los vehículos víricos comprenden retrovirus,
lentivirus, adenovirus, virus adeno-asociados,
virus de herpes, virus de vaccinia, virus de la anemia infecciosa
equina (EIAV, acrónimo de equine infectious anemia virus),
alfa-virus Sindbis y Semliki Forest, virus de
Ebstein Barr (EBV, Ebstein Barr Virus). Esto comprende también unos
virus con un tropismo alterado, obtenidos por modificación genética
de la proteína cápsida o una modificación química de la superficie
de la cápsida con polímeros hidrófilos y el ligando para dirección a
una diana.
Los vehículos no víricos se pueden seleccionar
entre lípidos catiónicos conocidos (es decir, unos lípidos que son
portadores de una carga eléctrica positiva neta global) o unos
polímeros que se pueden asociar con unas secuencias de nucleótidos
cargadas negativamente.
Ejemplos de lípidos catiónicos apropiados que se
pueden usar (para formar los denominados lipoplejos) son, por
ejemplo derivados de etil-fosfatidilcolina, en
particular ésteres de etil-fosfatidilcolina con
ácidos grasos, tales como
1,2-diestearoíl-sn-glicero-3-etil-fosfocolina
(Ethyl-DSPC o DSEPC),
1,2-dipalmitoíl-sn-glicero-3-etil-fosfocolina
(Ethyl-DPPC o DPEPC). Ejemplos de lípidos cargados
positivamente son sales de alquil-amonio con un ion
con carga de signo contrario de un halógeno (p. ej. cloro o bromo)
que comprende por lo menos una cadena de alquilo de
(C_{10}-C_{20}), preferiblemente de
(C_{14}-C_{18}), tal como, por ejemplo, cloruro
de estearil-amonio, cloruro de
hexadecil-amonio, bromuro de
dimetil-dioctadecil-amonio (DDAB),
bromuro de hexadecil-trimetil-amonio
(CTAB). Otros ejemplos de lípidos cargados positivamente son sales
de amonio terciarias o cuaternarias con un ion con carga de signo
contrario de un halógeno (p. ej. cloro o bromo) que comprende una o
preferiblemente dos cadenas de acilo de
(C_{10}-C_{20}), preferiblemente de
(C_{14}-C_{18}), enlazada(s) al átomo de
N a través de un puente de alquileno de
(C_{3}-C_{6}), tal como, por ejemplo,
1,2-diestearoíl-3-trimetil-amonio-propano
(DSTAP),
1,2-dipalmitoíl-3-trimetil-amonio-propano
(DPTAP),
1,2-dioleoíl-3-trimetil-amonio-propano
(DOTAP),
1,2-diestearoíl-3-dimetil-amonio-propano
(DSDAP).
Se pueden usar también lípidos catiónicos
sintéticos, tales como los que se describen en la patente de los
EE.UU. Nº 5.830.430, que se incorpora aquí por su referencia en su
totalidad. Éstos incluyen, por ejemplo,
tetrayoduro de
N,N'-bis-(dodecilaminocarbonilmetileno)-N,N'-bis(\beta-N,N,N-trimetilamoniometil-aminocarbonilmetilenetilen)diamina;
hexayoduro de
N,N''-bis-(hexadecilaminocarbonilmetileno)-N,N',N''-tris(\beta-N,N,N-trimetilamonio-etilaminocarbonilmetilendietilen)triamina;
tetrayoduro de
N,N'-bis(dodecilaminocarbonilmetilen)-N,N''-bis(\beta-N,N,N-
trimetilamonio-etilaminocarbonilmetilen)ciclohexilen-1,4-diamina,
heptayoduro de
1,1,7,7-tetra-(\beta3-N,N,N,N-tetrametilamonio-metilaminocarbonil-metilen)-3-hexadecilaminocar-
bonilmetilen-1,3,7-triaza-heptano; y
bonilmetilen-1,3,7-triaza-heptano; y
tetrayoduro de
N,N,N'N'-tetra(fosfoetanolaminocarbonilmetilen)dietilentriamina,
dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS);
trifluoroacetato de
2-3-dioleiloxi-N-(2-(esperminacarboxiamido)etil)-N,N-dimetil-1-propanaminio
(DOSPA);
dipalmitoíl-fosfatidil-etanolamidoespermina
(DPPES);
derivados de glicina y betaína tales como el
GB12; lípidos catiónicos portadores de una cadena doble insaturada
basada en el ácido
3,4-dihidroxi-benzoico (MVL5);
lípidos que contienen guanidina, tales como el
bis-guanidinio-tren-colesterol
(BGTC), derivados de colesterol tales como la
colesteril-3\beta-carboxiamidoetilen-dimetilamina
(DC-Chol).
\vskip1.000000\baselineskip
Opcionalmente, el ácido nucleico puede también
ser condensado previamente con sulfato de protamina (para formar las
denominadas "partículas LDP").
Los anteriores lípidos catiónicos pueden también
ser formulados en combinación con lípidos neutros y/o cargados
negativamente, que incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilcolinas
tales como dilauroíl-fosfatidilcolina (DALC),
dimiristoíl-fosfatidilcolina (DMPC),
dipalmitoíl-fosfatidilcolina (DPPC);
diaraquidoíl-fosfatidilcolina (DAPC),
diestearoíl-fosfatidilcolina (DSPC) o
dioleoíl-fosfatidilcolina (DOPC);
fosfatidiletanolaminas tales como
dimiristoíl-fosfatidiletanolamina (DMPE),
dipalmitoíl-fosfatidiletanolamina (DPPE),
diestearoíl-fosfatidiletanolamina (DSPE),
dioleil-fosfatidiletanolamina (DOPE),
diaraquidoíl-fosfatidiletanolamina (DAPE) o
dilinoleil-fosfatidiletanolamina (DLPE);
fosfatidilserinas, tales como
dimiristoíl-fosfatidilserina (DMPS),
diaraquidoíl-fosfatidilserina (DAPS),
dipalmitoíl-fosfatidilserina (DPPS),
diestearoíl-fosfatidilserina (DSPS),
dioleoíl-fosfatidilserina (DOPS); derivados de
ácidos fosfatídicos, tales como ácido
dipalmitoíl-fosfatídico (DPPA), ácido
dimiristoíl-fosfatídico (DMPA), ácido
diestearoíl-fosfatídico (DSPA), ácido
diaraquidoíl-fosfatídico (DAPA) y sus sales de
metales alcalinos; fosfatidilgliceroles, tales como dimiristoíl-
fosfatidilglicerol (DMPG) y sus sales de metales alcalinos,
dipalmitoíl-fosfatidilglicerol (DPPG) y sus sales de
metales alcalinos, diestearoíl-fosfatidilglicerol
(DSPG) y sus sales de metales alcalinos,
dioleoíl-fosfatidilglicerol (DOPG);
fosfatidilinositoles, tales como
dilauroíl-fosfatidilinositol (DLPI),
diaraquidoíl-fosfatidilinositol (DAPI),
dimiristoíl-fosfatidilinositol (DMPI),
dipalmitoíl-fosfatidilinositol (DPPI),
diestearoíl-fosfatidilinositol (DSPI),
dioleoíl-fosfatidilinositol (DOPI);
fosfatidiletanolaminas modificadas con PEG, tales como
DMPE-PEG1000, DMPE-PEG2000,
DMPE-PEG3000, DMPE-PEG4000,
DMPE-PEG5000, DPPE-PEG1000,
DPPE-PEG2000, DPPE-PEG3000,
DPPE-PEG4000, DPPE-PEG5000,
DSPE-PEG1000, DSPE-PEG2000,
DSPE-PEG3000, DSPE-PEG4000,
DSPE-PEG5000, DAPE-PEG1000,
DAPE-PEG2000, DAPE-PEG3000,
DAPE-PEG4000 o DAPEPEG5000; sales de ácidos
biliares tales como sales de ácido cólico, sales de ácido
desoxicólico o sales de ácido glicocólico; y sales de ácidos grasos
de (C_{12}-C_{24}), preferiblemente de
(C_{14}-C_{22}), tales como, por ejemplo una
sal de ácido palmítico, una sal de ácido esteárico, una sal de
1,2-dipalmitoíl-sn-3-succinilglicerol
o una sal de
1,3-dipalmitoíl-2-succinilglicerol;
colesterol, o lípidos polimerizados (tales como unos lípidos que
comprenden por ejemplo restos de cisteína o de tiol para hacer
posible una policondensación oxidante de lípidos).
Además, también se pueden emplear ventajosamente
los derivados fluorados de los anteriores lípidos.
El vehículo obtenido que contiene el ácido
nucleico, o bien puede estar en la forma de un único complejo de
material genético con el lípido (lipoplejo), o una pluralidad de
complejos pueden ser asociados conjuntamente para formar unas
estructuras "supramoleculares" tales como, por ejemplo, micelas
o liposomas.
Alternativamente, o además de las anteriores
formulaciones de lípidos, ciertos ácidos nucleicos pueden también
ser asociados con polímeros (para formar los/las denominados/as
poliplejos o nanopartículas poliméricas). Ejemplos de polímeros
apropiados son polímeros o copolímeros sintéticos que se preparan a
partir de unos monómeros seleccionados entre el conjunto que
consiste en ácido acrílico, ácido metacrílico, etilenimina, ácido
crotónico, acrilamida, acrilato de etilo, metacrilato de metilo,
metacrilato de 2-hidroxi-etilo,
ácido láctico, ácido glicólico,
\varepsilon-caprolactona, acroleína, un
cianoacrilato, un cianometacrilato, bisfenol A, epiclorhidrina,
acrilatos de hidroxialquilo, un siloxano, un
dimetil-siloxano, óxido de etileno, etilenglicol,
metacrilatos de hidroxialquilo, acrilamidas substituidas en N,
metacrilamidas substituidas en N,
N-vinil-2-pirrolidona,
2,4-pentadien-1-ol,
acetato de vinilo, acrilonitrilo, estireno,
p-amino-estireno,
p-amino-bencil-estireno,
estireno sulfonato de sodio,
2-sulfoxietil-metacrilato de sodio,
vinil-piridina, metacrilatos de aminoetilo,
lactidas, y cloruro de
2-metacriloíloxi-trimetil-amonio.
Ejemplos de (co-)polímeros sintéticos son, por ejemplo, un
poli(ácido acrílico), una poli(etilenimina), un poli(ácido
metacrílico), un poli(metacrilato de metilo), un
poli(cianometacrilato), una dendrímeros de
poli(amido-aminas), dendrímeros de compuestos
orgánicos de fósforo, un polisiloxano, un
poli(dimetil-siloxano), un poli(ácido
láctico), una
poli(\varepsilon-caprolactona), una resina
epoxídica, una poliamida, un
poliviniliden-poliacrilonitrilo, un
poliviniliden-poliacrilonitrilo-poli(metacrilato
de metilo), polímeros de
poli(lactida-co-glicolida
(tales como polímeros de
poli-(d-L-lactida-co-glicolida),
nylon y un poliestireno-poliacrilonitrilo así como
monómeros reticuladores polifuncionales tales como
N,N'-metilen-bisacrilamida,
dimetacrilatos de etilenglicol, dimetacrilato de
2,2'-(p-fenilendioxi)-dietilo,
divinil-benceno, trialil-amina y
metilen-bis-(4-fenil-isocianato),
incluyendo combinaciones de los mismos, tales como compuestos
polivinílicos (tales como, por ejemplo un poli(alcohol
vinílico) (PVA), un poli(cloruro de vinilo) y una
poli(vinil-pirrolidona)), un poliestireno,
poli(ácidos lácticos), hidrocarburos fluorados, carbonos fluorados
(tales como, por ejemplo, poli(tetrafluoroetileno), y
poli(metacrilato de metilo), y derivados de los mismos.
También se incluyen compuestos anfífilos que se componen de
polímeros catiónicos que han sido modificados covalentemente con
grupos hidrófobos (p. ej. restos de lípidos tales como palmitoílo)
y/o grupos hidrófilos (de un poli(etilenglicol)). Los
polímeros pueden opcionalmente estar reticulados, si se desea, para
intensificar, por ejemplo, la estabilidad de las nanopartículas.
Esto se podría conseguir mediante reticulación de polímeros
portadores de cisteína mediante una policondensación oxidante.
Ejemplos de polímeros naturales incluyen
hidratos de carbono o polisacáridos que se presentan en la
naturaleza tales como, por ejemplo, polímeros de, o formados a
partir de, arabinanos, fructanos, fucanos, galactanos,
galacturonanos, glucanos, mananos, xilanos (tales como, por ejemplo,
inulina), levano, fucoidano, carragenano, galatocarolosa, ácido
péptico, pectinas, incluyendo amilosa, pululano, glicógeno,
amilopectina, celulosa, dextrano, dextrina, dextrosa, una
polidextrosa, pustulano, quitina, quitosano, agarosa, queratano,
condroitano, dermatano, ácido hialurónico, ácido algínico, goma de
xantano, un almidón, heparina (incluyendo, por ejemplo, sulfato de
heparina o sulfato de heparitina), y otros diversos homopolímeros o
heteropolímeros naturales, tales como los que contienen una o más
de las/los siguientes aldosas, cetosas, ácidos o aminas: eritrosa,
treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, glucosa,
manosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa, eritrulosa, ribulosa,
xilulosa, psicosa, fructosa, sorbosa, tagatosa, manitol, sorbitol,
lactosa, sacarosa, trehalosa, maltosa, celobiosa, glicina, serina,
treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, ácido
aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, histidina, ácido
glucurónico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido galacturónico,
ácido manurónico, glucosamina, galactosamina y ácido neuramínico, y
derivados de los mismos que se presentan en la naturaleza.
Correspondientemente, unos apropiados polímeros naturales incluyen,
por ejemplo, proteínas tales como una albúmina, un colágeno y una
gelatina. Ejemplos de polímeros semi-sintéticos
incluyen carboximetil-celulosa,
hidroximetil-celulosa,
hidroxipropil-metil-celulosa,
metil-celulosa y
metoxi-celulosa.
El tiempo de permanencia del vehículo (así como
de las microcápsulas) en la circulación sistémica se puede ajustar
(preferiblemente aumentar) incorporando en él unos apropiados
materiales poliméricos, incluyendo, por ejemplo, polietilenos
(tales como, por ejemplo, un poli(etilenglicol), un
poli(oxietileno) y un poli(tereftalato de etileno),
polipropilenos (tales como, por ejemplo, un
poli(propilenglicol)), copolímeros de poli(oxietileno)
y de poli(oxipropileno), incluyendo copolímeros de bloques
de poli(oxietileno) y poli(oxipropileno), derivados
de poli(oxialquileno) de poli(etilenglicol), tales
como, por ejemplo la clase de compuestos citados como Pluronics®,
disponibles comercialmente de BASF, Parsippany, N.J.).
Igual que para los lipoplejos, también se pueden
formular poliplejos como entidades singulares únicas o en
estructuras más complejas tales como micelas o liposomas. Además de
composiciones formuladas a partir de lípidos y/o polímeros, los
métodos del presente invento pueden implicar también unas
composiciones y unas vesículas que comprenden péptidos catiónicos
tales como el péptido KALA (derivado de la subunidad
HA-2 de influenza), melitina, TAT. Además, también
están previstas unas formulaciones que comprenden combinaciones de
cualquiera de los anteriores lípidos y polímeros. Por ejemplo un
vehículo de genes puede incluir unos lipopoliplejos, en los que el
material genético está condensado con un policatión y atrapado
dentro de liposomas aniónicos o neutros.
De acuerdo con una forma de realización
alternativa, dicho agente bioactivo es un fármaco, que incluye, por
ejemplo, agentes antineoplásicos, tales como vincristina,
vinblastina, vindesina, busulfano, clorambucil, espiroplatino,
cisplatino, carboplatino, metotrexato, adriamicina, mitomicina,
bleomicina, citosina arabinósido, arabinosil adenina,
mercaptopurina, mitotano, procarbazina, dactinomicina (antinomicina
D), daunorrubicina, hidrocloruro de doxorrubicina, taxol,
plicamicina, aminoglutetimida, estramustina, flutamida, leuprolida,
acetato de megestrol, tamoxifeno, testolactona, trilostano,
amsacrina (m-AMSA), asparaginasa
(L-asparaginasa), etoposido, los interferones
\alpha-2a y 2b, productos sanguíneos tales como
las hematoporfirinas o derivados de los precedentes; agentes
modificadores de la respuesta biológica, tales como muramil -
péptidos; agentes antifúngicos, tales como ketoconazol, nistatina,
griseofulvina, flucitosina, miconazol o amfotericina B; hormonas o
compuestos análogos a hormonas, tales como una hormona del
crecimiento, la hormona estimuladora de melanocitos, estradiol,
dipropionato de beclometasona, betametasona, acetato de cortisona,
dexametasona, flunisolida, hidrocortisona,
metil-prednisolona, acetato de parametasona,
prednisolona, prednisona, triamcinolona o acetato de
fludrocortisona; vitaminas, tales como cianocobalamina o
retinoides; enzimas, tales como una fosfatasa alcalina o manganeso
superóxido dismutasa; agentes antialérgicos, tales como amelexanox;
agentes anticoagulantes, tales como warfarina, fenprocoumona o
heparina; agentes antitrombóticos; fármacos circulatorios, tales
como propranolol; agentes potenciadores metabólicos, tales como
glutatión; agentes antituberculosos, tales como ácido
p-amino-salicílico, isoniazida,
sulfato de capreomicina, ciclosexina, etambutol, etionamida,
pirazinamida, rifampina o sulfato de estreptomicina; agentes
antivíricos, tales como aciclovir, amantadina, azidotimidina,
ribavirina o vidarabina; agentes dilatadores de los vasos
sanguíneos, tales como diltiazem, nifedipina, verapamil,
tetranitrato de eritritol, dinitrato de isosorbida, nitroglicerina
o tetranitrato de pentaeritritol; antibióticos, tales como dapsona,
cloranfenicol, neomicina, cefacloro, cefadroxil, cefalexina,
cefradina, eritromicina, clindamicina, lincomicina, amoxicilina,
ampicilina, bacampicilina, carbenicilina, dicloxacilina,
ciclacilina, picloxacilina, hetacilina, meticilina, nafcilina,
penicilina o tetraciclina; agentes antiinflamatorios, tales como
diflunisal, ibuprofeno, indometacina, meclefenamato, ácido
mefenámico, naproxeno, fenilbutazona, piroxicam, tolmetina,
aspirina o salicilatos; agentes antiprotozoicos, tales como
cloroquina, metronidazol, quinina o antimoniato de meglumina;
agentes antirreumáticos, tales como penicilamina; agentes
narcóticos, tales como paregoric; agentes opiáceos, tales como
codeína, morfina u opio; glucósidos cardiacos, tales como
deslanesida, digitoxina, digoxina, digitalina o digitalis; agentes
bloqueadores neuromusculares, tales como mesilato de atracurio,
trietoyoduro de galamina, bromuro de hexafluorenio, yoduro de
metocurina, bromuro de pancuronio, cloruro de succinilcolina,
cloruro de tubocurarina o bromuro de vecuronio; agentes sedantes,
tales como amobarbital, amobarbital sódico, apropbarbital,
butabarbital sódico, hidrato de cloral, etoclorovinol, etinamato,
hidrocloruro de flurazepam, glutetimida, hidrocloruro de
metotrimeprazina, metiprilón, hidrocloruro de midazolam,
paraldehído, pentobarbital, secobarbital sódico, talbutal,
temazepam o triazolam; agentes anestésicos locales, tales como
bupivacaína, cloroprocaína, etidocaína, lidocaína, mepivacaína,
procaína o tetracaína; agentes anestésicos generales tales como
droperidol, etomidato, citrato de fentanil con droperidol,
hidrocloruro de ketamina, metohexital sódico o tiopental y sales
farmacéuticamente aceptables (p. ej. sales por adición de ácidos
tales como el hidrocloruro o hidrobromuro o sales de bases tales
como sales de sodio, calcio o magnesio) o derivados (p. ej.
acetatos) de los mismos; y agentes radioquímicos, p. ej. que
comprenden emisores alfa, beta o gamma tales como, por ejemplo,
^{177}Lu, ^{90}Y o ^{131}I.
Los anteriores fármacos pueden estar presentes
como tales en la composición del invento o preferiblemente son
asociados con unos componentes estabilizadores, para formar p. ej.
micelas o liposomas. Ejemplos de compuestos apropiados son
fosfolípidos, incluyendo diésteres con ácidos grasos de
fosfatidilcolina, etil-fosfatidilcolina,
fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina,
fosfatidilserina o esfingomielina; fosfolípidos modificados con
PEG, incluyendo en particular fosfatidiletanolaminas modificadas con
PEG; sales de amonio, tales como las anteriormente enumeradas, que
comprenden una o preferiblemente dos cadenas de acilo de
(C_{10}-C_{20}), preferiblemente de
(C_{14}-C_{18}), enlazadas al átomo de N a
través de un puente de alquileno de
(C_{3}-C_{6}), tales como
1,2-diestearoíl-3-trimetilamonio-propano
(DSTAP),
1,2-dipalmitoíl-3-trimetilamonio-propano
(DPTAP),
1,2-dioleoíl-3-dipalmitoíl-3-trimetilamonio-propano
(DOTAP),
1,2-diestearoíl-3-dimetilamonio-propano
(DSDAP); sales de ácidos grasos, preferiblemente sales de metales
alcalinos, en particular de sodio, tales como palmitato de sodio,
estearato de sodio, oleato de sodio, linoleato de sodio, dodecanoato
de sodio, una sal de sodio de
1,2-dipalmitoíl-sn-3-succinilglicerato
o una sal de sodio de
1,3-dipalmitoíl-2-succinilglicerol.
Se pueden usar también agentes tensioactivos poliméricos, tales
como, por ejemplo, poli(óxidos de etileno) (PEO), tales como un PEO
- n-alquil de
(C_{8}-C_{16})-monoéter, un
n-alquil de
(C_{8}-C_{10})-fenil PEO,
tetrametilbutilfenil PEO, un PEO polisorbatos, siendo vendidos
estos PEO bajo los nombres comerciales registrados de Brij®,
Lubrol®, Triton®, Nonidet® o Tween®; copolímeros de bloques tales
como copolímeros de bloques de óxido de etileno y óxido de
propileno (p. ej. Pluronic® o Synperonic®), que tienen
preferiblemente un PM (peso molecular) desde aproximadamente 3.000
a 20.000 daltones, preferiblemente de desde 5.000 a 15.000 daltones;
derivados de azúcares tales como un alquil de
(C_{6}-C_{10})-\beta-D-glucopiranósido,
un alquil de
(C_{8}-C_{12})-\beta-D-maltósido;
un alquil de
(C_{8}-C_{16})-dimetilamonio-propano-sulfonato;
y ácidos biliares y derivados de los mismos, tales como colato de
sodio o desoxicolato de sodio.
De acuerdo con una forma preferida de
realización del invento, un fármaco se puede suministrar por vía
local en combinación con un material genético, permitiendo de esta
manera una terapia farmacéutica/genética combinada del paciente (p.
ej. en el caso de un tratamiento de tumores).
Cualquiera que sea el vehículo empleado para
asociar el agente bioactivo, es importante que una parte relevante
del resultante "vehículo bioactivo" (es decir el vehículo
asociado con el agente bioactivo) no sea incorporada establemente
dentro de la envoltura de las microcápsulas ni asociada con ésta, de
manera tal que la mayor cantidad del material genético esté libre
para penetrar en la célula después de una aplicación de ultrasonidos
y de un estallido de las microcápsulas.
Los vehículos bioactivos se preparan tal como es
conocido en la especialidad. Preferiblemente, ellos se obtienen como
unos materiales liofilizados, que han de ser reconstituidos antes
del uso con un apropiado vehículo fisiológicamente aceptable.
Por ejemplo, unos vehículos bioactivos en la
forma de micelas se pueden preparar dispersando el agente bioactivo
y el lípido o compuesto polimérico en un vehículo líquido acuoso, y
opcionalmente agitando la mezcla. Ejemplos de apropiados vehículos
líquidos son agua, una solución salina (cloruro de sodio al 0,9%),
una solución salina tamponada con fosfato (10 mM, de pH 7,4), un
tampón HEPES (20 mM de pH 7,4), glucosa al 5% p/p (peso/peso) en
agua. Por ejemplo los compuestos anteriores pueden ser dispersados
en una concentración de desde aproximadamente 1 hasta 100 mg/ml en
un líquido acuoso y disueltos por medio de agitación o
sonicación.
Las micelas pueden ser luego almacenadas como
una dispersión acuosa (p. ej., en el vehículo acuoso que se ha
usado para su preparación) antes de ser administradas o añadidas y
mezcladas con una suspensión que contiene microcápsulas.
Alternativamente, la suspensión de micelas se puede liofilizar de
acuerdo con técnicas convencionales, con el fin de eliminar el
líquido y almacenar el producto seco final para los usos
subsiguientes.
Los anteriores vehículos se pueden modificar
adicionalmente para incluir un apropiado ligando para dirección a
una diana. Esta modificación adicional permite que el vehículo, que
es portador del agente bioactivo, se fije selectivamente a una
célula, un tejido o un órgano que se desee, a la o al que será
suministrado el agente bioactivo.
El término "ligando para dirección a una
diana" incluye dentro de su significado cualquier compuesto,
resto o residuo que tenga, o sea capaz de promover, una actividad
de dirección a una diana del vehículo que comprende el material
genético hacia cualquier sitio biológico o patológico dentro de un
cuerpo vivo. Las dianas con las que se puede asociar el ligando
para dirección a una diana incluyen tejidos, tales como, por
ejemplo, un tejido de miocardio (incluyendo células de miocardio y
cardiomiocitos), tejidos membranosos (incluyendo endotelio y
epitelio), láminas, un tejido conjuntivo (incluyendo tejido
intersticial) o tumores; coágulos de sangre; y receptores, tales
como, por ejemplo receptores de superficies celulares para hormonas
peptídicas, agentes neurotransmisores, antígenos, fragmentos del
complemento, inmunoglobulinas y receptores citoplasmáticos para
hormonas esteroides.
Los materiales o las sustancias que pueden
servir como ligandos para dirección a una diana incluyen, por
ejemplo, pero no se limitan a, proteínas, incluyendo anticuerpos,
fragmentos de anticuerpos, moléculas de receptores, moléculas de
fijación a receptores, glicoproteínas y lectinas; péptidos,
incluyendo oligopéptidos y polipéptidos; agentes peptidomiméticos;
sacáridos, incluyendo mono- y poli-sacáridos;
vitaminas; esteroides, compuestos análogos a esteroides, hormonas,
cofactores, agentes bioactivos y material genético, incluyendo
nucleósidos, nucleótidos y polinucleótidos.
Ejemplos de apropiadas/os dianas y ligandos para
dirección a una diana se describen, por ejemplo, en la patente de
los EE. UU. nº 6.139.819.
El ligando para dirección a una diana puede ser
un compuesto per se, que se añade y mezcla con los otros
componentes del vehículo, o puede ser un compuesto que está unido a
una molécula incluida en el vehículo.
En una forma de realización preferida, el
ligando para dirección a una diana puede ser unido a una molécula
del vehículo a través de un enlace covalente. En dicho caso, el
resto reactivo específico, que necesita estar presente en la
molécula, dependerá del particular ligando para dirección a una
diana, que se ha de acoplar con él. Como un ejemplo, si el ligando
para dirección a una diana puede ser enlazado a la molécula a través
de un grupo amino, unos apropiados restos reactivos para la
molécula pueden ser grupos de isotiocianato (que formarán un enlace
de tiourea), ésteres reactivos (para formar un enlace de amida),
grupos de aldehído (para la formación de un enlace de imina que ha
de ser reducido para dar un enlace de alquilamina), etc; si el
ligando para dirección a una diana puede ser enlazado a la molécula
a través de un grupo de tiol, unos apropiados restos reactivos
complementarios para la molécula incluyen derivados de haloacetilo o
maleimidas (para formar un enlace de tioéter); y si el ligando para
dirección a una diana puede ser enlazado a la molécula a través de
un grupo carboxílico, apropiados restos reactivos para la molécula
pueden ser aminas e hidrazidas (para formar enlaces de amidas o
alquilamidas). Con el fin de unir covalentemente un deseado ligando
para dirección a una diana, por lo menos una parte de los
compuestos que forman el vehículo deberá contener por lo tanto un
apropiado resto reactivo y el ligando para dirección a una diana que
contiene la funcionalidad complementaria será enlazado a él de
acuerdo con técnicas conocidas; p. ej. añadiéndolo a una dispersión
acuosa que comprende los apropiados componentes del vehículo. El
compuesto puede ser combinado con el deseado ligando para dirección
a una diana antes de preparar el vehículo, y la combinación así
obtenida se puede usar en el proceso de preparación del vehículo.
Alternativamente, el ligando para dirección a una diana puede ser
enlazado al respectivo compuesto durante el proceso de preparación
del vehículo o puede ser enlazado directamente al compuesto que ya
está incorporado en el vehículo.
De acuerdo con una forma alternativa de
realización, el ligando para dirección a una diana puede también ser
asociado de una manera apropiada con el vehículo mediante una
interacción física y/o electrostática. Como un ejemplo, un resto
funcional que tiene una afinidad y una selectividad altas para un
resto complementario, se puede introducir dentro de una molécula
del vehículo, mientras que el resto complementario será enlazado al
ligando para dirección a una diana. Por ejemplo, un resto de avidina
(o estreptavidina, neutravidina o de Extravidin®) (que tiene una
alta afinidad para biotina) puede ser enlazada covalentemente a un
fosfolípido mientras el resto de biotina complementario puede ser
incorporado en un apropiado ligando para dirección a una diana, p.
ej. un péptido o un anticuerpo. El ligando para dirección a una
diana, marcado con biotina, será de esta manera asociado con el
fosfolípido marcado con avidina del vehículo por medio del sistema
de acoplamiento entre avidina y biotina. Alternativamente, tanto el
fosfolípido como el ligando para dirección a una diana pueden ser
provistos de un resto de biotina y subsiguientemente acoplados unos
con otros por medio de avidina (que es un componente bifuncional
capaz de formar un puente entre las dos moléculas de biotina).
Ejemplos de un acoplamiento entre biotina/avidina de fosfolípidos y
péptidos se describen también en el documento US 6.139.819, que
antes se ha citado. Alternativamente, unas interacciones de van der
Waal's, interacciones electrostáticas y otros procesos de
asociación pueden asociar o unir el ligando para dirección a una
diana con las moléculas deseadas.
De acuerdo con una forma alternativa de
realización, el ligando para dirección a una diana puede ser un
compuesto que se ha añadido y mezclado con los componentes que
forman el vehículo, para ser incorporado eventualmente dentro del
vehículo, tal como, por ejemplo, un lipopéptido como se describe p.
ej. en los documentos WO 98/18501 o 99/55383.
Alternativamente, se puede producir primeramente
un vehículo, que comprende un compuesto que tiene un apropiado
resto capaz de interactuar con un correspondiente resto
complementario de un ligando para dirección a una diana; después de
esto el deseado ligando para dirección a una diana es añadido a una
suspensión del vehículo, para unirlo con el correspondiente resto
complementario situado en el vehículo.
Ejemplos de apropiadas dianas específicas, hacia
las que puede ser dirigido el conjunto, son, por ejemplo, fibrina y
el receptor de fijación a GPIIbIIIa en plaquetas activadas. La
fibrina y las plaquetas están de hecho generalmente presentes en
"trombos", es decir coágulos que se pueden formar en el
torrente sanguíneo, y causar una obstrucción vascular. Se describen
apropiados péptidos de fijación, por ejemplo en el documento US
6.139.819 que antes se ha citado. Unos péptidos de fijación
adicionales, específicos para dirección a una diana de fibrina, se
describen, por ejemplo, en el documento WO 02/055544.
Otros ejemplos de dianas importantes incluyen
receptores en placas vulnerables y receptores específicos para
tumores, tal como una región de dominio de cinasa (KDR acrónimo de
kinase domain region) y un complejo de VEGF (factor de crecimiento
endotelial vascular) y KDR. Unos péptidos de fijación apropiados
para la KDR o para el complejo de VEGF y KDR se describen, por
ejemplo, en los documentos WO 03/74005 y WO 03/084574. Otros
ejemplos de ligandos específicos para tumores son, por ejemplo,
transferrina, ácido fólico, una secuencia de
arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), una
secuencia NRG (para dirigir hacia una diana la aminopeptidasa
expresada en vasos que se han formado de nuevas) o la secuencia de
péptido GA3 (el receptor de Tie2 diana implicado en una angiogénesis
de tumor).
La composición del invento puede contener
además, si se desea, un agente de diagnóstico, que también se puede
incorporar en el anterior vehículo o se puede proporcionar como una
entidad separada.
El término "agente de diagnóstico" incluye
dentro de su significado cualquier compuesto, composición o
partícula que se pueda usar en conexión con métodos de diagnóstico,
incluyendo reproducir en imágenes una región interna de un paciente
y/o diagnosticar la presencia o ausencia de una enfermedad en un
paciente. Agentes de diagnóstico ilustrativos incluyen, por
ejemplo, agentes de contraste destinados a su uso en conexión con la
reproducción en imágenes por ultrasonidos (p. ej. microburbujas
rellenas con un gas), la reproducción en imágenes por resonancia
magnética, la reproducción en imágenes por rayos X, en particular
una tomografía computarizada, una reproducción en imágenes ópticas,
una reproducción en imágenes nucleares o una reproducción en
imágenes moleculares de un paciente, que incluyen, por ejemplo,
nanopartículas de magnetita. Un agente de diagnóstico puede ser
útil, por ejemplo para identificar el lugar exacto donde se han de
aplicar ondas de ultrasonidos, con el fin de determinar un
suministro efectivo del agente bioactivo.
La composición del invento puede contener además
unos apropiados agentes adyuvantes para intensificar aún más el
suministro del agente bioactivo, en particular de un material
genético, dentro de células. Unos adyuvantes útiles incluyen,
poli(oxialquilen) ésteres de ácidos grasos (tales como
poli(oxietilen) ésteres de ácidos grasos),
poli(oxialquilen) alcoholes grasos (tales como
poli(oxietilen) alcoholes grasos), poli(oxialquilen)
éteres de alcoholes grasos (tales como poli(oxietilen) éteres
de alcoholes grasos), poli(oxialquilen) ésteres de ácidos
grasos de sorbitán (tales como, por ejemplo, la clase de compuestos
que se citan como TWEEN®, disponibles comercialmente de ICI
Americas, Inc., Wilmington, Del.), poli(etilenglicoles) (PEG)
con diversos pesos moleculares, copolímeros de
poli(oxietileno) y poli(oxipropileno) (tales como
Pluronics®, Synperonic®) preferiblemente con un balance
hidrófilo-lipófilo (HLB, acrónimo de
hydrophilic-lipophilic balance) superior a 10 (p.
ej. Pluronic F68, F127 o F85), polisorbatos (tales como Tween20,
Tween40, y Tween80), poli(oxietilen) alcoholes (tales como
Brij) y plasmalógenos, que es el término que se aplica a un grupo de
fosfolípidos presentes en plaquetas que liberan aldehídos grasos
superiores, p. ej. palmital. También se conoce que unos anestésicos
locales tales como lidocaína, ropivacaína, bupivacaína,
mepivacaína, así como fenobarbital o pentobarbital, aumentan la
fluidez de las membranas y pueden mejorar aún más el suministro de
genes después de una insonación. Se pueden usar también derivados
de 1-4-dihidropirina (p. ej.
hexadecil 4 beta piridilo) así como alquil glicósidos y derivados de
alquil poliglicósidos.
La composición del invento puede ser formulada
en una diversidad de maneras, con el fin de ser administrada en un
método para suministrar eficazmente un agente bioactivo dentro de
una célula.
Por ejemplo, la composición se puede obtener
añadiendo y mezclando una suspensión acuosa que comprende las
microcápsulas (obtenida de acuerdo con cualquiera de los métodos de
producción antes citados) con una suspensión acuosa que comprende
el agente bioactivo, asociado preferiblemente con un vehículo
apropiado. Los productos son de hecho reconstituibles con facilidad
en un vehículo líquido acuoso apropiado, que es fisiológicamente
aceptable, estéril e inyectable, para formar las microvesículas
rellenas con un gas. Apropiados vehículos líquidos son agua,
soluciones acuosas tales como una solución salina (que
ventajosamente puede estar equilibrada de manera tal que el
producto final para inyección no sea hipotónico), o soluciones de
una o más sustancias que ajustan la tonicidad, tales como sales o
azúcares, alcoholes de azúcares, glicoles u otros materiales
polioles no iónicos (p. ej. glucosa, sacarosa, sorbitol, manitol,
glicerol, poli(etilenglicoles), propilenglicoles y
similares). Si se desea, se pueden añadir a la formulación aditivos
apropiados, tales como, por ejemplo, los adyuvantes anteriormente
mencionados.
Después de su formación, la suspensión que
comprende la composición del invento se puede almacenar para una
administración subsiguiente o se puede administrar directamente. Si
se desea, el vehículo líquido de la suspensión puede ser eliminado
(p. ej., mediante una liofilización) para obtener un polvo seco de
la composición, que puede ser almacenado (preferiblemente en la
presencia de un gas apropiado para formar las microcápsulas rellenas
con un gas, después de su reconstitución) durante unos períodos de
tiempo relativamente largos antes de su reconstitución.
Alternativamente, los componentes de la
composición pueden ser almacenados como composiciones separadas en
una forma secada (preferiblemente liofilizada) y reconstituidos como
una suspensión antes de la administración. Para el almacenamiento,
los componentes secados son preferiblemente mantenidos en una
atmósfera del gas que formará las microcápsulas después de una
reconstitución. La reconstitución con un vehículo líquido acuoso
puede tener lugar por separado en las dos composiciones secadas que
comprenden los respectivos componentes, obteniendo de esta manera
dos suspensiones separadas. Éstas pueden ser luego administradas por
separado o añadidas y mezcladas antes de la administración. De
acuerdo con una forma preferida de realización, una suspensión del
agente bioactivo secado se usa para reconstituir la composición de
microcápsulas secadas, para obtener finalmente una suspensión de la
composición. Opcionalmente, el agente bioactivo liofilizado
(asociado preferiblemente con un vehículo) es en primer lugar
reconstituido con un vehículo acuoso fisiológicamente aceptable y
luego la suspensión obtenida es usada para reconstituir la
composición de microcápsulas secadas.
Unas composiciones inyectables (también después
de una reconstitución de la composición liofilizada) deberán ser,
siempre que sea posible, isotónicas con la sangre. Por lo tanto,
antes de una inyección, se pueden añadir también pequeñas
cantidades de agentes isotónicos a las suspensiones que comprenden
el conjunto del invento. Los agentes isotónicos son unas soluciones
fisiológicas usadas corrientemente en medicina, tales como, por
ejemplo, una solución salina acuosa (NaCl al 0,9%), una solución al
2,6% de glicerol o una solución al 5% de dextrosa. La reconstitución
de las suspensiones acuosas se obtiene generalmente por simple
disolución del agente tensioactivo que forma películas secadas y
almacenadas en gas, y por suave agitación.
El volumen y las concentraciones del líquido de
reconstitución se pueden equilibrar deseablemente para hacer
sustancialmente isotónicas a las resultantes formulaciones prestas
para el uso. Por lo tanto, el volumen y la concentración del fluido
de reconstitución escogido dependerán del tipo y de la cantidad del
agente estabilizador (y de otros agentes de voluminosidad) presentes
en el producto liofilizado.
El presente invento se dirige también a un
estuche farmacéutico que comprende microcápsulas y un agente
bioactivo, tal como antes se han definido. Los componentes se
pueden mezclar conjuntamente o disponer por separado en el estuche,
ya sea como suspensiones o como componentes liofilizados.
Preferiblemente, ambos componentes se proporcionan en una forma
liofilizada, por ejemplo en recipientes separados, tales como viales
o paquetes separados. El estuche puede comprender, por lo tanto,
además un vehículo fisiológicamente aceptable apropiado, tal como
los que anteriormente se han enumerado, para reconstituir los
componentes liofilizados (ya sea por separado o en una única
suspensión). El estuche farmacéutico puede comprender además unos
convencionales componentes de estuches conocidos para los expertos
en la especialidad, una vez que se han armado o montado de acuerdo
con la presente descripción, tales como viales mezcladores,
jeringas, agujas.
La dosificación útil de microcápsulas y del
agente bioactivo que se ha de administrar o suministrar, así como
el modo de administración, variaran dependiendo del tipo y de la
naturaleza del compuesto que se ha de suministrar, de la edad, del
peso, de las células del paciente (animal) que se ha de tratar, de
la particular aplicación diagnóstica, terapéutica o de otro tipo,
pretendida (incluyendo el estado patológico, si lo hay, que se ha
de tratar) y el vehículo (si lo hay) que se emplee. Típicamente, la
dosificación es iniciada en unos niveles más bajos y se puede
aumentar hasta que se consiga el deseado efecto terapéutico. Las
microcápsulas y el agente bioactivo de una composición del invento
se pueden administrar ya sea concurrentemente (p. ej. en una misma
solución fisiológica), o en momentos subsiguientes, formando de esta
manera la composición del invento en el sitio deseado en el que se
aplican los ultrasonidos. En este último caso, el agente bioactivo
puede ser administrado en primer lugar, con el fin de dejar tiempo
suficiente para que éste circule y/o se una con la diana deseada
(en el caso de que sea asociado con un vehículo dirigido a diana).
Alternativamente, las microcápsulas se pueden administrar en primer
lugar, seguido por la administración del agente bioactivo.
Los expertos en la especialidad, basándose en la
presente descripción y en la bibliografía médica general serán
capaces de ajustar la deseada dosificación, incluyendo cualesquiera
cantidades de dosificación terapéuticamente efectivas.
La composición del invento se puede administrar
de diversas maneras, también dependiendo de su formulación
específica. Ejemplos de administraciones apropiadas son, por
ejemplo, las efectuadas por las vías intravascular, intralinfática,
parenteral, subcutánea, intramuscular, intradérmica,
intraperitoneal, intersticial, intratecal, intranasal, por la vía
de nebulizadores dentro de las vías aéreas, por vía ocular, oral,
intrarrectal, tópica, o por vía intratumoral, usando una variedad
de formas de dosificación. El método de administración por vía
tópica es la inyección de una secuencia de nucleótidos (o de otro
compuesto que se haya de suministrar), por un catéter de globo
poroso (de SCIMED Remedy, Boston Scientific, Natick, MA) o por un
catéter de inyección con agujas (Boston Scientific, Natik, MA). El
catéter de globo (que contiene unos canales) es introducido en el
torrente sanguíneo de un paciente. Una vez que el globo del catéter
alcanza el lugar en el que se ha de administrar el agente
bioactivo, el globo es inflado por bombeo y luego una mezcla de
microcápsulas y del agente bioactivo es infundida a través del
canal suministrando de esta manera la composición a la pared del
vaso. Se aplica luego un ultrasonido en el sitio deseado, ya sea
internamente (por ejemplo por vía endoscópica o intramuscular) o
externamente. Un segundo catéter para suministro de fármacos está
basado en un catéter de inyección con agujas, haciendo posible la
administración directa de las microcápsulas y del agente bioactivo
en el sitio deseado, seguido luego por una exposición a ultrasonidos
como antes se ha descrito.
Los conceptos de "ultrasonido",
"aplicaciones por ultrasonidos" y términos similares se
refieren a ondas de energía sonora, transmitidas preferiblemente de
una manera repetitiva, en lo suficiente para inducir un estallido
sustancial de microcápsulas rellenas con un gas y ayudar al
suministro de un agente bioactivo dentro de una célula.
Preferiblemente, el ultrasonido está en el intervalo de frecuencias
de desde aproximadamente 20 kHz hasta menos de aproximadamente 50
MHz, con un nivel de energía (también citado como intensidad
promediada en el tiempo de pico espacial, I_{spta}) de desde
aproximadamente 0,5 mW/cm^{2} hasta aproximadamente 10
W/cm^{2}. Para el método específico del invento, dicho ultrasonido
tendrá preferiblemente una presión acústica de por lo menos 200 kPa
a una frecuencia de 1,15 MHz, o de por lo menos 300 kPa a una
frecuencia de 2,25 MHz, que aumenta hasta p. ej. 10 MPa.
Típicamente, el ultrasonido es aplicado mediante aplicación externa,
por medio de convencionales dispositivos clínicos de ultrasonidos o
un transmisor de un único elemento, pero también se pueden aplicar
internamente, tal como por vía endoscópica e intravascular, como
antes se ha descrito.
Típicamente, se requieren unos niveles de
energía más altos y unas frecuencias ultrasónicas más bajas para la
penetración dentro de tejidos asentados profundamente; se pueden
usar unos niveles de energía más bajos y unas frecuencias
ultrasónicas más altas para el tratamiento de tejidos superficiales
o cuando el transductor de ultrasonidos se puede aplicar
directamente a la superficie de un tejido. Para aplicaciones in
vitro, el volumen y la forma geométrica del recipiente que
contiene el cultivo de células pueden afectar a la elección de la
energía y de la frecuencia. Por ejemplo, unas muestras de cultivos
celulares de pequeño volumen pueden necesitar menos energía para
una transfección acrecentada por ultrasonidos que unas cámaras de
biorreactores de gran volumen.
Para aplicaciones intravasculares, que pueden
emplear unos catéteres intravasculares equipados con transductores
de ultrasonidos para una terapia génica endovascular, se pueden
emplear frecuencias más altas, tales como las situadas por encima
de aproximadamente 10 MHz. Para la mayor parte de las aplicaciones,
sin embargo, la frecuencia del sonido varía desde aproximadamente
300 kHz hasta aproximadamente 3 MHz, de manera preferible desde
aproximadamente 500 kHz hasta aproximadamente 1,5 MHz, más
preferiblemente en alrededor de 1 MHz. Típicamente, el ultrasonido
destinado a usarse en el presente invento se proporciona a una
frecuencia más baja que la frecuencia convencional que se usa para
aplicaciones de reproducción en imágenes.
Típicamente, los ajustes del nivel de energía
pueden ser más altos que los empleados en el ultrasonido de
diagnóstico, fluctuando desde 0,5 mW/cm^{2} hasta aproximadamente
10 W/cm^{2}, de manera preferible desde aproximadamente 1
mW/cm^{2} hasta aproximadamente 3 W/cm^{2}. El nivel de energía
que se aplica es seleccionado de manera tal que la deposición total
de energía está generalmente por debajo del umbral citotóxico para
las células o el tejido.
Generalmente, se aplican frecuencias y niveles
de energía en cantidades más bajas y luego éstas se aumentan hasta
que se consiga la absorción celular deseada del compuesto
administrado.
La energía de ultrasonidos es aplicada en unos
períodos que son definidos por un ciclo de servicio dado.
Generalmente, se emplea un ultrasonido de onda continua que aplica
una exposición constante de energía de ultrasonidos (ciclo de
servicio de 100%). El ciclo de servicio se selecciona de manera tal
que el nivel de la salida de energía esté en un intervalo deseado.
El ciclo de servicio puede ser adaptado a la aplicación y puede
hacerse variar a lo largo de un amplio intervalo de valores (p. ej.
de 0,1%-100%).
Aunque unos altos niveles de energía de
ultrasonidos se pueden usar para obtener una hipertermia con el fin
de calentar el tejido y también para ablacionar directamente
tejidos, en el método del invento, los niveles de energía están
generalmente muy por debajo de los que causan la ablación de tejidos
y por debajo de los que causan un significativo efecto
hipertérmico. Mientras que la aplicación de energía de ultrasonidos,
que es necesaria para aumentar la eficiencia del suministro de un
agente bioactivo, puede dar como resultado un aumento en la
temperatura de unos pocos grados centígrados, cualquier aumento en
la temperatura es típicamente transitorio y la temperatura vuelve
con rapidez a la línea de base. Preferiblemente, la temperatura no
aumenta de manera significativa durante la aplicación del
ultrasonido, siendo cualquier aumento de la temperatura típicamente
menor que desde aproximadamente 1ºC hasta aproximadamente 2ºC. Unos
niveles progresivamente más altos de energía de ultrasonidos darán
como resultado unas subidas progresivas de la temperatura, pero la
temperatura se mantiene de manera preferible por debajo del nivel en
el que se producirá una citotoxicidad significativa (p. ej. a 44ºC
o más alta). La cantidad de energía y/o el período de tiempo de
exposición se pueden modificar de manera tal que se impida una
destrucción de las células inducida por las temperaturas. Algunas
aplicaciones pueden beneficiarse, sin embargo, de un cierto grado de
hipertermia, tal como, por ejemplo, en el caso de la terapia de un
cáncer, en la que la combinación de un suministro mediado por
ultrasonidos y una hipertermia pueden mejorar el tratamiento,
haciendo posible la aniquilación de una parte de células tumorales
por el efecto hipertérmico.
La energía de ultrasonidos puede ser aplicada al
tejido o a las células después de una inyección de microcápsulas,
simultáneamente con o después de la administración del agente
bioactivo a la célula. Típicamente, la energía de ultrasonidos es
aplicada después de una inyección de microcápsulas y no más de
aproximadamente 48 horas después de de que el agente bioactivo haya
sido administrado, aunque se pueden aplicar unos períodos de tiempo
más largos o más cortos.
Se pueden emplear ya sea una o múltiples
exposiciones de energía de ultrasonidos. La duración de la
exposición a ultrasonidos (período de tiempo de exposición) variará
dependiendo del nivel de energía del ultrasonido y del ciclo de
servicio. Para determinar la duración preferible, el ultrasonido se
aplica típicamente en unos períodos de tiempo de exposición más
bajos, y se aumenta hasta que se consiga la absorción celular
deseada del compuesto administrado. Una onda de choque de
ultrasonido con un alto nivel de energía (típicamente mayor que
alrededor de 2 W/cm^{2}, preferiblemente por encima de 5
W/cm^{2}, y también preferiblemente por encima de alrededor de 10
W/cm^{2}, dependiendo del ciclo de servicio) puede requerir
solamente unos pocos milisegundos de período de tiempo de
exposición. Más típicamente, el período de tiempo de exposición
fluctúa desde aproximadamente unos pocos segundos hasta
aproximadamente una hora de exposición de la célula a energía de
ultrasonidos, con el fin de conseguir un suministro intensificado
por ultrasonidos más efectivo del agente bioactivo. Incluso más
preferiblemente, la duración de una exposición a ultrasonidos
fluctúa entre aproximadamente unos pocos segundos y aproximadamente
unos pocos minutos y se puede repetir a intervalos diversos durante
la transfección. La duración de una exposición a energía de
ultrasonidos debería ser suficiente para causar el deseado efecto,
pero no tan larga que pueda resultar una significativa citotoxicidad
(a menos que ésta se requiera expresamente).
La energía de ultrasonidos se puede aplicar con
uno cualquiera de una diversidad de sistemas de ultrasonidos
disponibles comercialmente. Por ejemplo, se puede usar un aparato
parta terapia ultrasónica Rich-Mar modelo Sonitron
2000 (Inola, Okla.) con la frecuencia central de aproximadamente 1
MHz, en un modo pulsado o continuo. Unos transductores
convencionales, unos amplificadores de potencia y otros sistemas
componentes para practicar el invento se pueden ensamblar también
con facilidad. Alternativamente, se puede incorporar también en el
sistema un generador de impulsos/funciones o un generador de
funciones arbitrarias Tabor 8024 (Tabor electronics Ltd, Hanan,
Israel) para permitir un control sobre los intervalos de repetición
de impulsos, los ciclos de servicio, etc. Si se desea, unos efectos
específicos de frecuencia y amplitud, tales como, por ejemplo, unas
pautas de forma de onda de impulsos CHIRP (aumento en frecuencia) y
PRICH (disminución en frecuencia) se pueden obtener modificando el
ultrasonido. Las energías ultrasónicas se pueden suministrar también
a partir de amplificadores, transductores y generadores de
frecuencia comercialmente disponibles. Por vía de ejemplo, un
transductor de potencia con una frecuencia central de 1,15 MHz,
procedente de Valpey-Fisher
(Valpey-Fisher, Hopkinton, Mass.), un amplificador
de RF (radiofrecuencia) de potencia, procedente de ENI (ENI,
Rochester, N.Y.), y un generador de funciones arbitrarias Tabor
8024 (de Hanan, Israel) pueden constituir una disposición apropiada.
Alternativamente, un transductor de potencia procedente de
Panametrics (Panametrics V304) con una frecuencia central de 2,25
MHz, se puede usar también en la disposición. Finalmente, se puede
aplicar una energía de ultrasonidos a través de unos equipos de
ultrasonidos para diagnóstico.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El sistema de ultrasonidos de alta energía se
puede incorporar también con un sistema convencional de reproducción
en imágenes por ultrasonidos, para permitir una reproducción en
imágenes y una aplicación terapéutica de un ultrasonido con el mismo
aparato.
Alternativamente, la aplicación de un
ultrasonido de alta energía se puede realizar también en combinación
con otras formas convencionales de reproducción en imágenes tales
como una endoscopia (p. ej. un sistema de fibra óptica), tomografía
computarizada, reproducción en imágenes por resonancia magnética,
angiografía y medicina nuclear.
Cualquier técnica asociada de reproducción en
imágenes se puede emplear, por ejemplo para localizar e identificar
en un paciente a las células (situadas p. ej. en un tejido u órgano)
a las que se deberá de aplicar el ultrasonido de alta energía, o se
puede usar para vigilar y/o localizar la composición del invento
después de una administración a un paciente.
Los siguientes Ejemplos ilustraran el invento
con mayor detalle.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una solución que contiene 15 mg de
diestearoíl fosfatidilcolina (DSPC), 15 mg de dipalmitoíl
fosfatidilglicerol (DPPG) y 3 mg de ácido palmítico en una mezcla de
hexano y etanol 8/2 (v/v) y el disolvente se evapora hasta sequedad.
El polvo resultante y 2 g de un poli(etilenglicol) (de PM
4.000) se disuelven en 14 g de terc.-butanol a 60ºC. La solución es
repartida en partes alícuotas en viales de vidrio con una capacidad
de 10 ml (250 \mul/vial), enfriada rápidamente a -45ºC y
liofilizada. El material liofilizado es expuesto al aire y luego es
reconstituido con 5 ml a una solución salina al 0,9% mediante una
suave turbulencia. La resultante suspensión contiene microburbujas
rellenas con aire (2 x 10^{8} de burbujas/ml, analizado por un
Coulter Multisizer II).
\vskip1.000000\baselineskip
Se repite el procedimiento del Ejemplo 1 excepto
que el aire existente en un vial de vidrio que contenía el material
liofilizado fue primeramente evacuado por una bomba de vacío y
reemplazado por un perfluorocarbono gaseoso (C_{4}F_{10}). La
rigidez de las microburbujas obtenidas, medida de acuerdo con la
metodología descrita con anterioridad, es de aproximadamente 1
N/m.
\vskip1.000000\baselineskip
60 mg de tripalmitina se disuelven en
ciclohexano (0,6 ml). La sal sódica de diestearoíl
fosfatidilglicerol
(DSPG.Na - 40 mg) es dispersada en agua destilada (30 ml) a 70ºC durante 20 minutos y enfriada a 45ºC. La fase orgánica es emulsionada en la fase acuosa usando un homogeneizador POLYTRON® (a 8.500 rpm). El diámetro medio de las gotitas resultantes es de aproximadamente 3 \mum, según se determina con un espectrómetro de correlación de fotones (Malvern Master Sizer®).
(DSPG.Na - 40 mg) es dispersada en agua destilada (30 ml) a 70ºC durante 20 minutos y enfriada a 45ºC. La fase orgánica es emulsionada en la fase acuosa usando un homogeneizador POLYTRON® (a 8.500 rpm). El diámetro medio de las gotitas resultantes es de aproximadamente 3 \mum, según se determina con un espectrómetro de correlación de fotones (Malvern Master Sizer®).
Esta emulsión se añadió a un recipiente de
vidrio con una capacidad de 500 ml, que contenía 200 mg de un
poli(alcohol vinílico) (PVA - PM 9000 - de Aldrich) disueltos
en 5 ml de agua destilada. Después de haber mezclado, la emulsión
resultante se congeló rápidamente a -40ºC y se liofilizó (Christ
Beta 1-8K).
La torta fue vuelta a suspender en 20 ml de
agua. Unas microburbujas que contenían aire subieron hasta la
superficie. Las cápsulas flotantes fueron recuperadas, vueltas a
suspender en NaCl al 0,9% y analizadas con un Coulter counter
Multisizer II. La rigidez de las microcápsulas obtenidas, medida de
acuerdo con la metodología anteriormente descrita, era más alta que
50 N/m.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repite el Ejemplo 3, excepto que el aire
existente en el vial de vidrio que contiene el material liofilizado
es primeramente evacuado por una bomba de vacío y el material
liofilizado es expuesto al perfluorobutano con el fin de generar
unas cápsulas que contienen C_{4}F_{10}. La rigidez de las
microcápsulas obtenidas, medida de acuerdo con la metodología
descrita anteriormente, era más alta que 50 N/m.
\global\parskip1.000000\baselineskip
40 mg de un poliestireno con un PM de 30 kDa
(Standard MW 30,000, de Fluka Chemie) se disuelven en ciclohexano (1
ml). Una sal de sodio de diestearoíl fosfatidilglicerol (DSPG.Na -
40 mg) se dispersa en agua destilada (30 ml) a 70ºC durante 20
minutos y se enfría a 45ºC. La fase orgánica es emulsionada en la
fase acuosa usando un homogeneizador POLYTRON® (13'000 rpm,
Kinematica, Suiza).
La emulsión es añadida a un recipiente de vidrio
con una capacidad de 500 ml, que contiene 200 mg de un
poli(alcohol vinílico) (PVA - PM 9000, de Aldrich) disueltos
en 5 ml de agua destilada. Después de haber mezclado, la emulsión
resultante es congelada rápidamente a -40ºC y liofilizada. La torta
es vuelta a suspender en 20 ml de agua. Unas microcápsulas que
contienen aire suben hasta la superficie. Las cápsulas flotantes se
recuperan, se vuelven a suspender en una solución al 0,9% de NaCl
que contiene 0,05% de Pluronic F68, y se analizan con un Coulter
counter Multisizer II. La rigidez de las microcápsulas obtenidas,
medida de acuerdo con la metodología anteriormente descrita, era de
aproximadamente 8 N/m.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repite el Ejemplo 5, reemplazando el
poliestireno con un PM de 30 kDa por la misma cantidad de un
poliestireno de 100 kDa. La rigidez de las microcápsulas obtenidas,
medida de acuerdo con la metodología anteriormente descrita, era de
aproximadamente 12 N/m.
\vskip1.000000\baselineskip
El Ejemplo 5 se repite reemplazando el
poliestireno con un PM de 30 kDa por la misma cantidad de un
poliestireno de 300 kDa. La rigidez de las microcápsulas obtenidas,
medida de acuerdo con la metodología antes descrita, era de
aproximadamente 15 N/m.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparan micelas catiónicas con 1 mg/ml de un
fosfolípido catiónico DPEPC (Dipalmitoíl
Glicero-3-etil-fosfocolina,
Avanti® Polar Lipids, Inc. EE.UU.), 4 mg/ml de
DSPE-PTE020 (un fosfolípido PEG de brazos múltiples,
de NOF Corporation, Japón), y 0,25 mg/ml de
maleimida-PEG2000-diestearoíl-fosfatidiletanolamina
(de Shearwater Polymer, AL, EE.UU.).
Estos compuestos son primeramente disueltos en
una mezcla de cloroformo y metanol (2:1, v/v) en un matraz de fondo
redondo y luego los disolventes son evaporados bajo presión reducida
con el fin de obtener una película de lípido. Se obtienen micelas
catiónicas por hidratación de la película de lípido en un tampón
HEPES 10 mM a
60ºC.
60ºC.
Un acetiltioacetil RGD - péptido (un péptido con
afinidad para Alfa v beta 3-integrinas expresadas en
una angiogénesis de tumor) es desacetilado en una solución acuosa de
una mezcla de HEPES 0,05 M e hidroxilamina-HCl 0,05
M y EDTA 0,03 mM a un pH de 7 durante 30 min a la temperatura
ambiente. El RGD-péptido activado es incubado
durante una noche a 4ºC con las micelas en una relación molar de
péptido a maleimida de 1:2. Las resultantes micelas con RGD son
purificadas en una columna con Sephadex G-100 usando
un tampón HEPES como eluyente.
Un plásmido gWiz®-GFP (5.757 pares de bases;
Aldevron, Fargo, EE.UU.), que codifica la proteína fluorescente
verde (GFP acrónimo de Green Fluoorescent Protein) a razón de 100
\mug/ml en un tampón Hepes se añade a micelas catiónicas con RGD
con el fin de obtener un plásmido dirigido a diana que contiene un
complejo de micelas, que se puede usar en combinación con las
microcápsulas antes descritas en una composición de acuerdo con
el
invento.
invento.
\newpage
Un acetiltioacetil RGD - péptido (un péptido con
afinidad para Alfa v beta 3-integrinas expresadas en
una angiogénesis de tumor) es desacetilado en una solución acuosa de
mezcla de HEPES 0,05 M, hidroxilamina-HCl 0,05 M y
EDTA 0,03 mM a un pH de 7 durante 30 min a la temperatura ambiente.
El péptido con RGD es incubado durante una noche a 4ºC con una
solución de maleimida PEG2.000-DSPE en una relación
molar de péptido a maleimida de 1:2. El resultante
RGD-PEG2000-DSPE es purificado sobre
una columna de Sephadex G-100 usando un tampón HEPES
como eluyente.
\vskip1.000000\baselineskip
60 mg de palmitina se disuelven en ciclooctano
(0,6 ml). 5 mg de RGD-PEG2000-DSPE y
40 mg de DSPG.Na se dispersan en agua destilada (30 ml) a 70ºC
durante 20 minutos y se enfrían a 45ºC. La fase orgánica es
emulsionada en la fase acuosa usando un homogeneizador POLYTRON® (a
8.500 rpm).
La resultante microemulsión es centrifugada para
eliminar los lípidos en exceso (tripalmitina, DSPG y
RGD-PEG2000-DSPE) y es añadida luego
a un recipiente de vidrio con una capacidad de 500 ml, que contiene
40 mg/ml de una solución acuosa de un poli(alcohol vinílico)
(PVA). Finalmente, la emulsión es congelada a -40ºC y liofilizada.
Se obtuvieron finalmente unas microcápsulas que contenían el péptido
de RGD por reconstitución de una torta liofilizada con una solución
salina.
\vskip1.000000\baselineskip
Unas microcápsulas dirigidas a una diana, que
contienen RGD, se preparan tal como se ha descrito en el Ejemplo 9,
excepto que el RGD-PEG2000-DSPE es
disuelto en la fase orgánica (ciclooctano) en vez de en la fase
acuosa (suspensión en agua de (DSPG.Na).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
11-15
Los ensayos de suministro de genes se realizan
en unos tubos de ensayo con una capacidad de 3 ml, que contienen una
suspensión de células con un plásmido que expresa una proteína
fluorescente, a la que se le añaden diferentes formulaciones de
microvesículas (microburbujas o microcápsulas) rellenas con un gas,
preparadas de acuerdo con los Ejemplos anteriores.
Unas células de adenocarcinoma mamario de rata
MAT B III (#CRL-1666 procedente de ATCC) se incuban
a 37ºC bajo una atmósfera con 5% de CO_{2} en matraces de cultivo
de tejidos con una capacidad de 225 cm^{2}, en el medio 5A de Mac
Coy que contiene Glutamax-I (Life Technologie
Suiza), se suplementan con suero de ternero fetal (FCS, acrónimo de
foetal calf serum) desactivado por calor al 10% v/v y 1% v/v de
antibióticos (concentración inicial: 10.000 UI (unidades
internacionales)/ml de penicilina, 10.000 \mug/ml de
estreptomicina, 25 \mug/ml de Fungizone).
Cada tubo contiene 500 \mul de una suspensión
de células en una concentración final de 1 x 10^{6} células/ml,
que se mezcla con un medio de cultivo (medio A de Mac Coy de Life
Technologie, Suiza) que contiene el plásmido gWiz®-GFP (Aldevron,
Fargo, EE.UU), que codifica la proteína fluorescente verde
(GFP).
Unos ensayos de suministro de genes se realizan
con una concentración de plásmido de 10 \mug/ml y una relación de
microvesículas/células de 30. El tubo es montado sobre un sistema
rotatorio de exposición y sumergido en un baño de agua de 37ºC (D.L.
Miller, S. Bao, J.E. Morris, Sonoporation of cultured cells in the
rotating tube exposure system [sonoporación de células cultivadas en
el sistema de exposición en tubo rotatorio], Ultrasound in Med.
Biol., 25, 1, (1999) 143-149). La distancia entre el
transductor y el tubo es de 7,6 cm. Los tubos son insonados durante
10 segundos usando dos diferentes transductores (T1 o T2) que son
caracterizados de la siguiente manera:
\vskip1.000000\baselineskip
La insonación de una suspensión de células se
realiza de acuerdo con los siguientes parámetros: ciclo de servicio
de 20%, con una frecuencia de repetición de impulsos de 100 Hz, y a
unas presiones acústicas como las que se indican en los Ejemplos
específicos. El sistema de suministro por ultrasonidos comprende
además un amplificador de RF de potencia ENI A150 (ENI, Rochester,
N.Y.), y un generador de ondas arbitrarias Tabor 8024 (Tabor
Electronics Ltd, Hanan, Israel).
Los valores de la presión acústica (negativa de
pico) indicados en los siguientes Ejemplos se miden siguiendo un
proceso de calibración patrón usando un hidrófono de membrana
calibrado (hidrófono de membrana #MH026, Precision Acoustic Ltd,
Dorshester, Inglaterra).
Después de una insonación, las respectivas
mezclas son transferidas desde el tubo a unas placas de 12 pocillos
y suplementadas con 2 ml de un medio que contiene 10% de FCS. Luego
las células se incuban a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO_{2}
durante 24 horas.
Luego las células se analizan con un FACS
Calibur (Becton Dickinson AG, Suiza) con el fin de determinar el
porcentaje de células positivas para GFP y la intensidad media de
fluorescencia de unas células transfectadas positivamente. Dicho
brevemente, el medio de cultivo y las células se colocan en un tubo
de poliestireno con una capacidad de 5 ml, durante 24 horas después
de una transfección, se lavan con una solución salina tamponada con
fosfato (PBS, acrónimo de phosphate buffer saline), luego se vuelven
a suspender en 300-400 \mul de PBS y se mantienen
sobre hielo. La GFP es excitada usando la línea de 488 nm de un
láser de argón, y la luz emitida es recogida a 520 nm (fluorescencia
verde) y a 575 nm (fluorescencia roja) para permitir una corrección
en cuanto a autofluorescencia mediante regulación por puerta
diagonal. Antes de la medición, se añade cloruro de propidio (20
\mul procedentes de una solución de 40 \mul/ml) al tubo con el
fin de determinar la viabilidad de las células. La fluorescencia de
fondo es determinada usando células transfectadas artificialmente
(es decir, células expuestas a un ultrasonido en ausencia de un ADN
de plásmido y microvesículas). El programa lógico software CellQuest
Pro se usa para analizar los datos con el fin de expresar el
porcentaje de células positivas para GFP y la intensidad media de
fluorescencia (unidad arbitraria, AU, acrónimo de arbitrary unit).
El porcentaje de células positas para GFP (que indica la cantidad de
células que han sido transfectadas positivamente) se refiere a toda
la población celular, incluyendo las células muertas; sin embargo,
los desperdicios procedentes de células destruidas por ultrasonidos
no son tomados en cuenta. La intensidad media de fluorescencia
medida es proporcional a la cantidad de GFP que se ha producido por
las células después de una transfección (y por lo tanto a su vez es
proporcional el número de copias de plásmidos que han sido
suministrados efectivamente dentro de la célula).
\vskip1.000000\baselineskip
Cuatro partes alícuotas de las formulaciones de
microburbujas que se han preparado de acuerdo con el Ejemplo 1 son
añadidas a unos respectivos tubos de ensayo que contienen la
suspensión de células y el plásmido como antes se han descrito, y
son insonadas con el transductor T2 a unas respectivas presiones
acústicas de 247 KPa, 364 KPa, 571 KPa y 808 KPa. El porcentaje
medido de células positivas para GFP (% de células positivas para
GFP) y las intensidades medias de fluorescencia de células positivas
se señalan en las Figuras 1a y 1b, respectivamente como círculos
negros.
Similarmente, cuatro partes alícuotas de las
formulaciones de microcápsulas preparadas de acuerdo con el Ejemplo
3 son añadidas a unos respectivos tubos de ensayo que contienen la
suspensión de células y el plásmido como antes se han descrito, y
son insonadas con el mismo transductor T2 a las mismas respectivas
presiones acústicas diferentes.
El % medido de células positivas para GFP y las
intensidades de fluorescencia de las células positivas se señalan en
las Figuras 1a y 1b, respectivamente como círculos blancos.
Tal como se observa a partir de estas Figuras,
el % máximo de células positivas para GFP es de aproximadamente 25%
para las microburbujas (a 364 kPa) y de aproximadamente 17% para las
microcápsulas (a 808 kPa). Sin embargo, las células insonadas en la
presencia de microcápsulas muestran un valor más alto de la
intensidad media de fluorescencia (aproximadamente 440 AU a 808 kPa)
con respecto a unas células insonadas en la presencia de
microburbujas (aproximadamente 340 AU a 571 KPa). Así, a pesar de
una cantidad ligeramente más baja de células transfectadas, las
microcápsulas permiten una transferencia más efectiva de un agente
bioactivo dentro de las células. En la práctica, un número más bajo
de células son transfectadas después de una insonación en la
presencia de microcápsulas, pero una concentración más alta de un
agente bioactivo es suministrada no obstante dentro de las
células.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repite el Ejemplo 11, comparando las
microburbujas del Ejemplo 2 con las microcápsulas del Ejemplo 4, con
la misma modalidad. Además, se emplea el transductor T1 (enfocado, a
1,15 MHz) en lugar del T2, a unas respectivas presiones acústicas de
207 kPa, 307 kPa, 402 kPa y 480 kPa. Los resultados (% de células
positivas para GFP y las intensidades medias de fluorescencia) se
muestran en las Figuras 2a y 2b) (círculos negros: microburbujas;
círculo blanco: microcápsulas).
Como se observa a partir de la Figura 2a, el %
máximo de células positivas para GFP es de aproximadamente 18,5%
para las microburbujas y de aproximadamente 14% para las
microcápsulas. De acuerdo con la Figura 2b, se puede observar que
unas células insonadas en la presencia de microcápsulas muestran un
valor mucho más alto (casi del doble) de la intensidad media de
fluorescencia con respecto a unas células insonadas en la presencia
de microburbujas (es decir de aproximadamente 1.120 AU en
comparación con aproximadamente 550 AU, a 480 KPa).
\vskip1.000000\baselineskip
Cuatro partes alícuotas de cada una de las tres
formulaciones preparadas de acuerdo con los Ejemplos 5, 6 y 7,
respectivamente, son añadidas a unos respectivos tubos de
poliestireno que contienen la suspensión de células y el plásmido,
como antes se ha descrito, y son insonadas con el transductor T2 a
unas respectivas presiones acústicas de 247 KPa, 364 KPa, 571 KPa y
808 KPa. Las intensidades medias de fluorescencia que se han medido
(determinadas como antes se ha descrito) se señalan en la Figura 3
(Ejemplo 5: rombos blancos; Ejemplo 6: cuadrados blancos, Ejemplo 7:
triángulo negro). A partir de la Figura 3, se puede observar que las
células insonadas en la presencia de unas microcápsulas hechas de un
polímero de más alto peso molecular, particularmente a unas
presiones acústicas más altas que 400 KPa, muestran unas
intensidades medias de fluorescencia más altas, que corresponden a
un suministro más efectivo de los plásmidos dentro de las
células.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuatro partes alícuotas de cada una de las
formulaciones preparadas de acuerdo con el Ejemplo 3 o del Ejemplo
4, fueron añadidas a unos respectivos tubos de poliestireno, que
contenían la suspensión de células y el plásmido como antes se han
descrito, e insonadas con el transductor T2 a unas respectivas
presiones acústicas de 247 KPa, 364 KPa, 571 KPa y 808 KPa.
Las intensidades medias de fluorescencia que se
midieron (determinadas como antes se ha descrito) se señalan en la
Figura 4 (Ejemplo 5: círculos blancos; Ejemplo 4; círculos negros).
A partir de la Figura 4 puede observarse que las células insonadas
en la presencia de microcápsulas rellenas con un gas perfluorado
muestran una intensidad media de fluorescencia mucho más alta (casi
del doble) con respecto a las microcápsulas rellenas con aire.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuatro partes alícuotas de las formulaciones
preparadas de acuerdo con el Ejemplo 3 se añaden a unos respectivos
tubos de ensayo que contienen una suspensión de células y el
plásmido, como antes se han descrito. Se añaden por separado un
poli(etilenglicol) 4000 (PEG_{4000}) (de Fluka, Buchs,
Suiza), Pluronic F68 o Pluronic F127 (ambos suministrados por Sigma,
Buchs, Suiza) a la suspensión de células a razón de 0,05% p/v
(peso/volumen) antes de una exposición a ultrasonidos. Luego se
añaden microcápsulas a la suspensión y las células son insonadas con
el transductor T2 a las presiones acústicas de 571 KPa con el
sistema de suministro por ultrasonido que antes se ha descrito. Un
acondicionamiento con microcápsulas, sin adyuvante y expuestas a
ultrasonidos, se usa como testigo.
Se encuentra que unos adyuvantes tales como
PEG_{4000} y Pluronic F68/127 mejoran el porcentaje de células
positivas para GFP por al menos en un 20%, en comparación con el
testigo.
\vskip1.000000\baselineskip
5 x 10^{6} células MAT B III (adenocarcinoma
mamario de rata, #CRL-1666 procedente de ATCC) se
inyectan por vía subcutánea (100 \mul) dentro de la almohadilla
mamaria grasa de ratas Fischer 344 hembras, seis días antes del
tratamiento.
Un transductor enfocado de 1 MHz (T3) es montado
sobre un tubo de plexiglass relleno con agua que tiene una longitud
de 100 mm, permitiendo que la insonación se efectúe a la deseada
distancia al campo cercano (100 mm). Los detalles del transductor T3
son los siguientes:
El sistema de suministro por ultrasonido
comprende además un amplificador de RF de potencia ENI A150 (de ENI,
Rochester, N.Y.) y un generador de ondas arbitrarias Tabor 8024
(Tabor Electronics Ltd, Hanan, Israel).
Los tumores son insonados a una presión negativa
de pico de 1 MPa, con un ciclo de servicio (DC, acrónimo de duty
cycle) de 3% y una frecuencia de repetición de impulsos (PRF,
acrónimo de pulse repetition frequency) de 100 Hz, durante 60
segundos. El eje central de la propagación de los ultrasonidos es
enfocado sobre el tumor, y no interfiere con otras partes de la
rata. En cada experimento, se usa un sistema de diagnóstico (sonda
lineal que funciona a una frecuencia transmitida de 4 MHz, sonda
L7-4, ATL, HDI-5000, versión 10.5,
Philips ultrasound, Bothell, WA, EE.UU) para reproducir en imágenes
el tumor (modo B) y para comprobar tanto la distribución
intratumoral de microcápsulas después de una inyección como la
destrucción de las microcápsulas a continuación de una insonación.
Todos los datos ecográficos se registran sobre una cinta de
vídeo.
\vskip1.000000\baselineskip
Unas ratas son anestesiadas por inyección de una
mezcla de ketamina y xilazina (1 ml/kg). Después de una depilación,
una mezcla que contiene formulaciones de microcápsulas preparadas de
acuerdo con el Ejemplo 3 (3 \mul ó 10 \mul, equivalentes a 2,6 y
8,6 x 10^{6} microcápsulas) y 20 \mul de una solución de 1 mg/ml
de un ADN de plásmido que codifica la proteína luciferasa (vector
reportero de luciferasa pGL3, de Promega - Catalys AG, Wallisellen,
Suiza) se inyectan por vía intratumoral usando una aguja 27 G (la
aguja es dejada en su sitio durante 30 segundos después de una
inyección y luego es retirada lentamente). A continuación, el tumor
es insonado usando la sonda ajustada a medida que antes se ha
detallado. La insonación se realiza con un gel conductor de
ultrasonidos para asegurar una buena transmisión de los
ultrasonidos.
En experimentos testigos, una inyección
intratumoral de ADN en una solución salina tamponada con fosfato
(PBS) se realiza en microcápsulas, seguido por una insonación en
condiciones de ultrasonidos similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Para análisis cuantitativos de la transfección,
se extirpan tumores 48 horas después de una insonación, y se
homogeneizan en 5 ml de un Reactivo de Lisis de Cultivos Celulares
(de Promega - Catalys AG, Wallisellen, Suiza) a 18.000 rpm durante
20 segundos, usando un homogeneizador POLYTRON®. Los materiales
homogeneizados son luego centrifugados a 1.000 g durante 10 minutos
y el material sobrenadante es analizado con un luminómetro
(Victor^{2}, Perkin Elmer, Courtaboeuf, Francia) usando el estuche
Promega para luciferasa (Reactivo de Ensayo de Luciferasa,
Promega - Catalys AG, Wallisellen, Suiza). La actividad de luciferasa es calibrada a la unidad luminosa por picógramo (pg) de una solución patrón de luciferasa (QuantiLum® Recombinant Luciferase, Promega - Catalys AG, Wallisellen, Suiza). El resultado final es expresado como pg de luciferasa por g de tumor.
Promega - Catalys AG, Wallisellen, Suiza). La actividad de luciferasa es calibrada a la unidad luminosa por picógramo (pg) de una solución patrón de luciferasa (QuantiLum® Recombinant Luciferase, Promega - Catalys AG, Wallisellen, Suiza). El resultado final es expresado como pg de luciferasa por g de tumor.
Como se muestra en la Tabla 1 siguiente, la
eficiencia de transfección es más alta en unos tumores en los que se
ha inyectado con microcápsulas y se ha insonado, en comparación con
tumores testigo. Además, la eficiencia de suministro de genes
aumenta con la dosis de las microcápsulas inyectadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Unas células de adenocarcinoma mamario R3230,
cosechadas a partir de un vehículo vivo y homogeneizadas, se
implantan en ratas Fisher 344 hembras. Unas células R3230 en
suspensión (0,2 ml, aproximadamente 1 x 10^{7} células tumorales)
se inyectan por vía subcutánea en una almohadilla mamaria a cada
lado del abdomen en cada animal (con una edad de
10-12 semanas). Los tumores se hacen crecer durante
aproximadamente 20 días hasta que se alcanza el tamaño deseado. Unos
tumores no necróticos sólidos con un diámetro de
10-15 mm, se usan para experimentos de
insonación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa un total de 10 ratas cada una con 2
tumores para los experimentos. Uno de los tumores de cada par se usa
como un testigo interno, y por lo tanto no es expuesto a
ultrasonidos. Las ratas son anestesiadas por inyección de una mezcla
de ketamina y xilazina (1 ml/kg). Luego, una doxorrubicina liposomal
(Caelyx®, de Schering-Plough) es inyectada
lentamente en la vena yugular (a través de un catéter crónico) en
una dosis de 8 mg/kg de peso corporal, con una aguja del calibre 27
(1 mg de doxorrubicina en 500 \mul). Después de 10 minutos, unas
formulaciones de microcápsulas, preparadas de acuerdo con el Ejemplo
3, son infundidas dentro de la vena yugular en un caudal de 0,1
ml/min (5 x 10^{8} microcápsulas/ml). Luego, 30 segundos más
tarde, se usa un transductor de 1 MHz (T4) montado en un tubo de
plexiglass relleno con agua que tiene una longitud de 50 mm,
permitiendo una insonación de tumores en la distancia al campo
cercano, con el fin de insonar a uno de los tumores. Detalles del
transductor T4 son los
siguientes:
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema de suministro por ultrasonidos
comprende además un amplificador de RF de potencia ENI A150 (de ENI,
Rochester, N.Y.), y un generador de ondas arbitrarias Tabor 8024
(Tabor Electronics Ltd, Hanan, Israel). Uno de los tumores se
selecciona aleatoriamente para ser insonado en condiciones
controladas (1,5 MPa, ciclo de servicio de 40%, frecuencia de
repetición de impulsos de 100 Hz, 12 veces con una duración de la
exposición de 5 segundos, con un intervalo de pulsación de 30
segundos para permitir el relleno máximo de las microcápsulas en la
vasculatura del tumor), el segundo tumor sirve como un testigo. El
volumen total de microcápsulas inyectadas es de aproximadamente 1
ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades fluorescentes de la
doxorrubicina (DOX) se usan para cuantificar la cantidad
intratumoral de doxorrubicina. Unos tumores R3230 se cosechan 24
horas después del tratamiento, se pesan y se homogeneizan con un
Ultra-Turrax en un tampón Tris de pH 7 que contiene
el patrón interno de Daunorrubicina (DNR) (Fluka, Buchs, Suiza).
Luego las muestras se centrifugan a 8.800 g durante 10 minutos, y
200 \mul del material sobrenadante se mezclan con 125 \mul de
una solución de Triton X-100 (3% v/v) y con 675
\mul de un tampón de formiato de amonio 5 mM de pH 4,5. La
suspensión es centrifugada brevemente y sometida a una extracción de
la fase sólida. Las muestras tratadas son luego analizadas por
cromatografía de fase líquida de alto rendimiento (HPLC, acrónimo de
High Performance Liquid Chromatography) usando una columna de fase
inversa. Los compuestos eluidos que interesan, a saber DOX y DNR, se
vigilan con un detector de fluorescencia. Las longitudes de onda de
excitación y de emisión se ajustan a 475 y 550 nm, respectivamente.
Las muestras se tratan siempre en ausencia de luz y dentro de unos
tubos de polipropileno.
Los tumores expuestos a ultrasonidos en
presencia de microcápsulas, presentan una más alta concentración de
doxorrubicina en comparación con los tumores testigos no insonados,
indicando por lo tanto una mejoría en el suministro de fármacos.
Claims (14)
1. Una suspensión acuosa que comprende un
agente bioactivo y unas microcápsulas rellenas con un gas, que
tienen una envoltura polimérica y/o de lípido, en la que dichas
microcápsulas tienen una resistencia a un índice mecánico (MI) de
una onda de ultrasonidos aplicada de por lo menos 0,15 y dicho
agente bioactivo está sustancialmente sin unir con dicha envoltura y
dispersado libremente en dicha suspensión.
2. Una suspensión de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que dichas microcápsulas tienen una
resistencia a un índice mecánico de por lo menos 0,18.
3. Una suspensión de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2, en la que la envoltura de dichas
microcápsulas comprende un polímero biodegradable fisiológicamente
compatible.
4. Una suspensión de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2, en la que la envoltura de dichas
microcápsulas comprende un lípido biodegradable insoluble en
agua.
5. Una suspensión de acuerdo con una cualquiera
de las precedentes reivindicaciones, en la que las microcápsulas
tienen una rigidez Sp de por lo menos 5 N/m.
6. Una suspensión de acuerdo con una cualquiera
de las precedentes reivindicaciones, en la que el gas contenido en
las microcápsulas es un gas perfluorado.
7. Una suspensión de acuerdo con una cualquiera
de las precedentes reivindicaciones, en la que dicho agente
bioactivo es un fármaco o un material genético.
8. Una suspensión de acuerdo con una cualquiera
de las precedentes reivindicaciones, en la que dicho agente
bioactivo está asociado con un vehículo.
9. Una suspensión de acuerdo con la
reivindicación 8, en la que dicho agente bioactivo y dicho vehículo
están asociados en la forma de una micela o de un liposoma.
10. Una suspensión de acuerdo con una
cualquiera de las precedentes reivindicaciones 8 ó 9, en la que
dicho vehículo comprende además un ligando para dirección a una
diana.
11. Una suspensión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además
un agente de diagnóstico.
12. Una suspensión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además
unos adyuvantes para intensificar el suministro del agente bioactivo
dentro de las células.
13. Uso de una composición que comprende unas
microcápsulas rellenas con un gas y un agente bioactivo como se
define en una cualquiera de las precedentes reivindicaciones para
preparar una formulación farmacéuticamente activa para el suministro
de dicho agente bioactivo mediado por ultrasonidos.
14. Un estuche farmacéutico que comprende un
agente bioactivo y unas microcápsulas rellenas con un gas como se
han definido en una cualquiera de las precedentes reivindicaciones 1
a 12, o como componentes liofilizados.
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