ES2346281B1 - Uso de cepas de leishmania dhsp70-ii como vacuna. - Google Patents
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Abstract
Uso de cepas de Leishmania
\DeltaHSP70-II como vacuna.
La presente invención se refiere al uso de
organismos
del género Leishmania que tienen delecionado el gen
HSP70-II, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de la leishmaniasis en un mamífero, más preferiblemente en un perro, y más preferiblemente en un humano. También se refiere a las composiciones farmacéuticas que contienen dichos organismos, y a su uso en la elaboración de vacunas frente a la leishmaniasis.
del género Leishmania que tienen delecionado el gen
HSP70-II, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de la leishmaniasis en un mamífero, más preferiblemente en un perro, y más preferiblemente en un humano. También se refiere a las composiciones farmacéuticas que contienen dichos organismos, y a su uso en la elaboración de vacunas frente a la leishmaniasis.
Description
Uso de cepas de Leishmania
\Deltahsp70-II como vacuna.
La presente invención se encuentra dentro del
campo de la biología molecular y la medicina, y se refiere a una
línea de Leishmania defectiva para los dos alelos del gen
HSP70-II (línea
\Deltahsp70-II), a una composición que
comprende organismos de dicha línea, y al uso de dicha composición
como vacuna.
Los organismos protistas del género
Leishmania son los agentes causales de un amplio grupo de
enfermedades conocidas como leishmaniosis o más correctamente según
la SNOAPAD (Standard Nomenciature of Animal Parasites and
Diseases), leishmaniasis. Esta enfermedad presenta cuadros
clínicos y epidemiológicos diversos, afecta a unos
12-14 millones de personas en todo el mundo, y cada
año aparecen entre 1,5 y 2 millones de nuevos casos (Murray et
al., 2005. Lancet 366:1561-1577). Según
la OMS, actualmente amenaza a 350 millones de personas en 88 países
diferentes, principalmente en zonas tropicales y subtropicales, pero
los enfermos se encuentran, principalmente, en los países en vías de
desarrollo (Sudán, India, Bangladesh, Nepal y Brasil). Estos
organismos tienen un ciclo de vida digenético, alternante entre una
fase de vida libre, promastigotes flagelados en mosquitos de los
géneros Phlebotomus (en el viejo mundo) y Lutzomyia
(en América), y amastigotes no flagelados intracelulares que se
multiplican en el interior de macrófagos de mamíferos hospedantes.
La transmisión desde los insectos vectores ectodérmicos
(poiquilotérmicos) a los hospedadores mamíferos, implica un
"shock" térmico, que parece actuar como una señal de
diferenciación celular (Zilberstein & Shapira, 1994. Annu Rev
Microbiol 48:449-470). En este contexto, el
estudio de la respuesta al shock térmico, y los mecanismos de
regulación controlados por las proteínas HSP, pueden dilucidar los
mecanismos de diferenciación de estos protozoos.
Los organismos vivos responden al estrés por
calor, y otros tipos de estrés, sintetizando un set de proteínas
altamente conservadas, las heat-shock
proteins (HSPs) (Lindquist & Craig, 1988. Annu Rev
Genet 22:631-677). Sin embargo, las HSPs también
juegan un papel importante en la células no sometidas a estrés, al
estar involucradas en el plegamiento, ensamblaje, localización
intracelular, secreción, activación, y degradación de muchas
proteínas (Feder & Hofmann, 1999. Annu Rev Physiol
61:243-282). Tanto HSP70 como HSP90 interaccionan
con muchos otros componentes de vías de señalización que regulan el
crecimiento y desarrollo. En este sentido, la relación molecular
entre HSPs y las proteínas señalizadoras es crítica para el
correcto funcionamiento de estas vías: por ejemplo, los niveles
relativos de estas proteínas han demostrado ser importantes, puesto
que una deficiencia o un exceso de HSPs han dado lugar a un
crecimiento aberrante, desarrollo de malformaciones y muerte celular
(Mayer & Bukau, 2005. Cell Mol Life Sci
62:670-684).
Hasta la fecha HSP70 es la proteína más
conservada presente en todos los organismos. Entre sus numerosas
funciones, HSP70 protege a las células de los efectos deletéreos de
los plegamientos incorrectos y de la agregación de proteínas. Los
autores de la presente invención han demostrado que los loci del gen
HSP70-II se encuentran conservados en varias
especies de Leishmania (L. infantum, L. major, L. tropica,
L mexicana, L amazonensis) (Folgueira, et al., 2007.
Parasitology 134, 369-377).
Actualmente se ha producido un incremento de
casos de leishmaniasis humanas en individuos inmunosuprimidos, en
fase avanzada de infección por VIH, cuyas defensas inmunológicas
están muy debilitadas. En España, y otros países de la cuenca
mediterránea, la especie predominante es L. infantum, cuya
infección produce principalmente afecciones viscerales. El perro
doméstico está considerado como el principal reservorio de L.
infantum en la región mediterránea, desempeñando un papel clave
en la transmisión del parásito a seres humanos a través del
flebótomo. En países como España, donde la enfermedad es endémica en
los perros, casi todo el mundo padece una infección latente, de
manera que cuando una persona padece una bajada de defensas, como en
el caso del sida y otras inmunodeficiencias, la Leishmania
hasta entonces latente empieza a prosperar en el organismo. En
Europa, el 25% de los infectados con el virus del sida padece a la
vez una infección de leishmania. Además, la leishmaniasis canina
constituye un problema en sí mismo, ya que cerca del 50% de los
perros infectados desarrolla una sintomatología clínica que en la
mayoría de los casos conduce a la muerte del animal, debido a la
ineficacia de los métodos de tratamiento y a la toxicidad de sus
efectos secundarios.
Atendiendo a los síntomas clínicos de la
enfermedad, las leishmaniasis han sido clasificadas en 5 tipos:
leishmaniasis visceral o kala-azar, cutánea o
Botón de Oriente, cutáneo-difusa,
muco-cutánea o espundia, y leishmaniasis dérmica
post kala-azar. Estas formas han sido
clasificadas en base a criterios clínicos y son causadas por al
menos 15 especies diferentes.
Actualmente no existe ningún método profiláctico
eficaz y los tratamientos quimioterapéuticos no poseen la eficacia
deseable. Desde mediados del siglo pasado se usan drogas que
requieren administración parenteral y prolongados tratamientos,
presentando además, una serie de reacciones adversas que dificultan
su utilización (cardiotoxicidad con electrocardiogramas anormales,
pancreatitis, etc.). Entre los fármacos utilizados como primera
línea de tratamiento se encuentran los antimoniales pentavalentes
(SSG (Sodium stibogluconate) y Meglumina antimoniato). Como
segunda línea (cuando el paciente no responde a los primeros) existe
la Amfotericina B y la Aminosidina. Un problema adicional, puesto
que los enfermos se encuentran principalmente en países en
desarrollo, es el elevado precio de los tratamientos, que en
ocasiones lleva a su incumplimiento y a la aparición de
resistencias.
Aunque existen principios activos de origen
vegetal y sintéticos con actividad leishmanicida prometedora y baja
toxicidad (péptidos, moléculas orgánicas de síntesis etc), pero
hasta ahora por si solos, no son capaces de eliminar totalmente al
parásito. Y pese a que diversas vacunas se encuentran en diferentes
etapas de desarrollo, actualmente no hay ninguna vacuna aprobada
contra la enfermedad. Existe, por tanto, la necesidad de desarrollar
una vacuna capaz de generar una respuesta que integre activación
celular y producción de anticuerpos con un cierto balance hacia una
respuesta de tipo 1.
Los autores de la presente invención han
desarrollado una línea de L. infantum deficiente para el gen
HSP70-II (línea
\Deltahsp70-II), caracterizada porque su
virulencia está atenuada, no presentando variaciones en la misma, y
por que es capaz de generar inmunidad en un mamífero, tanto frente a
la leishmaniasis provocada por L. infantum como por L.
major.
Como se ha dicho previamente, los loci del gen
HSP70-II se encuentran conservados en otras
especies de Leishmania (L. infantum, L. chagasi, L. major,
L. tropica, L. mexicana, L. braziiiensis y L.
amazonensis), y, por tanto, mutantes de estas especies que
presenten delecionado el gen HSP70-II podrían
ser empleados como vacunas frente a las distintas leishmaniasis.
Los organismos de Leishmania que tienen
delecionado el gen HSP70-II, pueden usarse
para generar inmunidad en un mamífero frente a leishmaniasis. Así
pues, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de
organismos de Leishmania que tienen delecionado el gen
HSP70-II, de ahora en adelante organismos de
Leishmania de la invención, para la elaboración de un
medicamento para el tratamiento o prevención de la
leishmaniasis.
Los organismos del género Leishmania
pertenecen al Superreino Eukaryota, Orden
Kinetoplastida, Familia Trypanosomatidae.
Los métodos para delecionar un determinado gen
en el genoma de un organismo son conocidos en el estado de la
técnica. Generalmente, los métodos de deleción implican varios pasos
de clonación, y comprenden la construcción de un cassette de
deleción que contiene un cassette de expresión para un gen
marcador flanqueado con secuencias de pares de bases
correspondientes al promotor y terminador del gen a delecionar.
Posteriormente, los casetes de deleción se amplifican por PCR y se
utilizan para transformar las cepas de Leishmania
seleccionadas. A continuación, los transformantes se seleccionan en
función de dicho gen marcador. Un "cassette" o
"casete" es una región codificante de un gen procedente de un
organismo procariota o eucariota flanqueada por los elementos
reguladores necesarios para su expresión in vivo o in
vitro. Aunque los casetes de expresión pueden tener
configuraciones muy variadas, deben contener por lo menos un
promotor (promoter), una región codificante (ADNc eucariota o
gen procariota) y un terminador de la transcripción
(terminator) o un sitio de poliadenilación, según se trate de
un gen derivado de un organismo procariota o de un ADNc procedente
de un organismo eucariota. A esta configuración básica se le añade,
si fuera necesario, una secuencia con función reguladora para la
expresión natural del gen en el sistema elegido.
En el contexto de la presente invención,
HSP70-II se define por una secuencia de
nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia
codificante de la proteína HSP70 (SEQ ID NO: 1), u otras secuencias
homólogas, y que presenta una región 3'UTR característica, que se
recoge en la SEQ ID NO: 2, según ya ha sido descrito (Quijada et
al., 1997. J Biol Chem 272: 4493-4499).
El término "homología", tal y como se utiliza en esta memoria,
hace referencia a la semejanza entre dos estructuras debida a una
ascendencia evolutiva común, y más concretamente, a la semejanza
entre dos o más secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Puesto que
dos secuencias se consideran homologas si tienen el mismo origen
evolutivo, en general, se asume que valores superiores de similitud
o identidad del 50% indicarían homología. Podemos considerar, por
tanto, que porcentajes de identidad de, al menos, un 50%, podrían
mantener la función de la secuencia aminoacídica ortóloga recogida
en la SEQ ID NO: 1, y la secuencia de nucleótidos que codifica dicha
secuencia y que presenta un región 3'UTR característica como se ha
descrito (3'UTR-II) podría denominarse como gen
HSP70-II.
En esta memoria se entiende como
"leishmaniasis" una enfermedad zoonótica causada por diferentes
especies de protozoos del género Leishmania. Las
manifestaciones clínicas de la enfermedad, van desde úlceras
cutáneas que cicatrizan espontáneamente hasta formas fatales en las
cuales se presenta inflamación severa del hígado y del bazo. La
enfermedad por su naturaleza zoonótica, afecta tanto a perros como
humanos. Sin embargo, animales silvestres como zarigüeyas, coatíes y
osos hormigueros entre otros, son portadores asintomáticos del
parásito, por lo que son considerados como animales reservorios.
En el genoma de L. infantum existen 6
copias del gen HSP70 que se disponen en un tándem directo (Quijada
et al., 1997. J Biol Chem 272:
4493-4499). La principal diferencia que existe entre
las distintas copias reside en sus regiones 3'UTR: la región 3'UTR
del gen HSP70 situado en el extremo 3' del locus
(3'UTR-II) es altamente divergente en secuencia
respecto a la región 3'UTR de los 5 genes restantes
(3'UTR-I). Teniendo en cuenta esta divergencia de
secuencia de las regiones 3'UTR, a los cinco primeros genes HSP70,
aquellos que portan la región 3'UTRI, se las ha denominado genes
HSP70-I, mientras que al sexto gen, portador de la
región3'UTR-II, se le ha denominado
HSP70-II. Además de la divergencia de secuencia de
sus regiones 3'UTR, los genes HSP70-I y
HSP70-II presentan claras diferencias en cuanto a su
expresión durante el choque térmico. En otras especies de
Leishmania (L. major, L. tropica, L. mexicana y L.
amazonensis) la disposición de estos loci, y la región
característica 3'UTR-II, se encuentra conservada
(seis copias en tándem para L. infantum y L. major, y
7 copias en tándem para L. tropica, L. mexicana y L.
amazonensis), tal y como se describe en Folgueira et al.,
2007 (Parasitology 134:369-377).
Por tanto, en una realización preferida de este
aspecto de la invención, los organismos en los que se deleciona el
gen HSP70-II pertenecen a una especie de
Leishmania que se selecciona de la lista que comprende:
Leishmania infantum, L. chagasi, L. major, L. tropica, L.
mexicana, L. braziliensis y/o L. amazonensis. En otra
realización aún más preferida, los organismos de la cepa pertenecen
a la especie L. infantum.
La Leishmaniasis tiene especial
importancia no solo en países en desarrollo, sino también en países
desarrollados, por tratarse de una zoonosis en la cual se considera
al perro el principal reservorio del parásito L. infantum. De
esta manera, los casos registrados en muchos países, entre ellos
España, se deben al contacto con perros. Se ha observado que los
gatos y las ratas también pueden actuar como reservorios. Por tanto,
en una realización preferida de este aspecto de la invención, el
mamífero es un perro. En otra realización preferida de este aspecto
de la invención, el mamífero es humano. En una realización aún más
preferida, la leishmaniasis es causada por el parásito L.
infantum.
Los perros pertenecen a la especie Canis
lupus subsp. familiaris. Los organismos de la especie
Canis lupus subsp. familiaris pertenecen al Superreino
Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), Reino
Metazoa, Phylum Chordata, Subphylum Craniata,
Clase Mammalia, Orden Carnívora, Familia
Canidae y Género Canis. El hombre es un mamífero
humano que pertenece a la especie Homo sapiens. Los
organismos de la especie Homo sapiens pertenecen al
Superreino Eukaryota, (grupo Metazoa/Fungi), Reino
Metazoa, Phylum Chordata, Subphylum Craniata,
Clase Mammalia, Orden Primates, Familia
Hominidae y Género Homo.
El empleo de organismos de Leishmania de
la invención, en los que se deleciona el gen
HSP70-II, como inmunógenos, hace que puedan
ser empleados en composiciones como vacunas en mamíferos, incluyendo
humanos, o producir una respuesta en la producción de anticuerpos en
animales. Para la formulación de tales composiciones, una cantidad
efectiva inmunológicamente de al menos uno de los organismos de
Leishmania de la invención, es mezclado con un transportador
adecuado aceptable fisiológicamente para la administración a
mamíferos incluyendo humanos. Los inmunógenos pueden estar
incorporados en liposomas u otras vesículas similares, y/o mezclados
con un adyuvante o absorbente como es conocido en el campo de las
vacunas. Por ejemplo, pueden ser mezclados con otros complejos
inmunoestimuladores. Alternativamente, los inmunógenos no están
acoplados y meramente mezclados con un transportador aceptable
fisiológicamente tal como un compuesto tampón o salino normal
adecuado para la administración a mamíferos incluyendo humanos.
Así pues, otro aspecto de la invención se
refiere a una composición farmacéutica, de ahora en adelante
composición de la invención, que comprende organismos de
Lehismania de la invención, esto es, que tienen delecionado
el gen HSP70-II. En una realización preferida
de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica
comprende promastigotes de las cepas de Leishmania de la
invención. En otra realización preferida la composición de la
invención además comprende excipientes farmacológicamente
aceptables.
El término "promastigote" hace referencia
al estado flagelar de un protozoo tripanosomátido en el que el
flagelo surge de un kinetoplasto en frente del núcleo y emerge de la
terminación anterior del organismo (polo apical). Generalmente es la
fase extracelular, en el hospedador invertebrado intermediario o en
cultivo, de los parásitos de Leishmania.
Por tanto, y como se ha descrito anteriormente,
los inmunógenos (los organismos de Leishmania de la
invención) de la invención presentarían secuencias antigénicas
protectoras. Estos antígenos protectores son capaces de generar una
respuesta inmune (inmunogénica) protectora del hospedador, es decir,
una respuesta del hospedador que conduce a la generación de
moléculas efectoras inmunes, anticuerpos o células que dañan,
inhiben o matan a la entidad biológica invasora, "protegiendo"
así al hospedador de una enfermedad clínica o
sub-clínica y de una pérdida de productividad. Tal
respuesta inmune protectora puede manifestarse comúnmente por la
generación de anticuerpos.
Así pues, otro aspecto se refiere a los
anticuerpos, de ahora en adelante anticuerpos de la invención,
producidos tras la inmunización de un animal con organismos de
Lehismania de la invención o la composición de la invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el
animal empleado para la inmunización es un mamífero no humano.
En otro aspecto de la invención, los anticuerpos
producidos tras la inmunización del animal, de aquí en adelante
anticuerpos de la invención, son usados como medicamento.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente
a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas. Así,
los anticuerpos pueden estar en disolución acuosa estéril o en
fluidos biológicos, tal como suero. Las disoluciones acuosas pueden
estar tamponadas o no tamponadas y tienen componentes activos o
inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales
para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin
limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, y
similares, y nutrientes incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y
minerales. Alternativamente, los anticuerpos pueden prepararse para
su administración en forma sólida. Los anticuerpos pueden combinarse
con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin
limitarse a; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, goma
tragacanto, o gelatina; excipientes tales como almidón o lactosa;
agentes dispersantes tales como ácido algínico o almidón de maíz;
lubricantes tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como
dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como
sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes tales como menta o
salicilato de metilo.
Los anticuerpos o sus formulaciones pueden
administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al
hombre, en una variedad de formas. Tales medios incluyen, pero sin
limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular,
subcutáneo, intracecal, intraventricular, oral, enteral, parenteral,
intranasal o dérmico.
La dosificación de anticuerpos para obtener una
cantidad farmacéuticamente eficaz depende de una variedad de
factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo, tolerancia,... del
animal.
Otro aspecto se refiere a la composición de la
invención, para su uso como medicamento. Otro aspecto de la
invención se refiere al uso de la composición de la invención, para
la elaboración de un medicamento. Otro aspecto de la invención se
refiere al uso de la composición de la invención, para la
elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de la
leishmaniasis. En una realización preferida de este aspecto de la
invención, el medicamento es una vacuna, de aquí en adelante vacuna
de la invención. En una realización más preferida, la vacuna además
comprende excipientes farmacológicamente aceptables. En otra
realización preferida de este aspecto de la invención, la
composición (o la vacuna) de la invención además comprende un
adyuvante. En otra realización preferida la vacuna es
polivalente.
En el contexto de la presente invención el
término "vacuna" se refiere a una preparación antigénica
empleada para establecer la respuesta del sistema inmune a una
enfermedad. Son preparados de antígenos que una vez dentro del
organismo provocan la respuesta del sistema inmunitario, mediante la
producción de anticuerpos, y generan memoria inmunológica
produciendo inmunidad permanente o transitoria.
El término "antígeno" en esta memoria se
refiere a una molécula (generalmente una proteína o un
polisacárido), que puede inducir la formación de anticuerpos. Hay
muchos tipos de moléculas diferentes que pueden actuar de antígenos,
como las proteínas o péptidos, los polisacáridos y, más raramente,
otras moléculas como los ácidos nucleicos.
El término "medicamento", tal y como se usa
en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para
prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de
enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la
presente invención se refiere, también, a los organismos de la
invención, o a la composición de la invención que comprende
organismos de la invención en una cantidad terapéuticamente
efectiva, que es capaz de generar una respuesta inmune frente a un
organismo del género Leishmania, que está causando dicha
enfermedad en el hombre o los animales. Incluye, por tanto, lo que
se conoce como vacuna, tal y como se ha definido previamente en esta
memoria.
En esta memoria, el término "adyuvante" se
refiere a un agente, mientras no posea un efecto antigénico por si
mismo, que puede estimular el sistema inmune incrementando su
respuesta a la vacuna. Aunque sin limitarse a ellas, las sales de
aluminio "fosfato de aluminio" e "hidróxido de aluminio"
son los dos adyuvantes más comúnmente empleados en las vacunas.
Otras sustancias, como por ejemplo el escualeno, también se pueden
emplear como adyuvantes.
Tal y como se define en esta memoria, el término
"polivalente" se usa para referirse a la vacuna que comprende
la combinación de dos o más antígenos en total, incluyendo uno o más
de cualquiera de las especies, tipos, variedades o mutantes que se
incluyen dentro de la clasificación del género
Leishmania.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad de organismos de Leishmania de la invención que
permitan producir el efecto deseado. Los adyuvantes y vehículos
farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas
composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la
materia.
Las composiciones proporcionadas por esta
invención (que comprenden organismos las cepas de Leishmania
de la invención, o anticuerpos de la invención) pueden ser
facilitadas por cualquier vía de administración, para lo cual dicha
composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada y con los
excipientes farmacológicamente aceptables a la vía de administración
elegida.
Los términos "polinucleótido" y "ácido
nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a
formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto
ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxriribonucleótidos (ADN ó
DNA).
Los términos "secuencia aminoacídica",
"péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y
"proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren
a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que
pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Fig. 1. (A). Tasas de crecimiento de la línea de
Leishmania infantum tipo silvestre, de la línea mutante
\Deltahsp70-II y de la línea reexpresante
HSP70-II. Para las líneas
\Deltahsp70-II y reexpresante
HSP70-II (mutante
p70II-Pac-transfectado) fueron
cultivados en presencia (+) o ausencia de antibióticos de selección.
Los datos representan la media y la desviación estándar de al menos
tres experimentos independientes. (B) La proliferanción de los
promastigotes del tipo silvestre, del mutante
\Deltahsp70-II y de la línea reexpresante
HSP70-II se determinó por tinción CFSE.
Fig. 2. Morfología de los promastigotes del tipo
silvestre de Leishmania infantum, de la línea mutante
\Deltahsp70-II y de la línea reexpresante
HSP70-II. A diferentes tiempos a lo largo de la
curva de crecimiento (las densidades celulares se muestran en la
Fig. 1A), se recuperaron promastigotes del cultivo y se tiñeron con
Giemsa. Se registró la morfología de los promastigotes mediante
microscopía. Las imágenes se tomaron bajo aceite de inmersión usando
el objetivo 63x. Las flechas señalan células con dos flagelos.
Fig. 3. Análisis por citometría de flujo de la
interacción de los promastigotes del tipo silvestre de Leishmania
infantum, de la línea mutante \Deltahsp70-II y
de la línea reexpresante HSP70-II con los monocitos
humanos U937: (A) Macrófagos no infectados; (B) macrófagos
infectados con promastigotes de tipo silvestre; (C) macrófagos
infectados con promastigotes \Deltahsp70-II; (D)
macrófagos infectados con promastigotes reexpresantes
HSP70-II (mutantes \Deltahsp70-II
transfectados con p70II-Pac). Los datos representan
porcentajes de macrófagos CFSE etiquetados, al menos fueron contados
30.000. (E, F) Tasas de infección de macrófagos por promastigotes
del tipo silvestre de Leishmania infantum, de la línea
mutante \Deltahsp70-II y de la línea reexpresante
HSP70-II; (E) porcentaje de macrófagos infectados;
(F) número de parásitos por célula infectada. Los datos son medias y
desviaciones estándar de dos
experimentos.
experimentos.
Fig. 4. Determinación de la presencia de
nitritos en el medio de cultivo mediante el uso del reactivo de
Griess a las cuatro semanas de la infección por promastigotes
estacionarios de L. infantum silvestre, en ratones control y
ratones vacunados con promastigotes en fase estacionaria
(infectivos) de la línea \Deltahsp70-II por vía
intravenosa.
Fig. 5. Evolución de las lesiones causadas por
la infección de ratones con L. major en los ratones control
(A) y en los ratones vacunados (B) con promastigotes en fase
estacionaria (infectivos) de la línea
\Deltahsp70-II por vía intrave-
nosa.
nosa.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de
manifiesto la especificidad y efectividad de la cepa de L.
infantum deficiente para el gen hsp70-II
(línea \Deltahsp70-II) para la elaboración
de una vacuna frente a la leishmaniasis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron promastigotes de Leishmania
infantum procedentes de la cepa MCAN/ES/96/BCN/150,
MON-1 in Vitro a 26ºC en el medio RPMI 1640
(Invitrogen), suplementado con un 10% (v/v) de suero fetal bovino
(FCS, inactivado por calor durante 30 min. a 56ºC), 0,1 mg/ml
estreptomicina y 100 U/ml de penicilina.
Las construcciones se realizaron en primer lugar
sobre el vector pBICAT (Larreta et al., 2004. BMC Mol.
Biol. 5:3), un derivado de pBluescript que contiene el gen CAT,
codificante para la enzima cloranfenicol acetil transferasa de E.
coli. Finalmente, las construcciones fueron transferidas al
vector de expresión para tripanosomátidos pX63Neo (LeBowitz et
al., 1991. Gene 103: 119-123).
Para la obtención de las regiones reguladoras de
los genes HSP70, se partió de los clones pUCB2C, que contiene
el fragmento SalI de 5,72 kb procedente del clon genómico
B2g3, y pUCB2F, que contiene el fragmento SalI de 3,81 kb
procedente del clon genómico B2g6 (Quijada et al., 1997. J
Biol Chem 272, 4493-4499).
Para clonar la 5'-UTR y
secuencias reguladoras situadas corriente arriba, contenidas en el
plásmido pUCB2F, se usaron como primers directo y reverso los
oligonucleótidos recogidos en las secuencias (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID
NO: 4) que llevan incluidos las regiones reconocidas por enzimas de
restricción para facilitar la clonación. La digestión del producto
de PCR con las enzimas XbaI y EcoRV, dio lugar a un
fragmento de 1664 pb que fue clonado en el vector pBICAT para dar
lugar al clon pCATC3'. pBICAT es un derivado de pBluescript
conteniendo la región codificante del gen CAT (Larreta et
al., 2004. BMC Mol. Biol. 5, 3).
Para clonar la 3'-UTR_II junto
con la secuencia aguas abajo, se empleó el clon pUCB2C como molde
para la amplificación con primers específicos. Este clon es un
derivado de pUC18 que contiene el fragmento de
5.72-kb SalI del clon genómico pB2g3 (Quijada et
al., 1997. J. Biol. Chem. 272,
4493-4499). Los primers específicos fueron, el
directo (SEQ ID NO: 5), y el reverso (SEQ ID NO: 6). El fragmento de
ADN amplificado fue digerido con HindIII mas SalI, y el fragmento de
1685pb fue clonado en CATC3' para obtener CATC3'C6. Este plásmido
fue digerido con BglII, y el gen quimérico
CAT-HSP70-II fue clonado en
pX63NEO para generar pXcat70-II. Tanto las
construcciones como los fragmentos amplificados por PCR fueron
comprobados por secuenciación. La construcción del plásmido
pX5HisCAT3His, que contiene el gen CAT flanqueado por UTRs derivadas
del gen de la histona H2A, ha sido ya descrito (Larreta et
al., 2004. BMC Mol. Biol. 5: 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Los alelos HSP70-II fueron
reemplazados secuencialmente con los ORF de los genes marcadores
seleccionados comprendiendo o bien el gen NEO o el gen
HYG. Las construcciones fueron preparadas y los genes
marcadores fueron flanqueados por regiones específicas localizadas
aguas arriba y aguas debajo del ORF del gen
HSP70-II. Para este propósito, se eligió el clon
CATC3'C6, que contiene el gen CAT flanqueada por la región
aguas arriba más la 5'-UTR y la
3'-UTR mas las secuencias aguas abajo del gen
HSP70-II. Se reemplazó el gen CAT en
CATC3'C6 por doble digestión con BstBI más HindIII por los cassetes
apropiados conteniendo o el gen NEO o el gen HYG. Para
la amplificación del cassete NEO, el vector de clonación pcDNA3.1
(Invitrogen) se empleó como molde y los siguiente primers, directo
(SEQ ID NO: 7) y reverso (SEQ ID NO: 8). Para la amplificación del
cassete HYG, el vector de clonación pIRES1hyg (Clontech) se
empleó como molde y los siguiente primers, directo (SEQ ID NO: 9) y
reverso (SEQ ID NO: 10). Las construcciones resultantes se
denominaron Neo70-II e Hyg70-II,
respectivamente. 2 \mug de estas construcciones fueron cortadas
con BglII, y los ADNs linearizados fueron empleados individualmente
para la transfección del gen HSP70-II en
L. infantum. Tras la transfección y selección, el mutante
nulo HSP70-II resultante se denominó como
\Deltahsp70-II::NEO/\Deltahsp70-II::HYG,
siguiendo la nomenclatura genética de Clayton et al. 1998.
(Mol. Biochem. Parasitol. 97: 221-224).
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN para la transfección se preparó empleando
el sistema Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Se recogieron los
promastigotes de L. infantum en fase logarítmica tardía por
centrifugación, y fueron suspendidos a 2x10^{8} parásitos/ml en
buffer Cytomix (van den Hoff, 1992. Nucleic Acids Res. 20:
2902), usando 10^{8} parásitos por transfección. Se llevó a cabo
la electroporación por medio del Bio-Rad GenePulser
usando las condiciones descritas en Robinson & Beverley, 2003
(Mol Biochem Parasitol 128, 217-228). Para la
selección clonal, los parásitos transfectados fueron cultivados en
placas de agar-sangre (Quijada et al., 2003.
Mol. Biochem. Parasitol. 130, 139-141)
suplementadas con 20 \mug/ml G418 (Roche Applied Science) o con 50
\mug/ml higromicina B (Sigma).
Por tanto, los promastigotes tanto de la línea
silvestre de L. infantum (MCAN/ES/96/BCN150) como de la línea
mutante \Deltahsp70-II, fueron cultivados
in vitro como se describe en Larreta et al., (2004).
BMC Mol. Biol. 5:3). Para cultivar los mutantes, 20 \mug G418
(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)/ml, y 50 \mug higromicina B
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)/ml fueron añadidos al
medio.
\vskip1.000000\baselineskip
Cinética de crecimiento: Los
promastigotes fueron recogidos de cultivos en fase estacionaria y
diluidos hasta una concentración de 1 \times 10^{6}/ml en 10 ml
de medio fresco. A intervalos de 24 horas, se determinó la densidad
celular por enumeración en el hemocitómetro. Para la tinción
fluorescente, se recogieron los promastigotes, se lavaron dos veces
con buffer salino fosfato (PBS), y se resuspendieron hasta una
concentración de 1 \times 10^{7} células/ml en PBS. Se añadió
CFSE (5,6-carboxifluoresceina diacetato succinimidil
ester; Invitrogen) hasta una concentración final de 5 \muM y las
células se incubaron a 26ºC durante 10 minutos en oscuridad. Se
detuvo la reacción de tinción por adición de 5 volúmenes de medio de
cultivo congelado. Finalmente, se lavaron los promastigotes dos
veces con el medio, se resuspendieron a 1 \times 10^{6}
células/ml, y seguidamente se cultivaron a 26ºC. Se determinó la
fluorescencia media CFSE tras la tinción a 1, 2, 3, 4, y 7 días de
cultivo, mediante citometría de flujo en un citómetro FACSCalibur
(Becton Dickinson, San José, CA) usando CellQuest software.
Examen microscópico: se tomaron los
promastigotes cultivados a 26ºC por 4, 7, 9, ó 12 días, se lavaron
dos veces con PBS, y se depositaron sobre portas de microscopio. Las
preparaciones fueron fijadas en metanol durante 5 minutos, secadas
al aire durante 24 horas, y teñidas con
azur-eosina-azul de metileno en
solución según Giemsa (Merck, Darmstadt, Germany) diluida 1/20 en
agua destilada y lavada cinco veces con agua destilada. Se tomaron
imágenes usando un microscopio Axioskop2 plus y una cámara a color
Coolsnap FX.
\newpage
Análisis del ciclo celular por citometría de
flujo: se cogieron cuatro millones de promastigotes por
centrifugación, lavados dos veces con PBS, resuspendidas en 1 ml de
solución fijadora (30% PBS/70% metanol) e incubadas a 4ºC durante 1
hora. La células fijadas fueron colectadas por centrifugación y
resuspendidas en 500 \mul de buffer de citrato pH 7 (45 mM
MgCl_{2}, 20 mM MOPS, 30 mM de citrato sódico, y 0.1% Tritón
X-100) conteniendo 20 \mug de RNase A (Roche
Diagnostics)/ml y 50 \mug de ioduro de propidio
(Sigma-Aldrich)/ml. Las muestras se incubaron a 37ºC
durante 20 min en oscuridad y después se midió la fluorescencia por
citometría de flujo con un citómetro FACSCalibur.
El mutante delecionado
\Deltahsp70-II fue viable, pero sus
propiedades de crecimiento en medio axénico fueron diferentes de las
de la línea parental, principalmente durante la fase exponencial
tardía (Fig. 1 A). Las densidades del mutante de deleción
(12-14 \times 10^{6} por ml) durante la fase
estacionaria fueron menores que los de la línea parental
(25-27 \times 10^{6} por ml). Específicamente,
coincidiendo con la entrada en la fase estacionaria, la estabilidad
del cultivo \Deltahsp70-II desciende
gradualmente, mientras se mantuvo el número de microorganismos en el
cultivo silvestre (e incluso se incrementó ligeramente). Curvas de
crecimiento similares se obtuvieron cuando el mutante
\Deltahsp70-II se creció en ausencia o presencia
de higromicina B y G418. El crecimiento fue cuantitativamente medido
con el tinte intracitoplasmático estable CFSE. Cuando la célula
teñida con CFSE se divide, se distribuye el tinte entre las células
hijas y la intensidad de fluorescencia desciende correlativamente.
Tras la tinción de los promastigotes
\Deltahsp70-II y silvestres con CFSE, se
iniciaron los cultivos a una densidad inicial de 10^{6}
células/ml. La intensidad de fluorescencia CFSE se determinó a 0, 1,
2, 3, 4 y 7 días de cultivo. De manera notable, hasta el día 4, hubo
un descenso similar en la intensidad de fluorescencia en los
promastigotes \Deltahsp70-II y silvestres.
Sin embargo, la distribución de los picos de fluorescencia fue más
ancha en la población \Deltahsp70-II que en
la silvestre. De nuevo, el crecimiento de los promastigotes
\Deltahsp70-II expresando
HSP70-II de manera episomal fue más homogéneo
que el crecimiento de la línea mutante (Fig. 1B).
El examen de los cultivos bajo el microscopio de
inmersión reveló que las morfologías de las células en los cultivos
\Deltahsp70-II fue remarcablemente
heterogénea. Esto se documentó mediante tinción de Giemsa de los
promastigotes de los cultivos silvestres y
\Deltahsp70-II a diferentes tiempos (Fig.
2). En los cultivos \Deltahsp70-II, un
número significativo de células fueron más pequeñas que en los
promastigotes silvestres. Además, formas redondeadas, promastigotes
con dos flagelos, y formas dividiéndose fueron observadas con mayor
frecuencia en el cultivo \Deltahsp70-II. El
número de formas aberrantes se incrementó con el tiempo en el
cultivo. En contraste, alteraciones morfológicas fueron raras tras
la introducción de una copia episomal de
HSP70-II dentro de la línea mutante (Fig.
2).
La distribución del ciclo celular mostró que el
porcentaje de células en fase G_{2}/M fue mayor en los cultivos
\Deltahsp70-II que en los cultivos
silvestres, un modelo que se mantuvo a través del periodo de
cultivo. De manera similar, los datos mostraron que en los días 4 y
5, el número de células en la fase S fue mayor en el cultivo
\Deltahsp70-II que en el cultivo silvestre,
indicando un retraso en la fase S de las células mutante.
\vskip1.000000\baselineskip
Los promonocitos de las líneas celulares humanas
de linfoma histocítico U937 fueron inducidos a diferenciarse en
macrófagos por la adicción de 1 \times 10^{-8} M
forbol-miristato-acetato (PMA) al
medio de cultivo. Estos macrófagos fueron seguidamente incubados en
un medio de cultivo RPMI a 37ºC/5% CO_{2} con una fase
estacionaria de promastigotes con un ratio protozoo:células de 5:1.
Tras dos horas de incubación, los promastigotes no internalizados
fueron eliminados y las células restantes se incubaron en un medio
de cultivo RPMI a 37ºC/5% CO_{2} durante más de 4 días. A los días
1, 2, 3 y 4 las células fueron fijadas con metanol y teñidas con
Giemsa como se ha descrito arriba. Se contabilizaron al menos 600
macrófagos por preparación; se determinó el porcentaje de macrófagos
infectados y el número de promastigotes intracelulares por célula
infectada.
Para evaluar las interacciones
promastigote-macrófago, se tiñeron los promastigotes
con CFSE (como se ha descrito previamente) y entonces se incubaron
con macrófagos U937 (multiplicidad 5:1 protozoo macrófago) durante
24 horas a 37ºC/5% CO_{2}. La flouorescencia CFSE asociada a
macrófago se determinó en un citómetro FACSCalibur.
Grupos de ratones hembra de 7 semanas de edad
BALB/c (n=4) fueron inoculados por vía intravenosa en la vena
lateral de la cola con 10^{7} promastigotes en fase estacionaria
en 100 \mul de PBS. El suero obtenido del ratón se guardó en 50%
de glicerol a -20ºC. Cuatro semanas después de la infección, se
evaluó la carga parasitaria en el bazo y el hígado por dilución
limitante. El recíproco de la mayor dilución que fue positiva para
el crecimiento de los promastigotes fue considerado el número de
microorganismos viables por órgano.
Para el análisis de la respuesta de anticuerpos
se preparó el antígeno crudo de Leishmania a partir de
promastigotes de L. infantum incubando el microorganismo en
un buffer de lisis (1% Tritón X-100, 150 mM NaCl, 10
mM Tris-HCl pH 8, y 1 mM PMSF) durante 15 min. La
suspensión, guardada en hielo, fue sonicada hasta que se observó un
descenso en la viscosidad. El material insoluble fue centrifugado
hasta formar un pellet a 10,000 \timesg durante 5 min, y el
sobrenadante se guardó inmediatamente a -70ºC hasta su uso.
Las muestras de suero fueron analizadas para
anticuerpos específicos contra los antígenos totales de
Leishmania mediante un ensayo ELISA estándar. Brevemente,
placas estándar (NUNC A/S, Roskilde, Denmark) fueron guardadas toda
la noche a 4ºC con 100 \mul de antígeno crudo de Leishmania
(2 \mug/ml en PBS). Se ensayó el suero de ratón a dilución 1:100.
Como anticuerpos secundarios, fueron empleados los siguientes
conjugados de peroxidasa (Nordic Immunology Laboratories, Tilburg,
Netherlands): IgG anti-ratón de cabra (dilución
1:1000), IgG1 anti-ratón de cabra (dilución 1:1000),
e IgG2a anti-ratón de cabra (dilución 1:1000). El
substrato de peroxidasa fue ortofenilenodiamina dihidroclorhidra
(DAKO A/S, Glostrup, Denmark). Tras 30 minutos, se detuvo la
reacción por la adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1M, y se
leyó la absorbancia a 450 nm. La significancia de las diferencias
fue examinada mediante el test de la t de Student; P <
0.05 fue considerada estadísticamente significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cultivos continuos y pases en cultivo de
Leishmania dan lugar a una gradual pérdida de infectividad.
Por tanto, puesto que la generación de un mutante
\Deltahsp70-II por doble reemplazamiento
requiere la transfección repetida y la selección con fármacos, no
debe excluirse la posibilidad de que la carencia de infectividad de
la línea mutante sea consecuencia del prolongado cultivo in
vitro. Para testar esta posibilidad, se inocularon ratones
BALB/c con elevadas dosis de microorganismos mutantes. A los 28 días
posteriores a la infección, se recobraron células de
Leishmania del bazo del ratón infectado, lo que proporcionó
una demostración directa de que el mutante
\Deltahsp70-II mantuvo su infectividad.
Se empleó citometría de flujo para analizar la
interacción entre los macrófagos U937 y los promastigotes
\Deltahsp70-II (Fig. 3). Aunque el
porcentaje de macrófagos fluorescentes fue comparable cuando estas
células fueron cultivadas tanto con promastigotes
\Deltahsp70-II (76.54%) como con silvestres
(92.22%), hubo marcadas diferencias en las intensidades de
fluorescencia. La fluorescencia aumentada mostrada por los
macrófagos incubados con promastigotes silvestres fue una indicación
de que varios protozoos estaban interaccionando con un solo
macrófago (Fig. 3B). La transfección del mutante
\Deltahsp70-II con la construcción
p70II-Pac expresando HSP70-II
mejoró notablemente su habilidad para interaccionar con los
macrófagos (Figs.3C,D).
El análisis microscópico de la interacción
Leishmania-macrófago tras 1, 2, 3, y 4 días de
incubación protozoo-macrófago mostró que los
promastigotes mutante y silvestre infectaron un número similar de
macrófagos, sugiriendo que la deficiencia HSP70-II
no afecta a la penetración en los macrófagos. Sin embargo, tras 48
horas, el número de amastigotes presentes en los macrófagos difirió
significativamente entre los promastigotes
\Deltahsp70-II y silvestres, y la
diferencia se incrementó aún más en los días 3 y 4. Más aún, la
re-expresión de HSP70-II en
el mutante delecionado no fue suficiente para recuperar su limitada
capacidad para multiplicarse dentro del macrófago (Fig. 3F).
Se investigó también la habilidad del mutante de
deleción para causar leishmaniasis visceral en ratones BALB/c.
Cuatro semanas tras la infección, elevados números de
microorganismos estaban presentes en el hígado y bazo del ratón
infectado con los promastigotes silvestres de L. infantum
(Tabla 1). Sin embargo, en ratones infectados con el mutante
\Deltahsp70-II, se recuperaron solo
protozoos en bazo, y no en el hígado. En base al conteo celular, se
determinó que el mutante nulo
\Deltahsp70-II fue alrededor de unas 1000
veces menos infectivo que la cepa parental en el bazo de los ratones
BALB/c y avirulento en el hígado del ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Se encontraron bajos números de protozoos en el
bazo de ratones infectados con células reexpresando
HSP70-II (el mutante
\Deltahsp70-II transfectado con
p70II-Pac). Tras la reintroducción del gen en el
mutante \Deltahsp70-II, los niveles de
HSP70-II mRNA fueron menores que en los
promastigotes silvestres. El análisis de la respuesta humoral
inducida en los ratones infectados con Leishmania mostró que
los animales infectados con promastigotes silvestres tuvieron una
pronunciada reactividad contra los antígenos totales de
Leishmania. El suero de los ratones infectados con el mutante
Ahsp70-II (o el mutante transfectado con
p70II-Pac) también reaccionó positivamente contra
los antígenos de Leishmania, pero en menor medida que los
sueros de los animales infectados con el cultivo silvestre. El
análisis de los isotipos IgG específicos mostró un ratio IgG2a/IgG1
significativamente mayor en animales infectados con el mutante
\Deltahsp70-II (o el mutante
re-expresando), indicando que existen diferencias
cualitativas en la respuesta humoral del ratón infectado con el
cultivo silvestre vs. el mutante.
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Para el estudio de la reversión de la virulencia
se llevaron a cabo infecciones secuenciales en ratón, tal y como se
ha realizado en otros casos (Spath et al., 2004. Infect
Immun 72, 3622-3627). Al realizarse las
infecciones de forma secuencial, los parásitos recuperados del bazo
de los ratones infectados con el mutante
\Deltahsp70-II fueron empleados para realizar las
infecciones sucesivas. La línea mutante
\Deltahsp70-II produjo parasitemias muy bajas en
bazo, que fueron entre mil y un millón de veces inferiores a la
producida con una dosis igual de promastigotes silvestres de L.
infantum. En ningún caso, se detectaron parásitos en el hígado
de los ratones infectados con la línea
\Deltahsp70-II, mientras que este órgano resultó
altamente infectado con los parásitos de la línea silvestre de L.
infantum. A lo largo del proceso no se detectó variación alguna
en la virulencia de la línea mutante, lo que es una demostración de
la estabilidad del genotipo alterado de la línea
\Deltahsp70-II.
\vskip1.000000\baselineskip
Se infectaron 5 ratones con 10^{7}
promastigotes en fase estacionaria (infectivos) de la línea
\Deltahsp70-II por vía intravenosa. Tras doce
semanas de infección, los animales fueron infectados con 10^{6}
promastigotes estacionarios de L. infantum silvestre. Cuatro
semanas después de la infección, los ratones fueron sacrificados y
se recogieron los macrófagos peritoneales. En paralelo, se
recogieron los macrófagos presentes en el peritoneo de ratones
control (infectados con L. infantum silvestre, pero no
vacunados con el mutante \Deltahsp70-II). Los
macrófagos se depositaron sobre placas de
96-pocillos a una concentración de 10^{6} células
por ml y se incubaron durante 48 horas en ausencia o en presencia de
50 \mug/ml de antígeno soluble de Leishmania (SLA;
preparado a partir de promastigotes de L. major o de L.
infantum).
Trascurrida la incubación, se determinó la
presencia de nitritos en el medio de cultivo mediante el uso del
reactivo de Griess (utilizado siguiendo el protocolo de la casa
suministradora, Promega). Los resultados se muestran en la Fig.
4.
Los nitritos presentes en el medio de cultivo
son el resultado de la producción de óxido nítrico por parte de los
macrófagos en cultivo. La producción de óxido nítrico forma parte
del mecanismo de defensa de los macrófagos (la célula hospedadora
para Leishmania) frente a la infección del parásito y se
considera como el mejor parámetro asociado a una respuesta
inmunitaria protectora frente a Leishmania (Liew &
O'Donnell, 1993). Adv Parasitol 32, 161-259).
Estos resultados indican que la vacunación con la línea
\Deltahsp70-II está induciendo una inmunidad
protectora ya que los macrófagos están preparados para producir
grandes niveles de óxido nítrico al detectar el parásito (tanto sea
L. infantum o L. major).
\vskip1.000000\baselineskip
La infección de ratones con L. major es
utilizada como sistema modelo de ensayo de vacunas por dos razones
fundamentales. Por un lado, al producir lesiones cutáneas en el
sitio de inmunización (almohadilla plantar), el desarrollo de la
infección se puede monitorizar sin necesidad de sacrificar al
animal. Por otro lado, existe una clara asociación entre
protección/susceptibilidad y la inducción de una respuesta Th1/Th2
(Liew & O'Donnell, 1993. Adv Parasitol 32,
161-259).
Se infectaron 5 ratones con 10^{7}
promastigotes en fase estacionaria (infectivos) de la línea
\Deltahsp70-II por vía intravenosa. Tras cuatro
semanas de infección, los animales fueron infectados con 10^{4}
promastigotes estacionarios de L. major en la almohadilla de
la pata trasera derecha. En paralelo, se Infectó un grupo de ratones
control (no vacunados) con la misma dosis de L. major. El
tamaño de la lesión fue monitorizado semanalmente mediante la
utilización de un calibre digital. Los resultados, representados de
forma individual para cada ratón, se muestran en la Fig. 5a y 5b.
Como se observa, la evolución de la lesión en los ratones vacunados
fue mucho menor, siendo nula en tres de los 5 ratones.
<110> Universidad Autónoma de Madrid
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<120> Uso de cepas de Leishmania
\Deltahsp70-II como vacuna.
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<130> 1595.13
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
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<170> PatentIn version 3.4
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<210> 1
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<211> 653
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<212> PRT
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<213> Leishmania infantum
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 1119
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<212> DNA
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<213> Leishmania infantum
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 3
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\hskip1cm7
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<210> 4
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<211> 27
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 4
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\hskip1cm8
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<210> 5
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 5
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\hskip1cm9
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<210> 6
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 6
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\hskip1cm10
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<210> 7
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 7
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\hskip1cm11
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<210> 8
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<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador
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<400> 8
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\hskip1cm12
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<210> 9
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\hskip1cm13
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<210> 10
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<211> 29
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<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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<400> 10
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\hskip1cm14
Claims (14)
1. Uso de organismos de Leishmania que
tienen delecionado el gen HSP70-II, para la
elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de la
leishmaniasis en un mamífero.
2. Uso de organismos de Leishmania que
tienen delecionado el gen HSP70-II según la
reivindicación anterior, donde los organismos que tienen delecionado
el gen HSP70-II pertenecen a una especie de
Leishmania que se selecciona de la lista que comprende:
Leishmania infantum, L. chagasi, L. major, L. tropica, L.
mexicana, L. braziliensis y/o L. amazonensis.
3. Uso de organismos de Leishmania que
tienen delecionado el gen HSP70-II según
cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde los
organismos que tienen delecionado el gen
HSP70-II pertenecen a la especie
Leishmania infantum.
4. Uso de organismos de Leishmania según
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el
mamífero es el perro.
5. Uso de organismos de Leishmania según
cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el
mamífero es el hombre.
6. Uso de organismos de Leishmania según
cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la
leishmaniasis es causada por parásitos de la especie L.
infantum.
7. Composición farmacéutica que comprende un
organismo de Leishmania que tienen delecionado el gen
HSP70-II.
8. Composición farmacéutica según la
reivindicación anterior, donde el organismo de Leishmania se
encuentra en forma de promastigote.
9. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 7-8 que además comprende
excipientes y/o adyuvantes farmacológicamente aceptables.
10. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 7-9, para su uso como
medicamento.
11. Uso de una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 7-9, para la
elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de la
leishmaniasis.
12. Uso de la composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 7-9, para la
elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de la
leishmaniasis en un mamífero.
13. Uso de la composición farmacéutica según la
reivindicación 12, donde el mamífero es el hombre.
14. Uso de la composición farmacéutica según la
reivindicación 12, donde el mamífero es el perro.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200900387A ES2346281B1 (es) | 2009-02-11 | 2009-02-11 | Uso de cepas de leishmania dhsp70-ii como vacuna. |
| PCT/ES2010/070073 WO2010092219A1 (es) | 2009-02-11 | 2010-02-10 | Uso de cepas de leishmania δhsp70-ii como vacuna |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200900387A ES2346281B1 (es) | 2009-02-11 | 2009-02-11 | Uso de cepas de leishmania dhsp70-ii como vacuna. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2346281A1 ES2346281A1 (es) | 2010-10-13 |
| ES2346281B1 true ES2346281B1 (es) | 2011-08-08 |
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ID=42561438
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200900387A Active ES2346281B1 (es) | 2009-02-11 | 2009-02-11 | Uso de cepas de leishmania dhsp70-ii como vacuna. |
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|---|---|
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| WO (1) | WO2010092219A1 (es) |
-
2009
- 2009-02-11 ES ES200900387A patent/ES2346281B1/es active Active
-
2010
- 2010-02-10 WO PCT/ES2010/070073 patent/WO2010092219A1/es not_active Ceased
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010092219A1 (es) | 2010-08-19 |
| ES2346281A1 (es) | 2010-10-13 |
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