BRPI0412913B1 - Métodos para usar uma construção da expressão de dna; usar duas ou três construções da expressão de dna; usar as construções da expressão de dna para a produção de uma vacina para o tratamento de doenças de infecções por leishmaniose; usar duas ou três construções da expressão de dna para a produção de uma vacina para o tratamento de doenças de infecções por leishmaniose; construções da expressão de dna; e vacina para o tratamento de doenças de infecções por leishmaniose - Google Patents
Métodos para usar uma construção da expressão de dna; usar duas ou três construções da expressão de dna; usar as construções da expressão de dna para a produção de uma vacina para o tratamento de doenças de infecções por leishmaniose; usar duas ou três construções da expressão de dna para a produção de uma vacina para o tratamento de doenças de infecções por leishmaniose; construções da expressão de dna; e vacina para o tratamento de doenças de infecções por leishmaniose Download PDFInfo
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Abstract
"meio para tratamento de infecções por leishmaniose". a invenção refere-se ao uso de uma combinação de construções da expressão de dna para a produção de um medicamento para imunização contra infecções com leishmaniose, bem como uma vacina correspondente. as construções da expressão de dna em si são também um objeto da invenção. de acordo com a invenção, pretende-se de preferência que o antígeno imunogênico p36 lack seja utilizado em combinação com o antígeno da proteína antioxidante específica de tiol de leishmania infantum (tsa), o antígeno da proteína 11 de membrana do cinetoplasto de leishmania infantum (kmp-11) e o antígeno de glicoproteína 63 de leishmania infantum (gp63), para a geração de uma resposta imune. na qualidade de plasmídeos das construções da expressão de dna, podem ser utilizados plasmídeos de construções de expressão, e de preferência são utilizadas as construções da expressão gênica minimalística, imunologicamente definida (midge), de acordo com invenção. outras construções da expressão de dna de acordo com invenção são utilizadas para a produção de uma vacina de doenças por infecção com leishmaniose e fazem parte de uma vacina correspondente.
Description
(54) Título: MÉTODOS PARA USAR UMA CONSTRUÇÃO DA EXPRESSÃO DE DNA; USAR DUAS OU TRÊS CONSTRUÇÕES DA EXPRESSÃO DE DNA; USAR AS CONSTRUÇÕES DA EXPRESSÃO DE DNA PARA A PRODUÇÃO DE UMA VACINA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DE INFECÇÕES POR LEISHMANIOSE; USAR DUAS OU TRÊS CONSTRUÇÕES DA EXPRESSÃO DE DNA PARA A PRODUÇÃO DE UMA VACINA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DE INFECÇÕES POR LEISHMANIOSE; CONSTRUÇÕES DA EXPRESSÃO DE DNA; E VACINA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DE INFECÇÕES POR LEISHMANIOSE (51) Int.CI.: A61K 39/008 (30) Prioridade Unionista: 24/10/2003 EP 03090368.6 (73) Titular(es): MOLOGEN AG (72) Inventor(es): BURGHARDT WITTIG; LAURA FUERTES-LÓPEZ; MARCOS TIMÓN-JIMÉNEZ
1/28
MÉTODOS PARA USAR UMA CONSTRUÇÃO DA EXPRESSÃO DE DNA; USAR DUAS OU TRÊS CONSTRUÇÕES DA EXPRESSÃO DE DNA; USAR AS CONSTRUÇÕES DA EXPRESSÃO DE DNA PARA A PRODUÇÃO DE UMA VACINA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DE INFECÇÕES POR LEISHMANIOSE; USAR DUAS OU TRÊS CONSTRUÇÕES DA EXPRESSÃO DE DNA PARA A PRODUÇÃO DE UMA VACINA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DE INFECÇÕES POR LEISHMANIOSE; CONSTRUÇÕES DA EXPRESSÃO DE DNA; E VACINA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DE INFECÇÕES POR LEISHMANIOSE [001] A invenção refere-se ao uso de uma combinação de construções da expressão de DNA para a produção de um medicamento para imunização contra infecções com leishmaniose, bem como uma vacina correspondente. As construções da expressão de DNA em si são também um objeto da invenção.
[002] As leishmânias são flagelados de tripanossomos da ordem Kínetoplastída. Elas são transmitidas para diferentes espécies mamíferas e para humanos pelo mosquito-pólvora fêmeo hematófago das espécies Phlebotomus e Lutzomyia. As leishmanioses são doenças com um conjunto distinto de manifestações clinicas e constituem um problema de saúde importante. De acordo com as estimativas da Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de 12 milhões de seres humanos estão afetados mundialmente pela doença. Cerca de 2 a 9 por cento de todos pacientes com HIV sofrem de leishmaniose visceral, tornando-a a terceira maior doença parasítica prevalente que aflige os pacientes de HIV. Embora destruições teciduais sérias ocorram na leishmaniose mucocutânea e cutânea, uma leishmaniose visceral não-tratada (Kala-Azar) termina, na maioria dos casos, em morte.
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2/28 [003] Para o tratamento da doença, existem apenas alguns medicamentos clinicamente comprovados disponíveis. Portanto, os quimioterápicos - usualmente compostos do metal pesado antimônio - são utilizados para o tratamento de leishmaniose visceral há 60 anos. A toxicidade parcialmente maciça da maioria dessas preparaçoes limita seu uso. Além disso, a leishmânia desenvolveu, em muitas regiões, resistência contra preparações de antimônio (J. Postgrad.
| Med. 49(1) | :61-8 | (janeiro-março | de 2003 | )). | |
| obtenível. | [004] | Não | existe | ainda | uma terapia facilmente |
| [005] | Como | as | pessoas | que sobreviveram à |
infecção desenvolvem uma forte imunidade contra infecções posteriores, o desenvolvimento de uma vacinação eficaz deve ser possivel.
[006] A vacinação em relação à imunoterapia de leishmaniose causada por parasitas intracelulares deve ser possível induzindo uma resposta imune Thl típica. Dentro do estado da arte, a importância de induzir uma resposta Thl na terapia ou prevenção de leishmanioses é ressaltada muito frequentemente (Handman et al., J. Immunol. 160:394957, Gurunathan et al., Nature Med. 4(12):1409-15). Como um auxílio para a indução de uma resposta imune Thl típica, a citocina co-estimuladora IL-12 é referida como um adjuvante necessário (Parker et al., J. Immunol. 140:896-902).
[007] Adicionalmente, sequencias de ácidos nucleicos imunoestimulantes (ISS) podem ser usadas como adjuvante. Os modelos CpG da ISS levam a um aumento da atividade de células NK e macrófagos, bem como uma forte estimulação da resposta imune Thl celular. De preferência,
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3/28 podem ser usadas ISS ligadas de forma covalente, tendo um comprimento de 30 pares de bases, como descrito, por exemplo, no documento n2 EP 1 196 178 Al.
[008] Diferentes antígenos foram testado em váríos protocolos de vacinas experimentais em camundongos. A reação imunológica a esta infecção em camundongos parece ser similar àquela em humanos, e provavelmente também em cães (Cox, Int. J. Parasitol. 263:1147-1157). Os antígenos empregados foram gp63 (Scott et al., J. Exp Med. 168:16751684), gp46 (McMahon-Pratt et al., Infection and Immunity 61:3351-3359), p-4 e p-8 (Scott et al., Immunology 99:615624) e o antígeno referido como gp36 ou LACK (GonzalesAseguinolaza et al., Eur. J. Biochem. 259:909-916). O protocolo de vacinação mais exitoso, a imunização primária pela proteína p36 e a imunização secundária pelo vírus da vacínia que codifica p36 e IL-12 levou a um decréscimo médio em lesões de 52%, em comparação com camundongos nãovacinados (Gonzalo et al., Microbes and Infection: 3 (9):7 01-711).
[009] Apesar de proteger apenas 52 %, os vírus da vacínia foram usados nos experimentos citados como transportadores de genes. São os vetores virais que representam os transportadores de genes mais comumente utilizados por causa da sua alta eficiência de transfecção. Entretanto, o alto risco de uma reação citotóxica do hospedeiro, causada pelas células transfectadas, é conhecido. Assim sendo, a aplicação de altas doses de um adenovírus levou, em um ensaio clínico, à morte do paciente; obviamente, a razão para isso foi uma sobre- reação intensa do sistema imunológico (Lehrman, Nature 401:517-518 (1999)). Além disso,
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4/28 a metamorfose de uma cepa de vacinação atenuada em uma cepa virulenta não pode ser excluída por causa da sua instabilidade. Além disso, as partes virais em si podem atuar de forma imunogênica, levando a um decréscimo da sua eficiência pelo sistema imunológico dos pacientes.
[0010] Em vários experimentos da presente Requerente, camundongos BALB/c foram imunizados com construções de expressão que codificam o antígeno LACK p36. Foram aplicados neste caso diferentes protocolos de vacinação. Dentro destes estudos, em um grupo, pôde-se obter uma proteção de 57% contra infecções por Leishmania major (L. Lopez-Fuertes et al., Vaccine 21: 247-257 (2002)).
[0011] Gurunathan et al. usaram o antigeno LACK p36, codificado por vetores de expressão eucariótica, para experimentos de vacinação em camundongos (J. Exp. Med.,
186(7):1137-1147 (1997)).
[0012] Em outras abordagens, foram utilizadas diferentes combinações de antígenos. Com uma mistura de DNA plasmídico, que codifica TSA e LmSTll, o tamanho das lesões pôde ser minimizado durante um espaço de tempo definido (A. Campos-Neto et al., Infection and Immunity:2828-2836 (2002)).
[0013] A combinação tríplice dos antígenos LACK,
LmSTll
TSA, conseguiu inibir majoritariamente aparecimento de lesões dérmicas após a infecção e resultou em proteção por várias semanas (S. Mendez et al., J. of Immunology 166:5122-5128 (2001)).
[0014] Todos experimentos citados têm em comum que foi possível uma proteção apenas parcial, e assim sendo, uma proteção insuficiente contra infecções de leishmaniose. Além disso, uma grande desvantagem é que as combinações de
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5/28 vacinação não foram testadas em cães, os principais transmissores, porém em camundongos. Uma outra desvantagem é que foram usados plasmídeos como transportadores de genes. Os plasmídeos são obtidos por fermentação bacteriana. Desta forma, eles contêm, além do DNA do gene desejado necessário para replicação e seleção, tipicamente, genes resistentes contra os antibióticos usados durante a fermentação. 0 uso de construções da expressão gênica, baseadas em DNA plasmídico, tem o risco inerente de disseminar genes resistentes a antibióticos, o que é especialmente injustificável em campanhas de vacinação. As desvantagens dos vetores de expressão baseados em plasmídeos, descritas acima, encontram oposição maciça dentro da prática clínica contra seu uso.
[0015] Partindo deste estado da arte, é um objetivo da presente invenção fornecer uma construção da expressão de DNA, e além disso, várias construções da expressão de DNA que podem ser usadas para produzir um medicamento para a imunização eficiente contra leishmaniose.
atingido pelas [0016] O objetivo é características das reivindicações independentes.
[0017] As construções da expressão de DNA são, de acordo com a invenção, de preferência, construções da expressão gênica imunológicas minimalistas definidas,
| referidas | como | MIDGE | no seguinte: | (MIDGE® | : MINIMALISTIC | |
| IMMUNOLOGICALLY | DEFINED GENE EXPRESSION | VECTORS, vide | ||||
| documento | n° EP | 0 941 | 318 Bl, patente n | ° US 6. | 451. | 593 Bl). Os |
| vetores MIDGE | têm a | vantagem de que | eles | não | necessitam | |
| estruturas | que | não | são essenciais | para | a | eficiência |
terapêutica.
[0018] De acordo com a invenção, pretende-se de
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6/28 preferência que o antígeno imunogênico p36 LACK SEQ ID NO: 8 seja utilizado em combinação com o antígeno de proteína antioxidante específico de tiol (TSA) de Leishmania infantum SEQ ID NO: 4, o antígeno de proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo (Kmp-11) de Leishmania infantum SEQ ID NO: 2 e o antígeno de glicoproteína 63 (gp63) de Leishmania infantum SEQ ID NO: 6, para a geração de uma resposta imune.
[0019] Assim sendo, pretende-se o uso de uma construção da expressão de DNA para a produção de um medicamento para a imunização contra infecções de leishmaniose, onde a dita construção da expressão de DNA contém uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificadoras, levando à expressão do gene da proteína antioxidante específica de tiol (TSA) de Leishmania infantum SEQ ID NO: 4, glicoproteína gp63 SEQ ID NO: 6 e proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo (Kmp-11) SEQ ID NO: 2 ou seus alelos ou derivados com função correspondente.
[0020] Prefere-se também o uso de duas ou três construções da expressão de DNA para a produção de um medicamento para imunização contra infecções de leishmaniose, onde as ditas construções da expressão de DNA contêm, cada uma, uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificadoras, que levam coletivamente à expressão do gene de proteína antioxidante específica de tiol (TSA) de antígenos de Leishmania infantum SEQ ID NO: 4, glicoproteína gp63 SEQ ID NO: 6 e proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo (Kmp11) SEQ ID NO: 2 ou seus alelos ou derivados com função correspondente.
[0021] De acordo com a invenção, pretende-se que pelo menos dois antígenos de Leishmania infantum sejam
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7/28 expressos como proteínas de fusão. Isto pode ser, por um lado, a proteína de fusão - como produto da expressão - do gene da proteína específica de tiol (TSA) SEQ ID NO: 4 e o gene da proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo (Kmp-11) SEQ ID NO: 2, ou uma combinação deles. Consequentemente, com relação aos três diferentes antígenos de Leishmania infantum, prefere-se uma proteína de fusão - como produtos das expressões - do gene da proteína específica de tiol (TSA) SEQ ID NO: 4, gene da glicoproteína gp63 SEQ ID NO: 6 e o gene da proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo (Kmp-11) SEQ ID NO: 2, ou uma combinação deles.
[0022] O termo combinação deles significa cada ordem/alinhamento dos genes, isto é, sua ordem de leitura, como por exemplo, [TSA - Kmp-11], mas também [Kmp-11 - TSA] , isto é, [TSA - gp63 - Kmp-11] ou [TSA - Kmp-11 - gp63] ou [Kmp-11 - TSA - gp63] etc., etc.
[0023] Assim sendo, uma construção da expressão gênica que codifica diferentes proteínas de fusão também é pretendida. A proteína de fusão consiste em uma combinação de pelo menos dois dos antígenos mencionados (TSA SEQ ID NO: 4, Kmp-11 SEQ ID NO: 2). A biproteína de fusão é usada isoladamente ou em combinação com o antígeno gp63 SEQ ID NO:
6.
[0024] Além disso, a proteína de fusão pode consistir nos três antígenos, como descrito. Isto se refere a uma combinação dos antígenos TSA SEQ ID NO: 4, Kmp-11 SEQ ID NO: 2 e gp63 SEQ ID NO: 6.
[0025] Alem disso, prefere-se outro uso no qual, além das construções de expressão de DNA - independentemente de se as proteínas de fusão serão expressas ou não - está
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8/28 incluída uma construção da expressão de DNA para a expressão do antígeno p36 LACK de leishmania SEQ ID NO: 8 ou um seu alelo ou derivado com função correspondente. Assim sendo, o antígeno p36 LACK SEQ ID NO: 8 pode ser adicionado opcionalmente a esse coquetel.
[0026] A designação seu alelo ou derivado com função correspondente significa, dentro do contexto da presente invenção, sequências homólogas, onde o grau de homologia não está ainda caracterizado até agora, desde que a mesma função do gene esteja garantida e mantida.
[0027] Como transportador de genes, utiliza-se um cassete da expressão de MIDGE de filamento duplo fechado de forma covalente. As sequências de polinucleotídeos imunogênicos estão presentes como construções de expressão que consistem em moléculas de desoxirribonucleotídeos lineares fechados de forma covalente, tendo uma região de filamento duplo linear, onde os filamentos individuais que formam o filamento duplo são ligados por alças de filamento único curto de nucleotídeos de ácidos desoxirribonucleicos, onde os filamentos individuais que formam o filamento duplo consistem apenas em uma sequência codificadora sob controle de uma sequência promotora operável no animal que vai ser vacinado, e uma sequência terminadora. Assim sendo, o cassete de expressão consiste apenas na região codificadora, no promotor, e caso necessário, uma sequência terminadora, de tal modo que a construção contenha apenas as informações necessárias para a expressão do gene desejado, evitando a desvantagem de transportadores de genes com origem viral. Além disso, pretende-se de acordo com a invenção, que a construção ou construções de expressão estejam ligadas a um
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9/28 oligopeptídeo com 3 a 30 aminoácidos, onde o oligopeptideo consiste em metade dos aminoácidos básicos selecionados entre os grupos arginina e lisina, para um aumento da eficiência da transfecção. Especialmente, prefere-se particularmente uma sequência de localização nuclear, • a sequência de localização do núcleo (NLS) SEQ ID NO: 9, representado a sequência peptídica PKKKRKV (prolina- lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina) do Vírus Símio SV-40. Particularmente, para SV-40-NLS, demonstrou-se que as proteínas de até 465 kDa são direcionadas para o núcleo das células (Lanford et al., Cell 15; 46(4):575-82 (1986)). Esta capacidade do peptídeo foi utilizada para seu acoplamento ao DNA para melhorar a transferência dos genes.
• ou o fragmento do peptídeo T que compreende onze aminoácidos YGRKKRRQRRR do produto TAT do gene de HIV-1 SEQ ID NO: 10.
[0028] Assim sendo, as proteínas que ampliam a eficiência da transfecção das vacinas de DNA, como por exemplo, os peptídeos e proteínas catiônicas, são preferidas como partes das construções de DNA.
[0029] As sequências de polinucleotídeos codificadoras podem ser também vetores de expressão de filamento duplo circulares.
[0030] Sabe-se que um uso de códons (Otimização com Uso de Códons) dentro da construção de expressão, de preferência, em mamíferos, leva a um forte aumento da expressão da proteína (Grantham et al., Nucleic Acids Res., 9:1893-912 (1980)). Para expressar mais antígeno in vivo e para receber com isto uma resposta imune mais intensa, que
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10/28 resulta em uma proteção eficiente e duradoura contra infecções de leishmaniose, a sequência do tipo selvagem de gp63 foi otimizada. Otimizar significa adaptação de códons, também designada Otimização com Uso de Códons. Com este propósito, foi desenvolvida uma estratégia de clonagem, permitindo a síntese da sequência de DNA otimizada de gp63 a partir de oligonucleotídeos.
[0031] De acordo com a invenção, a sequência do antígeno gp63 de Leishmania infantum foi otimizada com códons (SEQ ID NO: 5) . Uma construção da expressão de DNA que compreende esta sequência é, portanto, também preferida.
[0032] As construções da expressão de DNA, de acordo com a invenção fornecem uma base para produzir uma vacina para o tratamento de infecções de leishmaniose e são parte de uma vacina correspondente.
[0033] Em outra modalidade preferida da invenção, a vacina pode conter sequências de ácidos nucleicos imunoestimulantes (ISS). As sequências de ácidos nucleicos estimuladoras imunogênicas, que contêm modelos CpG, compreendem um filamento circular de ácido desoxirribonucléico com uma sequência de bases antiparalela parcialmente complementar. Em uma modalidade especialmente preferida, as sequências de ácidos nucleicos imunoestimulantes têm um formato de halter.
[0034] Similarmente, a combinação de vacinas de acordo com a invenção, tendo compostos que aumentam a transfecção, como PEI (polietilenoimina) é possível.
[0035] Para a transfecção, podem ser utilizados métodos biológicos, químicos e/ou físicos, existentes no estado da arte, como por exemplo, transfecção por
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11/28 transferência balística ou eletroporação. Em uma modalidade preferida da invenção, a transfecção é conduzida por transfecção utilizando injeção intradérmica com uma seringa ou equipamento de injeção sem agulha.
| [0036] | O protocolo | de sequências adicionadas é |
| parte do pedido de | patente e do | presente relatório descritivo |
| lista as sequências | . | |
| [0037] | SEQ ID NO: | nome da sequência/- |
| descrição | ||
| [0038] | SEQ ID NO: 1 | sequência do DNA de Gene |
| de proteína 11 da | membrana de | cinetoplastídeo de Leishmania |
| infantum (Kmp-11) | ||
| [0039] | SEQ ID NO: 2 | sequência protéica do |
| antígeno da proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo de | ||
| Leishmania infantum | (Kmp-11) | |
| [0040] | SEQ ID NO: 3 | sequência do DNA do gene |
da proteína antoxidante específica de tiol de Leishmania infantum (TSA) [0041] SEQ ID NO: 4 sequência protéica do antígeno da proteína antioxidante específica de tiol de Leishmania infantum (TSA)
| [0042] SEQ | ID | NO: 5 | sequência do DNA | do |
| antígeno glicoproteína | 63 | (gp63) | , otimizada com códons, | de |
| Leishmania infantum | ||||
| [0043] SEQ | ID NO: | 6 sequência proteica | do | |
| antígeno glicoproteína | 63 | (gp63) | , otimizada com códons, | de |
Leishmania infantum [0044] SEQ ID NO: 7 sequência do DNA do antígeno p36 (LACK) de Leishmania infantum [0045] SEQ ID NO: 8 sequência protéica do
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12/28 antígeno p36 (LACK) de Leishmania infantum [0046] SEQ ID NO: 9 sequência de localização de núcleo (sequência peptídica) de SV40 [0047] SEQ ID NO: 10 fragmento de peptídeo T grande do produto do gene de HIV-1 TAT (peptídeo TAT) [0048] SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 36 oligômeros de DNA sintéticos, como descrito abaixo.
[0049] Outras medidas vantajosas estão descritas nas reivindicações independentes. A invenção será agora descrita e discutida pelas figuras e exemplos que se seguem.
[0050] O efeito surpreendente da combinação das construções da expressão de DNA e um medicamento de acordo com a invenção, contendo tal combinação ficarão evidenciados pelas representações e figuras, significando:
[0051] MIDGE-NLS p36 com MIDGE acoplado a NLS codificando o antígeno p36 LACK SEQ ID NO: 8 [0052] MIDGE-NLS TSA com MIDGE acoplado a NLS codificando o antígeno TSA SEQ ID NO: 4 [0053] MIDGE-NLS gp63 com MIDGE acoplado a NLS codificando o antígeno gp63 SEQ ID NO: 6 [0054] MIDGE-NLS Kmp-11 com MIDGE acoplado a MLS codificando o antígeno Kmp-11 SEQ ID NO: 2 [0055] pMCVp36 plasmídeo que codifica o antígeno
| p36 LACK SEQ ID NO: | 8 pMCV | TSA plasmídeo que | codifica | o | |
| [0056] | |||||
| antígeno | TSA SEQ ID | NO: | 4 | ||
| [0057] | pMCV | gp63 plasmídeo que | codifica | o | |
| antígeno | gp63 SEQ ID NO: | 6 | |||
| [0058] | pMCV | Kmp-11 plasmídeo que | codifica | o |
antígeno Kmp-11 SEQ ID NO: 2
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13/28 [0059] Ilustrando:
[0060] Fig. 1: O desenvolvimento de lesões dentro de 8 semanas após a inoculação da infecção em camundongos. Legendas:
| [0061] | L+K: LACK SEQ ID | NO: | 8 | em combinação | com | |
| Kmp-11 SEQ | ID NO: | 2 | ||||
| [0062] | L+T: LACK SEQ ID | NO: | 8 | em combinação | com | |
| TSA SEQ ID | NO: 4 | |||||
| [0063] | L+G: LACK SEQ ID | NO: | 8 | em combinação | com | |
| gp 63 SEQ | ID NO: | 6 | ||||
| [0064] | K+T: Kmp-11 SEQ | ID | NO: | 2 em combinação | ||
| com TSA SEQ ID NC | >: 4 | |||||
| [0065] | K+G: Kmp-11 SEQ | ID | NO: | 2 em combinação | ||
| com gp 63 | SEQ ID | NO: 6 | ||||
| [0066] | T+G: TSA SEQ ID | NO: | 4 | em combinação | com | |
| gp 63 SEQ | ID NO: | 6 | ||||
| [0067] | T+G+L: TSA SEQ ID | NO: | 4 | em combinação | com | |
| gp 63 SEQ | ID NO: | 6 e LACK SEQ ID NO: | 8 | |||
| [0068] | T+G+K: TSA SEQ ID | NO: | 4 | em combinação | com | |
| gp 63 SEQ | ID NO: | 6 e Kmp-11 SEQ ID NO | : 2 | |||
| [0069] | L+K+G: LACK SEQ | ID | NO: | 8 em combinação |
com Kmp-11 SEQ ID NO: 2 e gp 63 SEQ ID NO: 6 [0070] L+K+T: LACK SEQ ID NO: 8 em combinação com Kmp-11 SEQ ID NO: 2 e TSA SEQ ID NO: 4 [0071] T+G+L+K: TSA SEQ ID NO: 4 em combinação com gp 63 SEQ ID NO: 6, LACK SEQ ID NO: 8 e Kmp-11 SEQ ID NO: 2
0072] PBS: Grupo de Controle: PBS
0073] A Figura 1 ilustra diferentes combinações
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14/28 dos antígenos usados em camundongos. Os antígenos foram usados isoladamente, em seis combinações duplas diferentes, em quatro combinações triplas diferentes, e em uma combinação quádrupla. Na qualidade de parâmetro relevante para um sucesso clínico da vacinação, determinou-se o crescimento das lesões, causado pela infecção. 0 aumento do crescimento das lesões é plotado na ordenada em milímetros. As diferentes combinações de antígenos são plotadas como abscissa. É óbvio que dentro do grupo de combinações duplas, a combinação de TSA SEQ ID NO: 4 e gp63 SEQ ID NO: 6 dá a melhor proteção de vacinação. A segunda melhor proteção é alcançada pela combinação LACK SEQ ID NO: 8 e TSA SEQ ID NO: 4. Dentro do grupo de combinações triplas, o grupo LACK SEQ ID NO: 8, Kmp11 SEQ ID NO: 11 e TSA SEQ ID NO: 4 dá a melhor proteção. 0 sucesso atingido pela vacinação resulta em um tamanho claramente minimizado das presentes lesões. A segunda melhor proteção de vacinação é atingida pela combinação dos antígenos TSA SEQ ID NO:4, gp63 SEQ ID NO: 6, e Kmp-11 SEQ ID NO: 2. Dentro deste grupo, obtém-se um tamanho médio das lesões de 0,5 milímetro. O valor de 0,5 mm representa um limite para o olho humano reconhecer e analisar lesões. Isto significa que os animais tratados com a combinação TSA SEQ ID NO: 4, gp 63 SEQ ID NO: 6 e Kmp-11 SEQ ID NO: 2, apresentam por definição nenhuma lesão, isto é, as lesões avaliadas estão abaixo do limite de detecção. Em comparação, os camundongos não-tratados do grupo de controle têm um tamanho médio das lesões de 1,7 mm. Adicionalmente, estes animais apresentaram inchaço e vermelhidão intensos. Além disso, estes animais apresentaram um forte inchaço e vermelhidão das patas, sintomas que não puderam ser observados nos grupos
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15/28 protegidos, representando sinais claros de inflamação causada pela infecção.
[0074] Fig. 2: Determinação da titulação total de IgG em cães antes da inoculação da infecção com promastigotos de Leishmania infantum. Legenda:
[0075] Grupo 1: MIDGE-NLSp36 LACK [0076] Grupo 2: combinação dos antígenos MIDGENLS 4 Grupo 3: combinação de 4 antígenos plasmídicos Grupo 4: Grupo de Controle: PBS [0077] Os pontos representam os dados de cães individuais, e as barras horizontais marcam o valor médio do grupo correspondente. A densidade óptica (OD) aumenta com a concentração sérica dos anticorpos. Na Figura 2, há uma clara diferença entre a concentração dos anticorpos antiLeishmânia dos Grupos 1 e 2, por um lado, e os Grupos 3 e 4, por outro lado, são óbvios. Os cães do Grupo 1, vacinados com MIDGE-NLS-LACK, e os cães do Grupo 2, que receberam a combinação das sequências de quatro antígenos em MIDGE-NLS, possuíam mais anticorpos contra Leishmania infantum do que os Grupos 3 e 4. É notável que nenhum anticorpo foi detectável no Grupo 3, embora as mesmas sequências de anticorpos que no Grupo 2 tivessem sido usadas. Isto demonstra que a combinação das sequências de quatro antígenos, especialmente em combinação com os vetores MIDGE-NLS, é apropriada para a indução de uma resposta imune humoral. Além disso, em comparação com o Grupo 1, os cães do Grupo 2 tiveram em média mais anticorpos. Isto leva à conclusão de que a combinação dos quatro antigenos é vantajosa em comparação com a aplicação individual de LACK SEQ ID NO: 8.
[0078] Na descrição que se segue, os resultados
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16/28 dos experimentos estão discutidos mais detalhadamente. Detalhadamente:
[0079] Em um experimento de vacinação em camundongos, testou-se a eficácia de diferentes combinações dos antígenos, para atingir proteção máxima contra infecções com leishmaniose. Na qualidade de parâmetro para proteção induzida, considerou-se a supressão do crescimento das lesões pela vacina combinada. Para a avaliação da eficiência da proteção, foi realizada uma infecção inoculada com promastigotos de Leishmania infantum. A avaliação do crescimento das lesões foi feita semanalmente. Os resultados na Figura 1 são obtidos a partir da oitava semana após a inoculação da infecção. Basicamente, todos animais vacinados com um antígeno ou uma combinação dupla dos antígenos desenvolveram lesões mais cedo do que os animais vacinados com uma combinação tripla ou quádrupla. Um bom resultado da vacinação foi atingido com uma combinação tripla dos antígenos Kmp-11 SEQ ID NO: 2, TSA SEQ ID NO: 4 e p36 LACK SEQ ID NO: 8. Uma proteção comparável foi atingida com a combinação dos antígenos TSA SEQ ID NO: 4, gp63 SEQ ID NO: 6 e Kmp-11 SEQ ID NO: 2. 0 sucesso surpreendente fica óbvio pelo fato de que o tamanho das lesões para as combinações triplas (TSA SEQ ID NO: 4, gp 63 SEQ ID NO: 6, Kmp-11 SEQ ID NO: 2 e p36 LACK SEQ ID NO: 8, Kmp-11 SEQ ID NO: 2, gp 63 SEQ ID NO:6) ficou abaixo do limite de 0,5 mm, significando que nenhuma lesão aparente se desenvolveu. Assim sendo, o tamanho das lesões dos animais vacinados é 100% menor do que o do grupo de controle não-vacinado.
[0080] Tabela 1: Composição de combinações de antígenos para um experimento de vacinação em camundongos.
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Grupo Número de Quantidade_de animais DMA [mierogramal
| 1. | MlDÜE-NLS-p36 LRCK+Kmp-i i | 9 | 50 |
| 2. | MIDGE-NLS-p36 LACK+TSA | 9 | 50 |
| 3. | KIDGE-NLS-p36 LACK-i-gp 63 | 9 | 50 |
| 4. | MIDGE-NLS-Kjnpll + TSA | 9 | 50 |
| 5. | MIDGE-NLS-Kmplltgp 63 | 9 | 50 |
| 6. | MIDGE-NLS-TSA+gp 63 | 9 | 50 |
| 7 . | MIDGE-NLS-TSA+gp 63+p36 LACK | 9 | 50 |
| a. | MIDGE-NLS TSA+gp 63+p36 | 9 | 50 |
LACK+Kmp-U
| 9. | MIDGE-NLS p36 LACK | 9 | 50 |
| 10, | . MIDGE-NLS TSA | 9 | 50 |
| 11. | , MIDGE-NLS Knp-11 | 9 | 50 |
| 12. | , MIDGE-NLS gp 63 | 9 | 50 |
| 13. | . MIDGE-NLS TSA+gp 63+Kmp-ll | 9 | 50 |
| 14 . 63 | . MIDGE-NLS p36 LACK+Kmp-11+gp | 9 | 50 |
| 15. H1DGE-NLS p36 LACK+Kmp- 11+tsa | 9 | 50 | |
| 17. | P0S | 9 | 50 |
[0081] Foram testados nove camundongos BALB/c fêmeos por grupo. Os animais foram vacinados com 50 microgramas de DNA. Para as combinações de antígenos, foram usados 50 raicrogramas de cada antígeno. Depois de duas semanas, foi feita a segunda vacinação (reforço) . Três semanas depois do reforço, foi conduzida uma inoculação da infecção com 5 x 104 promastigotos de Leishmania infantum, que estavam quiescentes na fase metacíclica estacionária. Eles foram injetados na pata traseira direita. 0 estado das injeções foi verificado semanalmente. 0 tamanho das lesões foi determinado com um paquímetro deslizante eletrônico e por comparação com a pata traseira não tratada. Além disso, em um
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18/28 experimento seguinte, em cadelas da raça beagle com 4 a 12 idade, foram usadas diferentes combinações de combinação de antígenos meses de vacinas, utilizada aplicação do antígeno, relativamente correta porém diferindo na
Grupo 1 recebeu apenas um antígeno, a saber, o Antígeno p36 LACK SEQ ID NO: 8. Este antígeno deu boa proteção em experimentos anteriores e deveria ser comprovado em cães (L. Lopez-Fuertes et al., Vaccine 21:247-257 (2002)).
O Grupo 3 recebeu diferentes plasmídeos que codificam os antígenos de Leishmania infantum TSA SEQ ID NO: 4, Kmp-11 SEQ ID NO: 2, gp63 SEQ ID NO: 6 e p36 LACK SEQ ID NO: 8. Esse grupo foi usado para comparação de vetores e eficiência com o Grupo 2, consistindo nas mesmas combinações de antígenos, porém contendo vetores MIDGE acoplados a peptídeos.
[0082] Foram montados quatro grupos de vacinação com seis animais cada um, que foram vacinados por via intradérmica quatro vezes em um período de 15 dias com 200 microgramas de cada DNA por construção (vide Tabela 3) .
Antes de iniciar o experimento e depois de cada imunização dos animais, o sangue foi coletado para exame sorológico além das verificações veterinárias típicas.
[0083] Para determinar qual tipo de resposta imune foi induzida pela infecção, foram utilizados diferentes métodos. Ao método que permite conclusões sobre o tipo de resposta imune, pertence o teste assim denominado
Hipersensibilidade do Tipo Retardada (teste DTH). Medindo a espessura da derme no local de injeção 72 horas depois da é possível determinar de forma se uma resposta hipersensível retardada, e assim sendo, uma reação específica de células T, foi induzida. Os resultados estão resumidos na seguinte
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Tabela 2:
[0084] Tabela 2
| Gruúã Cíti | DTH CdSte DTH | |
| da Êpóa | ||
| vacínaolo | ||
| MID5E-HLSp36 LACK 1 | - | |
| 2 | - | - |
| 3 | - | - |
| 4 | - | 4 |
| ί | - | - |
| t | - | - |
| MIDGE-NLS 1 | - | * |
| TSA, p3b, Kr.pLl, <jp36 2 | - | * |
| 3 | - | * [7] |
| 4 | - | - |
| 5 | - | + |
| 6 | * | |
| PLa. jçnidflo 1 | - | |
| TSA, p36 LACK, nnpll, £ | - | |
| -gpíS 3 | - | - |
| 4 | - | + # |
| 5 | - | - |
| 6 | - | |
| Tampão -dfl f&S 1 | - | - |
| 2 | + | - |
| 3 | - | |
| 4 | - | |
| 5 | - | - <í) |
| € | - | - |
| [0085] A Tabela | 2 ilustra os resultados de um | |
| teste de Hipersensibilidade | do Tipo | Retardada (teste DTH). |
| Um inchaço local da derme é | avaliado | como teste DHT positivo |
| (marcado na figura com + | ou ++) | e indica que o animal |
| correspondente desenvolveu células de memória T específicas | ||
| de antígenos, causadas pela | infecção, | e assim sendo, ocorreu |
| uma resposta imune celular. | Como descrito, a resposta imune |
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20/28 celular é crucial para a profilaxia e terapia de doenças de leishmaniose. Antes de iniciar o experimento, um teste DTH foi realizado para assegurar que nenhum animal já tinha desenvolvido uma resposta imune celular contra Leishmania infantum por causa de uma infecção/vacinação anterior. Todos animais, exceto um, reagiram negativamente no teste DTH e preencheram com isto o pré-requisito para o experimento. Uma reação positiva depois de terminar a imunização significa que a imunização causou uma resposta imune celular específica contra Leishmania infantum. Isso é um sucesso da vacinação e justifica as expectativas para melhor proteção contra infecções.
[0086] Depois da última vacinação, o teste DTH foi repetido. Esperava-se que quase todos animais fossem positivos. Devido ao fato de que o animal testado como positivo anteriormente estava agora negativo, pode-se presumir que isto também é verdadeiro para o primeiro teste DTH que tinha sido mal interpretado.
[0087] A resposta imune causada pela vacinação foi caracterizada adicionalmente por exames sorológicos. A Figura 2 resume os resultados do teste ELISA de antígenos específicos contra Leishmania infantum dentro do soro dos cães imunizados. Genericamente, as concentrações dos anticorpos nos soros dos cães testados não foram muito altas. Este resultado está de acordo com as expectativas porque a meta da imunização era uma resposta imune celular e não uma resposta imune humoral.
[0088] Tabela 3: Composição de grupos de vacinação para um experimento contra Leishmania infantum em cães
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| Grupo Antígeno U3ado | Número de Animais | Quantidade Volume | ||
| de DNA | Aplicado | |||
| 1 | MIDGE-NLSp36 LACK | 6 | 200 ug por | 500 pl |
| construção | por | |||
| animal | ||||
| 2 | MIDGE-NLS-TSA, MIDGE- | 6 | 200 pg por | 500 pl |
| NLS-Kmp-11, MIDGE-NLS- | construção por | |||
| gp63, MIDGE-NLS-p36 LACK | animal | |||
| 3 | pMCV-TSA, pMVC-Kmp-11, | 6 | 200 pg | 500 pl |
| pMCV-gp63, pMCV-p36 | por | |||
| LACKMIDGE | animal |
tampão de PBS 6 - 500 ul por animal [0089] O sucesso da imunização pode ser descrito por uma reação de inoculação do animal ao germe. Quatro semanas depois da última imunização, conduziu-se uma inoculação da infecção aplicada por via intravenosa com 5xl07 promastigotos de Leíshmanía infantum. 0 grau de infecção, e assim sendo, a proteção recebida por imunização, é determinado por exames clínicos patológicos, que incluem exame do inchaço dos nodos linfáticos, perda de peso, degeneração com mudança correspondente da cor dos músculos, aumento excessivo do crescimento das unhas, e lesões da derme, bem como mudanças no hemograma. A presença e a quantidade do germe são determinadas por PCR. Uma comparação dos grupos depois de 11 meses da infecção por inoculação aos sintomas clínicos indica
Uma clara diferença entre o Grupo 2 e o Grupo de visível. No Grupo 2, apenas um cão sofreu de referente resultados:
Controle é os seguintes
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22/28 leishmaniose, e no Grupo de Controle, quatro dos seis cães pegaram leishmaniose. No Grupo 1, o número de cães infectados também foi menor do que no Grupo de Controle, e o Grupo 3 apresentou apenas uma ligeira diferença em relação ao Grupo de Controle. Uma comparação direta do efeito de MIDGE-NLS com plasmídeos que codificam exatamente o mesmo antígeno (Grupo 2 e Grupo 3) indica que MIDGE-NLS dá melhor proteção contra leishmaniose do que foi possível com plasmídeo. Os resultados dos experimentos permitem concluir que é possível inibir o desenvolvimento de sintomas clínicos de leishmaniose em cães pela imunização com uma combinação dos quatro antígenos que codificam MIDGE-NLS. Um resultado comparável como atingido com uma vacina de acordo com a invenção que contém MIDGE- NLS que codifica os quatro antígenos, foi, que seja do conhecimento da Requerente, descrito apenas por Ramiro et al., (Vaccine 3696: 1-11 (2003)). Em vez de MIDGE-NLS, Ramiro et al. usaram em seu estudo um Vírus da Vacínia recombinante (rW) como vacina de reforço. Os vírus da vacínia recombinantes são vírus geneticamente modificados que representam um alto risco de segurança comumente conhecido (Lehrman, Nature 401:517-518 (1999)).
Exemplos [0090] Exemplo 1: Clonagem do plasmídeo pMCVp36 [0091] Partindo do plasmídeo SCp36, dois fragmentos foram ampliados por PCR:
1. PCR cerca de 800 pares de bases;
[0092] Iniciador da esquerda: 5'[0093] T TATAT G GTAC CAT GAACATAC GAGGGT CAC C
T [0094] Iniciador da direita:5'Petição 870180009492, de 02/02/2018, pág. 30/48
23/28 [0095]
TTATATGAGCTCAGAAGACACGGACAGGGACCTCTTCCGTC
PCR cerca de 950 pares de bases;
[0096] Iniciador da esquerda: 5'TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT, [0097] Iniciador da direita: 5'TTATATGAGCTCTTACTCGGCCGTCGGAGATGG [0098] O produto da PCR, derivado da segunda reação de PCR, foi digerido com Eco31I e o fragmento menor (aproximadamente 200 pares de bases) foi isolado.
[0099] O produto da PCR da primeira reação de PCR foi digerido com Bpil.
[00100] O fragmento com 200 pares de bases e o fragmento digerido da primeira reação de PCR foram ligados e subseqüentemente digeridos com Kpnl e Saci, e inseridos por ligação no vetor pMOK que tinha sido digerido por Kpnl e Saci. O plasmídeo resultante foi denominado pMCVp36.
[00101] Exemplo 2: Clonagem do plasmídeo pMCVKmp11 [00102] O gene foi ampliado por PCR a partir do DNAc de Leishmania infantum. O produto da PCR foi clonado em pMCV1.4 e sequenciado após digestão com Kpnl e Xhol. O plasmídeo resultante foi denominado pMCVKpmll.
esquerda: da direita: 3: Clonagem
5'5'do [00103] Iniciador da
ATTATAGGTACCATGGCCACCACGTACGAG Iniciador TTAATTCTCGAGTTACTTGGATGGGTACTGCG Exemplo plasmídeo pMCVTSA [00104] O gene foi ampliado por PCR a partir do
DNAc de Leishmania infantum e uma base substituída sem mudar a sequência de aminoácidos, deletando um sítio de clivagem de
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Eco31I. O produto final da PCR foi digerido com Kpnl e Xhol e clonado no vetor pMCV1.4, e em seguida, sequenciando. O plasmídeo resultante foi denominado pMCVTSA.
[00105] Iniciador da esquerda: 5'AATTATGGTACCATGTCCTGCGGTAACGCCAAGATC Iniciador da esquerda: 5'AATATACTCGAGTTACTGCTTGCTGAAGTATCCTTCGAC [00106] [00107] [00108] [00109]
5'5'Iniciador da mutação da esquerda: TACCGCGGTCTCTTCATCATCG [00110] Iniciador da mutação da direita: TTGGGGGTCTCGATGAATAGACCGCGGTAGG [00111] Exemplo 4: Estratégia de clonagem para otimização da utilização de códons de gp63 [00112] Os oligonucleotideos com um comprimento de 18 a 28 pares de bases foram ordenados (MWG Biotech).
Dois [00113] oligonucleotideos com um comprimento de bases, representando um filamento anterior e posterior, foram anelados e ligados. Os oligonucleotideos anelados tinham em ambas extremidades uma ramificação com quatro bases. Prestou-se atenção para o fato de que as ramificações puderam ser encontradas apenas uma vez e não eram palíndromos. Os oligonucleotideos (filamento anterior e posterior) foram anelados aquecendo até 80 °C em tampão de cinase e subsequente resfriamento lento até a temperatura ambiente. Depois disso, adicionou-se ATP e polinucleotídeo cinase (PNK), e os oligonucleotideos foram fosforilados por uma hora. Na próxima etapa, os oligonucleotideos avizinhados foram misturados e ligados (oligonucleotideos 1+2, oligonucleotideos 3+4). Depois de uma hora, uma alíquota da
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25/28 ligação dos oligonucleotideos 1+2 e da dos oligonucleotideos 3+4 foram misturadas. Este procedimento foi repetido até um comprimento do produto da ligação de cerca de 300 pares de bases. Uma alíquota de cada etapa da ligação final foi usada como modelo para uma PCR com os iniciadores flanqueadores. O produto da PCR foi clonado no vetor de clonagem TOPO-TA (Invitrogen) e sequenciado. Isto [00114] foi feito na totalidade com seis fragmentos do gene inteiro. Os seis fragmentos individuais foram clivados a partir do plasmídeo intermediário com Eco31I e ligados. 0 produto da ligação com o tamanho correto foi ampliado em uma PCR final, digerido com Kpnl e Saci, extraído com gel e clonado dentro do vetor pMCV1.4, digerido com as mesmas enzimas. Depois disso, a sequência foi verificada por sequenciamento. O plasmídeo resultante foi denominado pMCVgp63.
[00115] Iniciador para os 6 fragmentos montados [00116] Fragmento 1: iniciador da esquerda: [00117] ATTATTGGTACCATGTCTGTGGACT [00118] iniciador da
TTATATGGTCTCTCTCAGGGCTCCCCAGTTG Fragmento 2:
direita: iniciador da esquerda:
[00119] ATTATAGGTCTCCTGAGAATTGCTGTGTCCACAGAG [00120] iniciador da direita:
TTATATGGTCTCACAGAGGCCACATACATCACAA [00121] Fragmento 3: iniciador da esquerda:
[00122] TATTATGGTCTCCTCTGTGCCCTCTGAGGAGGGAGTGCTGG
CC [00123] iniciador da direita:
AATTATGGTCTCCTCAATCTCCAGGTACTCCAGG
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26/28 [00124] Fragmento 4: iniciador da esquerda:
[00125] ATTATAGGTCTCATTGAGGACCAGGGAGGAG [00126] iniciador da direita:
TAATATGGTCTCGTGTCTGGTCACTCCACACTTG Fragmento 5: iniciador da esquerda:
[00127] ATTATAGGTCTCAGACACCCAGACCTGCCCC [00128] iniciador da direita:
TTATATGGTCTCGGGGTGCAGTTGGCATAGCC Fragmento 6: iniciador da esquerda:
[00129] ATATATGGTCTCCACCCCAGGCCTGAGAGTGG [00130] iniciador da direita:
TAATATGAGCTCCTACAGGGCCACAGCCAGCAGG [00131] Sequência global: iniciador da esquerda:
[00132] ATTATTGGTACCATGTCTGTGGACT [00133] iniciador da direita:
TAATATGAGCTCCTACAGGGCCACAGCCAGCAGG Exemplo 5: Acoplamento de NLS a oligonucleotideos A anexação de NLS foi feita da seguinte maneira: o peptídeo NLS que compreende a sequência PKKKRKV SEQ ID NO: 9 foi acoplado ao ODN em duas etapas. Em primeiro lugar, o oligonucleotideos modificado 5' -PH-dGGG AGT CCA GT xT TTC TGG AC (onde xT representa uma base timina amino-modificada com um residuo de ligação C2 amino ; = ODN
1) foi ativado por sulfo-KMUS (5 mM) em PBS à temperatura ambiente. A reação foi interrompida depois de 120 min pela adição de tris- (hidróxi-metil)-amino-metano 50 mM, e o ODN ativado foi obtido depois de precipitação com etanol (NaOAc 300 mM, pH 5,2, MgCl2 5,5 mM, etanol a 7 0 %), centrifugação e uma única corrida de lavagem com etanol a 70%. O ODN assim obtido foi dissolvido em PBS 0,1 mM e reagido com o peptideo
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27/28 ativado (0,2 mM) por uma hora à temperatura ambiente. A reação foi controlada por eletroforese em gel e coloração com brometo de etídio. O ODN ligado a NLS resultante foi purificado por HPLC e usado para a síntese de construções
MIDGE-NLS.
[00134] Exemplo 6: Produção de MIDGE-NLSp36 [00135] MIDGE são cassetes de expressão fechados de forma covalente, que consistem em apenas o promotor CMV, um íntron, a sequência gênica respectiva e uma sequência de poliadenilação (vide documento n- EP 0 941 318 Bl) . As construções foram obtidas da seguinte maneira: o plasmídeo pMCVp36, descrito no Exemplo 1.1, foi digerido [00136] completamente com Eco31I. A ligação com 5'-PH-GGG AGT CCA GT XT TTC TGG AC (= ODN 1) e 5'-AGG GGT CCA GTT TTC TGG ACS' (= ODN 2), fosforilados em 5', com formato de grampo para cabelo, foi realizada usando T4 DNA ligase na presença de Eco31I, e interrompida por aquecimento a 70 °C. A mistura resultante foi concentrada e tratada com Eco31I e T7 DNA polimerase na ausência de trifosfatos de desoxirribonucleotídeos. A purificação foi realizada por cromatografia de troca aniônica.
[00137] A produção de MIDGE-NLS-TSA, -Kmp-11 e gp63 foi feita de forma análoga.
[00138] Exemplo 7: Teste de DHT (Teste de Hipersensibilidade do Tipo Retardada) [00139] Durante este teste, uma quantidade minima de antígeno é aplicada ao estrato dérmico superior do animal do teste. A espessura da derme na posição da injeção foi determinada exatamente antes da aplicação. Depois disso, observa-se se a derme na posição da injeção fica inflamada.
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Uma característica de uma resposta imune ao antígeno, causada por células T sensibilizadas, é uma inflamação que é detectável depois de 48 a 72 horas. Os sintomas clínicos tais como inchaço, vermelhidão, e eventualmente, dor, dérmica local, podem ser rastreados para o efeito de citocinas. Um inchaço dérmico local é avaliado como teste DHT positivo (vide Tabela 1 marcada com + ou ++) e indica que o animal específico desenvolveu células de memória T, causadas por infecção.
[00140] Exemplo 8: Determinação de anticorpos totais após imunização [00141] Na Figura 2 estão os resultados da detecção por ELISA de anticorpos específicos contra Leishmania infantum dentro do soro de cães imunizados representados. Antes da inoculação da infecção, os soros de todos cães foram coletados. A determinação da titulação de anticorpos totais de IgG foi realizada por ELISA, onde a absorção é determinada em DO (densidade óptica) em um comprimento de onda X = 406 nm.
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Claims (29)
- REIVINDICAÇÕES1. MÉTODO PARA USAR UMA CONSTRUÇÃO DA EXPRESSÃO DE DNA, para a produção de um medicamento para imunização contra infecções de leishmaniose, caracterizado pela dita construção de DNA conter uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificadoras, que levam à expressão dos antígenos de Leíshmanía infantum, gene da proteína antioxidante especifica de tiol (TSA) SEQ ID NO: 4, glicoproteína gp63 SEQ ID NO: 6 e proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo (Kmp11) SEQ ID NO: 2.
- 2. MÉTODO PARA USAR DUAS OU TRÊS CONSTRUÇÕES DA EXPRESSÃO DE DNA, para a produção de um medicamento para imunização contra infecções de leishmaniose, caracterizado pelas construções da expressão de DNA conterem, cada uma, uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificadoras, que levam coletivamente à expressão dos antígenos de Leíshmanía infantum, gene da proteína antioxidante específica de tiol de (TSA) SEQ ID NO: 4, glicoproteína gp63 SEQ ID NO: 6 e proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo (Kmp-11) SEQ ID NO: 2.
- 3. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por pelo menos dois antígenos de Leíshmanía infantum serem expressos como proteínas de fusão.
- 4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela proteína de fusão ser o produto da expressão do gene da proteína específica de tiol (TSA) SEQ ID NO: 4 e do gene da proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo (Kmp-11) SEQ ID NO: 2.
- 5. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 3, caracterizado pela proteína de fusão ser o produto daPetição 870180009492, de 02/02/2018, pág. 37/482/6 expressão do gene da proteína antioxidante específica de tiol (TSA) SEQ ID NO: 4, do gene da glicoproteína gp63 SEQ ID NO: 6 e do gene da proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo (Kmp- 11) SEQ ID NO: 2.
- 6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por estar contida adicionalmente uma construção da expressão de DNA para a expressão do antígeno de leishmaniose p36 LACK SEQ ID NO: 8.
- 7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelas sequências de polinucleotídeos codificadoras serem construções de expressão que consistem em moléculas de ácidos desoxirribonucleicos lineares fechadas de forma covalente, tendo uma região de filamento duplo linear, onde os filamentos individuais que formam filamento duplo são ligados por alças curtas de filamento único de nucleotídeos de ácidos desoxirribonucleicos, onde os filamentos individuais que formam o filamento duplo consistem apenas em uma sequência codificadora sob controle de uma sequência promotora operável no animal que vai ser vacinado e uma sequência terminadora.
- 8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelas sequências de polinucleotídeos codificadoras estarem presentes como vetores de expressão de filamento duplo circular.
- 9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela construção da expressão de DNA estar ligada de forma covalente a um ou mais oligopeptídeos para aumentar a eficiência da transfecção.
- 10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por cada construção daPetição 870180009492, de 02/02/2018, pág. 38/483/6 expressão de DNA estar ligada a um oligopeptídeo com 3 a 30 aminoácidos, onde o oligopeptídeo consiste em metade dos aminoácidos básicos selecionados entre os grupos arginina e lisina.
- 11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelos oligopeptídeos ligados terem a sequência de aminoácidos YGRKKRRQRRR SEQ ID NO: 10.
- 12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelas construções da expressão de DNA lineares fechadas de forma covalente serem modificadas com um peptídeo que contém a sequência de localização nuclear (NLS) de antígeno de T grande de SV40 PKKKRKV SEQ ID NO: 9.
- 13. MÉTODO PARA USAR AS CONSTRUÇÕES DA EXPRESSÃO DE DNA PARA A PRODUÇÃO DE UMA VACINA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DE INFECÇÕES POR LEISHMANIOSE, caracterizado pelas ditas construções da expressão de DNA conterem uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificantes, que levam à expressão dos antígenos de Leíshmanía ínfantum, gene da proteína antioxidante especifica de tiol (TSA) SEQ ID NO: 4, glicoproteína gp63 SEQ ID NO: 6 e proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo (Kmp-11) SEQ ID NO: 2.
- 14. MÉTODO PARA USAR DUAS OU TRÊS CONSTRUÇÕES DA EXPRESSÃO DE DNA PARA A PRODUÇÃO DE UMA VACINA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DE INFECÇÕES POR LEISHMANIOSE, caracterizado pelas ditas construções da expressão de DNA conterem, respectivamente, uma ou mais sequências de ácidos nucleicos, que levam coletivamente à expressão dos antígenos de Leíshmanía ínfantum, gene da proteína antioxidante específica de tiol de (TSA) SEQ ID NO: 4, glicoproteína gp63Petição 870180009492, de 02/02/2018, pág. 39/484/6SEQ ID NO: 6 e proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo (Kmp-11) SEQ ID NO: 2.
- 15. CONSTRUÇÃO DA EXPRESSÃO DE DNA, caracterizada por conter uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificadoras que levam à expressão dos antígenos de Leishmania infantum, gene da proteína antioxidante especifica de tiol (TSA) SEQ ID NO: 4, glicoproteína gp63 SEQ ID NO: 6 e a proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo (Kmp-11) SEQ ID NO: 2.
- 16. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelos produtos gênicos serem expressos como uma proteína de fusão singular.
- 17. CONSTRUÇÃO DA EXPRESSÃO DE DNA, caracterizada por conter uma ou mais sequências de ácidos nucleicos codificadoras que levam à expressão dos antígenos de Leishmania infantum, gene da proteína antioxidante específica de tiol de (TSA) SEQ ID NO: 4 e proteína 11 da membrana de cinetoplastídeo (Kmp-11) SEQ ID NO: 2.
- 18. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelos produtos gênicos serem expressos como uma proteína de fusão singular.
- 19. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizada por ser uma molécula de ácido desoxirribonucleico linear fechada de forma covalente, que compreende uma região de duplo filamento linear, sendo que os filamentos individuais que formam a dita região de duplo filamento estão ligados por alças de filamento único curto nucleotídeos de ácidos desoxirribonucleicos, onde os filamentos individuais que formam o filamento duplo consistem apenas em uma sequência codificadora sob controle de umaPetição 870180009492, de 02/02/2018, pág. 40/485/6 sequência promotora operável no animal que vai ser vacinado, e uma sequência terminadora.
- 20. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizada pelas sequências de polinucleotídeos codificadoras estarem presentes como vetores de expressão de filamento duplo circular.
- 21. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizada por estar ligada de forma covalente a um ou mais oligopeptídeos para aumentar a eficiência da transfecção.
- 22. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por estar ligada a um oligopeptídeo com 3 a 30 aminoácidos, onde o oligopeptídeo consiste em metade dos aminoácidos básicos selecionados entre os grupos arginina e lisina.
- 23. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo oligopeptídeo ligado ter a sequência de aminoácidos YGRKKRRQRRR SEQ ID NO: 10.
- 24. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pela construção da expressão de DNA linear fechada de forma covalente ser modificada com um peptídeo que contém a sequência de localização nuclear (NLS) do antígeno de T grande de SV40 PKKKRKV SEQ ID NO: 9.
- 25. CONSTRUÇÃO, de acordo com uma das reivindicações 15 ou 16, caracterizada pela sequência de gp63 SEQ ID NO: 6 ser otimizada em códons.
- 26. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por conter a sequência SEQ ID NO: 5.
- 27. VACINA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DE INFECÇÕES POR LEISHMANIOSE, caracterizada por conter umaPetição 870180009492, de 02/02/2018, pág. 41/486/6 construção de DNA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 15 a 26.
- 28. VACINA, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada por conter adicionalmente adjuvantes e/ou sequências de ácidos nucleicos imunoestimuladores com um ou mais modelos CpG.
- 29. VACINA, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelas sequências de ácidos nucleicos imunoestimuladores serem um filamento circular de ácidos desoxirribonucleicos com uma sequência de bases antiparalela parcialmente complementar.Petição 870180009492, de 02/02/2018, pág. 42/481/1
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