ES2286905T3

ES2286905T3 - Sistema de estabilizacion de plasmidos para el suministro de antigenos.

Info

Publication number: ES2286905T3
Application number: ES99964042T
Authority: ES
Inventors: James E. Galen
Original assignee: University of Maryland Baltimore; University of Maryland College Park
Current assignee: University of Maryland Baltimore; University of Maryland College Park
Priority date: 1998-12-02
Filing date: 1999-12-02
Publication date: 2007-12-01
Anticipated expiration: 2019-12-02
Also published as: US7138112B2; NZ529507A; US20050003539A1; PL349041A1; NO20012721L; US20060030047A1; CA2352457A1; DE69935927T2; US20060030048A1; WO2000032047A1; CZ20011538A3; AU2036400A; EP1135025B1; EP1135025A4; AU776562B2; EP1135025A1; DK1135025T3; JP2003506007A; US7125720B2; US20060029616A1

Abstract

Vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica: un origen de replicación que confiere un número medio de copias que está comprendido entre 2 y 75, seleccionado de entre el grupo que consiste en: oriE1 (SEC ID nº.1), ori101 (SEC ID nº.3), ori15A (SEC ID nº.2) y sus derivados, y que está flanqueado en ambos extremos por terminadores de la transcripción; por lo menos una función de exterminio post-segregacional, seleccionada de entre el grupo que consiste en asd, ssb, phd-doc, kis-kid, y hok-sok, en la que la transcripción de flanqueo de los lugares que rodean dicha por lo menos una función post-segregacional es divergente y no perturbará significativamente los niveles de transcripción de tipo salvaje; y por lo menos una función de reparto seleccionada de entre el grupo que consiste en el lugar par de pSC101 y el parA de pR1, en la que la transcripción de flanqueo transcurre alejándose de dicha por lo menos una función de reparto; y un promotor ompC que comprende lasiguiente secuencia: AGATCX1X2TAAX3CATCCACAGGAGGATATCTGATG (SEC ID nº: 36), en la que X1 se selecciona de entre el grupo que consiste en G, C y A; X2 es un inserto que tiene de 1 a 5 nucleótidos; y X3 se selecciona de entre el grupo que consiste en A, T, G y C.

Description

Sistema de estabilización de plásmidos para el suministro de antígenos.

1. Antecedentes 1.1 Campo

La presente invención se refiere generalmente a plásmidos de expresión estabilizados mediante un Sistema de Estabilización de Plásmidos (según se define en la presente memoria) capaz de expresar una proteína o péptido, tal como un antígeno para uso en una vacuna vectorial viva, y a métodos para obtener y usar los plásmidos estabilizados. La invención optimiza la estabilización de plásmidos de expresión a dos niveles independientes: (1) eliminando la dependencia única de sistemas de estabilización letales equilibrados catalíticos; y (2) incorporando un sistema de reparto de plásmidos para evitar la segregación al azar de plásmidos de expresión, potenciando de ese modo la herencia y estabilidad.

La patente US nº 4.760.022 (Molin et al.) describe un vector de expresión que comprende elementos parA y parB, los cuales se afirma que son función de reparto que permiten una distribución ordenada de las moléculas del plásmido en la división celular.

Kim et al. (1996) J. Fermentation and Bioengineering, 82, 495-497, describe un número de plásmidos que comprende un lugar par del plásmido pSC101. Estos plásmidos se estabilizan cuando se suprime la transcripción del promotor P_{L}, pero se pierden rápidamente cuando se activa la transcripción.

1.2.1 Vacunas de vectores vivos bacterianos

Las vacunas de vectores vivos bacterianos suministran antígenos a un sistema inmunitario de un hospedante expresando los antígenos a partir de material genético contenido dentro del vector vivo bacteriano. El material genético es típicamente un replicón, tal como un plásmido. Los antígenos pueden incluir una amplia variedad de proteínas y/o péptidos de origen bacteriano, vírico, parasitario o de otro origen.

Entre los vectores vivos bacterianos actualmente en investigación se encuentran los patógenos entéricos atenuados (por ejemplo, Salmonella typhi, Shigella, Vibrio Cholerae), comensales (por ejemplo, Lactobacillus, Streptococcus gordonii) y cepas de vacunas autorizadas (por ejemplo, BCG). S. typhi es una cepa particularmente atractiva para la vacunación de seres humanos.

1.1.2Salmonella typhi atenuada como una cepa de vector vivo

S. typhi es un vector vivo bien tolerado que puede suministrar múltiples antígenos inmunógenos no relacionados al sistema inmunitario de los seres humanos. Se ha demostrado que los vectores vivos de S. typhi provocan anticuerpos y una respuesta inmunitaria celular a un antígeno expresado. Los ejemplos de antígenos suministrados con éxito mediante S. typhi incluyen el fragmento C no toxigénico pero muy inmunógeno de la toxina del tétano, y la proteína de la circumsporozoita de la malaria procedente de Plasmodium falciparum.

S. typhi se caracteriza por vías entéricas de infección, una cualidad que permite el suministro oral de la vacuna. S. typhi también infecta monocitos y macrófagos, y por lo tanto puede dirigir antígenos como dianas a APC profesionales.

La expresión de un antígeno mediante S. typhi generalmente requiere la incorporación de un plásmido recombinante que codifica el antígeno. En consecuencia, la estabilidad del plásmido es un factor clave en el desarrollo de vacunas de S. typhi atenuadas de alta calidad con la capacidad para expresar consistentemente antígenos extraños.

Los candidatos a vacunas de S. typhi atenuadas para uso en seres humanos deberían presentar por lo menos dos mutaciones bien separadas y bien definidas que provocasen independientemente la atenuación, puesto que la ocasión para la inversión in vivo de tales mutantes dobles sería insignificante. El candidato a vacuna atenuada CVD 908 de S. typhi presenta tales propiedades. CVD 908 contiene dos mutaciones de supresión no reversibles dentro de los genes aroC y aroD. Estos dos genes codifican enzimas críticas en la ruta biosintética que conduce a la síntesis de corismato, el precursor clave requerido para la síntesis de los aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano. El corismato también se requiere para la síntesis del ácido p-aminobenzoico; después de su conversión a tetrahidrofolato, el ácido p-aminobenzoico se convierte en los nucleótidos purínicos ATP y GTP.

1.2.3 Inestabilidad de los plásmidos

Las células bacterianas sin plásmidos tienden a acumularse más rápidamente que las células que tienen plásmidos. Una razón para este aumento de tasa de acumulación es que la transcripción y la traducción de genes plasmídicos impone una carga metabólica que ralentiza el crecimiento celular y da a las células sin plásmidos una ventaja competitiva. Además, algunas veces los productos génicos de plásmidos extraños son tóxicos para la célula hospedante.

\newpage

Es deseable la herencia estable de plásmidos en el campo de vacunas de vectores vivos bacterianos atenuadas, para asegurar la producción con éxito y continua de antígenos, así como en operaciones con biorreactores comerciales, a fin de evitar que el biorreactor sea ocupado por células sin plásmidos.

La herencia estable de un plásmido requiere generalmente que: (1) el plásmido se deba replicar una vez cada generación, (2) las desviaciones del número de copias se deben de corregir rápidamente antes de la división celular, y (3) con la división celular, los productos de la replicación plasmídica se deben de distribuir a ambas células hijas.

Aunque la integración cromosómica de genes extraños aumenta la estabilidad de tales secuencias, las manipulaciones genéticas implicadas pueden ser difíciles, y la caída en el número de copias del gen heterólogo a menudo da como resultado la producción de niveles insuficientes de antígeno heterólogo para asegurar una respuesta inmunitaria óptima. La introducción de genes heterólogos en plásmidos de múltiples copias mantenidos dentro de una cepa de vector vivo es una solución natural al problema del número de copias; la manipulación genética de tales plásmidos para la expresión controlada de tales genes heterólogos es sencilla. Sin embargo, los plásmidos resultantes pueden hacerse inestables in vivo, dando como resultado la pérdida de estos genes extraños.

1.2.4 Sistemas de estabilización de plásmidos

En la naturaleza, los plásmidos bacterianos a menudo se mantienen de forma estable, incluso aunque estén presentes habitualmente en números de copias muy bajos. La herencia estable de plásmidos de bajo número de copias de origen natural puede depender de la presencia de ciertos sistemas genéticos que evitan activamente la aparición de una progenie libre de plásmidos. En Jensen et al. Molecular Microbiol. 17:205-210, 1995 se pueden encontrar un repaso reciente de sistemas de estabilización de plásmidos.

1.2.5 Resistencia a antibióticos

Un medio para estabilizar plásmidos es proporcionar un gen de resistencia a antibióticos en el plásmido, y hacer crecer las células en medios enriquecidos con antibióticos. Sin embargo, este método es objeto de un número de dificultades. El enfoque de la resistencia a antibióticos es caro, requiriendo el uso de antibióticos costosos y, quizás de forma más importante, el uso de antibióticos en conjunción con la administración in vivo de vectores de vacunas está actualmente descartado por la U.S. Food and Drug Administration.

En aplicaciones de producción a gran escala, el uso de antibióticos puede imponer otras limitaciones. Con respecto a biorreactores comerciales, los mecanismos de resistencia a antibióticos pueden degradar el antibiótico y permitir que persista en el cultivo una población sustancial de células sin plásmidos. Tales células sin plásmidos no son productivas, y disminuyen el rendimiento del biorreactor.

Por lo tanto, existe en la técnica la necesidad de un sistema de estabilización de plásmidos diseñado especialmente para uso en vacunas de vectores vivos bacterianos que no descanse sobre la resistencia a antibióticos, y preferentemente que también sea útil en aplicaciones con biorreactores comerciales.

1.2.6 Funciones de estabilización de plásmidos segregacionales

Los plásmidos estables de bajo número de copias emplean una función de reparto que distribuye activamente las copias de plásmidos entre las células hijas. Las funciones de reparto ejemplares incluyen, sin limitación, sistemas de pSC101, el factor F, el profago P1, y los plásmidos de resistencia a fármacos IncFII. Tales funciones se denominan en la presente memoria como funciones "SEG".

1.2.7 Funciones de exterminio post-segregacional (PSK)

Las funciones de estabilización de plásmidos de PSK de origen natural emplean típicamente un sistema de dos componentes de toxina-antitoxina, y generalmente funcionan según lo siguiente: el plásmido codifica tanto una toxina como una antitoxina. Las antitoxinas son menos estables que las toxinas, que tienden a ser bastante estables. En una célula hija sin plásmidos, ya no se producen las toxinas y las antitoxinas; sin embargo, las antitoxinas menos estables se degradan rápidamente, liberando de ese modo a la toxina para que mate a la célula.

Las toxinas generalmente son proteínas pequeñas, y las antitoxinas son proteínas pequeñas (sistemas proteicos tales como phd-doc) o ARN antisentido, que se unen a ARNm que codifican la toxina, evitando su síntesis (sistemas antisentido tales como hok-sok).

Los sistemas letales equilibrados, discutidos más abajo en la Sección 1.2.7.3, son un ejemplo de una función de PSK artificial.

1.2.7.1 Sistema de estabilización proteico: el sistema phd-doc

En funciones de PSK proteicas, tanto la toxina como la antitoxina son sintetizadas a partir de operones en las que el gen que codifica la antitoxina está en dirección 5' del gen que codifica la toxina. Estos operones autorregulan los niveles de transcripción, y la síntesis de las proteínas codificadas está acoplada traduccionalmente. La antitoxina generalmente se sintetiza en exceso para asegurar que se bloquea la acción de la toxina. Las antitoxinas inestables se degradan constantemente por proteasas codificadas por el hospedante, requiriendo la síntesis constante de antitoxina para proteger la célula. Con la pérdida del plásmido, ya no se producen antitoxinas, y las antitoxinas existentes se degradan rápidamente, permitiendo que la toxina mate a la célula del hospedante.

El sistema phd-doc es un ejemplo de una función de PSK proteica. El sistema phd-doc se produce naturalmente dentro del bacteriófago P1 que existe en células infectadas y que raramente provoca la lisis, el cual lisogeniza Escherichia coli, como un plásmido de \sim100 kb. Este lugar de estabilización codifica dos proteínas pequeñas: la proteína Doc tóxica de 126 aminoácidos provoca la muerte con la maduración del plásmido, mediante un mecanismo desconocido, y la antitoxina Phd de 73 aminoácidos evita la muerte del hospedante, presumiblemente uniéndose y bloqueando la acción de Doc.

Phd y Doc están codificadas por un único transcrito en el que el codón de partida ATG del gen doc en dirección 3' solapa mediante una base al codón de parada TGA del gen phd en dirección 5'. Por lo tanto, la expresión de estas dos proteínas está acoplada de forma traduccional, excediendo la síntesis de Phd la síntesis de la proteína Doc tóxica.

Además, la transcripción de este operón está autorregulada a nivel de la transcripción mediante la unión de un complejo proteínico Phd-Doc a un sitio que bloquea el acceso de ARN polimerasa al promotor del operón a medida que las concentraciones de ambas proteínas alcanzan un nivel crítico. Aunque Doc parece que es relativamente resistente al ataque proteolítico, Phd es muy susceptible a la escisión. El mecanismo de PSK de un lugar phd-doc codificado por plásmidos es activado por lo tanto cuando las bacterias pierden espontáneamente este plásmido residente, conduciendo a la degradación de la antitoxina Phd y a la activación subsiguiente de la toxina Doc que provoca la muerte
celular.

1.2.7.2 Sistema de estabilización antisentido: el sistema hok-sok

En sistemas de estabilización antisentido, las antitoxinas son ARN antisentido que inhiben la traducción de ARNm que codifican la toxina. Al igual que los péptidos de la antitoxina, los ARN antisentido son menos estables que el ARNm que codifica la toxina. La pérdida del plásmido permite que se degraden las antitoxinas existentes, permitiendo de ese modo la síntesis de la toxina que mata a la célula del hospedante.

Un ejemplo de un sistema de estabilización antisentido es el sistema hok-sok, codificado por el lugar parB del plásmido R1. El sistema comprende tres genes: hok, sok y mok.

Hok es una proteína asociada a membrana que daña irreversiblemente la membrana celular, matando a las células del hospedante. La expresión de Hok a partir de ARNm de hok conduce a una pérdida del potencial de la membrana celular, a la detención de la respiración, a cambios en la morfología celular, y a la muerte celular.

El gen sok codifica un ARN que actúa en trans, el cual bloquea la traducción de ARNm de hok, evitando de este modo que Hok mate las células del hospedante. El ARN de sok es menos estable que el ARNm de hok, y es expresado a partir de un promotor relativamente débil. (Gerdes et al. Annu. Rev. Genet., 31:1-31, 1997). El mecanismo mediante el cual el ARN de sok bloquea la traducción de Hok en células que contienen plásmidos se puso de manifiesto sólo después de la identificación de mok (modulación de la muerte), un tercer gen en el lugar de parB. El marco de lectura abierta de mok solapa con hok, y es necesario para la expresión y regulación de la traducción de hok.

El ARN antisentido de hok forma un dúplex con el extremo 5' del mensaje mok-hok, haciendo inaccesible a ribosomas el sitio de unión a ribosomas de mok, y promoviendo la escisión mediante ARNasa III y la degradación del ARNm. En ausencia de la traducción de mok, hok no se expresa a partir del mensaje intacto, incluso aunque su propio sitio de unión a ribosoma no esté directamente oscurecido por ARN de sok.

Cuando se forma una célula libre de plásmidos, el ARN inestable de sok decae mucho más rápidamente que el mensaje mok-hok estable. Cuando se pierde la protección dada por sok, Mok y Hok son traducidos, y la célula muere.

Una limitación del sistema hok-sok es que puede surgir un número significativo de células sin plásmidos cuando el sistema hok-sok es inactivado por mutaciones dentro del marco de lectura abierta de Hok.

1.2.7.3 Sistemas letales equilibrados

En un sistema letal equilibrado (una función de PSK), se suprime del cromosoma bacteriano un gen cromosómico que codifica una proteína estructural esencial o una enzima, o se muta de forma que el gen ya no puede operar. El gen dañado o eliminado se sustituye entonces por un plásmido que comprende un gen completamente operativo. La pérdida del plásmido da como resultado una insuficiencia de la proteína esencial, y la muerte de la célula sin plásmidos.

Se ha empleado con éxito un sistema letal equilibrado en S. typhimurium basado en la expresión del gen asd que codifica aspartato \beta-semialdehído deshidrogenasa (Asd). Asd es una enzima crítica implicada en la síntesis de L-aspártico-\beta-semialdehído, que es un precursor esencial para la síntesis de los aminoácidos L-treonina (y L-isoleucina), L-metionina, y L-lisina, así como ácido diaminopimélico, un componente estructural clave esencial para la formación de la pared celular en bacterias Gram-negativas. La pérdida de plásmidos que codifican Asd sería letal para cualquier bacteria capaz de sintetizar Asd a partir del ribosoma, y daría como resultado la lisis de la bacteria debido a una incapacidad para ensamblar correctamente la capa de peptidoglicano de esta pared celular.

El sistema asd (una función de PSK) se ha empleado con éxito en cepas de vectores vivos a base de S. typhimurium atenuadas, para la inmunización de ratones con una variedad de antígenos procariotas y eucariotas, incluyendo antígenos diversos tales como el fragmento C de la toxina del tétano dextoxificada y la enterotoxina LT, péptidos víricos de la hepatitis B sintéticos, y antígenos específicos de gametos tales como el antígeno SP10 del esperma humano.

La inmunización de la mucosa murina con estas cepas de vectores vivos ha provocado respuestas inmunitarias significativas que implican respuestas de IgG sérica e IgA secretora en las superficies de la mucosa.

El sistema asd se ha introducido recientemente en cepas de vacunas atenuadas de Salmonella typhi, en un intento por incrementar la estabilidad de plásmidos que expresan péptidos víricos de hepatitis B sintéticos. Sin embargo, cuando se inmunizaron voluntarios con estas cepas de vectores vivos, no se detectó ninguna respuesta inmunitaria al antígeno extraño.

En realidad, hasta la fecha, muy pocos informes han documentado una respuesta inmunitaria a la expresión, a base de plásmidos, de un antígeno extraño a partir de plásmidos estabilizados tras la vacunación de seres humanos con un vector vivo atenuado de S. typhi. En un informe, la cepa Ty21a de la vacuna se hizo auxotrófica para tiamina seleccionando, en presencia de trimetoprima, una mutación indefinida en el gen thyA, que codifica timidilato sintetasa.

Aunque en algunos casos el fracaso de las cepas de vectores vivos puede haber resultado de la sobreatenuación de la propia cepa, parece probable que los sistemas actuales de exterminio para plásmidos sufren limitaciones adicionales. En aquellas situaciones en las que se ha inactivado la copia cromosómica del gen, más que eliminado, es posible la restauración de la copia cromosómica vía recombinación homóloga con la copia génica portada por el plásmido, si la cepa bacteriana utilizada es hábil en la recombinación.

Los sistemas letales equilibrados, basados en la producción de enzimas catalíticas, son el objeto de un número de deficiencias importantes. En particular, puesto que la complementación de la supresión del gen cromosómico requiere sólo una única copia génica, es inherentemente difícil mantener más de unas pocas copias de un plásmido de expresión. La cepa hospedante sin plásmidos se debe de hacer crecer en medios especiales para complementar químicamente la deficiencia metabólica existente.

Además, las células sin plásmidos también se pueden beneficiar de efectos de "alimentación cruzada" cuando un factor de crecimiento difusible es el limitante del crecimiento.

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de un Sistema de Estabilización de Plásmidos que no solamente dependa de un sistema letal equilibrado, particularmente para uso en vacunas de vectores vivos bacterianos.

2. Sumario

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica:

: un origen de replicación que confiere un número medio de copias que se encuentra entre 2 y 75, seleccionado de entre el grupo que consiste en: oriE1 (SEC ID nº.1), ori101 (SEC ID nº.3), ori15A (SEC ID nº.2) y sus derivados, y que está flanqueado en ambos extremos mediante terminadores de la transcripción;

: por lo menos una función de exterminio post-segregacional seleccionada de entre el grupo que consiste en asd, ssb, phd-doc, kis-kid, y hok-sok, en la que la transcripción de flanqueo a partir de los lugares que rodean dicha por lo menos una función post-segregacional es divergente y no perturbará significativamente los niveles de transcripción de tipo salvaje; y

: por lo menos una función de reparto seleccionada de entre el grupo que consiste en el lugar par de pSC101 y el parA de pR1, en la que la transcripción de flanqueo avanza lejos de dicha por lo menos una función de reparto; y

: un promotor ompC que comprende la siguiente secuencia: AGATCX^{1}X^{2}TAAX^{3}CATCCACAGGAGGATA TCTGATG (SEC ID nº: 36), en la que X^{1} se selecciona de entre el grupo que consiste en G, C y A; X^{2} es un inserto que tiene de 1 a 5 nucleótidos; y X^{3} se selecciona de entre el grupo que consiste en A, T, G y C.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporcionan un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica: un vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica:

: un origen de casete de replicación que comprende: una secuencia nucleotídica que codifica un origen de replicación que confiere un número medio de copias que está entre 2 y 75, seleccionado de entre el grupo que consiste en: oriE1 (SEC ID nº.1), ori101 (SEC ID nº.3), ori15A (SEC ID nº.2) y sus derivados; un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica el origen de la replicación; y un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica el origen de la replicación;

: por lo menos un casete de exterminio post-segregacional que comprende: una secuencia nucleotídica que codifica por lo menos una función de exterminio post-segregacional seleccionada de entre el grupo que consiste en asd, ssb, phd-doc, kis-kid, y hok-sok; un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de exterminio post-segregacional, y un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica por lo menos una función de exterminio post-segregacional;

: por lo menos un casete de reparto que comprende: (i) una secuencia nucleotídica que codifica por lo menos una función de reparto seleccionada de entre el grupo que consiste en el lugar par de pSC101 y el parA de pR1; un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de reparto, y un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de reparto; y

: un casete de expresión que comprende (i) una secuencia nucleotídica que codifica un promotor ompC que comprende la siguiente secuencia: AGATCX^{1}X^{2}TAAX^{3}CATCCACAGGAGGATATCTGATG (SEC ID nº: 36), en la que X^{1} se selecciona de entre el grupo que consiste en G, C y A; X^{2} es un inserto que tiene de 1 a 5 nucleótidos; y X^{3} se selecciona de entre el grupo que consiste en A, T, G y C, (ii) un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica el promotor, y (iii) un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica el promotor.

Según un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona una célula que comprende un vector de expresión según los aspectos primero o segundo de la invención.

Como un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona una vacuna de vector bacteriano atenuada viva, para uso en un método para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto, en el que la vacuna de vector bacteriano atenuada viva comprende una célula según el tercer aspecto de la invención.

Según un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para obtener una vacuna de vector bacteriano atenuada viva, que comprende transformar una cepa bacteriana con un vector de expresión según el aspecto primero o segundo de la invención.

En un aspecto particular, el plásmido de expresión estabilizado se emplea en una vacuna de vector vivo de Salmonella typhi, tal como la cepa CVD 908-htrA.

La estabilización de plásmidos de expresión se optimiza a dos niveles independientes: (1) eliminando la dependencia única de sistemas de estabilización letales equilibrados; y (2) incorporando un sistema de reparto de plásmidos para evitar la segregación al azar de plásmidos de expresión, potenciando de ese modo su herencia y estabilidad. El plásmido de expresión estabilizado se puede manipular recombinantemente mediante ingeniería genética para expresar uno o más antígenos, preferentemente uno o más antígenos de la toxina 2 de Shiga (Stx2) o sus homólogos sustanciales, tales como los pentámeros de la subunidad de la toxina de Shiga o una Stx 2 destoxificada genéticamente.

El plásmido de expresión estabilizado comprende preferentemente una o más funciones de estabilización de plásmidos no catalíticas.

Se describen plásmidos de expresión que comprenden un Sistema de Estabilización de Plásmidos, que comprende por lo menos una función de PSK y por lo menos una función de SEG. Por ejemplo, el Sistema de Estabilización de Plásmidos puede comprender un Sistema de Estabilización de Plásmidos de dos componentes que comprende una función de PSK y una función de SEG. Como alternativa, el Sistema de Estabilización de Plásmidos puede comprender un Sistema de Estabilización de Plásmidos de tres componentes, que comprende una función de PSK, una función de SEG y otra PSK. En una alternativa preferida, el Sistema de Estabilización de Plásmidos comprende hok-sok + par + parA + phd-doc; en el que cualquiera de las funciones expuestas

\hbox{se puede sustituir por  un
homólogo sustancial de la misma.}

Los Sistemas de Estabilización de Plásmidos se pueden incorporar en plásmidos de expresión de múltiples copias que codifican una o más proteínas o péptidos de interés. Tales plásmidos de expresión de múltiples copias producen un efecto de dosificación génica que potencia el nivel de expresión de la proteína o del péptido de interés. Cuando el Sistema de Estabilización de Plásmidos se emplea en una vacuna de vector viva bacteriana, la proteína o péptido de interés es uno o más antígenos extraños.

En un aspecto, el plásmido de expresión es un plásmido de expresión de vacuna que comprende un Sistema de Estabilización de Plásmidos y por lo menos un antígeno, por ejemplo por lo menos un antígeno de la toxina 2 de Shiga (Stx2) y/o un homólogo sustancial del mismo. Cuando el antígeno es un antígeno de la toxina 2 de Shiga, el antígeno de la toxina 2 de Shiga puede ser, por ejemplo, un pentámero de la subunidad B o una Stx 2 destoxificada genéticamente.

Se describen además plásmidos de expresión que comprenden un Sistema de Estabilización de Plásmidos que incorpora el sistema letal equilibrado ssb, y el lugar ssb del vector vivo bacteriano se ha inactivado usando un vector suicida que comprende un origen de replicación sensible a la temperatura. En un aspecto, el vector vivo bacteriano es S. typhi, y el vector suicida se usa para inactivar el lugar ssb de S. typhi. En un aspecto, el vector suicida es un derivado de pSC101 que porta sacB, descrito en la presente memoria.

Se describe un Sistema de Estabilización de Plásmidos que incorpora una función de PSK que implica un sistema de adicción de plásmidos silenciosos, basado en mecanismos de control de ARN antisentido que sólo sintetizan proteínas letales después de que se ha producido la pérdida del plásmido.

El plásmido de expresión puede comprender una serie de plásmidos de expresión, comprendiendo cada uno casetes genéticos autocontenidos que codifican la expresión regulada de un antígeno heterólogo, un origen de replicación, y un marcador seleccionable para recuperar el plásmido.

El plásmido de expresión comprende un Sistema de Estabilización de Plásmidos que incorpora una función de PSK basada en el gen ssb. Se pueden incorporar en los plásmidos de expresión alelos mutados, tales como ssb-1, descritos en la presente memoria, para potenciar plásmidos de mayores números de copias mediante la sobreexpresión de proteínas similares a SSB1 para formar los tetrámeros biológicamente activos requeridos de SSB.

El plásmido de expresión comprende un promotor. El promotor es un promotor ompC modificado que tiene la secuencia SEC ID nº. 36. El promotor inducible puede ser el promotor P_{ompC1}, o P_{ompC3} mutado, descrito en la presente memoria.

El plásmido de expresión puede comprender un lugar de herencia (o de reparto) de plásmidos; un origen de replicación seleccionado para proporcionar un número de copias que estabilice eficazmente un antígeno dado; una función de PSK; y una secuencia nucleotídica que codifica un antígeno y un promotor que controla en último lugar la traducción del antígeno y tiene una resistencia que se selecciona para mejorar la producción de antígenos sin matar la célula.

También se describe un método para usar el plásmido de expresión, que comprende transformar una célula bacteriana usando dicho plásmido de expresión, y cultivar la célula bacteriana para producir la proteína o péptido (por ejemplo, el antígeno), y/o administrar dicha célula transformada o cultivo celular a un sujeto. Cuando las células bacterianas transformadas se administran a un sujeto, éstas se administran en una cantidad necesaria para provocar una respuesta inmunitaria que confiera inmunidad al sujeto frente a la proteína o péptido. El sujeto es preferentemente un ser humano, pero también puede ser otro animal, tal como un perro, un caballo, o un pollo.

El plásmido de expresión puede comprender por lo menos tres casetes de expresión que funcionan independientemente, en el que un casete codifica una proteína o péptido de interés, y los casetes restantes codifican cada uno una Función de Estabilización de Plásmidos diferente.

El plásmido de expresión puede codificar (1) un antígeno de ensayo ligado operablemente a un promotor, y (2) un Sistema de Estabilización de Plásmidos.

Se describe además un casete de expresión de un antígeno de ensayo regulado, que opera de forma que, a medida que aumenta la inducción de la expresión del antígeno, se produce una carga metabólica sobre la bacteria que conduce fenotípicamente a la inestabilidad del plásmido, es decir, se crea una ventaja selectiva para todas las bacterias que pierden espontáneamente el plásmido ofensivo. El antígeno de ensayo puede ser la proteína fluorescente verde (GFPuv). El casete de expresión que codifica el antígeno de ensayo puede comprender también un promotor inducible, tal como el promotor ompC, situado de forma que el promotor inducible conduzca en último lugar la traducción del antígeno de ensayo.

Se describe un método para obtener un plásmido de expresión, que comprende sintetizar un plásmido de expresión que comprende por lo menos 3 casetes de expresión que funcionan independientemente, en el que un casete codifica una proteína o péptido de interés, y los casetes restantes codifican cada uno una Función de Estabilización de Plásmidos diferente.

Un método para identificar Sistemas de Estabilización de Plásmidos puede comprender: proporcionar un casete de expresión que codifique una proteína o péptido de interés, y por lo menos otros dos casetes de expresión, que codifican cada uno y que son capaces de expresar en el vector vivo bacteriano del hospedante una Función de Estabilización de Plásmidos diferente; insertar los tres casetes de expresión en un único plásmido de expresión; transformar un vector vivo bacteriano con el único plásmido de expresión; cultivar el vector vivo bacteriano transformado, y determinar la velocidad de introducción de células sin plásmidos en el cultivo.

Se describe una vacuna de vector vivo bacteriano atenuada, que comprende un vector vivo bacteriano atenuado que se ha transformado con un plásmido de expresión estabilizado que comprende un Sistema de Estabilización de Plásmidos, preferentemente un sistema de estabilización de plásmidos no catalítico.

También se describe una vacuna de vector vivo bacteriano atenuada, que comprende un vector vivo bacteriano atenuado que se ha transformado con un plásmido de expresión que comprende un Sistema de Estabilización de Plásmidos que incorpora por lo menos un sistema de PSK y por lo menos un sistema de SEG. El vector vivo bacteriano atenuado puede ser, por ejemplo, CVD 908-htrA de S. typhi.

Se describe además un método para vacunar un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de una vacuna de vector vivo bacteriano suficiente para provocar una respuesta inmunitaria potenciada. También se describe un método para evitar una enfermedad vacunando a un sujeto usando una cantidad de tal vector vivo bacteriano suficiente para provocar una respuesta inmunitaria protectora frente a uno o más patógenos de tal enfermedad. El sujeto es preferentemente un ser humano, pero también puede ser otro animal, tal como un caballo, una vaca o un cerdo. Por ejemplo, se describe un método para evitar el síndrome urémico hemolítico (HUS) provocado por Escherichia coli enterohemorrágica productora de la toxina 2 de Shiga, administrando a un sujeto una cantidad de un vector vivo bacteriano transformado con un plásmido estabilizado que codifica por lo menos un antígeno de la toxina 2 de Shiga.

Los Sistemas de Estabilización de Plásmidos se pueden detectar en busca de la eficacia, comprendiendo el método: proporcionar plásmidos de expresión que comprenden los Sistemas de Estabilización de Plásmidos descritos en la presente memoria y que codifican una proteína o péptido de interés, teniendo dichos plásmidos de expresión números de copias que varían desde un número pequeño de copias (por ejemplo, \sim5 copias por célula) a un número medio de copias (por ejemplo, \sim15 copias por célula) hasta un número elevado de copias (por ejemplo, \sim60 copias por célula); transformar vectores vivos bacterianos con tales plásmidos de expresión; y ensayar la velocidad de introducción de células sin plásmidos y/o la velocidad de crecimiento de células que contienen plásmidos. Los orígenes de replicación modificados pueden ser orígenes de replicación procedentes de los plásmidos pSC101 (número bajo de copias), pACYC184 (número medio de copias), y pAT153 (número elevado de copias). Se pueden utilizar casetes de replicación de plásmidos que funcionan independientemente, los cuales permiten ensayar la eficacia de uno o más sistemas de estabilización de plásmidos a medida que aumenta el número de copias.

Se describen plásmidos de expresión estabilizados para uso en vectores vivos de S. typhi atenuados, que contienen un marcador seleccionable que se puede sustituir fácilmente por un lugar no resistente a fármacos o por un gen que codifica un marcador de resistencia a fármacos aceptable, tal como aph que codifica la resistencia a los aminoglicósidos canamicina y neomicina.

Los Sistemas de Estabilización de Plásmidos descritos en la presente memoria proporcionan estabilidad mejorada a los plásmidos recombinantes, superando los problemas de la técnica anterior de la inestabilidad de plásmidos, por ejemplo en usos en biorreactores y en la vacunación de vectores vivos. Los plásmidos se adecuan específicamente para aplicaciones de vacuna, aunque tales plásmidos también son útiles en la producción a gran escala de proteínas.

Los plásmidos son una mejora importante con respecto a la técnica anterior, por cuanto superan los problemas asociados con la ocupación sin plásmidos y con la inestabilidad de plásmidos, y tienen una utilidad de amplio intervalo en campos tales como la producción comercial de proteínas y la producción de vacunas de vectores vivos bacterianos atenuadas.

Desde hace tiempo existe la necesidad de una solución a los problemas de la ocupación sin plásmidos y de la estabilidad de plásmidos asociados con el campo del suministro de vacunas y de la producción de proteínas. La presente invención resuelve esta necesidad largamente sentida.

3. Definiciones

La expresión "Sistema de Estabilización de Plásmidos" ("PMS"), como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia nucleotídica que comprende por lo menos una función de exterminio post-segregacional ("PSK") y por lo menos un sistema de reparto o de segregación ("SEG"), y que incluye opcionalmente cualquier otra Función de Estabilización de Plásmidos.

La expresión "Función de Estabilización de Plásmidos" se usa en la presente memoria para referirse a cualquier función que potencie la estabilidad de los plásmidos asociada con un PMS. La expresión incluye tanto secuencias nucleotídicas de origen natural, que codifican funciones de estabilización de plásmidos, así como secuencias nucleotídicas que son sustancialmente homólogas a tales funciones de estabilización de plásmidos de origen natural, y que retienen la función mostrada mediante la función de estabilización de plásmidos de origen natural correspondiente.

La expresión "Sistema de Exterminio Post-Segregacional" (PSK) se usa en la presente memoria para referirse a cualquier función que da como resultado la muerte de cualquier célula bacteriana recientemente dividida que no hereda el plásmido de interés, e incluye específicamente sistemas letales equilibrados tales como asd o ssb, sistemas proteicos tales como phd-doc, y sistemas antisentido tales como hok-sok. La expresión incluye secuencias nucleotídicas tanto de origen natural que codifican tales PSK, así como también secuencias nucleotídicas que son sustancialmente homólogas a tales secuencias nucleotídicas de origen natural y que retienen la función exhibida por las secuencias nucleotídicas de origen natural correspondientes.

La expresión "sustancialmente homóloga" o "sustancialmente homólogo", en referencia a una secuencia nucleotídica o secuencia de aminoácidos, indica que la secuencia de aminoácidos tiene suficiente homología comparada con una secuencia de referencia (por ejemplo, una secuencia nativa), para permitir que la secuencia realice la misma función básica que la secuencia de referencia correspondiente; una secuencia sustancialmente homóloga es típicamente por lo menos aproximadamente 70 por ciento secuencialmente idéntica según se compara con la secuencia de referencia, típicamente por lo menos aproximadamente 85 por ciento secuencialmente idéntica, preferentemente por lo menos aproximadamente 95 por ciento secuencialmente idéntica, y más preferentemente aproximadamente 96, 97, 98 o 99 por ciento secuencialmente idéntica, según se compara con la secuencia de referencia. Se apreciará que a lo largo de esta memoria descriptiva, cuando se hace referencia a secuencias nucleotídicas específicas y/o a secuencias de aminoácidos, que tales secuencias nucleotídicas y/o secuencias de aminoácidos se pueden sustituir por secuencias sustancialmente homólogas.

Las expresiones "Sistema de Segregación" y/o "Sistema de Reparto" (ambas denominadas en la presente memoria como "SEG") se usan de forma intercambiable en la presente memoria para referirse a cualquier función que potencie la estabilidad del plásmido y que opere para aumentar la frecuencia del suministro exitoso de un plásmido a cada una de las células bacterianas recientemente divididas, en comparación con la frecuencia de suministro de un plásmido correspondiente sin tal sistema de SEG. Los sistemas de SEG incluyen, por ejemplo, sistemas de equirreparto, sistemas de reparto de sitios pares, y el lugar par de pSC101. La expresión incluye tanto secuencias nucleotídicas de origen natural que codifican tales sistemas de SEG, así como secuencias nucleotídicas que son sustancialmente homólogas a tales secuencias nucleotídicas de origen natural y que retienen la función exhibida por las secuencias nucleotídicas de origen natural correspondientes.

El término "destoxificada" se usa en la presente memoria para describir una toxina que tiene una o más mutaciones de punto que reducen significativamente la toxicidad de la toxina en comparación con la toxina correspondiente sin tales mutaciones de punto.

La expresión "inmunizantemente eficaz" se usa en la presente memoria para referirse a una respuesta inmunitaria que confiere memoria celular inmunológica al sujeto, con el efecto de que una respuesta secundaria (a la misma o a una toxina similar) se caracteriza por una o más de las siguientes características: una fase más corta de desfase, en comparación con la fase de desfase que resulta de la exposición correspondiente en ausencia de inmunización; una producción de anticuerpo que continúa durante un período más prolongado que la producción de anticuerpo para una exposición correspondiente en ausencia de tal inmunización; un cambio en el tipo y calidad de anticuerpo producido, en comparación con el tipo y calidad de anticuerpo producido a partir de tal exposición en ausencia de inmunización; un desplazamiento en la respuesta de clase, apareciendo anticuerpos IgG en concentraciones más elevadas, y con una persistencia mayor que IgM; un aumento de la afinidad media (constante de unión) de los anticuerpos por el antígeno, en comparación con la afinidad media de anticuerpos por el antígeno a partir de tal exposición en ausencia de inmunización; y/u otras características conocidas en la técnica por caracterizar una respuesta inmunitaria secundaria.

4. Breve descripción de los dibujos

Figuras 1A-1C: mapas genéticos de plásmidos de expresión pGEN ejemplares (pGEN2, pGEN3 y pGEN4) de la presente invención.

Figuras 2A-2D: mapas genéticos de plásmidos de expresión ejemplares a base de oriE1 (pJN72, pJN51, pJN10, y pJN12) de la presente invención.

Figuras 3A-H: histogramas de citometría de flujo de fluorescencia de GFP para vectores de expresión que portan CVD 908-htrA, con el sistema de exterminio post-segregacional hok-sok.

Figuras 4A-4D: secuencia nucleotídica de pGEN2 completa (SEC ID nº. 1), que comprende los nucleótidos 1-4196.

Figuras 5A-B: secuencia nucleotídica de pGEN3 parcial (SEC ID nº. 2), que comprende los nucleótidos 1201-2397, y que muestra la secuencia de ori15A.

Figuras 6A-C: secuencia nucleotídica de pGEN4 parcial (SEC ID nº. 3), que comprende los nucleótidos 1201-3848, y que muestra la secuencia de ori101.

Figuras 7A-7E: mapas genéticos de plásmidos de expresión de pGEN ejemplares a base de ori15A (pGEN91, pGEN111, pGEN121, pGEN193, y pGEN222) de la presente invención.

Figuras 8A-C: histogramas de citometría de flujo de la fluorescencia de GFP para plásmidos de expresión pGEN91, pGEN111, pGEN121, pGEN193, y pGEN222.

5. Descripción detallada

Las vacunas de vectores vivos bacterianos emplean un vector vivo bacteriano para expresar genes que codifican antígenos protectores de patógenos bacterianos, víricos o parasitarios. Los antígenos protectores bacterianos son preferentemente no nativos al vector vivo bacteriano, es decir, heterólogos. La vacuna del vector vivo bacteriano se administra a un hospedante, exponiendo de ese modo los antígenos expresados al sistema inmunitario del hospedante, provocando una respuesta inmunitaria de carácter apropiado para conferir inmunidad al hospedante.

A fin de lograr una inmunogenicidad potenciada, los plásmidos que expresan tales antígenos protectores se deben estabilizar. Según lo que se conoce, ningún Sistema de Estabilización de Plásmidos a base de S. typhi actualmente disponible aprovecha los mecanismos de reparto de origen natural conocidos para mejorar la estabilidad de plásmidos de múltiples copias en otras cepas.

Se describe un Sistema de Estabilización de Plásmidos no catalítico para la estabilización de plásmidos de expresión que codifican antígenos extraños en una cepa de vacuna de vector vivo de S. typhi. La cepa de S. typhi puede ser CVD 908-htrA. Se describen mejoras y/u optimizaciones de la estabilización de plásmidos de expresión usando Sistemas de Estabilización de Plásmidos que operan a dos niveles independientes: (1) eliminar la dependencia única de sistemas de estabilización letales equilibrados catalíticos; y (2) incorporar un sistema de reparto de plásmidos que evitará la segregación al azar de los plásmidos de expresión, potenciando de ese modo su herencia y estabilidad. Una razón crítica para perseguir este enfoque particular es que este método de mejora de la estabilización de plásmidos no implica manipulaciones adicionales de la cepa del vector vivo, y por lo tanto puede mejorar la inmunogenicidad de antígenos heterólogos expresados dentro de cualquier cepa de vector vivo.

El Sistema de Estabilización de Plásmidos no catalítico descrito en la presente memoria mejora la estabilidad de plásmidos de expresión de múltiples copias dentro de una vacuna de vector vivo bacteriano, tal como CVD
908-htrA.

La función de PSK de origen natural hok-sok procedente del factor pR1 de resistencia a antibióticos, o su homólogo sustancial, se puede incorporar dentro de plásmidos de expresión de múltiples copias. El sistema hok-sok es un sistema de adicción de plásmidos silencioso, basado en mecanismos de control de ARN antisentido que sólo dan como resultado la síntesis de proteínas letales después de que se ha producido la pérdida de plásmidos.

Se describe además un sistema de estabilización de plásmidos que comprende una función de PSK a base de complementación, en el que el gen cromosómico ssb, que codifica la proteína de unión monocatenaria no catalítica esencial (SSB) requerida para la replicación del ADN, está específicamente suprimido e insertado dentro de un plásmido de expresión de múltiples copias.

También se describe un Sistema de Estabilización de Plásmidos mejorado, que comprende un plásmido de expresión que codifica por lo menos un lugar de SEG y por lo menos una función de PSK.

5.1 Vector suicida

Los antígenos heterólogos se pueden expresar dentro de cepas de vectores vivos, tales como CVD 908-htrA, a partir de genes que residen en plásmidos o integrados dentro del cromosoma. Una técnica para integrar estos genes en el cromosoma del hospedante implica el uso de "vectores suicidas" sensibles a la temperatura, tales como pIB307, que contiene un origen de replicación sensible a la temperatura procedente de pSC101 (ori101^{ts}). Se describe un vector suicida mejorado para uso en CVD 908 y CVD 908-htrA, derivado de pIB307, que permite una construcción más fácil de casetes de mutagénesis para alterar el cromosoma del vector vivo.

La integración de estos vectores suicidas en el cromosoma mediante recombinación homóloga resulta de la inactivación por temperatura de la proteína de replicación del plásmido, RepA, una proteína esencial para la función de ori101. La resolución espontánea de los intermedios merodiploides inestables resultantes se detecta mediante contraselección en busca de la pérdida del gen sacB contenido en el vector suicida de la resolución. El gen sacB contenido en todos los plásmidos cortados codifica la enzima levanosacarasa, que es letal cuando se expresa dentro del citoplasma de bacterias entéricas, incluyendo S. typhi, que crecen en presencia de sacarosa. Puesto que se seleccionan merodiploides de resolución incubando en presencia de sacarosa al 10%, los plásmidos cortados exterminarán bacterias del hospedante excepto que se curen espontáneamente.

Este sistema se usó con éxito para integrar un casete de resistencia a canamicina en el lugar de \squarearoC1019 de CVD 908. Sin embargo, estos experimentos tuvieron éxito debido a que el gen que se movilizaba en el cromosoma de S. typhi codificó un marcador de resistencia a fármacos seleccionable. Usando estos vectores primitivos, la sustitución del casete de resistencia a canamicina con un marcador no seleccionable no tuvo éxito debido a que, aunque el marcador entrante se pudo integrar en el cromosoma como un merodiploide, la resolución del merodiploide para sustituir al gen de resistencia a fármacos nunca se detectó.

Por lo tanto, se describe un método para usar tales vectores suicidas para inactivar el lugar ssb de las cepas de Salmonella typhi atenuadas, tales como CVD 908-htrA.

Esto permite que tales vectores suicidas permitan la movilización eficaz de genes que expresan proteínas o péptidos de interés, tales como antígenos heterólogos, en el cromosoma de CVD 908-htrA de S. typhi, en dos etapas. Por ejemplo, se introdujo un casete de sacB-aph en el lugar de \squarearoC1019, que entonces se seleccionó usando canamicina. La generación de esta cepa de CVD 908-htrA\squarearoC1019:sacB-aph de S. typhi produjo una cepa intermedia valiosa en la que, en teoría, cualquier gen estructural se puede insertar eficazmente en el lugar de aroC mediante intercambio de marcadores. El gen sacB se usó como un marcador contraseleccionable haciendo pasar merodiploides en presencia de sacarosa al 10%, para seleccionar la sustitución del casete sacB-aph con el casete de antígeno entrante, puesto que la resolución de merodiploides en presencia de sacarosa dará como resultado la pérdida del gen sacB, a fin de producir una progenie viable. Esta cepa intermedia se empleó para integrar eficazmente el mutante no toxigénico LT-K63 de la enterotoxina lábil al calor de E. coli, crando CVD 908\squarearoC1019:LT-K63.

5.2 Expresión de antígenos heterólogos basándose en plásmidos

Aunque la integración cromosómica de genes extraños confiere estabilidad a tales secuencias, las manipulaciones genéticas implicadas pueden ser difíciles, y la caída en el número de copias del gen heterólogo a menudo da como resultado la producción de niveles insuficientes de antígeno heterólogo para asegurar una respuesta inmunitaria
óptima.

Por el contrario, la estabilidad del plásmido es un fenómeno complejo que depende de múltiples factores, incluyendo (1) el número de copias del plásmido; (2) la expresión apropiadamente regulada de genes contenidos en el plásmido; y (3) la presión selectiva para asegurar la segregación y herencia apropiadas del plásmido.

Para asegurar la estabilidad, los plásmidos se deben de replicar de manera regulada, para evitar que su número de copias se eleve hasta niveles letales.

Además, los plásmidos se deben de segregar durante la división de una bacteria en crecimiento, para asegurar que cada célula hija reciba por lo menos una copia del plásmido. La segregación puede ser un suceso pasivo, al azar, o un proceso activo que implica la síntesis de nuevas proteínas que ayudan en la segregación y herencia de plásmidos. La herencia con éxito de plásmidos que se segregan al azar reside en un número suficientemente elevado de copias de plásmidos distribuidos al azar dentro de una bacteria que se divide, para garantizar virtualmente la herencia de por lo menos un plásmido por cada célula hija.

Los vectores de clonación de plásmidos usados habitualmente, que incluyen derivados de pBR322 de número medio de copias y plásmidos de pUC de número elevado de copias, se heredan mediante segregación al azar.

La segregación activa implica la síntesis de proteínas que se propone que se unen a tales plásmidos y que se coordinan después con las membranas de bacterias en división, para asegurar que cada hija recibe por lo menos una copia del plásmido. Los plásmidos que emplean tales sistemas de reparto activos son típicamente plásmidos de números muy pequeños de copias, tales como el factor de sexo F de E. coli, o los factores R de resistencia a antibióticos, tales como pR1 y pRK2.

Se describe el uso de funciones de SEG de origen natural para potenciar la herencia de plásmidos de expresión de múltiples copias, que de otro modo se heredarían mediante segregación al azar, para aumentar la estabilidad de estos plásmidos.

También se usan otros sistemas genéticos de origen natural, en los que las células hijas que no heredan con éxito un plásmido de expresión serán exterminadas y eliminadas de la población en crecimiento, es decir, funciones de PSK. La incorporación de más de una categoría de función de estabilización de plásmidos se denomina en la presente memoria como un Sistema de Estabilización de Plásmidos. Por ejemplo, la incorporación de tanto una función de SEG, tal como un lugar de reparto, como una función de PSK, en un único plásmido de expresión, produce un Sistema de Estabilización de Plásmidos.

Se debería señalar que un gen que confiere resistencia a un antibiótico bactericida, tal como el gen aph que codifica resistencia a canamicina y neomicina, también se considera como una función de PSK, como lo es el sistema letal equilibrado basado en asd.

5.3 Sistemas letales equilibrados

Un método para asegurar la herencia de plásmidos de expresión implica la construcción de un sistema de PSK o un homólogo sustancial del mismo, denominado como sistema letal equilibrado, para plásmidos que expresan antígenos heterólogos. En un sistema letal equilibrado basado en plásmidos, los plásmidos que se replican en el citoplasma de la bacteria expresan una proteína crítica requerida por la bacteria para crecer y replicarse. La pérdida de tales plásmidos elimina la capacidad de la bacteria para expresar la proteína crítica, y da como resultado la muerte celular.

El sistema asd se ha introducido recientemente en cepas de vacunas de S. typhi atenuadas, en un intento por aumentar la estabilidad de plásmidos que expresan péptidos víricos de la hepatitis B sintéticos.

Sin embargo, cuando se inmunizaron voluntarios con estas cepas de vectores vivos, no se detectó ninguna respuesta inmunitaria al antígeno extraño. Veánse Tacket et al., Infection and Immunity, 65:3381, 1997. En realidad, hasta la fecha, pocos informes han documentado una respuesta inmunitaria a la expresión, basada en plásmidos, de un gen extraño a partir de plásmidos (estabilizados o de otro modo) tras la vacunación de seres humanos con un vector vivo de S. typhi atenuado.

Aunque en algunos casos el fracaso de las cepas del vector vivo pueden haber resultado de la sobreatenuación de la propia cepa, la conclusión es que las funciones de PSK actualmente usadas para plásmidos sufren limitaciones adicionales, en particular limitaciones de segregación y limitaciones de la actividad catalítica. Por lo tanto, se proporcionan plásmidos de expresión mejorados que comprenden capacidades de segregación potenciadas incorporando por lo menos un sistema de reparto junto con por lo menos un sistema de PSK.

5.4 Limitaciones de la segregación

Una limitación de los sistemas de estabilización de plásmidos, tales como la función asd (así como la función thyA), es que no potencian la herencia de plásmidos residentes, que continúan segregándose al azar con o sin la presencia de la función asd. Por lo tanto, si los plásmidos de expresión residentes, que portan los genes asd, son inherentemente inestables, se perderán, independientemente del requisito de la bacteria por Asd.

La estabilidad inherente de un plásmido de expresión asd se puede definir haciendo crecer cepas que tienen el plásmido en presencia de DAP, que elimina la presión selectiva que asegura que todas las bacterias viables contienen el plásmido de expresión. Si un plásmido dado es inherentemente inestable, se perderá de la bacteria a una velocidad elevada, y tales bacterias sin plásmido se lisarán en ausencia de suplementos de crecimiento; el resultado global de este efecto será una población de bacterias que crece mucho más lentamente que las cepas inalteradas de tipo
salvaje.

Los plásmidos descritos en la presente memoria tienen una estabilidad plasmídica mejorada incorporando una función de SEG, tal como un lugar de reparto, o un homólogo sustancial de una función de SEG, sobre el plásmido de expresión, para potenciar la herencia de tales plásmidos mediante bacterias que se dividen activamente. Los lugares de reparto están presentes de forma natural en los plásmidos virulentos de S. typhi. Tinge y Curtiss, Journal of Bacteriology, 172:5266, 1990, dieron a conocer que tales lugares de reparto estaban bien conservados entre plásmidos virulentos de S. typhimurium, y que, cuando se introdujo un fragmento de restricción de 3,9 kb, que codifica este lugar, sobre el plásmido de bajo número de copias pACYC184 (\sim15 copias por célula), la estabilidad del plásmido observada aumentó desde 34% de células que contienen plásmido hasta 99% de células que contienen plásmido, después de 50 generaciones. La secuencia nucleotídica de este lugar se determinó más tarde por Cerin y Hackett, Plasmid, 30:30, 1993, (Número de Acceso de GenBank M97752).

5.5 Limitaciones de la actividad catalítica

Otra limitación potencial de una función de estabilización de plásmidos, tal como la función asd (así como el sistema thyA), es su dependencia de una enzima con actividad catalítica. Dado que la complementación con sólo una única copia del gen asd es suficiente para eliminar la auxotrofía, no está claro por qué todas las copias de un plásmido de múltiples copias deben de permanecer estables, especialmente si codifican un antígeno heterólogo especialmente problemático que inhibe el crecimiento de la bacteria.

Además, aunque los plásmidos de expresión de mayores números de copias pueden expresar niveles apreciables de un antígeno heterólogo dado in vitro, tales plásmidos puede que no se mantengan en los números de copias esperados in vivo debido a toxicidad, y de hecho pueden estar presentes en números de copias mucho menores, que sería de esperar para reducir cualquier respuesta inmunitaria observada específica para el gen heterólogo. En consecuencia, la presente invención proporciona así plásmidos de números bajos y medios de copias, estabilizados, para expresar antígenos heterólogos.

5.6 La función de PSK ssb no catalítica

La limitación potencial de la actividad catalítica asociada con sistemas letales equilibrados se resuelve en la presente memoria mediante el uso de plásmidos que expresan la proteína de unión monocatenaria (SSB) procedente de S. typhi para complementar en trans una mutación de otro modo letal introducida en el gen ssb cromosómico. La bioquímica y los papeles metabólicos de la proteína de SSB de E. coli se han repasado ampliamente en Lohman et al., Annual Reviews in Biochemistry 63:527, 1994 y en Chase et al., Annual Reviews in Biochemistry 55:103, 1986.

SSB es una proteína no catalítica de 177 aminoácidos, con un peso molecular relativo de 19 kDa, que se une con actividad elevada a ADN monocatenario (ADNss), y desempeña un papel esencial como una proteína accesoria en la replicación, recombinación y reparación del ADN. La forma biológicamente relevante de SSB implicada en la unión a ADNss es un tetrámero, que se une en dos modos a ADNss, asociándose íntimamente con una media de 35 (modo de unión de SSB_{35}) o 65 bases (modo de unión de SSB_{65}). Las condiciones específicas que controlan el modo de unión preferido son complejas y dependen de la concentración circundante de sales monovalentes y divalentes, del pH, y de la temperatura, así como de la cantidad de proteína de SSB presente. En condiciones dadas, concentraciones elevadas de SSB favorecen el modo de unión de SSB_{35}, mientras que concentraciones más bajas de SSB favorecen el modo de SSB_{65}. Sin embargo, se debe de enfatizar que en ambos modos de unión, la conformación requerida de SSB es un tetrámero.

Ahora se han caracterizado a nivel bioquímico, fisiológico y nucleotídico las mutaciones de punto sensibles a la temperatura que se producen espontáneamente dentro del gen ssb; uno de tales mutantes, ssb-1, contiene la mutación de punto His 55 a Tyr, y se ha encontrado que es incapaz de ensamblarse correctamente en tetrámeros a temperaturas no permisivas y a niveles de expresión naturales. Estas cepas mutantes muestran defectos letales en la replicación y recombinación del ADN, sensibles a la temperatura.

Las frecuencias de segregación de plásmidos que portan ssb, que complementan mutaciones de ssb cromosómicas en bacterias de E. coli, se examinaron por Porter et al. Bio/Technology 8:47, 1990. Estos autores observaron que, en experimentos que implican biorreactores, la frecuencia de segregación en cepas que contienen plásmidos que crecen en cultivo continuo en condiciones no selectivas durante 150 horas fue menor que 1 x 10^{-7}; esta frecuencia de segregación fue independiente del número de copias, puesto que tanto los plásmidos pACYC184 de menor número de copias como los plásmidos pUC19 de número de copias muy elevado se estabilizaron a la misma frecuencia. Sin embargo, se debe de señalar que los plásmidos implicados expresaron sólo un marcador de resistencia a fármacos, además de la proteína de SSB.

Se describe un sistema de estabilización de plásmidos mejorado, que incorpora un lugar de reparto, tal como aquel presente en pSC101, o un homólogo sustancial de tal lugar de reparto, y también puede incorporar un sistema de reparto activo, o un homólogo del mismo, tal como el descrito anteriormente para el plásmido virulento de S. typhimurium.

La presente invención elimina la dependencia de sistemas catalíticos para conferir estabilidad plasmídica. Se pueden introducir, en los plásmidos de expresión, alelos mutados similares a ssb-1, para potenciar plásmidos de mayor número de copias mediante sobreexpresión de proteínas similares a SSB1 para formar los tetrámeros de SSB biológicamente activos requeridos. También se puede usar una función de PSK que implica un sistema de adicción de plásmidos silencioso basado en mecanismos de control de ARN antisentido, que sólo sintetizan proteínas letales después de que se ha producido la pérdida del plásmido.

5.7 Plásmidos de expresión y casetes genéticos autocontenidos

Se describe además una serie de plásmidos de expresión que se denominan en la presente memoria como plásmidos de pGEN. Los plásmidos pGEN comprenden casetes genéticos autocontenidos que codifican la expresión regulada de un antígeno heterólogo, un origen de replicación, y un marcador seleccionable para recuperar el plásmido. Esta serie de vectores se ha diseñado específicamente para probar si cualquier Sistema de Estabilización de Plásmidos puede incrementar la estabilidad de plásmidos, por ejemplo dentro de un marco de vacuna de S. typhi
atenuada.

La estructura básica de estos vectores se representa en la Figura 1, y la secuencia génica compuesta para el vector pGEN 2 (SEC ID nº. 1) se representa en la Figura 4; las Figuras 5 y 6 muestran secuencias compuestas específicas para los orígenes de replicación en pGEN3 (SEC ID nº.2) y en pGEN4 (SEC ID nº. 3), respectivamente.

Es crítico señalar que los plásmidos de pGEN se diseñan para que comprendan 3 casetes genéticos que funcionan independientemente. Estos casetes se han construido de forma que los componentes individuales se pueden optimizar mediante sustitución, según sea necesario. En consecuencia, además de los diversos Sistemas de Estabilización de Plásmidos descritos en la presente memoria, los casetes pueden probar otros sistemas prometedores ahora en existencia, o que puedan estar disponibles en el futuro. Además, el o los plásmidos optimizados se pueden adaptar para expresar antígenos heterólogos protectores relevantes dentro de cepas de vacunas atenuadas, para la inmunización de seres humanos.

Los plásmidos de pGEN proporcionan un casete de expresión de antígenos de ensayo regulado, que opera de forma que se aumenta la inducción de la expresión del antígeno, se añade una carga metabólica sobre la bacteria que conduce fenotípicamente a la inestabilidad plasmídica, es decir, se crea una ventaja selectiva para todas las bacterias que pueden perder espontáneamente el plásmido agresor. De este modo, se describe un plásmido condicionalmente inestable que se puede examinar en busca de la estabilidad, a medida que se incorporan sistemas de estabilización de
plásmidos.

En un modo preferido, el casete de expresión de antígenos de ensayo regulado, contenido dentro de los plásmidos de pGEN, comprende el promotor ompC inducible, o un homólogo sustancial del mismo, que es el responsable de la expresión de una proteína detectable, tal como la proteína fluorescente verde optimizada en el codón (GFPuv, disponible de Clontech), cuya sobreexpresión es tóxica para E. coli y S. typhi.

También se describe una serie de replicones plasmídicos que tienen números de copias que varían desde un número bajo de copias (es decir, \sim1 hasta \sim10, preferentemente \sim5 copias por célula) hasta un número medio de copias (es decir, \sim11 hasta \sim25, preferentemente \sim15 copias por célula) hasta un número elevado de copias (es decir, \sim26 hasta \sim100, preferentemente \sim60 copias por célula). Para lograr esto, se han modificado orígenes de replicación procedentes de los plásmidos bien caracterizados pSC101, pACYC184, y pAT153), usando técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR), para crear casetes de replicación plasmídica que funcionan independientemente. Estos casetes de replicación permiten ensayar la eficacia de un sistema de estabilización de plásmidos, a medida que aumenta el número de copias.

También se describen plásmidos de expresión seleccionables, para uso en vectores vivos de S. typhi atenuados. Estos plásmidos de expresión contienen un marcador seleccionable que se pueden sustituir, en último lugar, por un lugar no resistente a fármacos, tal como ssb, o por un gen que codifica un marcador de resistencia a fármacos aceptable, tal como aph que codifica resistencia a los aminoglicósidos canamicina y neomicina.

Para lograr esto, se han construido casetes de resistencia que codifican resistencia a carbenicilina y tetraciclina, terminándose eficazmente la transcripción mediante un terminador rrnBT1T2. A continuación sigue una descripción de los componentes individuales que comprenden los casetes de expresión y de replicación.

Los componentes específicos del Sistema de Estabilización de Plásmidos se pueden insertar sistemáticamente en los replicones de expresión básicos, para evaluar cualquier influencia individual o sinérgica de estas funciones en la estabilidad plasmídica en presencia y en ausencia de selección. Por ejemplo, se puede insertar una función de exterminio post-segregacional (por ejemplo, el lugar hok-sok) como un casete de EcoRI-XbaI, de tal forma que la transcripción de flanqueo procedente de lugares circundantes, tales como los casetes del antígeno y de selección, sea divergente y no perturbará significativamente los niveles de transcripción de tipo salvaje que controlan la letalidad de este lugar (Figura 7B, pGEN111).

De forma similar, el lugar de reparto pasivo par se puede insertar como un fragmento de BamHI-BglII entre el origen de replicación y los casetes de selección (Figura 7C, pGEN121). De forma interesante, en el trabajo que condujo a la presente invención, se observó que la orientación del lugar par potencia la síntesis de GFPuv en medio sólido cuando se inserta en la orientación natural encontrada dentro de ori101 de pSC101; esta orientación se adoptó para todos los plásmidos de expresión.

El lugar de reparto activo es preferentemente el lugar parA, construido como un casete de XhoI-EcoRI procedente del mismo plásmido de resistencia pR1 a partir del cual se adaptó hok-sok. Para conservar los niveles de transcripción natural y la regulación dentro de este lugar, el casete se sitúa preferentemente en un área de los plásmidos de expresión de forma que la transcripción de flanqueo transcurre alejándose desde parA (Figuras 7D y 7E, pGEN193 y pGEN222).

5.8 Componentes de los casetes de expresión y de replicación del antígeno 5.8.1 Promotor

Se apreciará por el experto en la materia que se puede incluir, en los casetes de expresión, una amplia variedad de componentes conocidos en la técnica, incluyendo una amplia variedad de señales de transcripción, tales como promotores y otras secuencias que regulan la unión de ARN polimerasa al promotor. La operación de los promotores es bien conocida en la técnica, y se describe en Doi, Regulation of Gene Expression, Modern Microbial Genetics, páginas 15-39 (1991). La descripción que sigue usa el promotor ompC a título de ejemplo, y no delimita la invención.

Es promotor es preferentemente un promotor medioambientalmente regulable, controlado mediante una señal biológicamente relevante tal como osmolaridad. En un modo preferido, el promotor es el promotor ompC. El gen ompC codifica una proteína purínica que se inserta como un trímero en la membrana externa de la célula bacteriana. La expresión y el control de ompC son complejos, y se han repasado recientemente con considerable detalle en Pratt et al., Molecular Microbiology 20:911, 1996 y en Egger et al., Genes to Cells 2:167, 1997.

La síntesis de la proteína OmpC se controla finalmente a nivel de la transcripción mediante la osmolaridad del entorno circundante, de forma que los incrementos en la osmolaridad están acompañados por incrementos en la transcripción de ompC. Sin embargo, los incrementos de la osmolaridad no median directamente incrementos en la transcripción de ompC. Más bien, la bacteria percibe la osmolaridad circundante usando un sistema de transducción de señales de dos componentes codificado por el operón ompB. Este operón está compuesto de dos genes transcritos en el orden envZ-ompR. El gen envZ codifica una proteína de 450 aminoácidos (a.a.), que contiene dos regiones transmembránicas, que se inserta en la membrana interna bacteriana (quizás como un dímero), con un dominio de 118 a.a. N-terminal, sensible a la osmolaridad, que se extiende en el espacio periplásmico, y con un dominio catalítico de 270 a.a. C-terminal, que se extiende en el citoplasma. El dominio catalítico C-terminal presenta actividades tanto de quinasa como de fosfatasa, que están moduladas por la osmolaridad, de tal manera que, a medida que aumenta la osmolaridad, predomina la actividad de quinasa, y a medida que cae la osmolaridad, predomina la actividad de fosfatasa.

La actividad de quinasa de EnvZ fosforila el resto 55 de ácido aspártico de la proteína OmpR citoplásmica de 239 a.a., creando OmpR-P. Es esta proteína modificada OmpR-P la que se une al promotor ompC y activa la transcripción mediante ARN polimerasa; por lo tanto, a medida que aumenta la osmolaridad, la actividad creciente de quinasa de EnvZ produce niveles más elevados de OmpR-P, lo que a su vez conduce a una mayor transcripción de ompC. OmpR-P se une a una región del promotor ompC que se extiende desde las bases -41 (con relación al sitio de comienzo transcripcional de +1) hasta -102, estando seguida la unión inicial de OmpR-P a las bases -78 hasta -102 por una unión adicional a bases que se extienden hasta -41, a medida que la concentración de OmpR-P aumenta con la osmolaridad. Además, se ha demostrado que OmpR-P se une a una región en dirección 5' rica en AT, que se extiende hasta la base -405, que potencia además la transcripción de ompC.

En una realización preferida, el fragmento del promotor ompC procedente de E. coli se extiende desde los nucleotídicos +70 hasta -389. Este promotor puede dirigir la transcripción dentro de cepas de S. typhi atenuadas de un gen de resistencia a antibióticos, tal como el gen de resistencia a canamicina, de manera sensible osmóticamente. Por ejemplo, se ha demostrado que, cuando la concentración de NaCl en el medio líquido de crecimiento aumentó desde 0 mM hasta 300 mM, la resistencia a canamicina aumentó desde 0 \mug/ml hasta >800 \mug/ml.

5.8.2 Origen de replicación

Debido a grados variables de toxicidad asociada con diferentes antígenos heterólogos (es decir, mayor toxicidad para antígenos derivados de organismos parasitarios tales como Plasmodium falciparum, frente a una toxicidad virtualmente inexistente para el fragmento C de la toxina del tétanos), se describen vacunas de vectores vivos que expresan preferentemente tales antígenos a partir de plásmidos de número bajo o medio de copias. El experto en la materia apreciará que la selección de un origen de replicación dependerá del grado de toxicidad, es decir, el número de copias debe bajar a medida que la toxicidad para la cepa bacteriana aumente. En un modo preferido, el o los Sistemas de Estabilización de Plásmidos usados son capaces de estabilizar replicones de números bajos o medios de copias.

Es preferible para el origen de replicación conferir un número medio de copias que está entre aproximadamente 2 y aproximadamente 75. En un modo preferido, el origen de replicación se selecciona para conferir un número medio de copias que está entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50. De forma más preferible, el intervalo es desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 30. Óptimamente, el intervalo es desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 20.

El origen de replicación puede proceder de pSC101, que confiere un número de copias de aproximadamente 5 por equivalente genómico.

El lugar onE1 especifica la síntesis de un transcrito de 555 bases denominado ARN I, y la síntesis de un transcrito de ARN antisentido de 110 bases, denominado ARN II. A medida que se sintetiza ARN I, la región próxima de 5' del transcrito adopta una estructura de bucle de cañón compuesta de 3 dominios que se pueden hibridar a una estructura de bucle de cañón complementaria formada por ARN II, dando como resultado una estructura de ARN-ARN bicatenaria que provoca que se aborte la replicación plasmídica.

A medida que continúa la síntesis de ARN I, generando el transcrito de 555 bases de longitud completa, un reordenamiento de la estructura secundaria del transcrito destruye la estructura inicial de bucle de cañón de 3 dominios, para formar una configuración alternativa de bucle de cañón que ya no se hibrida a ARN II. La formación de esta estructura alternativa permite que el transcrito se hibride a una hebra de ADN del propio plásmido, formando un complejo de ARN-ADN que se rompe mediante ARNasa H endógena para desencadenar la síntesis de la primera hebra de ADN del plásmido y la replicación del plásmido.

Por lo tanto, la replicación plasmídica está controlada por la síntesis de ARN I, que sufre una cascada de configuraciones estructurales que conducen a la iniciación de la replicación. La progresión necesaria de la cascada de plegamiento del ARN I (y la iniciación resultante de la replicación) se interrumpe por competición de los dominios con ARN II. Este mecanismo es esencialmente el mismo en plásmidos que contienen oriE1 u ori15A.

La razón de que estos dos tipos de plásmidos puedan coexistir dentro de la misma bacteria se debe a la divergencia de secuencias dentro de la región de hibridación entre ARN I y ARN II, de tal forma que el ARN II de ori15A no se hibridará a ARN I de oriE1; esta divergencia de secuencias también afecta a la estabilidad del híbrido ARN I:ARN II, dando cuenta de las diferencias en el número de copias entre plásmidos que portan los orígenes de replicación oriE1 u ori15A.

La organización estructural de los casetes de los orígenes de replicación manipulados mediante ingeniería para pSC101 (ori101; \sim5 copias por equivalente genómico), pACYC184 (derivado de ori15A; \sim15 copias por equivalente genómico), y pAT153 (derivado de oriE1; \sim60 copias por equivalente genómico) es análoga en estructura y en función.

5.8.3 Proteína o péptido expresado

Cuando el casete de expresión se usa para identificar Sistemas de Estabilización de Plásmidos, preferentemente expresa una proteína o péptido sin ninguna actividad metabólica. Una proteína preferida es la proteína fluorescente verde (GFP) de la medusa bioluminiscente Aequiorea victoria, una proteína de 238 aminoácidos que sufre una modificación post-traduccional en la que están implicados 3 aminoácidos internos (^{65}Ser-Tyr-Gly^{67}) en una reacción de ciclación y oxidación. El fluoróforo resultante emite una luz azul verdosa de forma máxima a una longitud de onda de 509 nm al irradiarlo con luz ultravioleta de onda larga a una longitud de onda de 395 nm. Además, la actividad de fluorescencia es notablemente constante a lo largo de un amplio intervalo de pH, desde 5,5-12, y a temperaturas de hasta
70ºC.

Puesto que GFP no tiene ninguna actividad catalítica conocida, el nivel de fluorescencia observada dentro de la bacteria individual que expresa GFP puede proporcionar una indicación directa de niveles de transcripción del gen gfp portado por cada bacteria. La expresión de la proteína de GFP se ha cuantificado ahora en una variedad tanto de células procariotas como eucariotas, y no requiere cofactores adicionales o enzimas procedentes de A. victoria. La formación del fluoróforo depende aparentemente de enzimas y cofactores que se encuentran en todas partes, o es un suceso autocatalítico.

Las bacterias individuales que expresan GFP se pueden cuantificar ya sea solas o dentro de macrófagos, estirpes celulares epiteliales, y en tejidos de animales infectados, usando citometría de flujo. La fluorescencia de GFP depende absolutamente de los restos 2-232 de la proteína no desnaturalizada. Sin embargo, la fusión de dominios proteínicos biológicamente activos no relacionados al término N de GFP ha dado como resultado todavía proteínas de fusión con la actividad biológica heteróloga esperada, que continúa igualmente la fluorescencia.

Se ha confirmado, mediante análisis de secuencias (Clontech), que el alelo gfp preferido en la presente memoria (es decir, gfpuv) expresa un mutante de GFP (GFPuv) que contiene 3 sustituciones de aminoácidos (que no implican al fluoróforo), lo que incrementa la fluorescencia 18 veces con respecto a la de GFP de tipo salvaje.

Además, se han optimizado 5 codones de arginina raramente usados, para la expresión eficaz de GFP en E. coli. Puesto que la comparación de los niveles de expresión de diversas proteínas heterólogas en E. coli y CVD 908 ha demostrado una expresión equivalente o superior dentro de CVD 908, se esperaba que gfpuv funcionaría eficazmente en CVD 908-htrA.

Se inserta una secuencia codificante en una relación correcta al promotor, en la que el promotor y la secuencia codificante están tan relacionados que el promotor acciona la expresión de la secuencia codificante, de forma que se produce en último lugar el péptido o proteína codificado. Se entenderá que la secuencia codificante también debe de estar en relación correcta con cualesquiera otras secuencias reguladoras que puedan estar presentes.

5.8.4 Antígenos heterólogos

Los plásmidos de expresión expresan preferentemente un antígeno para presentación a un hospedante para provocar una respuesta inmunitaria que dé como resultado la inmunización y protección frente a la enfermedad. Aunque en la presente memoria se presentan las toxinas de Shiga como ejemplos de antígenos expresados de forma útil mediante plásmidos de expresión de vacunas descritos en la presente memoria, la invención tiene un alcance amplio y engloba la expresión de cualquier antígeno que no destruya el vector vivo bacteriano y que provoque una respuesta inmunitaria cuando el vector vivo bacteriano que contiene dicho plásmido o plásmidos de expresión se administra a un hospedante, es decir, a un ser humano o a otro animal.

Los plásmidos de expresión de vacunas proporcionados en la presente memoria se usan para transformar genéticamente cepas bacterianas atenuadas, preferentemente cepas usadas para la vacunación de seres humanos, y usadas muy preferentemente para transformar cepas de vacunas de S. typhi atenuadas tales como CVD 908-htrA, y preferentemente codifican la subunidad B de Stx2 o una holotoxina de Stx2 genéticamente destoxificada.

Un subconjunto de STEC, más a menudo denominado como E. coli enterohemorrágica (EHEC), es capaz de provocar síndromes clínicos graves, incluyendo colitis hemorrágina, síndrome urénico hemolítico (HUS) y púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), en una proporción pequeña de individuos infectados, además de provocar diarrea no hemorrágica en muchos otros.

La colitis hemorrágica se caracteriza por una diarrea hemorrágica copiosa, habitualmente sin fiebre, o con sólo un grado bajo de fiebre, y una cantidad relativamente pequeña de leucocitos fecales demostrables en las heces diarreicas. Estas características diferencian la colitis hemorrágica de la disentería provocada por Shigella, que típicamente presenta pocas heces de sangre y moco, precedidas por fiebre alta y con grandes números de leucocitos fecales visibles por microscopía.

HUS, una enfermedad potencialmente mortal que afecta muy a menudo a niños pequeños, pero que puede afectar a individuos de cualquier edad, se caracteriza por la triada de anemia hemolítica microangiopática, trombocitopenia y uremia. Actualmente, en Estados Unidos de América, HUS es la causa más frecuente de insuficiencia renal aguda en bebés y en niños pequeños. En un estudio de Siegler et al. con 288 pacientes tratados para HUS postdiarreico en Utah desde 1970-1994, apareció la enfermedad grave (definida como anuria que dura más de 7 días, oliguria que dura más de 14 días, o daño estructural extrarrenal tal como apoplejía) en el 25% de los casos, y estaba asociada con niños de menos de dos años de edad; aproximadamente un tercio de estos casos graves de HUS murieron (5%) o tuvieron secuelas importantes, incluyendo nefropatía de etapa terminal (5%) o daño cerebral crónico (3-5%), implicando los problemas crónicos menos graves la hipertensión, proteinuria o azotemia.

La TTP, que afecta muy a menudo a los adultos, se caracteriza por complicaciones neurológicas tales como apoplejía, además de trombocitopenia, anemia hemolítica e insuficiencia renal.

De lejos, el serotipo de EHEC más habitual es O157:H7. No obstante, otros serotipos de EHEC también provocan HUS y colitis hemorrágica, incluyendo O26:H11, O111:H8 y un número de otros. Las cepas de EHEC asociadas con HUS siempre elaboran una o más toxinas de Shiga, y portan un plásmido virulento de 60 MDa. Además, la mayoría también alberga el islote de patogenicidad cromosómica (el denominado LEE), que tiene un conjunto de genes que codifican la capacidad para unirse y desvanecerse. Está bien aceptado que las toxinas de Shiga elaboradas mediante EHEC desempeñan un papel clave en la patogénesis de colitis hemorrágica y de HUS.

Como se describe en detalle más abajo, la familia de toxinas de Shiga comprende dos grupos de toxinas, Stx1 (que es esencialmente idéntica a la citotoxina/neurotoxina/enterotoxina producida por el tipo 1 de Shigella dysenteriae, del bacilo de Shiga), y Stx'' (que es inmunológicamente distinta de Stx1, y tiene varias variantes relacionadas). En los Estados Unidos de América, la mayoría aplastante de EHEC asociada con casos de HUS expresa Stx2, ya sea sola o conjuntamente con Stx1.

Los focos más importantes de infección de EHEC son los bóvidos. El modo único más importante de transmisión de EHEC a seres humanos es vía el consumo de carne de res contaminada sin cocinar, a menudo carne de res triturada. De forma menos habitual, se ha inculpado a una variedad de otros vehículos alimentarios y otros modos de transmisión. De forma muy importante, EHEC es uno del puñado de patógenos entéricos bacterianos que, al igual que Shigella, se puede transmitir mediante contacto directo o mediante contacto con artículos contaminados.

Hay una gran expectativa y optimismo en parte de la mayoría de los epidemiólogos de que la irradiación de carne vendida en los Estados Unidos de América reducirá drásticamente la transmisión de EHEC a seres humanos, puesto que reducirá el único modo más importante de transmisión.

No obstante, ciertos grupos de riesgo expuestos a otros modos de transmisión de EHEC no se beneficiarán de esta intervención. Por ejemplo, la exposición de los trabajadores del matadero a EHEC, un peligro ocupacional, se produce en un punto en el ciclo del procesado de la carne, antes de que se utilizase la irradiación. Para tales grupos especiales, tales como aquellos para los cuales el riesgo permanecerá incluso después de la irradiación de la carne, pueden ser útiles las vacunas contra EHEC. Los plásmidos descritos en la presente memoria se pueden usar en la construcción de vacunas contra EHEC útiles para la prevención de la infección (en los focos animales o en seres humanos), y para prevenir las complicaciones graves de la infección de EHEC estimulando antitoxina de Shiga neutralizante.

Estudios con O1 de Vibrio cholerae que expresa la subunidad B de Stx1 han demostrado la factibilidad de provocar antitoxina de Shiga neutralizante mediante inmunización mucosal con vectores vivos. Sin embargo, puesto que virtualmente todas las EHEC asociadas con casos de HUS en los Estados Unidos de América expresan Stx2, sola o junto con Stx1, es preferible que una vacuna para evitar las complicaciones graves de la infección por EHEC, mediante la provocación de anticuerpos neutralizantes de la toxina, debiera estimular anti-Stx2 así como Stx1. Está dentro del amplio alcance de la presente invención proporcionar un sistema plasmídico estabilizado para expresar antígenos de Stx2, solos o junto con Stx1, en un vector vivo de S. typhi atenuado.

Otros antígenos que se pueden suministrar adecuadamente según las composiciones y métodos descritos en la presente memoria incluyen, por ejemplo, aquellos para la hepatitis B, Haemophilus influenzae tipo b, hepatitis A, pertussis acelular (_{ac}P), varicela, rotavirus, Streptococcus pneumoniae (pneumocócico), y Neisseria meningitidis (meningocócico). Véase Ellis et al., Advances in Pharm., 39:393-423, 1997.

Preferentemente, los antígenos codificados por los plásmidos de expresión son vacunas contra el cáncer.

Los antígenos codificados por estos plásmidos se pueden diseñar para provocar una respuesta inmunitaria frente a autoantígenos, receptores de células B y/o receptores de células T que están implicados en enfermedades autoinmunitarias o inmunológicas. Por ejemplo, cuando se provocan respuestas inmunitarias inapropiadas contra tejidos corporales o antígenos medioambientales, las vacunas de la presente invención pueden inmunizar contra los autoantígenos, los receptores de células B y/o los receptores de células T, para modular las respuestas y mejorar las enfermedades. Por ejemplo, tales técnicas pueden ser eficaces tratando miastenia grave, lupus eritematoso, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, alergias y asma.

5.8.4.1 La familia de la toxina de Shiga

En 1903 Conradi fue el primero en dar a conocer que S. dysenteriae 1 producía una exotoxina poderosa. Debido a que la inyección de esta toxina conduce a la parálisis de los miembros traseros de conejos, se denominó originalmente neurotoxina. Subsiguientemente, esta toxina, la toxina de Shiga, demostró ser letal para ciertas células en cultivo de tejidos (es decir, fue una citotoxina). Vicari et al., y después Keusch et al., demostraron que también funcionó como una enterotoxina.

Los científicos reconocen ahora la existencia de una familia de citotoxinas de Shiga que inhiben la síntesis de las proteínas, conduciendo a la muerte celular para células susceptibles. Durante muchos años después de la revelación de que tales toxinas se producían mediante ciertas cepas de E. coli además de la toxina de Shiga original producida por Shigella dysenteriae tipo 1, la nomenclatura para esta familia de toxinas fue confusa. Puesto que informes tempranos describieron la actividad de estas toxinas sobre células Vero (una estirpe celular derivada de células epiteliales de riñón de mono verde africano), muchos investigadores las denominaron verotoxinas. Otros se refirieron a estas toxinas expresadas en E. coli como toxinas similares a Shiga.

Las toxinas proteínicas se denominan colectivamente en la presente memoria como toxinas de Shiga (Stx), y los genes que codifican estas toxinas se denominan como stx, representando los subíndices el grupo y variante [es decir, stx_{1} para la toxina de Shiga producida por E. coli que es esencialmente idéntica a aquella de Shigella dysenteriae tipo 1 (stx), y stx_{2}, stx_{2c}, stx_{2d}, stx_{2e} para el grupo antigénicamente distinto de toxinas relacionadas].

La estructura, bioquímica y antigenicidad de las toxinas de Shiga están bien descritas en Melton-Celsa et al., Escherichia coli 0157:H7 and Other Shiga Toxin-producing E. coli Strains, 1998; Takeda, Bacterial Toxins and Virulence Factors in Disease, 1995; Gyles, Canadian J. of Microbiology, 38:734, 1992; y O'Brien et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 180:165, 1992.

\newpage

Estas citotoxinas de Shiga están compuestas de una única subunidad A catalítica de aproximadamente 32 kDa no asociada covalentemente con el dominio de unión a receptor pentamérico de aproximadamente 7,7 kDa de las subunidades B. Estas subunidades están codificadas por un único operón del orden stxA-stxB; la transcripción de los operones de stx y stx_{1} está regulada por hierro tanto en S. dysenteriae tipo 1 como en E. coli, pero aún no se han determinado, para ningún operón stx_{2}, ninguna señal de control medioambiental. Ninguna de estas toxinas está codificada en un plásmido; más bien, son codificadas por fagos (Stx1, Stx2, Stx2c, y Stx2d), o están codificadas cromosómicamente (Stx, Stx2e).

Como se ha mencionado anteriormente, todos los miembros de la familia de toxinas de Shiga son toxinas citolíticas que inhiben la síntesis de proteínas dentro de células susceptibles, bloqueando la unión a ribosomas del ARNt aminoacílico dependiente del factor 1 de alargamiento. Para todas las toxinas identificadas a partir de infecciones humanas, la penetración de células susceptibles mediante endocitosis sigue a la unión de la holotoxina a la globotriaosil ceramida del receptor glucolípido de la superficie celular (Gb_{3}), moviendo la toxina hasta el aparato de Golgi y al retículo endoplásmico, seguido de la liberación en el citoplasma. Las toxinas de Shiga son N-glucosidasas de ARN que despurinan una única adenina a partir del ARN de 28S de la subunidad ribosómica de 60S eucariota, inactivando de este modo la subunidad 60S, y conduciendo eventualmente a la muerte celular.

Hay seis miembros prototípicos de la familia de toxinas de Shiga: Stx, Stx1, Stx2, Stx2c, Stx2d, y Stx2e, que difieren entre sí inmunológicamente y en actividad tóxica. El detalle significativo se ha incluido en la presente memoria para proporcionar un antecedente para comprender la significancia de las mutaciones de punto discutidas más abajo, que se requieren para las holotoxinas destoxificadas genéticamente. Los miembros de la familia de toxinas de Shiga difieren entre sí en 3 formas fundamentales, como se ha resumido recientemente por Melton-Celsa et al., Escherichia coli 0157:H7 and Other Shiga toxin-producing E. coli Strains, 1998.

(1): Inmunológicamente: la familia de toxinas de Shiga está compuesta de dos serogrupos, Stx/Stx1 y Stx2; antisueros provocados contra Stx/Stx1 no neutralizan miembros del serogrupo de Stx2, según se juzga mediante el ensayo de citotoxicidad con células Vero.

(2)

Estructuralmente: Stx y Stx1 son esencialmente idénticas, difiriendo en un único aminoácido en la posición 45 de la subunidad A madura, y se ha resuelto la estructura cristalina para la holotoxina de Stx. El prototipo Stx2 es solamente 55% homólogo a los restos de la subunidad A madura de Stx/Stx1, y 57% homólogo a la subunidad B madura, lo que explica por qué los antisueros producidos contra Stx/Stx1 no neutralizan miembros del grupo de Stx2. Dentro del grupo de Stx2, Stx2e es la más distantemente relacionada, compartiendo una homología de aminoácidos del 93% con la subunidad A madura de Stx2, y una homología de 84% con la subunidad B madura; Stx2c y Stx2d son muy similares a Stx2, compartiendo una homología de 99-100% con restos

\hbox{de la subunidad A
madura,  y una homología de 97% con restos de la subunidad B
madura.}

(3): Citotoxicidad: Stx2 está entre las más letales de las toxinas de Shiga, con una LD_{50} para ratones inyectada intraperitonealmente de 0,5-2 ng. La LD_{50} para Stx1 y Stx2e es 200-400 ng, y 1-5 ng para Stx2d; sin embargo, Stx2d es poco habitual, por cuanto esta toxina se puede activar mediante el moco intestinal murino para aumentar la toxicidad de la toxina, reduciendo la LD_{50} hasta 0,5 ng.

5.8.5 Mutagénesis específica del sitio de toxinas de Shiga

Se describe una toxina de Shiga genéticamente destoxificada. La destoxificación se logra mediante mutagénesis específica del sitio, introduciendo dos mutaciones de punto definidas y bien separadas que alteran los restos críticos dentro del sitio catalítico de la subunidad A. Se introducen dos mutaciones de punto definidas y bien separadas, adicionales, dentro de la subunidad B, para alterar los restos críticos dentro del sitio de unión primario (es decir, SITIO I) que reside dentro de la hendidura formada por subunidades B adyacentes del anillo pentamérico de la holotoxina.

Se han hecho intentos previos para alterar el SITIO II de unión de menor afinidad. Sin embargo, este sitio de unión sólo se ha identificado a partir de estudios de modelos moleculares, y no está extensamente apoyado por estudios de mutación que favorecen la unión al SITIO I del receptor de Gb_{3}. Incluso si el SITIO II es un sitio de unión de baja afinidad alternativo, que permite la entrada de la holotoxina mutante en células susceptibles, la inactivación del dominio catalítico aún prevendrá la muerte celular.

Basándose en alineamientos de secuencias de aminoácidos, estudios de cristalografía mediante rayos X, y estudios de modelos moleculares, se han identificado los aminoácidos esenciales que comprenden el sitio activo dentro de la subunidad A catalítica de Stx, así como aquellos restos que comprenden el SITIO I de unión dentro del pentámero de la subunidad B de Stx/Stx1. La conclusión es que los aminoácidos esenciales para el sitio activo se seleccionan de entre el grupo que consiste en Tyr 77, Tyr 114, Glu 167, Arg 170, y Trp 203. Se cree que los restos que se requieren para la unión al receptor a las hendiduras formadas por subunidades B adyacentes incluyen Lys 13, Asp 16, Asp 17, Asp 18, Thr 21, Glu 28, Phe 30, Gly 60, y Glu 65. Estas predicciones de sitios son consistentes con estudios funcionales y experimentos in vivo que usan mutaciones individuales y dobles mutaciones definidas, dentro de dominios individuales de la halotoxina, introducidas mediante mutagénesis específica del sitio. En la Tabla 1 se presenta un resumen de tales mutaciones. Basándose en estos datos y en predicciones cristalográficas, está dentro de la amplia práctica de la invención proporcionar plásmidos de expresión que codifican toxinas de Shiga que tienen dos conjuntos específicos de mutaciones de punto tanto dentro de las subunidades A como B, para crear holotoxinas de Stx2 mutantes no tóxicas para uso como vacunas, tales como mediante expresión dentro de vectores vivos de S. typhi atenuados, tales como CVD 908-htrA.

1

5.9 Formulaciones farmacéuticas

Se contempla que las vacunas de vectores vivos bacterianos descritas en la presente memoria se administrarán en formulaciones farmacéuticas para uso en la vacunación de individuos, preferentemente seres humanos. Tales formulaciones farmacéuticas pueden incluir vehículos farmacéuticamente eficaces, y, opcionalmente, pueden incluir otros ingredientes terapéuticos, tales como diversos adyuvantes conocidos en la técnica.

El vehículo o vehículos deben de ser farmacéuticamente aceptables en el sentido de que sean compatibles con los ingredientes terapéuticos, y que no sean indebidamente perjudiciales para su receptor. El ingrediente o ingredientes terapéuticos se proporcionan en una cantidad y frecuencia necesarias para lograr el efecto inmunológico deseado.

El modo de administración y las formas de dosificación afectarán a las cantidades terapéuticas de los compuestos que son deseables y eficaces para la aplicación de vacunación. Los materiales de vectores vivos bacterianos se suministran en una cantidad capaz de provocar una reacción inmunitaria que es eficaz para incrementar la respuesta inmunitaria del paciente a la holotoxina mutante expresada, o a otro antígeno o antígenos heterólogos deseados. Una cantidad inmunizacionalmente eficaz es una cantidad que confiere una capacidad aumentada para prevenir, restrasar o reducir la gravedad del comienzo de una enfermedad, en comparación con tales habilidades en ausencia de tal inmunización. Será fácilmente manifiesto para la persona experta en la técnica que esta cantidad variará basándose en factores tales como el peso y la salud del receptor, el tipo de proteína o péptido que se expresa, el tipo de organismo infeccioso que se combate, y el modo de administración de las composiciones.

Los modos de administración pueden comprender el uso de cualquier medio y/o métodos adecuados para suministrar las vacunas de vectores vivos bacterianos a un lugar corpóreo del animal hospedante en el que las vacunas de vectores vivos bacterianos sean inmunoestimulantemente eficaces.

Los modos de suministro pueden incluir, sin limitación, métodos de administración parenteral, tales como el subcutáneo (SC), inyección, inyección intravenosa (IV), transdérmico, intramuscular (IM), intradérmico (ID), así como no parenteral, por ejemplo mediante administración oral, nasal, intravaginal, pulmonar, oftálmica y/o rectal.

La frecuencia de la dosis y las formas de dosificación adecuadas para las composiciones de vacunas de vectores vivos bacterianos se pueden determinar fácilmente por aquellos expertos normales en la técnica, sin experimentación innecesaria, mediante el uso de técnicas de determinación convencionales de títulos de anticuerpos, y mediante protocolos de bioeficacia/biocompatibilidad convencionales. Entre otras cosas, la frecuencia de la dosis y las formas de dosificación adecuadas dependen del antígeno particular empleado, del efecto terapéutico deseado, y del intervalo de tiempo deseado de bioactividad.

Las vacunas de vectores vivos bacterianos se pueden administrar de forma útil al animal hospedante con cualesquiera otros agentes activos farmacológica o fisiológicamente activos adecuados, por ejemplo sustancias antigénicas y/u otras sustancias biológicamente activas.

Las formulaciones se pueden presentar, por ejemplo, como unidades discretas, tales como cápsulas, obleas, comprimidos o pastillas para chupar, conteniendo cada una una cantidad predeterminada de la estructura de suministro de vector; o como una suspensión.

6. Ejemplos

Se ha construido una serie isogénica de plásmidos de expresión compuestos de casetes individuales para uso en vacunas de vectores vivos bacterianos, tales como E. coli y Salmonella. Con la excepción de sitios de unión ribosómicos (RBS), los lugares genéticos claves que controlan la iniciación y terminación de la transcripción, la replicación del plásmido, o que codifican proteínas expresadas, están contenidos dentro de fragmentos de restricción definidos, como se representa mediante el diagrama de plásmido representativo de pGEN2 observado en la Figura 1A. La estructura básica de estos plásmidos de expresión se resaltará en primer lugar, y después se resumirán los datos que demuestran la función de cada lugar dentro de la cepa CVD 908-htrA de vacuna atenuada.

6.1 Estructura de pGEN

La transcripción de cualquier antígeno heterólogo que va a ser expresado dentro de CVD 908-htrA está controlada principalmente por un promotor inducible contenido en un casete de EcoRI-BglII. Puesto que los plásmidos de expresión se modelaron inicialmente tras pTETnir15, las primeras versiones portaban el promotor nir15 anaeróbicamente activado (P_{nir15}). Sin embargo, este promotor se ha sustituido por un promotor P_{ompC} osmóticamente controlado, fuertemente regulado, que se manipula fácilmente in vitro variando la concentración de NaCl.

Los antígenos heterólogos están contenidos en un casete BglII-AvrII, flanqueado por un RBS optimizado en el extremo próximo 5' y por un terminador transcripcional trpA en el extremo distal de 3' de este casete. El origen de replicación para estos plásmidos de expresión se ha diseñado como un casete de AvrII-BglII, y está protegido de la transcripción de lectura que se origina en las regiones de flanqueo. Estas casetes portan un derivado extremadamente eficaz del terminador transcripcional T1T2 en un término, con el terminador transcripcional trpA, procedente del casete del antígeno heterólogo, en el extremo opuesto del casete de replicación.

Los sitios BglII y SpeI de flanqueo (véase la Fig. 2), entre el casete de replicación y el casete de selección, están destinados a la inserción de una función de estabilización de plásmidos, tal como el lugar par de pSC101. Los casetes de selección contenidos dentro de los plásmidos están contenidos dentro de los casetes de SpeI-XbaI, y se pueden usar, por ejemplo, para codificar resistencia a carbenicilina (el gen bla) o resistencia a tetraciclina (el gen tetA, véase la Fig. 1).

El casete de resistencia a fármacos se puede sustituir por el gen ssb que codifica la proteína de unión monocatenaria esencial de CVD 908-htrA de Salmonella typhi.

Los sitios XbaI y EcoRI de flanqueo, entre el casete de selección y P_{ompC}, están destinados a la inserción de funciones de estabilización adicionales, incluyendo un lugar de PSK tal como hok-sok (véase las Figs. 1 y 2), o una función de reparto adicional tal como el lugar parA de pR1 (véase la Fig. 7).

6.2 Promotor ompC modificado

Se pretendía que cualquier promotor que controla la transcripción de un gen heterólogo sea sensible a una señal medioambiental de importancia biológica. Para los plásmidos de expresión descritos en la presente memoria, se usó un casete del promotor ompC (P_{ompC}) procedente de E. coli, que se indujo mediante el incremento de la osmolaridad. La construcción de este casete se basó en la secuencia publicada de P_{ompC}, publicada por Norioka et al. (Norioka et al. 1986), y se llevó a cabo usando cebadores sintéticos para crear un casete de EcoRI-BglII de 459 pb, del que se eliminó el RBS natural.

Para confirmar que este promotor estaba controlado osmóticamente dentro de CVD 908-htrA, se construyó un derivado de pTETnir15 en el que P_{nir15}-toxC se sustituyó por un casete compuesto de P_{ompC} que conduce la expresión de un casete aphA-2 sin promotor, que confiere resistencia a canamicina. Este plásmido, denominado pKompC, se introdujo en CVD 908-htrA mediante electroporación, y se seleccionaron sistemáticamente receptores para resistencia a canamicina en medio LB. La expresión regulada osmóticamente de aphA-2 se determinó inoculando CVD 908-htrA(pKompC) en 50 ml de caldo nutriente suplementado (NB) que contiene concentraciones crecientes de canamicina, desde 0 hasta 300 \mug/ml; se construyó un conjunto paralelo de cultivos con los intervalos idénticos de canamicina añadidos, pero que también contienen sacarosa al 10%, para inducir P_{ompC}. Los cultivos se incubaron toda la noche a 37ºC, y se midió la O.D._{600}. Los resultados se dan en la Tabla 2, Experimento 1.

La Tabla 2 muestra la inducción con la osmolaridad del promotor P_{ompC}, que controla la expresión de resistencia a canamicina, dentro del CVD 908-htrA del vector vivo de S. typhi.

2

Independientemente de la presión selectiva usando canamicina, la presencia de sacarosa al 10% tuvo un efecto inhibidor sobre el crecimiento de CVD 908-htrA(pKompC). Sin embargo, los resultados sugirieron que P_{ompC} de E. coli estaba osmóticamente controlado cuando conduce la expresión del gen aphA-2 dentro de CVD 908-htrA(pKompC). Para confirmar esto, se inoculó CVD 908-htrA(pKompC) en 50 ml de caldo NB suplementado, que contiene concentraciones crecientes de canamicina, desde 200 hasta 800 \mug/ml; nuevamente se creó un conjunto paralelo de cultivos que contienen 300 mM de NaCl, para inducir P_{ompC}. Los cultivos se incubaron a 37ºC durante 16 h, y los resultados se dan en la Tabla 2, Experimento 2. Se confirmó que la expresión, dirigida por P_{ompC}, del gen aphA-2 dentro de CVD 908-htrA confiere resistencia a canamicina a niveles de hasta 800 \mug/ml, de manera osmóticamente regulada.

El casete del gen aph se sustituyó entonces por un casete de BglII-NheI de 756 pb que contiene el alelo gfpuv que codifica GFPuv. Durante la identificación visual de colonias de E. coli subiluminadas con luz ultravioleta, se escogieron para un estudio posterior una colonia fluorescente muy brillante y otra colonia fluorescente representativa, denominadas clon 1 y clon 3, respectivamente. Con la purificación de los plásmidos implicados, se determinó que el clon 1 contenía un plásmido que ya no portaba un sitio de BglII que separa P_{ompC} y gfpuv, mientras que el clon 3 portaba el sitio de BglII esperado. Se examinó la inducción de la expresión de GFP cuando los clones 1 y 3 se hicieron crecer en agar nutriente en presencia o en ausencia de NaCl, y se determinó mediante inspección visual que el clon 3 presentaba muy poca fluorescencia cuando se hacía crecer en agar nutriente que no contiene NaCl pero que daba una fluorescencia brillante cuando se cultivaba en placas en agar nutriente que contienen 300 mM de NaCl (datos no mostrados). Sin embargo, el clon 1 tuvo un nivel de fluorescencia de fondo mucho más elevado cuando no se inducía, pero daba una fluorescencia intensa cuando se inducía con 300 mM de NaCl. Para excluir mutaciones dentro del gen gfpuv que puedan afectar a la fluorescencia, se sustituyó P_{ompC} del clon 1 por PompC del clon 3, y se confirmó la disminución esperada de la fluorescencia según se juzga mediante subiluminación (datos no mostrados). Por lo tanto, se concluye que las diferencias en la fluorescencia observada estaban controladas por dos versiones genéticamente distintas del promotor P_{ompC}, que se designan P_{ompC1} (niveles de transcripción más elevados con menos control osmótico) y P_{ompC3} (niveles de transcripción moderados con control osmótico similar al observado para el casete de P_{ompC}-aph descrito antes); los plásmidos que contienen estos casetes de expresión se denominan como pGFPompC1 y pGFPompC3, respectivamente.

Para cuantificar las diferencias en la expresión inducida y no inducida de gfpuv controlada por P_{ompC1} y P_{ompC3}, se monitorizó la síntesis de GPFuv tanto con DH5\alpha de E. coli como con CVD 908-htrA de S. typhi, usando citometría de flujo. Esta técnica poderosa tiene las ventajas únicas de permitir una medida rápida de la expresión de GFPuv entre grandes números de bacterias individuales, así como de determinar exactamente la intensidad media de la fluorescencia debida a la síntesis de GFPuv dentro de cada población bacteriana analizada. Para lograr esto, se introdujeron pGFPompC1 y pGFPompC3 mediante electroporación, y las colonias se aislaron sobre 1 X de agar con LB suplementado, que contiene 100 \mug/ml de carbenicilina, que se hizo crecer a 30ºC durante 48 h. Las colonias aisladas se hicieron crecer entonces, y los cultivos se congelaron como lotes maestros. Las colonias recientes se inocularon entonces en caldo nutriente suplementado o en caldo nutriente suplementado que contiene 150 mM de NaCl, y se hicieron crecer a 37ºC/250 rpm durante 24 h; la diferencia en O.D._{600} para cualquier cultivo nunca fue mayor que 0,07. La inducción de la expresión de gfpuv, controlada por P_{ompC1} y P_{ompC3}, se analizó mediante citometría de flujo, y los resultados se presentan en la Tabla 3.

La Tabla 3 muestra una comparación de la inducción de P_{ompC1} y P_{ompC3}, que controlan la expresión de GFPuv, dentro de las cepas hospedantes DH5\alpha de E. coli y CVD 908-htrA^{1}.

3

El nivel basal de expresión para el casete de P_{ompC1}-gfpuv es 2,5 veces superior que para el casete de P_{ompC3}-gfpuv, cuando se expresa en DH5\alpha, y 2,1 veces superior cuando se expresa en CVD 908-htrA; sin embargo, el nivel basal de la fluorescencia detectada para la síntesis de GFPuv nunca superó una intensidad media fluorescente de 5,37, independientemente del fondo del hospedante. Si se define la relación de inducción como la relación de intensidad media fluorescente medida después de la inducción, dividida entre el nivel basal de la intensidad media fluorescente, se observó que, cuando se induce con 150 mM de NaCl, P_{ompC1} y P_{ompC3} presentaron relaciones de inducción en DH5\alpha de 1,7 y 2,4, respectivamente. De forma sorprendente, la relación de inducción para P_{ompC1} cuando se mide en CVD 908-htrA fue 4,4, y produjo una intensidad media máxima de la fluorescencia de 23,4 para estos experimentos. Aunque la relación de inducción para P_{ompC3} en CVD 908-htrA fue 6,7, la intensidad media de la fluorescencia de 17,1 fue menor que la medida para P_{ompC1}. Basándose en estos datos, parece que P_{ompC1} es el más fuerte y el controlado osmóticamente de los dos promotores de ompC. Por lo tanto, P_{ompC1} se escogió para la síntesis del intervalo más amplio posible de antígeno de ensayo heterólogo, para examinar los efectos de tales síntesis sobre la estabilidad
plasmídica.

Estos datos muestran claramente que, cuando conducen la expresión de gfpuv dentro de la cepa CVD 908-htrA de vectores vivos, P_{ompC1} y P_{ompC3} son inducibles con la osmolaridad creciente, aunque el nivel basal de transcripción es todavía digno de mención en ambos casos. Los resultados observados en condiciones de baja molaridad apoyan todavía las observaciones, usando medios sólidos, de que P_{ompC1} dirige la expresión de antígenos heterólogos de forma superior a P_{ompC3}. Puesto que se observó que P_{ompC3} presenta el sitio de BglII 3' terminal pretendido, que no se detectó para P_{ompC1}, se determinó la secuencia nucleotídica para P_{ompC1} para detectar quizás una mutación o mutaciones de punto que pudiesen explicar la fortaleza de P_{ompC1}. Las únicas diferencias identificadas estaban localizadas en el término 3' del casete. La secuencia pretendida dentro de esta región fue 5'-...catataacAGATCTtaatcatccacAGGAGGatatctgATG-3' (SEC ID nº. 4) (de izquierda a derecha, la mayúscula representa el sitio de BglII, el sitio de unión a ribosoma, y el codón de partida de GFPuv, respectivamente); la secuencia real demostró ser 5'-...catataacAGATC GATCT taa A catccacAGG
AGG A t A tctgATG-3 (SEC ID nº. 5) (representándose las bases insertadas o cambiadas medaine una mayúscula en negrita subrayada). Estos cambios detectados en la secuencia del promotor ompC1 son aparentemente responsables del incremento de la fuerza observada de P_{ompC1} mediante un mecanismo desconocido, puesto que ni la secuencia del promotor ompC básica, ni el sitio de unión a ribosoma optimizado han sido alterados espontáneamente.

6.3 Orígenes de replicación y casetes de selección

El éxito de expresar antígenos heterólogos potencialmente tóxicos o de otro modo problemáticos en CVD 908-htrA depende del número de copias del plásmido de expresión. Además, las respuestas inmunitarias observadas frente a un antígeno heterólogo dado están afectadas por el número de copias del gen o genes que codifican el antígeno, provocando los antígenos cromosómicamente expresados respuestas inmunitarias más pobres en comparación con la expresión a base de plásmidos.

Una respuesta inmunitaria optimizada dependerá de la expresión basada en plásmidos de múltiples copias del antígeno o antígenos heterólogos a partir de plásmidos con el número de copias apropiado.

Puesto que el número de copias apropiado para un gen heterólogo dado no se puede conocer a priori, la presente invención proporciona un conjunto de plásmidos de expresión que contienen los orígenes de replicación oriE1 (amplificado a partir de pAT153; número de copias \sim60), ori15A (amplificado a partir de pACYC184; número de copias \sim15), y ori101 (amplificado a partir de pSC101; número de copias \sim5). Estos casetes de replicación autocontenidos están todos portados sobre fragmentos de BglII-BamHI, y se representan para un conjunto de 3 plásmidos de expresión con resistencia a tetraciclina mostrados en las Figuras 1A-1C.

Se analizó, mediante citometría de flujo, la expresión del casete de expresión de gfpuv controlado por P_{ompC1}, contenido en estos plásmidos de expresión. Estos experimentos se diseñaron para detectar si las diferencias a nivel de la fluorescencia observada se podrían correlacionar con el número de copias esperado de un plásmido de expresión dado. Se hicieron pasar cepas de CVD 908-htrA que portan pGEN2, pGEN3 y pGEN4, sobre el medio rico SuperAgar suplementado con DHB y 20 \mug/ml de tetraciclina cuando fuese apropiado. Se usó SuperAgar debido a que es un medio muy rico (3X de agar de LB). Las placas se incubaron a 30ºC para reducir la toxicidad de la síntesis de GFP y permitir que las bacterias crezcan lujosamente sobre las placas. Las colonias aisladas se inocularon entonces en 45 ml de SuperBroth suplementado con DHB y 20 \mug/ml de tetraciclina cuando fuese apropiado, y se incubaron a 37ºC durante 16 h. Las bacterias se concentraron mediante centrifugación y se resuspendieron en 1 ml de PBS estéril, pH = 7,4, y se diluyeron 1:100 en PBS, pH = 7,4, antes del análisis de FACS. Las bacterias se analizaron mediante citometría de flujo, como se describe anteriormente, para dos experimentos de crecimiento independientes, y los resultados se presentan en la Tabla 4 al final de esta sección.

Estos datos apoyan la conclusión de que la sobreexpresión de GFPuv en CVD 908-htrA es tóxica para la bacteria. Puesto que el número teórico de copias aumenta para los plásmidos pGEN4, pGEN3, y pGEN2 que expresan GFPuv en condiciones de crecimiento idénticas, a partir del promotor P_{ompC1} idéntico, disminuye el porcentaje de la población en crecimiento que fluorece. Se espera que las bacterias "dim" no sean bacterias viables y que ya no contengan el plásmido de expresión, puesto que estos cultivos se hicieron crecer en presencia de 20 \mug/ml de tetraciclina. Sin embargo, se observa que, cuando se hacen pasar sobre medio sólido y se hacen crecer a 37ºC durante 24-36 h, CVD 908-htrA(pGEN2) crece malamente y no produce colonias aisladas, mientras que CVD 908-htrA(pGEN3) y CVD 908-htrA(pGEN4) crecen bastante bien y producen colonias aisladas que fluorecen
intensamente.

GFPuv se emplea en la presente memoria como representante de otros antígenos heterólogos problemáticos que sería de interés incluir en un vector vivo bacteriano, tal como el vector vivo a base de S. typhi; sin embargo, se apreciará que GFPuv se puede sustituir por cualquier antígeno proteínico o peptídico no metabólico.

Los datos anteriores muestran que aunque el uso de plásmidos de expresión de número medio de copias que contienen replicones oriE1 puede ser utilizable en la expresión de algunos antígenos, la expresión de antígenos de mayor toxicidad se expresará de forma más exitosa a partir de plásmidos con menor número de copias que emplean orígenes de replicación que producen números medios de copias entre 2 y 30, tales como los orígenes de replicación ori101 u ori15A.

4

6.4 El lugar de exterminio post-segregacional antisentido hok-sok

Usando la reacción en cadena de polimerasa, se amplificaron los genes de PSK de hok-sok, usando el plásmido R de resistencia a múltiples antibióticos pR1 como el molde en estas reacciones. Todos los intentos iniciales para clonar este lugar sobre plásmidos de números elevados o medios de copias no tuvieron éxito. A fin de seleccionar directamente el lugar de hok-sok durante la subclonación, se diseñó un conjunto de cebadores para uso en reacciones de PCR que solapan, de forma que el producto final fue un fragmento que contiene una fusión genética del lugar de hok-sok a partir de pR1 y un gen tetA sin promotor procedente de pBR322 que codifica resistencia a tetraciclina. Este casete se manipuló mediante ingeniería de forma que la transcripción del gen hok continuase en tetA; los dos lugares dentro de este casete se separaron mediante un sitio de restricción de XbaI para manipulaciones
futuras.

La construcción de este casete no sólo permitió la selección directa del lugar de hok-sok, sino también permitió la confirmación de que la función de PSK operaría en CVD 908-htrA de S. typhi. Después de la electroporación de plásmidos que portan el casete en CVD 908-htrA, los transformantes se podrían seleccionar usando tetraciclina. La recuperación exitosa de colonias aisladas indica la síntesis exitosa del ARNm de hok-tetA, y la síntesis exitosa del ARN de sok antisentido para evitar la producción y síntesis de Hok, que mataría a la bacteria. La recuperación del casete de hok-sok-tetA fue después simple, y se incorporó fácilmente en los plásmidos de expresión para crear el casete de marcador seleccionable de los plásmidos pGEN2, pGEN3, y pGEN4 representados en las Figuras
1A-1C.

Después se iniciaron experimentos para determinar el efecto de la función de PSK de hok-sok sobre la estabilidad de plásmidos de expresión que contienen oriE1 y el marcador de resistencia bla que codifica \beta-lactamasa, que confiere resistencia a carbenicilina. El casete de hok-sok se insertó en el plásmido de expresión pTETnir15 a base de pAT153, en el que el casete del antígeno heterólogo pnir15-toxC se sustituyó por el casete de P_{ompC1}-gfpuv, creando los plásmidos pJN72 (sin hok-sok) y pJN51 (con hok-sok). Se creó un conjunto adicional de plásmidos sustituyendo P_{ompC1} por el promotor más débil P_{ompC3}, creando pJN10 y pJN12; las estructuras de estos cuatro plásmidos isogénicos se representan en la Figura 2. Se hicieron pasar cepas de CVD 908-htrA, que portan pJN72, pJN51, pJN10, o pJN12, sobre el medio rico SuperAgar suplementado con DHB y 100 \mug/ml de carbenicilina, y las placas se incubaron como antes en busca de los plásmidos de pGEN a 30ºC, para reducir la toxicidad de la síntesis de GFPuv y permitir que las bacterias crezcan lujosamente sobre las placas.

Después, las colonias aisladas se inocularon en 45 ml de caldo Super suplementado con DHB y 100 \mug/ml de carbenicilina, y se hicieron crecer a 37ºC durante 24 horas para el análisis mediante citometría de flujo de fluorescencia. Se llevó a cabo un segundo experimento independiente, exactamente igual que el primero, excepto que las colonias aisladas se suspendieron en 500 \mul de caldo Super, y cada uno de 250 \mul se inoculó en 45 ml de cultivos de caldo Super pareados, con o sin 300 mM de NaCl añadido para inducir los casetes de P_{ompC}-gfpuv; los cultivos se incubaron a 37ºC durante 48 h, y se analizaron nuevamente mediante citometría de flujo; los resultados de ambos experimentos se presentan en la Tabla 5. Los histogramas de fluorescencia para plásmidos de expresión no inducidos e inducidos procedentes del experimento 2 se representan en las Figuras 3A-3H.

5

Estos resultados de la citometría de flujo se pueden explicar según lo siguiente: la expresión de GFPuv (u otro antígeno heterólogo potencialmente perjudicial) a partir de un plásmido de expresión de múltiples copias, tal como pJN72, aumenta el estrés metabólico sobre el vector vivo de CVD 908-htrA(pJN72), y aumenta la inestabilidad plasmídica en ausencia de selección. Puesto que el marcador seleccionable del plásmido de expresión codifica la enzima segregada \beta-lactamasa, entonces, a medida que aumenta el tiempo, disminuye la concentración de carbenicilina en el medio circundante, disminuye la presión selectiva, y aumenta la frecuencia de pérdida de plásmido; sin embargo, puesto que están implicados plásmidos de múltiples copias, relativamente pocas bacterias tienen éxito a la hora de perder todos los plásmidos residentes, pero el número medio de copias de pJN72 por bacteria
cae.

La cuantificación mediante citometría de flujo de la producción de GFPuv para una población no inducida de CVD 908-htrA(pJN72) en crecimiento sana indica que la mayoría de las bacterias expresan GFPuv, y se detectan pocas células que no fluorescen (Figura 3A). Sin embargo, el incremento de la producción de GFPuv mediante inducción del casete de P_{ompC1}-gfpuv aumenta el estrés metabólico sobre CVD 908-htrA(pJN72), y aunque se duplica la producción de GFP, el porcentaje de bacterias no fluorescentes aumenta a medida que se pierden más plásmidos de la población (Figura 3B).

En una población similar de CVD 908-htrA(pJN51) en crecimiento, cada bacteria porta plásmidos de múltiples copias que codifican tanto GFPuv como una función de PSK. La frecuencia de pérdida de plásmido para pJN51 sigue siendo la misma que para pJN72, pero en este caso, a medida que las bacterias individuales pierden copias del plásmido de expresión, se perturba la estequiometría 1:1 entre los niveles de ARNm de hok y de sok, y la producción de Hok conduce a la muerte celular; por lo tanto, las únicas bacterias de CVD 908-htrA(pJN51) que crecerán rápidamente serán aquellas que retienen todos sus plásmidos de expresión. En consecuencia, no es sorprendente que la cuantificación mediante citometría de flujo de la producción de GFPuv para una población no inducida de CVD 908-htrA(pJN51) en crecimiento sana ahora detecta una población de bacterias que fluorescen, que presentan niveles de fluorescencia de GFPuv equivalentes a los observados para CVD 908-htrA(pJN72) que se hace crecer en condiciones de inducción (Figura 3C frente a Figura 3B); sin embargo, el porcentaje de bacterias que no fluorescen se eleva hasta aproximadamente la mitad de la población global de organismos.

El aumento de la producción de GFPuv en esta población, mediante inducción del casete de P_{ompC1}-gfpuv en CVD 908-htrA(pJN51), aumenta nuevamente el estrés metabólico sobre el vector vivo, pero ahora el porcentaje de bacterias no fluorescentes supera casi completamente las pocas bacterias que fluorescen, puesto que se pierden presumiblemente muchos plásmidos de la población, y mueren las bacterias (Figura 2D).

Sería de esperar que si se usa un promotor más débil para controlar la expresión de GFPuv, la fluorescencia global de la población disminuiría (en comparación con la observada para una población similar de organismos que se hace crecer con un promotor potente que expresa GFPuv en idénticas condiciones), y el porcentaje de bacterias no fluorescentes debería de caer debido a la caída global en la síntesis de GFPuv. Sin embargo, como se observa en las Figuras 3E-3H, el uso del casete de P_{ompC3}-gfpuv más débil no mejoró significativamente la viabilidad de bacterias inducidas que portan un sistema de exterminio, incluso aunque se redujo la expresión global de GFPuv.

Se concluye que, a fin de maximizar el porcentaje de una población de vectores vivos que expresan el antígeno heterólogo de elección, no es suficiente sólo incorporar una función de PSK en un plásmido de expresión dado, tanto si es un marcador de resistencia a fármacos, el sistema asd, un sistema ssb alternativo, o el sistema de exterminio hok-sok. Además de optimizar el número de copias y los niveles de expresión, también se deben de mejorar las frecuencias de segregación de estos plásmidos, para asegurar que cada célula hija en una población activamente en crecimiento heredará por lo menos un plásmido de expresión, y aquellos que no lo hagan serán exterminados y eliminados de la población. Por lo tanto, está dentro del alcance de la presente invención proporcionar un plásmido de expresión que tiene una función de PSK y que tiene además un número de copias y/o niveles de expresión optimizados, acoplados con la incorporación de una o más funciones de SEG.

6.5 Sistema de exterminio a base de la complementación

También está dentro del amplio alcance de la presente invención proporcionar un plásmido de expresión que comprende un sistema de exterminio a base de la complementación, por ejemplo un sistema que implica la supresión del lugar ssb cromosómico de CVD 908-htrA mediante recombinación homóloga, y la transcomplementación de esta lesión usando plásmidos de múltiples copias que portan ssb funcional.

Para llevar a cabo tales construcciones se requiere la clonación de la sección pertinente del cromosoma de S. typhi que engloba el gen ssb y las secuencias de flanqueo, en la que se pueden introducir supresiones específicas para mutagénesis cromosómica.

Desde la presentación original, se ha realizado un progreso sustancial en la secuenciación del cromosoma de Salmonella typhi en el Sanger Centre en Londres. El Sanger Centre es un centro de investigación genómico creado en 1992 por Wellcome Trust y el Medical Research Council a fin de fomentar nuestro conocimiento de los genomas. Entre otros proyectos, el Sanger Centre está secuenciando el genoma de 4,5 Mb de S. typhi, en colaboración con Gordon Dougan del Departamento de Bioquímica, Imperial College, Londres. Están secuenciando la cepa CT18, una cepa muy patógena, resistente a múltiples fármacos, aislada de un paciente tifoide en Cho Quan Hospital, Ho Chi Minh City, Vietnam. Se sabe que esta cepa aloja pVN100 (un plásmido de resistencia a múltiples fármacos, de 130 kb) y un plásmido de 80 kb críptico. El genoma está siendo secuenciado mediante un enfoque de pistola de disparo genómico completo, usando una librería de pUC de 2 kb, generado en el laboratorio a partir de ADN cromosómico suministrado por el laboratorio del Prof. Dougan. Cada inserto está siendo secuenciado una vez desde cada extremo. La fase de pistola de disparo está ahora terminada, y el acabado ha comenzado. En el presente, hay 60 contigs a lo largo de 1 kb en la base de datos; un total de 5,106 Mb de la secuencia se ensambló a partir de 87.331
lecturas.

Basándose en resultados actualizados presentados el 4 de octubre de 1999, se ha identificado el Contig 343, que contiene el lugar ssb de S. typhi, y las secuencias de flanqueo críticas dentro de una región de 205.199 pb. Se han diseñado los cebadores 1 y 4 (enumerados más abajo) para amplificar, mediante PCR, un fragmento de 3535 pb del cromosoma de S. typhi en el que el lugar ssb está flanqueado por 1,5 kb de secuencia cromosómica. Esta simetría de flanqueo se requiere para frecuencias de intercambio de genes o segmentos óptimos entre cromosomas homólogos, para introducir el casete de sacB-neo contraseleccionable, y sustituir ssb. Usando la metodología previamente presentada, se usarán los cebadores 1 y 2 para manipular mediante ingeniería un casete de EcoRI-XmaI de 1,5 kb próximo a 5', en dirección 5' de ssb. Los cebadores 3 y 4 se usarán para generar el casete de XmaI-EcoRI de 1,5 kb distal de 3', en dirección 3' de ssb; ambos casetes de 1,5 kb se ligarán juntos, formando el fragmento de EcoRI de 3 kb que contiene un único sitio de XmaI exactamente en el centro del casete. El casete de sacB-neo se puede insertar ahora fácilmente en el sitio de XmaI, para completar la construcción del casete de mutagénesis a insertar en pCON (previamente descrito en la primera presentación). El casete de ssb-1 de complementación requerido se construirá usando los cebadores 5 y 6 como un casete de NheI para la sustitución de los marcadores de resistencia a fármacos dentro de los casetes de XbaI-SpeI de pGEN211, pGEN222, pGEN206, o cualquier versión posterior de los plásmidos de expresión detallados en la presente memoria.

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Cebador 1

100

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Cebador 2

101

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Cebador 3

102

\newpage

Cebador 4

103

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Cebador 5

104

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Cebador 6

105

\vskip1.000000\baselineskip

6.6 Estabilidad de los plásmidos de expresión en ausencia de selección

A fin de desarrollar un sistema de estabilización de plásmidos no catalítico, para potenciar la estabilidad de plásmidos de expresión de múltiples copias que codifican antígenos extraños en CVD 908-htrA, se iniciaron experimentos para monitorizar la estabilidad plasmídica cuantificando la expresión de GFPuv mediante citometría de flujo cuando las cepas se hacen pasar en ausencia de selección de antibióticos. Estos experimentos se diseñaron para superar 3 cuestiones fundamentales: 1] ¿cuál es el efecto del nivel de inducción de P_{ompC1} sobre la estabilidad de plásmidos que codifican un antígeno heterólogo tal como GFPuv?, 2] ¿cuál es el efecto del número de copias sobre la estabilidad de plásmidos que expresan GFPuv?, 3] ¿cómo afectan las funciones de estabilización hok-sok, par y parA a la retención plasmídica, tanto como componentes individuales como sinérgicamente?.

Se llevaron a cabo experimentos iniciales de citometría de flujo en los que CVD 908-htrA portaba replicones con el origen de replicación oriE1, ori15A, u ori101. Se determinó rápidamente que los replicones que portan los orígenes oriE1 de mayor número de copias eran inestables, incluso cuando las cepas se hacían crecer en presencia de selección de antibióticos. Los resultados de la citometría de flujo indicaron que, cuando se cultivaban en presencia de carbenicilina, el porcentaje de las poblaciones bacterianas que ya no expresaban GFPuv detectable oscilaba desde aproximadamente 50% para pGEN71 (que porta hok-sok) y pGEN84 (hok-sok + par) hasta 62% para pGEN211 (hok-sok + par + parA). Puesto que los replicones que portan un origen oriE1 no permitieron claramente la síntesis óptima del antígeno de ensayo de GFPuv heterólogo dentro de la mayoría de una población en crecimiento de bacterias vectoriales vivas, esta serie de plásmidos de expresión no se examinó más.

Después se examinaron CVD 908-htrA que portan plásmidos de expresión con un origen ori15A. Las cepas se inocularon en 25 ml de cultivos de 1 X LB + DHB (sin selección de antibiótico) que contiene 50 mM, 150 mM, o 300 mM de NaCl. Los cultivos se incubaron durante 24 h a 37ºC/250 rpm, se diluyeron 1:1000 en medio reciente de osmolaridad idéntica, y se incubaron durante otras 24 h; las muestras de todos los cultivos se analizaron para determinar los niveles de síntesis de GFPuv mediante citometría de flujo. Los resultados para la primera pasada en ausencia de selección se enumeran en la Tabla 6, y los histogramas que representan estos datos se muestran en la Figura 8.

\newpage

La Tabla 6 muestra la estabilidad dentro de CVD 908-htrA de los replicones ori15A, que contienen sistemas de estabilización de plásmidos de complejidad creciente, que se hacen crecer sin selección y en presencia de una osmolaridad creciente.^{1}

6

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{1}  Estos datos están representados como histogramas en la
Figura 8.\cr   ^{2}   \begin{minipage}[t]{150mm} Todas las cepas
se hicieron pasar a partir de lotes maestros congelados sobre 2 X de
agar de LB suplementado  con DHB y 50  \mu g/ml de carbenicilina, y
se incubaron durante 36 h a 30 ^{o}C . Las colonias aisladas se
reunieron  en 300  \mu l de 1 X de caldo de LB suplementado con DHB,
a partir de los cuales se inocularon 25  \mu l en  25 ml de 1 X de
caldo de LB que contiene DHB y 50 mM, 150 mM, o 300 mM de NaCl; los
cultivos se incubaron  a 37 ^{o}C , 250 rpm durante 24 h. Para los
resultados presentados en esta tabla, las bacterias se peletizaron 
entonces, se resuspendieron en 1 ml de PBS, pH 7,4, y después se
diluyeron 1:1000 en PBS para el análisis  mediante citometría de
flujo.
\end{minipage} \cr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

En general, a medida que aumenta la osmolaridad y se eleva la inducción de P_{ompC1}, cae el porcentaje de la población de vectores vivos que expresan GFPuv; no obstante, el nivel medio de la intensidad de fluorescencia aumenta según lo esperado. Por ejemplo, en presencia de 50 mM de NaCl, el 80,5% de una población de CVD 908-htrA(pGEN121) expresa GFPuv con una intensidad media de fluorescencia de 53,3. A medida que aumenta la concentración de NaCl hasta 300 mM de NaCl, el porcentaje de la población que expresa GFPuv cae hasta 56,7%; no obstante, la intensidad media de la fluorescencia se eleva hasta 105,3. Sin embargo, es notable que, para cepas que portan pGEN222 con un sistema de estabilización de plásmidos completo (es decir, hok-sok + par + parA), el porcentaje de la población que expresa el antígeno heterólogo permanece a aproximadamente 95%, mientras que la intensidad media de la fluorescencia aumenta desde 52,1 (50 mM de NaCl) hasta 89,2 (300 mM de NaCl). Se observó que, con la pasada posterior de estas cepas durante 24 horas adicionales en ausencia de selección de antibiótico, menos del 5% de las bacterias continuó expresando GFPuv funcional. Las tiras de estos cultivos sobre medio sólido, antes del análisis de flujo, indicaron que las bacterias no fluorescentes permanecían viables, pero eran sensibles a la selección mediante antibióticos. Cuando las bacterias que no fluorescen se clasificaron y se colocaron en placas, se confirmó que eran sensibles a antibióticos y no eran fluorescentes cuando se irradiaban con luz ultravioleta, indicando la pérdida de plásmidos
residentes.

Un experimento de pasada que implica CVD 908-htrA que porta plásmidos de expresión con un origen ori101 no detectó ninguna pérdida significativa de la expresión de GFPuv después de la pasada de las cepas durante 48 h sin selección, independientemente de la osmolaridad. Por lo tanto, las cepas se hicieron pasar en un experimento separado durante 96 h (es decir, 4 x 24 h) en presencia de 50, 150 ó 300 mM de NaCl. Las poblaciones se analizaron mediante citometría de flujo después de las pasadas 3 y 4, y los resultados se registraron en la Tabla 7.

\global\parskip0.900000\baselineskip

La Tabla 7 muestra la estabilidad dentro de CVD 908-htrA de los replicones ori101, que contienen sistemas de estabilización de plásmidos de complejidad creciente, que se hacen crecer sin selección y en presencia de una osmolaridad creciente.

7

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{1}   \begin{minipage}[t]{150mm} Todas las cepas se hicieron
pasar a partir de lotes maestros congelados sobre 2 X de agar de LB
suplementado  con DHB y 50  \mu g/ml de carbenicilina, y se
incubaron durante 36 h a 30 ^{o}C . Las colonias aisladas se
reunieron  en 300  \mu l de 1 X de caldo LB suplementado con DHB, a
partir de los cuales se inocularon 25  \mu l en 25  ml de 1 X de
caldo de LB que contiene DHB y 50 mM, 150 mM ó 300 mM de NaCl; los
cultivos se incubaron a 37 ^{o}C ,  250 rpm durante 24 h (definido
en la presente memoria como pasada número 1). Para la pasada número
2, se inocularon  25  \mu l de la pasada número 1 en 25 ml (es
decir, dilución 1:1000) de medio idéntico, y se incubaron a
37 ^{o}C ,  250 rpm durante 24 h adicionales, sin selección. Las
pasadas 3 y 4 se llevaron a cabo de manera idéntica,  pero después
de que se creó la siguiente pasada, las bacterias que quedan se
peletizaron entonces, se resuspendieron  en 1 ml de PBS, pH 7,4, y
después se diluyeron 1:1000 en PBS para el análisis mediante
citometría de flujo. \end{minipage} \cr   ^{2}  ND = no
realizado.\cr}

Los vectores vivos que portan replicones ori101 inestabilizados pierden eventualmente la capacidad de sintetizar el antígeno heterólogo después de 96 h. Por ejemplo, después del crecimiento durante 96 h en presencia de 50 mM de NaCl, sólo el 10,9% de CVD 908-htrA(pGEN132) expresó GFPuv y fluoresció. A medida que la concentración de NaCl en el medio aumentó hasta 150 mM, la fluorescencia se detectó en sólo 7,6% de la población; curiosamente, a 300 mM de NaCl, el porcentaje se recuperó hasta 51,3% de bacterias que fluorescen. De forma notable, CVD 908-htrA que porta pGEN142 (hok-sok) o pGEN206 (hok-sok + parA) retuvo la síntesis de GFPuv en más del 95% de la población después de 3 pasadas (72 h), independientemente de la osmolaridad (véase la Tabla 7). El porcentaje de CVD 908-htrA(pGEN142) que fluoresce permaneció casi a este nivel después de 4 pasadas (96 h), mientras que disminuyó ligeramente para CVD 908-htrA(pGEN206).

Tomados en conjunto, estos datos muestran que a medida que se reduce el número de copias, aumenta la estabilidad aparente de plásmidos residentes y la habilidad de un vector vivo para sintetizar un antígeno heterólogo tal como GFPuv; puesto que los sistemas de estabilización de plásmidos se acumulan en un plásmido dado, la estabilidad aparente y la síntesis de antígenos se potencian adicionalmente. Además, a medida que aumenta la inducción de P_{ompC1} y la producción concomitante del antígeno heterólogo, el porcentaje de una población en crecimiento que sigue siendo capaz de sintetizar el antígeno se puede reducir drásticamente.

6.7 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

Todas las construcciones plasmídicas se recuperaron en la cepa DH5\alpha o DH5\alphaF'IQ de Escherichia coli (Gibco BRL). La construcción del casete génico de hok-sok usó ADN molde de pR1 aislado de la cepa J53(pR1) de E. coli, una donación generosa por parte de James B. Kaper. El vector vivo de CVD 908-htrA de S. typhi es un derivado auxotrófico de la cepa Ty2 de tipo salvaje, con supresiones en aroC, aroD, y htrA (Tacket et al. 1997b). Todas las cepas usadas para el examen de la estabilidad plasmídica se hicieron crecer en medios suplementados con ácido 2,3-dihidroxibenzoico (DHB), como se describió previamente (Hone et al. 1991; Galen et al. 1997). Cuando se hicieron crecer en medio sólido, las cepas de CVD 908-htrA portadoras de plásmidos se hicieron pasar desde lotes maestros congelados (-70ºC) sobre 2 X de agar de Luria-Bertani que contiene (por litro) 20 g de Bacto triptona, 10 g de extracto de levadura Bacto, y 3 g de NaCl (2 X de agar de LB), más carbenicilina a una concentración de 50 \mug/ml. Las placas se incubaron a 30ºC durante 24-36 h para obtener colonias aisladas de \sim2 mm de diámetro; las cepas se incubaron a 30ºC para minimizar la toxicidad de la expresión de GFPuv en CVD 908-htrA.

Cuando se hicieron crecer en medio líquido, los cultivos se incubaron a 37ºC, 250 rpm durante 16-24 h. Para examinar la inducción osmótica del promotor ompC (P_{ompC}) dentro de DH5\alpha de E. coli o de CVD 908-htrA, las cepas se hicieron crecer en caldo nutriente Bacto (Difco) que contiene DHB y NaCl o sacarosa; los cultivos se suplementaron con 50 \mug/ml de carbenicilina o con concentraciones crecientes de canamicina cuando se examinaron los casetes de P_{ompC}-aphA-2. Para la cuantificación de la síntesis de GFPuv usando citometría de flujo, se inocularon 6-8 colonias aisladas, procedentes de lotes maestros que se hacen pasar sobre 2 X de agar de LB como antes, en 25 ml de 1 X caldo de LB suplementado con 50 \mug/ml de carbenicilina, cuando se desee, y NaCl a concentraciones crecientes, para incrementar la inducción de los promotores de ompC. Los cultivos se incubaron a 37ºC, 250 rpm durante 16-24 h antes de peletizar las bacterias para la citometría de flujo como se describe más abajo.

6.8 Técnicas genéticas moleculares

Se usaron técnicas estándares para la construcción de los plásmidos representados en la presente memoria (Sambrook et al., 1989). Excepto que se señale de otro modo, se usó ADN polimerasa de Taq nativa (Gibco BRL) en las reacciones en cadena de polimerasa (PCR). S. typhi se preparó para electroporación de plásmidos recombinantes después de cosechar a partir de caldo de LB de MIller (Gibco BRL) suplementado con DHB; después de peletizar las bacterias, las células se lavaron tres veces con un volumen de cultivo de agua destilada estéril, y se resuspendieron en agua destilada estéril hasta un volumen final de 1/100 del volumen de cultivo original. La electroporación de las cepas se realizó en un aparato Gene Pulser (Bio-Rad) ajustado a 2,5 kV, 200 \Omega, y 2,5 \muF. Después de la electroporación, las bacterias se repararon usando medio SOC, e incubando a 37ºC, 250 rpm durante 45 minutos; las bacterias se colocaron entonces en placas sobre 1 X de medio de LB que contiene DHB más 50 \mug/ml de carbenicilina, y se incubaron a 30ºC durante 24 h. Las colonias aisladas se limpiaron entonces sobre 2 X LB suplementado, y se incubaron a 30ºC durante 16 h. Se prepararon lotes maestros congelados cosechando bacterias en medio SOC sin suplementación adicional, y congelando a -70ºC.

6.9 Construcción de vectores de expresión

Los vectores de expresión enumerados en la siguiente Tabla 8 se prepararon durante el transcurso del reciente trabajo.

8

6.9.1 Construcción de pJN1 y pJN2

Los plásmidos de expresión construidos para estos estudios están compuestos de 3 casetes básicos que codifican 1] la expresión de un antígeno heterólogo, 2] un origen de replicación plasmídico, y 3] funciones de selección y estabilización. Para lograr esto, se construyó un replicón básico en el que estos casetes se separaron mediante sitios de restricción únicos. Los cebadores usados en la construcción de los

\hbox{casetes plasmídicos se exponen  en la siguiente Tabla
9:}

\global\parskip1.000000\baselineskip

9

10

11

12

Se remodificó mediante ingeniería genética pTETnir15 (véase la Tabla 8; Oxer et al. 1991) de tal manera que el origen de replicación de oriE1 y el gen bla se separaron mediante un único sitio SpeI. Para este fin, se sintetizó un casete de oriE1 mediante PCR usando Vent polimerasa con cebadores 1 y 2, y pCVD315 (Galen et al. 1990) como el molde. El fragmento de 735 pb resultante porta los sitios SpeI y BglII modificados mediante ingeniería próximos a 5' al promotor que controla la transcripción de ARN II, y un sitio AvrII modificado mediante ingeniería de 675 bases procedente de estos sitios. Se llevó a cabo una reacción de PCR separada usando cebadores 3 y 4 para crear un casete de bla de 1234 pb que contiene un sitio XbaI modificado mediante ingeniería próximo a 5' al sitio de EcoRI original. Los productos de estas dos reacciones de PCR se purificaron en gel, y se usaron en una PCR de solapamiento, con los cebadores 1 y 4, para producir un fragmento oriE1-bla de 1916 pb final que se autoligó para crear pJN1. El fragmento P_{nir15}-toxC a partir de pTETnir15 se cortó como un fragmento EcoRI (digestión parcial)-AvaI, en el que el término AvaI se pulió, y se insertó en la región de clonación múltiple de pSL1180 (Brosius, 1989) escindida con EcoRI y StuI; este casete se volvió a cortar entonces como un fragmento de EcoRI (digestión parcial)-AvrII, y se insertó en pJN1 escindido con EcoRI-AvrII, creando pJN2 (véase Tabla 8).

6.9.2 Construcción de pGFPompC

Para facilitar la identificación sistemática de un alelo de P_{ompC} osmóticamente regulado funcional a partir de Escherichia coli, se construyó un casete de aphA-2, que codifica resistencia a los aminoglucósidos neomicina y canamicina (Shaw et al. 1993). Se llevó a cabo una reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores 5 y 6 con el molde pIB279 (Blomfield et al. 1991), para generar un producto de 1044 pb, a partir del cual se escindió un fragmento de BglII-NheI de aphA-2 de 903 pb sin promotor, para la sustitución de un casete de BglII-NheI toxC que codifica el fragmento C de la toxina del tétano en pTETnir15. El promotor P_{nir15} anaeróbicamente regulado se sustituyó por un alelo de EcoRI-BglII P_{ompC} de 459 pb construido usando los cebadores 7 y 8 con ADN molde cromosómico procedente de DH5\alpha de E. coli, para crear pKompC. Después de confirmar la inducción osmótica de P_{ompC} examinando el incremento de la resistencia a canamicina con la osmolaridad creciente, el casete de aphA-2 se sustituyó entonces por un gen que codifica un alelo de GFPuv optimizado en el codón procariota (Clontech; Crameri et al. 1996). El gen gfpuv se recuperó mediante PCR usando los cebadores 9 y 10 con el molde pGFPuv para generar un fragmento de BglII-NheI de 751 pb que se insertó en pKompC, para generar pGFPompC. Las colonias se identificaron en busca de GFPuv funcional, y después las colonias más brillantes se examinaron para determinar la inducción de la fluorescencia con concentraciones crecientes de NaCl. Se escindió un casete de P_{ompC1}-gfpuv a partir de pGFPompC1 como un fragmento de EcoRI-NheI, y se insertó en un derivado de pJN2 escindido con EcoRI-NheI para crear pJJ4.

6.9.3 Construcción de pNRB1, pGEN2, pGEN3, y pGEN4

Puesto que se pretende que el número de copias no esté influido por la transcripción que se origina a partir de promotores fuera del origen de replicación, fue necesario asegurar que todos los casetes de replicación estuvieran flanqueados en ambos extremos por terminadores de la transcripción. Debido a que los casetes del origen y del antígeno de pJN2 están separados por el terminador trpA, sólo fue necesario insertar un terminador adicional entre los casetes del origen y de bla.

Para facilitar la construcción de plásmidos adicionales más tarde, se creó un casete de terA-T1T2. Primero se escindió pYA292 (Galan et al. 1990) con HindIII y BglII, y el fragmento del terminador T1T2 se pulió y se insertó en el sitio SmaI de la región de clonación múltiple de pBluescript II KS (Stratagene); cuando se identificó la orientación apropiada, este casete se volvió a cortar como un fragmento de BamHI-PstI, y se insertó en pIB307 (Blomfield et al. 1991) escindido con BamHI-PstI, creando pJG14. Después se determinó, mediante análisis de secuencias, que el casete había sufrido una supresión de aproximadamente 100 pb, eliminando la mitad del terminador T2.

Usando pBR322 como molde, se usaron los cebadores 11 y 12 para sintetizar un fragmento de tetA BglII de 1291 pb. Este fragmento tetA BglII se insertó entonces en el sitio de BamHI de pJG14 de forma que la transcripción del gen tetA termine en el terminador T1T2, creando pJG14tetA. Finalmente, este casete de tetA-T1T2 se escindió de pJG14tetA como un fragmento de EcoRI-PstI en el que el sitio de PstI se había eliminado puliéndolo; el fragmento resultante se insertó en pJJ4, se escindió con SpeI, se pulió y se volvió a escindir con EcoRI para sustituir el casete de bla y crear pNRB1.

La función de exterminio post-segregacional no catalítica a incorporar en los sistemas de estabilización de plásmidos de los plásmidos de expresión descritos en la presente memoria fue el lugar hok-sok, procedente del factor R de resistencia a múltiples fármacos pR1. Los intentos iniciales en la recuperación del lugar de hok-sok después de la PCR no tuvieron éxito. Por lo tanto, fue necesario usar PCR de solapamiento para generar un casete en el que hok-sok se fusionó transcripcionalmente a un gen tetA sin promotor, de tal manera que la transcripción que se origina a partir del promotor hok continuase en tetA y diese como resultado un transcrito que codifica tanto Hok como resistencia a tetraciclina. El ADN plasmídico de pR1 se purificó a partir de J53(pR1) de E. coli, en la que pR1 codifica resistencia tanto a carbenicilina como a cloranfenicol. El fragmento de hok-sok de 640 pb se sintetizó usando los cebadores 13 y 14; se recuperó un fragmento de tetA de 1245 pb sin promotor en una PCR separada, usando los cebadores 15 y 12, con pNRB1 como molde. Los productos de estas dos reacciones de PCR se usaron entonces en una PCR de solapamiento, con los cebadores 12 y 13, para producir el fragmento de hok-sok-tetA de 1816 pb final. Este fragmento se insertó como un fragmento de EcoRI-SphI en pNRB1 escindido con EcoRI-SphI, regenerando el gen tetA y creando
pGEN1.

Entonces se construyó un conjunto de 3 plásmidos isogénicos, que difieren solamente en el número de copias, a partir de los cuales se pudiesen derivar todos los demás plásmidos de expresión. El casete del origen de replicación de BglII-AvrIIde pGEN1 se sustituyó por un casete de oriE1 procedente de pJN2, para generar pGEN2. Se sintetizó un casete de replicación ori15A mediante PCR, usando los cebadores 16 y 17, con pACYC184 como molde, para generar un fragmento de BamHI-AvrII de 629 pb, que se insertó en pGEN2 escindido con BglII-AvrII para generar pGEN3. Finalmente, se sintetizó un casete de replicación de ori101 mediante PCR usando los cebadores 18 y 19, con pSC101 como molde, generando un fragmento de BamHI-AvrII de 1949 pb que se insertó en pGEN2 escindido con BglII-AvrII para crear pGEN4.

6.9.4 Construcción de pJN5, pGEN51, pGEN91, y pGEN132

El conjunto principal de plásmidos de expresión isogénicos, a los que se añadieron secuencialmente elementos individuales de un sistema de estabilización de plásmidos, estaba compuesto de pGEN51 (que contiene oriE1), pGEN91 (que contiene ori15A), y pGEN132 (que contiene ori101). El replicón básico a partir del cual se construyeron estos 3 plásmidos fue pJN5, que se ensambló escindiendo el cartucho P_{ompC}-gfpuv con un fragmento de EcoRI-NheI a partir de pGFPompC para sustituir el casete de P_{nir15}-toxC de pJN2. La construcción de pGEN51 se logró entonces mediante eliminación del casete de replicación a partir de pGEN2 como un fragmento de BamHI, y la sustitución del origen de replicación dentro de pJN5, digerido con BglII y BamHI, regenerando de ese modo el gen gfpuv. La construcción de pGEN91 y pGEN132 se realizó de manera idéntica mediante corte de los casetes del origen como fragmentos de BamHI a partir de pGEN3 y pGEN4, respectivamente (véase la Figura 7 para la representación de plásmidos de expresión isogénicos basados en pGEN91).

6.9.5 Construcción de pJN6, pGEN71, pGEN111, y pGEN142

El lugar de hok-sok se insertó entonces como un fragmento de XbaI-SalI en pJN5 escindido con XbaI y SalI, regenerando nuevamente el gen gfpuv para crear pJN6 (véase la Tabla 2). La construcción de pGEN71, pGEN111, y pGEN142 se llevó a cabo entonces exactamente de igual manera que para pGEN51, pGEN91, y pGEN132, mediante inserción en pJN6 de casetes de origen como fragmentos de BamHI a partir de pGEN2, pGEN3, y pGEN4, respectivamente.

6.9.6 Construcción de pJN7, pGEN84, y pGEN121

La construcción de los plásmidos de expresión de oriE1 y ori15A que contienen un sistema de estabilización de plásmidos, compuesto tanto de un sistema de exterminio post-segregacional como de por lo menos una función de reparto, se intentó en primer lugar usando la función par procedente de pSC101. Se sintetizó un fragmento de BamHI-BglII de 377 pb usando los cebadores 18 y 20, con ADN molde de pSC101; este fragmento se insertó en pJN6 escindido con BglII, para crear pJN7. Al igual que en las construcciones anteriores, los casetes del origen procedentes de pGEN2 y pGEN3 se cortaron entonces como fragmentos de BamHI, y se insertaron en pJN7 digerido con BglII y BamHI, para crear pGEN84 y pGEN121.

6.9.7 Construcción de pJN8, pGEN183, pGEN193, pGEN206, pGEN211 y pGEN222

Los plásmidos de expresión finales se construyeron introduciendo el lugar de reparto activo parA procedente de pR1. Al igual que con hok-sok, los intentos iniciales por recuperar el lugar parA tras la PCR no tuvieron éxito. Fue necesario usar PCR de solapamiento para generar un casete de aph-parA, en el que aph y parA se transcribieron divergentemente y se separaron mediante sitios de XbaI y XhoI, para permitir subclonar el lugar de parA. Se sintetizó un fragmento de parA de 1737 pb usando los cebadores 21 y 22 con pR1 como molde; se recuperó un fragmento de aphA-2 de 1076 pb en una PCR separada, usando los cebadores 23 y 24, con pIB279 como molde. Los productos de estas dos reacciones de PCR se usaron entonces en una PCR de solapamiento, con los cebadores 22 y 23, para producir el fragmento de aphA2-parA de 2743 pb final. Este fragmento se insertó como un fragmento de EcoRI-SpeI de 2703 pb en pJN6. El casete de parA se volvió a cortar entonces como un fragmento de XhoI, y se insertó nuevamente en pJN6 escindido con XhoI, regenerando el gen gfpuv, y creando pJN8.

Los plásmidos que portan un sistema de estabilización de plásmidos compuesto de la función hok-sok de exterminio post-segregacional y parA se construyeron mediante corte de los casetes de BamHI-SpeI de oriE1 y ori15A procedentes de pGEN51 y pGEN91 respectivamente, y mediante inserción en pJN8 escindido con BamHI y SpeI para crear pGEN183 y pGEN193, respectivamente. Los plásmidos que contienen el complemento completo de las funciones de estabilización de hok-sok, par, y parA, se construyeron mediante inserción de casetes de origen que contienen par, tales como los casetes de BamHI-SpeI procedentes de pGEN84, pGEN121, y pGEN132, en pJN8 escindido con BamHI y SpeI para crear pGEN211, pGEN222, y pGEN206, respectivamente.

6.10 Cuantificación de GFPuv y de la estabilización de plásmidos

La cuantificación de GFPuv y de la estabilización de plásmidos se analizó midiendo la fluorescencia de vectores vivos que portan plásmidos, usando un sistema de citómetro de flujo/seleccionador de células Epics Elite ESP (Coulter), con un láser de argón que excita a las bacterias a 488 nm, detectándose las emisiones a 525 nm. Se peletizaron 25 ml de 1 X de cultivos de LB, que se hacen crecer como se describe anteriormente, y las bacterias se resuspendieron en 1 ml de PBS. Las células se diluyeron entonces 1:1000 en PBS antes de la determinación de recuentos viables y del análisis de flujo. Se usó dispersión de la luz directa frente a lateral, medida con amplificadores logarítmicos, para dejar pasar las bacterias. Se adquirió un mínimo de 50.000 casos de cada muestra, a una velocidad de recogida de aproximadamente 3500 casos por segundo. La intensidad media de la fluorescencia, para una población bacteriana dada, se determinó usando el Paquete de Análisis Mediante Programa de Ordenador Epics Elite. Los niveles de la autofluorescencia, determinados usando plásmido menos las cepas CVD 908-htrA de S. typhi y DH5\alpha de E. coli, se usaron para colocar marcadores que cuantifican los porcentajes de bacterias en una población dada que expresa GFPuv.

6.11 Conclusiones

El objetivo general de la investigación presentada en las Sección 6.6-6.10 fue investigar la factibilidad a la hora de desarrollar un sistema de estabilización de plásmidos para la estabilización de plásmidos de expresión de múltiples copias que codifican antígenos extraños en una cepa de vacuna de vector vivo de S. typhi, sin modificación adicional del cromosoma. La estabilización de plásmidos de expresión se potenció a dos niveles independientes. En primer lugar, se eliminó la dependencia de los sistemas de estabilización letales equilibrados, que implican enzimas catalíticas expresadas a partir de plásmidos de múltiples copias; esto se logró mediante la incorporación, en los plásmidos de expresión, de un sistema de exterminio post-segregacional basado en el sistema de adicción de plásmidos hok-sok no catalítico, procedente del factor pR1 de resistencia a antibióticos. También se introdujo en estos plásmidos de expresión por lo menos una función de reparto de plásmidos de origen natural, para eliminar potencialmente la segregación al azar de tales plásmidos, potenciando de ese modo su herencia y estabilidad.

Aunque se pretende en último lugar que estos plásmidos de expresión expresen antígenos inmunógenos y protectores para el suministro al sistema inmunitario humano, se seleccionó GFPuv como un antígeno informador de ensayo, debido a que la cuantificación de la fluorescencia media en una población de vectores vivos en crecimiento se podría usar como una medida de la estabilidad de los plásmidos residentes dentro del vector vivo. Todos los plásmidos de expresión portaron un casete de expresión de antígeno idéntico, con un alelo P_{ompC1} que controla la transcripción, y optimizándose la traducción mediante incorporación de un sitio de unión a ribosoma de consenso. Debido a que no hay ninguna actividad catalítica asociada con la fluorescencia de GFPuv, el nivel de intensidad de la fluorescencia medido mediante citometría de flujo dentro de las bacterias individuales se pudo correlacionar directamente con la dosificación génica y con el número de copias. Además, el uso de un promotor de ompC osmóticamente regulado permitió una evaluación de la estabilidad plasmídica y de la viabilidad del vector vivo, ya que el aumento de la osmolaridad indujo niveles más elevados de la síntesis de GFPuv y presumiblemente niveles más elevados de esfuerzo metabólico sobre el vector vivo. Como se puede observar en la Tabla 2, se confirmó que el alelo de P_{ompC1}, modificado mediante ingeniería para estos estudios, fue sensible a un aumento de la osmolaridad; cuando dirige la expresión de un gen de resistencia aph-2, se observó una resistencia a menos de 50 \mug/ml de canamicina en ausencia de presión osmótica, pero la resistencia aumentó hasta más de 800 \mug/ml en presencia de 300 mM de NaCl. Fue sorprendente que, aunque el alelo P_{ompC1} se manipuló mediante ingeniería a partir del lugar cromosómico de E. coli, pareció que funcionaba más eficazmente en S. typhi. El nivel no inducido de expresión de GFPuv fue el mismo tanto para DH5\alpha como para CVD 908-htrA (intensidad media de la fluorescencia de 4,45 frente a 5,37, respectivamente; Tabla 3). Sin embargo, la síntesis de GFPuv aumentó un 70% en DH5\alpha después de la inducción, pero se elevó por encima de 300% en CVD 908-htrA (intensidad media de la fluorescencia de 7,69 frente a 23,4, respectivamente). Este efecto no se limitó al alelo de P_{ompC1}, sino que fue igualmente notable cuando se usa P_{ompC3} (Tabla 3). Estos datos no concuerdan con las observaciones recientes de Martines-Flores et al. (1999), que informaron que las fusiones genéticas de ompC-lacZ de E. coli se expresaron constitutivamente dentro de S. typhi, y que este nivel constitutivo de expresión fue comparable a niveles inducidos dentro de E. coli. Aunque se ha indentificado un lugar definido de mutaciones de punto en el término 3' del alelo P_{ompC1} de E. coli, que podría explicar su comportamiento controlado osmóticamente dentro de CVD 908-htrA de S. typhi, tales mutaciones no se identificaron en P_{ompC3}, lo que también responde a la osmolaridad en CVD 908-htrA. Sin embargo, se debe observar que las fusiones genéticas estudiadas por Martinez-Flores et al. implicaron 1.150 pb de la región de control en dirección 5' de 5'-ompC de E. coli, mientras que los alelos de P_{ompC}, construidos en la presente memoria, implican sólo 459 pb de la región de control próxima de 5' de ompC. Independientemente de esta discrepancia, es alentador que los niveles más elevados de expresión de genes heterólogos regulada se observan dentro de la cepa de vacuna de vector vivo de S. typhi atenuada.

Se examinaron entonces las contribuciones de varios sistemas de estabilización de plásmidos a la estabilidad de los plásmidos dentro de CVD 908-htrA, que crecen en ausencia de selección de antibióticos. Ninguna combinación de funciones de estabilización pudo estabilizar plásmidos que contienen orígenes de replicación de oriE1; de hecho, estos constructos fueron difíciles de propagar incluso en presencia de antibióticos. Estas observaciones plantean la duda de la razón de usar plásmidos de números más elevados de copias para optimizar la expresión de antígenos heterólogos dentro del citoplasma de vectores vivos a base de S. typhi, una estrategia que, hasta ahora, han seguido otros grupos que investigan Salmonella como vectores vivos (Covone et al. 1998).

La incorporación de sistemas de estabilización de plásmidos en plásmidos que portan un origen de replicación de ori15A fue más prometedora. Cuando los vectores vivos que portan tales plásmidos se hicieron pasar sin selección durante 24 h a 37ºC, se pusieron de manifiesto los efectos de diversas combinaciones de funciones de estabilización. En ausencia de funciones de estabilización, el replicón de ori15A pGEN91 se perdió en más del 90% de la población, independientemente del nivel de inducción de P_{ompC1} (véanse la Tabla 6 y la Figura 8). Con la incorporación del lugar de exterminio post-segregacional hok-sok en pGEN111, el porcentaje de bacterias que expresan GFPuv se triplicó en todas las condiciones de inducción, confirmando las observaciones de otros de que el lugar de hok-sok potencia la estabilidad de replicones de ori15A (Gerdes et al. 1985; Gerdes, 1988; Gerdes et al. 1997b). Sin embargo, aún se observa que, independientemente de las condiciones de inducción, más del 50% de la población bacteriana ya no fluoresce. Puesto que se confirmó que por lo menos una porción de esta población que no fluoresce aún era viable y carecía de resistencia a fármacos, estos datos confirman los informes previos (Gerdes et al. 1986; Wu y Wood, 1994; Pecota et al. 1997) de que la presencia de un sistema de exterminio post-segregacional hok-sok es insuficiente por sí misma para asegurar que se produzcan bacterias viables sin plásmidos en una población en crecimiento.

Un posible mecanismo que permite escapar de la influencia de hok-sok implica mutaciones de punto espontáneas que surgen dentro del marco de lectura abierta de Hok letal, que podría inactivar conformacionalmente Hok y de ese modo permitiría que se produjera la pérdida de plásmido sin letalidad. Este punto enfatiza el requisito de mecanismos múltiples para potenciar la estabilidad de plásmidos residentes dentro de bacterias en crecimiento; si una función de estabilización se inactiva, la probabilidad de que otras funciones independientes se inactiven espontáneamente es verdaderamente pequeña. De hecho, tal redundancia en las funciones de estabilización está muy extendida dentro de plásmidos de bajo número de copias de origen natural (Nordstrom y Austin, 1989). Por ejemplo, el factor F del sexo de Escherichia coli contiene una función de reparto activa (sop) y dos sistemas de exterminio (ccd y flm) (Loh et al. 1988; Golub y Panzer, 1988; Van Melderen et al. 1994; Niki e Hiraga, 1997). De forma similar, el plásmido pR1 de resistencia a fármacos contiene la función de reparto activa parA, así como el sistema de exterminio post-segregacional hok-sok; además, porta todavía otro sistema de exterminio kis-kid recientemente definido (Bravo et al. 1987; Bravo et al. 1988; Ruiz-Echevarria et al. 1995). Se demuestra en el trabajo dado a conocer en la presente memoria que la inserción en replicones de ori15A de múltiples copias de un sistema de estabilización más completo, compuesto tanto de un sistema post-segregacional como de dos funciones de reparto, mejora drásticamente la estabilidad de estos plásmidos de expresión en ausencia de selección, independientemente de las condiciones de inducción para la expresión de antígenos heterólogos. Sin embargo, después de la pasada sin selección durante 48 h, los plásmidos se perdieron eventualmente de la población bacteriana, debido a que escapan de la letalidad de Hok. Este problema se ha resuelto recientemente por Pecota et al (1997), que dio a conocer que la incorporación de sistemas de exterminio duales mejora significativamente la estabilidad plasmídica en comparación con el uso de hok-sok solo; en estos plásmidos no había funciones de reparto. Quizás la inclusión del sistema de exterminio kis-kid, para representar de forma más completa el complemento de funciones de estabilidad de pR1, puede ser necesaria para la estabilidad óptima de plásmidos de expresión de mayores números de copias dentro de vectores vivos de S. typhi; puesto que se han construido recientemente casetes de PSK de phd-doc, también se examina la compatibilidad de esta función de PSK en los plásmidos de expresión pGEN211, pGEN222 y pGEN206.

Una comparación de las cepas que portan pGEN121 (un replicón de ori15A que porta hok-sok + par, \sim15 copias por equivalente cromosómico) con el plásmido de un número mucho menor de copias pGEN142 (un replicón de ori101 que porta hok-sok + par; \sim5 copias por equivalente cromosómico) muestra que, en condiciones de inducción máxima de P_{ompC1} con 300 mM de NaCl, el 57% de una población de CVD 908-htrA(pGEN121) que se hace pasar durante sólo 24 h sin selección, fluoresce con una intensidad media de la fluorescencia de 105,3; para una población de CVD 908-htrA(pGEN142), que se hace pasar durante 96 h sin selección en condiciones de inducción idénticas, el 94% de las bacterias analizadas mediante citometría de flujo aún mantiene una intensidad media de la fluorescencia de 47,7. Basándose en tales resultados con GFPuv como un antígeno de ensayo, es tentador suponer que se puede lograr un nivel óptimo de antígeno heterólogo presentado mediante una vacuna de vector vivo a base de S. typhi atenuada al sistema inmunitario humano disminuyendo el número de copias de plásmidos de expresión residentes hasta quizás 5 copias por equivalente cromosómico.

La eficacia de provocar una respuesta inmunitaria dirigida contra un antígeno heterólogo dependerá, en parte, de la capacidad del vector vivo para presentar tales antígenos al sistema inmunitario. La capacidad del vector vivo para presentar antígenos dependerá a su vez de la estabilidad de los plásmidos de expresión de múltiples copias que codifican los antígenos heterólogos. Los resultados demuestran que la inclusión de un sistema de estabilización de plásmidos dentro de plásmidos de expresión de múltiples copias, sin posterior manipulación genética del vector vivo, potencia la estabilidad de tales plásmidos de expresión. Sin embargo, la presencia de plásmidos de múltiples copias también puede influir en la capacidad metabólica del vector vivo. Esto es importante debido a que algunos antígenos extraños de interés ejercen un efecto pernicioso sobre el vector vivo.

Aunque no se pretende estar atados por esta teoría, se concluye que se produce una carga metabólica significativa sobre CVD 908-htrA que porta un plásmido de expresión de múltiples copias; a medida que aumenta el número de copias y/o el nivel de expresión génica, aumenta la carga metabólica. Los estudios con E. coli han establecido claramente que las bacterias que portan plásmidos crecen de forma más lenta que las bacterias sin plásmidos (Boe et al. 1987; McDermott et al. 1993; Wu y Wood, 1994; Pecota et al. 1997; Summers, 1998). También se ha demostrado que, a medida que aumenta el número de copias, disminuye la velocidad de crecimiento de tales cepas; de forma similar, a medida que aumenta la inducción de genes heterólogos, disminuye además la velocidad de crecimiento (Wu y Wood, 1994; Pecota et al. 1997). Claramente, la pérdida espontánea de plásmido eliminaría cualquier carga metabólica, y permitiría que las bacterias sin plásmido superen rápidamente la población de bacterias que portan plásmidos. En estudios elegantes, Wu y Wood (Wu y Wood, 1994) mostraron que las cepas de E. coli que portan plásmidos mantenían los plásmidos en condiciones cuando la expresión de genes clonados era baja durante 100 h cuando se hacían pasar en ausencia de selección; por el contrario, en condiciones de inducción máximas, la pérdida completa de plásmidos ocurría a las 10 h. De forma interesante, cuando se insertó el lugar hok-sok en estos plásmidos de expresión, los plásmidos se mantuvieron durante 300 h en condiciones no inducidas, y durante 30 h en condiciones de inducción. Sería de esperar que tal desplazamiento en la expresión del antígeno dentro de una población de bacterias de vectores vivos redujese la eficacia de la estimulación de cualquier respuesta inmunitaria específica frente a un antígeno extraño. El análisis conduce a concluir que la meta de una vacuna de vector vivo a base de S. typhi multivalente eficaz es optimizar la viabilidad usando vectores de expresión estabilizados de menor número de copias, capaces de expresar niveles elevados de antígeno heterólogo en respuesta a una señal medioambiental probablemente encontrada in vivo después de que los organismos de la vacuna hayan alcanzado un nicho ecológico apropiado. Actualmente se está ensayando esta estrategia usando el modelo intranasal murino, para examinar la inmunogenicidad del fragmento C de la toxina del tétano expresado en CVD 908-htrA a partir de los vectores de expresión pGEN211 (oriE1), pGEN222 (ori15A), y pGEN206 (ori101), todos los cuales portan sistemas de estabilización de plásmidos idénticos, y difieren sólo en el número de copias. El trabajo presentado en la presente memoria permite el desarrollo de vacunas de vectores vivos a base de S. typhi orales, de una sola dosis, capaces de inducir respuestas inmunitarias protectoras contra patógenos humanos no relacionados múltiples.

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<110> Galen, James

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<120> SISTEMA DE ESTABILIZACIÓN DE PLÁSMIDOS PARA EL SUMINISTRO DE ANTÍGENOS

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<130> Solicitud de James Galen

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<190> 09/204.117

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<141> 02-12-1998

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<160> 3

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 4196

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> secuencia nucleotídica 1-4196 de pGEN2

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia nucleotídica 1-4196 de pGEN2 (véanse las figuras 4a-g)

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<400> 1

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13

14

15

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<210> 2

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<211> 1197

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia nucleotídica 1201-2397 de pGEN3 (véanse las figuras 5a-b)

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<400> 2

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16

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<210> 3

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<211> 2647

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia nucleotídica 1201-3847 de pGEN4 (véanse las figuras 6a-e)

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<400> 3

17

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> University of Maryland, Baltimore

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<120> SISTEMA DE ESTABILIZACIÓN DE PLÁSMIDOS PARA EL SUMINISTRO DE ANTÍGENOS

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<130> P011459EP

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<140> EP99964042.8

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<141> 02-12-1999

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<150> US 09/204.117

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<151> 02-12-1998

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<150> US 60/158,738

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<151> 12-10-1999

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<160> 40

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<170> PatentIn version 3.2

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<210> 1

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<211> 4196

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia nucleotídica completa de pGEN2

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<400> 1

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18

19

20

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<210> 2

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<211> 1197

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia nucleotídica parcial de pGEN3: nucleótidos 1201-2397 que codifican ori15A

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<400> 2

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21

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<210> 3

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<211> 2647

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia nucleotídica parcial de pGEN4: nucleótidos 1201-3848 que codifican ori101

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<400> 3

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22

23

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<210> 4

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<211> 41

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Porción de secuencia del promotor

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

catataacag atcttaatca tccacaggag gatatctgat g

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41

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<210> 5

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Porción de secuencia del promotor

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

catataacag atcgatctta aacatccaca ggaggatatc tgatg

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45

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<210> 6

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<211> 66

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 6

1000

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<210> 7

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<211> 66

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 7

1001

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<210> 8

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<211> 69

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 8

1002

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<210> 9

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<211> 77

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 9

1003

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<210> 10

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<211> 72

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 10

1004

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<210> 11

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<211> 64

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 11

1005

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<210> 12

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 12

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gcaggaaaga acatgtgagc ctagggccag caaaaggcca ggaac

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45

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<210> 13

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<212> ADN

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 13

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catgaccaaa atcccttaac tagtgtttta gatctactga gcgtcagacc ccg

\hfill

53

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<210> 14

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<211> 53

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

cggggtctga cgctcagtag atctaaaaca ctagttaagg gattttggtc atg

\hfill

53

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<210> 15

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<211> 49

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 15

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gctgtcaaac atgagaattc tagaagacga aagggcctcg tgatacgcc

\hfill

49

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<210> 16

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<211> 64

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 16

1006

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<210> 17

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<211> 59

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 17

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgaagcccaa cctttcatag aagctagcgg tggatccgaa atctcgtgat ggcaggttg

\hfill

59

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<210> 18

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 18

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aacaagcgtt ataggaattc tgtggtagca

\hfill

30

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<210> 19

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 19

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\hskip-.1em\dddseqskip

actttcatgt tattaaagat ctgttatatg

\hfill

30

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<210> 20

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<211> 59

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agatcttaat catccacagg aggctttctg atgagtaaag gagaagaact tttcactgg

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctagctcat tatttgtaga gctcatccat gc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agatctgaat tctagatcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcg

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agatcttatc aggtcgaggt ggcccggctc catgcaccgc gacgcaacgc g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

1007

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

1008

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

1009

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

1010

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggagatttc ctggaagatg cctaggagat acttaacagg gaagtgagag

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

1011

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

1012

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

1013

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

1014

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

1015

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgaagcccaa cctttcatag aaactagtgg tggaatcgaa atctcgtgat ggcaggttg

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

1016

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia Promotora Modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)..(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" puede ser G, C o A

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es un inserto de 1 a 5 nucleótidos seleccionados de A, C, G y T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" es A, C, G o T

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agatcnntaa ncatccacag gaggatatct gatg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de toxina de Shiga modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acagcagacg cgtta

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de toxina de Shiga modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgaacctag ggcga

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de toxina de Shiga modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaattcgcga ccagt

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de toxina de Shiga modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaatcagatt ctgga

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica:

: un origen de replicación que confiere un número medio de copias que está comprendido entre 2 y 75, seleccionado de entre el grupo que consiste en: oriE1 (SEC ID nº.1), ori101 (SEC ID nº.3), ori15A (SEC ID nº.2) y sus derivados, y que está flanqueado en ambos extremos por terminadores de la transcripción;

: por lo menos una función de exterminio post-segregacional, seleccionada de entre el grupo que consiste en asd, ssb, phd-doc, kis-kid, y hok-sok, en la que la transcripción de flanqueo de los lugares que rodean dicha por lo menos una función post-segregacional es divergente y no perturbará significativamente los niveles de transcripción de tipo salvaje; y

: por lo menos una función de reparto seleccionada de entre el grupo que consiste en el lugar par de pSC101 y el parA de pR1, en la que la transcripción de flanqueo transcurre alejándose de dicha por lo menos una función de reparto; y

: un promotor ompC que comprende la siguiente secuencia:

: AGATCX^{1}X^{2}TAAX^{3}CATCCACAGGAGGATATCTGATG (SEC ID nº: 36), en la que X^{1} se selecciona de entre el grupo que consiste en G, C y A; X^{2} es un inserto que tiene de 1 a 5 nucleótidos; y X^{3} se selecciona de entre el grupo que consiste en A, T, G y C.

2. Vector de expresión según la reivindicación 1, que comprende además una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de interés controlada transcripcionalmente mediante el promotor ompC, en el que la secuencia nucleotídica que codifica la proteína de interés comprende un terminador transcripcional en el extremo 3' distante.

3. Vector de expresión según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además un polinucleótido que codifica un marcador seleccionable.

4. Vector de expresión que comprende una secuencia nucleotídica que codifica:

: un casete de origen de replicación que comprende: una secuencia nucleotídica que codifica un origen de replicación que confiere un número medio de copias que está entre 2 y 75, seleccionado de entre el grupo que consiste en: oriE1 (SEC ID nº: 1), ori101 (SEC ID nº: 3), ori15A (SEC ID nº: 2) y sus derivados; un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica el origen de la replicación; y un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica el origen de la replicación;

: por lo menos un casete de exterminio post-segregacional, que comprende: una secuencia nucleotídica que codifica por lo menos una función de exterminio post-segregacional seleccionada de entre el grupo que consiste en asd, ssb, phd-doc, kis-kid, y hok-sok; un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de exterminio post-segregacional, y un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica por lo menos una función de exterminio post-segregacional;

: por lo menos un casete de reparto, que comprende: (i) una secuencia nucleotídica que codifica por lo menos una función de reparto seleccionada de entre el grupo que consiste en el lugar par de pSC101 y el parA de pR1; un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de reparto, y un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de reparto; y

: un casete de expresión que comprende (i) una secuencia nucleotídica que codifica un promotor ompC que comprende la siguiente secuencia:

: AGATCX^{1}X^{2}TAAX^{3}CATCCACAGGAGGATATCTGATG (SEC ID nº: 36), en la que X^{1} se selecciona de entre el grupo que consiste en G, C y A; X^{2} es un inserto que tiene de 1 a 5 nucleótidos; y X^{3} se selecciona de entre el grupo que consiste en A, T, G y C, (ii) un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica el promotor, y (iii) un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica el promotor.

5. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el número medio de copias del plásmido está comprendido dentro del intervalo de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60 copias por
célula.

6. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la función de reparto es una función de reparto activa.

7. Vector de expresión según la reivindicación 6, en el que la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de reparto comprende parA.

8. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la función de reparto es una función de reparto pasiva.

9. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que la secuencia nucleotídica que codifica dicha por lo menos una función de reparto es el lugar par de pSC101.

10. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la función de exterminio post-segregacional es ssb.

11. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X^{1} es G.

12. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X^{2} tiene de 1 a 4 nucleótidos.

13. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X^{2} tiene 4 nucleótidos.

14. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X^{2} tiene 4 nucleótidos, seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en A, T y C.

15. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X^{2} comprende un nucleótido o secuencia nucleotídica seleccionado de entre el grupo que consiste en ATCT; ATC; AT; TCT; CT; TC; A; T; C; y T.

16. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X^{2} se selecciona de entre el grupo que consiste en ATCT; ATC; AT; TCT; CT; TC; A; T; C; y T.

17. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X^{2} es ATCT.

18. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X^{3} es A.

19. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 18, que comprende además una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de interés localizada en el extremo 3' de la secuencia nucleotídica que codifica el promotor.

20. Vector de expresión según la reivindicación 2 ó 19, en el que la proteína de interés es un antígeno de interés.

21. Vector de expresión según la reivindicación 20, en el que el antígeno de interés se selecciona de entre el grupo que consiste en un antígeno vírico, un antígeno bacteriano, un antígeno cancerígeno, y un antígeno autoinmunitario.

22. Vector de expresión según la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en el que el antígeno de interés comprende una toxina de Shiga destoxificada.

23. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que el antígeno de interés comprende un antígeno de la toxina 2 de Shiga, seleccionado de entre el grupo que consiste en el pentámero de la subunidad B de la toxina 2 de Shiga, y una toxina 2 de Shiga genéticamente destoxificada.

24. Vector de expresión según la reivindicación 23, en el que la secuencia nucleotídica que codifica la toxina 2 de Shiga destoxificada tiene segmentos modificados seleccionados de entre el grupo que consiste en:

: (797) - ACA GCA GAC GCG TTA - (811) (SEC ID nº: 37);

: (902) - CTG AAC CTA GGG CGA - (916) (SEC ID nº: 38);

: (1345) - GAA TTC GCG ÁCIDO AGT - (1359) (SEC ID nº: 39); y

: (1435) - GAA TCA GAT TCT GGA - (1449) (SEC ID nº: 40).

25. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 24, que comprende además un casete de selección que comprende (i) un polinucleótido que codifica por lo menos un marcador seleccionable; (ii) un primer sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 5' de la secuencia nucleotídica que codifica dicho por lo menos un marcador seleccionable, y (iii) un segundo sitio de escisión mediante enzima de restricción único, localizado 3' de la secuencia nucleotídica que codifica dicho por lo menos un marcador seleccionable.

\newpage

26. Vector de expresión según la reivindicación 3 ó 25, en el que el marcador seleccionable es una proteína que proporciona resistencia a un antibiótico seleccionado de entre el grupo que consiste en un aminoglucósido, un cloranfenicol, una tetraciclina y una carbenicilina.

27. Vector de expresión según la reivindicación 3, la reivindicación 25 o la reivindicación 26, en el que el polinucleótido que codifica el marcador seleccionable se selecciona de entre el grupo que consiste en tetA, bla, aphA-2, y kan.

28. Célula que comprende el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

29. Célula según la reivindicación 28, en la que la célula es una célula procariota.

30. Célula según la reivindicación 29, en la que la célula procariota es Salmonella typhi.

31. Vacuna de vector bacteriano atenuado vivo, para uso en un método para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto, en el que la vacuna de vector bacteriano atenuado vivo comprende una célula según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30.

32. Vacuna de vector bacteriano atenuado vivo según la reivindicación 31, para uso según se especifica en la presente memoria, en la que la célula es Salmonella typhi.

33. Vector bacteriano atenuado vivo según la reivindicación 31 ó 32, en el que el sujeto es un ser humano.

34. Método para obtener una vacuna de vector bacteriano atenuado vivo, que comprende transformar una cepa bacteriana con un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.