ES2346574T3 - Metodo para la identificacion de peptidos antigenicos. - Google Patents

Abstract

Un método para aislar péptidos antigénicos en cantidades femtomolares, cuyo método consiste en (a)proporcionar complejos de moléculas de MHC II con péptidos antigénicos aislados a partir de células, muestras de tejido o fluido corporal de un organismo mamífero en una cantidad de 0,2 a 3 μg y (b)secuestrar los complejos mediante inmunoprecipitación, en el que los complejos están acoplados con anticuerpos específicos MHCII a cuentas, c)lavar los complejos unidos de moléculas MHCII con péptidos antigénicos con agua o tampón bajo en sal, donde el tampón bajo en sal es un tampón Tris, fosfato o acetato en un rango de concentración de 0,5 a 10 mM y d)eluir los péptidos antigénicos asociados de las moléculas MHC II.

Description

Método para la identificación de péptidos antigénicos.

La presente invención está relacionada con un método útil para aislar péptidos antigénicos de una cantidad limitada de células o fluidos corporales de un organismo mamífero en una cantidad suficiente para determinar su secuencia e identidad. Por tanto, esta invención está relacionada con métodos para identificar nuevos antígenos asociados a enfermedades, por ejemplo, antígenos tumorales y antígenos implicados en enfermedades autoinmunes, para ser usados con fines diagnósticos o terapéuticos. Los métodos de la presente invención también pueden ser utilizados para controlar la calidad de las vacunas. Más concretamente, los métodos de la invención pueden ser utilizados para determinar la secuencia de péptidos antigénicos presentados a través de los receptores peptídicos de las células dendríticas que son las células presentadoras de antígenos más importantes del cuerpo y herramientas valiosas para la vacunación.

Condiciones patológicas, tales como enfermedades infecciosas, trastornos autoinmunes o cáncer, se pueden distinguir de las condiciones sanas por la expresión de moléculas específicas de la enfermedad. En particular, las proteínas que son expresadas de novo, mutadas o expresadas aberrantemente, pueden ser utilizadas como marcadores de la correspondiente enfermedad.

Una clase potente de marcadores que sirve como herramientas diagnósticas y terapéuticas son los fragmentos de proteínas o péptidos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (del inglés, major histocompatibility complex, MHC). En humanos, las moléculas del MHC se denominan antígenos leucocitarios humanos (del inglés, human leukocyte antigens, HLA). Los péptidos asociados a HLA son cortos, abarcando 9-25 aminoácidos (Kropshofer, H. & Vogt, AB, Immunol Today 18 (1997) 77-82). Por un lado, estos péptidos derivan de las proteínas propias para establecer autotolerancia. Por otro lado, los péptidos asociados a HLA derivan de proteínas extrañas de origen viral, fúngico o bacteriano para luchar contra invasores externos. A través de la activación de células inmunes especializadas, llamadas linfocitos T (abreviado: células T), los complejos péptido-HLA son indispensables para organizar una respuesta inmune celular o humoral. Los auto-péptidos particulares, denominados péptidos autoantigénicos, son reconocidos erróneamente por células T autoagresivas dando lugar a enfermedades autoinmunes. Por el contrario, la falta de reconocimiento por células T de autopéptidos derivados de antígenos específicos de tumores, contribuye a la evasión inmune y al crecimiento progresivo de los tumores (Boon, T. et al., Ann Rev Immunol. 12 (1994) 337-265). Por lo tanto, sería de considerable importancia en la inmunología tumoral y en la autoinmunidad aumentar nuestro conocimiento sobre los péptidos marcadores asociados a una enfermedad.

Respecto a su función, se pueden distinguir dos clases de complejos péptido-MHC (Germain, R., Cell 76 (1994) 287-299): (i) complejos péptido-MHC de clase I, que pueden ser expresados por casi todas las células nucleadas para atraer a células T citotóxicas CD8+ que lisan células infectadas o células tumorales, (ii) complejos péptido-MHC de clase II, expresados constitutivamente sólo en las llamadas células presentadoras de antígeno (CPA), tales como linfocitos B, macrófagos o células dendríticas (CD). En particular, las CD tienen la capacidad de cebar a las células T ayudantes CD4+ (Banchereau, J. & Steinman, R.M., Nature 392 (1998) 245-254). Por otra parte, las CD pueden estar autorizadas para activar de manera óptima células T citotóxicas CD8+: esto se logra a través de la interacción previa de sus complejos péptido-MHC de clase II con las células T ayudantes CD4+ (Ridge, T. et al., Nature 393 (1998) 474-478). Por lo tanto, los péptidos presentados por las moléculas del MHC de clase II en las CD juegan un papel superior en la patogénesis de enfermedades que implican respuestas inmunes mediadas por células T.

El aparente papel de las CD en iniciar las respuestas inmunes ha estimulado los intentos para aprovechar las CD como vacunas, en particular contra el cáncer (Dallal, R.M. & Lotze, M.T., Curr Opinion Immunol 12 (2000) 583-588). Un avance clave fue la invención de técnicas para la diferenciación de CD in vitro de diferentes fuentes incluyendo sangre periférica, por ejemplo, monocitos adherentes, o células madre precursoras CD34+ derivadas de la médula ósea. Las CD diferenciadas y activadas in vitro pueden utilizarse para la vacunación de pacientes de cáncer después de co-cultivar con antígenos derivados de las células tumorales o mediante el empleo de técnicas análogas. Estudios piloto de vacunación con células dendríticas han inducido satisfactoriamente respuestas específicas contra el cáncer, incluidas respuestas clínicas (Timmermann, J.M. & Levy, R., Ann Rev Medicine 50 (1999) 507-529; Nestle, F.O., et al., Nature Medicine 7 (2001) 761-765).

Las vacunas contra el cáncer de células basadas en CD comprenden CD cometidas a pulsos con células cancerosas normales o modificadas genéticamente, lisados de células cancerosas, células cancerosas fusionadas a CD o complejos peptídicos de proteínas de choque térmico (Hsp-) derivadas de células cancerosas. El fundamento de esta última técnica es que las Hsp derivadas de células tumorales tienen péptidos específicos de tumores que son transferidos eficientemente a las moléculas del MHC de las CD. Estas CD finalmente preparan a las células T citotóxicas con reactividad antitumoral que conducen a la erradicación de tumores en ratones (Srivastava, P.K., et al., PNAS 83 (1986) 3407-3411; Suto, R., et al., Science 269 (1995) 1585-1588; Binder, R.J. et al, Nature Immunol. 1 (2000)
151-162).

La ventaja de todos estos enfoques es que no es necesario ningún conocimiento sobre la identidad de los antígenos tumorales. El inconveniente es que la identidad de los marcadores tumorales se desconoce y el número de copias de cada uno de los péptidos tumorales unidos a HLA es a menudo demasiado bajo para inducir respuestas de células T antitumorales a largo plazo.

Las vacunas basadas en la identificación de antígenos cancerosos incluyen CD preparadas con DNA desnudo, adenovirus o virus de la vacuna recombinantes, proteínas naturales o recombinantes purificadas de las correspondientes células tumorales o análogos sintéticos de péptidos tumorales. La ventaja de someter a pulsos a las CD con péptidos antigénicos tumorales en lugar de con los precursores genéticos o proteicos, es que los péptidos se pueden cargar directamente en las moléculas del MHC de las CD sin un posterior procesamiento.

Durante la última década, se han identificado numerosos péptidos derivados de proteínas de marcadores tumorales y restringidos por moléculas del MHC de clase I. Se agrupan en cuatro categorías: antígenos del cáncer de testículos, antígenos de diferenciación melanocito-melanoma, antígenos mutados y antígenos compartidos no mutados sobreexpresados en tumores. En varios estudios piloto de vacunación clínica, las CD de pacientes con melanoma se sometieron a pulsos con un cóctel de péptidos de melanoma que, hasta ahora, estaba exclusivamente restringido a HLA de clase I (Nestle, F.O. et al., Nature Medicine 4 (1998) 328-332; Thurner, B. et al., J Exp Med 190 (1999) 1669-1678). Sin embargo, existe una evidencia creciente de que la eficacia y la duración de las respuestas de las células T citotóxicas contra tumores pueden incrementarse por la implicación de las células T ayudantes limitadas al MHC de clase II. Por lo tanto, un método de vacunación mejorado podría prever el uso combinado de péptidos tumorales asociados a MHC de clase II además de los antígenos MHC de clase I.

El conocimiento de los antígenos cancerosos restringidos a MHC de clase II reconocidos por células T ayudantes CD4+ está por detrás de la identificación de los antígenos limitados a la clase I (Wang, R.-F., Trends in Immunol 22 (2001) 269-276). Una razón es que la transfección de librerías de cDNA de células tumorales a células diana y el uso posterior de las células T antitumorales para identificar los transfectantes adecuados y los epítopos antigénicos - un método usado satisfactoriamente con moléculas del MHC de clase I - no es efectiva porque las proteínas codificadas no viajan a la vía MHC de clase II en CPA.

Una alternativa innovadora es usar CD autólogas pulsadas con células tumorales o proteínas marcadoras de tumores específicos y secuenciar los péptidos asociados a MHC o a moléculas Hsp en las CD. Esta aproximación, sin embargo, no ha sido usada hasta ahora, ya que las CD no se dividen in vitro y sólo están disponibles en muy pequeñas cantidades en sangre periférica o médula ósea. Además, las técnicas de purificación y secuenciación de péptidos eran de lejos, demasiado insensibles, hasta ahora, para identificar directamente péptidos asociados a enfermedades por esta o cualquier otra aproximación.

Las mismas limitaciones son evidentes en el contexto de las enfermedades autoinmunes, tales como la artritis reumatoide (AR). Los pacientes con AR sufren de destrucción sistémica de su tejido de la articulación, que está mediada por linfocitos T auto-agresivos y auto-anticuerpos. La presencia de ambos, células T autoreactivas y anticuerpos, depende de la presentación de antígeno peptídico restringido a MHC de clase II. De acuerdo con esto, las moléculas HLA-DR, particularmente los genes DRB1*0401 y DRB1*0404 en personas de descendencia Europea, revelaron ser los principales factores de riesgo y otorgan mayor susceptibilidad a AR (Marrack P et al. Nat. Med., 2002, 7: 899-905). Se han propuesto varios autoantígenos candidatos, tales como colágeno tipo II, fiagrina, IgG y glicoproteína de cartílago gp39. Los péptidos autoantigénicos correspondientes se han esclarecido sólo por medios indirectos, por ejemplo la capacidad de activar clones de células T presentes en el suero o líquido sinovial de pacientes con AR. Recientemente, pareció claro que ninguno de los principales clones de células T CD4+ acumulados en el líquido sinovial inflamado de las articulaciones de pacientes de AR reconoce los epítopos respectivos (Kotzin BL et al., PNAS (2000), 97, 291-296). Una razón probable de esto es que no era posible, hasta ahora, secuenciar los péptidos asociados a HLA-DR del tejido sinovial en AR, de modo que la identificación de péptidos autoantigénicos sigue aún sin desvelarse.

Por lo tanto, de manera similar como en el campo de los tumores, es una necesidad importante establecer una metodología que permita la secuenciación de péptidos MHC procesados de forma natural en el rango femtomolar.

Kropshofer, H., et al., Science 270 (1995) 1357-1359, describen un método para aislar péptidos antigénicos en el rango femtomolar.

La presente invención proporciona métodos para aislar e identificar cantidades femtomolares de antígenos peptídicos presentados por 0,2 a 3 \mug de moléculas de MHC de clase II aisladas de un organismo o de células derivadas de un organismo. Dichos métodos corresponden al seguimiento inmunológico de enfermedades, por ejemplo enfermedades autoinmunes, el diseño de vacunas peptídicas individualizadas para el tratamiento de enfermedades, por ejemplo de cáncer y el control de calidad de las vacunas por ejemplo aquellas basadas en células dendríticas. Los métodos de la invención tienen la ventaja que la identidad de unir y/o presentar péptidos antigénicos puede dilucidarse desde muy pequeñas cantidades de fluidos corporales o células aisladas de un organismo mamífero.

Los métodos descritos aseguran que los péptidos antigénicos aislados e identificados son aquellos que están unidos y/o presentados por receptores peptídicos in vivo o son aquellos que están procesados de forma natural y presentados por CPA, preferiblemente CD in vitro.

Método

La presente invención proporciona un método para aislar péptidos antigénicos asociados a la enfermedad en cantidades femtomolares permitiendo su identificación cuyo método consiste en proporcionar complejos de receptores peptídicos con péptidos antigénicos de un organismo mamífero en una cantidad de 0,2 a 3 \mug. Esta cantidad equivale a la cantidad de material que está normalmente disponible en biopsias o fluidos corporales de pacientes o de donantes sanos. La cantidad más pequeña de material necesario en el estado de la técnica está en alrededor de 200 \mug de moléculas del MHC de clase II derivadas de una fuente ilimitada (ratones endogámicos) (Dongre AR y col., EJI 2001, 31, 1485-94). Esto es aproximadamente dos órdenes de magnitud de cantidad de material superior a la cantidad de material disponible de pacientes humanos.

La cantidad de tejido o fluido corporal necesario para obtener por ejemplo 100 ng de moléculas del MHC de clase II depende del número de células que expresan MHC de clase II y la tasa de expresión de moléculas del MHC de clase II: por ejemplo 100 ng de MHC de clase II son equivalentes a unos 2x10^{5} CD maduras o 5 a 10x10^{6} monocitos de sangre periférica o alrededor de 5x10^{7} células mononucleares de sangre periférica que pueden obtenerse de unos 50 ml de sangre.

La elevada sensibilidad requerida para identificar péptidos asociados a MHC se explica por el hecho de que cada tipo de estos receptores peptídicos, por ejemplo el producto del gen MHC de clase II humano HLA-DR1, lleva aproximadamente 500 a 1000 péptidos antigénicos diferentes (Chicz RM et al., J Exp. Med. 1993, 178, 27-47; Chicz RM & Urban RG, Immunol. Today, 1993, 15: 155-160). Sin embargo, la mayoría de los 500 a 1000 péptidos diferentes alcanzan un número de copias muy bajo y, por lo tanto, no es muy probable que juegue un papel fisiológico. Especialmente en el campo de MHC de clase II, aquellos péptidos con relevancia inmunológica, por ejemplo los que activan células T colaboradoras, alcanzan un número de copias de moderado a alto (Latek RR & Unanue ER, Immunol. Rev. 1999, 172: 209-228). Estos péptidos cubren alrededor del 40 al 50% de la cantidad total de material peptídico eluido de las moléculas del MHC de clase II y equivale a unos 10 a 200 péptidos indivi-
duales.

Muchos de los péptidos asociados al MHC de clase II están representados como un conjunto de 2 a 5 variantes truncadas en C- y N-terminal (Rudensky AY et al, Nature 1992, 359, 429-431; Chicz et al. Nature 1992, 358: 764-768) compartiendo una secuencia central común de unos 10 a 13 aminoácidos que es esencial para el reconocimiento del receptor de la célula T. Esas variantes truncadas/elongadas constituyen el mismo epítopo de la célula T. Eso significa que el número de epítopos diferentes, que son de importancia es realmente más pequeño, entre unos 5 a 70 epítopos diferentes. Así, la abundancia de epítopos inmunológicamente relevantes está en el rango de 0,2% al
5%.

El método de la presente invención consiste en

(a)

proporcionar complejos de moléculas de MHC II con péptidos antigénicos aislados a partir de células, muestras de tejido o fluido corporal de un organismo mamífero en una cantidad de 0,2 a 3 \mug y

(b)

secuestrar los complejos mediante inmunoprecipitación, en el que los complejos están acoplados a cuentas mediante anticuerpos específicos MHC II,

c)

lavar los complejos unidos de moléculas MHCII con péptidos antigénicos con agua o un tampón bajo en sal, donde el tampón bajo en sal es un tampón Tris, fosfato o acetato en un rango de concentración de 0,5 a 10 mM y

d)

eluir los péptidos antigénicos asociados de las moléculas MHC II.

\vskip1.000000\baselineskip

Origen de los péptidos

Los péptidos antigénicos de la presente invención son péptidos que están asociados con receptores peptídicos de tejidos o fluidos corporales o células de un organismo mamífero o de células presentadoras de antígenos derivadas de un organismo mamífero. Pueden estar unidos a los receptores peptídicos transmembrana que comprenden moléculas MHC II que presentan los péptidos antigénicos en la superficie celular de las células T del sistema inmunitario. Los péptidos antigénicos también pueden estar unidos a moléculas del MHC intra o extracelulares.

Los péptidos antigénicos comprenden los propios antígenos, antígenos tumorales, autoantígenos, antígenos virales, bacterianos, y parasíticos. Algunos péptidos antigénicos pueden inducir tolerancia. Otros péptidos antigénicos puede provocar una respuesta inmune y son por tanto péptidos inmunogénicos. Los péptidos antigénicos de la presente invención pueden ser péptidos antigénicos procesados de forma natural que significa que son generados por proteínas antigénicas por el sistema proteolítico de la célula respectiva y cargados en los receptores peptídicos. Los péptidos antigénicos también pueden ser péptidos antigénicos procesados de manera no natural, sintéticos o recombinantes, que pueden haberse administrado a un organismo donde se han cargado los receptores peptídicos sin otro procesamiento o pueden haber contactado con células que expresan receptores peptídicos en cultivo celular o con receptores peptídicos aislados in Vitro.

Por lo tanto, los métodos de la presente invención comprenden péptidos antigénicos, que son péptidos antigénicos procesados de forma natural, así como péptidos antigénicos que son péptidos antigénicos sintéticos o recombi-
nantes.

Como todos estos receptores peptídicos son capaces de acomodar una amplia variedad de ligandos peptídicos (véase más arriba), cada uno de los péptidos cuya secuencia ha sido determinada se representa sólo en cantidades femtomolares. 1 \mug de MHC de clase II (16 pmol) puede llevar especies peptídicas dominantes, con cada uno de los péptidos realizando una ocupación de 0,1 - 2%, equivalente a unos 16 - 320 femtomoles. Los métodos de la presente invención permiten el aislamiento de estas cantidades femtomolares de péptidos antigénicos desde 0,1 a 5 \mug de receptores peptídicos cargados con péptidos y su posterior secuenciación.

Origen de los receptores peptídicos

En otra realización, los métodos de la presente invención relacionan los receptores peptídicos que comprenden todas las proteínas que unen péptidos antigénicos, que consisten en moléculas MHC de clase II.

Además, los complejos de los receptores peptídicos con los péptidos antigénicos pueden aislarse de diversos fluidos corporales de un organismo, por ejemplo de la sangre, el suero, ascitis, fluido sinovial, de muestras de tejido de un organismo, por ejemplo biopsias tumorales, o de células aisladas de un organismo.

Los complejos de los receptores peptídicos con péptidos antigénicos pueden aislarse de un organismo mamífero, preferiblemente de un organismo humano.

Los receptores peptídicos se aíslan de un organismo en una cantidad de 0,2 a 3 \mug.

Origen del material celular

Los métodos de la presente invención abarcan células que expresan moléculas MHC II que comprenden células B, macrófagos, células dendríticas, monocitos, células epiteliales del timo, células de la microglía, células T activadas y células endoteliales y epiteliales después de la inducción con citoquinas proinflamatorias por ejemplo IFN gamma. Las células que expresan moléculas MHC II también se conocen como células presentadoras de antígeno (CPA) (Unanue, E.R.. Macrophages, antigen presenting cells and the phenomena of antigen handling and presentation. En: Fundamental Immunology, 2ª edición (editor Paul, W.E) New York, Raven Press, 1989).

Solubilización de receptores peptídicos a partir de células

Para la purificación de los complejos péptido - receptor peptídico a partir de células o tejidos, deben solubilizarse las membranas de las células y tejidos. La lisis celular puede llevarse a cabo con métodos conocidos en la materia, por ejemplo ciclos de congelación y descongelación y el uso de detergentes, y combinaciones de los mismos. Los métodos de lisis preferidos son la solubilización utilizando detergentes, preferiblemente TX-100, NP40, n-octilglucósido, Zwittergent, Lubrol, CHAPS, más preferiblemente TX-100 o Zwittergent 3-12. Los restos de células y núcleos deben eliminarse de los lisados celulares que contienen los complejos receptor - péptido solubilizados por centrifugación. Por lo tanto, en otra realización de la presente invención, los complejos de los receptores peptídicos con péptidos antigénicos se aíslan de las células con métodos que comprenden la solubilización con un detergente.

Purificación a nanoescala de los complejos péptido-MHC

Adicionalmente, la invención proporciona la purificación de los complejos peptídicos MHC de clase II de los lisados celulares por inmunoprecipitación.

Para la inmunoprecipitación, se usan los anticuerpos específicos para las moléculas del MHC de clase II y los apropiados para estos métodos. Los anticuerpos específicos son preferiblemente anticuerpos monoclonales, y están unidos covalentemente o no covalentemente, por ejemplo mediante Proteína A, acoplados a partículas, por ejemplo partículas de sefarosa o agarosa. Una selección del panel general de los anticuerpos anti-HLA usados en el estado de la técnica comprenden:

anticuerpos anti-HLA-DR: L243, TU36, DA6,147, preferiblemente L243; anticuerpos anti-HLA-DQ: SPVL3, TU22, TU169, preferiblemente TU22 y TU169; anticuerpo anti-HLA-DP B7/21 y anticuerpos anti-HLA-A,B,C W6/32 y B9,12.

Los anticuerpos monoclonales específicos para las diferentes moléculas de clase II del MHC pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo Pharmingen, Dianova) o purificadas del sobrenadante de las células de hibridoma respectivas utilizando cromatografía de afinidad para Proteína A- o Proteína G. Los anticuerpos monoclonales purificados pueden estar acoplados por varios métodos conocidos en la materia, preferiblemente por acoplamiento covalente de grupos amino de anticuerpos a sefarosa activada por CNBr.

El aislamiento inmunológico de las moléculas del MHC puede realizarse incubando las partículas-anticuerpo con el lisado celular en rotación durante varias horas. El lavado de las partículas-anticuerpo puede realizarse en tubos eppendorf. La eficacia de la inmunoprecipitación puede analizarse por SDS-PAGE y western blott utilizando anticuerpos que reconocen moléculas del MHC desnaturalizadas (anti-HLA-DRalfa: 1B5; anti-HLA clase I: HC10 o HCA2).

Elución y fraccionamiento de péptidos asociados a receptores peptídicos

Para eluir los péptidos de las moléculas del receptor, se obtiene una mezcla compleja de péptidos procesados de manera natural derivados de la fuente de antígeno potencial y de polipéptidos de origen intra- o extracelular. Solamente después de la elución, los péptidos pueden fraccionarse y someterse a análisis de secuencias.

Los péptidos antigénicos en los métodos de la presente invención pueden eluirse por una variedad de métodos conocidos en la materia, preferiblemente utilizando ácido diluido, por ejemplo acetonitrilo diluido (Jardetzky TS et al., Nature 1991 353, 326-329), ácido acético diluido y calentando (Rudensky AY et al., Nature 1991, 353, 622-626; Chicz RM et al., Nature 1992, 358, 764-768) o ácido trifluoroacético diluido a 37ºC (Kropshofer H et al., J Exp Med 1992, 175, 1799-1803). Más preferiblemente, los péptidos se eluyen a 37ºC con ácido trifluoroacético diluido.

Los complejos péptido- receptor peptídico secuestrados se lavan con agua o con un tampón bajo en sal antes de la elución para eliminar los contaminantes detergentes residuales. El tampón bajo en sal es un Tris, tampón acetato o fosfato en un rango de concentración de 0,5 - 10 mM, preferiblemente en una concentración de 0,5 mM. En una realización preferida, los complejos péptido- receptor peptídico se lavan con agua ultrapura (de calidad para secuenciar) convencionalmente usada para análisis de HPLC, preferiblemente con agua ultrapura (de calidad para secuenciar) de MERCK. El paso del lavado debe llevarse a cabo por ultrafiltración. La ultrafiltración debe llevarse a cabo en un tubo de ultrafiltración con exclusión de 30 kD, 20 kD, 10 kD o 5 kD, preferiblemente de 30 kD y un volumen de tubo de
0,5 - 1,0 ml (tubos "Ultrafree"; Millipore). El lavado en el tubo de ultrafiltración debe hacerse de 4 a 12 veces, preferiblemente de 6 a 10 veces, con un volumen de 10 a 20 veces el volumen de las partículas que llevan los complejos péptido - receptor, preferiblemente con un volumen de 15 veces las partículas. Los péptidos eluidos pueden separarse de las moléculas restantes del receptor peptídico utilizando el mismo tubo de ultrafiltración. Los péptidos eluidos pueden entonces liofilizarse.

Análisis de la secuencia peptídica por cromatografía líquida- espectrometría de masas (CL-EM)

En otra realización de la presente invención, los péptidos antigénicos aislados se fraccionan, se secuencian y se identifican. Por secuenciar se entiende que la secuencia de aminoácidos de los péptidos individuales en la mezcla de péptidos antigénicos aislados se esclarece por métodos adecuados para secuenciar cantidades femtomolares de péptidos. Por identificar se entiende lo establecido en qué proteínas o polipéptidos derivan los péptidos antigénicos y en qué secuencia se constituyen en esas proteínas o polipéptidos.

En un primer paso, la mezcla compleja de péptidos eluidos puede fraccionarse por una de las variedades de los posibles métodos cromatográficos, por ejemplo por fase reversa, intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico o una combinación de las mismas. Preferiblemente, la separación se realiza por cromatografía de fase reversa C18 o por HPLC bidimensional de fase reversa/intercambio catiónico, conocida como MudPit (Washburn MP et al., Nat Biotechnol., (2001), 19, 242-247).

El fraccionamiento se hace mediante HPLC utilizando columnas de microcapilares de sílice fundida que están conectados bien a la fuente de nano-flujo por electropulverización de un espectrómetro de masas o al mecanismo de microfraccionamiento que ubica las fracciones en una placa para análisis MALDI.

Son adecuadas una variedad de técnicas de espectrometría de masas, preferiblemente la EM MALDI de desintegración post-fuente (PSD) o espectrometría de masa de ionización por electropulverización en tándem (IES-EM), más preferiblemente ESI-EM con trampa de iones.

Las secuencias de los péptidos individuales pueden determinarse por medios conocidos en la materia. Preferentemente, el análisis de secuencias se realiza por fragmentación de los péptidos y la interpretación del espectro del fragmento asistida por ordenador utilizando algoritmos, por ejemplo MASCOT o SEQUEST. Ambos algoritmos informáticos usan bases de datos de secuencias de proteínas y nucleótidos para realizar los análisis de correlación cruzada del experimento y espectros de masa en tándem generados teóricamente. Esto permite el análisis de secuencias de alto rendimiento automatizado.

Análisis cualitativo de péptidos por espectrometría de masas MALDI

Para el análisis cualitativo del repertorio peptídico completo obtenido tras la elución, debe realizarse una espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF) (del inglés, matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight). utilizando parámetros que no fragmentan los péptidos, el análisis por
MALDI-TOF proporciona una visión muy general en lo que respecta a la complejidad de la mezcla de péptidos y la presencia de péptidos dominantes.

Análisis cuantitativo de péptidos

Para estimar la cantidad de péptidos únicos eluidos de los receptores del péptido, el paso por la columna micro-capilar puede analizarse por un detector UV de flujo que funciona a una longitud de onda de detección de 214 nm. Para la cuantificación las áreas del pico de los péptidos a analizar se comparan con las áreas de los picos de las cantidades graduales de péptidos sintéticos estándar.

Estrategia 1

Enfoque ex-vivo

La estrategia 1 de la presente invención se usa para aislar los péptidos antigénicos que se cargaron en los receptores peptídicos dentro de un organismo (enfoque ex vivo, Fig. 1A).

La presente invención está relacionada con un método para aislar e identificar péptidos asociados a MHC de clase II en cantidades femtomolares cuyo método consiste en proporcionar de 0,2 a 3 \mug de complejos péptido- MHC de clase II de un organismo mamífero. Esta cantidad de receptores peptídicos equivale a la cantidad de material que está normalmente disponible a partir de las biopsias o los fluidos corporales de pacientes o donantes sanos, por ejemplo 100 ng de complejos péptido- MHC de clase II pueden purificarse de aproximadamente 5x10^{7} células mononucleares de sangre periférica aislada a partir de aproximadamente 50 ml de sangre.

Los complejos péptido- MHC de clase II pueden purificarse a partir de células aisladas, por ejemplo monocitos sanguíneos, a partir de una mezcla de células, por ejemplo células mononucleares de sangre periférica, a partir de tejidos, por ejemplo biopsias tumorales, o a partir de fluidos corporales por ejemplo ascitis o fluido sinovial.

Los fluidos corporales pueden contener complejos péptido- MHC de clase II unidos a células presentes en el fluido corporal, por ejemplo en el fluido sinovial, unido a vesículas presentes en el fluido corporal, por ejemplo vesículas apoptóticas o exosomas derivados de células (Denzer K et al., J Cell Science, 2000, 113, 3365-3374), o los complejos péptido-MHC de clase II pueden estar presentes en forma soluble, debido al derramamiento de la membrana plasmática, por ejemplo moléculas del MHC de clase II solubles (Aultman D et al., Human Immunol., 1999, 60, 239-244).

Los complejos péptido-MHC de clase II pueden aislarse a partir de fluidos corporales diversos de un organismo, por ejemplo de sangre, suero, ascitis, fluido sinovial o a partir de muestras de tejido de un organismo, por ejemplo biopsias, tumores primarios o secundarios extirpados o a partir de células aisladas de un organismo.

Los complejos de receptores peptídicos con péptidos antigénicos pueden aislarse a partir de células, tejidos o fluidos corporales de un organismo mamífero, preferiblemente a partir de un organismo humano.

Estrategia 2

Enfoque in vitro

La estrategia 2 de la presente invención prevé el aislamiento de péptidos antigénicos que se han cargado en receptores peptídicos fuera de un organismo, por ejemplo en un cultivo celular (enfoque in vitro, Fig. 1B).

En otra realización la presente invención está relacionada con un método para aislar péptidos antigénicos en cantidades femtomolares cuyo método consiste en (a) proporcionar células que expresen MHC de clase II en un número que proporciona de 0,2 a 3 \mug de moléculas MHC de clase II, (b) poner en contacto las células con una fuente de antígeno potencial, (c) aislar los complejos péptido antigénico- moléculas MHC de clase II de las células y (d) eluir los péptidos asociados de las moléculas MHC de clase II.

Las células que expresan MHC de clase II pueden ser células que expresan MHC II (CPA). Preferiblemente, las CPA son células dendríticas, más preferiblemente, las CPA son células dendríticas inmaduras, aún más preferiblemente, las CPA son células dendríticas inmaduras generadas a partir de monocitos de sangre periférica.

Las células dendríticas pueden generarse a partir de monocitos sanguíneos o de precursores de células madre CD34+ derivadas de la médula ósea. Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) pueden aislarse a partir de muestras sanguíneas por centrifugación por gradiente de densidad. Los monocitos pueden aislarse a partir de CMSP por métodos conocidos en la materia, por ejemplo por clasificación por partículas magnéticas. La fuente de células dendríticas pueden ser especies de mamíferos, preferiblemente humanos. Los monocitos pueden entonces diferenciarse en cultivos celulares para convertirse en células dendríticas inmaduras. El estado de diferenciación puede monitorizarse por análisis de citomería de flujo, por ejemplo utilizando la sobreregulación de marcadores de superficie celular CD83, CD80, CD86, HLA-DR.

La cantidad de tejido o fluido corporal necesario para obtener por ejemplo 100 ng de moléculas MHC de clase II depende del número de células que expresan MHC de clase II y de la tasa de expresión de las moléculas MHC de clase II: por ejemplo 100 ng de MHC de clase II son equivalentes a alrededor de 2x10^{5} CD maduras o entre 5 y 10x10^{6} monocitos de sangre periférica o alrededor de 5x10^{7} células mononucleares de sangre periférica que pueden obtenerse a partir de unos 50 ml de sangre.

Las CPA se ponen entonces en contacto con una fuente de antígeno potencial. Las CPA, preferiblemente las células dendríticas inmaduras, se maduran por métodos conocidos en la materia, por ejemplo mediante incubación con citoquinas inflamatorias, como TNF alfa o una mezcla de TNF alfa, IL-6, IL1 beta y PGE2.

La fuente de antígeno potencial ofrecida a las CPA puede seleccionarse del grupo que comprende tejido tumoral, células tumorales, líneas de células tumorales, líneas de células tumorales modificadas genéticamente, un lisado celular crudo de estas células o líneas celulares, proteínas de choque térmico derivadas de células tumorales, patógenos, antígenos conocidos de virus, bacterias y parásitos, tejidos sometidos a ataque inmunológico, antígenos propios conocidos, autoantígenos, fluidos corporales o biopsias de tejidos de pacientes con tumores, enfermedades autoinmunes o enfermedades infecciosas, fluidos corporales o biopsias de tejidos de individuos sanos como controles de referencia. Las CPA control están tratadas de manera equivalente excepto que no están expuestas a una fuente de antígeno potencial. La fuente de antígeno potencial puede provenir de especies de mamíferos diferentes, preferiblemente de humanos.

Las CPA pueden estar en contacto con una fuente de antígeno potencial captada por las CPA mediante la captación mediada por receptor o por la absorción de fase fluida y haber sido internalizado. Las células pueden infectarse con una fuente de antígeno potencial, por ejemplo con un virus.

Para eluir los péptidos de las moléculas de MHC, se obtiene un grupo de péptidos procesados de manera natural derivados de la fuente de antígeno potencial además de polipéptidos de origen intracelular o extracelular.

Validación de epítopos por los péptidos asociados a MHC

Las secuencias peptídicas identificadas por los métodos de la invención pueden validarse por alguno de los siguientes criterios, que comprenden el motivo de unión a MHC, la capacidad de unión a MHC y el reconocimiento de células T.

Los motivos de unión a MHC son características estructurales comunes de los péptidos asociados a una molécula de MHC particular (variante alélica) que son necesarios para formar complejos estables con moléculas de MHC. Los ligandos peptídicos eluidos de las moléculas de MHC de clase I son relativamente cortos, en un rango entre 8 a 11 aminoácidos. Además, 2 o 3 cadenas laterales de los péptidos son relevantes para la unión. La posición de las respectivas cadenas laterales de aminoácidos varía con el alelo HLA, la mayoría de las veces dos de estos residuos llamados "ancla" están localizados en las posiciones 2 y 9. Con respecto a una posición ancla particular, normalmente sólo 1 o 2 aminoácidos pueden funcionar como aminoácidos ancla, por ejemplo leucina o valina V en la posición 2 en el caso de HLA-A2.

En el caso de las moléculas de MHC de clase II, la longitud del péptido varía de 12 a 18 aminoácidos e incluso pueden unirse péptidos más largos puesto que ambos extremos del surco de unión del péptido están abiertos. La mayoría de moléculas del HLA de clase II tienen capacidad para 4 residuos ancla en las posiciones relativas P1, P4, P6 y P9 contenidos en una región central nonamérica. Esta región central, sin embargo, puede presentar una distancia variable desde el extremo N-terminal del péptido. En la mayoría de casos, los residuos 2-4 de N-terminal preceden a la región central. Por lo tanto, los residuos ancla P1 están localizados en las posiciones 3, 4 o 5 en la mayoría de péptidos asociados a HLA de clase II. Los péptidos eluidos de las moléculas de HLA-DR de clase II comparten una gran ancla P1 hidrofóbica, representada por tirosina, fenilalanina, triptófano, metionina, leucina, isoleucina o
valina.

La posición y el tipo exacto de residuos ancla constituyen el motivo de unión al péptido que es conocido por la mayoría de los productos alélicos HLA de clase II que ocurren frecuentemente. Un algoritmo informático que permite la validación de motivos en secuencias peptídicas es el "Tepitope", disponible en vaccinome (www.vaccinome.com).

La capacidad de unión a MHC de los péptidos identificados por los métodos de la presente invención pueden ser probados por métodos conocidos en el arte usando, por ejemplo, moléculas de MHC de clase II aisladas y péptidos sintéticos con secuencias de aminoácidos idénticas a aquellas identificadas por el método de la invención (Kropshofer H et al., J. Exp. Med. 1992; 175, 1799-1803; Vogt AB et al., J. Immunol. 1994; 153, 1665-1673; Sloan VS et al., Nature 1995; 375, 802-806). Alternativamente, puede usarse un ensayo de unión celular que utiliza líneas celulares que expresan MHC de clase II y péptidos biotinilados para verificar el epítopo identificado (Arndt SO et al., EMBO J., 2000; 19, 1241-1251).

En ambos ensayos, la capacidad de unión relativa de un péptido se mide determinando la concentración necesaria para reducir al 50% la unión de un péptido marcador marcado (CI50). El péptido que se une con una afinidad razonable a las moléculas HLA de clase II relevantes alcanza valores de CI50 que no exceden en 10 veces la CI50 de los péptidos establecidos como referencia.

Los mismos ensayos de unión pueden utilizarse también para probar la capacidad de los péptidos de unirse a moléculas MHC de clase II alternativas, es decir, moléculas MHC de clase II distintas de aquellas que las que se han eluido utilizando el método de la invención.

El reconocimiento de las células T puede representar otro proceso de verificación del epítopo que implique la prueba de la capacidad para activar las poblaciones de células T CD4+ de los péptidos identificados por los métodos de la invención. Las células T CD4+ se activan por péptidos unidos a moléculas del MHC de clase II. Se sintetizan péptidos con secuencias de aminoácidos idénticas a aquellas identificadas mediante los métodos de la invención o que corresponden a la secuencia central derivada de un grupo anidado de péptidos identificados mediante los métodos de la invención. Entonces se prueba la capacidad de los péptidos sintéticos de activar células T CD4+ de (a) sujetos de prueba que expresan moléculas de MHC de clase II de interés y tienen al menos un síntoma de la enfermedad; y (b) sujetos control que expresan la molécula MHC de clase II de interés y no tienen síntomas de la enfermedad. Sujetos control adicionales pueden ser aquellos con síntomas de la enfermedad y que no expresan la moléculas MHC de clase II de interés.

En algunas enfermedades (por ejemplo, aquellas con un componente autoinmune) la respuesta de las células T CD4+ de los sujetos de prueba pero no de las células T CD4+ de los sujetos control descritos en (b) proporciona evidencias confirmatorias de que el péptido relevante es un epítopo que activa las células T CD4+ que pueden iniciar, activar o exacerbar la enfermedad relevante. En otras enfermedades (por ejemplo cáncer o enfermedades infecciosas sin un componente autoinmune), un patrón similar de respuesta y falta de respuesta al descrito en la frase previa podría indicar que el péptido relevante es un epítopo que activa células T CD4+ que pueden mediar inmunidad frente a la enfermedad o, al menos, una disminución de los síntomas de la enfermedad.

Las respuestas de las células T CD4+ pueden medirse por una variedad de métodos in vitro conocidos en la materia. Por ejemplo, las células mononucleares de sangre periférica total (CMSP) pueden cultivarse con o sin un péptido sintético candidato y sus respuestas proliferativas pueden medirse, por ejemplo, mediante la incorporación de timidina-[^{3}H] en su DNA. Puede probarse que las células T proliferativas son células T CD4+ eliminando las células T CD4+ de las CMSP antes del ensayo o añadiendo anticuerpos inhibitorios que se unen a la molécula CD4+ en las células T, inhibiendo de ese modo la proliferación de estas últimas. En ambos casos, la respuesta proliferativa se inhibirá sólo si las células T CD4+ son las células que proliferan. Alternativamente, las células T CD4+ pueden purificarse a partir de las CMSP y probarse su respuesta proliferativa frente a los péptidos en presencia de CPA que expresan la molécula MHC de clase II apropiada. Tales CPA pueden ser linfocitos B, monocitos, macrófagos o células dendríticas, o CMSP total. Las CPA también pueden ser líneas celulares inmortalizadas derivadas de linfocitos B, monocitos, macrófagos o células dendríticas. Las CPA pueden expresar endógenamente la molécula de MHC de clase II de interés o pueden expresar polinucleótidos transfectados que codifican tales moléculas. En todos los casos las CPA pueden convertirse, antes del ensayo, en células no proliferativas mediante un tratamiento, por ejemplo, con radiación ionizante o mitomicina-C.

Como una alternativa a la medición de la proliferación celular, puede medirse la producción de citoquinas de las células T CD4+ mediante procedimientos conocidos en la materia. Las citoquinas incluyen, sin limitación, interleuquina 2 (IL-2), interferón gamma (IFN gamma), interleuquina 4 (IL-4), TNF-alfa, interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 10 (IL-10), interleuquina 12 (IL-12) o TGF beta. Los ensayos para medirlas incluyen, sin limitación, el ELISA y bioensayos en los se prueban la respuesta (por ejemplo, proliferación) de células sensibles a las citoquinas relevantes en presencia de una muestra de ensayo.

Alternativamente, la producción de citoquinas por los linfocitos CD4+ puede visualizarse directamente por tinción con inmunofluorescencia intracelular y por citometría de flujo.

Aplicaciones

Los métodos de la presente invención pueden aplicarse para identificar péptidos implicados en la patogénesis de un amplio rango de enfermedades, especialmente aquellas en las que la susceptibilidad se ha asociado con la expresión de uno o varios alelos del MHC específicos o aquellas en las que se han perdido las respuestas de células T restringidas a MHC.

Las enfermedades candidatas incluyen, sin limitación, las enfermedades autoinmunes (por ejemplo artritis reumatoide (AR), diabetes tipo I, esclerosis múltiple (EM), enfermedad celíaca, miastenia gravis (MG) y lupus eritematoso sistémico (LES)), el cáncer (por ejemplo melanoma, cáncer de mama, linfomas de células B, cáncer de próstata, cáncer renal) o las enfermedades infecciosas (por ejemplo enfermedades causadas por el VIH, el virus de la hepatitis C, el virus del sarampión, micobacterias).

Un aspecto de la invención es una propuesta terapéutica, en la que uno o más péptidos identificados se usan para vacunar pacientes contra el cáncer o enfermedades infecciosas. Con este fin, los péptidos relevantes pueden administrarse directamente al paciente, en una cantidad suficiente para que los péptidos se unan a las moléculas del MHC, y provoquen la activación de las células T seguida de la lisis mediada por las células T de las células infectadas o cancerosas.

Alternativamente, los péptidos relevantes pueden utilizarse para la generación de vacunas basadas en CD. En este caso, pueden realizarse pulsos con los péptidos relevantes o proteínas recombinantes que contengan las secuencias de péptidos relevantes en CD autólogas derivadas de los monocitos de los pacientes. En particular, en la vacunación contra tumores, pueden utilizarse una combinación de péptidos antigénicos tumorales asociados a MHC de clase I y clase II para realizar el pulso en las CD. De manera similar, las moléculas de ácidos nucleicos que codifican los péptidos relevantes pueden incorporarse en un vector para transfectar las células tumorales. Estas células tumorales transfectadas pueden fusionarse con las CD. En cualquiera de estos casos, las CD que presentan los péptidos relevantes en el contexto de las moléculas MHC adecuadas se administrarán al paciente para provocar una respuesta de las células T.

Otra aplicación terapéutica de los péptidos está relacionada con la situación en la que los péptidos identificados son autoantígenos en el contexto de las enfermedades autoinmunes. En este caso, los complejos del péptido autoantigénico respectivo y sus moléculas MHC de clase II restrictivas pueden ser la diana de anticuerpos quiméricos o humanizados. Esta aproximación puede dar lugar a la disminución de los complejos peptídicos del MHC de clase II autoantigénicos y, por lo tanto, a una disminución en el número de células T ayudantes CD4+ autoagresivas que pertenecen a una de las fuerzas motrices de la autoinmunidad.

Por lo tanto, la presente invención proporciona la utilización de los métodos descritos para el diseño de vacunas peptídicas individualizadas para el tratamiento de enfermedades, preferiblemente el cáncer.

Además, el método de la invención puede explotarse para distintos propósitos de diagnóstico. En primer lugar, los péptidos de la invención pueden utilizarse como marcadores de respuesta para rastrear la eficacia de un régimen terapéutico. Esencialmente, se puede determinar el valor basal para el péptido relevante, por ejemplo un péptido autoantigénico en el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide, utilizando la estrategia 1 de la invención, administrar un fármaco terapéutico dado y luego monitorizar los niveles del péptido autoantigénico a partir de ese momento, observando los cambios en los niveles del péptido como indicios de la eficacia del régimen.

Por lo tanto, la presente invención proporciona la utilización de los métodos descritos para controlar la eficacia de un tratamiento terapéutico.

De la misma manera, los péptidos asociados a MHC de clase II derivados de sangre de pacientes que sufren enfermedades autoinmunes (por ejemplo AR, diabetes tipo I, EM, enfermedad celíaca, MG o LES) pueden utilizarse como marcadores de respuesta para fármacos terapéuticos contra enfermedades autoinmunes.

Asimismo, los péptidos autoantigénicos que se encuentran sólo en determinados estados o fases de una enfermedad autoinmune pueden utilizarse como marcadores específicos de estadio.

Por lo tanto, la presente invención proporciona la utilización de los métodos descritos para la monitorización inmune de las enfermedades, preferiblemente enfermedades autoinmunes.

Otro aspecto de la invención es un método para controlar la calidad de las vacunas basadas en CD. Las CD autólogas usadas como vacunas contra tumores se exponen a antígenos tumorales para cargar las moléculas del MHC de las CD con los péptidos antigénicos tumorales apropiados. Un prerrequisito de una vacuna CD de alta calidad es un elevado número de copias de los péptidos antigénicos tumorales unidos a las moléculas del MHC relevantes. Aplicando la estrategia 2 de esta invención, la presencia o ausencia de los péptidos relevantes pueden analizarse previamente a la utilización de las respectivas preparaciones de CD para la vacunación. De forma similar, puede determinarse la calidad de las vacunas basadas en otras CPA, por ejemplo macrófagos o células B.

Por lo tanto, la presente invención proporciona la utilización de los métodos descritos para el control de calidad de las vacunas.

Finalmente, el método de la invención no sólo permite la identificación de los péptidos asociados a MHC de clase II, sino al mismo tiempo, de la proteína de la que se deriva el péptido. Estas proteínas pueden utilizarse como marcadores de diagnóstico de la misma manera como se ha descrito anteriormente para los péptidos correspon-
dientes.

Habiendo ya descrito en general esta invención, ésta se comprenderá mejor en referencia a ejemplos específicos, que están incluidos aquí con la única finalidad de ilustrar y que no pretenden ser limitantes, a menos que se especifique lo contrario, en relación con las siguientes figuras.

La Fig. 1A es un diagrama que muestra una visión general de la metodología que sigue la estrategia 1 (aproximación directa): los complejos de péptido - MHC de clase II o los complejos péptido - Hsp se aíslan directamente del tejido o de los fluidos corporales, dando lugar de ese modo a la identificación de los antígenos asociados a MHC de clase II o Hsp procesados de manera natural y presentados in vivo.

La Fig. 1B es un diagrama que muestra una visión general de la metodología que sigue la estrategia 2 (aproximación indirecta): Las células dendríticas (CD), las células presentadoras (CPA) de antígeno más especializadas, se ponen en contacto con una fuente antigénica (por ejemplo fluidos corporales) bajo condiciones óptimas para la captación del antígeno y el procesamiento del antígeno. Como control, las CD se cultivan bajo las mismas condiciones sin contacto con los antígenos. Después de la maduración de la CD, se purifican las moléculas MHC de clase II cargadas con el antígeno y se aíslan e identifican los respectivos péptidos antigénicos asociados a MHC de clase II.

La Fig. 2A ilustra la estrategia 2 y es un análisis de espectrometría de masas de los péptidos unidos a HLA-DR, aislados de células dendríticas maduras con tratamiento control (panel superior) o con un pulso de vacuna de la gripe Inflexal Berna V^{TM}, que contiene hemaglutinina recombinante encapsulada en virosoma del virus de la gripe (panel inferior). Las tres principales señales inducidas por el tratamiento con Inflexal Berna V^{TM} están marcados con flechas y números.

La Fig. 2B muestra la secuencia proteica (código de una letra) de la proteína hemaglutinina de la cepa B/ Yamanashi/166/98 de la gripe. Se subraya el epítopo recientemente identificado HLA-DR (véase la Fig. 2A).

La Fig. 3A contiene un análisis de espectrometría de masas representativo del repertorio de péptidos unidos a HLA-DR aislados de células dendríticas maduras con un tratamiento control (panel superior) o sometidas a un pulso con la línea celular de melanoma necrótico UKRV-Mel-15a (panel inferior). Está marcado el pico del péptido, (M+H^{+})=1820,6, que se vuelve dominante en el perfil al contactar con las células de melanoma.

La Fig. 3B muestra el correspondiente espectro de fragmentación MALDI-PSD del péptido con masa experimental (M+H+)=1820,6. Este péptido se indujo por contacto con las células de melanoma necrótico (Fig. 3A). La búsqueda en la base de datos condujo a la identificación del epítopo de vimentina, vimentina(202-217) (véase la Tabla 2).

La Fig. 3C muestra un espectro de EM-EM con trampa de iones de un péptido con la masa experimental
(M+H+)=1820,6. Este péptido se indujo por contacto con células de melanoma necrótico (Fig. 3A). La búsqueda en la base de datos condujo a la identificación del epítopo vimentina, vimentina(202-217) (véase la Tabla 2).

Ejemplos

Los ejemplos que siguen están en relación con las figuras descritas anteriormente y se basan en la metodología resumida en la Figura 1A y en la Figura 1B, y se describen en detalle a continuación. Los reactivos comercialmente disponibles contemplados en los ejemplos se usaron según las instrucciones del fabricante a menos que se indique lo contrario.

Metodología de la invención Líneas celulares y cultivo

El estudio se realizó con células dendríticas humanas que se diferenciaron a partir de monocitos, como se describe a continuación. Los monocitos se purificaron de sangre periférica humana. Además, se usaron las líneas celulares de melanoma UKRV-Mel-15a y UKRV-Mel-20c (Eichmueller S et al., Exp Dermatol 2002; 11, 292-31).

Todas las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (abreviado: RPMI) suplementado con Piruvato 1 mM, Glutamina 2 mM y un 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (Gibco BRL, Rockville, MD).

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP)

La sangre periférica se obtuvo de un banco de sangre local como preparaciones de capa leucocitaria estándar de donantes sanos. Se usó heparina (2001 U/ml sangre, Liquemine, Roche) para evitar la coagulación. Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se aislaron por centrifugación en LSM® (1,077-1,080 g/ml; ICN, Aurora, OH) a 800 g (temperatura ambiente) durante 30 min. Las CMSP se recogieron de la interfase y se lavaron dos veces en RPMI que contenía Hepes 20 mM (500 g durante 15 min., 300 g durante 5 min.). Para eliminar los eritrocitos, se trataron las CMSP con tampón ALT (cloruro de amonio 140 mM, Tris 20 mM, pH 7,2) durante 3 min. a 37ºC. Las CMSP se lavaron dos veces con RPMI que contenía Hepes 20 mM (200 g durante 5 min.).

Generación de células dendríticas de monocitos de sangre periférica

Los monocitos se aislaron de las CMSP por separación positiva utilizando partículas magnéticas anti-CD14 (Miltenyi Biotech, Auburn, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los monocitos se cultivaron en RPMI suplementado con aminoácidos no esenciales al 1% (Gibco, BRL, Rockville, MD), 50 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos humanos recombinante (GM-CSF; S.A. 1,1 x 10^{7} U/mg) (Leucomax; Novartis, Basilea, Suiza) y 3 ng/ml de IL-4 recombinante humana (S.A. 2,9 x 10^{4} U/mg) (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los monocitos se siembran a 0,3 x 10^{6}/ml en placas de 6 pocillos (Costar) durante 5 días para obtener células dendríticas inmaduras.

La calidad de células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos se monitorizó rutinariamente mediante un análisis de citometría de flujo según el fenotipo: CD1a (elevado), CD3 (neg.), CD 14 (reducido), CD19 (neg.), CD56 (neg.), CD80 (reducido), CD83 (neg.), CD86 (reducido) y HLA-DR (elevado). Por el contrario, las células dendríticas maduras (véase a continuación) muestran el siguiente fenotipo: CD1a (reducido), CD80 (elevado), CD83 (elevado), CD86 (elevado) y HLA-DR (elevado). Los anticuerpos monoclonales contra CD1a, CD3, CD14, CD19, CD56, CD80, CD83 y CD86, además de los controles de isotipo respectivos, se adquirieron de Pharmingen (San Diego,
CA).

Exposición de las células dendríticas a células de melanoma necrótico

Las líneas de células de melanoma se hicieron necróticas mediante 4 ciclos de congelación en nitrógeno líquido y la posterior descongelación a temperatura ambiente. El porcentaje de células necróticas se monitorizó mediante microscopía óptica. Para introducir en las células dendríticas el antígeno derivado de células del melanoma, se expusieron 6 x 10^{6} células dendríticas inmaduras a 1,8 x 10^{7} células necróticas (relación 3:1). Al mismo tiempo la maduración de las células dendríticas se indujo añadiendo 10 ng/ml de factor de necrosis tumoral recombinante humano (TNF alfa; S.A. 1,1 x 10^{5} U/mg). Como control, se incubaron 6 x 10^{6} células dendríticas sólo con TNF alfa.

Después de 24-48 horas de cocultivo, las células dendríticas maduras se recolectaron por centrifugación a 300 g durante 10 min. Las células se lavaron con RPMI que contenía SFB al 10% y se transfirieron a un tubo Eppendorf. Después de centrifugar a 400 g durante 3 min., el sobrenadante se eliminó completamente y las células se congelaron a -70ºC.

Generación de cuentas con anti-HLA de clase II

El anticuerpo monoclonal (mAb) anti-HLA-DR L243 (ATCC, Manassas, VA) se produjo cultivando la línea celular de hibridoma de ratón respectiva. El mAb L243 se purificó utilizando sefarosa con proteína A (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y se inmovilizó en cuentas de sefarosa activadas con CNBr (Pharmacia) en una concentración final de 2,5 mg/ml, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las cuentas L243 se mantuvieron en PBS que contenía un 0,1% de Zwittergent 3-12 (Calbiochem, La Jolla, CA).

Purificación a nanoescala de complejos de péptido - HLA-DR

Los botones de células dendríticas congeladas se resuspendieron un 10 volúmenes de tampón de lisis enfriado en hielo (Triton-X-100 al 1%, Tris 20 mM, pH 7,8, MgCl_{2} 5 mM, que contiene los inhibidores de proteasa quimostatina, pepstatina, PMSF y leupeptina (Roche, Mannheim, Alemania)) y se lisaron en un agitador horizontal a 1000 rpm, 4ºC durante 1 h. El lisado celular se clarificó de residuos celulares y núcleos mediante centrifugación a 2000 g, 4ºC durante 10 min. El lisado se coincubó con las cuentas L243 (5-10 \mul de cuentas L243 por cada 100 \mul de lisado celular) en un agitador horizontal a 1000 rpm, 4ºC durante 2 horas. Los complejos péptido-HLA-DR inmunoprecipitados unidos a las cuentas L243 se sedimentaron por centrifugación a 2000 g, 4ºC durante 5 min. y se lavaron tres veces con 300 \mul de Zwittergent 3-12 al 0,1% (Calbiochem) en PBS.

La eficacia de la eliminación de los complejos péptido-HLA-DR se monitorizó analizando los respectivos lisados celulares antes y después de la inmunoprecipitación. Se analizaron en paralelo alícuotas de las partículas por Western Blotting utilizando el mAb específico anti- HLA-DRa 1B5 (Adams, T.E. et al., Immunology 50 (1983) 613-624).

Elución de péptidos asociados a HLA-DR

Los complejos péptido-HLA-DR unidos a cuentas L243 se resuspendieron en 400 \mul de H_{2}O (calidad HPLC; Merck, Darmstadt, Alemania), se transfirieron a un tubo de ultrafiltración, Ultrafree MC, de tamaño de exclusión 30 kD (Millipore, Bedford, MA) y se lavaron 10 veces con 400 \mul de H_{2}O (calidad HPLC) mediante centrifugación durante 2-4 min. a 14000 rpm a 4ºC. Para eluir los péptidos unidos, se añadieron 50 \mul de ácido trifluoroacético al 0,1% (Fluka, Buchs, Suiza) en H_{2}O (calidad HPLC) y la incubación se realizó durante 30 min. a 37ºC. Los péptidos eluidos se recogieron en un nuevo tubo Eppendorf por centrifugación de la unidad Ultrafree a 14000 rpm durante 3 min. a TA e inmediatamente liofilizados en una centrífuga de vacío Speed-Vac^{TM}.

Fraccionamiento de péptidos mediante nano-HPLC

Los péptidos liofilizados eluidos de las moléculas HLA-DR se resuspendieron en ácido trifluoroacético al 0,05%, acetonitrilo al 5% (Merck, Darmstadt, Alemania) en H_{2}O, (calidad HPLC) y se separaron en un capilar PepMap C18 de 75 \mum x 15 cm (C18; 3 \mum; 100 \ring{A}) (LC-Packings, Amsterdam, Holanda) conectado a un automuestreador FAMOS^{TM} y un HPLC de nano-flujo ULTIMATE^{TM} (Dionex, Olten, Suiza). Se utilizó el siguiente gradiente no lineal a una tasa de flujo constante de 200 nl/min: 0-40 min. de sistema B al 5-50%; 40-50 min. de sistema B al 50-90%. El Sistema A era trifluoroacético al 0,05%, acetonitrilo al 5%/H_{2}O y el sistema B era trifluoroacético al 0,04%, acetonitrilo al 80%/H_{2}O. La separación se monitorizó mediante absorción UV dual a 214 nm y 280 nm. Las fracciones (400 nl) se recogieron utilizando el colector de fracciones PROBOT^{TM} (BAI, Weiterstadt, Alemania) y se situaron sobre un AnchorChip 600/384 para MALDI-EM (Bruker, Bremen, Alemania).

Análisis de secuencia de péptidos por espectrometría de masas Espectrometría de masas MALDI-TOF

Los péptidos colocados sobre una placa AnchorChip se cocristalizaron con la matriz (10 mg/ml; ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (Merck, Darmstadt, Alemania), acetonitrilo al 50%, ácido trifluoroacético al 0,1%). Para el análisis cualitativo del repertorio completo de péptidos, las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas MALDI-TOF Ultraflex^{TM} (Bruker, Bremen, Alemania), de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Espectrometría de masas EM/EM con trampa de iones

Para realizar la secuenciación de alto rendimiento de las mezclas de péptidos complejas, se usó el MudPIT (tecnología de identificación proteica multidimensional) (Washburn MP et al., Nat Biotechnol 19 (2001), 242-247) que se basa en un fraccionamiento en cromatografía líquida seguido de una secuenciación por espectrometría de masas.

Con este fin, los péptidos liofilizados eluidos de las moléculas HLA se resuspendieron en un tampón que contenía acetonitrilo al 5% (v/v), ácido acético al 0,5% (v/v), ácido heptafluorobutírico (HFBA) al 0,012% (v/v) y ácido fórmico al 5% (v/v). La muestra se separó en una columna microcapilar de sílice fundido (100 \mum i.d. x 365 \mum) generada por un extractor láser Modelo P-2000 (Sutter Instrument Co., Novato, CA). La microcolumna se llenó con material de fase reversa C18 de 3 \mum (C18-ACE 3 \mum [ProntoSIL 120-3-C18 ACE-EPS, Leonberg, Alemania]) seguido de 3 cm de material de intercambio catiónico de 5 \mum (Partisphere SCX; Whatman, Clifton, NJ).

Se llevó a cabo una separación de gradiente de 8 pasos completamente automatizada en un HPLC Agilent serie 1100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania), utilizando los siguientes tampones: ACN al 5%/HFBA al 0,02%/ ácido acético al 0,5% (tampón A), ACN al 80%/HFBA al 0,02%/ácido acético al 0,5% (tampón B), acetato de amonio 250 mM/ACN al 5%/HFBA al 0,02%/ácido acético al 0,5% (tampón C), y acetato de amonio 1,5 M/ACN al 5%/HFBA al 0,02%/ácido acético al 0,5%(tampón D). El primer paso de 106 min. consistía de un gradiente de 100 min. de tampón B del 0 al 80% y 6 min. mantenidos de tampón B al 80%. Los siguientes 6 pasos (106 min. cada uno) se caracterizaron por el siguiente perfil: 5 min. de tampón A al 100%, 2 min. de tampón C al x%, 5 min. de tampón A al 100%, un gradiente de 3 min. de tampón B del 0 al 10%, un gradiente de 55 min. de tampón B del 10 al 35%, un gradiente de 20 min. de tampón B del 35 al 50%, un gradiente de 16 min. de tampón B del 50 al 80%. Los 2 min. de porcentaje x de tampón C en los pasos 2-7 fueron los siguientes: 10, 20, 30, 40, 70, 90 y 100%. El paso 8 consistía en el siguiente perfil: un lavado de 5 min. de tampón A al 100%, un lavado salino de 20 min. con tampón D al 100% y un gradiente de 100 min. de tampón B al 0-80%.

La columna de HPLC se acopló directamente a un espectrómetro de masas con trampa de iones Finnigan LCQ (Finnigan, Bremen, Alemania) equipado con una fuente de ionización por electropulverización nano-LC. La espectrometría de masas en el modo EM-EM se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. La identificación de los péptidos se hizo mediante el algoritmo Sequest frente a la base de datos swiss.fasta.

Espectrometría de masas MALDI-PSD

Como alternativa al análisis de secuencias mediante EM/EM con trampa de iones, como se ha descrito anteriormente, se realizó un análisis MALDI-PSD en un espectrómetro de masas TOF/TOF Bruker Ultraflex (Bruker, Bremen, Alemania) utilizando el programa de adquisición de datos FLEXControl 1.1 Alpha. La calibración se consiguió utilizando una digestión por tripsina de la albúmina de suero humana (Merck, Darmstadt, Alemania). Las mezclas peptídicas se escanearon primero en modo de reflectrón. Los péptidos de interés se seleccionaron entonces para el modo de lift (análisis MALDI-PSD). El espectro de fragmentación de péptidos obtenido se evaluó automáticamente utilizando los programas Xmas 5.1.2 y Biotools 2.1 (Bruker) y se utilizó para la identificación de secuencias en una base de datos proteica no redundante utilizando el algoritmo MASCOT (http://www.matrixscience.com).

Ejemplo 1

La estrategia 1 (Fig. 1A) se usó para identificar péptidos asociados a moléculas HLA-DR expresadas en la superficie de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Las CMSP se aislaron de la sangre periférica mediante centrifugación por gradiente de densidad en Ficoll. De 50 ml de sangre se recuperaron 5,3 x 10^{7} CMSP. Los tipos celulares típicamente presentes en las CMSP son los linfocitos T (alrededor del 50%), linfocitos B (5-10%), monocitos (15-25%) y células NK (del inglés natural killer) (alrededor del 6%). Las células dendríticas de sangre periférica también están presentes pero sólo en muy pequeñas cantidades (< 0,5%). El análisis de CMSP por citometría de flujo reveló que tanto las células B como los monocitos expresan cantidades considerables de moléculas HLA-DR mientras que las células NK y las células T dan negativo en la tinción. La pequeña cantidad de células dendríticas en las CMSP no puede visualizarse mediante FACS. Las células T humanas son capaces de sobreexpresar el HLA-DR tras su activación, sin embargo, las células T activadas están normalmente ausentes en la sangre periférica.

Aunque el número de células B presentes en las CMSP es de 2 a 3 veces inferior al de los monocitos, su nivel de expresión de HLA-DR es unas 2 veces superior. Esto significa que en los lisados de CMSP el número de moléculas HLA-DR que se originan de células B es comparable al número de moléculas HLA-DR de los monocitos.

Las CMSP se lisaron en TX-100 y las moléculas HLA-DR se precipitaron utilizando el mAb L243 anti-DR. La precipitación se controló mediante un análisis de Western blot utilizando el mAb anti-DRalfa 1B5. Un análisis de Western blot cuantitativo utilizando moléculas HLA-DR purificadas como referencia reveló que se purificaron alrededor de 200 ng de HLA-DR a partir de 5,3 x 10^{7} células. Los péptidos asociados a HLA-DR se eluyeron en TFA al 0,1% y la mezcla peptídica se fraccionó utilizando un intercambio catiónico/cromatografía líquida de fase reversa bidimensional (MudPit). La secuenciación se realizó mediante espectrometría de masas con trampa de iones de alto rendimiento y la búsqueda en la base de datos se realizó utilizando el banco de datos humano "humangp". Los péptidos identificados con una correlación cruzada > 2,0 están listados en la Tabla 1.

Pudieron identificarse 27 péptidos: 8 péptidos derivaban de albúmina de suero humana y constituían un grupo anidado de péptidos típicos entre los péptidos asociados a MHC de clase II (variantes de elongación/truncamiento en los extremos N y C del mismo epítopo); 3 péptidos derivaban de apolipoproteína AII, de nuevo representando solamente un epítopo; 3 péptidos derivaban de alfa 1 anti-tripsina y representaban un epítopo; 4 péptidos derivaban de la proteína ERp72 relacionada con la isomerasa del disulfuro proteico (1 epítopo). Los últimos 9 péptidos derivaban de proteínas diferentes y, por lo tanto, representaban 9 epítopos diferentes.

Se derivaban 15 péptidos (4 epítopos) de proteínas extracelulares que son componentes principales del suero humano: la albúmina del suero es la proteína más abundante en el suero, la apolipoproteína All es un componente de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y la alfa 1 anti-tripsina es un inhibidor de proteasas del suero bien conocido. La cadena ligera de la ferritina (donante del péptido nº 10) está presente virtualmente en todas las células y a bajas concentraciones en el plasma. Muy probablemente, estas proteínas se internalizaron por captación de fase fluida, y después del procesamiento proteolítico los péptidos respectivos se cargaron en las moléculas HLA-DR dentro de las CPA (monocito o célula B). Alternativamente, estas proteínas o fragmentos de las respectivas proteínas podrían haberse unido a las moléculas de HLA-DR de la superficie celular.

La proteína transmembranal múltiple asociada al lisosoma (lam5) es el donante del péptido nº 4 y se expresa en células hematopoyéticas. La localización subcelular de lam5 es el lisosoma, así que está ya presente en el compartimento de carga de las moléculas HLA-DR, a las que puede unirse antes o después de la escisión proteolítica. Las moléculas HLA de clase I (que dan lugar al péptido nº 19) están presentes en casi todas las células nucleadas, por lo tanto es probable que deriven de las propias CPA. Alternativamente, las moléculas de HLA de clase I pueden tomarse a partir del suero, donde se ha descrito que se vierten moléculas HLA de clase I.

La PDI ERp72 es una proteína residente en el RE que se ha descrito se expresa en músculo y pulmón, pero también en una línea celular linfoblastoide. La ERp72 dio lugar a los péptidos nº 20 a 23. La piruvato quinasa es una proteína citosólica y existe en varias isoformas, expresándose la isoforma M1 en músculo, corazón y cerebro, y la isoforma M2 descrita en tejidos fetales. El epítopo (péptidos 20-23) está presente en ambas isoformas. El péptido nº 24 deriva de la actina alfa 1, una proteína citosólica que está altamente expresada en el músculo esquelético. Por lo tanto, los tres epítopos podrían derivar de células musculares que podrían haber liberado sus proteínas celulares al suero debido a lesión o a daños microtisulares.

El péptido nº 5 se derivó de la helicasa Fbox 1, sin embargo, poco se sabe hasta ahora, sobre la expresión en tejido de esta proteína.

Los péptidos nº 25, 26 y 27 derivan de proteínas que podrían repartirse en los cromosomas 17, 6 y 4, respectivamente, pero no había información acerca de las respectivas proteínas o su función, expresión en tejido o localización subcelular.

El análogo bovino (TPTLVEVSRSLGKVGTR) del epítopo de la albúmina del suero (péptidos nº 11-18) se ha descrito como un epítopo asociado a HLA-DR en el contexto de los alelos DR DRB1*1101//DRB1*1104 (Verreck FA et al., Immunogenetics 1996; 43, 392-397). Se ha identificado mediante la secuenciación de Edman de autopéptidos derivados de células B transformadas por EBV en cultivo. El motivo de unión al péptido de ambos alelos requiere un residuo aromático o alifático en posición P1, un residuo alifático en P4 y un residuo básico en P6 (Verreck FA et al., Immunogenetics 1996; 43, 392-397). Estos requisitos se cumplen también en el epítopo de albúmina de suero humana derivada de CMSP e identificada aquí (P1 = L, P4 = V, P6 = R), (péptidos 11-18), pero también en los péptidos 1-4, 6-10, 20-23 y 27 (Tabla 1). Además, se ha descrito un epítopo en superposición con el péptido de la alfa 1 anti-tripsina encontrado aquí en las células B - EBV en el contexto de DRB1*0402 (Friede T et al., 1996, Biochim Biophys Acta 1996; 1316; 85-10).

El alelo DR coexpresado con DRB1*1101 es DRB3*0202, y tiene los siguientes requisitos para la unión al péptido: residuo aromático o alifático en posición P1, una asparagina en P4 y un residuo polar en P6 (Verreck FA et al., Immunogenetics 1996; 43, 392-397). Estos requisitos los cumplen los péptidos 5 y 19. Así, la mayoría de los péptidos identificados (n=21) contienen el mismo motivo, los que indica que derivan del mismo alotipo HLA-DR o de más de un alotipo HLA-DR que comparte un motivo común.

Ejemplo 2

La estrategia 2 (Fig. 1B) se utilizó para identificar nuevos péptidos asociados a moléculas HLA-DR expresadas en la superficie de las células dendríticas que están expuestas a un antígeno potencial. En este caso, la fuente antigénica era una vacuna disponible comercialmente contra el virus de la gripe, conocida como INFLEXAL Berna V (Berna, Suiza).

Las células dendríticas se diferenciaron de los monocitos de sangre periférica y se cultivaron a una concentración de 0,5x10^{6} células/ml. Se expusieron 6x10^{6} células dendríticas a la vacuna INFLEXAL Berna V (Berna, Suiza) durante 24 horas añadiendo INFLEXAL Berna V a una concentración de 100 \mul/ml (que corresponde a 3 \mug/ml de hemaglutinina derivada del virus de la gripe). Al mismo tiempo la maduración de las células dendríticas se indujo añadiendo TNF alfa (10 ng/ml). Como control, se cultivó la misma cantidad de células dendríticas (6 x 10^{6}) en ausencia del antígeno, pero en presencia entonces de TNF alfa (10 ng/ml).

Ambos grupos de células dendríticas se lisaron en detergente TX-100 y se precipitaron las moléculas HLA-DR utilizando mAb L243 anti-DR inmovilizado en cuentas de sefarosa. Los péptidos asociados a HLA-DR se eluyeron con TFA al 0,1% y se analizaron por MALDI-EM (Fig. 2A): El panel superior muestra la compleja mezcla de autopéptidos asociados a HLA-DR de CD no pulsadas. Los 3 péptidos dominantes que muestran una relación masa-carga de m/z = 2334, m/z = 2545 y m/z = 2676, corresponden a variantes de CLIP, del inglés the class II associated invariant chain peptide, (Riberdy JM et al., Nature 1992; 360, 474-477), un autopéptido dominante en las células dendríticas maduras. El panel inferior muestra el repertorio peptídico de CD que se pulsaron con INFLEXAL. La comparación de ambos espectros de EM reveló que las 3 señales nuevas se volvían dominantes en el perfil del péptido MALDI-EM de CD al entrar en contacto con la vacuna INFLEXAL. Estas 3 señales nuevas aparecieron a m/z = 1969,4, m/z = 2097,6 y m/z = 2196,6 (Fig. 2A).

Las proteínas hemaglutinina contenidas en INFLEXAL Berna V derivaron de 3 cepas diferentes de virus de la gripe: cepa A/Nueva Caledonia/20/99; cepa A/Panamá/2007/99; cepa B/Yamanashi/166/98 (de acuerdo con la recomendación de la OMS teniendo en cuenta la diversidad genética de los virus circulantes (Lindstrom SE et al., J. Virol. 1999, 73, 4413-4426)).

Una búsqueda de las masas identificadas en las tres secuencias de hemaglutinina diferentes de las cepas de la gripe mencionadas anteriormente, revelaron que los tres péptidos representaban variantes de longitud de un epítopo (Id. de Sec. Nº: 86, 87, 88, 89) localizadas en la hemaglutinina del virus de la gripe, cepa B/Yamanashi/166/98 (Fig. 2B; Id. de Sec. Nº: 90).

Este epítopo HA(253-271) KPGKTKTIVYQRGILLPQK (Id. de Sec. Nº: 88) contiene el motivo de unión a péptidos del MHC para DRB1*0101 y DRB5*0101 utilizando I-260 como residuo ancla P1, Q-264 como P4 y L269 como P9 (los residuos ancla están subrayados).

Los estudios de unión a péptido del MHC que utilizan el péptido sintético con la secuencia de aminoácidos KPGKTKTIVYQRGILLPQ confirmaron la capacidad de unión a los alelos DRB1*0101 y DRB5*0101 y revelaron lo mismo para DRB1*0401. De este modo, el epítopo recientemente identificado derivado de la hemaglutinina del virus de la gripe (cepa B/Yamanashi/166/98) revela un epítopo con capacidad de unión promiscua.

Ejemplo 3

De forma adicional, la estrategia 2 (Fig. 1B) se utilizó para identificar péptidos tumorales asociados a HLA-DR. Así, las células dendríticas se expusieron a una línea celular de melanoma necrótico, UKRV-Mel-15a.

Se coincubaron 3x10^{6} células dendríticas con 9x10^{6} células necróticas de la línea de melanoma UKRV-Mel-15a y se cultivaron durante 24 horas en presencia de TNF alfa (10 ng/ml). Como control, se cultivaron 3x10^{6} células dendríticas solamente en presencia de TNF alfa (10 ng/ml).

Ambos grupos de células dendríticas se lisaron en detergente TX-100 y las moléculas HLA-DR se precipitaron utilizando mAb L243 anti-DR. Los péptidos asociados a HLA-DR se eluyeron con TFA al 0,1% y se analizaron por MALDI-EM (Fig. 3A):

En este ejemplo, los péptidos asociados a HLA-DR de ambos cultivos de CD se compararon por espectrometría MALDI-EM y sólo se usaron las señales peptídicas contenidas en el perfil de CD pulsadas con células de melanoma para identificar nuevos epítopos por secuenciaciones sucesivas.

El análisis MALDI-EM reveló una señal dominante con una masa observada de m/z = 1820,6 en el espectro de CD pulsadas en comparación con las CD no pulsadas (Fig. 3A).

La secuenciación por fragmentación MALDI-PSD resultó en un epítopo nuevo derivado del antígeno tumoral vimentina: vimentina(202-217) con la secuencia de aminoácidos TLQSFRQDVDNASLA (Fig. 3B). El análisis de la secuencia por EM-EM con trampa de iones confirmó esta secuencia (Fig. 3C).

La vimentina (202-217) y muchos otros antígenos conocidos del melanoma comparten un motivo común apropiado para la unión a moléculas HLA-DR4 B1*0401 (Tabla 2). En contraste al típico motivo de unión al péptido DRB1*0401 derivado de péptidos antigénicos propios y extraños, los péptidos derivados de melanA, CDC27, tirosinasa y vimentina presentan ácido aspártico (D) en lugar de treonina (T) o serina (S) en la posición ancla P6. La relevancia de esta peculiaridad permanece sin investigar.

La vimentina es conocida por ser una proteína marcadora en una variedad de tumores malignos y benignos. Junto con la melanA/MART-1, tirosinasa y S100, la vimentina se utiliza de forma rutinaria para seguir células de melanoma en muestras clínicas de los pacientes de melanoma. De forma interesante, los clones de melanoma con bajo potencial invasivo tienen una alta expresión de vimentina, mientras que la vimentina está regulada negativamente en los clones de células de melanoma altamente invasivas (Gutgemann A et al., Arch Dermatol Research 2001; 293, 283-290). Por contra, se observó un aumento de la expresión de vimentina en carcinoma de próstata pobremente diferenciado y metastático (Lang SH et al., Prostate 2002; 52, 253-263). Además, la vimentina se sobreexpresa en el carcinoma de células renales humano en relación al tejido renal normal (Stassar MJ et al. Br. J. Cancer 2001; 85, 1372-1382). Asimismo, >95% de células tumorales en el linfoma clásico de Hodgkin son positivos para la vimentina, mientras que los linfomas de células B ricas en células T son negativos para vimentina (Rudiger T et al., Am J Surg Path 1998, 22, 1184-91).

El péptido vimentina (202-217) identificado por el método de la invención es el primer epítopo de vimentina derivado de HLA restringido de clase II descrito hasta ahora.

Ejemplo 4

En este ejemplo la estrategia 2 (Fig. 1B) se utilizó para identificar la mayor cantidad de péptidos posible unidos a moléculas de HLA-DR de células dendríticas (CD) después de la maduración inducida por TNF alfa y la exposición a antígenos potenciales. La secuenciación se hizo por tecnología de EM-EM con trampa de iones de alto rendimiento.

Así, se coincubaron 5 x 10^{6} células dendríticas con 1,5 x 10^{7} células necróticas de la línea de melanoma UKRVMel-20c y se cultivaron durante 24 horas en presencia de TNF alfa (10 ng/ml). Como control, se cultivaron 5 x 10^{6} células dendríticas solamente en presencia de TNF alfa (10 ng/ml).

Ambos grupos de células dendríticas se lisaron en detergente TX-100 y las moléculas HLA-DR se precipitaron utilizando mAb L243 anti-DR. Los péptidos asociados a HLA-DR se eluyeron con TFA al 0,1% y se analizaron por tecnología de EM-EM CL con trampa de iones de alto rendimiento.

Las secuencias de péptidos identificadas de CD no pulsadas (control) se muestran en la Tabla 3, mientras que las secuencias de péptidos identificadas de CD pulsadas con células de melanoma necrótico se muestran en la Tabla 4.

Las secuencias de los 35 péptidos individuales de las moléculas HLA-DR de las CD se identificaron en ausencia de células de melanoma, y las secuencias de los 40 péptidos se encontraron en presencia de células de melanoma UKRV-Me120c. La comparación de las secuencias de péptidos reveló que 21 péptidos eran idénticos (nº. 1-21), 14 secuencias (11 epítopos) eran específicos de CD no pulsadas y 17 secuencias (9 epítopos) estaban presentes sólo después del pulso de células de melanoma.

7 de los 9 péptidos inducidos por células de melanoma comparten el motivo de unión de DRB1*0405 (Tabla 5). En gran medida, 3 de los 9 epítopos inducidos por células de melanoma derivaron de proteínas marcadoras de tumores conocidos, a saber factor de traducción IF- 4A1, factor de traducción FE-1 alfa y P78 inducible por interferon gamma (IFN gamma).

El factor de iniciación de traducción IF-4A1 está consistentemente sobreexpresado en las líneas celulares de melanoma en relación a los melanocitos humanos normales. La sobreexpresión de IF-4A1 parece ser un rasgo importante de las células de melanoma y podría contribuir a su transformación neoplásica (Eberle J et al., Int. J. Cancer 1997; 71, 396-401).

Una gran evidencia sugiere la participación de los factores de elongación ribosomal (EF) en el inicio de la oncogénesis. La expresión alterada de EF-1 alfa, un componente central de la síntesis de proteínas, se ha relacionado en varios estudios con los fenotipos transformados. La sobreexpresión del mRNA de EF-1 alfa se ha correlacionado con el aumento de potencial metastático en adenocarcinoma mamario y el EF-1 alfa tiene un grado considerable de homología con el oncogén de próstata PTI-1 (Gopalkrishnan RV et al., Int J. Biochem Cell Biol 1999; 31, 151-162; Edmonds BT et al., J Cell Sci 1996; 109, 2705-2714).

Se eluyó un autopéptido procesado de manera natural derivado de EF-1 alfa que contiene el mismo epítopo que los péptidos nº. 42 y 43 (Tabla 4) de moléculas HLA-DR purificadas de líneas de células B transformadas EBV (Verreck FA et al., Immunogenetics 1996; 43, 392-397).

La progresión del cáncer de próstata de un estado dependiente de hormonas a uno independiente de hormonas incluye una cascada de alteraciones genéticas causadas por la activación de oncogenes y/o la inactivación de genes supresores de tumores. Se identificaron varios genes que están altamente sobreexpresados en líneas de células de cáncer independiente de andrógenos. Entre otros, se identificaron los genes inducibles por interferón 1-8U y p78 (Markku H et al., Lab Invest. 2000; 80, 1259-1268.).

Así, los péptidos derivados del factor de traducción IF-4A1, factor de traducción EF-1 alfa y P78 inducible por IFN gamma identificados por el método de la invención son nuevos candidatos antigénicos de tumor que pueden utilizarse como marcadores de diagnóstico o vacunas terapéuticas.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

<110> F. Hoffmann-La Roche Ltd.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Método para la identificación de péptidos antigénicos asociados a enfermedades

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 21388

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.2

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

41

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip0,8cm

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip0,8cm

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\hskip0,8cm

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip0,8cm

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\hskip0,8cm

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\hskip0,8cm

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\hskip0,8cm

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\hskip0,8cm

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\hskip0,8cm

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\hskip0,8cm

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

93

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Influenza B virus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Influenza virus B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\hskip0,8cm

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Influenza virus B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\hskip0,8cm

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Influenza virus B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\hskip0,8cm

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 346

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Influenza virus B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\hskip0,8cm

100

\hskip0,8cm

101

Claims (18)

1. Un método para aislar péptidos antigénicos en cantidades femtomolares, cuyo método consiste en

(a)

proporcionar complejos de moléculas de MHC II con péptidos antigénicos aislados a partir de células, muestras de tejido o fluido corporal de un organismo mamífero en una cantidad de 0,2 a 3 \mug y

(b)

secuestrar los complejos mediante inmunoprecipitación, en el que los complejos están acoplados con anticuerpos específicos MHCII a cuentas,

c)

lavar los complejos unidos de moléculas MHCII con péptidos antigénicos con agua o tampón bajo en sal, donde el tampón bajo en sal es un tampón Tris, fosfato o acetato en un rango de concentración de 0,5 a 10 mM y

d)

eluir los péptidos antigénicos asociados de las moléculas MHC II.

\vskip1.000000\baselineskip

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células aisladas de un organismo mamífero son células dendríticas.

3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que los complejos secuestrados de moléculas MHC II con péptidos antigénicos se lavan con agua en un tubo de ultrafiltración antes de eluir los péptidos.

4. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el que los péptidos antigénicos se eluyen de las moléculas MHC II utilizando ácido diluido.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los péptidos antigénicos se eluyen de las moléculas MHC II a 37ºC con ácido trifluoroacético diluido.

6. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en el que los péptidos antigénicos aislados se fraccionan, se secuencian y se identifican.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que los péptidos antigénicos aislados se fraccionan, se secuencian y se identifican por métodos que comprenden cromatografía líquida y espectrometría de masas.

8. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en el que los péptidos antigénicos son péptidos antigénicos procesados de manera natural o péptidos antigénicos procesados de manera no natural administrados al
organismo.

9. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en el que las células son células que expresan moléculas MHC II.

10. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9 donde el organismo mamífero es un organismo huma-
no.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en el que las células del paso a) son células que expresan MHC II en un número que proporciona de 0,2 a 3 \mug de moléculas MHC II y en el que las células que expresan MHC II están en contacto con una fuente de antígeno potencial previamente al aislamiento de los complejos peptídicos antígeno- molécula MHC II.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que las células que expresan MHC II son células dendríticas y en el que las células dendríticas están expuestas a una fuente potencial de antígeno como células dendríticas inmaduras al mismo tiempo que son inducidas a células dendríticas maduras.

13. El método de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 12, en el que la fuente de antígeno potencial pertenece al grupo que comprende células tumorales, líneas de células tumorales, patógenos, antígenos virales, bacterianos o parasíticos, autoantígenos, fluidos corporales por ejemplo suero, fluido sinovial, ascitis.

14. El método de acuerdo con las reivindicaciones 11 a 13, en el que los péptidos antigénicos aislados se fraccionan, se secuencian y se identifican y los péptidos antigénicos derivados de la fuente del antígeno potencial se identifican comparando a los péptidos identificados de las células que han estado en contacto con un fuente del antígeno potencial con aquellos que se han identificado de células que no han estado en contacto con la fuente del antígeno
potencial.

15. El uso de los métodos de las reivindicaciones 11 a 14 para el control de calidad de las vacunas.

\newpage

16. El uso de los métodos de las reivindicaciones 1 a 14 para la monitorización inmunológica de las enfermedades.

17. El uso de los métodos de las reivindicaciones 1 a 14 para el control de la eficacia de un tratamiento terapéutico.

18. El uso de los métodos de las reivindicaciones 1 a 14 para el diseño de vacunas peptídicas individualizadas para el tratamiento de enfermedades.