ES2347284T3 - Uso de depsipeptido y congeneres del mismo como inmunosupresores en la prevencion o tratamiento del rechazo que sigue a un transplante y para inducir la apoptosis de celulas t cd4 o cd8 activadas. - Google Patents

Abstract

El uso de un compuesto con la siguiente estructura: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero de la misma, en la que: m es 1, 2, 3 ó 4; n es 0, 1, 2 ó 3; p y q son independientemente 1 ó 2; X es O, NH o NR; R1, o R2 y R3 son lo mismo o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; para la fabricación de un medicamento para usar en la prevención o tratamiento del rechazo tras un transplante.

Description

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Uso de depsipéptido y congéneres del mismo como inmunodepresores en la prevención o tratamiento del rechazo que sigue a un transplante y para inducir la apoptosis de células T CD4 o CD8 activadas.

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, a depsipéptidos o congéneres de los mismos y al uso de los mismos como inmunodepresores y, más específicamente, al tratamiento y/o la prevención de un trastorno inmunitario tal como enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias y para la reducción de rechazo inmunológico del material trasplantado, por administración a un animal de una cantidad eficaz de un depsipéptido tal como FR901228.

Fundamentos de la invención

Es deseable la modulación del sistema inmunitario en una variedad de contextos, a partir de la inhibición de una respuesta autoinmunitaria, para controlar enfermedades infecciosas e inhibir el rechazo de injerto/tejido. La principal solución para mitigar el rechazo es la supresión farmacológica del sistema inmunitario del receptor. Con esto en mente, la mayoría de los compuestos inmunomoduladores que se utilizan en la actualidad son inmunodepresores. Desde el principio de los años 60, la disponibilidad de estos agentes inmunodepresores ha estado restringida a sólo unos fármacos. Sin embargo, en el principio de los años 80, además de azatioprina y corticosteroides, la ciclosporina llegó a estar disponible de manera generalizada y ha sido el fármaco de elección desde entonces. (Kobashigawa, Trans. Proc. 30:1.095-1.097, 1.998, Isoniemi, Ann. Chi. Gyn. 86:164-170, 1.997). Sin embargo, los agentes inmunodepresores más recientes son relativamente pocos en número y también se experimentan muchos de los efectos secundarios no deseados, asociados con agentes más tempranos. Aunque se han usado estos fármacos para aumentar los tiempos de supervivencia para órganos trasplantados, bien como agentes únicos o en asociación con otros inmunodepresores, muchos también son útiles para tratar enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias, hipersensibilidad retardada, enfermedades del injerto contra el hospedador y enfermedades asociadas al sistema inmunitario, similares.

Los fármacos inmunodepresores usados en la actualidad incluyen agentes antiproliferativos, tales como: metotrexato, azatioprina y ciclofosfamida. Puesto que estos fármacos afectan a la mitosis y a la división celular, presentan graves efectos tóxicos sobre las células normales con alta velocidad de recambio tal como células de médula ósea y el revestimiento del tubo digestivo. (Miller, Semin. Vet. Med. Surg. 12(3):144-149, 1.997). De acuerdo con esto, la depresión de la médula y la lesión hepática son efectos secundarios comunes.

Los compuestos antiinflamatorios usados para producir inmunodepresión incluyen corticosteroides adrenales tales como dexametasona y prednisolona. Los efectos secundarios comunes, observados con el uso de estos compuestos son: infecciones frecuentes, metabolismo anormal, hipertensión arterial y diabetes.

Otros compuestos inmunodepresores usados en la actualidad, para inhibir la activación de los linfocitos y posterior proliferación incluyen: ciclosporina, FK506 y rapamicina. Estos fármacos inhiben bien la fosfatasa dependiente de calcio, calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6, que es importante para la señalización producida por factor de crecimiento (rapamicina) (Liu et al., Cell 66:807-815; 1.991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1.991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1.993; Isoniemi (supra)). La ciclosporina y los compuestos de su familia están entre los inmunodepresores más comúnmente usados. La ciclosporina se usa típicamente para prevenir o tratar el rechazo de órganos en trasplantes de: riñón, hígado, corazón, páncreas, médula ósea y corazón-pulmón, así como para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias tales como: enfermedad de Crohn, anemia aplásica, esclerosis múltiple, miastenia grave, uveítis, cirrosis biliar, etc. Sin embargo, las ciclosporinas experimentan un intervalo de administración terapéutica pequeño y efectos tóxicos graves incluyendo: nefrotoxicidad, hepatotoxicidad, hipertensión arterial, hirsutismo, cáncer y neurotoxicidad. (Philip and Gerson. Clin. Lab. Med. 18(4):755-765, 1.998; Hojo et al., Nature 397:530-534, 1.999).

Adicionalmente, se han usado anticuerpos monoclonales, tales como OKT3, para prevenir y/o tratar el rechazo de injerto. La introducción de anticuerpos monoclonales en un paciente, como con muchos materiales biológicos, produce diversos efectos secundarios, tales como escalofríos y disnea. (Richards et al., Cancer Res. 59(9):2.096-2.101, 1.999).

Dentro del contexto de muchas enfermedades potencialmente mortales, el trasplante de órganos se considera un tratamiento clásico y, en muchos casos, la única alternativa a la muerte. La respuesta inmunitaria a antígenos de superficies celulares extrañas en el injerto, codificada por el complejo principal de histocompatibilidad (CPH) y presente en todas las células, en general impide el trasplante con éxito de tejidos y órganos a menos que los tejidos para trasplante procedan de un donante compatible y se suprima la respuesta inmunitaria normal. De otra manera que con gemelos idénticos, la mejor compatibilidad y por lo tanto, índices de implantación a largo plazo, se consiguen usando donantes hermanos idénticos de CPH o donantes cadáveres no emparentados, idénticos, de CPH (Strom, Clin. Asp. Autoimm. 4:8-19, 1.990). Sin embargo, tales casos de compatibilidad ideal son difíciles de conseguir. Además, con la necesidad creciente de órganos de donantes existe en la actualidad una escasez creciente de órganos para trasplante. De acuerdo con esto, ha surgido el xenotrasplante como un área de estudio intensivo pero se hace frente a muchos obstáculos con respecto al rechazo dentro del animal receptor (Kaufman et al., Annu. Rev. Immunol. 13:339-367, 1.995).

La respuesta del hospedador a un aloinjerto de órgano implica una compleja serie de interacciones celulares entre linfocitos T y B, así como macrófagos o células dendríticas que se reconocen y se activan por antígeno extraño (Strom, supra; Cellular and Molecular Immunology. Abbas et al., (Eds), WB Saunders Co., Penn., 1.994). Los factores estimulantes conjuntos, principalmente citocinas y las interacciones específicas entre células, proporcionadas por células accesorias activadas tales como macrófagos o células dendríticas, son esenciales para la proliferación de células T. Estos macrófagos y células dendríticas se adhieren bien directamente a células T por proteínas de adhesión específicas o segregan citocinas que estimulan células T, tales como IL-12 e IL-15 (Strom. En: Organ Transplantation: Current Clinical and Immunological Concepts, 1.989). Las señales de estimulación conjunta procedentes de células accesorias, estimulan la activación de la transcripción y la expresión del gen interleucina-2 (IL-2) de receptores de IL-2 de alta afinidad en células T (Pankewycz et al., Transplantation 47:318, 1.989; Cantrell et al., Science 224:1.312, 1.991; Williams et al., J. Immunol. 132:2.330-2.337, 1.984). Se segrega IL-2, una proteína de 15 kDa, por linfocitos T en la estimulación de antígenos y se requiere para la respuesta inmunitaria normal. IL-2 estimula la proliferación y diferenciación de las células linfáticas por unión a receptores (IL-2R) de superficies celulares específicas de IL-2. IL-2 también inicia la ayuda a la activación de células T de células T citotóxicas y estimula la segregación de interferón- (IFN-), que a su vez activa las propiedades citodestructivas de los macrófagos (Farrar et al., J. Immunol. 126:1.120-1.125, 1.981). Además, IFN- e IL-4 también son importantes activadores de expresión de clase II de CPH en el órgano trasplantado, extendiéndose de ese modo adicionalmente la cascada de rechazo por exaltación de la capacidad inmunógena del órgano trasplantado

\hbox{(Pober  et al., J Exp. Med. 157 :1.339,  1.983;
Kelley  et al., J. Immunol. 132 :240-245,
1.984).}

El modelo actual de una respuesta en que intervienen células T sugiere que las células T se sensibilizan en la zona de las células T de órganos linfáticos secundarios, principalmente por células dendríticas. La interacción inicial requiere contacto célula a célula entre moléculas de CPH cargadas de antígeno sobre células que presentan antígeno (las CPA) y el complejo receptor de células T (RCT)/CD3 sobre células T. El acoplamiento del complejo RCT/CD3 produce expresión de CD154 predominantemente sobre células T CD4, que a su vez activan la CPA por acoplamiento de CD40, conduciendo a la presentación de antígeno mejorada (Grewal et al., Ann. Rev. Immunol. 16:111-135, 1.998). Esto está causado parcialmente por regulación hacia arriba de la expresión de CD80 y CD86 en la CPA, que son ambos ligandos para la importante molécula de estimulación conjunta de CD28, en células T. Sin embargo, el acoplamiento de CD40 también conduce a la expresión superficial prolongada de complejos de CPH y antígeno, expresión de ligandos para 4-1BB y OX-40 (moléculas de estimulación conjunta potentes, expresadas en células T activadas). Además, el acoplamiento de CD40 conduce a la segregación de diversas citocinas (por ejemplo, IL-12, IL-15, TNF-\alpha, IL-1, IL-6 e IL-8) y quimiocinas (por ejemplo, Rantes, MIP-1\alpha y MPC-1), todas las cuales tienen efectos importantes sobre la activación y la maduración tanto de CPA como de células T (Mackey et al., J. Leukoc. Biol. 63:418-428, 1.998).

Mecanismos similares están implicados en el desarrollo de enfermedad autoinmunitaria, tal como diabetes de tipo I. En seres humanos y en ratones diabéticos no obesos (DNO), la diabetes sacarina dependiente de insulina (DSDI) resulta de una destrucción autoinmunitaria dependiente de células T, espontanea, de las células \beta pancreáticas que producen insulina, que se intensifica con la edad. El procedimiento está precedido por infiltración de los islotes con células mononucleares (insulitis), compuesta principalmente por linfocitos T (Bottazzo et al. J. Engl. J. Med. 113:353, 1.985; Miyazaki et al. Clin. Exp. Immunol. 60:622, 1.985). Un equilibro delicado entre células T autoagresivas y fenómenos inmunitarios de tipo depresor, determinan si la expresión de autoinmunidad se limita a insulitis o progresa a DSDI. En ratones DNO, un modelo de DSDI humano, han tenido éxito estrategias terapéuticas que fijan como objetivo las células T, en prevenir la DSDI (Makino et al., Exp. Anim. 29:1, 1.980). Estas incluyen timectomía neonatal, administración de ciclosporina e infusión intravenosa de anticuerpos monoclonales (IL-2R) de células T antipan, antiCD4 o antiCD25, (los mAb, por sus siglas en inglés) (Tarui et al., Insulitis and Type I Diabetes. Lessons from the NOD Mouse, Academic Press, Tokio, pág. 143, 1.986). Otros modelos incluyen los utilizados típicamente para enfermedad autoinmunitaria e inflamatoria, tales como: esclerosis múltiple (modelo EAE), artritis reumatoide, enfermedad del injerto contra el hospedador, lupus eritematoso sistémico (modelo NZBxNZWF_{1}- - -autoinmunidad sistémica) y similares, (véase, por ejemplo, Theofilopoulos and Dixon, Adv. Immunol. 37:269-389, 1.985; Eisenberg et al., J. Immunol. 125:1.032-1.036, 1.980; Bonneville et al., Nature 344:163-165, 1.990; Dent et al., Nature 343:714-719, 1.990; Todd et al., Nature 351:542-547, 1.991; Watanabe et al., Biochem. Genet. 29:325-335, 1.991; Morris et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 57:263-273, 1.990; Takahashi et al., Cell 76:969-976, 1.994; Current Protocols in Immunology, Richard Coico (Ed.), John Wiley & Sons, Inc. Capítulo 15, 1.998).

La patente de EE.UU. Nº 5.294.603 describe derivados de didemnina estructuralmente diferentes que son citotóxicos, antivíricos e inmunodepresores.

En un artículo de Wang Ruoxiang et al titulado "Fungal metabolite FR901228 inhibits c-Myc and Fas ligand expression in oncogene" (volumen 17, número 12, 24 de septiembre de 1998 (páginas 1503-1508) se indica que el FR901228 bloquea la apoptosis inducida por activación en hibridomas de células, que se correlaciona con su inhibición específica de expresión de c-Myc. También se indica que el FR901228 no efectúa la producción inducida por activación de IL-2.

El objetivo de toda prevención de rechazo y estrategias de inhibición autoinmunitaria es suprimir la reactividad inmunitaria del paciente al tejido o agente antigénico, con un mínimo de morbilidad y mortalidad. De acuerdo con esto, en la actualidad se está usando una serie de fármacos o investigando sus propiedades inmunodepresoras. Como se discutió anteriormente, el inmunodepresor más comúnmente usado es ciclosporina, pero el uso de ciclosporina presenta numerosos efectos secundarios. De acuerdo con esto, en vista de las relativamente pocas elecciones para agentes eficaces en inmunodepresión, con perfiles de baja toxicidad y efectos secundarios manejables, existe una necesidad en la técnica de identificación de agentes inmunodepresores alternativos. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona otras ventajas relacionadas.

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En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un compuesto con la siguiente estructura:

1

o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero de la misma,

en la que:

m es 1, 2, 3 ó 4;

n es 0, 1, 2 ó 3;

p y q son independientemente 1 ó 2;

X es O, NH o NR;

R_{1}, o R_{2} y R_{3} son los mismos o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y

R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; para la fabricación de un medicamento para usar en la prevención o tratamiento del rechazo tras un transplante. Preferiblemente, el transplante comprende el transplante de uno cualquiera o más de los órganos o tejidos seleccionados del grupo que consiste en corazón, riñón, hígado, médula ósea, piel, córnea, vasos, pulmón, páncreas, intestino, extremidad, músculo, tejido nervioso, duodeno, intestino delgado y célula de islotes pancreáticos.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un compuesto con la siguiente estructura:

2

o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero de la misma,

en la que:

m es 1, 2, 3 ó 4;

n es 0, 1, 2 ó 3;

p y q son independientemente 1 ó 2;

X es O, NH o NR;

R_{1}, R_{2} y R_{3} son los mismos o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y

R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; para la fabricación de un medicamento para usar en la inhibición del crecimiento de células T CD4 o CD8, donde dichas células T CD4 o CD8 han sido inducidas por la unión de CD3 y CD28.

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En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un compuesto con la siguiente estruc-
tura:

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o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero de la misma,

en la que:

m es 1, 2, 3 ó 4;

n es 0, 1, 2 ó 3;

p y q son independientemente 1 ó 2;

X es O, NH o NR;

R_{1}, o R_{2} y R_{3} son los mismos o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y

R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; para la fabricación de un medicamento para usar en la inhibición del crecimiento de células T CD4 o CD8, donde dichas células T CD4 o CD8 han sido inducidas por lonomicina/PMA.

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En otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un compuesto con la siguiente estructura:

4

o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero de la misma,

en la que:

m es 1, 2, 3 ó 4;

n es 0, 1, 2 ó 3;

p y q son independientemente 1 ó 2;

X es O, NH o NR;

R_{1}, o R_{2} y R_{3} son los mismos o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y

R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; para la fabricación de un medicamento para usar en la inhibición del crecimiento de células T CD4 o CD8, donde dichas células T CD4 o CD8 han sido inducidas por células dendríticas alogénicas.

En resumen, la presente descripción se dirige a depsipéptidos y congéneres de los mismos (también referidos en la presente memoria como "compuestos") que tienen actividad como agentes inmunosupresores. También se describe un método para suprimir una respuesta inmunitaria de un animal, administrando al animal una cantidad eficaz de un compuesto con la siguiente estructura (I):

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en la que m, n, p, q, X, Y, R_{1}, R_{2} y R_{3} son como se define a continuación, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables y estereoisómeros de las mismas.

En la práctica de los métodos de la presente descripción, los compuestos se pueden administrar suprimiendo la respuesta inmunitaria en animales que tienen enfermedad autoinmunitaria, enfermedad inflamatoria o enfermedad del injerto contra el hospedador, así como a animales que han experimentado un alotrasplante o xenotrasplante. Los métodos adicionales de esta invención incluyen la administración de un compuesto de esta invención para inhibir la proliferación de linfocitos, para exaltar la supervivencia del injerto siguiendo al trasplante por administración previa a, al mismo tiempo con o posterior a un procedimiento de trasplante (incluyendo alotrasplante y xenotrasplante), para reducir la segregación de IL-2 a partir de linfocitos, para inhibir la producción de CD25 o CD154 en linfocitos siguiendo a estimulación y/o para producir anergia o muerte celular programada en células T activadas al tiempo que se mantienen recuentos de células T completos.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona métodos para producir tolerancia del sistema inmunitario a un antígeno por administración a un animal de una dosis de un compuesto de estructura (1). También se describen métodos para reducir la segregación de TNF-\alpha y para inhibir el ciclo celular de una célula T activada previamente a la entrada en la fase S por administración a un compuesto de estructura (I).

Estos y otros aspectos de esta invención serán obvios con referencia a la siguiente descripción detallada. Con este propósito, se muestran diversas referencias en la presente memoria, que describen en más detalle cierta información de los fundamentos, procedimientos, compuestos y/o composiciones.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama de barras que representa inhibición dependiente de la dosis de proliferación de linfocitos de sangre periférica (LSP) siguiendo incubación con FR901228 y estimulación por perlas con anticuerpos antiCD3 y antiCD28 unidos a las mismas.

La Figura 2 es un diagrama de barras que representa inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de linfocitos de sangre periférica (LSP), siguiendo incubación con FR901228 y estimulación con lonomicina/AFM (por sus siglas en inglés).

La Figura 3 es un diagrama de barras que representa inhibición dependiente de la dosis de proliferación de células T positivas, CD4, siguiendo incubación con FR901228 y estimulación por perlas con anticuerpos antiCD3 y antiCD28 unidos a las mismas.

La Figura 4 es un diagrama de barras que representa inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de células T positivas, CD4, siguiendo incubación con FR901228 y estimulación con células dendríticas alogénicas generadas in vitro.

Las Figuras 5A-5D son diagramas de barras que representan mediciones de citometría de flujo de: (A) expresión de CD154, (B) expresión de CD25, (C) expresión de CD69 y (D) viabilidad celular, siguiendo activación de células T en presencia de niveles variables de FR901228.

La Figura 6 es un diagrama de barras que representa la expresión de IL-2 cuando se mide por ELISA (por sus siglas en inglés), 24 horas después de estimulación con perlas, 3x28, (perlas conjugadas de antiCD3 y antiCD28) de células T en presencia de niveles variables de FR901228.

La Figura 7 es un diagrama de barras que representa la intensidad de fluorescencia media de células CD4 coloreadas con DACF-ES, el día 6, siguiendo estimulación o no estimulación, con perlas, 3x28, en asociación con la adición de FR901228 en puntos de tiempo variables.

Las Figuras 8A-8B son diagramas de barras que representan mediciones por citometría de flujo de: (A) expresión de CD137w, CD154, CD25, CD62L y CD49d y (B) expresión de CD11a, CD134, CD26, CD54, CD95 y CD69, siguiendo estimulación o no estimulación con perlas, 3x28, en presencia o ausencia de FR901228 (20
ng/ml).

La Figura 9 es un diagrama de barras que representa la expresión de CD154 en células CD4 siguiendo una estimulación inicial con perlas, 3x28, en presencia de 20 unidades de IL-2 y una estimulación posterior, el día 3 a 4, con perlas, 3x28, 20 unidades de IL-2, p de perlas 3x28/20 unidades de IL-2 o no estimulación y 20 mg/ml de FR901228 (añadido el día tres).

Las Figuras 10A-10B son diagramas de barras que representan la presencia de IL-2 y TNF-\alpha en sobrenadantes de células LSP siguiendo estimulación por perlas, 3x28, en presencia de FR901228 (20 ng/ml) y ciclosporina (500 ng/ml).

La Figura 11 representa datos de flujo de células T Jurkat transinfectadas de manera estable con un vector que contiene la secuencia de ácidos nucleicos para proteína fluorescente, verde, bajo control del activador de CD154, 24 horas, siguiendo estimulación con perlas, 3x28, en presencia de 0, 10, 50 y 100 ng/ml de FR901228.

La Figura 12 representa datos de flujo de coloración de ADN intracelular de células T CD4 no siguiendo estimulación o siguiendo estimulación con perlas, 3x28, durante 24 horas, en presencia de 0, 1, 10, 50 y 100 ng/ml de FR901228.

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Descripción detallada de la invención

Como se indicó anteriormente, la invención se dirige a compuestos, específicamente FR901228 y congéneres del mismo, que son útiles en el contexto de la supresión inmunitaria. FR901228 es un depsipéptido aislado de la bacteria terrestre Chromobacterium violaceum. Se mostró con posterioridad que FR901228 podía inhibir la transformación de fibroblastos (NIH-3T3) de ratón transinfectados Ha-ras. La proteína ras mutante, en que valina reemplaza glicina-12, es capaz de producir cambios morfológicos en células NIH-3T3. En estas células, el fenotipo transformado es indicativo de activación oncogénica y se correlaciona con oncogenia aumentada. Recientemente, se ha identificado un gran número de fármacos candidatos así como productos naturales que invierten este fenotipo y por lo tanto invierten la transformación de estirpes celulares tumorígenas. FR901228 es un producto natural que se ha identificado en este esfuerzo y se ha mostrado con posterioridad que es altamente activo en modelos basados en animales. Como resultado, FR901228 ha recibido considerable atención como agente antitumor.

Más específicamente, FR901228 es un depsipéptido bicíclico (es decir, un péptido que contiene uniones éster así como uniones amida) con la siguiente estructura:

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Aunque no se conoce la base molecular para la actividad de FR901228, se ha postulado que la unión disulfuro puede funcionar como un cambio conformacional controlado por redox y que el entorno reductor en el interior de una célula puede transformar este compuesto en la forma ditiol monocíclica (Khan et al., J. Am. Chem. Soc., 118:7.237-7.238, 1.996).

La fabricación de FR901228 por un procedimiento de fermentación, se describe en la patente de EE.UU. Nº 4.977.138, cedida a Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd (incorporada en la presente por referencia en su totalidad). En esa patente, la fermentación de una cepa de bacteria que pertenece al género Chromobacterium violaceum WB968 se cultiva en un medio nutritivo que contiene fuentes de carbono y nitrógeno asimilables y en condiciones aerobias. Siguiendo a la terminación de la fermentación, se recupera y se purifica FR901228 por técnicas convencionales tales como: extracción con disolventes, cromatografía o recristalización.

Además de aislamiento de FR901228 como producto natural, la síntesis total de este compuesto ahora se ha explicado por Khan et al., (supra). Este procedimiento implica un procedimiento de 14 etapas que proporciona FR901228 en rendimiento total de 18%. En resumen, la síntesis implica primero la reacción de aldol asimétrico catalítica de Carreira, para producir un \beta-hidroxiácido que contiene tiol. La porción peptídica del compuesto se unió por métodos de síntesis de péptidos clásicos. El \beta-hidroxiácido que contiene tiol se acopló después a la porción peptídica y se generó un anillo monocíclico por formación de la unión éster (depsipéptido). El sistema de anillo bicíclico de FR901228 se formó después en la conversión de los tioles protegidos a una unión disulfuro.

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En la práctica de la presente invención, se ha descubierto que el FR901228 específicamente o compuestos de estructura (I) en general, tienen propiedades inmunodepresoras. Con este propósito, los compuestos usados de acuerdo con la presente invención, incluyen además de FR901228, compuestos con la siguiente estructura (I):

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incluyendo sales farmacéuticamente aceptables y estereoisómeros de las mismas.

en la que:

m es 1, 2, 3 ó 4;

n es 0, 1, 2 ó 3;

p y q son independientemente 1 ó 2;

X es O, NH o NR;

R_{1}, R_{2} y R_{3} son lo mismo o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y

R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior.

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Como se usa en la presente memoria, la terminología "resto de cadena lateral de aminoácido" quiere decir cualquier resto de cadena lateral de aminoácido presente en proteínas que se encuentran en la naturaleza, incluyendo (pero no limitándose a) los restos de cadena lateral de aminoácido que se encuentran en la naturaleza, identificados en la Tabla 1 a continuación. Otros restos de cadena lateral que se encuentran en la naturaleza, de esta invención, incluyen (pero no se limitan a) los restos de cadena lateral de: fenilglicina; 3,5-dibromotirosina; 3,5-diyodotirosina; hidroxilisina, naftilalanina, tienilalanina, -carboxiglutamato, fosfotirosina, fosfoserina y aminoácidos glucosilados tales como serina, asparagina y treonina, glucosiladas.

TABLA I

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Cuando el resto de cadena lateral de aminoácido es prolina, se debería entender que el grupo R_{1}, R_{2} o R_{3} está unido al átomo de nitrógeno adyacente para formar el anillo de pirrolindinilo de prolina. Por ejemplo, es una realización de la estructura (I), en la que m, n, p y q son 1, el grupo R_{1} puede ser prolina - esto es, R_{1} tomado junto con el átomo de nitrógeno adyacente forma un anillo de pirrolindinilo, como se representa por la siguiente estructura (II):

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Además de restos de cadena lateral de aminoácido que se encuentran en la naturaleza, los restos de cadena lateral de aminoácido de la presente invención también incluyen diversos derivados de los mismos. Como se usa en la presente memoria, un "derivado de resto de cadena lateral de aminoácido" incluye modificaciones y/o variaciones a restos de cadena lateral de aminoácido que se encuentran en la naturaleza e incluye realizaciones en las que R_{1}, R_{2} y/o R_{3} están unidos al anillo bicíclico de estructura (I) por un enlace doble o triple. Por ejemplo, los restos de cadena lateral de aminoácido de: alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilglicina y fenilalanina se pueden clasificar en general como restos alquilo, arilo o aralquilo de cadena inferiores. Los derivados de restos de cadena lateral de aminoácido incluyen otros restos alquilo, arilo o aralquilo de cadena, inferiores, saturados o insaturados, sustituidos o no sustituidos, cíclicos o no cíclicos, de cadena lineal o ramificada.

Como se usa en la presente memoria, los "restos alquilo de cadena inferiores" contienen de 1-12 átomos de carbono, los "restos arilo de cadena inferiores" contienen de 6-12 átomos de carbono y los "restos aralquilo de cadena inferiores" contienen de 7-12 átomos de carbono. Por lo tanto, en una realización, el derivado de cadena lateral de aminoácido se selecciona de un alquilo de 1-12 átomos de carbono, un arilo de 6-12 átomos de carbono y un aralquilo de 7-12 átomos de carbono y en una realización más preferida, de un alquilo de 1-7 átomos de carbono, un arilo de 6-10 átomos de carbono y un aralquilo de 7-11 átomos de carbono.

Cuando R_{1}, R_{2} y R_{3} como se explica en la estructura (I), están unidos por un enlace bien doble o triple, una realización representativa incluye compuestos de estructura (III), en la que R_{2} está unido por un enlace doble:

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En una realización de la estructura (III), R_{2} es un alquilo de cadena inferior, insaturado, tal como =CHCH_{3}, =CHCH_{2}CH_{3} y similares. En el caso de FR901228, R_{2} de estructura (III) es =CHCH_{3} y m, n, p, q son cada uno 1, X es oxígeno y está presente el doble enlace opcional (y en la configuración trans).

Los derivados de cadena lateral de aminoácido de esta invención además incluyen derivados sustituidos de restos alquilo, arilo y aralquilo, de cadena, inferiores, en los que el sustituyente se selecciona de (pero no se limita a) uno o más de los siguientes restos químicos: -OH, -OR, -COOH, -COOR, -CONH_{2}, -NH_{2}, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO_{2}R, -SO_{2}H, -SOR, -PO_{3}R, -OPO_{3}R y halógeno (incluyendo F, Cl, Br y I), en los que cada caso de R se selecciona independientemente de un resto alquilo, arilo o aralquilo, de cadena, inferior. Por otra parte, los restos alquilo, arilo y aralquilo, de cadena, inferiores, cíclicos, de esta invención incluyen naftaleno, así como compuestos heterocíclicos tales como: tiofeno, pirrol, furano, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, 3-pirrolina, pirrolidina, piridina, pirimidina, purina, quinolina, isoquinolina y carbazol. Los derivados de cadena lateral de aminoácido además incluyen derivados de heteroalquilo de la porción alquílica de los restos alquilo y aralquilo, de cadena, inferiores, incluyendo (pero no limitándose a) fosfonatos y silanos de alquilo y aralquilo.

Con respecto a p y q de la estructura (I), se debería entender que el tamaño de la porción peptídica del anillo se puede aumentar por la adición de uno (es decir, cuando bien p o q es 2) o dos (es decir, cuando tanto p como q son dos) restos de aminoácidos. Por ejemplo, cuando p es 2 y q es 1 (y X es oxígeno) los compuestos de esta invención incluyen los de las siguientes estructuras (IV):

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En la estructura (IV) anterior, el resto de cadena lateral de aminoácido correspondiente al grupo R_{1} de estructura (I) se denomina R_{1}' en el primer caso y R_{1}'' en el segundo caso (puesto que p es 2 en esta realización) para aclarar que estos restos de cadena lateral de aminoácido pueden ser lo mismo o diferentes. En realizaciones adicionales, p es 1 y q es 2 o tanto p como q son 2.

En la estructura (I), la denominación "===" representa un doble enlace opcional. Cuando está presente, el doble enlace puede estar en la configuración bien cis- o trans-. En una realización, el doble enlace está en la configuración trans, como está en el caso de FR901228.

Dependiendo de la elección de los restos X e Y, los compuestos de la presente invención incluyen ésteres cuando X es oxígeno, amidas cuando X es NH o NR. Por ejemplo, cuando tanto p como q son 1, los compuestos representativos de esta invención incluyen ésteres y amidas, como se representa por las estructuras (VI) y (VII), respectivamente:

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Los compuestos para usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar de acuerdo con el siguiente Esquema 1 de Reacción:

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Esquema 1 de Reacción

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Etapa (1)

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En la etapa (1), se prepara aldehído 2 a partir de dienoato 1 (en el que n =1, 2 ó 3) por el procedimiento en tres etapas explicado por Kahn et al., J. Am. Chem. Soc. 118:7.237-7.238, 1.996. Se forma éster 3 bencílico por adición catalizada de Ti(IV) de O-bencilo, acetal de ceteno O-TMS a aldehído 2 (en el que R'=H y R''= OH o R' = OH y R''=H). La hidrólisis de éster 3 bencílico con LiOH en MeOH/H_{2}O da hidroxiácido 4.

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Etapa (2)

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En la etapa (2), se prepara la porción peptídica del compuesto por técnicas de síntesis de péptidos clásicas que empiezan con un éster 5 metílico de aminoácido, apropiado. Se hace reaccionar éster 5 metílico con un aminoácido N-protegido utilizando el reactivo BOP para producir dipéptido 6, seguido por acoplamiento a N-Fmoc-cisteína-(S-trifenilmetilo) cuando m es 1 o un análogo del mismo cuando m es 2, para producir tripéptido 7. El tripéptido 7 se transforma después en tetrapéptido 8 N-protegido, seguido por la desprotección del grupo FMOC para producir tetrapéptido 9. En el esquema de reacción anterior, R_{1}, R_{2} y R_{3} son lo mismo o diferentes y representan independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o derivado del mismo, como se definió anteriormente. Se reconocerá que la técnica anterior corresponde a la síntesis de compuestos de estructura (I) cuando p y q son ambos 1. En realizaciones en las que uno o ambos de p y/o q son 2, se utiliza la técnica anterior para incorporar uno o dos grupos aminoácido adicionales en la porción peptídica del compuesto.

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Etapa (3)

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En la etapa (3), el acoplamiento de tetrapéptido 9 e hidroxiácido 4 con BOP y DIEA produce el éster 10 hidroximetílico. La hidrólisis en que interviene LiOH, de éster 10 metílico, proporciona el correspondiente ácido carboxílico, que después se puede transformar en el compuesto intermedio 11 de lactona, monocíclico, por ciclación con DEAD y PPh_{3}. Por último, la oxidación de la bis(S-trifenilmetil)lactona 11, con yodo, en solución de MeOH diluido proporciona compuestos de la presente invención con estructura (I).

Alternativamente, también se pueden sintetizar los compuestos de esta invención por la siguiente técnica:

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Etapa (1) Alternativa

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En esta realización, el compuesto 4' se prepara por los procedimientos anteriores y después se añade, en la Etapa (3) anterior, a la porción peptídica preparada por la Etapa (2). El compuesto intermedio resultante se cicla como se describió previamente, para producir compuestos de estructura (I).

En el caso de que X sea NH o NR, se pueden preparar tales compuestos cuando R' o R'' del compuesto 4 son NH o NHR, respectivamente. Además, cuando no está presente el doble enlace opcional de estructura (I), se pueden emplear las mismas técnicas de reacción pero utilizando los correspondientes compuestos intermedios saturados.

Los compuestos usados de acuerdo con la presente invención también incluyen sales de adición, ácidas, que se pueden preparar por métodos bien conocidos en la técnica y se pueden formar a partir de ácidos orgánicos e inorgánicos. Los ácidos orgánicos adecuados incluyen ácidos: maleico, fumárico, benzoico, ascórbico, succínico, metanosulfónico, acético, trifluoroacético, oxálico, propiónico, tartárico, salicílico, cítrico, glucónico, láctico, mandélico, cinámico, aspártico, esteárico, palmítico, glucólico, glutámico y bencenosulfónico. Los ácidos inorgánicos adecuados incluyen ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico y nítrico. Como se usa en la presente memoria, se desea que la terminología "sal farmacéuticamente aceptable" de estructura (I) incluya cualquiera y todas las formas de sal adecuadas.

Con respecto a los estereoisómeros, los compuestos de estructura (I) pueden presentar centros quirales y se pueden encontrar como racematos, mezclas racémicas y como enantiómeros o diastereómeros individuales. Todas dichas formas isoméricas están incluidas dentro de la presente invención, incluyendo mezclas de las mismas. Además, algunas de las formas cristalinas de los compuestos de estructura (I) pueden existir como polimorfas, que están incluidas en la presente invención. Además, algunos de los compuestos de estructura (I) también pueden formar solvatos con agua u otros disolventes orgánicos. Tales solvatos están incluidos de manera similar dentro del alcance de esta
invención.

La presente invención se refiere al uso de compuestos de estructura (I), para la fabricación de un medicamento, para el tratamiento y/o la prevención de respuesta inmunitaria o respuestas y enfermedades en que interviene el sistema inmunitario, tal como la prevención o el tratamiento de rechazo siguiendo a trasplante de materiales de injerto, sintéticos u orgánicos, células, órganos o tejido para reemplazar toda o parte de la función de tejidos, tales como: corazón, riñón, hígado, médula ósea, piel, cornea, vasos, pulmón, páncreas, intestino, extremidad, músculo, tejido nervioso, duodeno, intestino delgado, célula de islotes pancreáticos, incluyendo xenotrasplantes, etc.. Además se puede usar la presente invención para prevenir/suprimir una respuesta inmunitaria asociada con un tratamiento de terapia de genes tales como la introducción de genes extraños en células autólogas y expresión del producto codificado.

Como se usa en la presente memoria, "una respuesta inmunitaria" se refiere a la reacción del cuerpo a antígenos extraños o autoantígenos a fin de que se neutralicen y/o eliminen. La respuesta inmunitaria en que intervienen células implica la producción de linfocitos por el timo (células T) en respuesta a exposición a antígenos. Esta reacción es importante en hipersensibilidad retardada, rechazo de trasplantes de tejido y en algunas infecciones. En la respuesta inmunitaria humoral se producen linfocitos del plasma (células B) en respuesta a exposición a antígenos con formación posterior de anticuerpos. Esta respuesta puede producir inmunidad o hipersensibilidad. La respuesta inmunitaria no específica o inflamación, es la respuesta de los tejidos y células del cuerpo a lesionarse por cualquier fuente (por ejemplo, trauma, organismos, productos químicos, isquemia, etc.). La respuesta inicial del sistema inmunitario a cualquier amenaza implica actividades vasculares, químicas y de células sanguíneas. Se requiere respuesta inmunitaria específica cuando la inflamación es inadecuada para hacer frente a la lesión o invasión por un organismo o agente. Se dirige y se controla por células T y B. La inmunidad celular se refiere a la respuesta de células T: inmunidad humoral es la terminología usada previamente para referirse a respuestas de células B. Además, la referencia en la presente memoria a células CD4 o CD8 o similares, quiere decir que infiere que las células son positivas para el marcador de superficies celulares CD4 o CD8.

Los usos adicionales descritos pueden incluir el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades cutáneas inflamatorias e hiperproliferativas y manifestaciones cutáneas de enfermedades inmunológicas tales como: dermatitis seborreica, angioedemas, eritemas, acné y alopecia circunscrita; diversas enfermedades oculares (autoinmunitarias y de otro modo); reacciones alérgicas tales como alergias al polen, enfermedad obstructiva reversible de las vías respiratorias, que incluye estados tales como asma (por ejemplo, asma bronquial, asma alérgica, asma intrínseca, asma extrínseca y asma por el polvo), en particular asma crónica o inveterada (por ejemplo, asma tardía e hipersensibilidad de las vías respiratorias), bronquitis, rinitis alérgica y similares; inflamación de mucosa y de vasos sanguíneos, actividad de ciertas infecciones víricas tales como infección por citomegalovirus e infección por el virus de Epstein-
Barr.

En una realización, se describe un método para tratar un estado en un animal, cuyo tratamiento se ve afectado o facilitado por la reducción de la proliferación y/o activación de linfocitos (por ejemplo, regulación por disminución de CD25 y/o CD154) que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de estructura (I). Se proporciona el método para tratar un estado en un animal, cuyo tratamiento se facilita por inhibición de proliferación de linfocitos y/o inhibición de marcadores de activación (por ejemplo, CD25 y CD154) e inhibición de función inmunitaria, en la que el estado puede ser autoinmunitario, inflamación, rechazo de injerto/tejido o incluye cualquiera de una serie de indicaciones tales como las descritas en la presente memoria, que son producidas o exacerbadas inmunológicamente.

De acuerdo con esto, una realización de la descripción es un método para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. Mientras que otra realización es un uso para la prevención o tratamiento de rechazo de trasplantes de órganos extraños, que comprende administrar a un paciente que necesite tal terapia una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención.

Como se indicó anteriormente, la ciclosporina es el principal fármaco en la actualidad, usado para prevenir el rechazo de órganos trasplantados. El fármaco actúa por inhibición de la función de la calcineurina en los linfocitos, evitándose de ese modo que el sistema inmunitario del cuerpo movilice su enorme arsenal de agentes de protección naturales para rechazar la proteína extraña del trasplante. Aunque la ciclosporina es eficaz en la lucha contra el rechazo del trasplante, es nefrotóxica y se sabe que causa diversos efectos secundarios no deseados, incluyendo insuficiencia renal, función hepática anormal, malestar gastrointestinal y producción de cáncer. (Hojo et al., Nature 397:530-534, 1.999).

Se están investigando fármacos más seguros, más recientes, que presenten menos efectos secundarios, constantemente en el campo. La presente invención proporciona tales agentes inmunodepresores que, sin desear limitarnos a un mecanismo particular de acción, parecen producir tolerancia inmunitaria de larga duración. FR901228 permite la activación parcial de las células T CD4 (por ejemplo, producción de CD69, pero reducción de la expresión superficial de CD25, CD137w, CD11a, CD134, CD54, CD95 y CD154, así como reducción de producción de IL-2 y/o TNF-\alpha). Las células T CD4 activadas en presencia de FR901228, no experimentan muerte celular producida por activación (MCPA), sin embargo experimentan con posterioridad muerte celular programada in vitro lo más probablemente debido a la ausencia de segregación de IL-2 y/o estimulación de receptor de IL-2. Además, el tratamiento de células T, CD4 y CD8, activadas previamente con compuestos de la clase de FR901228, tales como los representados en la estructura (I), inhibe su crecimiento y produce muerte celular programada dentro de un tiempo corto, al tiempo que deja reposar a las células T aparentemente no afectadas. La producción de muerte celular programada en las células T que responden no sólo elimina las células T activadas sino que también produce un estado de tolerancia inmunitaria de larga duración (Ferguson and Green. Nature Med. 5(11):1.231-1.232, 1.999). No se entiende bien la razón para esta tolerancia específica. Sin embargo, la inmunización con células de donante no divididas (por ejemplo, células dendríticas o linfocitos de sangre periférica irradiados) en presencia de FR901228 previamente al trasplante podía conferir muy bien tolerancia específica a respuestas futuras del hospedador contra el injerto sin la presencia adicional de FR901228.

La terminología "tolerancia", como se usa en la presente memoria, se refiere a un estado de insensibilidad del sistema inmunitario hacia un antígeno contra el que tiene la capacidad de reaccionar. Aunque no se desea estar limitado a un mecanismo particular, se cree que se produce esa tolerancia por los compuestos de la presente invención por la producción de muerte celular programada en células T activadas. Por ejemplo, si se activan células T por un antígeno y experimentan con posterioridad muerte celular programada, no tendrá lugar una respuesta inmunitaria posterior contra este antígeno. La producción de tolerancia por un compuesto particular se puede ensayar por cualquier método y modelo conocidos por los expertos en la técnica. En un ejemplo, se puede ensayar la estimulación primaria y secundaria por un antígeno en presencia de los compuestos de la presente invención. En resumen, un animal se inocula con un antígeno seguido por una inoculación posterior con el compuesto, aproximadamente 2 semanas más tarde se puede inocular el animal con el mismo antígeno en ausencia del compuesto y se mide la respuesta inmunitaria secundaria. De acuerdo con esto, se puede medir la respuesta tanto primaria como cualquiera secundaria por análisis de sangre simple. Una muestra que no presenta respuesta inmunitaria secundaria, demuestra tolerancia producida por el compuesto inmunodepresor. Además, se pueden utilizar ensayos in vitro clásicos para determinar la activación de células T, tales como ensayos CTL (por sus siglas en inglés) o ensayar segregación de
IL-2.

Además de la producción de muerte celular programada de células T, CD4 y CD8, producida con una serie de estímulos, incluyendo unión de CD3 y CD28, concurrente, la estimulación de ionomicina/ácido forbol mirístico (AFM) y la estimulación de células dendríticas alogénicas, demuestran inhibición de crecimiento cuando se trata con FR901228, bien al mismo tiempo con estimulación o siguiendo a estimulación. De acuerdo con esto, tales composiciones mejoran enormemente en fármacos tales como la ciclosporina, que inhiben las células T, CD4, muy pronto en la cascada de activación. Esto causa que las células T, CD4, activadas en presencia de ciclosporina sean de hecho sin tratamiento previo o células no activadas, que no experimentan muerte celular programada. Por lo tanto, cuando se termina el tratamiento de ciclosporina se desarrollará la respuesta inmunitaria inhibida. En otras palabras, si las células CD4 están en un estado activo en presencia de los de los compuestos de la presente invención, estas células experimentarán muerte celular programada y por lo tanto una tolerancia por último al antígeno, al tiempo que cuando se tratan estas mismas células con ciclosporina sólo se inhibe la respuesta inmunitaria al tiempo que la ciclosporina queda
presente.

Además, la supresión inmunitaria de FR901228 conduce a la producción de anergia y/o muerte celular programada sólo en células T activadas; por lo tanto, se mantiene el nivel general de células T y otras células hematopoyéticas. Por contraste, tanto la ciclosporina como FK506 bloquean los casos más recientes de activación de células T y por lo tanto evitan que entren células T en un estado en que llegan a ser susceptibles de producción de muerte celular
programada.

FR901228 presenta una serie de características que ayudan a su capacidad para actuar como un inmunodepresor potente. De acuerdo con esto, los compuestos de la clase referida en la estructura (I), incluyendo FR901228, pueden presentar una o más de las siguientes características: inhibición de crecimiento de células T, CD4 y CD8, producida por unión de CD3 y CD28, ionomicina/AFM o células dendríticas alogénicas; inhibición de crecimiento acumulable de células T, CD4 y/o CD8, cuando se añaden después de la activación inicial; inhibición de rutas de transducción de señales tanto para unión CD3/CD28 como estimulación de IL-2; inhibición de la producción de: CD25, CD134, CD137w, CD154, CD11a, CD54 y CD95 sobre células T, CD4; no afecta significativamente a la producción de CD69 o a la regulación por disminución producida por activación de CD62L: reducción de segregación de IL-2 a partir de linfocitos de sangre periférica; reducción de segregación de TNF-\alpha a partir de linfocitos de sangre periférica; inhibición del ciclo celular previa a la entrada en la fase S para células T activadas; inhibición de p21 cip/waf y producción de C/EPB-\alpha en células T activadas; inhibición de expresión de c-myc en células T activadas; inhibición de proliferación producida por IL-2 de células T activadas e inhibición de CD154 al nivel transcripcional. Además, FR901228 no afecta a la fosforilación en masa, cuando se mide por métodos Western de fosfotirosina. Por lo tanto, estas observaciones indican que los compuestos de estructura (I) afectan a la ruta de activación de células T en múltiples puntos, permitiendo por lo tanto que la activación transcurra en etapas iniciales, tal como fosforilación, pero evitando casos posteriores de activación y proliferación.

Para determinar si un compuesto particular es un inmunodepresor eficaz, se puede llevar a cabo una variedad de metodologías conocidas en la técnica. Con respecto a esto, se puede medir la proliferación y/o activación de linfocitos siguiendo en contacto con el compuesto de interés previo a, simultáneo con o posterior a la estimulación. Por ejemplo, una señal de contraste de la activación de células T y posterior producción de proliferación (así como ser un iniciador de inflamación) es la producción de IL-2, IFN-\gamma, CD25, CD69 o CD154, que se puede medir por una variedad de métodos, incluyendo ELISA y citometría de flujo. También se pueden utilizar otros métodos experimentales comúnmente empleados para medir la proliferación celular y la segregación de citocinas, incluyendo un ensayo colorimétrico que emplea coloración con yoduro de propidio, (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il], 2,5-difeniltetrazolio) MTT, coloraciones vitales, DACF-ES (diacetato de 5-(y 6-)carboxifluoresceína y éster succinimidílico), recuento celular, un ensayo de incorporación de bromodesoxiuridina o de incorporación de timidina (véase, por ejemplo, Avian Dis. 43(2): 172-181, 1.999; Anticancer Res. 17(1B):725-728, 1.997; Geller. Scand. J. Immunol. 35:327-334, 1.992; Levine et al, Int. J. Immun. 7(6):891-904, 1.995; Hara et al., J. Exp. Med. 161:1.513-1.524, 1.985; Harding et al., Nature 356:607-609, 1.992; Linsley et al., Science 257:792-795, 1.992; publicación de patente PCT Nº WO 95/33.823).

Se conocen bien en la técnica métodos de activación de linfocitos y por lo tanto la estimulación de proliferación de linfocitos e incluyen la estimulación en presencia o ausencia de IL-2 con fitohemaglutinina (FHA), concanavalina A (ConA), anticuerpos antiCD3, (en presencia o ausencia de anticuerpos antiCD28), células alogénicas, superantígenos o ionomicina/AFM. (Paul, Fundamental Immunology, Cuarta Edición, Lippincott-Raven, 1.998).

Existe una variedad de modelos in vitro y animales para ensayar y validar compuestos inmunodepresores de la presente invención y su aplicabilidad a una enfermedad o indicación particular relacionada con el sistema inmunitario. De acuerdo con esto, un experto en la técnica podía elegir fácilmente el modelo apropiado de los existentes en la actualidad en la técnica. Tales modelos incluyen el uso de ratones DNO, en que resulta DSDI de una destrucción autoinmunitaria dependiente de células T, espontánea, de células \beta pancreáticas que producen insulina que se intensifica con la edad (Bottazo et al., J. Engl. J. Med. 113:353, 1.985; Miyazaki et al., Clin. Exp. Immunol. 60:622, 1.985). En ratones DNO, un modelo de DSDI humano, se ha tenido éxito con estrategias terapéuticas que fijan como objetivo células T, en prevenir DSDI (Makino et al., Exp. Anim. 29:1, 1.980). Estas incluyen timectomía neonatal, administración de ciclosporina e infusión intravenosa de anticuerpos monoclonales (los mAb) (IL-2R) de células T antipan, antiCD4 o antiCD25 (Tarui et al., Insulitis and Type I Diabetes, Lessons from the NOD Mouse, Academic Press, Tokio, pág. 143, 1.986). Otros modelos incluyen, por ejemplo, los utilizados típicamente para enfermedad autoinmunitaria e inflamatoria tales como: esclerosis múltiple (modelo EAE), artritis reumatoide, enfermedad del injerto contra el hospedador (modelos de trasplante para estudiar el rechazo de injerto usando injerto de piel, trasplante de corazón, trasplantes de islotes de Langerhans, trasplantes de intestino grueso y delgado y similares), modelos de asma, lupus eritematoso sistémico (autoinmunidad sistémica - - modelo NZBxNZWF_{1}) y similares (véase, por ejemplo, Takakura et al., Exp. Hematol. 27(12):1.815-821, 1.999; Hu et al., Immunology 98(3):379-385, 1.999; Blyth et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14(5):425-438, 1.996; Theofilopoulos and Dixon, Adv. Immunol. 37:269-389, 1.985; Eisenberg et al., J. Immunol., 125:1.032-1.036; 1.980; Bonneville et al., Nature 344:163-165, 1.990; Dent et al., Nature 343:714-719, 1.990; Todd et al., Nature 351:542-547, 1.991; Watanabe et al., Biochem. Genet. 29:325-335, 1.991; Morris et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 57:263-273, 1.990; Takahashi et al., Cell 76:969-976, 1.994; Current Protocols in Immunology, Richard Colco (Ed.), John Wiley & Sons, Inc., Capítulo 15,
1.998).

Los individuos con necesidad de tratamiento para suprimir el sistema inmunitario incluyen individuos con enfermedad autoinmunitaria; individuos que experimentan trasplante e individuos con enfermedad cardiovascular; individuos con reacciones alérgicas e individuos con desrregulación inmunitaria producida por trauma o patógenos. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen: diabetes sacarina dependiente de insulina, asma, psoriasis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico así como otras discutidas anteriormente. Los individuos con un trasplante de órgano o célula/tejido también tienen necesidad de tratamiento para suprimir el sistema inmunitario para suprimir o prevenir el rechazo del trasplante de órganos. Un "trasplante de órganos" se refiere a transferir o "trasplantar" un órgano interno (por ejemplo, corazón, pulmón, riñón, hígado, páncreas, estómago, intestino grueso e intestino delgado y médula ósea) u órgano externo (por ejemplo, piel) de un donante a un receptor, en el que el donante es genéticamente distinto del individuo o animal que ha recibido el trasplante. Un "trasplante de órgano" también incluye trasplantes de especies cruzadas (es decir,
xenotrasplantes).

"Una cantidad eficaz" es la dosis de compuesto requerida para conseguir el efecto terapéutico y/o profiláctico deseado, por ejemplo, la dosis del compuesto que da como resultado la supresión de una respuesta inmunitaria sin tratamiento previo o de memoria en el individuo o animal o que da como resultado la supresión de un rechazo del trasplante de órgano en el individuo. Un "efecto terapéutico y/o efecto profiláctico, deseado" incluye, por ejemplo, aumentar la expectativa de vida o mejorar los síntomas de un individuo o animal que tiene o es probable que tenga una enfermedad autoinmunitaria tal como: asma, psoriasis, colitis ulcerosa, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico y similares. Los ejemplos de síntomas que se pueden mejorar incluyen: hiperglucemia en diabetes; artralgias; rigidez e inmovilidad en artritis reumatoide; parálisis en esclerosis múltiple y erupción cutánea y lesión cutánea en lupus eritematoso sistémico. Con respecto a la diabetes sacarina dependiente de insulina, un "efecto terapéutico o profiláctico deseado" incluye mitigar o prevenir complicaciones secundarias que resultan de la enfermedad, tales como trastornos vasculares. Las dosis adecuadas dependerán de la edad, salud y peso del receptor, la extensión de la enfermedad, clase de tratamiento concurrente, si hay alguno, frecuencia de tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. Por ejemplo, las dosis pueden ser de aproximadamente 0,001-100 miligramos al día. Ordinariamente, es eficaz de 0,1 a 50 miligramos al día en una o más aplicaciones para obtener los resultados deseados. En ciertas realizaciones, la dosis se puede ajustar de manera que se mantengan las células T no activadas y sustancialmente sólo las células T activadas se dirijan a muerte celular programada, anergia y/o insensibilidad funcional temporal (es decir, se mantiene el nivel general de células T y/u otras células que se dividen). En otras realizaciones, el tratamiento de depsipéptidos consigue un efecto inmunodepresor, al tiempo que en otras realizaciones la dosis utilizada no afecta a la división de células hematopoyéticas y en aún otras realizaciones la dosis no afecta sustancialmente la división celular en general. Sin embargo, se pueden determinar fácilmente los intervalos de dosis eficaces durante estudios clínicos y metodologías de ensayo clásicas disponibles en la técnica. Estas dosis son las cantidades eficaces para la prevención o tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, la prevención o tratamiento de rechazo de trasplante extraño y/o aquejamientos, enfermedades y dolencias, relacionados.

Un "individuo" es preferiblemente un mamífero, tal como un ser humano, pero también puede ser un animal con necesidad de tratamiento veterinario, por ejemplo, animales domésticos (por ej., perros, gatos y similares), animales de granja (por ej., vacas, ovejas, cerdos, caballos, pollos y similares) y animales de laboratorio (por ej., ratas, ratones, conejillos de Indias y similares).

Se puede administrar el compuesto solo o junto con otros agentes farmacológicamente activos, por ej., junto con otros agentes inmunodepresores o junto con antibióticos y/o agentes antivíricos. Los compuestos que se pueden administrar conjuntamente incluyen: esteroides (por ej., acetato de metilprednisolona), los AINE y otros inmunodepresores conocidos tales como: azatioprina, 15-desoxiespergualina, ciclosporina, mizoribina, mofetil micofenolato, brequinar sódico, leflunomida, FK-506, rapamicina y compuestos relacionados. Las dosis de estos fármacos también variarán dependiendo del estado y del individuo que se tiene que tratar.

Se puede administrar una cantidad eficaz del compuesto por una ruta apropiada en una dosis única o en dosis múltiples.

Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen tanto las sales metálicas (inorgánicas) como sales orgánicas, una lista de las cuales se da en Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 17ª, pág. 1.418 (1.985). Se sabe bien por un experto en la técnica que se elige una forma de sal apropiada basada en: estabilidad física y química, fluidez, hidroscopicidad y solubilidad. Como se entenderá por los expertos en la materia, las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos inorgánicos tales como: hidrocloruro, sulfato, fosfato, difosfato, hidrobromuro y nitrato o sales de un ácido orgánico tal como: malato, maleato, fumarato, tartrato, succinato, citrato, acetato, lactato, metanosulfonato, p-toluenosulfonato o palmoato, salicilato y estearato. Similarmente, los cationes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sodio, potasio, calcio, aluminio, litio y amonio (especialmente sales de amonio con aminas secundarias). Las sales preferidas de esta invención por las razones citadas anteriormente incluyen sales de: potasio, sodio, calcio y amonio. También se incluyen dentro del alcance de esta invención: estereoisómeros, formas cristalinas, hidratos y solvatos de los compuestos de la presente invención.

Como inmunodepresores, estos compuestos son útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, la prevención del rechazo de trasplantes de órganos extraños y/o aquejamientos, enfermedades y dolencias, relacionados.

Los compuestos de esta invención se pueden administrar para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, la prevención del rechazo de trasplantes de órganos extraños y/o aquejamientos, enfermedades y dolencias, relacionados, de acuerdo con la invención por cualquier medio que efectúe contacto del compuesto ingrediente activo con el sitio de acción en el cuerpo de un animal de sangre caliente. Por ejemplo, la administración, puede ser: oral, tópica, incluyendo transdérmica, ocular, sublingual, intranasal, inhalación, intravaginal, rectal, intracisternal y parenteral. La terminología "parenteral" como se usa en la presente memoria se refiere a modos de administración que incluyen: subcutáneo, intravenoso, intramuscular, inyección intraarticular o infusión intravenosa, intraesternal o intraperitoneal.

Se pueden administrar los compuestos por cualquier medio convencional disponible para uso junto con productos farmacéuticos, bien como agentes terapéuticos individuales o en una asociación de agentes terapéuticos. Se pueden administrar solos, pero en general se administran con un vehículo farmacéutico seleccionado sobre la base de la ruta de administración elegida y la práctica farmacéutica clásica.

El ingrediente activo se puede administrar oralmente en formas de dosificación sólidas tales como: cápsulas, comprimidos, comprimidos medicinales, grageas, gránulos y polvos o en formas de dosificación líquidas, tales como: elixires, jarabes, emulsiones, dispersiones y suspensiones. (Véase por ej., Chan et al., Invest. New Drugs 15:195-206, 1.997, que demuestra la biodisponibilidad de dosis orales de FR901228). El ingrediente activo también se puede administrar por vía parenteral, en formas de dosificación líquidas, estériles, tales como: dispersiones, suspensiones o soluciones. Otras formas de dosificación que también se pueden usar para administrar el ingrediente activo como: ungüento, crema, gotas, parche transdérmico o polvo para administración tópica, como una solución oftálmica o formación de suspensión, es decir, gotas para los ojos, para administración ocular, como una composición en aerosol o en polvo para inhalación o administración intranasal o como una crema, ungüento, aerosol o supositorio para administración rectal o vaginal.

Las cápsulas de gelatina contienen el ingrediente activo y vehículos en polvo tales como: lactosa, almidón, derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico y similares. Se pueden usar diluyentes similares para preparar tabletas comprimidas. Tanto los comprimidos como las cápsulas se pueden fabricar como productos de liberación prolongada para proporcionar liberación continua de medicación durante un periodo de horas. Las tabletas comprimidas pueden estar recubiertas de azúcar o recubiertas de película para enmascarar cualquier sabor desagradable y proteger el comprimido de la atmósfera o con recubrimiento entérico para disgregación selectiva en el tubo digestivo.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral pueden contener colorantes y saborizantes para aumentar la aceptación del paciente.

En general, son vehículos adecuados: agua, un aceite adecuado, solución salina, dextrosa acuosa (glucosa) y soluciones de azúcar relacionadas y glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicoles, para soluciones parenterales. Las soluciones para administración parenteral contienen preferiblemente una sal soluble en agua del ingrediente activo, agentes estabilizantes adecuados y si es necesario, sustancias amortiguadoras. Los agentes antioxidantes tales como: bisulfito de sodio, sulfito de sodio o ácido ascórbico, bien solos o combinados, son agentes estabilizantes adecuados. También se usan ácido cítrico y sus sales y etilendiaminotetraacetato de sodio (AEDT). Además, las soluciones parenterales pueden contener conservantes tales como: cloruro de benzalconio, metil- o propilparabén y clorobutanol. En ciertas realizaciones, la composición se prepara por dilución de 10 mg de depsipéptido liofilizado y 20 mg de povidona, USP, con 2 ml de una solución que contiene etanol al 20%, USP, en propilenglicol, USP. La solución se diluye después adicionalmente con inyección de cloruro de sodio al 0,9%, USP, a una concentración de fármaco final en el intervalo de 0,02 a 5,0 mg/ml.

Para administración por inhalación, los compuestos de la presente invención se pueden distribuir convenientemente en forma de presentación en aerosol a partir de envases presurizados o nebulizadores. Los compuestos también se pueden distribuir como polvos que se pueden formular y la composición de polvo se puede inhalar con la ayuda de un dispositivo inhalador para insuflación de polvo. El sistema de distribución preferido para inhalación es un aerosol (IDM) de inhalación de dosis medida que se puede formular como una suspensión o solución de un compuesto de la presente invención en propelentes adecuados tales como fluorocarbonos o hidrocarburos.

Para administración ocular, se puede formular una preparación oftálmica con una solución o suspensión en porcentaje en peso apropiada, de los compuestos de la presente invención, en un vehículo oftálmico apropiado, de manera que el compuesto se mantenga en contacto con la superficie ocular durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el compuesto trate la superficie mucosal o penetre en la córnea y regiones internas del ojo.

Las mismas formas de dosificación se pueden usar en general cuando los compuestos de esta invención se administran escalonadamente o junto con otro agente terapéutico.

Cuando los fármacos se administran en asociación física, se deberían seleccionar la forma de dosificación y la ruta de administración, dependiendo de la compatibilidad de los fármacos asociados. Por lo tanto, la terminología administración conjunta se entiende que incluye la administración de los dos agentes concomitantemente o secuencialmente o alternativamente, como una asociación de dosis fijada de los dos componentes activos.

A partir de lo anterior, se apreciará que aunque se han descrito realizaciones específicas de la invención, en la presente memoria, por propósitos de ilustración, se pueden hacer diversas modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. De acuerdo con esto, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo I

Crecimiento celular y preparación

Se cultivaron células aisladas de sangre humana, en medios de cultivo X vivo (Biowhittaker Inc., Walkersville, MO) y dependiendo del uso enriquecidos con o sin 20 U/ml de IL-2 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y enriquecidos con suero humano al 5% (Biowhittaker), Glutamina 2 mM (Life Technologies, Rockville, MD) y HEPES 20 mM (Life Technology). Se cultivaron células E6-1 de Jurkat (ATCC, Manassas, VA) en RPM1 1.640 (Life Technologies) enriquecido con suero fetal bovino al 10% (SFB) (Biowhittaker), glutamina 2 mM (Life Technologies), penicilina 2 mM (Life Technologies) y estreptomicina 2 mM (Life Technologies).

Se obtuvieron capas leucocíticas de donantes voluntarios, humanos, sanos (American Red Cross, Portland, OR). Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) usando Medios de Cultivo de Separación de Linfocitos (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

Se obtuvieron linfocitos de sangre periférica (LSP) a partir de la fracción de CMSP por incubación en un matraz de cultivo (Costar, Pittsburg, PA) o con Dynabeads no recubiertas (Dynal, Oslo, Noruega), 1 x 10^{8} células/ml, 2 perlas/célula, 2 h, a 37ºC. Se retiraron monocitos y macrófagos por adherencia al matraz de cultivo o fagocitación de las perlas paramagnéticas que se redujeron por separación magnética de las células, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Dynal). Se purificaron células CD4 a partir de la fracción de LSP por incubación con 10 \mug/ml de anticuerpos monoclonales contra CD8, (clon G10-1), CD20 (clon IF5), CD14 (clon F13) y CD16 (Coulter), 10^{8} células/ml, 20 min., a 4ºC. Después de lavado, se redujeron dos veces las células con dynabeads acopladas a Ig de oveja antiratón (10^{6} células/ml, 6 perlas/célula, 20 min., a 4ºC) y separación magnética de las células. La pureza de las células CD4 es de manera rutinaria 91-95%, cuando se mide por citometría de flujo.

Se generaron células dendríticas a partir de las CMSP que se adhirieron al matraz de cultivo (Costar), 10^{8} células/ml, 2 h, a 37ºC (sin Dynabeads). Después de lavado extenso, se cultivaron células adhesivas, durante 7 días, en medios de cultivo que contenían 500 U/ml de GM-CSF (por sus siglas en inglés) (Boehringer-Mannheim) y 12,5 U/ml de IL-4 (Boehringer-Mannheim). La población celular resultante se adhirió débilmente y expresó marcadores superficiales, característico de células dendríticas (positivo para HLA-DR, CD86, CD83, CD11c y negativo para CD4) (nota: todos los anticuerpos obtenidos de Becton Dickinson, CA).

Se puede obtener el mAb (OKT3) antiCD3 de Ortho Biotec., (Raritan, NJ) y se puede obtener el mAb (9,3) antiCD28 de Bristol-Myers Squibb. (Stamford. Conn.).

Ejemplo II

Estimulación de células T y medición de la misma

Se estimularon células por tres metodologías diferentes: 1) Dynabeads (M-450) acopladas por enlaces covalentes a anticuerpos (OKT-3) antiCD3 y (9,3) antiCD28, (perlas 3x28), de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Dynal), 3 perlas/célula, 2) Ionomicina (Calbiochem. La Jolla, CA) (100 ng/ml) y forbol 12-miristato-13-acetato (AFM) (Calbiochem) (10 ng/ml), 3) células dendríticas alogénicas (25.000 células dendríticas/200.000 células CD4). Se estimularon todas las células a una concentración de 1x10^{6} células/ml. Las células se incubaron con compuestos de estructura (I) (por ej., FR901228) (NCI, Bethesda, MD) durante 1 a 2 horas previamente a la estimulación, como se explicó en líneas generales anteriormente. Se llevaron a cabo ensayos de proliferación por cuadriplicado en placas de fondo plano de 96 pozos. Las células se estimularon a 1x10^{6} células/ml en un volumen final de 200 1. La proliferación se midió por ensayo MTT (por sus siglas en inglés) (estuche de ensayo MTT, Chemicon International Inc., Temecula, CA) el día 3 (método 1 y 2 de estimulación) o el día 6 (método 3 de estimulación) y los resultados se presentan como valor medio de cuadriplicados. Se estimularon cultivos de LSP o cultivos de células CD4 purificadas, con perlas 3x28, ionomicina/AFM o células dendríticas alogénicas. Como se demuestra en las Figuras 1-4, concentraciones tan bajas como 10 ng/ml de FR901228 inhibieron completamente la proliferación de células CD4, estimuladas con perlas 3x28 o ionomicina/AFM, mientras concentraciones de 1 ng/ml de FR901228 o por debajo no presentaron efecto significativo (estos experimentos se llevaron a cabo usando una incubación de 2 horas con FR901228 previamente a la estimulación). Interesantemente, se inhibió significativamente la proliferación producida por células dendríticas alogénicas, por FR901228 en concentraciones tan bajas como 1 ng/ml. Además, una mayor supervivencia celular no se vio afectada por FR901228, cuando se evaluó por medición de ADN sub-G1 e integridad de la membrana celular (Figura 5D). La ausencia de citotoxicidad de FR901228 está de acuerdo con los resultados descritos por Byrd et al., Blood 94(4):1.401-1.408, 1.999; Bates et al., Clinical Pharmacology, Programs and Proceedings of American Society of Clinical Oncology, Abstract 693, 1.999 y Chassaing et al., J. Chrmatogr. B 719:169-176,
1.998.

Los protocolos de crecimiento y activación son los mismos que los descritos anteriormente.

Ejemplo III

Ensayos de marcador de activación

Se estudió el efecto de FR901228 en la producción de diversos marcadores de activación en células CD4. Con respecto a esto, se marcaron células con uno o más de los siguientes anticuerpos: Ab de CD4 antihumano (Immunotech., Fullerton, CA), Ab de CD11a antihumano acoplado a FITC (por sus siglas en inglés) (Pharmingen), Ab de CD26 antihumano acoplado a FITC (Pharmingen), Ab de CD49d antihumano acoplado a FITC (Coulter), Ab de CD54 antihumano acoplado a FITC (Pharmingen and Becton Dickinson), Ab de CD95 antihumano acoplado a FITC (Pharmingen), Ab de CD134 antihumano acoplado a FITC (Pharmingen), Ab de CD25 antihumano acoplado a FITC (Becton Dickinson, Fullerton, CA), Ab de CD69 antihumano acoplado a FITC (Becton Dickinson), Ab de CD154 antihumano acoplado a FITC o PE (por sus siglas en inglés) (Becton Dickinson) o Ab de control de isotipo IgG1 acoplado a FITC o PE. Se marcaron células, 2x10^{5}, durante 20 minutos, a 4ºC, con 2 \mul de cada anticuerpo en un volumen final de 30 \mul, se lavaron y se volvieron a suspender en paraformaldehído al 1% (Sigma, St. Louis, MO). Interesantemente, la expresión de CD25 y CD154 se suprimió fuertemente después de la estimulación con perlas, 3x28, en concentraciones tan bajas como 10 ng/ml de FR901228 (Figura 5A y 5B). Por contraste, la producción de CD69 no se vio afectada por 100 ng/ml de FR901228 (Figura 5C). Además, las Figuras 8A-8B demuestran la inhibición de la producción de: CD25, CD134, CD137w, CD154, CD11a, CD54 y CD95 sobre células T CD4 sin afectar significativamente a la producción de CD69 o a la regulación por disminución producida por activación de CD62L (Figuras 8A-8B). Esto sugiere que FR901228 impone una inhibición específica, pero no completa, de la activación de células CD4 proximales. Además, la viabilidad celular mayor no se vio afectada significativamente por concentraciones hasta 100 ng/ml de FR901228, cuando se midió por exclusión de yoduro (YP) de propidio usando procedimientos de citometría de flujo clásicos (véase Dengler et al., Anticancer Drugs, 6(4):522-532,
1.995).

La inhibición de FR901228 no se pudo desviar por activación de ionomicina/AFM, que implica que la inhibición de FR901228 es aguas abajo de la subida en calcio intracelular observada inmediatamente después de la estimulación de CD3 de células CD4.

Ejemplo IV

Ensayos de IL-2 y TNF-\alpha

Se prepararon células como se describió anteriormente. Los sobrenadantes de las células estimuladas 24 h, se sometieron a un inmunoanálisis ligado a enzimas (ELISA), IL-2 o TNF-\alpha, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Biosource International, Sunnyvale, CA).

En un ensayo alternativo, se midió IL-2 por coloración intracelular de células T CD4 usando citometría de flujo. Por marcado intracelular de IL-2 o IFN-, se incubaron primero células con 1 g/ml de Monensina (Calbiochem), durante 4 horas, previamente al ensayo. Las células se colorearon con posterioridad para proteínas superficiales, como se describió anteriormente, se fijaron y permeabilizaron usando estuche de coloración intracelular de Becton Dickinson, se marcaron con Ab de IL-2 antihumano acoplado a PE e IFN- antihumano acoplado a FITC o los Abs de control correspondientes, como se describió por el fabricante. Se llevó a cabo la adquisición de datos y el análisis por citometría de flujo, en un citómetro de flujo FACSCalibur de Becton Dickinson usando software Celiquest siguiendo el protocolo del fabricante (Becton Dickinson).

Para estudiar el mecanismo detrás de la inhibición de FR901228 de proliferación de células CD4, se analizó la producción de IL-2 y TNF-\alpha por células CD4 activadas. FR901228 en concentraciones tan bajas como 10 ng/ml inhibió fuertemente la producción de IL-2, medido por ELISA, después de 24 h de estimulación con perlas (perlas acopladas a anticuerpo antiCD3 y antiCD28), 3x28, de células CD4 purificadas (Figura 6). Se observó una inhibición similar usando medición de IL-2 intracelular (no mostrado). Sin embargo, la producción de IL-2 disminuida no era exclusivamente responsable de la ausencia de proliferación de células T, ya que la adición de 100 U/ml de IL-2 (Boehringer Manheim) no restableció la proliferación. La observación de que FR901228 inhibía la producción de IL-2 contrasta con resultados previos indicados por Wang et al., que indica que FR901228 no inhibía la producción de IL-2 producida por CD3 del hibridoma de células T A1.1 (Oncogene 17(12):1.503-1.508, 1.998). Se desconoce la razón para esta diferencia en la actualidad.

En experimentos adicionales, se midió tanto IL-2 como TNF-\alpha por ELISA siguiendo a 24 horas de estimulación de linfocitos de sangre periférica (LSP) con perlas, 3x28, en presencia o ausencia de 20 ng/ml de FR901228 y 500 ng/ml de ciclosporina (Figuras 10A y 10B).

Ejemplo V

Ensayos de inhibición de proliferación

Se prepararon linfocitos de sangre periférica, como se describió anteriormente, se estimularon con perlas, 3x28, y se colorearon con diacetato de carboxifluoresceína y éster succinimidílico (DACF-ES), el día 6, posestimulación. La estimulación celular se llevó a cabo como se indicó anteriormente y se lavaron las células dos veces con PBS (por sus siglas en inglés) y se volvieron a suspender en medios de cultivo y se incubaron con DACF-ES (Molecular Probes, OR). Después de aproximadamente 10 minutos de coloración, las células se lavaron con medios de cultivo y FPS (por sus siglas en inglés) y se midió la incorporación de tinte. Se añadió FR901228 en diversos puntos de tiempo posestimulación, al tiempo 0 o a 24, 72 y 120 horas posestimulación. La Figura 7 representa datos de flujo generados por coloración con DACF-ES. El eje de ordenadas muestra intensidad de fluorescencia media, que tiene que ver con la inversa del crecimiento celular. De acuerdo con esto, los datos indican que el crecimiento celular de células T activadas se inhibía por FR901228 bien poniendo en contacto las células con FR901228 previamente a, al mismo tiempo con o con posterioridad a la estimulación con perlas, 3x28.

Ejemplo VI

Expresión de CD154 sobre células CD4

Se estudió el efecto de FR901228 en la producción del marcador de activación de CD154 sobre células CD4. Con respecto a esto, se marcaron células con Ab de CD4 antihumano acoplado a FITC (Immunotech., Fullerton, CA); Ab de CD154 antihumano acoplado a PE (Becton Dickinson, Fullerton, CA) o Ab de control de isotipo IgG1 acoplado a FITC o PE. Se marcaron células, 2x10^{5}, durante 20 minutos, a 4ºC, con 2 \mul de cada anticuerpo en un volumen final de 30 \mul, se lavaron y se volvieron a suspender en paraformaldehído al 1% (Sigma, St. Louis, MO). Las células se estimularon durante cuatro días, en presencia de perlas, 3x28, y/o 20 unidades/ml de IL-2 o un anticuerpo antiIL-2, el día tres. Se añadió FR901228 al cultivo en una concentración de 20 ng/ml. El día 4, se midió la intensidad de fluorescencia media por citometría de flujo. Como se representa en la Figura 9, la presencia de ausencia de IL-2 no compensó la supresión de expresión de CD154 producida por FR901228.

Ejemplo VII

Represión de CD154 en el nivel transcripcional

En este experimento, se transinfectaron de manera estable células T de Jurkat con una construcción de vector (p-EGFP1, Clonetech) en el que se unió la secuencia de nucleótidos que codifica proteína fluorescente, verde, de manera operable, al activador de CD154 clonado de células de Jurkat. Siguiendo a la selección de células que contenían el vector de interés, se sometieron las células a estimulación, durante 24 horas, con perlas, 3x28, en presencia de concentraciones variables (0 a 100 ng/ml) de FR901228. Se detectó después la fluorescencia usando citometría de flujo. Como se demuestra por la Figura 11, sólo células con 0 ng/ml de FR901228 mostraron producción de expresión de GFP más allá de las células sin estimulación.

En experimentos independientes, se llevó a cabo RT-PCR (por sus siglas en inglés) de la transcripción de CD154 después de 18 horas de estimulación con perlas, 3x28 y diversas cantidades de FR901228. Estos experimentos demostraron niveles reducidos de expresión de CD154 con cantidades crecientes de FR901228 (datos no mostrados). Los experimentos también se llevaron a cabo usando células CD4 incubadas con construcciones de hebra complementaria de c-myc. Después de estimulación por perlas, 3x28, durante veinticuatro horas, la construcción de c-myc de hebra complementaria redujo la expresión de CD154, cuando se midió por citometría de flujo, por aproximadamente 50%, cuando se compara con controles que no incluyen construcción, incluyen hebra transcrita o transinfección con una construcción de c-myc aleatorizada (datos no mostrados). De acuerdo con esto, FR901228 y compuestos similares pueden fijar como objetivo la actividad de c-myc y su producción de CD154 como un mecanismo de supresión inmunitaria.

Ejemplo VIII

Inhibición de ciclo celular previamente a entrada a fase S

Se incubaron células CD4 no estimuladas y estimuladas (estimulación de perlas, 3x28) con concentraciones variables de FR901228 y se midió el contenido de ADN intracelular por coloración con yoduro de propidio (YP) usando procedimientos clásicos. En resumen, se colorearon las células con una mezcla de 1 \mug/ml de YP y saponina al 0,03%, en PBS, durante aproximadamente 20 a 30 minutos. Como se indica por la Figura 12, la síntesis de ADN no tuvo lugar en células no estimuladas o en células estimuladas incubadas con 10 a 100 ng/ml de FR901228. De acuerdo con esto, parece que FR901228 inhibió el ciclo celular de células T activadas, previamente a entrar en la fase
S.

Ejemplo IX

Ensayos de proliferación de células T de radioisótopos

Se separaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP), de donantes sanos, por centrifugación en gradiente de densidad con fycoll-hypaque (LSM, Organon Teknika, Durham, Carolina del Norte). Después de lavado, el CMSP con medio de cultivo completo (medio de cultivo RPMI 1.640 con suero humano al 5%, glutamina 100 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácido no esencial 0,1 mM, penicilina 2 mM (Life Technologies) y estreptomicina 2 mM (Life Technologies), se irradiaron después a 7,5 J/kg (7.500 rad) y se volvieron a suspender a 4 - 4,5 x 10^{6} células/ml en medio de cultivo completo. Otra alíquota de CMSP se hizo formar rosetas con glóbulos rojos de oveja tratados con neuraminidasa (GRO). Después de otra centrifugación con LSM, se produjo la lisis de los GRO de estas células T en forma de rosetas, después, con amortiguador para producir la lisis, de cloruro de amonio (Life Technologies). Después de lavar dos veces con medios de cultivo completos, estas células T purificadas se volvieron a suspender también a 2-2,5 x 10^{6} células/ml en medios de cultivo completos. Se añadieron las diversas diluciones del compuesto de ensayo, por triplicado, a 50 l/pozo, en una placa de microcultivo de fondo plano de 96 pozos (Costar, Cambridge, Massachusetts). La suspensión de células T se distribuyó inmediatamente después en los pozos a 100 l/pozo. Después de incubar las células con el compuesto de ensayo, durante 30 min., a 37ºC, en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5% - aire al 95%, se añadió Ab antiCD3 (OKT-3, Ortho Diagnostic, Nueva Jersey) por pozo (conc. final de 10 ng/ml), seguido por 50 l de las CMSP irradiadas. La placa de cultivo se incubó después a 37ºC, en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5%-aire al 95%, durante 72 horas. Se valoró la proliferación de linfocitos T por medición de la incorporación de timidina (^{3}H) tritiada. Durante las últimas 18-24 horas de cultivo, las células se marcaron a pulso con 2 Ci/pozo de timidina tritiada (NEN, Cambridge, Massachusetts). Los cultivos se cosecharon sobre filtros de fibra de vidrio usando una cosechadora de muestras múltiples (MACH-II, Wallace, Gaithersburg, Maryland). Se midió la radiactividad de los discos de filtro que correspondía a pozos individuales por métodos de recuento en contadores de centelleo, líquidos, clásicos, (Betaplate Scint Counter, Wallace). Se calcularon recuentos medios por minuto de pozos replicados y los resultados se expresaron como concentración de compuesto requerida para inhibir la incorporación de timidina tritiada de células T por
50%.

Ejemplo X

Prevención y/o retardo de comienzo de diabetes en ratones DNO o DNOSCID

Este Ejemplo ilustra la capacidad de un compuesto de depsipéptido representativo FR901228, para prevenir o retardar el comienzo de la diabetes en ratones DNO y DNOSCID.

Se disolvió FR901228 en DMSO al 10%, en PBS y se administraron i.p. a ratones DNO o DNOSCID cada dos días. Los controles sólo contenían el excipiente DMSO (DMSO al 10% en PBS). Dado eso, los ratones DNOSCID no desarrollaron espontáneamente diabetes, se inyectaron 30 x 10^{6} células de bazo DNO, de un ratón DNO de 10 semanas, en cada ratón DNOSCID (i.v.) a las 4 semanas de edad, para producir diabetes, se administraron 0,5 mg/kg de FR901228 en cada tratamiento a veinte animales (diez animales DNO y diez animales DNOSCID). Cada dos semanas se evaluó el número de ratones en cada grupo de tratamiento que había llegado a ser diabético, midiendo los niveles de glucosa en sangre usado un glucómetro a intervalos de dos semanas. Una lectura de más de 200 mg/dl de glucosa en sangre en dos observaciones consecutivas, se consideró indicativa de franca diabetes. Los valores numéricos medios de glucosa para estos grupos se presentan en la Tabla 2 a continuación.

Como se muestra en la Tabla 2, en ratones DNOSCID, el comienzo de franca diabetes se retardó por al menos dos semanas en los ratones tratados con el compuesto, cuando se compara con los ratones que se trataron sólo con excipiente. Sorprendentemente, los resultados de los ratones DNO fueron incluso más espectaculares, porque ningún ratón DNO tratado con el compuesto, desarrolló franca diabetes durante el estudio de 18 semanas, mientras 8 de 10 ratones tratados con excipiente desarrollaron franca diabetes en el mismo cuadro temporal. Claramente, estos datos demuestran un efecto inmunodepresor en el retardo del comienzo de la diabetes fenotípico.

TABLA 2A Ratones DNO SCID inyectados de FR901228 frente a inyección con vehículo DMSO

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17

18

Claims (12)

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   1. El uso de un compuesto con la siguiente estructura:

   19

   o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero de la misma, en la que:

   m es 1, 2, 3 ó 4;

   n es 0, 1, 2 ó 3;

   p y q son independientemente 1 ó 2;

   X es O, NH o NR;

   R_{1}, o R_{2} y R_{3} son lo mismo o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y

   R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; para la fabricación de un medicamento para usar en la prevención o tratamiento del rechazo tras un transplante.
2. 2. El uso de la reivindicación 1, en el que el transplante comprende el transplante de uno cualquiera o más de los órganos o tejidos seleccionados del grupo que consiste en corazón, riñón, hígado, médula ósea, piel, córnea, vasos, pulmón, páncreas, intestino, extremidad, músculo, tejido nervioso, duodeno, intestino delgado y célula de islotes pancreáticos.
3. 3. El uso de un compuesto con la siguiente estructura:

   20

   o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero de la misma, en la que:

   m es 1, 2, 3 ó 4;

   n es 0, 1, 2 ó 3;

   p y q son independientemente 1 ó 2;

   X es O, NH o NR;

   R_{1}, R_{2} y R_{3} son los mismos o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y

   R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; para la fabricación de un medicamento para usar en la inhibición del crecimiento de células T CD4 o CD8, donde dichas células T CD4 o CD8 han sido inducidas por la unión de CD3 y CD28.
4. 4. El uso de un compuesto con la siguiente estructura:

   21

   o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero de la misma, en la que:

   m es 1, 2, 3 ó 4;

   n es 0, 1, 2 ó 3;

   p y q son independientemente 1 ó 2;

   X es O, NH o NR;

   R_{1}, o R_{2} y R_{3} son los mismos o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y

   R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; para la fabricación de un medicamento para usar en la inhibición del crecimiento de células T CD4 o CD8, donde dichas células T CD4 o CD8 han sido inducidas por lonomicina/PMA.
5. 5. El uso de un compuesto con la siguiente estructura:

   22

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   o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero de la misma, en la que:

   m es 1, 2, 3 ó 4;

   n es 0, 1, 2 ó 3;

   p y q son independientemente 1 ó 2;

   X es O, NH o NR;

   R_{1}, o R_{2} y R_{3} son los mismos o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y

   R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; para la fabricación de un medicamento para usar en la inhibición del crecimiento de células T CD4 o CD8, donde dichas células T CD4 o CD8 han sido inducidas por células dendríticas alogénicas.
6. 6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto es FR901228.
7. 7. Un compuesto con la siguiente estructura:

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   23

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   o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero de la misma, en la que:

   m es 1, 2, 3 ó 4;

   n es 0, 1, 2 ó 3;

   p y q son independientemente 1 ó 2;

   X es O, NH o NR;

   R_{1}, o R_{2} y R_{3} son lo mismo o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y

   R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; para usar en la prevención o tratamiento del rechazo tras un transplante.
8. 8. El compuesto de la reivindicación 7, en el que el transplante comprende el transplante de uno cualquiera o más de los órganos o tejidos seleccionados del grupo que consiste en corazón, riñón, hígado, médula ósea, piel, córnea, vasos, pulmón, páncreas, intestino, extremidad, músculo, tejido nervioso, duodeno, intestino delgado y célula de islotes pancreáticos.

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9. 9. Un compuesto con la siguiente estructura:

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   24

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   o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero de la misma, en la que:

   m es 1, 2, 3 ó 4;

   n es 0, 1, 2 ó 3;

   p y q son independientemente 1 ó 2;

   X es O, NH o NR;

   R_{1}, R_{2} y R_{3} son los mismos o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y

   R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; para usar en la inhibición del crecimiento de células T CD4 o CD8, donde dichas células T CD4 o CD8 han sido inducidas por la unión de CD3 y CD28.
10. 10. Un compuesto con la siguiente estructura:

    25

    o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero de la misma, en la que:

    m es 1, 2, 3 ó 4;

    n es 0, 1, 2 ó 3;

    p y q son independientemente 1 ó 2;

    X es O, NH o NR;

    R_{1}, o R_{2} y R_{3} son los mismos o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y

    R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; para usar en la inhibición del crecimiento de células T CD4 o CD8, donde dichas células T CD4 o CD8 han sido inducidas por lonomicina/PMA.
11. 11. Un compuesto con la siguiente estructura:

    26

    o una sal farmacéuticamente aceptable o estereoisómero de la misma, en la que:

    m es 1, 2, 3 ó 4;

    n es 0, 1, 2 ó 3;

    p y q son independientemente 1 ó 2;

    X es O, NH o NR;

    R_{1}, o R_{2} y R_{3} son los mismos o diferentes e independientemente un resto de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y

    R es un resto alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; para usar en la inhibición del crecimiento de células T CD4 o CD8, donde dichas células T CD4 o CD8 han sido inducidas por células dendríticas alogénicas.
12. 12. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, donde el compuesto es FR901228.