ES2347340T3 - Construcciones multimericas. - Google Patents
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Abstract
Una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z, en la que: X comprende el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 pero carece de los dominios tipo Ig 1 y 3 de VEGF-R1, estando dicho dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 unido covalentemente al resto Z mediante el resto Y; Y consta de un polipéptido de 5-25 restos aminoacídicos; y Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG o una parte Fc de una molécula de anticuerpo.
Description
Construcciones multiméricas.
La invención se refiere a proteínas construidas
de forma recombinante útiles para tratar la neovascularización
patológica, por ejemplo, asma, artritis, cáncer, y degeneración
macular.
La neovascularización patológica es un
componente clave de enfermedades como degeneración macular
relacionada con la edad (AMD) húmeda, retinopatía diabética
proliferativa, artritis reumatoide, osteoartritis, y asma. También
desempaña un papel importante en el crecimiento y propagación de
tumores. La neovascularización está regulada por un delicado
equilibrio de factores pro- y anti-angiogénicos.
Se sabe que el factor de crecimiento del
endotelio vascular (VEGF) es necesario para la neovascularización.
Se ha demostrado que la inhibición de la actividad VEGF inhibe la
neovascularización en modelos animales de AMD, artritis y en
diversos modelos de tumor. Los métodos usados para inhibir la
actividad VEGF incluyen anticuerpos, proteínas de fusión
receptoras, péptidos y pequeñas moléculas.
Se ha demostrado que las proteínas
VEGF-R1 (Flt-1) y
VEGF-R2 (KDR) se unen a VEGF con elevada afinidad.
Tanto Flt-1 como KDR tienen siete dominios tipo Ig
en su región extracelular. Se ha demostrado que el domino 2 es
esencial para la unión a VEGF. Fusiones de cada uno de los
receptores solubles de longitud completa (dominios
1-7) y los dominios 1-3 con Fc de
IgG se unen a VEGF de forma eficaz. Las fusiones de Fc de IgG con el
dominio tipo Ig 2 solo, sin embargo, eran incapaces de unirse a
VEGF, ya que eran una combinación de dominio tipo Ig 1 y 2.
Davis-Smyth, 1996. Por lo tanto, los dominios tipo
Ig 1 y 3 parecen ser necesarios junto con el dominio 2 para la
unión eficaz a VEGF.
Holash et al. (2002) Proc. Natl. Acad.
Sci. vol. 99(17): 11393-11398 describe
polipéptidos de fusión adicionales que comprenden partes del
receptor VEGF-R1 fusionado a la parte Fc de la
cadena pesada de IgG1. Vangelista et al. (2002) Protein
Engineering vol. 15(1): 51-57 describe un
polipéptido de fusión en el que los dos dominios extracelulares de
la cadena \alpha de Fc\varepsilonRI están fusionados al dominio
C-terminal de dimerización de la cadena pesada de
IgG1 humana.
De acuerdo con un aspecto de la presente
descripción, se proporciona una proteína de fusión. La proteína de
fusión tiene la fórmula X-Y-Z. X
comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por
un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una
citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta
esencialmente de un polipéptido de 5-25 restos
aminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada
de IgG.
Otro aspecto de la presente descripción es un
polipéptido de fórmula X-Y-Z. X
comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por
un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una
citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta
esencialmente de un resto enlazador que proporciona la separación
espacial de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una
región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG.
Otro aspecto más de la presente descripción es
una proteína de fusión de fórmula
X-Y-Z. X comprende un polipéptido
seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular,
una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina,
y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un polipéptido
de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una parte Fc de
una molécula de anticuerpo.
La presente descripción también proporciona una
proteína de fusión de fórmula X-Y-Z.
X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto
por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una
citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta
esencialmente de un resto enlazador que proporciona la separación
espacial de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una
parte Fc de una molécula de anticuerpo.
Otro aspecto más de la presente descripción es
un método para multimerizar un polipéptido X. Un polipéptido X se
une a un polipéptido Z mediante un polipéptido Y para formar el
polipéptido XYZ. X comprende un polipéptido seleccionado entre el
grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de
anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de
crecimiento. Y consta esencialmente de un polipéptido de
5-25 restos aminoacídicos. Z es una región CH3 de
una molécula de cadena pesada de IgG. El polipéptido XYZ que se
forma se multimeriza.
Otro aspecto más de la presente descripción
proporciona un método para multimerizar un polipéptido X. El
polipéptido X se une a un polipéptido Z mediante un resto Y para
formar el polímero XYZ. X comprende un polipéptido seleccionado
entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región
variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor
de crecimiento. Y consta esencialmente de un resto enlazador que
proporciona la separación espacial de 5-25 restos
aminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada
de IgG. El polipéptido XYZ que así se forma se multimeriza.
En un aspecto de la presente descripción se
proporciona un ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico
codifica una proteína de fusión que comprende un dominio tipo Ig 2
de VEGF-R1 (Flt-1); un enlazador; y
un dominio de multimerización. La proteína de fusión comprende una
secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº
2, 8, 21, 23, y 25.
En otro aspecto de la presente descripción se
proporciona una proteína de fusión. La proteína de fusión comprende
un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1
(Flt-1), un enlazador, y un dominio de
multimerización. La proteína de fusión comprende una secuencia
seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21,
23, y 25.
En otro aspecto de la presente descripción se
proporciona un método in vitro. Se suministra una molécula
de ácido nucleico a una célula de mamífero aislada. La molécula de
ácido nucleico codifica una proteína de fusión que comprende un
dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1
(Flt-1); un enlazador; y un dominio de
multimerización. La proteína de fusión comprende una secuencia
seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21,
23, y 25. La expresión de la proteína de fusión está controlada por
un promotor. Se forma una célula que expresa una proteína de
fusión.
Otro aspecto más de la presente descripción es
un método para suministrar una proteína de fusión a un mamífero. Se
suministra una célula de mamífero que expresa la proteína de fusión
a un mamífero. La célula expresa y secreta la proteína de fusión
suministrando de este modo la proteína de fusión al mamífero. La
proteína de fusión comprende un dominio tipo Ig 2 de
VEGF-R1 (Flt-1), un enlazador, y un
dominio de multimerización. La proteína de fusión comprende una
secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2,
8, 21, 23, y 25.
Otro aspecto de la presente descripción es un
método para suministrar una proteína de fusión a un mamífero. Se
suministra una proteína de fusión que comprende un dominio tipo Ig 2
de VEGF-R1 (Flt-1), un enlazador, y
un dominio de multimerización a un mamífero. La proteína de fusión
comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por
las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25. Como alternativa, puede
suministrarse una construcción de ácido nucleico que codifica dicha
proteína de fusión al mamífero, por lo cual el mamífero expresa la
proteína de fusión.
Estos y otros aspectos de la presente
descripción que se describirán en más detalle a continuación
proporcionan a la técnica métodos y agentes para tratar
enfermedades relacionadas con la proliferación e inflamación
vascular. Los agentes pueden proporcionar estabilidad y
biodisponibilidad aumentadas con relación a las formas naturales de
las proteínas.
Ahora una parte de la descripción que está
contenida en este documento proporciona los aspectos y realizaciones
de la presente invención. Más particularmente, un primer aspecto de
la presente invención proporciona una proteína de fusión de fórmula
X-Y-Z, en la que: X comprende el
dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 pero carece de los
dominios tipo Ig 1 y 3 de VEGF-R1, estando dicho
dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 unido covalentemente al
resto Z mediante el resto Y; Y consta de un polipéptido de
5-25 restos aminoacídicos; y Z es una región CH3 de
una molécula de cadena pesada de IgG o una parte Fc de una molécula
de anticuerpo.
En un aspecto relacionado, la presente invención
proporciona una composición que comprende esta proteína de fusión
de la invención, comprendiendo dicha composición adicionalmente uno
o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un método para multimerizar un polipéptido X,
comprendiendo el método: unir un polipéptido X a un polipéptido Z
mediante un polipéptido Y para formar un polipéptido XYZ, en el
que: X comprende el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1
pero carece de los dominios tipo Ig 1 y 3 de
VEGF-R1, estando dicho dominio tipo Ig 2 de
VEGF-R1 unido covalentemente al polipéptido Z
mediante el polipéptido Y; Y consta de un polipéptido de
5-25 restos aminoacídicos; y Z es una región CH3 de
una molécula de cadena pesada de IgG o una parte Fc de una molécula
de anticuerpo; por lo cual el polipéptido XYZ multimeriza.
En aspectos adicionales más, la presente
invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica
la proteína de fusión de la presente invención, un vector que
comprende dicha molécula de ácido nucleico, una célula de mamífero
que comprende la molécula de ácido nucleico, y un método in
Vitro que comprende suministrar la molécula de ácido nucleico a
una célula de mamífero aislada para formar una célula que exprese
la proteína de fusión.
En más aspectos adicionales, la presente
invención proporciona la proteína de fusión, el ácido nucleico, el
vector o la célula de mamífero de la presente invención, para su uso
en el tratamiento de un mamífero. En una realización, el mamífero
tiene degeneración macular relacionada con la edad húmeda o
retinopatía diabética proliferativa. En otra realización, el
mamífero tiene cáncer. En otra realización, el mamífero tiene
artritis reumatoide. En otra realización, el mamífero tiene asma.
En otra realización, el mamífero tiene osteoporosis.
Se exponen aspectos y realizaciones adicionales
de la presente invención en las reivindicaciones adjuntas.
Fig. 1. Región flexible del enlazador
9-Gly en la construcción
D2-9Gly-Fc. La flexibilidad relativa
predicha por el método de Karpus y Schultz (1985) muestra al
enlazador de 9 unidades de poliglicina (9-Gly)
(aminoácidos 94 a 103) en la proteína
D2-9Gly-Fc como una región con mayor
flexibilidad que el promedio (>1) en comparación con la
construcción D2-Fc que no contiene el enlazador
9-Gly. Ambas proteínas de fusión contienen
secuencias de aminoácidos idénticas encerradas en los recuadros: sp
- péptido señal (aminoácidos -24 a -1), dominio 2 de
Flt-1 (aminoácidos 1 a 93) y los restos de
IgG1-Fc (244 aminoácidos). La flecha representa el
sitio de escisión por la peptidasa señal predicha usando el
programa SignalP V2.0 (Nielsen et al., 1997).
Fig. 2. Actividad biológica de
D2-9Gly-Fc frente a
D2-Fc. Se cultivaron células 293 en el medio de
privación (M199 + FCS al 5%) y se transfectaron con plásmidos que
contenían los casetes de expresión
D2-9Gly-Fc y D2-Fc
bajo el control de promotor CMV. Se recogió el medio condicionado
(CM) 72 h después. Se sembraron HUVEC en placas de 96 pocillos (2E3
células/pocillo) en medio de privación + VEGF (10 ng/ml) y se
añadieron 50 \mul de CM más VEGF (10 ng/ml) 24 h después. Los
controles (+/- VEGF) se incubaron con CM a partir de la transfección
de plásmido pEGFP de control (Clontech; pEGFP lleva una variante
cambiada a rojo de la proteína fluorescente verde de tipo silvestre
(GFP) que se ha optimizado para una fluorescencia más brillante y
mayor expresión en células de mamífero). El control positivo se
trató con 50 ng de proteína recombinante
Flt-1-IgG (R&D Systems). Las
HUVEC se ensayaron para la proliferación 3 días después del
tratamiento usando el reactivo CellTiter 96® AQ_{ueous}
(Promega). Los datos representan las medias de los valores promedio
de la OD490 de dos experimentos cada uno ensayado por
triplicado.
Fig. 3. Análisis de transferencia de Western de
D2-9Gly-Fc y D2-Fc.
Parece que el tamaño de las proteínas tanto
D2-9Gly-Fc como
D2-Fc es el doble de grande cuando migra en gel no
reductor en comparación con la migración en gel reductor. Las
proteínas se cargaron a partir del medio condicionado después de que
las transfecciones en células 293 de plásmidos que expresan
D2-9Gly-Fc y D2-Fc
se separaran por electroforesis en SDS y se transfirieran a una
membrana de PVDF. La transferencia se sondeó con anticuerpos de
cabra anti-Fc de IgG1 humana y de conejo
anti-IgG de cabra-HRP.
Fig. 4. Proteínas híbridas
sFlt-1 que contienen el enlazador 9Gly y VEGF Ex3.
Comparación de estructura de
D2-9Gly-Ex3/CH3 con proteínas
construidas previamente. Las tres proteínas contienen idéntica
secuencia de aminoácidos del dominio 2 de Flt-1,
que consta de 24 aminoácidos del péptido señal de
Flt-1 y 93 aminoácidos del dominio 2 de
Flt-1.
D2-9Gly-Ex3/CH3 contiene 9
aminoácidos del enlazador 9Gly, 14 aminoácidos de VEGF Ex3 y 120
aminoácidos de la región CH3 de Fc de cadena pesada de IgG1
humana.
Fig. 5. Actividad biológica de
D2-9Gly-Ex3/CH3 frente a
D2-9Gly-Fc. La proteína
D2-9Gly-Ex3/CH3, en la que el
dominio 2 está conectado a la región CH3 a través del enlazador 9Gly
y VEGF Ex3, también inhibe de forma eficaz la proliferación de
HUVEC dependiente de VEGA en comparación con las proteínas de
control D2-9Gly-Fc y
D2-Fc. Se usaron 50 ng de
Flt-1-IgG recombinante (R&D
Systems) como control.
Fig. 6. Ensayo de proliferación de HUVEC que
compara la actividad proteica de
D2-(Gly_{4}Ser)_{3}-Fc con
D2-9Gly-Fc y
D2-9Gly-Ex3/CH3.
Fig. 7. Transferencia de Western. Se separaron
las proteínas (no reducidas y reducidas) del medio condicionado de
células 293 transfectadas (15 \mul de CM) con plásmidos que
expresaban proteínas (1):
D2-9Gly-Fc; (2):
D2-(G_{4}S)_{3}-Fc y (3): EGFP por
electroforesis en SDS y se transfirieron a una membrana de PVDF. La
transferencia se sondeó con anticuerpos de cabra
anti-Fc de IgG1 humana y de conejo
anti-IgG de cabra-HRP.
Fig. 8. Combinaciones con/sin enlazador 9Gly o
VEGF Ex3. Comparación de estructura de tres nuevas proteínas con o
sin enlazador 9Gly y/o VEGF Ex3,
D2-9Gly-CH3, D2-CH3
y D2-Ex3/CH3.
Fig. 9. Ensayo de proliferación de HUVEC con las
construcciones Flt-1(D2) con combinaciones
9Gly, Ex3 y CH3. Se comparó el medio condicionado de células 293 (5
\mul) que contenían las proteínas D2-Ex3/CH3,
D2-9Gly-CH3 y
D2-CH3 con
D2-9Gly-Fc y
D2-9Gly-Ex3/CH3.
Fig. 10. Transferencia de Western. Se
transfectaron células 293 con plásmidos que expresaban: (1)
D2-9Gly-Fc; (2)
D2-9Gly-CH3 (52/26 kDa); y (3)
D2-CH3 (50/25 kDa). Las proteínas del medio
condicionado de células 293 (15 \mul de CM no reducido y/o
reducido) se separaron por electroforesis en SDS y se transfirieron
a una membrana de PVDF. La transferencia se sondeó con conjugado
anti-VEGF-R1 humano HRP (R&D
Systems).
Fig. 11. Ensayo de unión de VEGF "in
vitro". Se diluyeron en serie los medios condicionados de
células 293 que contenían concentraciones conocidas tanto de
D2-9Gly-Fc como de los receptores
solubles de control Flt-1
D(1-3) (que varían en las concentraciones de
0,29 - 150 pM) y se mezclaron con VEGF 10 pM. Después se midió la
cantidad de VEGF no unido por ELISA.
D2-9Gly-Fc se une a VEGF con mayor
afinidad que todas las demás construcciones. "n" representa la
cantidad de experimentos independientes (ensayo de transfección y
unión).
Fig. 12. La cinética de unión de las
construcciones solubles de Flt-1 se midió por
resonancia de plasmón superficial con un instrumento BIAcore. Las
construcciones sFlt-1 se inmovilizaron sobre un chip
detector, y se inyectó VEGF165 a concentraciones que variaban de
0,2 a 15 nM. Los sensogramas se evaluaron usando el programa BIA
Evaluation, se determinaron las constantes de velocidad Ka y Kd y se
calculó la constante de disociación (KD) a partir de la proporción
Kd/Ka = KD. Un menor valor de KD significa mejor afinidad.
Fig. 13A-13C. La Fig. 13A
muestra los niveles de expresión de las construcciones de
Flt-1 que tenían diversos enlazadores. La Fig. 13B
muestra la dimerización o multimerización de construcciones de
Flt-1 que tenían diversos enlazadores y un resto
CH3 de Fc de IgG1. La diferencia entre las condiciones no reducidas
y reducidas indica que las proteínas habían multimerizado. La Fig.
13C muestra la bioactividad inhibidora de las construcciones de
Flt-1 indicadas presentes en medio condicionado en
un ensayo de proliferación de HUVEC en presencia de VEGF. Cada una
de las construcciones mostró actividad inhibidora que se acerca a
los niveles de proliferación de las HUVEC en ausencia de VEGF.
Fig. 14. Usando un modelo murino de retinopatía
inducida por oxígeno (OIR) de neovascularización retiniana (NV), se
administró una de las construcciones de Flt-1 a los
ojos del ratón y se determinó la neovascularización. Los ratones se
expusieron a condiciones hiperóxicas. La cantidad de acontecimientos
neovasculares se determinó en los ojos tratados en comparación con
los acontecimientos en los ojos no tratados de los mismos animales.
El animal se consideró un "respondedor" si había una reducción
de más del 50% en los acontecimientos neovasculares.
\vskip1.000000\baselineskip
Es un descubrimiento de la presente invención
que el dominio tipo Ig 2 Flt-1 sin los dominios 1 y
3 es capaz de unirse de forma eficaz a VEGF y de inhibir la
proliferación de las células endoteliales dependiente de VEGF. El
dominio 2 puede unirse covalentemente a un dominio de
multimerización mediante un enlazador. Los enlazadores son
típicamente cadenas polipeptídicas. La longitud de la cadena puede
ser de 6, 7, 9, 11, 13, 15 o más restos aminoacídicos, pero
típicamente está entre 5 y 25 restos. Dependiendo de la longitud y
la composición de la cadena lateral, un enlazador puede tener,
aunque no lo necesita, una flexibilidad mayor de la promedio. La
flexibilidad puede calcularse usando algoritmos conocidos en la
técnica. Los dominios de multimerización son aquellas partes de las
proteínas multiméricas que promueven la asociación de subunidades
para forma, por ejemplo, dímeros, trímeros, tetrámeros, etc. Las
proteínas recombinantes adecuadas para la unión eficaz a VEGF y/o
la inhibición de la proliferación de células endoteliales
dependiente de VEGF se seleccionan entre el grupo compuesto por las
SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.
Además, se ha descubierto que los dominios de
multimerización y los enlazadores pueden usarse con una diversidad
de proteínas diferentes o partes de proteínas para inducir la
multimerización. Dichas proteínas pueden ser aquellas que se unen a
un ligando o receptor solamente cuando se multimerizan, o pueden ser
aquellas cuya afinidad de unión se potencia cuando se multimerizan.
Las proteínas para la multimerización adecuadas incluyen receptores
extracelulares (que incluyen partes de los mismos), regiones
variables de anticuerpos, citoquinas, quimioquinas, y factores de
crecimiento. Las proteínas adecuadas incluyen receptores tirosina
quinasa y receptores serina-treonina quinasa. Los
ejemplos específicos de receptores extracelulares incluyen el
receptor de EGF, receptores acoplados a proteína G, el receptor de
FGF, receptores Fc, receptores de células T, etc. Los ejemplos de
regiones variables de anticuerpos incluyen Fab, F(ab')2, y
ScFv. Los ejemplos de citoquinas incluyen GM-CSF,
IL-1\alpha, IL-1\beta,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-10, IL-12,
IL-18, IL-21, IL-23,
IFN-\alpha, IFN-\beta,
IFN-\gamma, MIP-1\alpha,
MIP-1\beta, TGF-\beta,
TNF\alpha, y TNF\beta. Los ejemplos de quimioquinas incluyen
BCA-1/BLC, BRAK, quimioquina CC-2,
CTACK, CXCL-16, ELC, ENA, ENA-70,
ENA-74, ENA-78, eotaxina,
exodus-2, fractalquina, GCP-2, GRO,
GRO alfa (MGSA), GRO-beta,
GRO-gamma, HCC-1,
HCC-4, I-309, IP-10,
I-TAC, LAG-1,
LD78-beta, LEC/NCC-4,
LL-37, linfotactina, MCP, MCAF
(MCP-1), MCP-2,
MCP-3, MCP-4, MDC, MDC,
MDC-2, MDC-4, MEC/CCL28, MIG, MIP,
MTP-1 alfa, MIP-1 beta,
MIP-1 delta,
MIP-3/MPIF-1, MIP-3
alfa, MIP-3 beta, MIP-4 (PARC),
MIP-5, NAP-2, PARC,
PF-4, RANTES, RANTES-2,
SDF-1 alfa, SDF-1 beta, TARC, y
TECK. Los ejemplos de factores de crecimiento incluyen
anfirregulina humana, proteínas de angiogénesis humanas, ACE humana,
angiogenina humana, angiopoyetina humana, angiostatina humana,
betacelulina humana, BMP humana, BMP-13
humana/CDMP-2, BMP-14
humana/CDMP-1, BMP-2 humana,
BMP-3 humana, BMP-4 humana,
BMP-5 humana, BMP-6 humana,
BMP-7 humana, BMP-8 humana,
BMP-9 humana, factores estimuladores de colonias
humanos, ligando flt3 humano, G-CSF humano,
GM-CSF humano, M-CSF humano, factor
de crecimiento de tejido conectivo humano, cripto-1
humano, cryptic humano, ECGF humano, EGF humano,
EG-VEGF humano, eritropoyetina humana, fetuína
humana, FGF humano, FGF-1 humano,
FGF-10 humano, FGF-16 humano,
FGF-17 humano, FGF-18 humano,
FGF-19 humano, FGF-2 humano,
FGF-20 humano, FGF-3 humano,
FGF-4 humano, FGF-5 humano,
FGF-6 humano, FGF-7 humano/KGF,
FGF-8 humano, FGF-9 humano,
FGF-ácido humano, FGF-básico humano,
GDF-11 humano, GDF-15 humano, factor
liberador de la hormona del crecimiento humano,
HB-EGF humano, heregulina humana, HGF humano, IGF
humano, IGF-I humano, IGF-II humano,
inhibina humana, KGF humano, LCGF humano, LIF humano, factores
misceláneos de crecimiento humanos, MSP humana, miostatina humana,
propéptido de miostatina humano, factor de crecimiento nervioso
humano, oncostatina M humana, PD-ECGF humano, PDGF
humano, PDGF humano (homodímero AA), PDGF humano (heterodímero AB),
PDGF humano (homodímero BB), PDGF humano (homodímero CC), PIGF
humano, PIGF humano, PIGF-1 humano,
PIGF-2 humano, SCF humano, SMDF humano, factores de
crecimiento de células madre humanas, SCGF-alfa
humano, SCGF-beta humano, trombopoyetina humana,
factor de crecimiento transformante humano,
TGF-alfa humano, TGF-beta humano, y
VEGF humano.
La proteína receptora Flt-1
tiene una parte extracelular que comprende siete dominios tipo Ig.
Estos están localizados en los restos con los números 32...123,
151...214, 230...327, 335...421, 428...553, 556...654, y 661...747
del número de acceso a Genbank P17948, véase también la SEC ID Nº
15. Los restos con los números 1-26 comprenden una
secuencia señal. La proteína Flt-1 está codificada
por la secuencia de ADN mostrada en el número de acceso a Genbank
NM_002019 (SEC ID Nº 14).
Los dominios de multimerización que pueden
usarse de acuerdo con la presente descripción son conocidos en la
técnica. Pueden usarse las secuencias de la parte Fc de la cadena
pesada de IgG1 o IgG2 gamma, por ejemplo, CH3 solo (aminoácidos
371-477) o los dominios tanto CH2 como CH3
(aminoácidos 247-477). La parte Fc de las moléculas
Ig es la que se obtiene por escisión de moléculas de anticuerpo
completo con la enzima papaína. Pueden usarse otros medios para
obtener estas partes. Para la secuencia proteica de la cadena pesada
de IgG1 gamma, véase el número de acceso a Genbank Y14737 y la SEC
ID Nº 10. Pueden usarse otras regiones Fc, por ejemplo, de otros
tipos de IgG y de anticuerpos IgA, IgM, IgD, o IgE. También puede
usarse la región de multimerización de VEGF. Se muestra una
secuencia de ADN que codifica VEGF en el número de acceso a Genbank
NM_003376 y la SEC ID Nº 11. Se muestra una secuencia de
aminoácidos de VEGF en el número de acceso a Genbank CAC19513 y la
SEC ID Nº 12. La región de multimerización de VEGF (SEC ID Nº 13),
codificada por el exón 3 de VEGF (VEGF Ex3), está en
aproximadamente los restos aminoacídicos 75-88 de la
proteína VEGF (SEC ID Nº 12). Los dominios de multimerización
causarán que al menos el 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%,
85%, 90%, o 95% de las proteínas de fusión monoméricas miren sobre
un gel de poliacrilamida no desnaturalizante a una velocidad
apropiada para un multímero. La glicosilación puede afectar a la
migración de una proteína en un gel. Aunque aquí se muestran
secuencias particulares, también pueden usarse variantes tales como
variantes alélicas. Típicamente dichas variantes tendrán al menos
un 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia
descrita.
La multimerización puede ensayarse, por ejemplo,
usando geles reductores y no reductores, como se demuestra en este
documento. La multimerización también puede ensayarse por detección
de afinidad de unión aumentada de una proteína por su
ligando/receptor. Pueden usarse ensayos de resonancia de plasmón
superficial BiaCore^{TM} a este respecto. Estos ensayos detectan
cambios en la masa midiendo los cambios en el índice de refracción
en una capa acuosa cercana a la superficie de un chip detector.
Cualquier método conocido en la técnica puede usarse para detectar
la multimerización.
Los restos enlazadores de acuerdo con la
presente descripción pueden estar compuestos por, por ejemplo,
5-100 restos aminoacídicos, 5-75
restos aminoacídicos, 5-50 restos aminoacídicos,
5-25 restos aminoacídicos, 5-20
restos aminoacídicos, 5-15 restos aminoacídicos,
5-10 restos aminoacídicos, o 5-9
restos aminoacídicos. Los ejemplos de enlazadores útiles incluyen:
gly_{9} (SEC ID Nº 27), glu_{9} (SEC ID Nº 28), ser_{9} (SEC
ID Nº 29), gly_{5}cyspro_{2}cys (SEC ID Nº 30),
(gly_{4}ser)_{3} (SEC ID Nº 31),
SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº 32),
ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº 13),
GlyAspLeuIleTyrArgAsnGlnLys (SEC ID Nº 26), y
Gly_{9}ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº 34).
Otros enlazadores polipeptídicos que pueden usarse incluyen una
poliglicina de diferentes longitudes, incluyendo de 5, 7, o 30
restos. Además, pueden usarse otras partes de Flt-1
como enlazador, por ejemplo, el dominio 3 de Flt-1.
Véase la SEC ID Nº 15. Los restos enlazadores también pueden
crearse a partir de otros polímeros, tales como polietilenglicol.
Dichos enlazadores pueden tener de 10 a 1000,
10-500, 10-250,
10-100, o 10-50 unidades monoméricas
de etilenglicol. Los polímeros adecuados deben ser de un tamaño
similar al tamaño ocupado por el intervalo apropiado de restos
aminoacídicos. Un polímero de tamaño ajustado típico proporcionaría
un espaciado de aproximadamente 10-25 angstrom.
A pesar de la generalidad de la descripción
anterior, sin embargo, la presente invención se refiere a una
proteína de fusión de fórmula X-Y-Z,
en la que: X comprende el dominio tipo Ig 2 de
VEGF-R1 pero carece de los dominios tipo Ig 1 y 3
de VEGF-R1, estando dicho dominio tipo Ig 2 de
VEGF-R1 unido covalentemente al resto Z mediante el
resto Y; Y consta de un polipéptido de 5-25 restos
aminoacídicos; y Z es una región CH3 de una molécula de cadena
pesada de IgG o una parte Fc de una molécula de anticuerpo.
Las proteínas de fusión de acuerdo con la
presente descripción, incluyendo las proteínas de fusión de la
presente invención, pueden crearse por cualquier medio conocido en
la técnica. Aunque dichas proteínas pueden crearse de forma
sintética, o uniendo partes que están hechas, también puede usarse
la producción recombinante. Puede producirse una secuencia génica
fusionada usando las herramientas convencionales de ADN
recombinante. La secuencia génica fusionada puede insertarse en un
vector, por ejemplo, un vector viral o plasmídico, para replicar la
secuencia génica fusionada. Puede introducirse una secuencia
promotora que es funcional en la célula receptora final cadena
arriba de la secuencia génica promotora. Los promotores usados
pueden ser constitutivos, inducibles o reprimibles. Se conocen bien
en la técnica ejemplos de cada tipo. El vector puede introducirse en
una célula hospedadora o mamífero por cualquier medio conocido en
la técnica. Los vectores adecuados que pueden usarse incluyen
adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus,
lentivirus, y plásmidos. Si el vector está en un vector viral y el
vector se ha empaquetado, entonces pueden usarse los viriones para
infectar células. Si se usa ADN desnudo, entonces pueden usarse los
procedimientos de transfección o transformación que sean apropiados
para las células hospedadoras particulares. Pueden usarse
formulaciones de ADN desnudo utilizando polímeros, liposomas, o
nanoesferas para el suministro de genes de fusión. Las células que
pueden transformarse o transfectarse con construcciones
recombinantes de acuerdo con la invención pueden ser cualesquiera
que sean convenientes para el especialista. Los tipos celulares
ejemplares que pueden usarse incluyen bacterias, levaduras, células
de insecto, y de mamífero. Entre las células de mamífero, pueden
elegirse células de mucho tipos tisulares, según sea conveniente.
Las células ejemplares que pueden usarse son fibroblastos,
hepatocitos, células endoteliales, células madres, células
hematopoyéticas, células epiteliales, miocitos, células neuronales,
y queratinocitos. Estas células pueden usarse para producir
proteínas in vitro, o pueden suministrarse a mamíferos
incluyendo seres humanos para producir las proteínas codificadas
in vivo. Este medio de suministro es una alternativa al
suministro de ácido nucleico a un mamífero, al suministro de un
vector viral a un mamífero, y al suministro de la proteína de
fusión a un mamífero.
Las composiciones de proteína o ácidos nucleicos
pueden estar en vehículos, tales como tampones, vehículos acuosos o
lipófilos, vehículos estériles o no estériles, pirogénicos o no
pirogénicos. Los vehículos no pirogénicos son útiles para
formulaciones inyectables. Las formulaciones pueden ser líquidas o
sólidas, por ejemplo, liofilizadas. Las formulaciones también
pueden administrarse en forma de aerosoles. Las composiciones pueden
contener una o más proteínas de fusión o uno o más ácidos
nucleicos, o tanto proteínas de fusión como ácidos nucleicos. Las
proteínas de fusión y/o los ácidos nucleicos en una composición
pueden ser homogéneos, en cuyo caso se formarán proteínas
homomultiméricas, o pueden ser heterogéneos en la composición, en
cuyo caso se formarán proteínas heteromultiméricas. En el caso de
heteromultímeros, típicamente el resto X variará entre proteínas de
fusión, pero el resto Z será igual entre las proteínas de
fusión.
Pueden proporcionarse proteínas de fusión a una
célula u hospedador mamífero por cualquier medio conocido en la
técnica. Puede suministrarse la proteína a la célula u hospedador.
Puede administrarse el ácido nucleico a la célula u hospedador.
Pueden administrarse las células transformadas o transfectadas a la
célula u hospedador. En el último caso, se desean células del mismo
fondo genético para reducir el rechazo de transplante.
Las células adecuadas para el suministro a
animales hospedadores mamíferos incluyen cualquier tipo celular de
mamífero de cualquier órgano, tumor, o línea celular. Por ejemplo,
pueden usarse células humanas, murinas, de cabra, ovinas, bovinas,
de perro, de gato, y porcinas. Los tipos celulares adecuados para su
uso incluyen, sin limitación, fibroblastos, hepatocitos, células
endoteliales, queratinocitos, células hematopoyéticas, células
epiteliales, miocitos, células neuronales, y células madre.
Los medios de suministro de proteínas de fusión
o ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión incluyen el
suministro de células que expresan las proteínas de fusión, el
suministro de las proteínas de fusión, y el suministro de ácidos
nucleicos que codifican las proteínas de fusión. Las proteínas de
fusión, células, o ácidos nucleicos pueden suministrarse
directamente al órgano o tumor deseado, por ejemplo, por inyección,
cateterismo, o endoscopia. También pueden suministrarse por vía
intravenosa, intrabronquial, intratumoral, intratecal,
intramuscular, intraocular, tópica, subcutánea, transdérmica o
per os. Los pacientes que pueden tratarse de forma eficaz
incluyen aquellos con degeneración macular relacionada con la edad
húmeda, retinopatía diabética proliferativa, artritis reumatoide,
osteoartritis, uveítis, asma, y cáncer. Los tratamientos mejorarán
los síntomas y/o los marcadores de la enfermedad y/o la gravedad de
la enfermedad.
Los ácidos nucleicos pueden suministrarse a
mamíferos, y en particular, a seres humanos, en cualquier vector
deseado. Estos incluyen vectores virales o no virales, incluyendo
vectores adenovirales, vectores virales
adeno-asociados, vectores retrovirales, vectores
lentivirales, y vectores plasmídicos. Los tipos ejemplares de virus
incluyen VHS (virus del herpes simple), adenovirus, AAV (virus
adeno-asociado), VIH (virus de la inmunodeficiencia
humana), VIB (virus de la inmunodeficiencia bovina), y VLM (virus de
la leucemia murina). Los ácidos nucleicos pueden administrarse en
cualquier formato deseado que proporcione niveles de suministro
suficientemente eficaces, incluyendo en partículas virales, en
liposomas, en nanopartículas, y en complejo con polímeros.
Pueden usarse combinaciones de tratamientos con
proteína y ácido nucleico. Por ejemplo, puede administrarse una
proteína de fusión de acuerdo con la presente descripción, por
ejemplo, una proteína de fusión de acuerdo con la presente
invención a un paciente. Si se observa una respuesta favorable,
entonces puede administrarse una molécula de ácido nucleico que
codifique la proteína de fusión para un efecto a largo plazo. Como
alternativa, la proteína y el ácido nucleico pueden administrarse
de forma simultánea o aproximadamente simultánea. En otra
alternativa, puede administrarse un anticuerpo o proteína de fusión
para un ligando seguido de o de forma concomitante con un
anticuerpo o compañero de fusión para un receptor. Otra opción
emplea una combinación de ácidos nucleicos en la que uno codifica
un anticuerpo y otros codifica una proteína de fusión. Algunos
anticuerpos que pueden emplearse en combinación con las
construcciones de Flt-1 de la presente descripción,
por ejemplo, en combinación con las construcciones
Flt-1 de la presente invención (sea en forma de
proteína o de ácido nucleico) son bevacizumab y ranibizumab, ambos
dirigidos contra VEGF. Estos son particularmente útiles para tratar
el cáncer y la degeneración macular, respectivamente.
La práctica de la presente descripción,
incluyendo la práctica de la presente invención emplea, salvo que
se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología
molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología,
biología celular, bioquímica e inmunología, que pertenecen a las
habilidades de la técnica. Dichas técnicas se explican
completamente en la bibliografía, tal como, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Segunda Edición (Sambrook et al.,
1989); Current Protocols In Molecular Biology (F.M. Ausubel
et al., eds., 1987); Oligonucleotide Synthesis (M.J.
Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed.,
1987); Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.);
Handbook Of Experimental Immunology (D.M. Wei & C.C.
Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells
(J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase
Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current
Protocols In Immunology (J.E. Coligan et al, eds.,
1991); Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane
eds. (1988)); y PCR 2: A Practical Approach (M.J.
MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)).
Un vehículo de suministro de genes es cualquier
molécula que puede transportar polinucleótidos insertados al
interior de una célula hospedadora. Ejemplos de vehículos de
suministro de genes son liposomas, polímeros biocompatibles,
incluyendo polímeros naturales y polímeros sintéticos;
lipoproteínas; polipéptidos; polisacáridos; lipopolisacáridos;
envueltas virales artificiales; partículas metálicas; y bacterias,
virus, tales como baculovirus, adenovirus y retrovirus, vectores
bacteriófagos, cósmidos, plasmídicos, fúngicos y otros vehículos de
recombinación típicamente usados en la técnica que se han descrito
para la expresión en una diversidad de hospedadores eucariotas y
procariotas, y pueden usarse para terapia génica así como para la
simple expresión de proteínas.
Suministro de genes, transferencia génica, y
similares, como se usan en este documento, son términos que se
refieren a la introducción de un polinucleótido exógeno (a veces
mencionado como "transgén") en una célula hospedadora,
independientemente del método usado para la introducción. Dichos
métodos incluyen una diversidad de técnicas bien conocidas tales
como transferencia génica mediada por vector (por, por ejemplo,
infección/transfección vírica, o diversos complejos de suministro
de genes basados en proteínas o basados en lípidos diferentes) así
como técnicas que facilitan el suministro de polinucleótidos
"desnudos" (tal como electroporación, suministro por
"pistola génica" y diversas técnicas diferentes usadas para la
introducción de polinucleótidos). El polinucleótido introducido
puede mantenerse de forma estable o transitoria en la célula
hospedadora. El mantenimiento estable típicamente requiere que el
polinucleótido introducido contenga un origen de replicación
compatible con la célula hospedadora o se integre en un replicón de
la célula hospedadora tal como un replicón extracromosómico (por
ejemplo, un plásmido) o un cromosoma nuclear o mitocondrial. Se sabe
que varios vectores son capaces de mediar la transferencia de genes
a células de mamífero, que se conocen en la técnica y se describen
en este documento.
El polinucleótido exógeno se inserta en un
vector tal como adenovirus, adenovirus parcialmente eliminado,
adenovirus completamente eliminado, virus
adeno-asociado (AAV), retrovirus, lentivirus,
plásmido desnudo, complejo plásmido/liposoma, etc. para el
suministro al hospedador mediante vía intravenosa, intramuscular, a
través de la porta u otra vía de administración. Los vectores de
expresión que pueden usarse en los métodos y composiciones de la
presente descripción, por ejemplo, en las composiciones de la
presente invención incluyen, por ejemplo, vectores virales. Uno de
los métodos más frecuentemente usados de administración de terapia
génica, tanto in vivo como ex vivo, es el uso de
vectores virales para el suministro del gen. Se conocen muchas
especies de virus, y muchas se han estudiado para propósitos de
terapia génica. Los vectores virales más habitualmente usados
incluyen aquellos derivados de adenovirus, virus
adeno-asociados (AAV) y retrovirus, incluyendo
lentivirus, tales como el virus de la inmunodeficiencia humana
(VIH).
El adenovirus es un virus de ADN nuclear, sin
envuelta con a genoma de aproximadamente 36 kb, que se ha
caracterizado bien a través de estudios en genética clásica y
biología molecular (Hurwitz, M.S., Adenoviruses Virology, 3ª
edición, Fields et al., eds., Raven Press, Nueva York, 1996;
Hitt, M.M. et al., Adenovirus Vectors, The Development of
Human Gene Therapy, Friedman, T. ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Nueva York 1999). Los genes virales se clasifican
en unidades transcripcionales tempranas (denominadas
E1-E4) y tardías (denominadas
L1-L5), que se refieren a la generación de dos
clases temporales de proteínas virales. La demarcación de estos
acontecimientos es la replicación de ADN viral. Los adenovirus
humanos se dividen en numerosos serotipos (aproximadamente 47,
numerados en consecuencia y clasificados en 6 grupos: A, B, C, D, E
y F), en base a propiedades que incluyen hemaglutinación de
glóbulos rojos, oncogenicidad, composiciones y homologías de ADN y
aminoácidos proteicos, y relaciones antigénicas.
Los vectores adenovirales recombinantes tienen
varias ventajas para su uso como vehículos de suministro de genes,
incluyendo el tropismo por células tanto en división como no en
división, potencial patogénico mínimo, capacidad de replicarse a un
elevado título para la preparación de reservas de vector, y el
potencial de portar grandes insertos (Berkner, K.L., Curr. Top.
Micro. Immunol. 158:39-66, 1992; Jolly, D.,
Cancer Gene Therapy 1:51-64 1994). Se han
diseñado vectores adenovirales con deleciones de diversas secuencias
génicas adenovirales, tales como vectores pseudoadenovirales (PAV)
y adenovirales parcialmente eliminados (llamados "DeAd"), para
aprovechar las características deseables de los adenovirus que los
convierten en un vehículo adecuado para el suministro de ácidos
nucleicos a células receptoras.
En particular, los vectores pseudoadenovirales
(PAV), también conocidos como "adenovirus gutless" o
mini-vectores adenovirales, son vectores
adenovirales derivados del genoma de un adenovirus que contiene las
secuencias nucleotídicas de acción cis mínimas necesarias
para la replicación y empaquetado del genoma del vector y que
pueden contener uno o más transgenes (Véase, la patente de Estados
Unidos Nº 5.882.877 que cubre los vectores pseudoadenovirales (PAV)
y métodos para producir PAV). Los PAV se han diseñado para
aprovechar las características deseables de los adenovirus que los
convierten en un vehículo adecuado para el suministro de genes.
Aunque los vectores adenovirales generalmente pueden portar insertos
de hasta 8 kb de tamaño por la deleción de regiones que son
prescindibles para el crecimiento viral, la capacidad de carga
máxima puede conseguirse con el uso de vectores adenovirales que
contienen deleciones de la mayoría de las secuencias codificantes
virales, incluyendo PAV. Véase, la patente de Estados Unidos Nº
5.882.877 de Gregory et al.; Kochanek et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93:5731-5736, 1996; Parks et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13565-13570,
1996; Lieber et al., J. Virol. 70:8944-8960,
1996; Fisher et al., Virology 217:11-22,
1996; la patente de Estados Unidos Nº 5.670.488; la publicación PCT
Nº WO96/33280, publicada el 24 de octubre de 1996; la publicación
PCT Nº WO96/40955, publicada el 19 de diciembre de 1996; la
publicación PCT Nº WO97/25446, publicada el 19 de julio de 1997; la
publicación PCT Nº WO95/29993, publicada el 9 de noviembre de 1995;
la publicación PCT Nº WO97/00326, publicada el 3 de enero de 1997;
Morral et al., Hum. Gene Ther.
10:2709-2716,1998. Dichos PAV, que pueden alojar
hasta aproximadamente 36 kb de ácidos nucleico foráneo, son
ventajosos porque la capacidad de carga del vector está optimizada,
mientras que se reduce el potencia de respuestas inmunes del
hospedador contra el vector o la generación de virus competentes
para la replicación. Los vectores PAV contienen las secuencias de
nucleótidos de la repetición terminal invertida (ITR) 5' y la ITR 3'
que contienen el origen de replicación, y la secuencia de
nucleótidos de acción cis necesaria para el empaquetado del
genoma del PAV, y pueden alojar uno o más transgenes con elementos
reguladores apropiados, por ejemplo, promotor, potenciadores,
etc.
Otros, los vectores adenovirales parcialmente
eliminados proporcionan un vector adenoviral parcialmente eliminado
(llamado "DeAd") en el que la mayoría de los genes tempranos
adenovirales necesarios para la replicación del virus se eliminan
del vector y se colocan dentro del cromosoma de una célula
productora bajo el control de un promotor condicional. Los genes
adenovirales que se pueden eliminar que se pueden colocar en la
célula productora pueden incluir E1A/E1B, E2, E4 (solamente ORF6 y
ORF6/7 tienen que colocarse en la célula), pIX y pIVa2. También
puede eliminarse E3 del vector, pero como no es necesario para la
producción del vector, puede omitirse de la célula productora. Los
genes tardíos adenovirales, normalmente bajo el control del promotor
tardío principal (MLP), están presentes en el vector, pero el MLP
puede remplazarse por un promotor condicional.
Los promotores condicionales adecuados para su
uso en vectores DeAd y líneas celulares productoras incluyen
aquellos con las siguientes características: baja expresión basal en
estado no inducido, de modo que no se expresen genes adenovirales
citotóxicos o citostáticos a niveles dañinos para la célula; y
expresión de elevado nivel en estado inducido, de modo que se
produzcan suficientes cantidades de proteínas virales para soportar
la replicación y ensamblaje del vector. Los promotores condicionales
preferidos adecuados para su uso en vectores DeAd y líneas
celulares productoras incluyen el sistema de control génico del
dimerizador, basado en los agentes inmunosupresores FK506 y
rapamicina, el sistema de control génico de la ecdisona y el sistema
de control génico de la tetraciclina. También puede ser útil en la
presente descripción, incluyendo la presente invención, la
tecnología GeneSwitch^{TM} (Valentis, Inc., Woodlands, TX)
descrita en Abruzzese et al., Hum. Gene Ther. 1999
10:1499-507. El sistema de expresión adenoviral
parcialmente eliminado se describe adicionalmente en el documento
WO99/57296.
El virus adeno-asociado (AAV) es
un parvovirus ADN humano de cadena sencilla cuyo genoma tiene un
tamaño de 4,6 kb. El genoma del AAV contiene dos genes principales:
el gen rep, que codifica las proteínas rep (Rep 78, Rep 68, Rep 52,
y Rep 40) y que están implicadas en la replicación, rescate,
transcripción e integración de AAV; y el gen cap que codifica las
proteínas cap que forman la partícula viral AAV. El AAV obtiene su
de su dependencia en un adenovirus u otro virus auxiliar (por
ejemplo, herpesvirus) para suministrar los productos génicos
esenciales que permitan que el AAV experimente una infección
productiva, es decir, se reproduzca por sí mismo en la célula
hospedadora. En ausencia del virus auxiliar, el AAV se integra en
forma de un provirus en el cromosoma de la célula hospedadora,
hasta que se ve rescatado por superinfección de la célula
hospedadora con un virus auxiliar, habitualmente un adenovirus
(Muzyczka, Curr. Top. Micor. Immunol.
158:97-127, 1992).
El interés en AAV como vector de transferencia
génica está provocado por varias características de su biología. En
ambos extremos del genoma de AAV hay una secuencia de nucleótidos
conocida como repetición terminal invertida (ITR), que contiene las
secuencias de nucleótidos de acción cis necesarias para la
replicación, rescate, empaquetado e integración del virus. La
función de integración de la ITR mediada por la proteína rep en
trans permite que el genoma de AAV se integre en un
cromosoma celular después de la infección, en ausencia de virus
auxiliar. Esta propiedad única del virus tiene relevancia para el
uso de AAV en transferencia de genes, ya que permite la integración
de un AAV recombinante que contenga un gen de interés en el genoma
celular. Por lo tanto, puede conseguirse la transformación genética
estable, ideal para muchos de los objetivos de la transferencia de
genes, mediante el uso de vectores rAAV. Además, el sitio de
integración para el AAV está bien establecido y se ha localizado en
el cromosoma 19 del ser humano (Kotin et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 87:2211-2215, 1990). Esta predecibilidad
del sitio de integración reduce el peligro de acontecimientos de
inserción aleatoria en el genoma celular que pueden activar o
inactivar genes del hospedador o interrumpir las secuencias
codificantes, consecuencias que pueden limitar el uso de vectores
con integración de AAV, la eliminación de este gen en el diseño de
vectores rAAV puede provocar patrones de integración alterados que
se han observado con vectores rAAV (Ponnazhagan et al., Hum Gene
Ther. 8:275-284, 1997).
Hay otras ventajas al uso de AAV para la
transferencia de genes. El rango de hospedador de los AAV es amplio.
Además, a diferencia de los retrovirus, los AAV pueden infectar
células tanto quiescentes como en división. Además, los AAV no se
han asociado con enfermedad humana, obviando muchas de las
preocupaciones de han surgido con los vectores de transferencia de
genes derivados de retrovirus.
Los enfoques convencionales a la generación de
vectores rAAV recombinantes ha requerido la coordinación de una
serie de acontecimientos intracelulares: la transfección de la
célula hospedadora con un genoma de vector rAAV que contenga un
transgén de interés flanqueado por las secuencias ITR de AAV, la
transfección de la célula hospedadora por un plásmido que codifique
los genes para las proteínas rep y cap de AAV que son necesarias en
trans, y la infección de la célula transfectada con un virus
auxiliar para suministrar las funciones auxiliares no AAV
necesarias en trans (Muzyczka, N., Curr. Top. Micor.
Immunol. 158:97-129, 1992). Las proteínas
adenovirales (u otros virus auxiliares) activan la transcripción del
gen rep de AAV, y las proteínas rep después pueden activar la
transcripción de los genes cap de AAV. Las proteínas cap después
utilizan las secuencias ITR para empaquetar el genoma del rAAV en
una partícula viral rAAV. Por lo tanto, la eficacia del empaquetado
está determinada, en parte, por la disponibilidad de cantidades
adecuadas de las proteínas estructurales, así como la accesibilidad
de cualquier secuencia de empaquetado de acción cis
necesarias en el genoma del vector rAAV.
Los vectores retrovirales son una herramienta
común para el suministro de genes (Miller, Nature (1992)
357:455-460). La capacidad de los vectores
retrovirales de suministrar una única copia no ordenada del gen en
un amplio intervalo de células somáticas de roedores, primates y
seres humanos hace a los vectores retrovirales muy adecuados para
transferir genes a una célula.
Los retrovirus son virus ARN en los que el
genoma viral es ARN. Cuando se infecta una célula hospedadora con
un retrovirus, el ARN genómico se transcribe de forma inversa en un
intermedio de ADN que se integra de forma muy eficaz en el ADN
cromosómico de las células infectadas. Este intermedio de ADN
integrado se conoce como provirus. La transcripción del provirus y
su ensamblaje en virus infecciosos sucede en presencia de un virus
auxiliar apropiado o en una línea celular que contenga secuencias
apropiadas que posibiliten la encapsidación sin producción
simultánea de un virus auxiliar contaminante. No es necesario un
virus auxiliar para la producción de retrovirus recombinante si se
proporcionan las secuencias para la encapsidación por
co-transfección con vectores apropiados.
El genoma retroviral y el ADN pro viral tienen
tres genes: el gag, el pol, y el env, que están flanqueados por dos
secuencias de repetición terminal larga (LTR). El gen gag codifica
las proteínas estructurales internas (matriz, cápsida, y
nucleocápsida); el gen pol codifica la ADN polimerasa dirigida por
ARN (transcriptasa inversa) y el gen env codifica las
glucoproteínas de la envuelta viral. Las LTR 5' y 3' sirven para
promover la transcripción y la poliadenilación de los ARN de los
viriones. La LTR contiene todas las demás secuencias de acción
cis necesarias para la replicación viral. Los lentivirus
tienen genes adicionales que incluyen vit, vpr, tat, rev, vpu, nef,
y vpx (en VIH-1, VIH-2 y/o
VIS).Adyacentes a la LTR 5' hay secuencias necesarias para la
transcripción inversa del genoma (el sitio de unión del ARNt
cebador) y para la encapsidación eficaz del ARN viral en partículas
(el sitio Psi). Si las secuencias necesarias para la encapsidación
(o empaquetado del ARN retroviral en viriones infecciosos) están
ausentes en el genoma viral, el resultado es un defecto en
cis que evita la encapsidación del ARN genómico. Sin embargo,
el mutante resultante aún es capaz de dirigir la síntesis de todas
las proteínas del virión.
Los lentivirus son retrovirus complejos que,
además de los genes retrovirales comunes gag, pol y env, contienen
otros genes con función reguladora o estructural. La mayor
complejidad posibilita que los lentivirus modulen el ciclo vital de
los mismos, como en el transcurso de la infección latente. Un
lentivirus típico es el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH),
el agente etiológico del SIDA. In vivo, el VIH puede infectar
células diferenciadas de forma terminal que raramente se dividen,
tales como linfocitos y macrófagos. In vitro, el VIH puede
infectar cultivos primarios de macrófagos derivados de monocitos
(MDM) así como células HeLa-Cd4 o linfoides T
detenidas en el ciclo celular por tratamiento con afidicolina o
irradiación gamma. La infección de las células depende del aporte
nuclear activo de complejos de preintegración de VIH a través de los
poros nucleares de las células diana. Eso sucede por la interacción
de múltiples determinantes moleculares parcialmente redundantes en
el complejo con la maquinaria de importación nuclear de la célula
diana. Los determinantes identificados incluyen una señal de
localización nuclear funcional (NLS) en la proteína de matriz gag
(MA), la proteína asociada a viriones cariófila, vpr, y un resto de
fosfotirosina C-terminal en la proteína MA gag. El
uso de retrovirus para terapia génica se describe, por ejemplo, en
la patente de Estados Unidos 6.013.516; y la patente de Estados
Unidos 5.994.136.
Otros métodos para suministrar ADN a las células
no usan virus para el suministro. Por ejemplo, pueden usarse
compuestos anfífilos catiónicos para suministrar el ácido nucleico
de la presente descripción, por ejemplo, el ácido nucleico de la
presente invención. Como los compuestos diseñados para facilitar el
suministro intracelular de moléculas biológicamente activas deben
interaccionar con entornos tanto no polares como polares (en o
sobre, por ejemplo, la membrana plasmática, fluidos tisulares,
compartimentos dentro de la célula, y la propia molécula
biológicamente activa), dichos compuestos se diseñan típicamente
para que contengan dominios tanto polares como no polares. Los
compuestos que tiene estos dos dominios pueden llamarse anfífilos, y
muchos lípidos y lípidos sintéticos que se han descrito para su uso
en la facilitación de dicho suministro intracelular (sean para
aplicación in vitro o in vivo) cumplen esta
definición. Una clase particularmente importante de dichos
anfífilos es los anfífilos catiónicos. En general, los anfífilos
catiónicos tienen grupos polares que son capaces de cargarse
positivamente en o aproximadamente a pH fisiológico, y esta
propiedad se entiende que es importante en la técnica para definir
cómo interaccionan los anfífilos con los muchos tipos de moléculas
biológicamente activas (terapéuticas) incluyendo, por ejemplo,
polinucleótidos cargados negativamente tales como ADN.
El uso de composiciones que comprenden
compuestos anfífilos catiónicos para el suministro de genes se
describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 5.049.386;
el documento US 5.279.833; el documento US 5.650.096; el documento
US 5.747.471; el documento US 5.767.099; el documento US 5.910.487;
el documento US 5.719.131; el documento US 5.840.710; el documento
US 5.783.565; el documento US 5.925.628; el documento US 5.912.239;
el documento US 5.942.634; el documento US 5.948.925; el documento
US 6.022.874; el documento U.S. 5.994.317; el documento U.S.
5.861.397; el documento U.S. 5.952.916; el documento U.S. 5.948.767;
el documento U.S. 5.939.401; y el documento U.S. 5.935.936.
Además, el ácido nucleico de la presente
descripción, por ejemplo, el ácido nucleico de la presente invención
puede suministrarse usando "ADN desnudo". Los métodos para
suministrar una secuencia de ADN no integrante, no infecciosa que
codifica un polipéptido o péptido deseado unida de forma funcional a
un promotor, libre de asociación con proteínas que faciliten la
transfección, partículas virales, formulaciones liposomales,
lípidos cargados y agentes de precipitación de fosfato cálcico se
describen en la patente de Estados Unidos 5.580.859; el documento
U.S. 5.963.622; el documento U.S. 5.910.488.
También se ha informado de sistemas de
transferencia de genes que combinan componentes virales y no
virales. Cristiano et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90:11548; Wu et al. (1994) J. Biol. Chem.
269:11542; Wagner et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89:6099; Yoshimura et al. (1993) J. Biol.
Chem. 268:2300; Curiel et al. (1991) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88:8850; Kupfer et al. (1994) Human Gene
Ther. 5:1437; y Gottschalk et al. (1994) Gene
Ther. 1:185. En la mayoría de los casos, se han incorporado
adenovirus en los sistemas de suministro de genes para sacar
provecho de sus propiedades endosomolíticas. Las combinaciones
presentadas de componentes virales y no virales generalmente
implican unión covalente del adenovirus a un complejo de suministro
de genes o co-internalización de adenovirus no
unido con complejos de lípido catiónico:ADN.
Para el suministro de ADN y proteína al ojo, la
administración típicamente será local. Esto tiene la ventaja de
limitar la cantidad de ADN que tiene que administrar y de limitar
los efectos secundarios sistémicos. Pueden usarse muchos modos
posibles de suministro incluyendo, aunque sin limitación:
administración tópica sobre la córnea por una pistola génica;
inyección subconjuntival, inyección intracameral, mediante gotas
oculares a la córnea, inyección al interior de la cámara anterior
mediante el limbo temporal, inyección intraestromal, aplicación a
la córnea combinada con pulsos eléctricos, inyección intracorneana,
inyección subretiniana, inyección intravitreal, e inyección
intraocular. Como alternativa, pueden transfectarse o transducirse
células ex vivo y suministrarse por implante intraocular.
Véase, Auricchio, Mol. Ther. 6: 490-494,
2002; Bennett, Nature Med. 2: 649-654, 1996;
Borrás, Experimental Eye Research 76:
643-652, 2003; Chaum, Survey of Ophtalmology
47: 449-469, 2002; Campochiaro, Expert
Opinions in Biological Therapy 2: 537-544
(2002); Lai, Gene Therapy 9: 804 813, 2002; Pleyer,
Progress in Retinal and Eye Research, 22:
277-293, 2003.
Pueden ensayarse los efectos de diversos agentes
terapéuticos y administraciones propuestas en modelos animales
adecuados para enfermedades particulares. Por ejemplo, la
retinopatía del prematuro puede ensayarse en un modelo de
retinopatía inducida por oxígeno en ratones como se describe en
Smith, Investigative Ophtalmology & Visual Science, 35:
101-111, 1994. Puede usarse neovascularización
coroidal inducida por láser en ratones como modelo para
neovascularización coroidal humana (CNV) que sucede en enfermedades
tales como degeneración macular relacionada con la edad. Tobe,
American Journal of Pathology 153: 1641-1646,
1998. Se han desarrollado otros modelos de CNV en primates, ratas,
cerdos enanos, y conejos. Se han desarrollado modelos de ratón de
degeneración macular relacionada con la edad en ratones
genéticamente deficientes. Los ratones deficientes en la
proteína-1 quimioatrayente de monocitos o el
receptor-2 de quimioquina C-C
desarrollan características de degeneración macular relacionada con
la edad. Ambati, Nature Med. 9: 1390-1397,
2003.
Aunque la invención se ha descrito con respecto
a ejemplos específicos incluyendo los modos actualmente preferidos
de realizar la invención, los especialistas en la técnica apreciarán
que existen numerosas variaciones y permutaciones de los sistemas y
técnicas descritas anteriormente que están dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generaron dos construcciones: la primera,
D2-9Gly-Fc, que contenía un
enlazador de 9 unidades de poliglicina (9Gly) y la segundo,
D2-Fc, con la misma secuencia excepto el enlazador
9Gly (Fig. 1).
Se analizaron las secuencias de aminoácidos de
las proteínas D2-9Gly-Fc y
D2-Fc usando el Protein Analysis Toolbox del
programa de análisis de secuencias Mac Vector 6.5.1. (IBI, New
Haven, CT). El enlazador de 9 unidades de poliglicina en la
secuencia de D2-9Gly-Fc se
identificó como una región con mayor flexibilidad promedio por el
método de predicción de flexibilidad de Karpus y Schultz (1985)
Naturwiss, 72: 212-213. No se detectó dicha
región en la secuencia de D2-Fc (Fig. 1).
Se ensayó un dominio tipo Ig 2
Flt-1 conectado a la región Fc de IgG1 por un
enlazador de 9 unidades de poliglicina
(D2-9Gly-Fc) flexible. La proteína
de fusión D2-9Gly-Fc es capaz de
unirse de forma eficaz a VEGF y de inhibir la proliferación de
células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) dependiente de
VEGF. Véase la Fig. 2. En contraste, cuando se une el dominio tipo
Ig 2 Flt-1 directamente a la cadena pesada de IgG1
(Fc) para formar D2-Fc, se observó una unión
solamente mínima a VEGF. Véase la Fig. 2. Tanto la dimerización
mediante el Fc de IgG1 como la inserción de un enlazador flexible
parecen facilitar la unión de VEGF al dominio 2 de
Flt-1. Se confirmó la presencia de formas diméricas
tanto en D2-9Gly-Fc como en
D2-Fc por análisis de transferencia de Western.
Véase la Fig. 3.
Se administra una inyección intravitreal de
vector AAV (de 1 x 10^{8} a 1 x 10^{9} partículas en un volumen
de 0,0005 ml) a ratones C57BL/6 recién nacidos (P0) o de 1 día de
edad (P1). Se induce neovascularización retiniana (NV) en los
ratones C57BL/6 exponiendo crías P7 y sus hembras de lactación a
hiperoxia durante 5 días. Las crías se devolvieron a aire ambiental
en P12 y se sacrificaron en P17 (momento del pico de NV). (Smith
LEH, Weslowski E, McLellan A, Kostyk SK, D'Amato R, Sullivan y
D'Amore PA. Oxygen-Induced Retinopathy in the
Mouse. Invest Opth Vis Sci. 1994;
35:101-111.) Se seccionaron de forma transversal en
serie ojos completos impregnados en parafina a intervalos de 5
micrómetros. El grado de NV se determina contando la cantidad de
núcleos de células endoteliales internos a la membrana de limitación
interna en secciones tomadas cada 100 micrómetros.
Se comparan cohortes de animales tratados con
los vectores AAV que codifican los agentes
anti-angiogénicos con cohortes tratadas con
vectores que codifican transgenes irrelevantes o con vectores que no
codifican un transgén. La cantidad promedio de núcleos de células
endoteliales en cada ojo tratado se compara con el ojo similar no
tratado de cada animal.
Se ha demostrado que el dominio 2 de
Flt-1 es esencial para la unión de VEGF_{165}. Sin
embargo, se demostró que el dominio 2 de Flt-1 solo
era incapaz de unirse a VEGF A. (Davis-Smyth et
al., 1996.) VEGF A, cuando está presente en forma de dímero, se
une a Flt-1 a través de restos ácidos (aminoácidos
63-67 de la proteína madura) que permite un posible
mecanismo para la dimerización inducida por ligando del receptor
(Keyt et al, 1996).
Por lo tanto, se usó una dimerización del
dominio 2 de Flt-1 como estrategia para restaurar la
unión del dominio 2 de Flt-1 a VEGF A. Puede usarse
la fusión con un fragmento de la cadena pesada de IgG para la
dimerización de proteínas (Davis-Smyth et
al., 1996). Aquí se demuestra que los aminoácidos
75-88 (es decir, PSCVPLMRCGGCCN; SEC ID Nº 13) de
VEGF A (SEC ID Nº 12) aumentan la actividad biológica de las
proteínas híbridas sFlt-1.
Inicialmente, se diseñaron tres proteínas
híbridas: D2-9Gly-Fc,
D2-Fc y
D2-9Gly-Ex3/CH3 (Fig. 4). Las tres
proteínas híbridas contienen el mismo dominio D2 de
Flt-1 que
D2-9Gly-Fc. No se observó unión de
VEGF con D2-Fc, que no contiene el enlazador de 9
unidades de poliglicina (9Gly). La tercera proteína,
D2-9Gly-Ex3/CH3, contiene el
enlazador de 9 unidades de poliglicina (9Gly) y el dominio de
multimerización de VEGF (aminoácidos PSCVPLMRCGGCCN; SEC ID Nº 13;
VEGF Ex3), pero también contiene la región CH3 de Fc de cadena
pesada de IgG1 humana (aminoácidos 371-477 de la
SEC ID Nº 10).
La proteína D2-Fc no mostró
actividad inhibidora eficaz en el ensayo de proliferación de HUVEC
(Fig. 5) y por implicación no se unía a VEGF_{165} de forma
eficaz. Sin embargo, la tercera proteína híbrida,
D2-9Gly-Ex3/CH3, que comprende el
dominio 2 de Flt-1 fusionado con la región CH3
mediante tanto el enlazador 9Gly como la región de dimerización de
VEGF_{165} (Ex3), mostraba actividad inhibidora en un ensayo de
proliferación de HUVEC dependiente de VEGF (Fig. 5). Esto implica
que esta proteína híbrida se une a VEGF_{165} de forma eficaz.
El uso de varios enlazadores de poliglicina se
ha descrito previamente para la mejora de las características
proteicas (Mouz et al., 1996; Qiu et al., 1998). Para
la siguiente construcción se ha usado otro tipo de enlazador, el
oligómero de 15 unidades
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3
(Huston et al., 1988). Se generó la proteína
D2-(Gly_{4}Ser)_{3}-Fc y contiene el
dominio 2 de Flt-1, el enlazador
(Gly_{4}Ser)_{3} y la región Fc de la cadena pesada de
IgG1 humana.
D2-(Gly_{4}Ser)_{3}-Fc
se caracterizó adicionalmente en un ensayo de proliferación de
HUVEC. La actividad biológica de
D2-(Gly_{4}Ser)_{3}-Fc medida por la
inhibición de la proliferación de HUVEC fue similar a la de
D2-9Gly-Fc y
D2-9Gly-Ex3/CH3 (Fig. 6).
La construcción
D2-(Gly4Ser)_{3}-Fc se caracterizó
adicionalmente por transferencia de Western y se comparó con
D2-9Gly-Fc (Fig. 9). Ambas
construcciones están presentes principalmente en una forma dimérica
y se detectaron formas monoméricas después de la separación de
muestras reducidas.
Para investigar el papel del enlazador 9Gly o la
secuencia de dimerización de VEGF Ex3 sobre la unión del receptor
soluble VEGF, se generaron otras tres construcciones:
D2-9Gly-CH3, D2-CH3
y D2-Ex3/CH3 (Fig. 8). Las tres construcciones se
generaron y como todas las construcciones previas también se
pusieron bajo el control del promotor CMV. Su actividad de bloqueo
de VEGF se ensayó en el ensayo de proliferación de HUVEC (Fig.
9).
El ensayo de proliferación de HUVEC de proteínas
que contienen la región CH3 de IgG1 ha demostrado que
D2-9Gly-CH3 (sin Ex3) y la proteína
D2-Ex3/CH3 (sin enlazador 9Gly) tenían potencia de
bloqueo de VEGF similar en comparación con la proteína
D2-9Gly-Ex3/CH3 parental. Sin
embargo, parece que la proteína D2-CH3 es el
inhibidor más débil de VEGF entre todas ellas (Fig. 9).
Los datos de ELISA de Flt-1 de
medios condiciones de células 293 transfectadas tienen niveles de
Flt-1 similares para
D2-9Gly-Ex3/CH3,
D2-9Gly-CH3 y
D2-Ex3/CH3 y D2-CH3
(70-90 ng/ml) y un poco mayores (\sim150 ng/ml)
para la forma menos activa de D2-CH3. La
transferencia de Western de las construcciones
D2-9Gly-CH3 y D2-CH3
(Fig. 10) demuestra un predominio de formas diméricas en
condiciones no reducidas.
El ensayo de unión de VEGF permite comparar las
afinidades de unión relativas a VEGF de estos receptores de VEGF
solubles en un sistema libre de células.
En resumen, se diluyeron en serie medios
condicionados que contenían concentraciones conocidas de receptor
soluble (que variaban en las concentraciones de 0,29 - 150 pM) y se
mezclaron con VEGF 10 pM. La cantidad de VEGF no unido se midió
después por ELISA. D2-9Gly-Fc se une
a VEGF con mayor afinidad en las concentraciones de receptor de
0,001 a \sim0,2 pM que todas las demás construcciones.
D2-CH3 tiene la afinidad más baja para unirse a
VEGF (Fig. 11).
Davis-Smyth, et
al., EMBO J., 15, 1996, 4919
Huston, J. S., et al.
(1991) Methods Enzymol. 203,
46-88
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Protein Eng., 10, 1
Qiu, H., et al. (1998)
J. Biol. Chem. 273: 11173-11176.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Tabla de
secuencias
<110> Scaria, Abraham
\hskip1cm Pechan, Meter
\hskip1cm Wadsworth, Samuel
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<120> CONSTRUCCIONES MULTIMÉRICAS
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<130> 003482.00025
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/658209
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<151>
04-03-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/608887
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
13-09-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 1077
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 358
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 1050
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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<210> 5
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<211> 426
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 744
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1434
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 477
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 648
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 215
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5777
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (235)...(336)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> dominio 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5830
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1356
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 675
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 224
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 717
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 702
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1095
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína de fusión recombinante o
secuencia que codifica la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> enlazador de proteína de fusión
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> resto enlazador para proteínas de
fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> resto enlazador para proteínas de
fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm43
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> resto enlazador para proteínas de
fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm44
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> resto enlazador para proteínas de
fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> resto enlazador para proteínas de
fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> resto enlazador para proteínas de
fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm47
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> resto enlazador para proteínas de
fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> resto enlazador para proteínas de
fusión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm49
Claims (57)
1. Una proteína de fusión de fórmula
X-Y-Z, en la que:
X comprende el dominio tipo Ig 2 de
VEGF-R1 pero carece de los dominios tipo Ig 1 y 3 de
VEGF-R1, estando dicho dominio tipo Ig 2 de
VEGF-R1 unido covalentemente al resto Z mediante el
resto Y;
Y consta de un polipéptido de
5-25 restos aminoacídicos; y
Z es una región CH3 de una molécula de cadena
pesada de IgG o una parte Fc de una molécula de anticuerpo.
2. La proteína de fusión de la reivindicación 1,
en la que X es el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1
(FLT-1).
3. La proteína de fusión de la reivindicación 1,
en la que el polipéptido Y es flexible.
4. La proteína de fusión de la reivindicación 1,
en la que el polipéptido Y se selecciona entre el grupo compuesto
por gly_{9} (SEC ID Nº 27), glu_{9} (SEC ID Nº 28), ser_{9}
(SEC ID Nº 29), gly_{5}cyspro_{2}cys (SEC ID Nº 30),
(gly_{4}ser)_{3} (SEC ID Nº 31),
SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº 32), Pro Ser Cys
Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn (SEC ID Nº 13),
Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys
(SEC ID Nº 26), y
Gly_{9}ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº
34).
5. La proteína de fusión de la reivindicación 1,
en la que Z es una región CH3 de IgG1.
6. La proteína de fusión de la reivindicación 1,
en la que Z es una región CH3 de IgG2.
7. La proteína de fusión de la reivindicación 1,
en la que el Fc es un Fc de IgG.
8. La proteína de fusión de la reivindicación 7,
en la que el Fc de IgG es Fc de IgG1.
9. Una composición que comprende la proteína de
fusión de cualquier reivindicación precedente, que comprende
adicionalmente uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente
aceptables.
10. La composición de la reivindicación 9, donde
dicha composición es una formulación líquida.
11. La composición de la reivindicación 9, donde
dicha composición es una formulación liofilizada.
12. Una composición que comprende una o más
proteínas de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones
1-8, donde dicha composición comprende multímeros de
dichas proteínas de fusión.
13. La composición de la reivindicación 12,
donde dicha composición consta esencialmente de una única especie
de proteína de fusión que forma homomultímeros.
14. La composición de la reivindicación 12,
donde dicha composición consta esencialmente de proteínas de fusión,
en las que el resto X en dichas proteínas de fusión en la
composición es heterogéneo.
15. La composición de la reivindicación 12, que
comprende adicionalmente uno o más excipientes o vehículos
farmacéuticamente aceptables.
16. La composición de la reivindicación 15,
donde dicha composición es una formulación líquida.
17. La composición de la reivindicación 15,
donde dicha composición es una formulación liofilizada.
18. Un método para multimerizar un polipéptido
X, comprendiendo el método:
unir un polipéptido X a un polipéptido Z
mediante un polipéptido Y para formar el polipéptido XYZ, en el
que:
X comprende el dominio tipo Ig 2 de
VEGF-R1 pero carece de los dominios tipo Ig 1 y 3 de
VEGF-R1, estando dicho dominio tipo Ig 2 de
VEGF-R1 unido covalentemente al polipéptido Z
mediante el polipéptido Y;
Y consta de un polipéptido de
5-25 restos aminoacídicos; y
Z es una región CH3 de una molécula de cadena
pesada de IgG o una parte Fc de una molécula de anticuerpo; por lo
cual el polipéptido XYZ multimeriza.
19. El método de la reivindicación 18, en el que
la etapa de unión comprende construir una molécula de ácido
nucleico que codifica cada uno de X, Y, y Z en forma de una única
fase de lectura abierta, en el que dicho polipéptido XYZ se expresa
a partir de la construcción de ácido nucleico en una célula
hospedadora.
20. El método de la reivindicación 18, en el que
X es el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1
(Flt-1).
21. Una molécula de ácido nucleico que codifica
una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1.
22. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo
con la reivindicación 21, en la que Z es una parte Fc de una
molécula de anticuerpo.
23. El ácido nucleico de la reivindicación 21 ó
22, en el que X es el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1
(Flt-1).
24. El ácido nucleico de la reivindicación 23,
en el que la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada
entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 8, 21, y 23.
25. El ácido nucleico de la reivindicación 23,
en el que la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada
entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2 y 25.
26. La proteína de fusión de la reivindicación
1, en la que X es dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1
(Flt-1) y la proteína de fusión comprende una
secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 8,
21, y 23.
27. La proteína de fusión de la reivindicación
1, en la que X es el dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1
(Flt-1) y la proteína de fusión comprende una
secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2
y 25.
28. Una célula de mamífero que comprende el
ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones
21-25.
29. La célula de mamífero de la reivindicación
28 que es una célula humana.
30. La célula de mamífero de la reivindicación
29 que se selecciona entre el grupo compuesto por un fibroblasto,
un hepatocito, una célula endotelial, un queratinocito, una célula
hematopoyética, un sinoviocito, una célula epitelial, una célula
retiniana, y una célula madre.
31. Un método in vitro que comprende:
suministrar el ácido nucleico de una cualquiera
de las reivindicaciones 21-25 a una célula de
mamífero aislada para formar una célula que exprese dicha proteína
de fusión.
32. El método de la reivindicación 31, en el que
la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el
grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.
33. El método de la reivindicación 31 ó 32 que
comprende adicionalmente:
usar la célula que expresa dicha proteína de
fusión para la fabricación de una composición para su suministro a
un mamífero.
34. La célula de mamífero de una cualquiera de
las reivindicaciones 28-30, para su uso en el
tratamiento de un mamífero.
35. El ácido nucleico de una cualquiera de las
reivindicaciones 21-25, para su uso en el
tratamiento de un mamífero, por lo cual dicha proteína de fusión se
expresa en el mamífero.
36. El ácido nucleico de la reivindicación 35,
en el que la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada
entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.
37. La célula de mamífero de la reivindicación
34, o el ácido nucleico de la reivindicación 35, donde el mamífero
tiene degeneración macular relacionada con la edad húmeda o
retinopatía diabética proliferativa.
38. La célula de mamífero de la reivindicación
34, o el ácido nucleico de la reivindicación 35, donde el mamífero
tiene cáncer.
39. La célula de mamífero de la reivindicación
34, o el ácido nucleico de la reivindicación 35, donde el mamífero
tiene artritis reumatoide.
40. La célula de mamífero de la reivindicación
34, o el ácido nucleico de la reivindicación 35, donde el mamífero
tiene asma.
41. La célula de mamífero de la reivindicación
34, o el ácido nucleico de la reivindicación 35, donde el mamífero
tiene osteoartritis.
42. La proteína de fusión de una cualquiera de
las reivindicaciones 1-8, para su uso en el
tratamiento de un mamífero.
43. La proteína de fusión de la reivindicación
42, donde el mamífero tiene degeneración macular relacionada con la
edad húmeda o retinopatía diabética proliferativa.
44. La proteína de fusión de la reivindicación
42, donde el mamífero tiene cáncer.
45. La proteína de fusión de la reivindicación
42, donde el mamífero tiene artritis reumatoide.
46. La proteína de fusión de la reivindicación
42, donde el mamífero tiene asma.
47. La proteína de fusión de la reivindicación
42, donde el mamífero tiene osteoartritis.
48. La proteína de fusión de la reivindicación
42, donde la proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada
entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.
49. Un vector que comprende el ácido nucleico de
una cualquiera de las reivindicaciones 21-25.
50. El vector de la reivindicación 49, donde el
vector es un vector viral que se selecciona entre el grupo
compuesto por un vector adenoviral, un vector viral
adeno-asociado, un vector retroviral, y un vector
lentiviral.
51. El vector de la reivindicación 50, donde el
vector es un vector viral adeno-asociado.
52. El vector de una cualquiera de las
reivindicaciones 49-51, para su uso en el
tratamiento de un mamífero.
53. El vector de la reivindicación 52, donde el
mamífero tiene degeneración macular relacionada con la edad húmeda
o retinopatía diabética proliferativa.
54. El vector de la reivindicación 52, donde el
mamífero tiene cáncer.
55. El vector de la reivindicación 52, donde el
mamífero tiene artritis reumatoide.
56. El vector de la reivindicación 52, donde el
mamífero tiene asma.
57. El vector de la reivindicación 52, donde el
mamífero tiene osteoartritis.
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