ES2347525T3 - Polinucleotidos inmunomoduladores y metodos para usuarios. - Google Patents

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Abstract

Un polinucleótido inmunomodulador que tiene menos de 50 bases o pa- res de bases y que comprende una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 132.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a polinucleótidos inmunomoduladores que comprenden una secuencia inmunoestimuladora de oligonucleótidos (ISS). También se refiere a la administración de los polinucleótidos para modular una respuesta inmune.
TÉCNICA ANTERIOR
El tipo de respuesta inmune generada frente a la infección u otro estímulo antigénico se puede distinguir generalmente por el subgrupo de linfocitos T cooperadores (Th) implicados en la respuesta. El subgrupo Th1 es responsable de las funciones clásicas mediadas por células, tales como la hipersensibilidad de tipo retardado y la activación de los linfocitos T citotóxicos (CTLs), mientras que las funciones del subgrupo Th2 son más eficaces como ayudantes para la activación de los linfocitos B. El tipo de respuesta inmune frente a un antígeno está influido generalmente por las citocinas producidas por las células que responden al antígeno. Las diferencias en las citocinas secretadas por los linfocitos Th1 y Th2 se cree que reflejan diferentes funciones biológicas de estos dos subgrupos. Véase, por ejemplo, Romagnani (2000) Ann. Allergy Asthma Immunol. 85:9-18.
El subgrupo Th1 puede ser particularmente adecuado para responder a las infecciones víricas, a los agentes patógenos intracelulares y a las células tumorales porque secreta IL-2 e IFN-�, los cuales activan los CTLs. El subgrupo Th2 puede ser más adecuado para responder a las bacterias que viven de forma libre y a los parásitos helmínticos y puede mediar en reacciones alérgicas, ya que la IL-4 y la IL-5 son conocidas por inducir la producción de IgE y la activación de eosinófilos, respectivamente. En general los linfocitos Th1 y Th2 secretan patrones característicos de citocinas y de este modo, un tipo de respuesta puede moderar la actividad del otro tipo de respuesta. Un desplazamiento en el equilibrio de Th1/Th2 puede dar como resultado, por ejemplo, una respuesta alérgica o, alternativamente, una respuesta incrementada de los CTL.
En numerosas enfermedades infecciosas, tales como la tuberculosis y la malaria, las respuestas de tipo Th2 tienen poco valor protector contra la infección. Las vacunas propuestas que emplean pequeños péptidos obtenidos a partir del antígeno diana y de otros agentes antigénicos utilizados generalmente que evitan el uso de partículas víricas intactas, potencialmente infecciosas, no provocan siempre la respuesta inmune necesaria para conseguir un efecto terapéutico. La falta de una vacuna terapéuticamente eficaz contra el virus de la inmunodeficiencia adquirida humana (VIH), es un ejemplo desafortunado de este fracaso. Las vacunas basadas en proteínas inducen típicamente respuestas inmunes de tipo Th2, caracterizadas por títulos elevados de anticuerpos neutralizantes, pero sin una inmunidad significativa mediada por células.
Por otra parte, algunos tipos de respuestas de anticuerpos son inadecuadas en determinadas indicaciones, más particularmente en la alergia, en donde una respuesta de los anticuerpos IgE puede dar como resultado un choque anafiláctico. Generalmente, las respuestas alérgicas también implican respuestas inmunes de tipo Th2. Las respuestas alérgicas, que incluyen las del asma alérgica, se caracterizan por una respuesta de fase temprana, que tiene lugar unos segundos o minutos después de la exposición al alérgeno y se caracterizan por una desgranulación celular, y una respuesta de fase tardía que tiene lugar de 4 a 24 horas después y se caracteriza por la infiltración de eosinófilos en el sitio de exposición al alérgeno. Específicamente, durante la fase temprana de la respuesta alérgica, el alérgeno se reticula con los anticuerpos IgE sobre células basófilas y mastocitos, que a su vez desencadenan la desgranulación y la liberación posterior de histamina y de otros mediadores de la inflamación, desde los mastocitos y las células basófilas. Durante la respuesta de fase tardía, los eosinófilos se infiltran en el sitio de exposición al alérgeno (en donde se produce una lesión del tejido y como resultado una disfunción).
La inmunoterapia con antígenos para los trastornos alérgicos implica la inyección subcutánea de pequeñas cantidades, pero gradualmente crecientes, de antígeno. Tales tratamientos de inmunización presentan el riesgo de inducir anafilaxis mediada con IgE y no dirigir con eficacia los eventos mediados con citocina de la respuesta alérgica de fase tardía. Hasta el momento, este enfoque solamente ha obtenido un éxito limitado.
La administración de determinadas secuencias de ADN, conocidas generalmente como secuencias inmunoestimuladoras o “ISS”, induce una respuesta inmune con una preferencia para el tipo Th1, tal y como se indica por la secreción de citocinas asociadas con Th1. La administración de un polinucleótido inmunoestimulador con un antígeno, da como resultado una respuesta inmune de tipo Th1 frente al antígeno administrado. Roman y col. (1997) Nature Med. 3:849-854. Por ejemplo, ratones inyectados intradérmicamente con �-galactosidasa (�-Gal) de Escherichia coli (E. coli) en solución salina o en alumbre complementario, respondieron produciendo anticuerpos específicos IgG1 e IgE, y células CD4+ que secretaban IL-4 e IL-5, pero no IFN-�, mostrando que los linfocitos T eran predominante del subgrupo Th2. Sin embargo, ratones inyectados intradérmicamente (o con un aplicador para hacer un rasguño en la piel con una púa) con ADN del plasmídico (en solución salina) que codificaba �-Gal y que contenía una ISS, respondían produciendo anticuerpos IgG2a y linfocitos CD4+ que secretaban IFN-�, pero no IL-4 ni IL-5, mostrando que los linfocitos T eran predominantemente del subgrupo Th1. Por otra parte, la producción específica de IgE en los ratones inyectados con ADN plasmídico, se redujo un 66-75%. Raz y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5141-5145. En general, la respuesta a la inmunización con ADN desnudo se caracteriza por la producción de IL-2, de TNF� y de IFN-� por linfocitos T CD4+ estimulados con el antígeno, lo que es indicativo de una respuesta de tipo Th1. Esto es particularmente importante en el tratamiento de la alergia y del asma, tal y como se muestra por una disminución de la producción de IgE. La capacidad de los polinucleótidos inmunoestimuladores de estimular una respuesta inmune de tipo Th1, se ha mostrado con antígenos bacterianos, antígenos víricos y con alérgenos (véase, por ejemplo, el documento WO 98/55495).
Otras referencias que describen ISS incluyen: Krieg y col. (1989) J. Immunol. 143:2448-2451; Tokunaga y col. (1992) Microbiol. Immunol. 36:55-66; Kataoka y col. (1992) Jpn. J. Cancer Res. 83:244-247; Yamamoto y col. (1992) J Immunol. 148:40724076; Mojcik y col. (1993) Clin. Immuno. and Immunopathol. 67:130-136; Branda y col. (1993) Biochem. Pharmacol. 45:2037-2043; Pisetsky y col. (1994) Life Sci. 54(2):101107; Yamamoto y col. (1994a) Antisense Research and Development. 4:119-122; Yamamoto y col. (1994b) Jpn. J Cancer Res. 85:775-779; Raz y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523; Kimura y col. (1994) J. Biochem. (Tokio) 116:991-994; Krieg y col. (1995) Nature 374:546549; Pisetsky y col. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 772:152-163; Pisetsky (1996a) J. Immunol. 156:421-423; Pisetsky (1996b) Immunity 5:303-310; Zhao y col. (1996) Biochem. Pharmacol. 51:173-182; Yi y col. (1996) J. Immunol. 156:558-564; Krieg (1996) Trends Microbiol. 4(2):73-76; Krieg y col. (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6:133-139; Klinrnan y col. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:2879-2883; Raz y col. (1996); Sato y col. (1996) Science 273:352-354; Stacey y col. (1996) J Immunol. 157:2116-2122; Ballas y col. (1996) J. Immunol. 157:1840-1845; Branda y col. (1996) J. Lab. Clin. Med. 128:329-338; Sonehara y col. (1996) J. Interferon and Cytokine Res. 16:799-803; Klinman y col. (1997) J. Immunol. 158:3635-3639; Sparwasser y col. (1997) Eur. J. Immunol. 27:1671-1679; Roman y col. (1997); Carson y col. (1997) J. Exp. Med. 186:1621-1622; Chace y col. (1997) Clin. Immunol. and Immunopathol. 84:185-193; Chu y col. (1997) J. Exp. Med. 186:16231631; Lipford y col. (1997a) Eur. J. Immunol. 27:2340-2344; Lipford y col. (1997b) Eur.
J. Immunol. 27:3420-3426; Weiner y col. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1083310837; Macfarlane y col. (1997) Immunology 91:586-593; Schwartz y col. (1997) J. Clin. Invest. 100:68-73; Stein y col. (1997) Antisense Technology, capítulo 11, págs. 241-264, C. Lichtenstein y W. Nellen, compiladores, IRL Press; Wooldridge y col. (1997) Blood 89:2994-2998; Leclerc y col. (1997) Cell. Immunol. 179:97-106; Kline y col. (1997) J. Invest. Med. 45(3):282A; Yi y col. (1998a) J. Immunol. 160:1240-1245; Yi y col. (1998b) J. Immunol. 160:4755-4761; Yi y col. (1998c) J. Immunol. 160:58985906; Yi y col. (1998d) J. Immunol. 161:4493-4497; Krieg (1998) “Applied Antisense Oligonucleotide Technology” capítulo 24, págs. 431-448, C. A. Stein y A. M. Krieg, compiladores, Wiley-Liss, Inc.; Krieg y col. (1998a) Trends Microbiol. 6:23-27; Krieg y col. (1998b) J. Immunol. 161:2428-2434; Krieg y col. (1998c) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:12631-12636; Spiegelberg y col. (1998) Allergy 53(45S):93-97; Horner y col. (1998) Cell Immunol. 190:77-82; Jakob y col. (1998) J. Immunol. 161:3042-3049; Redford y col. (1998) J. Immunol. 161:3930-3935; Weeratna y col. (1998) Antisense & Nucleic Acid Drug Development 8:351-356; McCluskie y col. (1998) J. Immunol. 161(9):4463-4466; Grarnzinski y col. (1998) Mol. Med. 4:109-118; Liu y col. (1998) Blood 92:3730-3736; Moldoveanu y col. (1998) Vaccine 16:1216-1224; Brazolot Milan y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15553-15558; Briode y col. (1998) J. Immunol. 161:7054-7062; Briode y col. (1999) Int. Arch. Allergy ImmunoL 118:453-456; Kovarik y col. (1999) J. Immunol. 162:1611-1617; Spiegelberg y col. (1999) Pediatr. Pulmonol. Suppl. 18:118-121; Martin-Orozco y col. (1999) Int. Immunol. 11:1111-1118; documento EP 468.520; documento WO 96/02555; documento WO 97/28259; documento WO 98/16247; documento WO 98/18810; documento WO 98/37919; documento WO 98/40100; documento WO 98/52581; documento WO 98/55495; documento WO 98/55609 y documento WO 99/11275. Véase también Elkins y col. (1999) J. Immunol. 162:2291-2298, documento WO 98/52962, documento WO 99/33488, documento WO 99/33868, documento WO 99/51259 y documento WO 99/62923. Véase también Zimmermann y col. (1998) J. Immunol. 160:3627-3630; Krieg (1999) Trends Microbiol. 7:64-65 y los documentos de patente de EE.UU. n�s 5.663.153, 5.723.335 y 5.849.719. Véase también Liang y col. (1996) J. Clin. Invest. 98:1119-1129; Bohle y col. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2344-2353 y el documento WO 99/56755. Véase también el documento WO 99/61056; documento WO 00/06588; documento WO 00/16804; documento WO 00/21556; documento WO 00/54803; documento WO 00/61151; documento WO 00/67023; documento WO 00/67787 y el documento de patente de EE.UU. n� 6.090.791. Véase también Manzel y col. (1999) Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 9:459-464; Verthelyi y col. (2001) J. Immunol. 166:2372
2377; documento WO 01/15726; documento WO 01/12223; documento WO 01/22972; documento WO 01/22990; documento WO 01/35991; documento WO 01/51500; documento WO 01/54720; los documentos de patente de EE.UU n�s. 6.174.872,
6.194.388, 6.207.646, 6.214.806, 6.218.371, 6.239.116.
Las ISS incluyen generalmente una secuencia CG. Los nucleótidos que flanquean la CG de una ISS también parece que tienen un papel en la actividad inmunomoduladora del polinucleótido. Sigue habiendo una necesidad de identificar continuamente ISS para el uso en polinucleótidos inmunomoduladores.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a secuencias inmunoestimuladoras (ISS) y a polinucleótidos inmunomoduladores que contienen ISS y a métodos para modular las respuestas inmunes en individuos empleando estos polinucleótidos, particularmente en seres humanos.
En un aspecto, la invención proporciona un polinucleótido inmunomodulador que tiene menos de 50 bases o pares de bases y que comprende una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 132. En ciertas realizaciones, la invención incluye composiciones que comprenden un polinucleótido inmunomodulador de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los polinucleótidos inmunomoduladores descritos en esta memoria pueden comprender adicionalmente una o varias secuencias TGC y/o T, 5-bromocitosina, G, preferentemente 5’ (o aguas arriba) de la ISS. Los polinucleótidos inmunomoduladores descritos en esta memoria pueden comprender adicionalmente una o varias secuencias TCGA y/o T, 5-bromocitosina, G, A.
En otro aspecto, cualquier polinucleótido inmunomodulador de la invención está estabilizado.
En otro aspecto, la invención proporciona un complejo de microsoporte y polinucleótido inmunomodulador que incluye un polinucleótido inmunomodulador de la invención enlazado con un microsoporte, particularmente con un microsoporte con un tamaño inferior a 10 �m.
En otro aspecto, la invención proporciona composiciones que comprenden cualquiera de los polinucleótidos inmunomoduladores (incluyendo los que forman un complejo con un microsoporte) de la invención. Las composiciones también pueden incluir, por ejemplo, un excipiente farmacéuticamente aceptable o cualquiera entre diversos componentes distintos, tales como un antígeno. En particular, la invención
proporciona:
-
una composición inmunomoduladora que comprende un polinucleótido inmunomodulador de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable; y
-
una composición inmunomoduladora que comprende un antígeno y un polinucleótido inmunomodulador de la invención.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un polinucleótido inmunomodulador de la invención en la preparación de un medicamento para modular una respuesta inmune. Un polinucleótido inmunomodulador de la invención se administra a un individuo en una cantidad suficiente para modular una respuesta inmune en dicho individuo. La inmunomodulación de acuerdo con la invención se puede poner en práctica en individuos que incluyen los que padecen un trastorno asociado con una respuesta inmune de tipo Th2 (p. ej., alergias o asma inducida por alergia), en individuos que reciben vacunas, tales como vacunas terapéuticas (p. ej., vacunas que comprenden un epítopo de la alergia, un epítopo micobacteriano o un epítopo asociado con un tumor) o vacunas profilácticas, en individuos con cáncer y en individuos que tienen una enfermedad infecciosa.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un polinucleótido inmunomodulador de la invención, en la preparación de un medicamento para tratar la fibrosis pulmonar idiopática o una infección vírica. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un polinucleótido inmunomodulador de la invención en la preparación de un medicamento para emplear en un método para aliviar un síntoma de una enfermedad infecciosa o de un trastorno relacionado con IgE. Una cantidad eficaz de un polinucleótido inmunomodulador de la invención se administra a un individuo que tiene una enfermedad infecciosa. La administración de un polinucleótido inmunomodulador de acuerdo con la invención, alivia uno o varios síntomas de la enfermedad infecciosa. La enfermedad infecciosa que se puede tratar de acuerdo con la invención, incluye enfermedades infecciosas causadas por un agente patógeno celular (p. ej., una enfermedad micobacteriana, malaria, leishmaniosis, toxoplasmosis, esquistosomiasis o clonorquiasis), y puede incluir o excluir una enfermedad vírica.
La invención se refiere adicionalmente a un equipo de reactivos que comprende un polinucleótido inmunomodulador de la invención y las instrucciones para el uso del polinucleótido inmunomodulador para inmunomodular a un individuo. El equipo de reactivos es preferentemente para realizar los usos de la invención. Los equipos de reactivos de la invención comprenden un polinucleótido inmunomodulador de la invención (generalmente en un recipiente adecuado), e incluyen adicionalmente las instrucciones para el uso del polinucleótido inmunomodulador en la inmunomodulación de un individuo, por ejemplo, cuando el individuo padece un trastorno asociado con una respuesta inmune de tipo Th2 (p. ej., alergias o asma inducida por alergia), está recibiendo vacunas tales como vacunas terapéuticas (p. ej., vacunas que comprenden un epítopo alérgico, un epítopo micobacteriano o un epítopo asociado con un tumor) o vacunas profilácticas, padece cáncer o padece una enfermedad infecciosa. Se pueden proporcionar otras instrucciones adecuadas.
También se describe en esta memoria un polinucleótido inmunomodulador que comprende una ISS que comprende una secuencia con la fórmula 5'-X1 X2 A X3 C G X4 T C G-3' (SEQ ID NO: 62) en donde X1 es T, G, C o Z (Z= 5-bromocitosina), en donde X2 es T, G, A o U, en donde X3 es T, A o C, en donde X4 es T, G o U y en donde la fórmula no es 5'-TGAACGTTCG-3' (SEQ ID NO: 63) ni 5'-GGAACGTTCG-3' (SEQ ID NO: 64).
También se describe en esta memoria un polinucleótido inmunomodulador que comprende una ISS que comprende una secuencia de fórmula 5'-X1 X2 A X3 Z G X4 T C G-3' (SEQ ID NO: 65) en donde Z es 5-bromocitosina, en donde X1 es T, G, C o Z (Z= 5-bromocitosina), en donde X2 es T, G, A o U, en donde X3 es T, A o C, en donde X4 es T, G o U y en donde la fórmula no es 5'-TGAAZGTTCG-3' (SEQ ID NO: 66; Z= 5-bromocitosina).
También se describe en esta memoria un polinucleótido inmunomodulador que comprende al menos una de las siguientes secuencias: TGAACGUTCG (SEQ ID NO: 67), GAACCGTTCG (SEQ ID NO: 75), CGAACGTTCG (SEQ ID NO: 77), ZGAAZGUTCG (SEQ ID NO: 93) y GAAAZGUTCG (SEQ ID NO: 89), en donde Z es 5-bromocitosina.
También se describen en esta memoria métodos para incrementar el interferóngamma (IFN-�) en un individuo (o para estimular los niveles de IFN-� (o la(s) cantidad(es) en un individuo), que comprenden administrar una cantidad eficaz de un polinucleótido inmunomodulador de la invención al individuo. La administración de un polinucleótido inmunomodulador de la invención incrementa el IFN-� en el individuo. Objetos adecuados para estos métodos incluyen los individuos que podrían obtener un beneficio de un aumento del IFN-�, o los individuos que tienen fibrosis pulmonar idiopática (IPF), escleroderma, fibrosis inducida por radiación cutánea, fibrosis hepática que incluye fibrosis hepática inducida por esquistosomiasis, fibrosis renal, así como otros estados que se pueden mejorar con la administración de IFN-�.
También se describen en esta memoria métodos para incrementar el interferónalfa (IFN-�) en un individuo (o para estimular los niveles de IFN-� (o la(s) cantidad(es)) en un individuo), que comprenden administrar una cantidad eficaz de un polinucleótido inmunomodulador de la invención al individuo. La administración de un polinucleótido inmunomodulador de acuerdo con la invención, incrementa el IFN-� en el individuo. Objetos adecuados para estos métodos incluyen los individuos que tienen una infección vírica, así como otros estados que se pueden mejorar con la administración de IFN-� o con un aumento de la cantidad de IFN-�.
MODOS PARA REALIZAR LA INVENCIÓN
También hemos descubierto polinucleótidos inmunomoduladores que comprenden secuencias inmunoestimuladoras (ISS) y métodos para modular respuestas inmunes en individuos, particularmente en seres humanos, usando estos polinucleótidos inmunomoduladores. Las composiciones de la invención comprenden un polinucleótido inmunomodulador que comprende una ISS de la invención. Algunos polinucleótidos inmunomoduladores descritos en esta memoria, incluyen adicionalmente al menos una secuencia TCG o T, 5-bromocitosina, G. En algunos polinucleótidos inmunomoduladores, la(s) secuencia(s) adicional(es) TCG y/o T, 5-bromocitosina, G se crea por la adición de una T o una TC o una T, 5-bromocitosina en el extremo 5’ de la ISS. Hemos observado que los polinucleótidos inmunomoduladores que comprenden ISS específicas, modulan de forma eficaz las células inmunes, incluyendo las células humanas. Nuestro descubrimiento tiene un interés particular porque las células humanas pueden ser más resistentes a la inmunomodulación a través de polinucleótidos inmunomoduladores que las células procedentes de animales de laboratorio de uso común, tales como ratones. También hemos observado que algunos polinucleótidos de la invención estimulan con eficacia el IFN-�, incluso en células humanas.
La invención también proporciona la modulación de una respuesta inmune en un individuo, administrando un polinucleótido inmunomodulador de la invención al individuo.
Además se proporcionan equipos de reactivos que comprenden los polinucleótidos que contienen ISS de la invención. Los equipos de reactivos pueden comprender además instrucciones para administrar un polinucleótido inmunomodulador de la invención para la inmunomodulación en un sujeto y los polinucleótidos inmunomoduladores.
Técnicas generales
En la puesta en práctica de la presente invención se emplearán, a no ser que se indique de otro modo, técnicas convencionales de la biología molecular (que incluyen técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la técnica común. Tales técnicas se explican en su totalidad en la bibliografía, por ejemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edición (Sambrook y col., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, compilador, 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, compilador, 1987); “Handbook of Experimental Immunology” (D. M. Weir & C. C. Blackwell, compiladores); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J. M. Miller & M. P. Calos, compiladores., 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel y col., compiladores, 1987); “PCR: The Polimerase Chain Reaction”, (Mullis y col., compiladores, 1994); “Current Protocols in Immunology” (J. E. Coligan y col., compiladores, 1991); “The Immunoassay Handbook” (D. Wild, compilador, Stockton Press NY, 1994); “Bioconjugate Techniques” (Greg T. Hermanson, compiladores, Academic Press, 1996); y “Methods of Immunological Analysis” (R. Masseyeff, W. H. Albert y N. A. Staines, compiladores, Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993).
Definiciones
Tal y como se utiliza en esta memoria, la forma singular "un", “una”, y "el", “la”, incluye las referencias en plural, a menos que se indique de otro modo. Por ejemplo, “una" ISS incluye una o varias ISS.
Tal y como se utiliza en esta memoria de forma intercambiable, los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" incluyen ADN monocatenario (ssADN), ADN bicatenario (dsADN), ARN monocatenario (ssARN) y ARN bicatenario (dsARN), oligonucleótidos y oligonucleósidos modificados o combinaciones de los mismos. El oligonucleótido puede tener una configuración lineal o circular, o el oligonucleótido puede contener ambas, segmentos lineales y circulares. Los oligonucleótidos son polímeros de nucleósidos unidos, generalmente, a través de enlaces fosfodiéster, aunque en los oligonucleótidos también se pueden utilizar enlaces alternativos, tales como ésteres fosforotioato. Un nucleósido consiste en una base púrica (adenina (A) o guanina (G) o un derivado de las mismas) o pirimidínica (timina (T), citosina (C) o uracilo (U), o un derivado de las mismas) unida a un azúcar. Las cuatro unidades de nucleósidos (o las bases) en el ADN se denominan desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina y desoxicitidina. Un nucleótido es un éster fosfato de un nucleósido.
El término "ISS", tal y como se utiliza en esta memoria, se refiere a secuencias de polinucleótidos que efectúan y/o contribuyen a una respuesta inmune medible, tal y como se mide in vitro, in vivo y/o ex vivo. Ejemplos de respuestas inmunes medibles incluyen, pero sin estar limitados a los mismos, la producción de anticuerpos específicos del antígeno, la secreción de citocinas, la activación o la expansión de poblaciones de linfocitos, tales como linfocitos NK, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos B, y similares. Preferiblemente, las secuencias de ISS activan preferentemente una respuesta de tipo Th1. Un polinucleótido para uso en la invención contiene por lo menos una ISS. Tal y como se utiliza en esta memoria, “ISS" es un término abreviado para un polinucleótido que contiene una ISS, que incluye los polinucleótidos inmunomoduladores que contienen ISS de la invención.
El término "3’" se refiere generalmente a una región o a una posición en un polinucleótido o un oligonucleótido 3’ (aguas abajo) de otra región o posición en el mismo polinucleótido u oligonucleótido.
El término "5’" se refiere generalmente a una región o a una posición en un polinucleótido o un oligonucleótido 5’ (aguas arriba) de otra región o posición en el mismo polinucleótido u oligonucleótido.
Una región, una porción o una secuencia que es "adyacente" a otra secuencia, está colindando directamente con esa región, porción o secuencia. Por ejemplo, una secuencia de polinucleótido adicional que es adyacente a la porción ISS de un polinucleótido inmunomodulador, está colindando directamente con esa región.
La expresión "polinucleótido inmunomodulador" o "IMP" o "polinucleótido que contiene una ISS", tal y como se utiliza en esta memoria, se refiere a un polinucleótido que comprende por lo menos una ISS. En determinadas realizaciones, el IMP es una ISS.
El término "inmunomodulador" o "que modula una respuesta inmune", tal y como se utiliza en esa memoria, incluye los efectos inmunoestimuladores así como los efectos inmunosupresores. La inmunomodulación es sobre todo una alteración cualitativa de una respuesta inmune global, aunque también pueden tener lugar cambios cuantitativos junto con la inmunomodulación. Una respuesta inmune que está inmunomodulada de acuerdo con la presente invención, es una que se desplaza hacia una respuesta inmune de “tipo Th1”, en contraposición con una respuesta inmune de "tipo Th2". Las respuestas de tipo Th1 se consideran típicamente respuestas del sistema inmune celular (p. ej., linfocitos citotóxicos), mientras que las respuestas de tipo Th2 son generalmente "humorales", o se basan en anticuerpos. Las respuestas inmunes de tipo Th1 se caracterizan normalmente por reacciones de “hipersensibilidad de tipo retardado" frente a un antígeno, y se pueden detectar a nivel bioquímico por niveles incrementados de citocinas asociadas con Th1, tales como IFN-�, IFN-�, IL-2, IL-12 y TNF-�, así como IL-6, aunque la IL-6 también puede estar asociada con respuestas de tipo Th2. Las respuestas inmunes de tipo Th1 están asociadas generalmente con la producción de linfocitos citotóxicos (CTLs) y bajos niveles o una producción transitoria de anticuerpos. Las respuestas inmunes de tipo Th2 están asociadas generalmente con niveles más altos de producción de anticuerpos, incluyendo la producción de IgE, en ausencia de CTL o con una producción mínima, así como la expresión de citocinas asociadas con Th2, tales como IL-4. Por consiguiente, la inmunomodulación de acuerdo con la invención se puede reconocer, por ejemplo, mediante un aumento de la producción de IFN-� y/o una disminución de la producción de IgE, en un individuo tratado de acuerdo con la invención, comparada con la ausencia de tratamiento.
El término "conjugado" se refiere a un complejo, en el cual se enlazan un polinucleótido que contiene ISS y un antígeno. Tales enlaces conjugados incluyen enlaces covalentes y/o no covalentes.
El término "antígeno" significa una sustancia que es reconocida y se une específicamente con un anticuerpo o con un receptor del antígeno de un linfocito T. Los antígenos pueden incluir péptidos, proteínas, glicoproteínas, polisacáridos, hidratos de carbono complejos, azúcares, gangliósidos, lípidos y fosfolípidos; porciones de los mismos y combinaciones de los mismos. Los antígenos se pueden encontrar en la naturaleza o pueden ser sintéticos. Los antígenos adecuados para la administración con ISS incluyen cualquier molécula capaz de provocar una respuesta específica del antígeno con linfocitos B o con linfocitos T. Preferiblemente, los antígenos provocan una respuesta de anticuerpos específicos del antígeno. Los haptenos están incluidos en el alcance de "antígeno“. Un hapteno es un compuesto de bajo peso molecular que no es inmunógeno por sí mismo, pero que se vuelve inmunógeno cuando se conjuga con una molécula inmunógena que contiene determinantes antigénicos. Las moléculas pequeñas se tienen que haptenizar para que se vuelvan antigénicas. Preferiblemente, los antígenos de la presente invención incluyen péptidos, lípidos (p. ej., esteroles, ácidos grasos y fosfolípidos), polisacáridos, tales como los utilizados en las vacunas de Haemophilus influenzae, gangliósidos y glicoproteínas.
“Aditivo" se refiere a una sustancia que, cuando se añade a un agente inmunógeno tal como un antígeno, potencia o mejora no específicamente una respuesta inmune frente al agente en el hospedador receptor, después de la exposición a la mezcla.
El término "péptido" son polipéptidos que tienen una longitud y una composición suficientes para efectuar una respuesta biológica, p. ej., la producción de anticuerpos o la actividad de citocinas, siendo o no el péptido un hapteno. Típicamente, los péptidos tienen por lo menos seis residuos de aminoácido de longitud. El término "péptido" incluye adicionalmente aminoácidos modificados (que están presentes o no en la naturaleza), incluyendo tales modificaciones, pero sin estar limitadas a las mismas, la fosforilación, la glicosilación, la pegilación, la lipidización y la metilación.
Los “péptidos antigénicos" pueden incluir péptidos naturales purificados, péptidos sintéticos, proteínas recombinantes, extractos brutos de proteína, virus atenuados
o inactivados, células, microorganismos, o fragmentos de tales péptidos. Un "péptido antigénico" o un "polipéptido antigénico" significa por consiguiente, todo o una porción del polipéptido que muestra una o varias propiedades antigénicas. Así, por ejemplo, un "polipéptido antigénico Amb a 1" o un "antígeno del polipéptido Amb a 1" es una secuencia de aminoácidos Amb a 1, tanto la secuencia completa, como una porción de la secuencia, y/o una modificación de la secuencia, que muestra una propiedad antigénica (es decir, que se une específicamente a un anticuerpo o a un receptor de linfocito T).
Una "molécula de entrega" o un "vehículo de entrega" es un resto químico que facilita, permite y/o potencia la entrega de un polinucleótido inmunomodulador en un sitio concreto y/o en relación con una sincronización concreta. Un vehículo de entrega además, puede estimular o no adicionalmente una respuesta inmune.
Una "respuesta alérgica frente al antígeno" significa una respuesta inmune caracterizada generalmente por la generación de eosinófilos y/o IgE específica del antígeno y sus efectos resultantes. Tal y como se conoce bien en la técnica, IgE se une con los receptores de IgE en los mastocitos y los basófilos. Después de una exposición posterior al antígeno reconocido por la IgE, el antígeno se reticula con la IgE en los mastocitos y en los basófilos, causando la desgranulación de estas células, que incluye, pero no está limitada, a la liberación de histamina. Se debe entender que las expresiones “respuesta alérgica al antígeno”, “alergia” y "estado alérgico" son igual de apropiadas para aplicar en la invención. Además, se debe entender que la invención es igual de adecuada para la prevención de una respuesta alérgica que para tratar un estado alérgico preexistente.
Tal y como se utiliza en esta memoria, el término "alérgeno" significa un antígeno o una porción antigénica de una molécula, generalmente una proteína, que provoca una respuesta alérgica, después de la exposición a un sujeto. Típicamente, el sujeto es alérgico al alérgeno, tal y como se indica, por ejemplo, con el ensayo de eritema y formación de habón o cualquier método conocido en la técnica. Una molécula se dice que es un alérgeno incluso si solamente un pequeño subgrupo de sujetos muestra una respuesta inmune alérgica (p. ej., IgE), después de la exposición a la molécula. En la técnica se conoce una variedad de alérgenos aislados. Éstos incluyen, sin estar limitados a los mismos, los proporcionados en la Tabla 1 de esta memoria.
El término "desensibilización" se refiere al procedimiento de administrar dosis crecientes de un alérgeno frente al cual el paciente ha mostrado sensibilidad. Ejemplos de las dosis de alérgeno utilizadas para la desensibilización son conocidas en la técnica, véase, por ejemplo, Fornadley (1998) Otolaryngol. Clin. North. Am. 31:111-127.
La “inmunoterapia específica del antígeno" se refiere a cualquier forma de inmunoterapia que implique el antígeno y genere una modulación de la respuesta inmune específica del antígeno. En el contexto de la alergia, la inmunoterapia específica del antígeno incluye, pero no está limitada a la misma, la terapia de desensibilización.
El término "microsoporte" se refiere a una composición sólida que es insoluble en agua y que tiene un tamaño menor de aproximadamente 150, 120 o 100 �m, preferiblemente menor de aproximadamente 50-60 �m, preferiblemente menor de aproximadamente 10 �m, preferiblemente menor de aproximadamente 5, 2,5, 2 ó 1,5 �m. Los microsoportes incluyen "nanosoportes", que son microsoportes que tienen un tamaño menor de aproximadamente 1 �m, preferiblemente menor de aproximadamente 500 nm. Los microsoportes incluyen partículas en fase sólida, tales como las partículas formadas a partir de polímeros biocompatibles presentes en la naturaleza, polímeros sintéticos o copolímeros sintéticos, aunque los microsoportes formados a partir de agarosa o de agarosa reticulada se pueden incluir o excluir de la definición de microsoportes en esta memoria, así como otros materiales biodegradables conocidos en la técnica. Los microsoportes para uso en la presente invención pueden ser biodegradables o no biodegradables. Los microsoportes no biodegradables en fase sólida están formados por polímeros u otros materiales que no son erosionables y/o no degradables bajo condiciones fisiológicas en mamíferos, tales como poliestireno, polipropileno, sílice, material cerámico, poliacrilamida, oro, látex, hidroxiapatita, dextrano, y materiales de tipo ferromagnético y paramagnético. Los microsoportes biodegradables en fase sólida pueden estar formados por polímeros que son degradables (p. ej., poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) y copolímeros de los mismos) o erosionables (p. ej., poliortoésteres, tales como 3,9-dietiliden-2,4,8,10-tetraoxaspiro[5.5]undecano (DETOSU) o polianhídridos, tales como polianhídridos de ácido sebácico) bajo condiciones fisiológicas en mamíferos. Los microsoportes también pueden estar en fase líquida (p. ej., a base de aceite o de lípido), tales como liposomas, iscoms (complejos inmunoestimuladores, que son complejos estables de colesterol, fosfolípido y saponina activador del aditivo) sin antígeno, o en gotas o micelas que se encuentran en emulsiones de aceiteen-agua o de agua-en-aceite. Los microsoportes biodegradables en fase líquida incorporan típicamente un aceite biodegradable, conociéndose en la técnica una variedad de los mismos, que incluyen el escualeno y los aceites vegetales. Los microsoportes tienen típicamente forma esférica, pero los microsoportes que se desvían de la forma esférica también son aceptables (p. ej., elipsoidales, forma de varilla, etc.). Debido a su naturaleza insoluble (con respecto al agua), los microsoportes se pueden separar del agua por filtración y de soluciones (acuosas) a base de agua.
El término "no biodegradable", tal y como se utiliza en esta memoria, se refiere a un microsoporte que no se degrada o se desgasta bajo condiciones fisiológicas normales en mamíferos. Generalmente, un microsoporte se considera no biodegradable si no se degrada (es decir, pierde menos del 5% de su masa o de la longitud promedio del polímero) después de una incubación durante 72 horas a 37ºC en suero humano normal.
Un microsoporte se considera "biodegradable" si se puede degradar o desgastar en condiciones fisiológicas normales en mamíferos. Generalmente, un microsoporte se considera biodegradable si se degrada (es decir, si pierde al menos 5% de su masa o de la longitud promedio del polímero) después de una incubación durante 72 horas a 37ºC en suero humano normal.
El "tamaño" de un microsoporte es generalmente el "tamaño de diseño" o el tamaño que se desea para las partículas, indicado por el fabricante. El tamaño puede ser una dimensión medida directamente, tal como un diámetro promedio o máximo, o se puede determinar con un ensayo indirecto, tal como un ensayo de selección por filtración. La medición directa del tamaño del microsoporte se realiza típicamente mediante microscopía, generalmente por microscopía óptica o por microscopía electrónica de barrido (SEM), en comparación con partículas de tamaño conocido o por referencia a un micrómetro. Ya que se presentan variaciones menores del tamaño durante el procedimiento de fabricación, los microsoportes se consideran que tienen un tamaño indicado, si las mediciones muestran que los microsoportes tienen la medición indicada ± aproximadamente 5-10%. Las características del tamaño también se pueden determinar por técnicas dinámicas de dispersión de la luz o de oscurecimiento. Alternativamente, el tamaño del microsoporte se puede determinar por ensayos de selección por filtración. Un microsoporte es más pequeño que un tamaño indicado, si por lo menos el 97% de las partículas pasan a través de un filtro de "tipo tamiz" (es decir, un filtro en el cual las partículas retenidas están en la superficie del filtro, tal como filtros de policarbonato o de polietersulfona, en contraposición con un “filtro de profundidad” en el que las partículas retenidas se alojan dentro del filtro) de tamaño indicado. Un microsoporte es más grande que un tamaño indicado si por lo menos aproximadamente el 97% de las partículas del microsoporte quedan retenidas por un filtro de tipo tamiz del tamaño indicado. Así, por lo menos aproximadamente el 97% de los microsoportes de aproximadamente 10 �m hasta aproximadamente 10 nm de tamaño, pasan a través de un filtro de tamiz con un tamaño de poro de 10 �m y quedan retenidos por un filtro de tamiz de 10 nm.
Tal y como se indica en las consideraciones anteriores, la referencia a un tamaño o a un intervalo de tamaño para un microsoporte, incluye implícitamente variaciones aproximadas y aproximaciones del tamaño y/o del intervalo de tamaño indicados. Esto se refleja por medio del empleo del término "aproximadamente” cuando se hace referencia a un tamaño y/o a un intervalo de tamaño, y la referencia a un tamaño
o a un intervalo de tamaño en el que no se hace referencia a "aproximadamente", no significa que el tamaño y/o el intervalo de tamaño sean exactos.
La expresión "complejo de polinucleótido inmunomodulador/microsoporte” o "complejo de IMP/MC" se refiere a un complejo de un polinucleótido que contiene ISS y a un microsoporte. Los componentes del complejo pueden estar enlazados covalentemente o no covalentemente. Los enlaces no covalentes pueden estar mediados por cualquier fuerza de unión no covalente, que incluye la interacción hidrófoba, el enlace iónico (electrostático), enlaces por puentes de hidrógeno y/o las fuerzas de van der Waals. En el caso de enlaces hidrófobos, el enlace generalmente es a través de un resto hidrófobo (p. ej., colesterol) unido covalentemente al IMP.
Un "individuo" es un vertebrado, tal como un vertebrado aviar, y preferentemente es un mamífero, más preferiblemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no están limitados a los mismos, los seres humanos, los primates, los animales de granja, los animales para deporte, los roedores y los animales domésticos.
Una "cantidad eficaz" o una "cantidad suficiente" de una sustancia es la cantidad suficiente para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo los resultados clínicos, y, por ello, una “cantidad eficaz" depende del contexto en el cual se está aplicando. En el contexto de la administración de una composición que modula una respuesta inmune frente a un antígeno coadministrado, una cantidad eficaz de un polinucleótido inmunomodulador y un antígeno es una cantidad suficiente para conseguir tal modulación, comparada con la respuesta inmune obtenida cuando el antígeno se administra solo. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o en varias administraciones.
El término "coadministración" tal y como se utilizado en esta memoria, se refiere a la administración de por lo menos dos sustancias diferentes, suficientemente próximas en el tiempo para modular una respuesta inmune. Preferiblemente, la coadministración se refiere a la administración simultánea de al menos dos sustancias diferentes.
La “estimulación" de una respuesta o de un parámetro incluye producir y/o potenciar esa respuesta o parámetro. Por ejemplo, la “estimulación" de una respuesta inmune, tal como una respuesta de tipo Th1, significa un aumento en la respuesta, que se puede conseguir produciendo y/o potenciando una respuesta. De forma similar, la “estimulación" de una citocina o de un tipo de célula (tal como CTLs) significa un aumento en la cantidad o en el nivel de citocina o del tipo de célula.
Un "trastorno asociado con IgE” es un estado fisiológico que se caracteriza, en parte, por unos niveles elevados de IgE, que pueden ser o no persistentes. Los trastornos asociados con IgE incluyen, pero no están limitados a los mismos, la alergia y las reacciones alérgicas, los trastornos relacionados con la alergia (descritos más abajo), el asma, la rinitis, la conjuntivitis, la urticaria, el choque, alergias a picaduras de himenóptero, alergias a fármacos e infecciones con parásitos. La expresión también incluye las manifestaciones relacionadas con estos trastornos. Generalmente, la IgE en tales trastornos es específica del antígeno.
Un "trastorno relacionado con la alergia” significa un trastorno que es el resultado de los efectos de una respuesta inmune con IgE específica del antígeno. Tales efectos pueden incluir, pero no están limitados a los mismos, la hipotensión y el choque. La anafilaxia es un ejemplo de un trastorno relacionado con la alergia durante el cual la histamina liberada en la circulación, causa una vasodilatación así como un incremento de la permeabilidad de los capilares, dando como resultado una fuerte pérdida de plasma de la circulación. La anafilaxia puede tener lugar de forma sistémica, con efectos asociados que se experimentan por todo el cuerpo, y puede tener lugar localmente, estando la reacción limitada a un tejido o a un órgano diana específico.
La expresión "enfermedad vírica", tal y como se utiliza en esta memoria, se refiere a una enfermedad que tiene un virus como agente etiológico. Ejemplos de enfermedades víricas incluyen la hepatitis B, la hepatitis C, la gripe, el síndrome de inmu
nodeficiencia adquirida (SIDA) y el herpes zoster.
Tal y como se emplea en esta memoria, y tal y como se entiende en la técnica, el “tratamiento” es una estrategia para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo los resultados clínicos. Para los fines de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no están limitados a los mismos, el alivio
o la mejora de uno o de varios síntomas, la disminución del grado de la enfermedad, el estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, la prevención de la propagación de la enfermedad, retardar o aplacar la progresión de la enfermedad, mejorar o aliviar el estado de enfermedad, y la remisión (si es parcial o total), tanto de forma detectable como no detectable. El “tratamiento” también puede significar prolongar la supervivencia, comparada con la supervivencia esperada si no se recibe un tratamiento.
La “paliación” de una enfermedad o de un trastorno significa que el grado y/o las manifestaciones clínicas indeseables de un trastorno o de un estado de la enfermedad disminuyen y/o el curso temporal de la progresión se ralentiza o se alarga, comparado con el trastorno sin tratamiento. Especialmente en el contexto de la alergia, tal y como entienden perfectamente los expertos en la materia, la paliación puede tener lugar después de la modulación de la respuesta inmune contra un(os) alérgeno(s). Además, la paliación no tiene lugar necesariamente mediante la administración de una dosis, sino que ocurre frecuentemente después de la administración de una serie de dosis. Así, una cantidad suficiente para paliar una respuesta o un trastorno, se puede administrar en una o a varias administraciones.
Un "título de anticuerpo", o una "cantidad de anticuerpo", que "es producido“ por un polinucleótido inmunomodulador y un antígeno, se refiere a la cantidad de un anticuerpo dado, medida en un momento después de la administración del polinucleótido inmunomodulador y del antígeno.
Un "anticuerpo asociado a Th1" es un anticuerpo cuya producción y/o aumento está asociado con una respuesta inmune de tipo Th1. Por ejemplo, IgG2a es un anticuerpo asociado a Th1 en el ratón. Para los fines de esta invención, la medición de un anticuerpo asociado a Th1 se puede realizar midiendo en uno o en varios de tales anticuerpos. Por ejemplo, en el ser humano, la medición de un anticuerpo asociado con Th1 podía implicar la medición de IgG1 y/o de IgG3.
Un "anticuerpo asociado a Th2" es un anticuerpo cuya producción y/o aumento está asociado con una respuesta inmune de tipo Th2. Por ejemplo, IgG1 es un anticuerpo asociado a Th2 en el ratón. Para los fines de esta invención, la medición de un anticuerpo asociado a Th2 se puede realizar midiendo en uno o en varios de tales anticuerpos. Por ejemplo, en el ser humano, la medición de un anticuerpo asociado con Th2 podía implicar la medición de IgG2 y/o de IgG4.
"Atenuar" o "inhibir" una función o una actividad, tal como la producción de citocinas, la producción de anticuerpos o la liberación de histaminas, es reducir la función o la actividad cuando se compara por otro lado, con las mismas condiciones, a excepción de una condición o de un parámetro de interés, o alternativamente, comparando con otra condición. Por ejemplo, una composición que comprende un polinucleótido inmunomodulador y un antígeno que inhiben la liberación de histamina, reduce la liberación de histamina comparando, por ejemplo, con la liberación de histamina inducida sólo por el antígeno. A modo de otro ejemplo, una composición que comprende un polinucleótido inmunomodulador y un antígeno que inhiben la producción de anticuerpos, reduce el grado y/o los niveles de anticuerpo, comparando, por ejemplo, con el grado y/o los niveles de anticuerpo producidos por el antígeno solo.
Tal y como se emplea en esta memoria, la expresión "que comprende" y sus cognados, se emplean en el sentido de incluir; es decir es equivalente a la expresión "que incluye" y sus cognados correspondientes.
Composiciones de la invención
La invención proporciona secuencias inmunoestimuladoras (ISS) y polinucleótidos inmunomoduladores (IMP) para modular la respuesta inmune en individuos. Cada polinucleótido inmunomodulador comprende por lo menos una secuencia inmunoestimuladora (ISS).
Las composiciones de la invención comprenden un polinucleótido inmunomodulador aislado (o una combinación de dos o varios polinucleótidos inmunomoduladores) o junto con otro agente inmunomodulador, tal como un péptido, un antígeno (descrito más abajo) y/o un aditivo adicional. Las composiciones de la invención pueden comprender un polinucleótido inmunomodulador de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes farmacéuticamente aceptables, que incluyen tampones, son conocidos en la técnica. Remington: “The Science and Practice of Pharmacy, vigésima edición, Mack Publishing (2000).
Después de la administración, las composiciones que comprenden un antígeno, un polinucleótido inmunomodulador de la invención, y opcionalmente un aditivo, pueden conducir a una potenciación de una respuesta inmune frente al antígeno y de este modo, pueden dar como resultado una respuesta inmune potenciada comparada con la respuesta que es el resultado de una composición que comprende la ISS y el antígeno solos. Los aditivos son conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a los mismos, las emulsiones de aceite-en-agua, las emulsiones de agua-en aceite, el alumbre (sales de aluminio), los liposomas y las micropartículas, que incluyen pero no están limitadas a, poliestireno, almidón, polifosfaceno y polilactida/poliglicósidos. Otros aditivos adecuados también incluyen, pero no están limitados a los mismos, MF59, DETOX® (Ribi), mezclas de escualeno (SAF-1), péptido de muramilo, derivados de saponina, preparaciones de la pared celular de micobacterias, lípido A monofosforilo, derivados de ácido micólico, tensioactivos no iónicos de copolímeros en bloque, Quil A, subunidad B de la toxina del cólera, polifosfaceno y derivados, y complejos inmunoestimuladores (ISCOMs), tales como los descritos por Takahashi y col. (1990) Nature 344:873-875, así como, aditivos basados en lípidos y otros descritos en esta memoria. Para el uso veterinario y para la producción de anticuerpos en animales, se pueden utilizar componentes mitógenos de aditivo de Freund (completo e incompleto).
Los polinucleótidos que contienen ISS de la invención pueden estar combinados con otras terapias para indicaciones particulares. Por ejemplo, además de un polinucleótido que contiene ISS, las composiciones de la invención también pueden comprender fármacos contra la malaria, tales como cloroquina para pacientes con malaria, fármacos contra la leishmania, tales como pentamidina y/o alopurinol para pacientes con leishmaniosis, fármacos contra las micobacterias, tales como isoniacida, rifampicina y/o etambutol para pacientes con tuberculosis, o reactivos para la desensibilización contra el alérgeno para pacientes atópicos (alérgicos).
Tal y como se ha descrito en esta memoria, las composiciones de la invención pueden incluir polinucleótidos que contienen ISS y pueden comprender adicionalmente uno o varios agentes inmunoterapéuticos adicionales (es decir, un agente que actúa a través del sistema inmunitario y/o se obtiene a partir del sistema inmunitario) que incluyen, pero no están limitados a los mismos, citocina, aditivos y anticuerpos. Ejemplos de anticuerpos terapéuticos incluyen los utilizados en el contexto del cáncer (p. ej., anticuerpos antitumorales), tales como los descritos más abajo.
Polinucleótidos inmunomoduladores
De acuerdo con la presente invención, el polinucleótido inmunomodulador contiene por lo menos una ISS, seleccionada entre SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:132, y puede contener múltiples ISSs. Las ISSs pueden estar adyacentes dentro del polinucleótido o pueden estar separadas por bases de nucleótidos adicionales dentro del polinucleótido, o pueden estar solapadas dentro del polinucleótido. En determinadas realizaciones, el polinucleótido inmunomodulador consiste en una ISS.
Las ISS se han descrito en la técnica y se pueden identificar fácilmente empleando ensayos convencionales que indican diferentes aspectos de la respuesta inmune, tales como la secreción de citocinas, la producción de anticuerpos, la activación de los linfocitos NK y la proliferación de los linfocitos T. Véanse, p. ej., los documentos WO 97/28259; WO 98/16247; WO 99/11275; Krieg y col. (1995) Nature 374:546-549; Yamamoto y col. (1992a); Ballas y col. (1996); Klinman y col. (1997); Sato y col. (1996); Pisetsky (1996a); Shimada y col. (1986) Jpn. J. Cancer Res. 77:808-816; Cowdery y col. (1996) J. Immunol. 156:4570-4575; Roman y col. (1997); Lipford y col. (1997a); los documentos WO 98/55495 y WO 00/61151. Por consiguiente, este método y otros se pueden utilizar para identificar, someter a ensayo y/o confirmar los polinucleótidos inmunomoduladores que contienen ISS.
La ISS puede tener cualquier longitud que sea inferior a 50 bases o pares de bases, preferiblemente más de 20 bases o pares de bases de longitud y comprende la secuencia 5’-citosina, guanina-3'.
Tal y como se aclara en esta memoria, se entiende que, con respecto a las fórmulas descritas en esta memoria, cualquiera y todos los parámetros se seleccionan de forma independiente. Por ejemplo, si x = 0-2, y se puede seleccionar independientemente sin importar los valores de x (o cualquier otro parámetro seleccionable en una fórmula).
Una ISS puede comprender una secuencia de 10 meros de fórmula: 5'-X1 X2 A X3 C G X4 T C G-3' (SEQ ID NO: 62) en donde X1 es T, G, C o Z (Z= 5-bromocitosina), en dondeX2esT,G,Ao U, endondeX3esT,A oC,en dondeX4es T, Go U yen donde la ISS no es 5'-TGAACGTTCG-3' (SEQ ID NO: 63) ni 5'-GGAACGTTCG-3' (SEQ ID NO: 64).
También se describe en esta memoria una ISS que comprende una ISS que comprende cualquiera de las siguientes secuencias: TGAACGUTCG (SEQ ID NO: 67); TGACCGTTCG (SEQ ID NO: 68); TGATCGGTCG (SEQ ID NO: 69); TGATCGTTCG (SEQ ID NO: 70); TGAACGGTCG (SEQ ID NO: 71); GTAACGTTCG (SEQ ID NO: 72); GTATCGGTCG (SEQ ID NO: 73); GTACCGTTCG (SEQ ID NO: 74); GAACCGTTCG (SEQ ID NO: 75); ZGACCGTTCG (SEQ ID NO: 76), en donde Z = 5-bromocitosina; CGAACGTTCG (SEQ ID NO: 77); CGACCGTTCG (SEQ ID NO: 78); ZGAACGTTCG (SEQ ID NO: 79), en donde Z = 5-bromocitosina; TTAACGUTCG (SEQ ID NO: 80);
TUAACGUTCG (SEQ ID NO: 81) y TTAACGTTCG (SEQ ID NO: 82).
En algunas realizaciones, el polinucleótido inmunomodulador comprende la se
cuencia 5'-TCGTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 1). En otras realizaciones, el polinucleótido inmunomodulador comprende cual
quiera de las siguientes secuencias: 5'-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO:
19); y 5'-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3’ (SEQ ID NO: 132). También se describe en esta memoria un polinucleótido inmunomodulador que
comprende cualquiera de las secuencias siguientes: 5'-TGACTGTGAACGUTCGAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 2); 5'-TCGTCGAUCGUTCGTTAACGUTCG-3’ (SEQ ID NO: 3); 5'-TCGTCGAUCGTTCGTUAACGUTCG-3’ (SEQ ID NO: 4); 5'-TCGTCGUACGUTCGTTAACGUTCG-3’ (SEQ ID NO: 5); 5'-TCGTCGAXCGUTCGTTAACGUTCG-3’ (SEQ ID NO: 6), en donde X = 2amino-adenina; 5'-TGATCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 7); 5'-TGACTGTGAACGUTCGGTATGA-3’ (SEQ ID NO: 8); 5'-TGACTGTGACCGTTCGGTATGA-3’ (SEQ ID NO: 9); 5'-TGACTGTGATCGGTCGGTATGA-3’ (SEQ ID NO: 10); 5'-TCGTCGAACGTTCGTT-3’ (SEQ ID NO: 11); 5'-TCGTCGTGAACGTTCGAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 12); 5'-TCGTCGGTATCGGTCGGTATGA-3’ (SEQ ID NO: 13); 5'-CTTCGAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 14); 5'-CTGTGATCGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 15); 5'-TGACTGTGAACGGTCGGTATGA-3’ (SEQ ID NO: 16); 5'-TCGTCGGTACCGTTCGGTATGA-3’ (SEQ ID NO: 17); 5'-TCGTCGGAACCGTTCGGAATGA-3’ (SEQ ID NO: 18); 5'-TCGTCGTAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 20); 5'-TGACTGTGACCGTTCGGAATGA-3’ (SEQ ID NO: 21); 5'-TCGTCGAACGTTCGAACGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 22); 5'-TZGTZGAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 23), en donde Z = 5bromocitosina; 5'-TCGTZGAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 24), en donde Z = 5bromocitosina; 5'-TCGTCGACCGTTCGGAATGA-3’ (SEQ ID NO: 25); 5'-TZGTZGACCGTTCGGAATGA-3’ (SEQ ID NO: 26), en donde Z = 5
bromocitosina; 5'-TCGTZGACCGTTCGGAATGA-3’ (SEQ ID NO: 27), en donde Z = 5bromocitosina; 5'-TTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 28); 5'-CTTZGAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 29), en donde Z = 5bromocitosina; y 5'-TGATCGTCGAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 30).
También se describe en esta memoria una ISS de un polinucleótido inmunomodulador de la invención que puede comprender una secuencia de 10 meros de fórmula:
5'-X1 X2 A X3 Z G X4 T C G-3’ (SEQ ID NO: 65)
en donde Z es 5-bromocitosina, en donde X1 es T, G, C o Z (Z = 5bromocitosina), en donde X2 es T, G, A o U, en donde X3 es T, A o C, en donde X4 es T, G o U y en donde ISS no es 5'-TGAAZGTTCG-3' (SEQ ID NO: 66; Z= 5bromocitosina).
También se describe en esta memoria una ISS que comprende cualquiera de las secuencias siguientes (en donde Z es 5-bromocitosina): TGAAZGUTCG (SEQ ID NO: 83), TGACZGTTCG (SEQ ID NO: 84), TGATZGGTCG (SEQ ID NO: 85), GTATZGGTCG (SEQ ID NO: 86), GTACZGTTCG (SEQ ID NO: 87), GAACZGTTCG (SEQ ID NO: 88), GAAAZGUTCG (SEQ ID NO: 89), ZGACZGTTCG (SEQ ID NO: 90), CGAAZGTTCG (SEQ ID NO: 91), ZGAAZGTTCG (SEQ ID NO: 92), ZGAAZGUTCG (SEQ ID NO: 93), TTAAZGUTCG (SEQ ID NO: 94), TUAAZGUTCG (SEQ ID NO: 95) y TTAAZGTTCG (SEQ ID NO: 96).
También se describe en esta memoria un polinucleótido inmunomodulador que
comprende cualquiera de las secuencias siguientes (en donde Z es 5-bromocitosina): 5'-TGACTGTGAAZGUTCGAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 31); 5'-TCGTCGAAZGTTCGTTAAZGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 32); 5'-TGACTGTGAAZGUTCGGTATGA-3’ (SEQ ID NO: 33); 5'-TGACTGTGAAZGUTCGGAATGA-3’ (SEQ ID NO: 34); 5'-TCGTCGGAAAZGUTCGGAATGA-3’ (SEQ ID NO: 35); 5'-TCGTZGAAZGUTCGGAATGA-3’ (SEQ ID NO: 36).
Una ISS de un polinucleótido inmunomodulador puede comprender una secuencia de 10 meros de fórmula:
5'-X1 X2 A X3 C G X4 T C G-3' (SEQ ID NO: 133) en donde X1 es T, C o Z (Z = 5-bromocitosina), en donde X2 es T, G, A o U, en donde X3 es T, A o C, en donde X4 es T, G o U y en donde la fórmula no es 5'TGAACGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 63). También se describe en esta memoria un polinucleótido inmunomodulador que comprende cualquiera de las siguientes secuencias (en donde Z es 5-bromocitosina): 5'-TGACTGTGAAZGTTCGAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 37); 5'-TGACTGTGAAZGTTZGAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 38); 5'-TGACTGTGAAZGTTCCAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 39); 5'-TGACTGTGAACGTUCGAGATGA (SEQ ID NO: 40); 5'-TGACTGTGAACGXTCGAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 41), en donde X = 5bromouracilo; 5'-TGACTGTGAAZGTTCGTUATGA-3’ (SEQ ID NO: 42); 5'-TGACTGTGAAZGTTCGGTATGA-3’ (SEQ ID NO: 43); 5'-CTGTGAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 44); 5'-TZGTZGTGAACGTTCGAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 45); 5'-TCGTZGTGAACGTTCGAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 46); 5'-TGACTGTGAACGXTCGAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 47), en donde X = 4tiotimina; 5'-TGACTGTGAACXTTCXAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 48); en donde X = 6-tioguanina; 5'-TGACTGTGAACGTTCGTUATGA-3’ (SEQ ID NO: 49); 5'-TGACTGTGAACGTTCGTTATGA-3’ (SEQ ID NO: 50); 5'-TCGTTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 51); 5'-TGATTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 52); 5'-CTGTCAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 53); 5'-TCGTCGGAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 55); 5'-TCGTCGGACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 56); 5'-TCGTCGTACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 57); 5'-TCGTCGTTCGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 58).
En algunas realizaciones, en relación con cualquiera de las ISSs descritas en esta memoria, el polinucleótido inmunomodulador puede comprender adicionalmente una o más secuencias TCG y/o T, 5-bromocitosina, G, preferiblemente 5' de la ISS, por ejemplo, una o más secuencias TCG y/o T, 5-bromocitosina, G, 5' de la ISS; dos o más secuencias TCG y/o T, 5-bromocitosina, G, 5' de la ISS; o tres o más secuencias TCG y/o T, 5-bromocitosina, G, 5' de ISS. La(s) TCG(s) y/o T, 5-bromocitosina, G(s) pueden estar o no directamente adyacentes a la ISS. Ejemplos de estas secuencias se proporcionan en esta memoria. En esta memoria se describe un polinucleótido inmunomodulador que incluye cualquiera de las siguientes: 5'-TCGCGAACGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 97); 5'-TCGTCGAACGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 98); 5'-TZGCGAACGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 99; en donde Z = 5-bromocitosina); 5-TZGTZGAACGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 100; en donde Z = 5-bromocitosina); 5'-TCGTTAACGTTCG-3’ (SEQ ID NO: 101).
En algunos casos, la(s) secuencia(s) adicional(es) TCG y/o T, 5-bromocitosina G está inmediatamente 5' y adyacente a la ISS, es decir, 0 bases separan la TCG o T, 5-bromocitosina, G de la ISS, por ejemplo, como en 5'-T, C, G, ISS-3' o 5'-T, 5bromocitosina, G, ISS-3'. La ISS puede ser cualquiera de las fórmulas de 10-meros descritas en esta memoria. Los polinucleótidos inmunomoduladores que comprenden tales secuencias incluyen, por ejemplo, las SEQ ID NOs. 12, 18 y 46.
En otros casos, una base separa la(s) secuencia(s) adicional(es) 5 ' TCG y/o T, 5-bromocitosina, G de la ISS, por ejemplo, como en 5'-T, C, G, N, ISS-3' o 5'-T, 5bromocitosina, G, N, ISS-3’ (en donde N = cualquier base). Los polinucleótidos inmunomoduladores que comprenden tales secuencias incluyen, por ejemplo, las SEQ ID NOs. 19, 26 y 27. En otros casos, dos bases separan la(s) secuencia(s) adicional(es) 5' TCG y/o T, 5-bromocitosina, G de la ISS, por ejemplo, como en 5'-T, C, G, N, N, ISS-3' o 5'-T, 5-bromocitosina, G, N, N, ISS-3’ (en donde N = cualquier base). La ISS puede ser cualquiera de las fórmulas de 10-meros descritas en esta memoria.
En algunos de los polinucleótidos inmunomoduladores descritos en esta memoria, la(s) secuencia(s) adicional(es) TCG y/o T, 5-bromocitosina, G se crea por la adición de una T o una TC o una T, 5-bromocitosina al extremo 5’ de la ISS. Por ejemplo, en SEQ ID NO: 14, CG de la TCG adicional, son las dos primeras bases de la ISS de 10-meros (5'-CTTCGAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 14)). En otro ejemplo, la G de la TCG es la primera base de la ISS de 10-meros en SEQ ID NO: 20 (5'TCGTCGTAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 20)). Para polinucleótidos tales como éstos, la ISS puede ser una de las fórmulas de 10-meros descritas en esta memoria
(p. ej., SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 65 o SEQ ID NO: 133). Los polinucleótidos inmunomoduladores que comprenden tales secuencias incluyen, por ejemplo, SEQ ID NOs. 14, 19, 20, 36 y 55.
Por consiguiente, por ejemplo, el polinucleótido inmunomodulador comprende una T adyacente el extremo 5’ de la secuencia de 10-meros de ISS, SEQ ID NO: 62, en donde X1 es C y X2 es G. Véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 19. Por ejemplo, el polinucleótido inmunomodulador comprende una TC adyacente al extremo 5’ de la secuencia de 10-meros de la ISS, SEQ ID NO: 62, en donde X1 es G. Véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 55.
En ciertos casos, en los que la secuencia adicional TCG o T, 5-bromocitosina, G se crea por la adición de una T o de una TC o de una T, 5-bromocitosina en el extremo 5’ de la ISS, la secuencia adicional puede crear una secuencia TCGA o una T, 5-bromocitosina, G, A con la ISS. Por ejemplo, en SEQ ID NO: 19, la CGA de la TCGA adicional son las tres primeras bases de la ISS de 10-meros (5'TCGTCGAACGTTCGAGATG-3’ (SEQ ID NO: 19)). En otro ejemplo, la 5bromocitosina, G, A de la secuencia T, 5-bromocitosina, G, A, son las tres primeras bases de la ISS de 10-meros en SEQ ID NO: 36 (5'-TCGTZGAAZGUTCGGAATGA-3’ (SEQ ID NO: 36)). Por consiguiente, en esta memoria se describen polinucleótidos inmunomoduladores que comprendiendo una ISS y una secuencia TCGA o una T, 5-bromocitosina, G, A, en el extremo 5’ de la ISS.
En esta memoria se describe una ISS de un polinucleótido inmunomodulador que comprende la fórmula:
5'-(TCG)w Ny A X3 C G X4 T C G-3’ (SEQ ID NO: 126)
en donde w es 1-2, en donde y es 0-2, en donde N es cualquier base, en donde X3 es T, A o C, en donde X4 es T, G o U. Los polinucleótidos inmunomoduladores que comprenden tales secuencias de ISS incluyen, pero no están limitados a las mismas, las SEQ ID NOs. 1, 11, 12, 13, 17, 18, 14, 19, 55, 20, 22, 25, 28 y 30.
También se describe en esta memoria una ISS que comprende cualquiera de las siguientes secuencias:
TCGAACGTTCG (SEQ ID NO: 102), TCGTCGAACGTTCG (SEQ ID NO: 98),
TCGTGAACGTTCG (SEQ ID NO: 103), TCGGTATCGGTCG (SEQ ID NO:
104), TCGGTACCGTTCG (SEQ ID NO: 105), TCGGAACCGTTCG (SEQ ID
NO: 106), TCGGAACGTTCG (SEQ ID NO: 107), TCGTCGGAACGTTCG (SEQ
ID NO: 108), TCGTAACGTTCG (SEQ ID NO: 109), TCGTCGGAACGTTCG
(SEQ ID NO: 108), TCGACCGTTCG (SEQ ID NO: 110), TCGTCGACCGTTCG
(SEQ ID NO: 111), TCGTTAACGTTCG (SEQ ID NO: 101).
También se describe en esta memoria una ISS de un polinucleótido inmunomodulador que comprende la fórmula:
5'-(TXG)z Ny A X3 C G X4 T C G-3’ (SEQ ID NO: 127)
en donde z es 1-2, en donde y es 0-2, en donde X es 5-bromocitosina, en donde N es cualquier base, en donde X3 es T, A o C, en donde X4 es T, G o U. Los polinucleótidos inmunomoduladores que comprenden tales secuencias de ISS incluyen, pero no están limitados a las mismas, las SEQ ID NOs. 45, 23, 26 y 29.
También se describe en esta memoria una ISS que comprende cualquiera de las secuencias siguientes (en donde X es 5-bromocitosina): TXCTGAACGTTCG (SEQ ID NO: 112), TXCTXCTGAACGTTCG (SEQ ID NO: 113), TXCAACGTTCG (SEQ ID NO: 114), TXCTXCAACGTTCG (SEQ ID NO: 115), TXGACCGTTCG (SEQ ID NO: 116), TXCTXCACCGTTCG (SEQ ID NO: 54).
También se describe en esta memoria una ISS de un polinucleótido inmunomodulador que comprende la fórmula:
5'-T C G T X G Ny A X3 C G X4 T C G-3’ (SEQ ID NO: 128)
en donde y es 0-2, en donde X es 5-bromocitosina, en donde N es cualquier base, en donde X3 es T, A o C, en donde X4 es T, G o U. Los polinucleótidos inmunomoduladores que comprenden tales secuencias de ISS incluyen, pero no están limitados a las mismas, las SEQ ID NOs. 46, 24 y 27.
También se describe en esta memoria una ISS de un polinucleótido inmunomodulador que comprende cualquiera de las secuencias siguientes (en donde X es 5bromocitosina): TCGTXGTGAACGTTCG (SEQ ID NO: 117), TCGTXGAACGTTCG (SEQ ID NO: 118), TCGTXGACCGTTCG (SEQ ID NO: 119).
También se describe en esta memoria una ISS de un polinucleótido inmunomodulador que comprende la fórmula:
5'-(TCG)w Ny A X3 X G X4 T C G-3’ (SEQ ID NO: 129)
en donde w es 1-2, en donde y es 0-2, en donde N es cualquier base, en donde X3 es T, A o C, en donde X es 5-bromocitosina, en donde X4 es T, G o U. Los polinucleótidos inmunomoduladores que comprenden una tal ISS incluyen, pero no están limitados a la misma, SEQ ID NO: 35. En algunas realizaciones, la ISS comprende la secuencia TCGGAAAXGTTCG (SEQ ID NO: 120) o TCGAAXGTTCG (SEQ ID NO: 121), donde X es 5-bromocitosina.
También se describe en esta memoria una ISS de un polinucleótido inmunomodulador que comprende la fórmula:
5'-(TXG)z Ny A X3 X G X4 T C G-3’ (SEQ ID NO: 130)
en donde z es 1-2, en donde y es 0-2, en donde X es 5-bromocitosina, en donde N es cualquier base, en donde X3 es T, A o C, en donde X4 es T, G o U. En algunas realizaciones, la ISS comprende la secuencia TXGAAXGUTCG (SEQ ID NO: 122) o
TXGAAXGTTCG (SEQ ID NO: 123), en donde X es 5-bromocitosina.
También se describe en esta memoria una ISS de un polinucleótido inmunomodulador que comprende la fórmula:
5'-T C G T X G Ny A X3 X G X4 T C G-3’ (SEQ ID NO: 131)
en donde y es 0-2, en donde X es 5-bromocitosina, en donde N es cualquier base, en donde X3 es T, A o C, en donde X4 es T, G o U. Los polinucleótidos inmunomoduladores que comprenden tal secuencia de ISS incluyen, pero no están limitados a la misma, SEQ ID NO: 36. En algunas realizaciones, la ISS comprende la secuencia TCGTXGAAXGUTCG (SEQ ID NO: 124) o TCGTXGAAXGTTCG (SEQ ID NO: 125), en donde X es 5-bromocitosina.
Una ISS y/o un polinucleótido inmunomodulador pueden contener modificaciones. Las modificaciones de la ISS incluyen cualquier modificación conocida en la técnica, pero no están limitadas a las mismas, modificaciones del grupo 3'OH o 5'OH, modificaciones de la base de nucleótidos, modificaciones del componente de azúcar y modificaciones del grupo fosfato. Otras modificaciones tales se describen a continuación.
Una ISS y/o un polinucleótido inmunomodulador pueden ser un ADN monocatenario o bicatenario, así como un ARN monocatenario o bicatenario u otros polinucleótidos modificados. Una ISS puede incluir o no una o varias regiones palindrómicas, que pueden estar presentes en los motivos decaméricos descritos anteriormente o se pueden extender más allá de los motivos. Una ISS puede comprender secuencias flanqueantes adicionales, algunas de las cuales están descritas en esta memoria. Una ISS puede contener bases presentes en la naturaleza o modificadas, y no presentes en la naturaleza, y puede contener azúcar, fosfato, y/o los extremos modificados. Por ejemplo, las modificaciones del fosfato incluyen, pero no están limitadas a las mismas, fosfonato de metilo, fosforotioato, fosforamidato (con puentes o sin puentes), fosfotriéster y fosforoditioato y se pueden utilizar con cualquier combinación. Otros enlaces sin fosfato también se pueden utilizar. Preferiblemente, los oligonucleótidos de la presente invención comprenden cadenas principales fosforotioato. Las modificaciones del azúcar conocidas en la técnica, como análogos de 2’-alcoxi-ARN, análogos de 2’amino-ARN y quimeras de 2'-alcoxi- o amino-ARN/ADN, y otras descritas en esta memoria, también se pueden preparar y combinar con cualquier modificación del fosfato. Ejemplos de las modificaciones de las bases (descritas adicionalmente más abajo) incluyen, pero no están limitadas a las mismas, la adición de un resto aceptor de electrones a C-5 y/o C-6 de una citosina de la ISS (p. ej., 5-bromocitosina, 5-yodocitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina) y a C-5 y/o C-6 de un uracilo de la ISS (p. ej., 5yodouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo). Véase, por ejemplo, el documento de la solicitud de patente internacional número WO 99/62923.
La ISS y/o el polinucleótido inmunomodulador se pueden sintetizar empleando técnicas y equipos para la síntesis de ácido nucleico que son bien conocidos en la técnica, que incluyen, pero no están limitados a los mismos, los métodos enzimáticos, los métodos químicos, y la degradación de secuencias de oligonucleótidos más grandes. Véase, por ejemplo, Ausubel y col. (1987); y Sambrook y col. (1989). Cuando están ensambladas enzimáticamente, las unidades individuales se pueden ligar, por ejemplo, con una ligasa tal como una ligasa de ADN T4 o una ligasa de ARN. Documento de patente de EE.UU. n� 5.124.246. La degradación del oligonucleótido se puede realizar mediante la exposición de un oligonucleótido a una nucleasa, según se ejemplifica en el documento de patente de EE.UU. n� 4.650.675.
La ISS y/o el polinucleótido inmunomodulador también se puede aislar empleando procedimientos de aislamiento de polinucleótidos convencionales. Tales procedimientos incluyen, pero no están limitados a los mismos, la hibridación de sondas con genotecas genómicas o de ADNc para detectar las secuencias de nucleótidos compartidas, el rastreo con anticuerpos de las genotecas de expresión para detectar las características estructurales compartidas y la síntesis de secuencias naturales particulares, mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
El polinucleótido inmunomodulador circular se puede aislar, se puede sintetizar por métodos recombinantes o se puede sintetizar químicamente. Cuando el IMP circular se obtiene a través del aislamiento o por métodos recombinantes, el IMP será preferiblemente un plásmido. La síntesis química de oligonucleótidos circulares más pequeños se puede realizar usando cualquier método descrito en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Gao y col. (1995) Nucleic Acids Res. 23:2025-2029; y Wang y col. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2326-2333.
Las técnicas para preparar los oligonucleótidos y los oligonucleótidos modificados son conocidas en la técnica. El ADN o el ARN presente en la naturaleza, que contiene enlaces fosfodiéster, se sintetiza generalmente acoplando secuencialmente la fosforamidita del nucleósido adecuado al grupo 5'-hidroxi del oligonucleótido en crecimiento, fijado a un soporte sólido en el extremo 3’, seguido por la oxidación del triéster de fosfito intermedio en un triéster fosfato. Una vez que la secuencia de oligonucleótidos deseada ha sido sintetizada, el oligonucleótido se retira del soporte, los grupos triéster fosfato se desprotegen en diésteres fosfato y las bases de nucleósidos se desprotegen empleando amonio acuoso u otras bases. Véase, por ejemplo, Beaucage (1993) “Oligodeoxyribonucleotide Synthesis" en “Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties” (Agrawal, compilador) Humana Press, Totowa, NJ; Warner y col. (1984) DNA 3:401 y el documento de patente de EE.UU. n� 4.458.066.
La ISS y/o el polinucleótido inmunomodulador también pueden contener oligonucleótidos modificados con fosfato, algunos de los cuales son conocidos por estabilizar el polinucleótido. Por consiguiente, algunas realizaciones incluyen polinucleótidos inmunomoduladores estabilizados. La síntesis de polinucleótidos que contienen enlaces fosfato modificados o enlaces sin fosfato, también es conocida en la técnica. Para una revisión, véase Matteucci (1997) “Oligonucelotide Analogs: an Overview" en ”Oligonucleotides as Therapeutic Agents”, (D. J. Chadwick y G. Cardew, compiladores.) John Wiley and Sons, Nueva York, NY. El derivado de fósforo (o el grupo fosfato modificado) que se puede unir al azúcar o a un resto análogo del azúcar en los oligonucleótidos de la presente invención, puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfonato, fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato o similares. La preparación de los análogos de fosfato mencionados anteriormente, y su incorporación en los nucleótidos, nucleótidos modificados y oligonucleótidos, por sí misma, también es conocida y no es necesaria una descripción detallada. Peyrottes y col. (1996) Nucleic Acids Res. 24:1841-1848; Chaturvedi y col. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; y Schultz y col. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973. Por ejemplo, la síntesis de oligonucleótidos fosforotioato es similar a la descrita anteriormente para los oligonucleótidos presentes en la naturaleza, salvo que la etapa de oxidación está reemplazada por una etapa de sulfuración (Zon (1993) “Oligonucleoside Phosphorothioates" en “Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties” (Agrawal, compilador), Humana Press, págs. 165-190). De forma similar, la síntesis de otros análogos de fosfato, tales como fosfotriester (Miller y col. (1971) JACS 93:6657-6665), fosforamidatos que no forman puentes (Jager y col. (1988) Biochem. 27:7247-7246), fosforamidiatos N3’ a P5’ (Nelson y col. (1997) JOC 62:7278-7287) y fosforoditioatos (documento de patente de EE.UU. n� 5.453.496) también se han descrito. Otros oligonucleótidos mo
dificados que no se basan en fósforo, también se pueden utilizar (Stirchak y col. (1989) Nucleic Acids Res. 17:6129-6141). Los oligonucleótidos con las cadenas principales fosforotioato pueden ser más inmunógenos que los que tienen cadenas principales de fosfodiéster y parecen ser más resistentes a la degradación después de la inyección en el hospedador. Braun y col. (1988) J. Immunol. 141:2084-2089; y Latimer y col. (1995) Mol. Immunol. 32:1057-1064.
La ISS y/o los polinucleótidos inmunomoduladores utilizados en la invención pueden comprender uno o varios ribonucleótidos (que contienen ribosa como el único componente de azúcar o el principal), desoxirribonucleótidos (que contienen desoxirribosa como el componente de azúcar principal), o, tal y como es conocido en la técnica, azúcares modificados o análogos de azúcar se pueden incorporar en la ISS y/o en el polinucleótido inmunomodulador. Así, además de la ribosa y de la desoxirribosa, el resto de azúcar puede ser pentosa, desoxipentosa, hexosa, desoxihexosa, glucosa, arabinosa, xilosa, lixosa, y un grupo ciclopentilo "análogo" al azúcar. El azúcar puede estar en forma de piranosilo o en forma de furanosilo. En la ISS y/o el IMP, el resto de azúcar es preferiblemente furanosido de ribosa, desoxirribosa, arabinosa o 2'-0alquilribosa, y el azúcar puede estar unido a las bases heterocíclicas respectivas, con la configuración � o � anomérica. Las modificaciones del azúcar incluyen, pero no están limitadas a las mismas, análogos de 2’-alcoxi-ARN, análogos de 2’-amino-ARN y quimeras de 2'-alcoxi- o amino-ARN/ADN. Por ejemplo, una modificación del azúcar en la ISS y/o en el polinucleótido inmunomodulador incluye, pero no está limitada a la misma, 2-aminodesoxiadenosina. La preparación de estos azúcares o análogos de azúcares y de los “nucleósidos” respectivos, en donde tales azúcares o análogos están unidos a una base heterocíclica (base de ácido nucleico) ya es conocida, por lo que no es necesario describirla en esta memoria, excepto hasta el punto que una preparación tal pueda pertenecer a cualquier ejemplo específico. Las modificaciones del azúcar también se pueden realizar y combinar con cualquier modificación del fosfato en la preparación de una ISS y/o de un polinucleótido inmunomodulador.
Las bases heterocíclicas, o las bases de ácido nucleico, que se incorporan en la ISS y/o en el polinucleótido inmunomodulador pueden ser bases púricas o pirimidínicas principales presentes en la naturaleza, (a saber uracilo, timina, citosina, adenina y guanina, tal y como se ha mencionado anteriormente), así como modificaciones presentes en la naturaleza y sintéticas de dichas bases principales.
Los expertos en la materia reconocerán que una gran cantidad de nucleósidos no naturales "sintéticos", que comprenden diferentes bases heterocíclicas y diferentes restos de azúcar (y de análogos de azúcar) están disponibles en la técnica, y mientras que se satisfagan otros criterios de la presente invención, la ISS y/o el polinucleótido inmunomodulador pueden incluir una o varias bases heterocíclicas distintas de los componentes de las cinco bases principales de los ácidos nucleicos presentes en la naturaleza. Preferiblemente, sin embargo, la base heterocíclica en la ISS y/o en el IMP incluye, pero no está limitada a las mismas, los grupos uracil-5-ilo, cytosin-5-ilo, adenin-7-ilo, adenin-8-ilo, guanin-7-ilo, guanin-8-ilo, 4-aminopirrolo [2.3-d] pirimidin-5-ilo, 2amino-4-oxopirolo [2,3-d] pirimidin-5-ilo, 2-amino-4-oxopirrolo [2.3-d] pirimidin-3-ilo, en donde las purinas están unidas al resto del azúcar de la ISS y/o del IMP a través de la posición 9, las pirimidinas a través de la posición 1, las pirrolopirimidinas a través de la posición 7 y las pirazolopirimidinas a través de la posición 1.
La ISS y/o el polinucleótido inmunomodulador pueden comprender por lo menos una base modificada. Tal y como se utiliza en esta memoria, la expresión "base modificada" es sinónimo de "análogo de la base", por ejemplo, una “citosina modificada" es sinónimo de "análogo de citosina”. De forma semejante, los nucleósidos o los nucleótidos “modificados" se definen en esta memoria como sinónimos de “análogos” de nucleósidos o de nucleótidos. Ejemplos de modificaciones de las bases incluyen, pero no están limitadas a las mismas, la adición de un resto aceptor de electrones al C-5 y/o al C-6 de una citosina de la ISS y/o del IMP. Preferiblemente, el resto aceptor de electrones es un átomo de halógeno. Tales citosinas modificadas pueden incluir, pero no están limitadas a las mismas, azacitosina, 5-bromocitosina, bromouracilo, 5clorocitosina, citosina clorada, ciclocitosina, arabinósido de citosina, 5-fluorocitosina, fluoropirimidina, fluorouracilo, 5,6-dihidrocitosina, 5-yodocitosina, hidroxiurea, yodouracilo, 5-nitrocitosina, uracilo y cualquier otro análogo de pirimidina o una pirimidina modificada. Otros ejemplos de las modificaciones de las bases incluyen, pero no están limitados a los mismos, la adición de un resto aceptor de electrones a un C-5 y/o un C6 de un uracilo de la ISS y/o del polinucleótido inmunomodulador. Preferiblemente, el resto aceptor de electrones es un átomo de halógeno. Tales uracilos modificados pueden incluir, pero no están limitados a los mismos, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5fluorouracilo, 5-yodouracilo.
Otros ejemplos de modificaciones de las bases incluyen la adición de uno o de varios grupos tiol a la base que incluyen, pero no están limitados a los mismos, 6-tioguanina, 4-tio-timina y 4-tio-uracilo.
Se prefiere que las citosinas de los motivos CG presentes en la ISS no estén metiladas, aunque se contemplan otras modificaciones y/o adiciones. Sin embargo, en determinadas realizaciones, la ISS puede contener una o varias citosinas metiladas. En tales realizaciones, se prefiere que las citosinas de la secuencia de 10-meros de la ISS (es decir, la C de la CG y/o las porciones TCG de las fórmulas descritas en esta memoria, p. ej., SEQ ID NOs.: 62, 65, 126, 127, 128, 129, 130, 131 y 133) no estén metiladas en la posición C5. Sin embargo, la metilación en la posición N4 está contemplada en las ISSs que comprenden citosinas metiladas.
La preparación de los nucleósidos con modificación de las bases y la síntesis de oligonucleótidos modificados usando dichos nucleósidos con bases modificadas como precursores, se ha descrito, por ejemplo, en los documentos de patentes de EE.UU. n�s. 4.910.300, 4.948.882 y 5.093.232. Estos nucleósidos con bases modifica
das se han diseñado de modo que se puedan incorporar por síntesis química en el extremo terminal o en posiciones internas de un oligonucleótido. Tales nucleósidos con las bases modificadas, presentes en una posición terminal o interna de un oligonucleótido, pueden servir como sitios para la fijación de un péptido u otro antígeno. Los nucleósidos modificados en su resto de azúcar también se han descrito (que incluyen, pero no están limitados a, p. ej., los documentos de patentes de EE.UU. n�s. 4.849.513, 5.015.733, 5.118.800, 5.118.802) y se pueden utilizar de forma semejante.
En algunas realizaciones, un polinucleótido inmunomodulador es menor que aproximadamente cualquiera de las siguientes longitudes (en bases o pares de bases): 50; 25. En algunas realizaciones, un polinucleótido inmunomodulador es mayor que aproximadamente cualquiera de las siguientes longitudes (en bases o pares de bases): 20; 25; 30; 40. Alternativamente, el polinucleótido inmunomodulador puede estar dentro de cualquiera de los intervalos de tamaño que tienen un límite superior de 50 o 25, y un límite inferior seleccionado independientemente de 20; 25; 30; 40, en donde el límite inferior es menor que el límite superior.
También se describen en esta memoria métodos para preparar los polinucleótidos inmunomoduladores descritos en esta memoria. Los métodos pueden ser cualquiera de los descritos en esta memoria. Por ejemplo, el método podría ser sintetizar el polinucleótido que contiene la ISS (por ejemplo, empleando una síntesis en estado sólido) y puede comprender además cualquier etapa(s) de purificación. Los métodos de purificación son conocidos en la técnica. Otros métodos de preparación incluyen combinar un polinucleótido inmunomodulador y un antígeno.
Antígeno
Cualquier antígeno se puede coadministrar con un polinucleótido inmunomodulador y/o se puede utilizar en composiciones que comprenden un polinucleótido inmunomodulador y un antígeno (y en la preparación de estas composiciones).
En algunas realizaciones, el antígeno es un alérgeno. Ejemplos de alérgenos recombinantes se proporcionan en la Tabla 1. La preparación de muchos alérgenos es bien conocida en la técnica, incluyendo, pero sin estar limitada a, la preparación de antígeno E de polen de ambrosía (Amb a I) (Rafnar y col. (1991) J. Biol. Chem. 266: 229-1236), alérgeno de hierba Lol p 1 (Tamborini y col. (1997) Eur. J. Biochem. 249:886-894), alérgenos principales de los ácaros Der pl y Der PII (Chua y col. (1988)
J. Exp. Med. 167:175-182; Chua y col. (1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91:124129), alérgeno del gato doméstico Fel d I (Rogers y col. (1993) Mol. Immunol. 30:559
5 568), polen de abedul Bet vl (Breiteneder y col. (1989) EMBO J. 8:1935-1938), alérgenos del cedro japonés Cry j 1 y Cry j 2 (Kingetsu y col. (2000) Immunology 99:625629), y antígenos proteicos de otros pólenes de árboles (Elsayed y col. (1991) Scand.
J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204:17-31). Tal y como se ha indicado, los alérgenos que proceden de los árboles son conocidos, incluyendo los alérgenos del abedul, el enebro 10 y el cedro japonés. La preparación de los antígenos proteicos del polen de la hierba para la administración in vivo, ya ha sido descrita.
En algunas realizaciones, el alérgeno es un alérgeno de los alimentos, incluyendo pero sin estar limitados a, el alérgeno del cacahuete, por ejemplo Ara h I (Stanley y col. (1996) Adv. Exp. Med. Biol. 409:213-216); el alérgeno de la nuez, por ejem
15 plo, Jug r I (Tueber y col. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 101:807-814); el alérgeno de la nuez de Brasil, por ejemplo, albúmina (Pastorello y col. (1998) J: Allergy Clin. Immunol. 102:1021-1027; el alérgeno del camarón, por ejemplo, Pen a I (Reese y col. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:240-242); el alérgeno del huevo, por ejemplo, ovomucoide (Crooke y col. (1997) J. Immunol. 159:2026-2032); el alérgeno de la le
20 che, por ejemplo, �-lactoglobina bovina (Selot y col. (1999) Clin. Exp. Allergy 29:10551063); el alérgeno de los peces, por ejemplo, parvalbúminas (Van Do y col. (1999) Scand. J. Immunol. 50:619-625; Galland y col. (1998) J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 706:63-71.). En algunas realizaciones, el alérgeno es un alérgeno del látex, incluyendo pero no estando limitado a, Hev b 7 (Sowka y col. (1998) Eur. J. Biochem.
25 255:213-219). La Tabla 1 muestra una lista ejemplar de los alérgenos que se pueden utilizar.
TABLA 1
ALÉRGENOS RECOMBINANTES
Grupo
Alérgeno Referencia
ANIMALES:
CRUSTACEOS
Camarón/langosta
tropomiosina Pan s I Leung y col. (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 98:954-961 Leung y col. (1998) Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 7:2-20
INSECTOS
Hormiga
Sol i 2 (venom) Schmidt y col. J Allergy Clin Immunol., 1996, 98:82-8
Abeja
Fosfolipasa A2 (PLA) Muller y col. J Allergy Clin Immunol, 1995,
96:395-402
Forster y col. J Allergy Clin Immunol, 1995,
95:1229-35
Muller y col. Clin Exp Allergy, 1997, 27:915-20
Hialuronidasa (Hya)
Soldatova y col. J Allergy Clin Immunol, 1998,
101:691-8
Cucaracha
Bla g Bd90K Helm y col. J Allergy Clin Immunol, 1996,
98:172-180
Bla g 4 (calicina a)
Vailes y col. J Allergy Clin Immunol, 1998,
101:274-280
S-transferasa de glutatión
Arruda y col. J Biol Chem, 1997, 272:20907-12
Per a 3
Wu y col. Mol Immunol, 1997, 34:1-8
Acaro
Der p 2 (alérgeno prin- Lynch y col. J Allergy Clin Immunol, 1998,
cipal)
101:562-4
Hakkaart y col. Clin Exp Allergy, 1998, 28:169
74
Hakkaart y col. Clin Exp Allergy, 1998, 28:45-52
Hakkaart y col. Int Arch Allergy Immunol, 1998,
115(2):150-6
Mueller y col. J Biol Chem, 1997, 272:26893-8
variante Der p2
Smith y col. J Allergy Clin Immunol, 1998,
101:423-5
Der f2
Yasue y col. Clin Exp Immunol, 1998, 113:1-9
Yasue y col. Cell Immunol, 1997, 181:30-7
Der p10
Asturias y col. Biochim Biophys Acta, 1998,
1397:27-30
Tyr p 2
Eriksson y col. Eur J Biochem, 1998
Avispón
Antígeno 5 aka Dol m V (venom) Tomalski y col. Arch Insect Biochem Physio, 1993, 22:303-13
Mosquito
Aed a I (apirasa salivar) Xu y col. Int Arch Allergy Immunol, 1998,
115:245-51
Avispa
antígeno 5, hialuronida- King y col. J Allergy Clin Immunol, 1996, 98:588
sa y fosfolipasa (venom)
600
MAMÍFEROS
Gato
Fel d I Slunt y col. J Allergy Clin Immunol, 1995, 95:
1221-8
Hoffmann y col. (1997) J Allergy Clin Immunol
99:227-32
Hedlin Curr Opin Pediatr, 1995, 7:676-82
Vaca
Bos d 2 (dander; lipocalina a) �-lactoglobulina (BLG, alérgeno principal de la leche de vaca) Zeiler y col. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100:721-7 Rautiainen y col. Biochem Bioph. Res Comm., 1998, 247:746-50 Chatel y col. Mol Immunol, 1996, 33:1113-8 Lehrer y col. Crit Rev Food Sci Nutr, 1996, 36:553-64
Perro
Can f I y Can f 2, lipo- Konieczny y col. Immunology, 1997, 92:577-86
calinas salivares
Spitzauer y col. J Allergy Clin Immunol, 1994,
93:614-27
Vrtala y col. J Immunol, 1998, 160:6137-44
Caballo
Equ c1 (alérgeno principal, lipocalina a) Gregoire y col. J Biol Chem, 1996, 271:32951-9
Ratón
protein urinaria del ratón (MUP) Konieczny y col. Immunology, 1997, 92:577-86
OTROS ALÉRGENOS MAMÍFEROS
DE
Insulina
Ganz y col. J Allergy Clin Immunol, 1990, 86:4551 Grammer y col. J Lab Clin Med, 1987, 109:141-6 Gonzalo y col. Allergy, 1998, 53:106-7
Interferones
interferón alfa 2c Detmar y col. Contact Dermatis, 1989, 20:14950
MOLUSCOS
topomiosina Leung y col. J Allergy Clin Immunol, 1996, 98: 954-61
ALÉRGENOS VEGETALES :
Cebada
Hor v 9 Astwood y col. Adv Exp Med Biol, 1996, 409: 269-77
Abedul
alérgeno del polen, Bet v 4 rBet v 1 Bet v 2: (profilina) Twardosz y col. Biochem Bioph. Res Comm., 1997, 23 9:197 Pauli y col. J Allergy Clin Immunol, 1996, 97:1100-9 van Neerven y col. Clin Exp Allergy, 1998, 28:423-33 Jahn-Schmid y col. Immunotechnology, 1996, 2: 103-13 Breitwieser y col. Biotechniques, 1996, 21:91825 Fuchs y col. J Allergy Clin Immunol, 1997,100:3 56-64
Nuez de Brasil
globulina Bartolome y col. Allergol Immunopathol, 1997, 25:135-44
Cereza
Pru a I (alérgeno principal) Scheurer y col. Mol Immunol, 1997, 34:619-29
Maíz
ZmI3 (polen) Heiss y col. FEBS Lett, 1996, 381:217-21 Lehrer y col. Int Arch Allergy Immunol, 1997,113: 122-4
Hierba
Phl p 1, PhI p 2, Phl p 5 (polen de Phleum pratense) Hol 1 5 polen de cañota alérgeno de pasto azul Cyn d 7 grama Cyn d 12 (profilina a) Bufe y col. Am J Respir Crit Care Med, 1998, 57:1269-76 Vrtala y col. J Immunol Jun 15,1998,160:613744 Niederberger y col. J Allergy Clin Immun., 1998, 101: 258-64 Schramm y col. Eur J Biochem, 1998, 252:200-6 Zhang y col. J Immunol, 1993,151: 791-9 Smith y col. Int Arch Allergy Immunol, 1997, 114:265-71 Asturias y col. Clin Exp Allergy, 1997, 27:130713 Fuchs y col. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100:356-64
Cedro japonés
Jun a 2 (Juniperus ashei) Cry j 1, Cry j 2 (Cryptomeria japonica) Yokoyama y col. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 275:195-202 Kingetsu y col. Immunology, 2000, 99:625-629
Enebro
Jun o 2 (polen) Tinghino y col. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:772-7
Látex
Hev b 7 Sowka y col. Eur J Biochem, 1998, 255:213-9
Fuchs y col. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100:3 56-64
Mercurialis
Mer a I (profilina) Vallverdu y col. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:3 63-70
Mostaza (amarilla)
Sin a I (semilla) Gonzalez de la Pena y col. Biochem Bioph. Res Comm.,1993, 190:648-53
Canola
Bra r I alérgeno del polen Smith y col. Int Arch Allergy Immunol, 1997, 114 :265-71
Cacahuete
Ara h I Stanley y col. Adv Exp Med Biol, 1996, 409:2136 Burks y col. J Clin Invest, 1995, 96:1715-21 Burks y col. Int Arch Allergy Immunol, 1995, 107: 248-50
Poa pratensis
Poa p9 Parronchi y col. Eur J Immunol, 1996, 26:697703 Astwood y col. Adv Exp Med Biol, 1996, 409:269-77
Ambrosía
Amb a I Sun y col. Biotechnology Aug, 1995, 13:779-86 Hirschwehr y col. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:196-206 Casale y col. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100:110-21
Centeno
Lol p I Tamborini y col. Eur J Biochem, 1997, 249:88694
Nuez
Jug r I Teuber y col. J Allergy Clin Immun., 1998, 101:807-14
Trigo
alérgeno Fuchs y col. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100:356-64 Donovan y col. Electrophoresis, 1993, 14:917-22
HONGOS:
Aspergillus
Asp f I, Asp f 2, Asp f 3, Asp f 4, rAsp f 6 Superóxido dismutasa de manganeso (MNSOD) Crameri y col. Mycoses, 1998, 41 Supl 1:56-60 Hemmann y col. Eur J Immunol, 1998, 28:115560 Banerjee y col. J Allergy Clin Immunol, 1997, 99:821-7 Crameri Int Arch Allergy Immunol, 1998, 115:99114 Crameri y col. Adv Exp Med Biol, 1996, 409:1116 Moser y col. J Allergy Clin Immunol, 1994, 93:111 Mayer y col. Int Arch Allergy Immunol,1997, 113:213-5
Blomia
alérgeno Caraballo y col. Adv Exp Med Biol, 1996, 409:81-3
Penicillinium
alérgeno Shen y col. Clin Exp Allergy, 1997, 27:682-90
Gotzi
Psi c 2 Horner y col. Int Arch Allergy Immunol, 1995, 107: 298-300
En algunas realizaciones, el antígeno procede de un agente infeccioso, que incluyen agentes infecciosos de protozoos, bacterias, hongos (que incluyen los unicelulares y los multicelulares), y virus. Ejemplos de antígenos víricos adecuados se han descrito en esta memoria y se conocen en la técnica. Las bacterias incluyen Hemophilus influenza, Mycobacterium tuberculosis y Bordetella pertussis. Los agentes infecciosos de protozoos incluyen el plasmodio de la malaria, especies de Leishmania, especies de Trypanosoma y especies de Schistosoma. Los hongos incluyen Candida albicans.
En algunas realizaciones, el antígeno es un antígeno vírico. Los antígenos víricos polipeptídicos incluyen, pero no están limitados a los mismos, proteínas del VIH tales como las proteínas gag de VIH (que incluyen, pero no están limitadas a, la proteína de anclaje a la membrana (MA), la proteína de la cápsida del núcleo (CA) y la proteína de la nucleocápsida (NC)), la polimerasa del VIH, la proteína de la matriz del virus de la gripe (M) y la proteína de la nucleocápsida (NP) del virus de la gripe, el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), la proteína del núcleo de la hepatitis B (HBcAg), la proteína de la hepatitis e (HBeAg), la polimerasa de ADN de la hepatitis B, los antígenos de la hepatitis C, y similares. Referencias que describen la vacunación contra la gripe incluyen Scherle y Gerhard (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:44464450; Scherle y Gerhard (1986) J. Exp. Med. 164:1114-1128; Granoff y col. (1993) Vaccine 11:S46-51; Kodihalli y col. (1997) J. Virol. 71:3391-3396; Ahmeida y col. (1993) Vaccine 11:1302-1309; Chen y col. (1999) Vaccine 17:653-659; Govorkova y Smirnov (1997) Acta Virol. 41:251-257; Koide y col. (1995) Vaccine 13:3-5; Mbawuike y col. (1994) Vaccine 12:1340-1348; Tamura y col. (1994) Vaccine 12:310-316; Tamura y col. (1992) Eur. J. Immunol. 22:477-481; Hirabayashi y col. (1990) Vaccine 8:595
599. Otros ejemplos de polipéptidos antigénicos son los antígenos específicos de grupo o de subgrupo, los cuales se conocen para una variedad de agentes infecciosos, que incluyen, pero no están limitados a, adenovirus, virus del herpes simplex, virus del papiloma, virus respiratorio sincitial y poxvirus.
Tal y como se muestra en el Ejemplo 3 más abajo, la administración de los polinucleótidos que contiene ISS junto con un antígeno del virus de la hepatitis, un antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), da como resultado unos títulos incrementados de los anticuerpos anti-HBsAg en primates, cuando se compara con la administración de HBsAg solo.
Muchos péptidos antigénicos y proteínas son conocidos y están disponibles en la técnica; otros se pueden identificar con técnicas convencionales. Para la inmunización contra la formación de tumores o el tratamiento de tumores existentes, los péptidos inmunomoduladores pueden incluir células tumorales (vivas o irradiadas), extractos de células tumorales o subunidades proteicas de antígenos tumorales, tales como Her-2/neu, Mart1, antígeno carcinoembrionario (CEA), gangliósidos, glóbulo de grasa de la leche humana (HMFG), mucina (MUC1), antígenos MAGE, antígenos BAGE, antígenos GAGE, gp100, antígeno específico de la próstata (PSA), y tirosinasa. Las vacunas para la contracepción con base inmune se pueden formar incluyendo proteínas del esperma administradas con ISS. Lea y col. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1307: 263.
Los virus atenuados e inactivos son adecuados para el uso en esta memoria como antígeno. La preparación de estos virus es bien conocida en la técnica y muchos están comercialmente disponibles (véase, p. ej., Physician’s Desk Reference (1998) 52ª edición, Medical Economics Company, Inc.). Por ejemplo, el virus de la poliomielitis está disponible como IPOL® (Pasteur Merieux Connaught) y ORIMUNE® (Lederle Laboratories), el virus de la hepatitis A como VAQTA® (Merck), el virus del sarampión como ATTENUVAX® (Merck), el virus de las paperas como MUMPSVAX® (Merck) y el virus de la rubeola como MERUVAX®II (Merck). Además, los virus atenuados e inactivos tales como VIH-1, VIH-2, virus de herpes simplex, virus de la hepatitis B, rotavirus, virus del papiloma humano y no humano y virus lento del cerebro, pueden proporcionar los antígenos peptídicos.
En algunas realizaciones, el antígeno comprende un vector vírico, tal como virus vaccinia, adenovirus y el poxvirus de los canarios.
Los antígenos se pueden aislar desde su fuente, usando técnicas de purificación conocidas en la técnica o, más convenientemente, se pueden producir empleando métodos recombinantes.
Los péptidos antigénicos pueden incluir péptidos naturales purificados, péptidos sintéticos, proteínas recombinantes, extractos proteicos brutos, virus atenuados o inactivos, células, microorganismos, o fragmentos de tales péptidos. Los péptidos inmunomoduladores pueden ser naturales o se pueden sintetizar química o enzimáticamente. Cualquier método de síntesis química conocido en la técnica es adecuado. La síntesis de péptidos en fase de solución se puede utilizar para construir péptidos de tamaño moderado o para la construcción química de péptidos, la síntesis en fase sólida se puede emplear. Atherton y col. (1981) Hoppe Seilers Z. Physiol. Quím. 362:833
839. Las enzimas proteolíticas también se pueden utilizar para acoplar aminoácidos para producir péptidos. Kullmann (1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Inc. Alternativamente, el péptido se puede obtener usando la maquinaria bioquímica de una célula, o por aislamiento de una fuente biológica. Las técnicas de ADN recombinante se pueden emplear para la producción de péptidos. Hames y col. (1987) “Transcription and Translation: A Practical Approach”, IRL Press. Los péptidos también se pueden aislar empleando técnicas convencionales tales como la cromatografía de afinidad.
Los antígenos son preferiblemente péptidos, lípidos (p. ej., esteroles que excluyen el colesterol, los ácidos grasos y los fosfolípidos), polisacáridos tales como los utilizados en las vacunas contra el H. influenza, gangliósidos y glicoproteínas. Estos se pueden obtener a través de distintos métodos conocidos en la técnica, que incluyen el aislamiento y la síntesis usando métodos químicos y enzimáticos. En determinados casos, tales como para muchos esteroles, ácidos grasos y fosfolípidos, las porciones antigénicas de las moléculas están disponibles comercialmente.
Ejemplos de antígenos víricos útiles en las composiciones y los métodos objeto, que usan las composiciones incluyen, pero no están limitados a los mismos, antígenos del VIH. Tales antígenos incluyen, pero no están limitados a los mismos, los antígenos obtenidos a partir de las glicoproteínas de la envuelta del VIH que incluyen, pero no están limitadas a las mismas, gp160, gp120 y gp41. Numerosas secuencias de los genes y de los antígenos de VIH son conocidas. Por ejemplo, la base de datos de la secuencia del VIH del Laboratorio Nacional de Los Alamos, recoge, organiza y anota las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del VIH. Esta base de datos es accesible vía Internet, en http://hiv-web.lanl.gov/, y en una publicación anual, véase “Human Retroviruses and AIDS Compendium” (por ejemplo, la edición del año 2000).
Los antígenos que provienen de agentes infecciosos se pueden obtener empleando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de extractos víricos o bacterianos naturales, a partir de células infectadas con el agente infeccioso, a partir de polipéptidos purificados, a partir de polipéptidos producidos de forma recombinante y/o como péptidos sintéticos.
ISS-Antígeno
Cuando se utiliza con un antígeno, la ISS se puede administrar con un antígeno según una variedad de formas. En algunas realizaciones, un polinucleótido que contiene ISS, y un antígeno se pueden administrar espacialmente uno próximo del otro, o como una mezcla por adición (es decir, en solución). Tal y como descrito más abajo, la cercanía espacial se puede realizar según una variedad de formas, que incluyen la conjugación (enlace), la encapsidación, mediante la fijación a una plataforma o la adsorción sobre una superficie. Generalmente, y lo más preferible, un polinucleótido que contiene una ISS, y un antígeno están asociados de forma próxima a una distancia eficaz para potenciar la respuesta inmune generada, comparada con la administración
de la ISS y del antígeno como una mezcla por adición.
En algunas realizaciones, el polinucleótido que contiene la ISS está conjugado con el antígeno. La porción de ISS puede estar acoplada con la porción del antígeno de un conjugado según una variedad de maneras, que incluyen las interacciones covalentes y/o no covalentes.
El enlace entre las porciones se puede realizar en el extremo 3' o 5' de la ISS,
o en una base modificada de forma conveniente en una posición interna en la ISS. Si el antígeno es un péptido y contiene un grupo reactivo adecuado (p. ej., un éster de Nhidroxisuccinimida) puede reaccionar directamente con el grupo amino N4 de los residuos de citosina. Dependiendo del número y de la ubicación de los residuos de citosina en la ISS, se puede conseguir un acoplamiento específico en uno o en varios residuos.
Alternativamente, oligonucleósidos modificados, tales como los que se conocen en la técnica, se pueden incorporar en un extremo, o en posiciones internas en la ISS. Estos pueden contener grupos funcionales bloqueados que, cuando se desbloquean, son reactivos con una variedad de grupos funcionales que pueden estar presentes en el antígeno de interés o fijados al mismo.
Cuando el antígeno es un péptido o un polipéptido, esta porción del conjugado se puede fijar químicamente al extremo 3’ de la ISS a través de un soporte sólido. Por ejemplo, la porción de la ISS se puede añadir a una porción del polipéptido que se ha sintetizado previamente sobre un soporte. Haralambidis y col. (1990a) Nucleic Acids Res. 18:493-499; y Haralambidis y col. (1990b) Nucleic Acids Res.18:501-505. Alternativamente, la ISS se puede sintetizar de modo que esté conectada a un soporte sólido a través de un enlazador escindible que se extiende desde el extremo 3'. Después de la escisión química de la ISS del soporte, un grupo tiol terminal se deja en el extremo terminal 3’ del oligonucleótido (Zuckermann y col. (1987) Nucleic Acids Res. 15:53055321; y Corey y col. (1987) Science 238:1401-1403)) o un grupo amino terminal se deja en el extremo 3’ del oligonucleótido (Nelson y col. (1989) Nucleic Acids Res.17:1781-1794). La conjugación de la ISS modificada en amino con grupos amino del péptido, se puede realizar del modo descrito en Benoit y col. (1987) Neuromethods 6:43-72. La conjugación de la ISS modificada con tiol, con grupos carboxilo del péptido se puede realizar tal y como se describe en Sinah y col. (1991) “Oligonucleotide and Analogues: A Practical Approach”, IRL Press. El acoplamiento de un oligonucleótido que es portador de una maleimida añadida a la cadena lateral de tiol de un residuo de cisteína de un péptido, también se ha descrito. Tung y col. (1991) Bioconjug. Chem.
2:464465.
La porción del péptido o del polipéptido del conjugado puede estar fijada al extremo 5’ de la ISS a través de un grupo amino, tiol o carboxilo que se ha incorporado en el oligonucleótido durante su síntesis. Preferiblemente, mientras que el oligonucleótido se fija al soporte sólido, un grupo enlazador que comprende una amina, un tiol o un carboxilo protegidos en un extremo, y una fosforamidita en el otro, se unen covalentemente al 5’-hidroxilo. Agrawal y col. (1986) Nucleic Acids Res. 14:6227-6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485-4502; Kremsky y col. (1987) Nucleic Acids Res. 15:2891-2909; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15:3131-3139; Bischoff y col. (1987) Anal. Biochem. 164:336-344; Blanks y col. (1988) Nucleic Acids Res. 16:1028310299; y los documentos de patente de EE.UU. n�s 4.849.513, 5.015.733, 5.118.800 y
5.118.802. Después de la desprotección, las funcionalidades amino, tiol y carboxilo se pueden utilizar para fijar covalentemente el oligonucleótido con un péptido. Benoit y col. (1987); y Sinah y col. (1991).
Un conjugado de ISS-antígeno también se puede formar a través de interacciones no covalentes, tales como enlaces iónicos, interacciones hidrófobas, enlaces de puente de hidrógeno y/o las fuerzas de van der Waals.
Los conjugados unidos no covalentemente pueden incluir una interacción no covalente, tal como un complejo de biotina-estreptavidina. Un grupo biotinilo se puede fijar, por ejemplo, a una base modificada de una ISS. Roget y col. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7643-7651. La incorporación de un resto de estreptavidina en la porción del péptido permite la formación de un complejo unido no covalentemente del péptido conjugado con la estreptavidina y el oligonucleótido biotinilado.
Las asociaciones no covalentes también pueden tener lugar a través de interacciones iónicas que implican una ISS y residuos dentro del antígeno, tales como aminoácidos cargados, o a través del uso de una porción enlazadora que comprende residuos cargados que pueden interaccionar con el oligonucleótido y con el antígeno. Por ejemplo, la conjugación no covalente puede tener lugar entre una ISS generalmente cargada negativamente y residuos de aminoácido cargados positivamente de un péptido, p. ej., residuos de polilisina, poliarginina y polihistidina.
La conjugación no covalente entre la ISS y los antígenos puede tener lugar a través de motivos que se unen al ADN de las moléculas que interaccionan con el ADN como sus ligandos naturales. Por ejemplo, tales motivos que se unen al ADN, se pueden encontrar en factores de la transcripción y en anticuerpos anti-ADN.
El enlace de la ISS con un lípido se puede formar empleando métodos convencionales. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, la síntesis de conjugados de oligonucleótido-fosfolípido (Yanagawa y col. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189-192), conjugados de oligonucleótido-ácido graso (Grabarek y col. (1990) Anal. Biochem. 185:131-135; y Staros y col. (1986) Anal. Biochem. 156:220-222), y conjugados de oligonucleótido-esterol. Boujrad y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5728-5731.
El enlace del oligonucleótido con un oligosacárido se puede formar empleando métodos convencionales conocidos. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, la síntesis de conjugados de oligonucleótido-oligosacárido, en donde el oligosacárido es un resto de una inmunoglobulina. O'Shannessy y col. (1985) J. Applied Biochem.
7: 347-355.
El enlace de una ISS circular con un péptido o un antígeno se puede formar de formas diferentes. Cuando la ISS circular se sintetiza empleando métodos recombinantes o químicos, es adecuado un nucleósido modificado. Ruth (1991) en Oligonucleotide and Analogues: A Practical Approach, IRL Press. La tecnología convencional de los enlaces se puede utilizar entonces para conectar la ISS circular con el antígeno
o con el otro péptido. Goodchild (1990) Bioconjug. Chem. 1:165. Cuando la ISS circular está aislada o sintetizada empleando métodos recombinantes o químicos, el enlace se puede formar activando químicamente o fotoactivando un grupo reactivo (p. ej. carbeno, radical) que se ha incorporado en el antígeno o en otro péptido.
Métodos adicionales para la fijación de péptidos y de otras moléculas a los oligonucleótidos, se pueden encontrar en el documento de patente de EE.UU. n� 5.391.723; Kessler (1992) “Nonradiactive labeling methods for nucleic acids" en Kricka (compilador) “Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press; y Geoghegan y col. (1992) Bioconjug. Chem. 3:138-146.
Una ISS puede estar asociada de forma próxima con un(os) antígeno(s) a través de otras vías. En algunas realizaciones, una ISS y un antígeno están asociados de forma próxima mediante encapsulación. En otras realizaciones, una ISS y un antígeno están asociados de forma próxima mediante el enlace con una molécula plataforma. Una "molécula plataforma" (también denominada "plataforma") es una molécula que contiene sitios que permiten la fijación de la ISS y del(de los) antígeno(s). En otras realizaciones, una ISS y un antígeno están asociados de forma próxima mediante adsorción sobre una superficie, preferiblemente una partícula soporte.
En algunas realizaciones, los métodos de la invención emplean un agente de encapsulación que puede mantener la asociación próxima de la ISS y del primer antígeno, hasta que el complejo está disponible para la diana (o las composiciones que comprenden tales agentes de encapsulación). Preferiblemente, la composición que comprende la ISS, el antígeno y el agente de encapsulación está en forma de emulsiones de aditivos de aceite-en-agua, micropartículas y/o liposomas. Más preferiblemente, las emulsiones de aditivos de aceite-en-agua, las micropartículas y/o los liposomas que encapsulan una molécula inmunomoduladora de ISS, están en forma de partículas desde aproximadamente 0,04 �m hasta aproximadamente 100 �m de tamaño, preferiblemente cualquiera de los siguientes intervalos: desde aproximadamente 0,1 �m hasta aproximadamente 20 �m; desde aproximadamente 0,15 �m hasta aproximadamente 10 �m; desde aproximadamente 0,05 �m hasta aproximadamente 1,00 �m; desde aproximadamente 0,05 �m hasta aproximadamente 0,5 �m.
Los sistemas de dispersión coloidal, tales como microesferas, perlas, complejos macromoleculares, nanocápsulas y un sistema a base de lípidos, tal como emulsiones de aceite-en-agua, micelas, micelas y liposomas mezclados pueden proporcionar una encapsulación eficaz de las composiciones que contienen ISS.
La composición de la encapsulación comprende adicionalmente cualquiera entre una amplia variedad de componentes. Éstos incluyen, pero no están limitados a los mismos, el alumbre, los lípidos, los fosfolípidos, las estructuras de la membrana lipídica (LMS), el polietilenglicol (PEG) y otros polímeros, tales como polipéptidos, glicopéptidos y polisacáridos.
Los polipéptidos adecuados para ser los componentes de la encapsulación, incluyen cualquiera conocido en la técnica e incluyen, pero no están limitados a los mismos, las proteínas que se unen a ácidos grasos. Los polipéptidos modificados contienen cualquiera entre una variedad de modificaciones, que incluyen, pero no están limitadas a las mismas, la glicosilación, la fosforilación, la miristilación, la sulfatación y la hidroxilación. Tal y como se utiliza en esta memoria, un polipéptido adecuado es uno que protegerá una composición que contiene ISS para conservar la actividad inmunomoduladora de la misma. Ejemplos de proteínas que se unen incluyen, pero no están limitadas a las mismas, albúminas tales como seroalbúmina bovina (BSA) y albúmina de guisante.
Otros polímeros adecuados pueden ser cualquiera conocido en la técnica de productos farmacéuticos e incluyen, pero no están limitados a los mismos, los polímeros presentes en la naturaleza, tales como dextranos, almidón de hidroxietilo y polisacáridos, y polímeros sintéticos. Ejemplos de polímeros presentes en la naturaleza incluyen las proteínas, los glicopéptidos, los polisacáridos, el dextrano y los lípidos. El polímero adicional puede ser un polímero sintético. Ejemplos de polímeros sintéticos que son adecuados para el uso en la presente invención incluyen, pero no están limitados a los mismos, poli(alquil glicoles) (PAG), tales como PEG, polioles polioxietilados (POP), tales como glicerol polioxietilado (POG), politrimetilenglicol (PTG), polipropilenglicol (PPG), poli(metacrilato de hidroxietilo), poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(ácido acrílico), polietiloxazolina, poliacrilamida, polivinilpirrolidona (PVP), poliaminoácidos, poliuretano y polifosfaceno. Los polímeros sintéticos también pueden ser lineales o ramificados, sustituidos o no sustituidos, homopolímeros, copolímeros o copolímeros en bloque de dos o más monómeros sintéticos diferentes.
Los PEGs para el uso en las composiciones de encapsulación de la presente invención se pueden adquirir a partir de proveedores químicos o se pueden sintetizar usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
El término "LMS", tal y como se utiliza en esta memoria, significa partículas de lípidos lamelares en donde los grupos polares de la cabeza de un lípido polar, se disponen enfrentados a una fase acuosa de una interfaz, para formar estructuras de la membrana. Ejemplos de las LMSs incluyen liposomas, micelas, cocleatos (es decir, liposomas generalmente cilíndricos), microemulsiones, vesículas unilamelares vesículas multilamelares y similares.
Un sistema preferido de dispersión coloidal de esta invención es un liposoma. En los ratones inmunizados con un antígeno encapsulado en un liposoma, los liposomas parecían potenciar una respuesta inmune de tipo Th1 frente al antígeno. Aramaki y col. (1995) Vaccine 13:1809-1814. Tal y como se utiliza en esta memoria, un "liposoma" o una "vesícula lipídica" es una vesícula pequeña limitada por al menos una, y posiblemente más de una, membrana de bicapa lipídica. Los liposomas se preparan artificialmente a partir de fosfolípidos, glicolípidos, lípidos, esteroides tales como colesterol, moléculas relacionadas, o una combinación de los mismos, mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluyen pero no están limitados a, ultrasonidos, extrusión, o eliminación del detergente a partir de complejos lípido-detergente. Un liposoma también puede comprender opcionalmente componentes adicionales, tales como un componente que se dirige hacia la diana de tejido. Se entiende que una "membrana lipídica" o una "bicapa lipídica" no tiene que consistir exclusivamente en lípidos, sino que puede contener además cualquier otro componente adecuado, que incluye, pero sin estar limitados a los mismos, colesterol y otros esteroides, productos químicos liposolubles, proteínas de cualquier longitud, y otras moléculas anfipáticas, con la condición de que la estructura general de la membrana sea una lámina de dos superficies hidrófilas que tienen intercalado un núcleo hidrófobo. Para una exposición general de la estructura de la membrana, véase “The Encyclopedia of Molecular Biology” de J. Kendrew (1994). Para los lípidos adecuados véase, p. ej., “Liposomes: from Physics to Applications” Elsevier, Amsterdam.
Los procedimientos para preparar liposomas que contienen composiciones que contienen ISS, son conocidos en la técnica. Las vesículas lipídicas se pueden preparar según cualquier método apropiado conocido en la técnica. Los métodos incluyen, pero no están limitados a los mismos, la microencapsulación, la microfluidización, el método LLC, la inyección de etanol, la inyección de freón, el método de la "burbuja", la diálisis de detergente, la hidratación, los ultrasonidos y la evaporación en fase inversa. Revisado por Watwe y col. (1995) Curr. Sci. 68:715-724. Las técnicas se pueden combinar para proporcionar vesículas con los atributos más deseables.
La invención abarca el uso de LMSs que contienen componentes que se dirigen a la diana tisular o celular. Tales componentes que se dirigen a la diana son componentes de una LMS que potencia su acumulación en ciertos sitios del tejido o sitios celulares, preferentemente hacia otros tejidos o sitios celulares, cuando se administran a un animal, un órgano, o un cultivo celular intactos. Un componente que se dirige hacia la diana es generalmente accesible desde el exterior del liposoma, y por lo tanto está unido preferiblemente a la superficie exterior o está insertado en la bicapa lipídica externa. Un componente que se dirige hacia la diana puede ser, entre otros, un péptido, una región de un péptido más grande, un anticuerpo específico de una molécula o de un marcador de la superficie celular, o un fragmento del mismo que se une al antígeno, un ácido nucleico, un hidrato de carbono, una región de un hidrato de carbono complejo, un lípido especial, o una molécula pequeña tal como un fármaco, una hormona o un hapteno, fijada a cualquiera de las moléculas mencionadas anteriormente. Los anticuerpos con una especificidad hacia marcadores de la superficie celular específicos del tipo celular son conocidos en la técnica y se pueden preparar fácilmente por métodos conocidos en la técnica.
Las LMSs se pueden dirigir a la diana de cualquier tipo de célula hacia la cual se va a dirigir un tratamiento terapéutico, p. ej., un tipo de célula que puede modular y/o participar en una respuesta inmune. Tales células y órganos diana incluyen, pero no están limitados a los mismos, APCs, tales como macrófagos, células dendríticas y linfocitos, estructuras linfáticas, tales como nódulos linfáticos y el bazo, y estructuras no linfáticas, particularmente aquellas en las cuales se encuentran células dendríticas.
Las composiciones de LMS de la presente invención pueden comprender adicionalmente tensioactivos. Los tensioactivos pueden ser catiónicos, aniónicos, anfifílicos o no iónicos. Una clase preferida de tensioactivos son los tensioactivos no iónicos; particularmente preferidos son los que son hidrosolubles.
En realizaciones en las cuales una ISS y un antígeno están asociados de forma próxima a través del enlace con una molécula plataforma, la plataforma puede ser proteínica o no proteínica (es decir, orgánica). Ejemplos de plataformas proteínicas incluyen, pero no están limitadas a las mismas, albúmina, gammaglobulina, inmunoglobulina (IgG) y ovoalbúmina. Borel y col. (1990) Immunol. Methods 126:159-168; Dumas y col. (1995) Arch. Dematol. Res. 287:123-128; Borel y col. (1995) Int. Arch. Allergy Immunol. 107:264-267; Borel y col. (1996) Ann. N. Y. Acad. Sci. 778:80-87. Una plataforma es polivalente (es decir, contiene más de un sitio de unión o de enlace) para acomodar la unión a la ISS y al antígeno. Otros ejemplos de plataformas polímeras son dextrano, poliacrilamida, ficol, carboximetilcelulosa, poli(alcohol vinílico) y poli(ácido D-glutámico/D-lisina.
Los principios del uso de las moléculas plataforma son bien conocidos en la técnica. Generalmente, una plataforma contiene, o se derivatiza para contener, sitios de unión apropiados para una ISS y un antígeno. Además, o alternativamente, la ISS y/o el antígeno se derivatizan para proporcionar grupos de enlace apropiados. Por ejemplo, una plataforma aislada es un enlazador bifuncional (es decir, tiene dos sitios de unión), tal como un péptido. Otros ejemplos se describen más abajo.
Las moléculas plataforma pueden estar biológicamente estabilizadas, es decir, muestran una semi-vida de excreción in vivo, frecuentemente de horas a días o a meses, para conferir una eficacia terapéutica, y están compuestas preferiblemente por una cadena sencilla sintética de la composición definida. Tienen generalmente un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000.000, preferiblemente cualquiera de los intervalos siguientes: desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 500.000; desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 200.000; desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 50.000 (o menos, tal como 30.000). Ejemplos de moléculas plataforma de valencia son polímeros (o están comprendidos por polímeros) tales como polietilenglicol (PEG; preferiblemente que tiene un peso molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 8000), poli-Dlisina, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, ácido D-glutámico y D-lisina (con un coeficiente de 3:2). Otras moléculas que se pueden utilizar son la albúmina y la IgG.
Otras moléculas plataforma adecuadas para el uso en la presente invención son las moléculas plataforma definidas químicamente, no polímeras de valencia, descritas en el documento de patente de EE.UU. n� 5.552.391. Otras moléculas plataforma definidas químicamente homogéneas de valencia, adecuadas para el uso en la presente invención son 2,2’-etilendioxidietilamina (EDDA) derivatizada y trietilenglicol (TEG).
Moléculas plataforma adecuadas y adicionales de valencia incluyen, pero no están limitadas a las mismas, tetraaminobenceno, heptaaminobetaciclodextrina, tetraaminopentaeritritol, 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano (Cyclam) y 1,4,7,10tetraazaciclododecano (Cyclen).
Generalmente estas plataformas se preparan con técnicas convencionales de la síntesis química. El PEG se tiene que derivatizar y volver polivalente, lo que se realiza empleando técnicas convencionales. Algunas sustancias adecuadas para la síntesis de conjugados, tales como PEG, albúmina e IgG están disponibles comercialmente.
La conjugación de una ISS y de un antígeno con una molécula plataforma se puede efectuar según una variedad de formas, implicando típicamente uno o varios agentes reticulantes y grupos funcionales sobre el antígeno y la plataforma de ISS y la molécula plataforma. Las plataformas y la ISS y el antígeno tienen que tener grupos enlazadores apropiados. Los grupos enlazadores se añaden a las plataformas usando técnicas químicas sintéticas convencionales. Los grupos enlazadores se pueden añadir a los antígenos polipeptídicos y a la ISS usando técnicas sintéticas en fase sólida convencionales o técnicas recombinantes. Las estrategias recombinantes pueden requerir la modificación post-traduccional para fijar un enlazador, y tales métodos son conocidos en la técnica.
A modo de ejemplo, los polipéptidos contienen restos de la cadena lateral de aminoácidos que contienen grupos funcionales, tales como grupos amino, carboxilo o sulfhidrilo que sirven como sitios para el acoplamiento del polipéptido a la plataforma. Los residuos que tienen tales grupos funcionales se pueden añadir al polipéptido, si el polipéptido no contiene todavía estos grupos. Tales residuos se pueden incorporar mediante técnicas de síntesis en fase sólida o técnicas recombinantes, siendo ambas bien conocidas en las técnicas de síntesis de péptidos. Cuando el polipéptido tiene una(s) cadena(s) lateral(es) de hidratos de carbono (s) (o si el antígeno es un hidrato de carbono), los grupo amino, sulfhidrilo y/o aldehído funcionales se pueden incorporar en la misma mediante métodos químicos convencionales. Por ejemplo, los grupos amino primarios se pueden incorporar mediante reacción del azúcar oxidado con etilendiamina en presencia de cianoborohidruro sódico, los sulfhidrilos se pueden introducir mediante reacción del dihidrocloruro de cisteamina seguida de reducción con un agente reductor de disulfuro convencional, mientras que los grupos aldehído se pueden generar después de la oxidación con peryodato. En una manera similar, la molécula plataforma también se puede derivatizar para contener grupos funcionales si no posee ya los grupos funcionales apropiados.
Los enlazadores hidrófilos de longitudes variables son útiles para conectar la ISS y el antígeno a las moléculas plataforma. Los enlazadores adecuados incluyen oligómeros o polímeros de etilenglicol lineales. Tales enlazadores incluyen los enlaza-dores con la fórmula R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2 en donde n = 0-200, m = 1 o 2, R1 = H o un grupo protector tal como tritilo, R2 = H o alquilo o arilo, p. ej., éster de 4-nitrofenilo. Estos enlazadores son útiles para conectar una molécula que contiene un grupo reactivo tiol, tal como haloaceilo, maleiamida, etc., a través de un tioéter, con una segunda molécula que contiene un grupo amino, a través de un enlace amida. Estos enlazadores son flexibles con respecto al orden de fijación, es decir, el tioéter se puede formar el primero o el último.
En realizaciones en las cuales una ISS y un antígeno están asociados de forma próxima mediante adsorción sobre una superficie, la superficie puede estar en forma de una partícula de soporte (por ejemplo, una nanopartícula) preparada con un núcleo inorgánico u orgánico. Ejemplos de tales nanopartículas incluyen, pero no están limitados a las mismas, partículas nanocristalinas, nanopartículas preparadas por la polimerización de acrilatos de alquilciano y nanopartículas preparadas mediante la polimerización de malonato de metilideno. Las superficies adicionales a las cuales se puede adsorber una ISS y un antígeno, incluyen, pero no están limitadas a las mismas, partículas de carbón activado y nanoplacas cerámicas proteicas. Otros ejemplos de partículas de soporte se proporcionan en esta memoria.
La adsorción de polinucleótidos y de polipéptidos a una superficie con el fin de suministrar moléculas adsorbidas a las células, es conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Douglas y col. (1987) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 3:233-261; Hagiwara y col. (1987) In Vivo 1:241-252; Bousquet y col. (1999) Pharm. Res. 16:141-147; y Kossovsky y col., documento de patente de EE.UU. n� 5.460.831. Preferiblemente, el
material que comprende la superficie adsorbente es biodegradable. La adsorción de una ISS y/o de un antígeno a una superficie puede tener lugar a través de interacciones no covalentes, que incluyen interacciones iónicas y/o hidrófobas.
Generalmente, las características de los soportes, tales como nanopartículas, como la carga superficial, el tamaño de las partículas y el peso molecular, dependen de las condiciones de polimerización, la concentración de monómeros y la presencia de estabilizadores durante el proceso de polimerización (Douglas y col., 1987). La superficie de las partículas soporte puede estar modificada, por ejemplo, con un revestimiento superficial, para permitir o para potenciar la adsorción de la ISS y/o del antígeno. Las partículas de soporte con ISS y/o antígeno adsorbidos, se pueden revestir adicionalmente con otras sustancias. La adición de tales sustancias puede prolongar, por ejemplo, la semi-vida de las partículas una vez administradas al sujeto y/o pueden dirigir las partículas hacia la diana de un tipo celular o de un tejido específicos, tal y como se describe en esta memoria.
Las superficies nanocristalinas a las que se puede adsorber una ISS y un antígeno se han descrito (véase, por ejemplo, el documento de patente de EE.UU. n� 5.460.831). Las partículas nanocristalinas del núcleo (con diámetros de 1 �m o menos) están recubiertas con una capa que modifica la energía superficial que favorece la adsorción de polipéptidos, de polinucleótidos y/o de otros agentes farmacéuticos. Tal y como se describe en el documento de patente de EE.UU. n� 5.460.831, por ejemplo, una partícula del núcleo está recubierta con una superficie que favorece la adsorción de un oligonucleótido y está recubierta posteriormente con una preparación del antígeno, por ejemplo, en forma de una mezcla de lípido-antígeno. Tales nanopartículas son complejos autoensamblantes de partículas con un tamaño de nanómetros, típicamente en el orden de 0,1 �m, que son portadoras de una capa interior de ISS y una capa exterior de antígeno.
Otra superficie adsorbente son las nanopartículas producidas por polimerización de cianoacrilatos de alquilo. Los cianoacrilatos de alquilo se pueden polimerizar en medios acuosos acidificados por un procedimiento de polimerización aniónica. Dependiendo de las condiciones de polimerización, las partículas pequeñas tienden a tener tamaños en el intervalo de 20 a 3000 nm, y es posible producir características de la superficie específicas de nanopartículas y con cargas específicas de la superficie (Douglas y col., 1987). Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden estar adsorbidos a nanopartículas de poli(cianoacrilato de isobutilo e isohexilo) en presencia de cationes hidrófobos, tales como cloruro de tetrafenilfosfonio o sales de amonio cuaternario, tales como bromuro de cetiltrimetilamonio. La adsorción de oligonucleótidos sobre estas nanopartículas parece estar mediada por la formación de pares de iones entre grupos fosfato cargados negativamente de la cadena de ácidos nucleicos y cationes hidrófobos. Véase, por ejemplo, Lambert y col. (1998) Biochimie 80:969-976, Chavany y col. (1994) Pharm. Res. 11:1370-1378; Chavany y col. (1992) Pharm. Res. 9:441-449. Los polipéptidos también se pueden adsorber a las nanopartículas de poli(cianoacrilato de alquilo). Véase, por ejemplo, Douglas y col., 1987; Schroeder y col. (1998) Peptides 19:777-780.
Otra superficie adsorbente son las nanopartículas preparadas por la polimerización de malonato de metilideno. Por ejemplo, tal y como se describe en Bousquet y col., 1999, los polipéptidos adsorbidos a nanopartículas de poli(malonato de metilideno 2.1.2) parece que se obtienen inicialmente a través de fuerzas electrostáticas seguido por la estabilización a través de fuerzas hidrófobas.
Complejos de IMP/MC
Los polinucleótidos que contienen ISS se pueden administrar en forma de complejos de polinucleótido inmunomodulador/microsoporte (IMP/MC). Por consiguiente, la invención proporciona composiciones que comprenden complejos de IMP/MC.
Los microsoportes útiles en la invención son inferiores a aproximadamente 150, 120 o 100 �m de tamaño, más comúnmente inferiores a aproximadamente 50-60 �m de tamaños, preferiblemente inferiores a aproximadamente 10 �m de tamaño, y son insolubles en agua pura. Los microsoportes utilizados en la invención son preferiblemente biodegradables, aunque microsoportes no biodegradables son aceptables. Los microsoportes están comúnmente en fase sólida, tal como "perlas" u otras partículas, aunque los microsoportes en fase líquida, tales como emulsiones de aceite-en-agua que comprenden polímeros biodegradables o aceites, también se contemplan. Una amplia variedad de materiales de tipo biodegradable y no biodegradable aceptables para el uso como microsoportes, son conocidos en la técnica.
Los microsoportes para uso en las composiciones de la invención son generalmente inferiores a aproximadamente 10 �m de tamaño (p. ej., tienen un diámetro promedio menor de aproximadamente 10 �m, o al menos aproximadamente el 97% de las partículas pasan a través de un filtro de tamiz de 10 �m), e incluyen nanosoportes (es decir, soportes inferiores a aproximadamente 1 �m de tamaño). Preferiblemente, los microsoportes se seleccionan con tamaños dentro de un límite superior de aproximadamente 9, 7, 5 2 o 1 �m, o 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200 o 100 nm y un límite inferior seleccionado independientemente de aproximadamente 4, 2 o 1 �mo aproximadamente 800, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 25 o 10 nm, en donde el límite inferior es menor que el límite superior. En algunas realizaciones, los microsoportes tienen un tamaño de aproximadamente 1,0-1,5 �m, aproximadamente 1,0-2,0 �m o aproximadamente 0,9-1,6 �m. En determinadas realizaciones preferidas, los microsoportes tienen un tamaño de aproximadamente 10 nm hasta aproximadamente 5 �m, o aproximadamente 25 nm hasta aproximadamente 4,5 �m, aproximadamente 1 �m, aproximadamente 1,2 �m, aproximadamente 1,4 �m, aproximadamente 1,5 �m, aproximadamente 1,6 �m, aproximadamente 1,8 �m, aproximadamente 2,0 �m, aproximadamente 2,5 �m o aproximadamente 4,5 �m. Cuando los microsoportes son nanosoportes, las realizaciones preferentes incluyen nanosoportes de aproximadamente 25 a aproximadamente 300 nm, 50 a aproximadamente 200 nm, aproximadamente 50 nm o a aproximadamente 200 nm.
Los microsoportes biodegradables en fase sólida se pueden preparar a partir de polímeros biodegradables que incluyen, pero no están limitados a: poliésteres biodegradables, tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), y copolímeros (que incluyen copolímeros en bloque) de los mismos, así como los copolímeros en bloque de poli(ácido láctico) y de polietilenglicol; poliortoésteres, tales como polímeros basados en 3,9-dietiliden-2,4,8,10-tetraoxaspiro[5.5]undecano (DETOSU); polianhídridos, tales como polímeros de poli(anhídrido) basados en monómeros relativamente hidrófilos, tales como ácido sebácico; imidas de polianhídrido, tales como polímeros de polianhídrido basados en monómeros obtenidos a partir de ácido sebácico que incorporan aminoácidos (es decir, enlazados con el ácido sebácico a través de los enlaces imida a través del nitrógeno amino terminal) tales como glicina o alanina; poli(ésteres de anhídrido); polifosfacenos, especialmente polifosfacenos que contienen grupos éster sensibles a la hidrólisis que pueden catalizar la degradación del esqueleto del polímero, a través de la generación de grupos de ácido carboxílico (Schacht y col., (1996) Biotechnol. Bioeng 1996:102); y poliamidas tales como poli(ácido láctico-co-lisina).
Una amplia variedad de materiales no biodegradables adecuados para la preparación de microsoportes también son conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin estar limitados a poliestireno, polipropileno, polietileno, látex, oro, y materiales de tipo ferromagnético o paramagnético. Determinadas realizaciones excluyen el oro, el látex, y/o las perlas magnéticas. En determinadas realizaciones, los microsoportes se pueden preparar con un primer material (p. ej., un material magnético) encapsulado con un segundo material (p. ej., poliestireno).
Las microesferas en fase sólida se preparan empleando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar por la técnica de extracción/evaporación del disolvente de la emulsión. Generalmente, en esta técnica, los polímeros biodegradables, tales como polianhidratos, poli(�-cianoacrilatos de alquilo) y poli(�-hidroxi ésteres), por ejemplo, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido D,L -láctico-coglicólico) y poli(caprolactona), se disuelven en un disolvente orgánico adecuado, tal como cloruro de metileno, para constituir la fase dispersa (DP) de la emulsión. La DP se emulsiona mediante homogeneización con velocidad elevada en un exceso de volumen de la fase acuosa continua (CP) que contiene un tensioactivo disuelto, por ejemplo, poli(alcohol vinílico) (PVA) o polivinilpirrolidona (PVP). El tensioactivo en la CP es para asegurar la formación de gotas discretas y de tamaño conveniente de la emulsión. El disolvente orgánico se extrae a continuación en la CP y se evapora posteriormente elevando la temperatura del sistema. Las micropartículas sólidas se separan a continuación mediante centrifugación o filtración, y se secan, por ejemplo, mediante liofilización o aplicación de vacío, antes de almacenar a 4ºC.
Las características físico-químicas, tales como el tamaño medio, la distribución por tamaños y la carga superficial de las microesferas secas, se pueden determinar. Las características del tamaño se determinan, por ejemplo, mediante la técnica de dispersión dinámica de la luz y la carga superficial se determina midiendo el potencial zeta.
Los microsoportes en fase líquida incluyen liposomas, micelas, gotas de aceite y otras partículas lipídicas o a base de aceite que incorporan polímeros biodegradables o aceites. En determinadas realizaciones, el polímero biodegradable es un tensioactivo. En otras realizaciones, los microsoportes en fase líquida son biodegradables debido a la inclusión de un aceite biodegradable, tal como escualeno o un aceite vegetal. Un microsoporte preferido en fase líquida son gotas de aceite dentro en una emulsión de aceite-en-agua. Preferiblemente, las emulsiones de aceite-en-agua utilizadas como microsoportes comprenden sustituyentes biodegradables, tales como escualeno.
Los complejos de IMP/MC comprenden un IMP unido a la superficie de un microsoporte (es decir, el IMP no está encapsulado en el MC), y comprenden preferiblemente múltiples moléculas del IMP unidas a cada microsoporte. En determinadas realizaciones, una mezcla de diferentes IMPs puede formar un complejo con un microsoporte, de modo que el microsoporte se une a más de una especie del IMP. El enlace entre el IMP y el MC puede ser covalente o no covalente. Tal y como lo entenderá un experto en la técnica, el IMP se puede modificar o derivatizar y la composición del microsoporte se puede seleccionar y/o modificar para acomodar el tipo de unión deseada para la formación del complejo de IMP/MC.
Los complejos de IMP/MC unidos covalentemente se pueden enlazar usando cualquier tecnología de reticulación covalente conocida en la técnica. Típicamente, la porción del IMP se modificará, para incorporar un resto adicional (p. ej., un grupo ami-no, carboxilo o sulfhidrilo libre) o para incorporar bases de nucleótidos modificadas (p. ej., fosforotioato) para proporcionar un sitio en el cual la porción del IMP se pueda unir al microsoporte. El enlace entre las porciones del IMP y del MC del complejo se pueden preparar en el extremo 3' o 5' del IMP, o en una base convenientemente modificada en una posición interna en el IMP. El microsoporte generalmente también se modifica para incorporar restos con los cuales se puede formar un enlace covalente, aunque los grupos funcionales que están normalmente presentes en el microsoporte también se pueden utilizar. El IMP/MC se forma incubando el IMP con un microsoporte bajo condiciones que permiten la formación de un complejo covalente (p. ej., en presencia de un agente reticulante o por medio de un microsoporte activado que comprende un resto activado que formará un enlace covalente con el IMP).
Una amplia variedad de tecnologías de reticulación son conocidas en la técnica, e incluyen agentes reticulantes reactivos con grupos amino, carboxilo y sulfhidrilo. Como será evidente para un experto en la técnica, la selección de un agente reticulante y el protocolo de la reticulación dependerá de la configuración del IMP y del microsoporte, así como de la configuración final deseada del complejo de IMP/MC. El agente reticulante puede ser homobifuncional o heterobifuncional. Cuando se emplea un agente reticulante homobifuncional, el agente reticulante explota el mismo resto en el IMP y el MC (p. ej., un agente reticulante de aldehído se puede utilizar para enlazar covalentemente un IMP y un MC, cuando el IMP y el MC comprenden unas o varias aminas libres). Los agentes reticulantes heterobifuncionales utilizan diferentes restos en el IMP y el MC, (p. ej., un éster de maleimido-N-hidroxisuccinimida se puede utilizar para enlazar covalentemente un grupo sulfhidrilo libre en el IMP y un grupo amino libre en el MC), y se prefieren para minimizar la formación de enlaces dentro del microsoporte. En la mayoría de los casos, es preferible la reticulación con un primer resto de reticulación en el microsoporte y un segundo resto de la reticulación en el IMP, en donde el segundo resto de la reticulación no está presente en el microsoporte. Un método preferido para producir el complejo de IMP/MC es mediante la activación del microsoporte, incubando con un agente reticulante heterobifuncional, formando de este modo el complejo de IMP/MC incubando el IMP y el MC activado bajo condiciones apropiadas para la reacción. El agente reticulante puede incorporar un brazo "espaciador" entre los restos reactivos, o los dos restos reactivos en el agente reticulante pueden estar enlazados directamente.
En una realización preferida, la porción del IMP comprende por lo menos un grupo sulfhidrilo libre (p. ej., proporcionado por una base o un enlazador modificado en 5’-tiol) para la reticulación con el microsoporte, mientras que el microsoporte comprende grupos amino libres. Un agente reticulante heterobifuncional reactivo con estos dos grupos (p. ej., un agente reticulante que comprende un grupo maleimido y un NHSéster), tal como por ejemplo 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo se utiliza para activar el MC, a continuación se reticula covalentemente el IMP para formar el complejo de IMP/MC.
Los complejos de IMP/MC no covalentes pueden estar unidos por cualquier enlace o interacción no covalente, que incluyen los enlaces iónicos (electrostáticos), las interacciones hidrófobas, los enlaces de hidrógeno, las fuerzas de van der Waals, o una combinación de dos o más interacciones diferentes, como es el caso normalmente cuando se tiene que unir una pareja de unión con el IMP y el MC.
Los complejos de IMP/MC no covalentes preferidos forman típicamente complejos mediante interacciones hidrófobas o electrostáticas (iónicas), o una combinación de las mismas, (p. ej., a través del emparejamiento de bases entre un IMP y un polinucleótido unido a un MC, empleando una pareja de unión). Debido a la naturaleza hidrofílica de la cadena principal de los polinucleótidos, los complejos de IMP/MC que dependen de interacciones hidrófobas para formar el complejo, requieren generalmente la modificación de la porción del IMP del complejo para incorporar un resto muy hidrófobo. Preferiblemente, el resto hidrófobo es biocompatible, no inmunógeno, y está presente en la naturaleza en el individuo para el que está destinada la composición (p. ej., se encuentra en mamíferos, particularmente en seres humanos). Ejemplos de restos hidrófobos preferidos incluyen lípidos, esteroides, esteroles tales como colesterol, y terpenos. El método para enlazar el resto hidrófobo con el IMP, dependerá por supuesto, de la configuración del IMP y de la identidad del resto hidrófobo. El resto hidrófobo se puede añadir a cualquier sitio conveniente en el IMP, preferiblemente en el extremo 5' o 3'; en el caso de adición de un resto de colesterol a un IMP, el resto de colesterol se añade preferiblemente al extremo 5’ del IMP, usando reacciones químicas convencionales (véase, por ejemplo, Godard y col. (1995) Eur. J. Biochem. 232:404-410). Preferiblemente, los microsoportes para uso en los complejos de IMP/MC enlazados mediante enlaces hidrófobos, se preparan a partir de materiales hidrófobos, tales como gotas de aceite o polímeros hidrófobos, aunque también se pueden utilizar materiales hidrófilos modificados, para incorporar restos hidrófobos. Cuando el microsoporte es un liposoma u otro microsoporte en fase líquida que comprende un lumen, el complejo de IMP/MC se forma mezclando el IMP y el MC después de la preparación del MC, para evitar la encapsulación del IMP durante el de la preparación del MC, para evitar la encapsulación del IMP durante el procedimiento de preparación del MC.
Los complejos de IMP/MC no covalentes unidos mediante enlace electrostático explotan típicamente la carga altamente negativa de la cadena principal del polinucleótido. Por consiguiente, los microsoportes para el uso en complejos de IMP/MC unidos no covalentemente generalmente están cargados positivamente (catiónicos) a pH fisiológico (p. ej., aproximadamente pH 6,8-7,4). El microsoporte puede poseer intrínsecamente una carga positiva, pero los microsoportes preparados a partir de compuestos que no poseen normalmente una carga positiva, se pueden derivatizar o modificar de otra forma para que estén cargados positivamente (catiónicos). Por ejemplo, el polímero usado para preparar el microsoporte se puede derivatizar para añadir grupos cargados positivamente, tales como aminas primarias. Alternativamente, los compuestos cargados positivamente se pueden incorporar en la formulación del microsoporte durante la preparación (p. ej., los tensioactivos cargados positivamente se pueden utilizar durante la preparación de copolímeros de poli(ácido láctico)/poli(ácido glicólico) para conferir una carga positiva a las partículas de microsoporte resultantes).
Tal y como se ha descrito en esta memoria, para preparar microesferas catiónicas, se pueden añadir lípidos o polímeros catiónicos, por ejemplo, 1,2-dioleoil-1,2,3trimetilamoniopropano (DOTAP), bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) o polilisina, tanto al DP como al CP, según su solubilidad en estas fases.
Tal y como se ha descrito en esta memoria, los complejos de IMP/MC se pueden formar previamente por adsorción sobre microesferas catiónicas mediante la incubación del polinucleótido y de las partículas, preferiblemente en una mezcla por adición acuosa. Tal incubación se puede realizar bajo cualquier condición deseada, que incluye la temperatura ambiente (de la sala) (p. ej., aproximadamente 20ºC) o bajo refrigeración (p. ej., 4ºC). Debido a que las microesferas catiónicas y los polinucleótidos se asocian relativamente rápido, la incubación puede ser durante cualquier período de tiempo conveniente, tal como 5, 10, 15 minutos o más, incluyendo incubaciones durante una noche y más largas. Por ejemplo, los polinucleótidos que contienen la ISS, se pueden adsorber sobre las microesferas catiónicas mediante la incubación acuosa durante una noche del polinucleótido y las partículas a 4ºC. Sin embargo, ya que las microesferas catiónicas y los polinucleótidos se asocian espontáneamente, el complejo de IMP/MC se puede formar mediante la simple administración conjunta del polinucleótido y del MC. Las microesferas se pueden caracterizar por el tamaño y la carga superficial antes y después de la asociación con el polinucleótido. Los lotes seleccionados, se pueden evaluar entonces, según la actividad contra testigos adecuados en, por ejemplo, una célula mononuclear humana de la sangre periférica, establecida (PBMC), tal y como se describe en esta memoria, y con ensayos de esplenocitos de ratón. Las formulaciones se pueden evaluar también en modelos animales adecuados.
Los complejos de IMP/MC no covalentes enlazados mediante el apareamiento de bases de nucleótidos se pueden producir empleando metodologías convencionales. Generalmente, los complejos de IMP/MC con bases apareadas se producen usando un microsoporte que comprende un polinucleótido enlazado, preferiblemente un enlace covalente, (el "polinucleótido de captura") que es por lo menos parcialmente complementario al IMP. El segmento de la complementariedad entre el IMP y el nucleótido de captura es preferiblemente al menos 6, 8, 10 o 15 pares de bases contiguas, preferiblemente por lo menos 20 pares de bases contiguas. El nucleótido de captura puede estar unido al MC por cualquier método conocido en la técnica, y preferiblemente está unido covalentemente con el IMP en el extremo 5' o 3'.
En otras realizaciones, se puede utilizar una pareja de unión para enlazar el IMP y el MC en un complejo de IMP/MC. El par de unión puede ser un receptor y un ligando, un anticuerpo y un antígeno (o un epítopo), o cualquier otro par de unión que se una con afinidad elevada (p. ej., Kd menor de aproximadamente 10-8). Un tipo de par de unión preferido es biotina y estreptavidina o biotina y avidina, que forman complejos unidos muy estrechamente. Cuando se utiliza un par de unión para mediar en la unión del complejo de IMP/MC, el IMP se derivatiza, típicamente mediante un enlace covalente, con un miembro del par de unión, y el MC se derivatiza con el otro miembro del par de unión. La mezcla de los dos compuestos derivatizados produce como resultado la formación del complejo de IMP/MC.
Numerosas realizaciones del complejo de IMP/MC no incluyen un antígeno, y determinadas realizaciones excluyen antígeno(s) asociado(s) con la enfermedad o el trastorno que es el objeto de la terapia con el complejo de IMP/MC. En otras realizaciones, el IMP también se une a una o a varias moléculas de antígeno. El antígeno se puede acoplar con la porción del IMP de un complejo de IMP/MC en una variedad de maneras, incluyendo las interacciones covalentes y/o no covalentes, tal y como se describe, por ejemplo, en el documento WO 98/16247. Alternativamente, el antígeno se puede enlazar con el microsoporte. El enlace entre el antígeno y el IMP en los complejos de IMP/MC que comprenden un antígeno unido al IMP, se puede preparar por técnicas descritas en esta memoria y que son conocidas en la técnica, que incluyen, pero no están limitadas a las mismas, el enlace covalente directo, la conjugación covalente a través de un resto del agente reticulante (que puede incluir un brazo espaciador), la conjugación no covalente a través de un par de unión específico (p. ej., biotina y avidina), y la conjugación no covalente a través de la unión electrostática o hidrófoba.
Usos de la invención
La invención proporciona usos para modular una respuesta inmune en un individuo, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano, administrando al individuo un polinucleótido que contiene ISS tal y como se describe en esta memoria. La inmunomodulación puede incluir la estimulación de una respuesta inmune de tipo Th1 y/o la inhibición o la reducción de una respuesta inmune de tipo Th2. El polinucleótido que contiene ISS se administra en una cantidad suficiente para modular una respuesta inmune. Tal y como se ha descrito en esta memoria, la modulación de una respuesta inmune puede ser humoral y/o celular, y se mide empleando técnicas convencionales, tal y como se han descrito en esta memoria.
Una variedad de individuos son adecuados para recibir el(los) polinucleótido(s) inmunomodulador(es) descrito en esta memoria. Preferiblemente, pero no necesariamente, el individuo es un ser humano.
En determinadas realizaciones, el individuo padece un trastorno asociado con una respuesta inmune de tipo Th2, tal como alergias o asma inducida por alergia. La administración de un polinucleótido que contiene ISS produce como resultado una inmunomodulación que incrementa los niveles de una o varias citocinas asociadas con una respuesta del Tipo Th1, que pueden dar como resultado una reducción de las características de la respuesta de tipo Th2 asociadas con la respuesta del individuo al alérgeno. La inmunomodulación de individuos con trastornos asociados con una respuesta de tipo Th2, da como resultado la reducción o la mejora de uno o varios de los síntomas del trastorno. Cuando el trastorno es alergia o asma inducida por alergia, la mejora en uno o en varios de los síntomas incluye una reducción de uno o varios de los siguientes: rinitis, conjuntivitis alérgica, niveles circulantes de IgE, niveles circulantes de histamina y/o la necesidad de “ayuda” con terapia inhaladora (p. ej., albuterol inhalado administrado con un inhalador o nebulizador de dosis fija).
En otras realizaciones, el individuo sometido a la terapia inmunomoduladora de la invención es un individuo que recibe una vacuna. La vacuna puede ser una vacuna profiláctica o una vacuna terapéutica. Una vacuna profiláctica comprende uno o varios epítopos asociados con un trastorno que el individuo tiene el riesgo de padecer (p. ej., antígenos de la M. tuberculosis como vacuna para la prevención de la tuberculosis). Las vacunas terapéuticas comprenden uno o varios epítopos asociados con un trastorno concreto que afecta al individuo, tal como los antígenos de superficie de M. tuberculosis o M. bovis en pacientes con tuberculosis, antígenos frente a los cuales el individuo es alérgico (es decir, terapia de desensibilización de la alergia) en individuos con alergias, células tumorales de un individuo con cáncer (p. ej., tal y como se describe en el documento de patente de EE.UU. n� 5.484.596), o antígenos asociados con
tumores en pacientes con cáncer. Tal y como se indica en el Ejemplo 3 más abajo, la administración de polinucleótidos que contienen ISS junto con un antígeno del virus de la hepatitis, un antígeno superficial de la hepatitis B (HBsAg), produce como resultado unos títulos incrementados de anticuerpos anti-HBsAg en primates, comparados con la administración aislada de HBsAg.
El polinucleótido que contiene ISS se puede entregar junto con la vacuna (p. ej., en la misma inyección o en una inyección simultánea, pero separada) o el polinucleótido que contiene ISS se puede administrar por separado (p. ej., por lo menos 12 horas antes o después de la administración de la vacuna). En determinadas realizaciones, el(los) antígeno(s) de la vacuna es parte de la ISS, por enlace covalente o no covalente con la ISS. La administración de una terapia de polinucleótidos inmunomoduladores a un individuo que recibe una vacuna, da como resultado una respuesta inmune frente la vacuna que se desplaza hacia una respuesta de tipo Th1, cuando se compara con individuos que reciben una vacuna sin el polinucleótido que contiene ISS. El desplazamiento hacia una respuesta de tipo Th1 se puede reconocer por una hipersensibilidad de la respuesta de tipo retardada (DTH) frente al antígeno(s) en la vacuna, una respuesta incrementada de IFN-� y de tipo Th1 asociada con citocinas, la producción de CTLs específicos del antígeno(s) de la vacuna, niveles bajos o reducidos de IgE específica del antígeno(s) de la vacuna, una reducción de los anticuerpos asociados con Th2 específicos del antígeno(s) de la vacuna, y/o un aumento de los anticuerpos asociados con Th1 específicos del(de los) antígeno(s) de la vacuna. En el caso de vacunas terapéuticas, la administración del polinucleótido que contiene ISS y la vacuna, da como resultado una mejora de uno o de varios síntomas del trastorno que se pretende tratar con la vacuna. Tal y como será evidente para un experto en la técnica, el(los) síntoma(s) exacto(s) y la manera de mejorarlo, dependen del trastorno que se va a tratar. Por ejemplo, cuando la vacuna terapéutica es para la tuberculosis, el tratamiento con el polinucleótido que contiene ISS con vacuna, da como resultado una reducción de la tos, del dolor pleural o de la pared torácica, la fiebre y/o otros síntomas conocidos en la técnica. Cuando la vacuna es un alérgeno utilizado en la terapia de desensibilización de la alergia, el tratamiento da como resultado una reducción de los síntomas de la alergia (p. ej., reducción de la rinitis, de la conjuntivitis alérgica, de los niveles circulantes de IgE y/o de los niveles circulantes de histamina).
Otras realizaciones de la invención se refieren a la terapia inmunomoduladora de individuos que tienen una enfermedad o un trastorno preexistente, tal como cáncer
o una enfermedad infecciosa. El cáncer es una diana atractiva para la inmunomodulación porque la mayoría de los cánceres expresan antígenos asociados con el tumor o específicos del tumor que no se encuentran en otras células en el cuerpo. La estimulación de una respuesta de tipo Th1 contra las células tumorales, da como resultado una destrucción directa y/o pasiva de las células tumorales a través del sistema inmunitario, conduciendo a una reducción de las células cancerosas y/o a una reducción de los síntomas. La administración de un polinucleótido que contiene ISS a un individuo que tiene cáncer, da como resultado la estimulación de una respuesta inmune de tipo Th1 contra las células tumorales. Una respuesta inmune tal, puede destruir las células tu-morales, por la acción directa de las células del sistema inmunitario celular (p. ej., CTLs) o de componentes del sistema inmunitario humoral, o por efecto pasivo sobre las células próximas a las células que son una diana del sistema inmunitario. Véase, por ejemplo, Cho y col. (2000) Nat. Biotechnol. 18:509-514. En el contexto del cáncer, la administración de polinucleótidos que contienen ISS puede comprender además la administración de uno o varios agentes terapéuticos adicionales, tales como, por ejemplo, anticuerpos antitumorales, regímenes de quimioterapia y/o tratamientos por radiación. Los anticuerpos antitumorales que incluyen, pero no están limitados a fragmentos de anticuerpos antitumorales y/o sus derivados, y anticuerpos antitumorales monoclonales, sus fragmentos y/o sus derivados, son conocidos en la técnica, y su administración en la terapia contra el cáncer (p. ej., RITUXAN® (rituximab); HERCEPTIN® (trastuzumab)). La administración de uno o varios agentes terapéuticos adicionales puede ocurrir antes, después y/o simultáneamente a la administración de los polinucleótidos que contienen ISS.
La terapia inmunomoduladora de acuerdo con la invención también es útil para individuos con enfermedades infecciosas, particularmente enfermedades infecciosas que son resistentes a las respuestas inmunes humorales (p. ej., enfermedades causadas por infecciones de micobacterias y de patógenos intracelulares). La terapia inmunomoduladora se puede utilizar para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por agentes patógenos celulares (p. ej., bacterias o protozoos) o por agentes patógenos subcelulares (p. ej., virus). La terapia con ISS se puede administrar a individuos que padecen enfermedades micobacterianas, tales como tuberculosis (p. ej., infecciones con M. tuberculosis y/o M. bovis), lepra (es decir, infecciones con M. leprae), o infecciones con M. marinum o M. ulcerans. La terapia con ISS también es útil para el tratamiento de infecciones víricas, que incluyen infecciones con el virus de la influenza, el virus respiratorio sincitial (RSV), el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C, el herpesvirus, particularmente el herpesvirus simplex, y el virus del papiloma. Las enfermedades causadas por parásitos intracelulares, tales como la malaria
(p. ej., infección con Plasmodium vivax, P. ovale, P. falciparum y/o P. malariae), leishmaniasis (p. ej., infección con Leishmania donovani, L. tropica, L. mexicana, L. braziliensis, L. peruviana, L. infantum, L. chagasi, y/o L. aethiopica), y la toxoplasmosis (es decir, la infección con Toxoplasmosis gondii) también se benefician de una terapia con ISS. La terapia con ISS también es útil para el tratamiento de enfermedades parasitarias, tales como la esquistosomiasis (es decir, la infección con bilharzia del género Schistosoma, tal como S. haematobium, S. mansoni, S. japonicum y S. mekongi) y clonorquiasis (es decir, la infección con Clonorchis sinensis). La administración de un polinucleótido que contiene ISS a un individuo que padece una enfermedad infecciosa, da como resultado una mejora de los síntomas de la enfermedad infecciosa. En algunas realizaciones, la enfermedad infecciosa no es una enfermedad vírica.
También se describen en esta memoria métodos para incrementar o estimular por lo menos una citocina asociada con Th1 en un individuo, que incluye IL-2, IL-12, TNF-�, IFN-� e IFN-�. También se describen en esta memoria métodos para incrementar o estimular el IFN-� en un individuo, particularmente en un individuo que necesite unos niveles mayores de IFN-�, administrando una cantidad eficaz de un polinucleótido que contiene ISS al individuo, de modo que el IFN-� se incrementa. Los individuos que necesitan un IFN-� incrementado son los que tienen trastornos que responden generalmente a la administración de IFN-�. Tales trastornos incluyen un número de trastornos inflamatorios que incluyen, pero no están limitados a, colitis ulcerativa. Tales trastornos también incluyen un número de trastornos fibróticos, incluyendo, pero sin estar limitados a los mismos, la fibrosis pulmonar idiopática (IPF), la esclerodermia, la fibrosis inducida por radiación cutánea, la fibrosis hepática que incluye fibrosis hepática inducida por esquistosomiasis, la fibrosis renal, así como otros estados que se pueden mejorar con la administración de IFN-�. La administración de un polinucleótido que contiene ISS de acuerdo con la invención, da como resultado un aumento de los niveles de IFN-�, y da como resultado la mejora de uno o de varios síntomas, la estabilización de uno o varios síntomas, y/o la prevención o el retardo de la progresión (p. ej., la reducción o la eliminación de lesiones o de síntomas adicionales) del trastorno que responde a IFN-�.
La invención se puede poner en práctica junto con otras terapias que componen las normas asistenciales para el trastorno, tales como la administración de agentes antiinflamatorios, tales como una terapia sistémica con corticoesteroides (p. ej., cortisona) en IPF.
También se describen en esta memoria unos métodos para aumentar el IFN-� en un individuo, particularmente en un individuo que requiere unos niveles incrementados de IFN-�, administrando una cantidad eficaz de un polinucleótido que contiene ISS al individuo, de modo que los niveles de IFN-� se incrementen. Los individuos que necesitan un IFN-� incrementado son los que tienen trastornos que responden generalmente a la administración de IFN-�, incluyendo IFN-� recombinante, que incluyen, pero no están limitados a, infecciones víricas y cáncer. Los polinucleótidos inmunomoduladores eficaces para inducir la producción de IFN-� comprenden una o varias secuencias TCG y/o T, 5-bromocitosina, G, además de la ISS, particularmente en el extremo 5’ de la ISS, tal y como se describe en esta memoria. La(s) TCG(s) adicional y/o T, 5-bromocitosina, G(s) pueden estar inmediatamente en 5' y estar adyacentes a la ISS o pueden estar en 5' de la ISS, separando una o varias bases TCG y/o T, 5bromocitosina, G de la ISS. En algunas realizaciones, las secuencias adicionales TCG y/o T, 5-bromocitosina, G, se crean por la adición de una T o una TC o una T, 5bromocitosina al extremo 5’ de la ISS. En algunas realizaciones en donde la secuencia adicional de TCG o T, 5-bromocitosina, G se crea por la adición de una T o una TC o una T, 5-bromocitosina, en el extremo 5’ de la ISS, la secuencia adicional puede crear una secuencia TCGA o una T, 5-bromocitosina, G, A con la ISS.
Ejemplos de polinucleótidos inmunomoduladores particularmente eficaces para inducir la producción de IFN-�, incluyen, pero no están limitados a los mismos, SEQ ID NO: 1, 14, 19, 46, 24, 11, 18, 35, 12, 13, 28 y 36.
La administración del polinucleótido que contiene ISS de acuerdo la invención da como resultado un aumento de los niveles de IFN-�, y da como resultado una mejoría de uno o de varios síntomas, la estabilización de uno o varios síntomas, y/o la prevención o el retardo de la progresión (p. ej., la reducción o la eliminación de lesiones o síntomas adicionales) del trastorno que responde a IFN-�. La invención se puede poner en práctica junto con otras terapias que componen las normas asistenciales para el trastorno, tales como la administración de agentes antivíricos para las infecciones víricas.
También se proporcionan usos para reducir niveles, particularmente los niveles séricos de IgE en un individuo que tiene un trastorno relacionado con IgE, administrando una cantidad eficaz de un polinucleótido que contiene ISS al individuo. En tales métodos, el polinucleótido inmunomodulador se puede administrar aislado (p. ej., sin el antígeno) o se puede administrar con el antígeno, tal como un alérgeno. La reducción de IgE da como resultado una mejoría de uno o de varios síntomas del trastorno relacionado con IgE. Tales síntomas incluyen síntomas de la alergia, tales como rinitis, conjuntivitis, una menor sensibilidad hacia los alérgenos, una reducción de los síntomas de la alergia en un individuo con alergias, o una reducción de la gravedad de una respuesta alérgica. Por consiguiente, la invención también proporciona métodos para tratar un estado alérgico en un individuo. En algunas realizaciones, los métodos para tratar un estado alérgico incluyen administrar el polinucleótido inmunomodulador con una cantidad o una dosis particular de antígeno. Con cualquier administración adicional de antígeno, la cantidad o la dosis del antígeno administrado puede permanecer constante, puede disminuir o puede aumentar (como en la terapia convencional de desensibilización) a lo largo del curso del tratamiento.
También se describen en esta memoria métodos para estimular la producción de CTL en un individuo, particularmente en un individuo que requiera una cantidad y/o una actividad incrementada de los CTLs, que comprenden administrar una cantidad eficaz de un polinucleótido que contiene ISS al individuo, de modo que se incrementa la producción de CTL. Los individuos que requieren incrementar la producción de CTL son los que tienen trastornos que responden generalmente a la actividad de los CTLs. Tales trastornos incluyen, pero no están limitados a los mismos, cáncer e infecciones intracelulares. La administración del polinucleótido que contiene ISS de acuerdo con la invención da como resultado un aumento de los niveles de CTLs, y da como resultado una mejoría de uno o de varios síntomas, la estabilización de uno o varios síntomas, y/o la prevención o el retardo de la progresión (p. ej., la reducción o la eliminación de lesiones o de síntomas adicionales) del trastorno que responde a la actividad de CTL.
Los usos de la invención incluyen cualquier realización descrita en esta memoria, tal como administrar polinucleótidos que contienen ISS en forma de complejo de polinucleótido inmunomodulador/microsoporte (con o sin el antígeno, o con o sin el antígeno a lo largo del curso de las administraciones), o asociado con proximidad con un antígeno.
Tal y como será evidente para un experto en la técnica, los usos de la invención se pueden poner en práctica junto con otras terapias para la indicación particular contra la cual se administra el polinucleótido que contiene ISS. Por ejemplo, la terapia con ISS se puede administrar junto con fármacos antimalaria, tales como la cloroquina, a los pacientes con malaria, junto con fármacos contra la leishmania, tales como la pentamidina y/o el alopurinol para pacientes con leishmaniosis, junto con fármacos contra las micobacterias, tales como isoniacida, rifampicina y/o etambutol en pacientes con tuberculosis, o junto con reactivos para la terapia de desensibilización contra el alérgeno en pacientes atópicos (alérgicos).
Tal y como se describe en esta memoria, la administración de polinucleótidos que contienen ISS puede comprender adicionalmente uno o varios agentes inmunoterapéuticos adicionales (es decir, un agente que actúa a través del sistema inmunitario y/o se obtiene a partir del sistema inmunitario) que incluyen, pero no están limitados a los mismos, citocina, aditivos y anticuerpos (que incluyen pero no están limitados a los mismos, fragmentos y/o derivados de anticuerpos y anticuerpos monoclonales). Ejemplos de anticuerpos terapéuticos incluyen los utilizados en el contexto del cáncer (p. ej., anticuerpos antitumorales). La administración de tales agentes inmunoterapéuticos adicionales se aplica a todos los métodos los descritos en esta memoria.
Un polinucleótido que contiene ISS también se puede administrar junto con un aditivo. La administración de un antígeno con una ISS y un aditivo conduce a una potenciación de una respuesta inmune frente al antígeno y así, se puede obtener como resultado una respuesta inmune potenciada, comparada con la que se obtiene como resultado a partir de una composición que comprende la ISS y el antígeno solos. Los aditivos son conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a los mismos, emulsiones de aceite-en-agua, emulsiones de agua-en-aceite, alumbre (sales de aluminio), liposomas y micropartículas, que incluyen pero no están limitados los mismos, poliestireno, almidón, polifosfaceno y polilactida/poliglicósidos. Otros aditivos adecuados también incluyen, pero no están limitados a los mismos, MF59, DETOX® (Ribi), mezclas de escualeno (SAF-1), péptido de muramilo, derivados de saponina, preparaciones de la pared celular de micobacterias, lípido A monofosforilo, derivados de ácido micólico, tensioactivos no iónicos de copolímeros en bloque, Quil A, subunidad B de la toxina del cólera, polifosfaceno y derivados, y complejos inmunoestimuladores (IS-COMs), tales como los descritos por Takahashi y col. (1990) Nature 344:873-875, así como, aditivos basados en lípidos y otros descritos en esta memoria. Para uso veterinario y para la producción de anticuerpos en animales, se pueden utilizar componentes mitógenos de aditivo de Freund (completo e incompleto).
Administración y evaluación de la respuesta inmune
El polinucleótido que contiene ISS se puede administrar junto con otros agentes farmacéuticos y/o inmunogénicos y/o inmunoestimuladores, tal y como se describe en esta memoria, y se puede combinar con un vehículo fisiológicamente aceptable de los mismos (y por tanto, la invención incluye estas composiciones). El polinucleótido que contiene ISS puede ser cualquiera de los descritos en esta memoria.
Por consiguiente, el polinucleótido que contiene ISS se puede administrar junto con otros agentes inmunoterapéuticos que incluyen, pero no están limitados a los mismos, citocina, aditivos y anticuerpos.
Como con todas las composiciones inmunogénicas, las cantidades inmunológicamente eficaces y el método de administración de la formulación particular del polinucleótido que contiene ISS, pueden variar dependiendo del individuo, del estado que se va a tratar y de otros factores evidentes para una persona experta en la técnica. Los factores que se van a considerar incluyen la antigenicidad del antígeno si se administra, si se va a administrar o no el polinucleótido que contiene ISS, con un aditivo o unido covalente a un aditivo, la molécula de entrega y/o el antígeno, la vía de administración y el número de dosis inmunizantes que se van a administrar. Tales factores son conocidos en la técnica y un experto en la técnica puede hacer tales determinaciones sin una experimentación indebida. Un intervalo de dosificación adecuado es uno que proporcione la modulación deseada de la respuesta inmune (p. ej., la estimulación de IFN-� e IFN-�). Cuando se desea una respuesta inmune frente a un antígeno, un intervalo de dosificación adecuado es uno que proporciona la modulación deseada de la respuesta inmune frente al antígeno. Generalmente, la dosificación se determina por la cantidad de polinucleótido que contiene ISS, administrada al paciente, más que por la cantidad total administrada de composición que contiene ISS. Los intervalos de dosificación útiles del polinucleótido que contiene ISS, dados en cantidades de polinucleótido que contiene ISS suministrada, pueden ser, por ejemplo, desde aproximadamente uno cualquiera de los siguientes: 1 a 500 �g/kg, 100 a 400 �g/kg, 200 a 300 �g/kg, 1 a 100 �g/kg, 100 a 200 �g/kg, 300 a 400 �g/kg, 400 a 500 �g/kg. La cantidad absoluta dada a cada paciente depende de propiedades farmacológicas, tales como la biodisponibilidad, la tasa de aclaramiento y la vía de administración.
La cantidad eficaz y el método de administración de la formulación del polinucleótido que contiene ISS varían basándose en el paciente individual, el resultado deseado y/o el tipo de trastorno, la etapa de la enfermedad y otros factores evidentes para una persona experta en la técnica. La(s) vía(s) de administración útil en una aplicación particular es evidente para un experto en la técnica. Las vías de administración incluyen pero no están limitadas a las mismas, dérmica, transdérmica, transmucosa, epidérmica, parenteral, gastrointestinal y nasofaríngea, y pulmonar que incluye transbronquial y transalveolar. Un intervalo de dosificación adecuado es uno que proporciona suficiente composición que contiene ISS para alcanzar una concentración tisular de aproximadamente de 1 - 10 �M, según lo medido en los niveles en sangre. La cantidad la biodisponibilidad, la tasa de aclaramiento y la vía de administración.
Tal y como se describe en esta memoria, las APCs y los tejidos con una concentración elevada en APCs son dianas preferidas para el polinucleótido que contiene ISS. Por tanto, se prefiere la administración del polinucleótido que contiene ISS sobre la piel y/o las mucosas de mamíferos en donde las APCs están presentes en una concentración relativamente elevada.
La presente invención proporciona formulaciones de polinucleótido que contienen ISS, adecuadas para la aplicación tópica que incluyen, pero no están limitadas a, implantes fisiológicamente aceptables, ungüentos, cremas, enjuagues y geles. La administración tópica es, por ejemplo, mediante vendajes o un vendaje en el que se ha dispersado un sistema de entrega, mediante la administración directa de un sistema de entrega dentro de incisiones o de heridas abiertas, o mediante un dispositivo de administración transdérmico dirigido a un sitio de interés. Las cremas, los enjuagues, los geles o los ungüentos en los que se ha dispersado un polinucleótido que contiene ISS, son adecuados para el uso como ungüentos tópicos o como agentes para la reparación de heridas.
Las vías de administración dérmica preferidas son las que son menos invasivas. Entre estos medios se prefiere la transmisión transdérmica, la administración epidérmica y la inyección subcutánea. Entre estos medios, la administración epidérmica se prefiere porque se espera que haya concentraciones más elevadas de APCs en el tejido intradérmico.
La administración transdérmica se realiza mediante la aplicación de una crema, un enjuague, un gel, etc., capaz de permitir que el polinucleótido que contiene ISS penetre en la piel y entre en la corriente sanguínea. Composiciones adecuadas para la administración transdérmica incluyen, pero no están limitadas a las mismas, suspensiones, aceites, cremas y ungüentos farmacéuticamente aceptables, aplicados directamente sobre la piel o incorporados en un soporte protector, tal como un dispositivo transdérmico (denominado "parche"). Ejemplos de cremas, ungüentos, etc., adecuad0s se pueden encontrar, por ejemplo, en “Physican’s Desk Reference”.
Para la transmisión transdérmica, la iontoforesis es un método adecuado. La transmisión iontoforética se puede realizar empleando parches comercialmente disponibles que entregan su producto continuamente a través de la piel intacta durante un período de varios días o más. El uso de este método permite la transmisión controlada de composiciones farmacéuticas en concentraciones relativamente elevadas, permite la infusión de una combinación de fármacos y permite el uso simultáneo de un promotor de la absorción.
Un producto ejemplar como parche, para uso en este método es el LECTRO PATCH, un producto de marca registrada de General Medical Company de Los Angeles, CA. Este producto mantiene electrónicamente los electrodos del depósito a un pH neutro y se puede adaptar para proporcionar dosificaciones con diferentes concentraciones, para dosificar de forma continua y/o periódica. La preparación y el uso del parche se tienen que realizar según las instrucciones impresas del fabricante que acompañan al producto LECTRO PATCH; esas instrucciones se incorporan en esta memoria con esta referencia. Otros sistemas de parches oclusivos también son adecuados.
Para la transmisión transdérmica, la entrega ultrasónica a baja frecuencia es también un método adecuado. Mitragotri y col. (1995) Science 269:850-853. La aplicación de frecuencias ultrasónicas de baja frecuencia (aproximadamente de 1 MHz) permite la entrega controlada de composiciones terapéuticas, que incluyen las de alto peso molecular.
La administración epidérmica implica esencialmente la irritación mecánica o química de la capa más exterior de la epidermis, lo suficiente para provocar una respuesta inmune contra el agente irritante. Específicamente, la irritación debe ser suficiente para atraer las APCs al sitio de la irritación.
Un medio irritante mecánico ejemplar emplea una multiplicidad de dientes cortos de diámetro muy estrecho, que se pueden utilizar para irritar la piel y para atraer las APCs al sitio de la irritación, para tomar la ISS transferida desde el extremo de los dientes. Por ejemplo, la prueba de la tuberculina original de Koch (del inglés, “old tuberculin”) de MONO VACC, fabricada por Pasteur Merieux de Lyon, Francia, contiene un dispositivo adecuado para la introducción de composiciones que contienen un polinucleótido inmunomodulador.
El dispositivo (que es distribuido en los EE.UU. por Connaught Laboratories, Inc. de Swiftwater, PA) consiste en un recipiente de plástico que tiene un émbolo de jeringa en un extremo y un disco con dientes en el otro. El disco con dientes sostiene una multiplicidad de dientes de diámetro estrecho con una longitud con la que se puede arañar justo la capa exterior de las células epidérmicas. Cada uno de los dientes en el equipo de reactivos de MONO-VACC está recubierto con tuberculina original; en la presente invención, cada aguja está recubierta con una composición farmacéutica de la formulación del polinucleótido inmunomodulador. El uso del dispositivo es preferiblemente el indicado en las instrucciones escritas del fabricante, incluidas con el producto del dispositivo. Dispositivos similares que también se pueden utilizar en esta realización, son los que se emplean actualmente para realizar pruebas de alergia.
Otro enfoque adecuado para la administración epidérmica del polinucleótido que contiene ISS, es mediante el uso de un producto químico que irrita las células exteriores de la epidermis, provocando de este modo una respuesta inmune suficiente para atraer las APCs hacia el área. Un ejemplo es un agente queratinolítico, tal como el ácido salicílico utilizado en la crema depilatoria tópica, disponible en el comercio vendida por Noxema Corporation, bajo la marca comercial NAIR. Esta estrategia también se puede utilizar para conseguir la administración epitelial en la mucosa. El agente químico irritante también se puede aplicar junto con el agente irritante mecánico (tal como, por ejemplo, ocurriría si el diente del tipo MONO-VACC también estuviera recubierto con el agente irritante químico). El polinucleótido que contiene ISS se puede suspender en un soporte que también contiene el agente irritante químico o se puede administrar junto con el mismo.
Las vías parenterales de administración incluyen pero no están limitadas a las mismas, la inyección eléctrica (iontoforesis) o a la inyección directa, tal como la inyección directa en una línea venosa central, la inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea. Las formulaciones de polinucleótido que contiene ISS adecuadas para la administración parenteral, se formulan generalmente en agua USP o en agua para inyección y pueden comprender además tampones para el pH, agentes volumétricos salinos, agentes conservantes y otros excipientes farmacéuticamente aceptables. El polinucleótido inmunomodulador para la inyección parenteral se puede formular en soluciones isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina y solución salina tamponada con fosfato, para la inyección.
Las vías de administración gastrointestinales incluyen, pero no están limitadas a las mismas, la ingestión y la rectal. La invención incluye formulaciones de polinucleótido que contiene ISS adecuadas para la administración gastrointestinal que incluyen pero no están limitadas a las mismas, polvos, píldoras o líquidos para la ingestión farmacéuticamente aceptables y supositorios para la administración rectal. Tal y como será evidente para un experto en la técnica, las píldoras o los supositorios comprenderán adicionalmente sólidos farmacéuticamente aceptables, tales como almidón, para proporcionar la carga para la composición.
La administración nasofaríngea y pulmonar se realiza por inhalación, e incluyen rutas de entrega tales como las rutas intranasal, transbronquial y transalveolar. La invención incluye formulaciones de polinucleótido que contiene ISS adecuadas para la administración por inhalación que incluyen pero no están limitadas a las mismas, las suspensiones líquidas para formar aerosoles, así como las formas en polvo para los sistemas de entrega por inhalación de polvo seco. Los dispositivos adecuados para la administración por inhalación de las formulaciones de ISS incluyen, pero no están limitados a los mismos, los atomizadores, los vaporizadores, los nebulizadores y los dispositivos de entrega para la inhalación de polvo seco.
Tal y como es bien conocido en la técnica, las soluciones o las suspensiones utilizadas para las vías de administración descritas en esta memoria, pueden incluir uno cualquiera o varios de los componentes siguientes: un diluyente estéril, tal como agua, para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tal como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral se puede incluir en ampollas, jeringas desechables o viales de varias dosis fabricados con vidrio o plástico.
Tal y como se conoce en la técnica, las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable, incluyen soluciones acuosas estériles (que sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación en el momento de usar de las soluciones inyectables estériles o la dispersión. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición tiene que ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que tenga una buena capacidad inyectable. Debe ser estable bajo las condiciones de preparación y de almacenamiento y se debe proteger contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, empleando un revestimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y empleando tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede conseguir con varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. Puede ser preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico en la composición. La prolongada absorción de las composiciones inyectables se puede ocasionar incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, el monoestearato de aluminio y la gelatina.
Tal y como es conocido en la técnica, las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el(los) compuesto(s) activo(s) en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado, con un ingrediente o una combinación de los ingredientes mencionados anteriormente, si es necesario, seguido por una esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes requeridos entre los mencionados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado a vacío y la liofilización, con los que se obtiene un polvo del ingrediente activo, más cualquier ingrediente adicional deseado, a partir de una solución previamente filtrada de forma estéril de los mismos.
La elección de las vías de administración se puede utilizar para modular la respuesta inmune provocada. Por ejemplo, los títulos de IgG y las actividades de CTL eran idénticos cuando se administra un vector del virus de la gripe por vía intramuscular o epidérmica (biolística); sin embargo, la inoculación muscular produjo sobre todo IgG2a, mientras que la ruta epidérmica producía sobre todo IgG1. Pertmer y col. (1996) J. Virol. 70:6119-6125. Así, una persona experta en la técnica puede aprovecharse de ligeras diferencias en la inmunogenicidad, provocadas por las diferentes vías de administración de los polinucleótidos inmunomoduladores de la presente invención.
Las composiciones y los métodos de administración mencionados anteriormente, describen pero no limitan los métodos de administración de las formulaciones de polinucleótidos que contienen ISS de la invención. Los métodos para producir las diferentes composiciones y los dispositivos están dentro de las capacidades de una persona experta en la técnica y no se describen detalladamente en esta memoria.
El análisis (cualitativo y cuantitativo) de la respuesta inmune frente a ISS puede ser a través de cualquier método conocido en la técnica, que incluyen, pero no están limitados a, la medición de la producción de anticuerpos específicos para el antígeno (que incluye medir subclases específicas del anticuerpo), la activación de poblaciones específicas de linfocitos tales como los linfocitos T CD4+, los linfocitos NK o CTLs, la producción de citocinas tales como IFN-�, IFN-�, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 o IL-12 y/o la liberación de la histamina. Los métodos para medir las respuestas del anticuerpo específico incluyen el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y son bien conocidos en la técnica. La medición de la cantidad de tipos específicos de linfocitos, tales como linfocitos T CD4+, se consigue, por ejemplo, con citometría de flujo (FACS). La citotoxicidad y los ensayos con CTL se pueden realizar, por ejemplo tal y como se describe en Raz y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523 y Cho y col. (2000). Las concentraciones de citocina se pueden medir, por ejemplo, por ELISA. Estos y otros ensayos para evaluar la respuesta inmune frente a un inmunógeno son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, “Selected Methods in Cellular Immunology” (1980) Mishell y Shiigi, compiladores., W. H. Freeman y Co.
Preferiblemente, una respuesta de tipo Th1 se estimula, es decir, se provoca y/o se potencia. Haciendo referencia a la invención, la estimulación de una respuesta inmune de tipo Th1 se puede determinar midiendo in vitro o ex vivo la producción de citocina procedente de las células tratadas con ISS, comparadas con las tratadas sin ISS. Los métodos para determinar la producción de citocina en las células incluyen los métodos descritos en esta memoria y cualquiera conocido en la técnica. El tipo de citocinas producidas como respuesta al tratamiento con ISS, indica una respuesta inmune influida por las células de tipo Th1 o de tipo Th2. Tal y como se emplea en esta memoria, la expresión producción de citocina "influida por tipo Th1” se refiere a la producción incrementada y medible de citocinas asociadas con una respuesta inmune de tipo Th1, en presencia de un estimulador, comparada con la producción de tales citocinas en ausencia de estimulación. Ejemplos de tales citocinas influidas por tipo Th1 incluyen, pero no están limitadas a las mismas, IL-2, IL-12, IFN-� e IFN-�. En cambio, “citocinas influidas por tipo Th2" se refiere a las que están asociadas con una respuesta inmune de tipo Th2, e incluyen, pero no están limitadas a las mismas, IL-4, IL5, e IL
13. Las células útiles para la determinación de la actividad de ISS incluyen células del sistema inmunitario, células primarias aisladas a partir de un hospedador y/o líneas celulares, preferiblemente APCs y linfocitos, incluso más preferiblemente macrófagos y
linfocitos T.
La estimulación de una respuesta inmune de tipo Th1 también se puede medir en un hospedador tratado con un polinucleótido que contiene ISS y se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica que incluye, pero no está limitado a:
(1) una reducción de los niveles de IL-4 o de IL-5 medidos antes y después de la estimulación con el antígeno; o la detección de niveles más bajos (o incluso ausentes) de IL-4 o de IL-5 en un hospedador tratado con ISS, opcionalmente comparado con un testigo sensibilizado con un antígeno, o sensibilizado y estimulado, tratado sin ISS; (2) un incremento de los niveles de IL-12, de IL-18 y/o de IFN (�, � o �) antes y después de la estimulación con el antígeno; o la detección de niveles más elevados de IL-12, IL-18 y/o IFN (�, � o �) en un hospedador tratado con ISS comparado con un testigo sensibilizado con un antígeno, o sensibilizado y estimulado, tratado sin ISS; (3) una producción de anticuerpos “influida por tipo Th1" en un hospedador tratado con ISS, comparado con un testigo tratado sin ISS; y/o (4) una reducción de los niveles de IgE específica del antígeno, tal y como se mide antes y después de la estimulación con el antígeno; o la detección de niveles más bajos (o incluso ausentes) de IgE específica del antígeno en un hospedador tratado con ISS, comparado con un testigo sensibilizado con un antígeno, o sensibilizado y estimulado, tratado sin ISS. Una variedad de estas determinaciones se puede realizar midiendo las citocinas producidas por las APCs y/o los linfocitos, preferiblemente macrófagos y/o linfocitos T, con métodos in vitro o ex vivo, descritos en esta memoria o cualquiera conocido en la técnica. Algunas de estas determinaciones se pueden realizar midiendo la clase y/o la subclase de anticuerpos específicos del antígeno, usando métodos descritos en esta memoria o cualquiera conocido en la técnica.
La clase y/o la subclase de los anticuerpos específicos del antígeno producidos como respuesta a un tratamiento con polinucleótido que contiene ISS, indica una respuesta inmune influida por el tipo Th1 o por el tipo Th2, por las células. Tal y como se utiliza en esta memoria, la expresión producción de anticuerpos "influida por el tipo Th1" se refiere a la producción de anticuerpos incrementada y medible asociada con una respuesta inmune de tipo Th1 (es decir, anticuerpos asociados con Th1). Se pueden medir uno o varios anticuerpos asociados con Th1. Ejemplos de tales anticuerpos influidos por el tipo Th1 incluyen, pero no están limitados a los mismos, la IgG1 y/o la IgG3 humanas (véase, p. ej., Widhe y col. (1998) Scand. J. Immunol. 47:575-581 y de Martino y col. (1999) Ann. Allergy Asthma Immunol. 83:160-164) y la IgG2a de múrido. En cambio, los “anticuerpos influidos por el tipo Th2" se refiere a los asociados con una respuesta inmune de tipo Th2, e incluyen, pero no están limitados a los mismos, IgG2, IgG4 y/o IgE humanas (véase, p. ej., Widhe y col. (1998) y de Martino y col. (1999)) e IgG 1 y/o IgE de múrido.
La inducción de citocinas influidas por el tipo Th1 que tiene lugar como resultado de la administración del polinucleótido que contiene ISS, produce respuestas inmunes celulares potenciadas, tales como las que realizan los linfocitos NK, los linfocitos citotóxico asesinos, los linfocitos cooperadores Th1 y de memoria. Estas respuestas son particularmente beneficiosas para el uso en la vacunación protectora o terapéutica contra virus, hongos, parásitos protozoos, bacterias, enfermedades alérgicas y asma, así como tumores.
En algunas realizaciones, una respuesta Th2 se suprime (reduce). La supresión de una respuesta Th2 se puede determinar, por ejemplo, por la reducción de los niveles de citocinas asociadas con Th2, tales como IL-4 e IL-5, la reducción de los niveles de anticuerpos asociados con Th2, así como la reducción de IgE y la reducción de la liberación de histamina como respuesta a un alérgeno.
Equipo de reactivos de la invención
La invención proporciona equipos de reactivos. En determinadas realizaciones, los equipos de reactivos de la invención comprenden generalmente uno o varios recipientes que comprenden cualquier polinucleótido que contiene ISS de la invención. Los equipos de reactivos pueden comprender adicionalmente un conjunto adecuado de instrucciones, generalmente instrucciones escritas, que hacen referencia al uso del polinucleótido que contiene ISS para cualquiera de los métodos descritos en esta memoria (p. ej., la inmunomodulación, la mejora de uno o de varios síntomas de una enfermedad infecciosa, el incremento de los niveles de IFN-�, el incremento de los niveles de IFN-�, o una mejoría en un trastorno relacionado con IgE).
Los equipos de reactivos pueden comprender un polinucleótido que contiene ISS envasado en cualquier envase conveniente y apropiado. Por ejemplo, si el polinucleótido que contiene ISS es una formulación seca (p. ej., liofilizada o un polvo seco), se emplea normalmente un vial con un tapón elástico, de modo que el polinucleótido que contiene ISS se puede suspender de nuevo fácilmente inyectando fluido a través del tapón elástico. Ampollas con cierres no elásticos y desmontables (p. ej., vidrio sellado) o tapones elásticos son los que se utilizan más convenientemente para las formulaciones líquidas de polinucleótido que contiene ISS. También se contemplan envases para emplear junto con un dispositivo específico, tal como un inhalador, un dispositivo para la administración nasal (p. ej., un atomizador) o un dispositivo para infusión tal como una minibomba.
Las instrucciones referentes al uso de un polinucleótido que contiene ISS incluyen generalmente la información en cuanto a la dosificación, el programa de dosificación y a la vía de administración para el método de uso destinado. Los recipientes del polinucleótido que contiene ISS pueden ser dosis unitarias, envases a granel (p. ej., paquetes multidosis) o dosis de subunidades. Las instrucciones suministradas en los equipos de reactivos de la invención son típicamente instrucciones escritas en una etiqueta o un inserto del paquete (p. ej., una hoja de papel incluida en el equipo de reactivos), pero instrucciones legibles por una máquina (p. ej., instrucciones almacenadas en un disco magnético u óptico) también son aceptables. En algunas realizaciones, los equipos de reactivos comprenden adicionalmente un antígeno (uno o varios antígenos), que pueden o no estar envasado en el mismo recipiente (formulación) que el(los) polinucleótido(s) que contiene(n) la ISS. El antígeno se ha descrito en esta memoria.
En determinadas realizaciones, los equipo de reactivos de la invención comprenden un polinucleótido que contiene ISS en forma de un complejo de polinucleótido inmunomodulador/microsoporte (IMP/MC) y pueden comprender además un conjunto de instrucciones, generalmente escritas, referentes al uso del complejo de IMP/MC para cualquiera de los métodos descritos en esta memoria (p. ej., inmunomodulación , mejora de uno o varios síntomas de una enfermedad infecciosa, aumento de los niveles de IFN-�, aumento de los niveles de IFN-�, o mejora de un trastorno relacionado con IgE).
En algunas realizaciones, los equipos de reactivos de la invención comprenden materiales para la producción de complejos de IMP/MC incluidos generalmente en recipientes separados de IMP y de MC, aunque en ciertas realizaciones, se suministran los materiales para producir MC más que el MC formado previamente. El IMP y el MC se suministran preferiblemente en una forma que permite la formación del complejo de IMP/MC después de mezclar el IMP y el MC suministrados. Esta configuración se prefiere cuando el complejo de IMP/MC está unido con un enlace no covalente. Esta configuración también se prefiere cuando el IMP y el MC se tienen que reticular a través de un agente reticulante heterobifuncional; el IMP o el MC se suministra en forma "activada" (p. ej., enlazado con el agente reticulante heterobifuncional, de modo que está disponible un resto reactivo con el IMP).
Los equipos de reactivos para los complejos de IMP/MC que comprenden un MC en fase líquida, comprenden preferiblemente uno o varios recipientes que incluyen materiales para producir MC en fase líquida. Por ejemplo, un equipo de reactivos de IMP/MC para una emulsión de MC de aceite-en-agua puede comprender uno o varios recipientes que contienen una fase oleosa y una fase acuosa. Los contenidos del recipiente se emulsionan para producir el MC, que a continuación se pueden mezclar con el IMP, preferiblemente un IMP que se ha modificado para incorporar un resto hidrófobo. Tales materiales incluyen aceite y agua, para la producción de emulsiones de aceite-en-agua, o recipientes para componentes liofilizados del liposoma (p. ej., una mezcla de fosfolípido, colesterol y un tensioactivo) más uno o varios recipientes de una fase acuosa (p. ej., un tampón acuoso farmacéuticamente aceptable).
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Inmunomodulación de células de múrido mediante polinucleótidos que contienen ISS
En los siguientes Ejemplos, sólo las SEQ ID NOs: 1, 19 y 32 están dentro del alcance de la invención.
Los polinucleótidos inmunomoduladores (es decir, que contienen una ISS) o los polinucleótidos testigos (es decir, sin ISS) se sometieron a ensayo para estudiar la actividad inmunomoduladora sobre esplenocitos de ratón. Los polinucleótidos sometidos a ensayo eran oligodesoxinucleótidos fosforotioatos completamente modificados. Entre los polinucleótidos sometidos a ensayo estaban 5'TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 59) (testigo positivo) y 5'TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 60) (testigo negativo).
Los fragmentos del bazo de ratones BALB/c se digirieron con colagenasa/dispasa (0,1 U/mL/0,8 U/mL) disuelta en la solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 45 minutos a 37ºC, después se dispersaron mecánicamente forzando los fragmentos digeridos a través de rejillas metálicas. Los esplenocitos dispersados se sedimentaron por centrifugación, después se resuspendieron en medio de nuevo aporte (RPMI 1640 con suero de ternera fetal al 10%, más 50 unidades/ml de penicilina, 50 �g/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM y �-mercaptoetanol 0,05 mM).
Los esplenocitos de ratón se repartieron en placas de 96 pocillos (7 x 107 células/ml) y se incubaron durante una hora a 37ºC. Se añadieron 100 �L de la muestra del ensayo o el testigo concentrados 2x, y las células se incubaron 24 horas más. El medio se recogió de cada pocillo y se sometió a ensayo para estudiar las concentraciones de citocina mediante ELISA. Los polinucleótidos se sometieron a ensayo con diferentes concentraciones que incluían 5,0, 1,0 y 0,1 �g/ml. Las muestras testigo in
5 cluían el medio solo y PANSORBIN® termodestruido, Staphylococcus aureus fijado en formalina (SAC) (CalBiochem).
El IFN-� se sometió a ensayo usando un ELISA con formato de tipo sándwich. El medio procedente del ensayo de los esplenocitos de ratón, se incubó en placas de microtitulación recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-IFN-� (Nunc). El IFN-� uni
10 do se detectó usando un anticuerpo anti-IFN-� biotinilado y un anticuerpo secundario conjugado de estreptavidina-rábano picante, revelado con el substrato cromogénico de la peroxidasa 3',3,5,5’-tetrametilbencidina (TMB), en presencia de peroxidasa, y se cuantificó midiendo la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas de precisión Emax (Molecular Devices).
15 Los polinucleótidos inmunomoduladores que contenían una ISS incrementaban sustancialmente la secreción de IFN-� en los esplenocitos de ratón, y se compararon con los testigos. Las Tablas 2-5 resumen los resultados del ensayo que estudia el IFN� producido como respuesta a 5 �g/ml de polinucleótido.
20 Tabla 2. Ensayos en esplenocitos de ratón – IFN-� (pg/ml)
ensayo/testigo
Exp. 1 Exp. 2
SEQ ID NO: 59
164 1010
SEQ ID NO: 60
18 3
SEQ ID NO: 2
134
SEQ ID NO: 47
111
SEQ ID NO: 41
131
SEQ ID NO: 48
3
SEQ ID NO: 42
623
SEQ ID NO: 43
794
media
18 3
SAC
4535 12719
Tabla 3. Ensayos en esplenocitos de ratón – IFN-� (�g/ml)
ensayo/testigo
Exp. 3 Exp. 4
SEQ ID NO: 59
185 1090
SEQ ID NO: 60
12 48
SEQ ID NO: 33
140
SEQ ID NO: 8
26
SEQ ID NO: 9
12
SEQ ID NO: 10
12
SEQ ID NO: 12
341
SEQ ID NO: 13
12
SEQ ID NO: 1
2045
SEQ ID NO: 3
1302
SEQ ID NO: 4
2002
SEQ ID NO: 5
1743
SEQ ID NO: 6
2832
media
12 48
SAC
2676 8753
Tabla 4. Ensayos en esplenocitos de ratón – IFN-� (�g/ml)
ensayo/testigo
Exp. 5
SEQ ID NO: 59
1051
SEQ ID NO: 60
48
SEQ ID NO: 1
1335
SEQ ID NO: 14
1119
SEQ ID NO: 44
716
SEQ ID NO: 17
3
SEQ ID NO: 18
3
SEQ ID NO: 45
274
SEQ ID NO: 46
1251
SEQ ID NO: 19
1467
SEQ ID NO: 23
282
SEQ ID NO: 24
1155
SEQ ID NO: 25
3
SEQ ID NO: 26
3
SEQ ID NO: 27
11
SEQ ID NO: 28
1331
media
3
SAC
924
Tabla 5. Ensayos en esplenocitos de ratón – IFN-� (pg/ml)
ensayo/testigo
Exp. 6 Exp. 7
SEQ ID NO: 59
435 281
SEQ ID NO: 60
9 18
SEQ ID NO: 1
419 279
SEQ ID NO: 11
149
SEQ ID NO: 44
222 342
SEQ ID NO: 9
9
SEQ ID NO: 12
540
SEQ ID NO: 19
625
SEQ ID NO: 55
486
SEQ ID NO: 20
458
SEQ ID NO: 21
9
SEQ ID NO: 22
709
media
9
SAC
3215
Ejemplo 2: Inmunomodulación de células humanas con polinucleótidos que
contienen ISS
Los polinucleótidos inmunomoduladores (es decir, que contienen una ISS) o las muestras testigo, que incluyen polinucleótidos sin ISS (5'TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 60) y 5'TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA-3’ (SEQ ID NO: 61)), SAC y la media solos, se sometieron a ensayo para estudiar la actividad inmunomoduladora en células mononucleares humanas de sangre periférica (PBMCs). Los polinucleótidos sometidos a ensayado eran oligodesoxinucleótidos fosforotioatos, completamente modificados.
La sangre periférica se recogió de personas voluntarias por venipuntura usando jeringas heparinizadas. La sangre se estratificó sobre la almohadilla de FICOLL (Amersham Pharmacia Biotech) y se centrifugó. Las PBMCs, localizadas en la interfase de FICOLL®, se recogieron, después se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS). Las células se resuspendieron y se cultivaron en placas con 24 o 48 pocillos con 2 x 106 células/mL en RPMI 1640, con suero AB humano termoinactivado al 10%, más 50 unidades/mL de penicilina, 50 �g/mL de estreptomicina, 300 �g/ml de glutamina, piruvato sódico 1 mM, y 1 x MEM aminoácidos no esenciales (NEAA).
Las células se cultivaron en presencia de muestras para el ensayo (polinucleótidos inmunomoduladores o testigos) a 20 �g/ml durante 24 horas, después el medio exento de células se recogió de cada pocillo y se analizó para determinar la concentración de IFN-� y de IFN-�. El IFN-� y el IFN-� se sometieron a ensayo empleando equipos de reactivos para ELISA CYTOSCREEN® de BioSource International, Inc., según las instrucciones del fabricante.
Los polinucleótidos que contienen ISS estimulaban la secreción de IFN-� y/o de IFN-� a través de PBMCs humanos. En el ensayo con PBMC humanos, los niveles de fondo de IFN-� pueden variar, incluso significativamente, con el donante. Otras citocinas tales como IFN-�, sin embargo, muestran un patrón generalmente estable de la activación y exhiben normalmente niveles de fondo bajos en condiciones sin estimulación. Ejemplos de los resultados de tales ensayos con donantes de PBMC independientes, se resumen en las Tablas 6.
Tal y como se indica en la Tabla 6, determinados polinucleótidos inmunomoduladores son eficaces para elevar los niveles de IFN-� en células humanas. También, tal y como se indica en la Tabla 6, determinados polinucleótidos inmunomoduladores son particularmente eficaces elevando los niveles de IFN-� en células humanas. Tales polinucleótidos incluyen generalmente los que comprenden por lo menos una secuencia TCG o T, 5-bromocitosina, G, 5’ de la ISS o por lo menos una secuencia TCG o T, 5-bromocitosina, G creada por la adición de una T o una TC o una T, -5-bromocitosina al extremo 5’ de la ISS. Ejemplos de tales polinucleótidos inmunomoduladores incluyen, pero no están limitados a las mismas, las SEQ ID NOs: 1, 14, 19, 46, 24, 11, 18, 12, 13, 28 y 36.
Tabla 6. Ensayos en PBMC humanos - IFN (pg/ml)
Experimento 1:
ensayo/testigo
Donante 9 Donante 94 Donante 9 Donante 94
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
20 30 131 274
60
0 0 0 0
2
29 19 100 171
47
39 30 235 341
41
25 27 89 257
48
24 24 108 157
42
10 13 24 48
43
15 17 102 170
media
0 0 0 0
SAC
10 31 536 814
Experimento 2:
ensayo/testigo
Donante 45 Donante 112 Donante 45 Donante 112
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
25 122 36 45
60
6 13 4 6
2
29 196 43 74
41
47 282 15 48
42
16 114 10 30
43
10 144 27 22
31
20 60 45 26
33
15 48 62 11
8
14 122 30 16
9
9
121 16 11
10
10
109 23 8
13
49 475 250 50
1
162 454 819 281
11
25 164 281 99
3
36 399 479 91
4
30 210 155 51
5
35 319 495 123
6
41 188 616 308
44
21 166 75 20
14
41 281 475 148
media
0 0 7 39
SAC
133 119 42 13
Experimento 3:
ensayo/testigo
Donante 7 Donante 58 Donante 7 Donante 58
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
769 76 231 14
60
74 26 0 0
2
580 110 174 20
12
512 124 260 29
55
901 98 738 53
20
752 63 224 18
19
1907 218 734 137
23
1628 211 701 120
24
1719 326 1280 208
45
419 60 256 11
46
556 77 288
9
328 35 149 17
17
332 90 376 24
18
437 75 174 57
25
561 87 295 61
1
1273 236 759 136
33
488 53 328 15
media
119 0 0 18
SAC
977 158 1269 1036
Experimento 4:
ensayo/testigo
Donante 60 Donante 65 Donante 60 Donante 65
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
139 43 44 180
60
14 0 8 1
12
335 57 837 742
9
55 19 32 64
10
76 22 39 56
13
308 44 248 362
44
80 24 92 221
14
167 48 635 1425
11
205 50 1134 1184
1
410 92 1024 1320
media
0 0 11 1
SAC
197 124 285 1655
Experimento 5:
ensayo/testigo
Donante 113 Donante 114 Donante 113 Donante 114
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
192 285 189 19
60
2 21 1 1
1
299 968 643 192
19
277 712 548 180
28
184 341 951 396
33
68 242 109 63
34
110 203 359 66
36
170 523 866 356
media
0 0 1 2
SAC
211 780 1493 997
Experimento 6:
ensayo/testigo
Donante 101 Donante 125 Donante 101 Donante 125
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
19 207 93 0
60
0 126 0 0
44
8 91 230 6
2
8 249 87 0
12
38 101 181 0
45
8 72 91 0
46
18 174 136 0
55
35 289 1102 5
20
42 126 346 0
19
32 419 2999 70
23
27 115 376 0
24
45 465 4025 92
9
0 150 3 0
17
24 145 118 0
18
20 168 29 0
25
29 228 197 6
26
18 153 73 0
27
24 171 346 34
28
23 298 2361 108
1
93 369 1524 24
media
0 9 0 0
SAC
11 39 0 0
Experimento 7
ensayo/testigo
Donante 98 Donante 123 Donante 98 Donante 123
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
0 21 7 1
60
0 1 1 8
44
0 4 0 14
12
4 46 9 47
19
25 139 22 337
23
0 34 2 68
24
13 107 30 1074
9
0 10 1 7
18
0 34 14 49
25
1 21 7 59
26
0 19 3 31
27
0 51 15 98
28
3 37 18 153
1
103 121 11 217
media
0 0 2 1
SAC
3 16 51 265
Experimento 8:
ensayo/testigo
Donante 106 Donante 107 Donante 106 Donante 107
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
72 218 173 224
60
14 3 0 0
33
76 231 430 165
8
54 193 374 129
9
43 183 179 144
10
36 122 183 62
12
54 379 727 2866
13
58 264 425 1853
1
124 485 1670 2534
media
4 2 0 0
SAC
120 342 4000 1275
Experimento 9:
ensayo/testigo
Donante 56 Donante 82 Donante 56 Donante 82
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
69 30 87 276
60
5 5 0 0
33
62 30 124 151
8
76 25 79 71
9
52 16 40 7
10
28 20 13 32
12
89 42 226 684
13
76 37 168 688
1
82 62 802 3851
media
2 4 0 0
SAC
112 1432 2520 4000
Experimento 10:
ensayo/testigo
Donante 41 Donante 45 Donante 41 Donante 45
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
0 16 43 363
60
20 11 16 19
44
0 7 30 195
2
0 5 20 164
47
0 7 32 146
41
0 9 30 124
42
0 4 23 44
43
7 10 43 199
1
16 31 498 2726
media
0 0 18 25
SAC
624 233 16931 35036
Experimento 11:
ensayo/testigo
Donante 99 Donante 100 Donante 99 Donante 100
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
37 4 519 57
60
144 27 22 27
2
23 5 306 76
47
39 3 235 39
41
23 1 219 34
48
32 1 838 53
42
58 3 342 92
43
23 0 662 62
1
61 17 3680 404
media
0 20 15 60
SAC
849 177 3446 6230
Experimento 12:
ensayo/testigo
Donante 83 Donante 103 Donante 83 Donante 103
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
308 16 250 8
60
49 160 0 0
61
10 0 0 0
1
820 109 928 219
3
625 130 554 71
4
546 111 188 25
5
444 158 385 47
6
276 64 906 160
2
255 75 347 21
31
501 11 301 6
media
0 693 3 0
SAC
1471 590 456 515
Experimento 13:
ensayo/testigo
Donante 26 Donante 97 Donante 26 Donante 97
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
324 541 267 24
60
6 103 0 1
12
530 516 949 350
45
303 214 377 20
46
536 696 1274 142
9
208 301 153 12
17
515 586 1628 158
18
435 238 1572 64
1
1045 879 4302 1039
11
284 163 3424 299
44
391 465 2059 666
14
414 395 5172 1334
19
638 466 5874 2485
media
0 24 0 1
SAC
274 102
Experimento 14:
ensayo/testigo
Donante 97 Donante 124 Donante 97 Donante 124
SEQ ID NO:
IFN-� IFN-�
59
218 104 76 24
60
4 18 0 0
18
206 50 104 22
35
279 117 219 27
media
0 2 0 3
SAC
298 301 1170 784
Ejemplo 3: Respuesta inmune de primates frente al antígeno + ISS
Las respuestas inmunes frente a la administración del antígeno de superficie de
la hepatitis B (HBsAg) en presencia de un polinucleótido que contiene ISS de la inven
ción, se examinaron en mandriles.
El HBsAg era HBsAg recombinante producido en levadura. Los grupos de mandriles (cinco animales por grupo) incluían mandriles macho y hembra con pesos en el intervalo de 8-31 kg (los pesos medios de los grupos de 13-16 kg) al comienzo del estudio.
Los mandriles fueron inmunizados tres veces, a intervalos de dos meses (0, 2 y 4 meses), mediante inyección intramuscular (IM) con 20 �g de HBsAg en un 1 ml de volumen. Tal y como se describe más abajo, algunos de los grupos también recibieron ISS con el HBsAg.
Se recogió sangre de todos los animales antes de la inmunización y 2 semanas después de la inmunización. Los títulos de IgG anti-HBsAg se midieron del modo siguiente. Se analizaron muestras de suero del mandril con un equipo de reactivos comercial AUSAB EIA (Abbott Labs, n� de catálogo 9006-24 y 1459-05) empleando per
las recubiertas con HBsAg obtenidas a partir de plasma humano. Las muestras se sometieron a ensayo junto con un panel de patrones positivos y negativos de HBsAg, obtenido a partir de plasma humano, en un intervalo de 0-150 mUI/ml. El HBsAg conjugado con biotina y el anticuerpo conjugado con anti-biotina-HRP de conejo se utilizaron para la detección como complejo de anticuerpo secundario. El ensayo se reveló con orto-fenilendiamina (OPD) y los valores de la absorbancia se determinaron a 492 nm con la substracción del ruido de fondo a 600 nm (espectrofotómetro Quantum II, Abbott Labs.) Usando el valor de la absorbancia del espécimen, la concentración correspondiente de anti-HBsAg se expresa en miliunidades internacionales por ml (mUI/ml), según se determinó con la curva patrón, de acuerdo con los parámetros establecidos por el fabricante. Para los especímenes diluidos, la cuantificación se basó en la absorbancia del espécimen que daba como resultado un valor entre 0-150 mUI/ml, multiplicando por el factor de dilución para llegar a la concentración final.
El análisis estadístico se realizó con datos transformados logarítmicamente mediante análisis de la varianza (programa estadístico NCSS97, de Statistical Software, Kaysville, UT) usando una comparación de los valores previstos por ANOVA unidireccional (� = 0,05). Una p � 0,05 se consideró significativa.
Los grupos de animales sometidos a ensayo se inmunizaron del modo siguiente:
Grupo 1 – 20 �g de HBsAg;
Grupo 2 – 20 �g de HBsAg + 1000 �g de SEQ ID NO: 59 (ISS);
Grupo 3 – 20 �g de HBsAg + 1000 �g de SEQ ID NO: 60 (no ISS);
Grupo 4 – 20 �g de HBsAg + 1000 �g de SEQ ID NO: 38 (ISS); Grupo 5 – 20 �g de HBsAg + 1000 �g de SEQ ID NO: 2 (ISS); Grupo 6 – 20 �g de HBsAg + 1000 �g de SEQ ID NO: 18 (ISS); Grupo 7 – 20 �g de HBsAg + 1000 �g de SEQ ID NO: 35 (ISS);
5
Los resultados del estudio se muestran en la Tabla 7 más abajo. La administración de los oligonucleótidos que contienen una secuencia de ISS, junto con HBsAg daba como resultado unos títulos incrementados de anticuerpos anti-HBsAg, comparada con la administración de HBsAg solo o la administración de HBsAg con un oligo
10 nucleótido no ISS. En una comparación por parejas, la respuesta inmune detectada en el Grupo 2 (oligonucleótido con ISS) era significativamente diferente de la detectada en el Grupo 3 (oligonucleótido sin ISS) (p < 0,05 después de la primera inmunización, p = 0,06 después de la tercera inmunización). En las comparaciones por parejas con el Grupo 2, no se encontraron diferencias significativas en las respuestas inmunes entre
15 las del Grupo 2 y las que se encontraron con otros grupos que recibían un oligonucleótido con ISS (Grupo 4, Grupo 5, Grupo 6 y Grupo 7).
Tabla 7. Anti-HBsAg en muestras de sangrado después de la inmunización
Después de la primera inmunización
Después de la segunda inmunización Después de la tercera inmunización
Grupo
n� mUI/ml media ± DS mUI/ml media ± DS mUI/ml media ± DS
1
1
0 59 0 806 0 4245
HBsAg
2 135 ± 58 muerto ± 1229 muerto ± 5673
3
59 613 12.075
4
6 2598 4773
5
94 12 131
2
6 9 108 357 2181 1273 14.773*
HBsAg
7 0 ± 216 1829 ± 3526 6186 ± 15.522
SEQ ID NO:59
8 28 158 11.304
9
495 8366 41.138
10
11 195 13.966
3
11 1 1** 2133 524 23.744 5529
HBsAg
12 0 ± 1 21 ± 903 5 ± 10.235
SEQ ID NO:60
13 3 202 520
14
0 85 647
15
0 178 2732
4
16 29 25 333 1546 4893 12.346**
HBsAg
17 50 ± 23 3281 ± 1131 15.363 ± 6728
SEQ ID NO:38
18 43 1556 22.069
19
4 781 7716
20
0 1779 11.690
5
21 8 26 6256 4556 50.538 27.726
HBsAg
22 116 ± 51 16.043 ± 6943 84.681 ± 38.365
SEQ ID NO:2
23 1 280 750
24
0 107 316
25
4 93 2346
6 HBsAg SEQ ID NO:18
26 27 28 29 30 21 4 3 39 221 58 ± 93 563 169 6319 3318 3652 2804** ± 2515 24.100 280 23.981 93.750 42413 36,904** ± 35.121
7 HBsAg SEQ ID NO:35
31 32 33 34 35 5 4 3 0 1 3** ± 2 14.190 438 4 687 1735 3411 ± 6059 3336 6926 193 24.938 32.844 13.647 ± 14.392
Comparación por parejas con HBsAg solo (Grupo 1) **p<0,05; *p=0,05
Ejemplo 4: Preparación de microesferas biodegradables, catiónicas
Las microesferas catiónicas de poli(ácido láctico, ácido glicólico) (PLGA) se prepararon del modo siguiente. Se disolvieron 0,875 g de polímero poli(D,L-lactida-co5 glicolida) 50:50, con una viscosidad intrínseca de 0,41 dl/g (0,1%, cloroformo, 25ºC) en 7,875 g de cloruro de metileno con una concentración de 10% p/p, junto con 0,3 g de DOTAP. La fase orgánica clara se emulsionó a continuación en 500 ml de solución acuosa de poli(alcohol vinílico) (PVA) (0,35% p/v) mediante homogeneización a 4000 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente, usando un mezclador de laboratorio 10 (Silverson L4R, Silverson Instruments). La temperatura del sistema alcanzó entonces los 40ºC mediante circulación de agua caliente a través de la camisa del recipiente de mezclado. Simultáneamente, se redujo la tasa de agitación a 1500 rpm, y estas condiciones se mantuvieron durante 2 horas para extraer y evaporar el cloruro de metileno. La suspensión de las microesferas se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente con
15 ayuda de agua fría circulante. Las micropartículas se separaron por centrifugación a 8000 rpm durante 10 minutos, a temperatura ambiente (Beckman Instruments) y se resuspendieron en agua desionizada sometiendo el baño a ultrasonidos suaves. El lavado de centrifugación se repitió dos veces adicionales para eliminar el exceso de PVA de la superficie de las
20 partículas. Los sedimentos de la centrifugación final de las partículas se resuspendieron en aproximadamente 10 ml de agua, y se liofilizaron durante una noche. El polvo catiónico seco de las microesferas se caracterizó según el tamaño y la carga superficial: tamaño medio (número ponderado, �) = 1,4; potencial zeta (milivoltio) = 32,4.
25 Ejemplo 5: Inmunomodulación con los complejos de IMP/MC en células humanas Los polinucleótidos se sometieron a ensayo para estudiar la actividad inmunomoduladora sola y formando complejos con microesferas catiónicas de PLGA (cPLGA)
en el ensayo con PBMC humanas. El ensayo con PBMC humanas se realizó tal y como se ha descrito en el Ejemplo 2. Las microesferas catiónicas de PLGA se prepararon tal y como se ha descrito en el Ejemplo 4. Los polinucleótidos se sometieron a ensayo como agentes únicos, o junto con microesferas de cPLGA. Los polinucleótidos 5 sometidos a ensayo eran SEQ ID NO: 59, 60, 1 y 132. Todos los polinucleótidos contenían enlaces 100% fosforotioato y se sometieron a ensayo a una concentración de 20 �g/ml. El cPLGA se añadió con una concentración de 100 pg/ml. Cuando se sometieron a ensayo los polinucleótidos con cPLGA, el polinucleótido y cPLGA se mezclaron previamente durante 15 min. a temperatura ambiente y después se añadieron al 10 cultivo. SAC (PANSORBIN® CalBiochem, dilución 1/5000) e IMP (que contiene ISS), SEQ ID NO: 59, se utilizaron como testigos positivos, y como polinucleótido testigo, SEQ ID NO: 60, y las células solas se utilizaron como testigos negativos. El PLGA catiónico también se sometió a ensayo solo. SAC contiene material celular de Staph. aureus (Cowan I). Las muestras se sometieron a ensayo en cuatro donantes sanos por
15 ensayo. Tal y como se muestra en la Tabla 8 más abajo, los polinucleótidos que contienen ISS (IMPs), las SEQ ID NOs: 59, 1 y 132, eran capaces de inducir IFN-� e IFN-� cuando se utilizaban solos. La formación de complejos de estos IMPs con los microsoportes catiónicos de cPGLA (cat MC) potenciaba significativamente la inducción de
20 ambas citocinas. El polinucleótido testigo, SEQ ID NO: 60 no inducía el IFN-� ni el IFN
� cuando se empleaba solo o cuando formaba complejos con cPLGA.
TABLA 8
IFN-� (pg/ml)
IFN-� (pg/ml)
Muestra
Ex 1 Ex 2 Ex 3 Ex 4 media Ex 1 Ex 2 Ex 3 Ex 4 media
SEQ ID NO: 59
324 1036 529 653 636 9 43 22 108 43
SEQ ID NO: 60
430 19 48 35 34 0 0 4 54 15
SEQ ID NO: 1
287 278 2679 1057 1075 230 268 295 798 398
cat MC
9 5 59 72 36 7 0 98 112 54
SEQ ID NO: 59/cat MC
601 358 1474 1941 1093 115 116 515 1298 511
SEQ ID NO: 60/cat MC
13 13 46 65 34 5 0 0 43 12
SEQ ID NO: 1/cat MC
1645 770 3322 3355 2273 1896 1078 2691 1728 1848
células solas
11 4 0 13 7 8 2 3 64 19
IFN-� (pg/ml)
IFN-� (pg/ml)
Muestra
Ex 1 Ex 2 Ex 3 Ex 4 media Ex 1 Ex 2 Ex 3 Ex 4 media
SEQ ID NO: 59
1508 344 144 104 525 50 172 234 72 132
SEQ ID NO: 60
124 24 16 40 51 2 32 474 2 128
SEQ ID NO: 132
2928 936 380 108 1088 4968 72 1290 1182 1878
cat MC
32 8 72 120 58 10 2 60 92 41
SEQ ID NO:59/ cat MC
1640 968 960 2300 1467 948 260 1298 1470 994
SEQ ID NO: 60/ cat MC
72 16 32 316 109 14 14 22 2 13
SEQ ID NO: 132/ cat MC
1060 4584 5172 1188 3001 5292 1050 3772 3214 3332
células solas
44 24 20 28 29 20 200 2 2 56

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un polinucleótido inmunomodulador que tiene menos de 50 bases o pares de bases y que comprende una secuencia seleccionada entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 132.
  2. 2.
    Un polinucleótido inmunomodulador de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la secuencia SEQ ID NO: 132.
  3. 3.
    Un polinucleótido inmunomodulador de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el polinucleótido inmunomodulador es monocatenario.
  4. 4.
    Un polinucleótido inmunomodulador de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el polinucleótido inmunomodulador es bicatenario.
  5. 5.
    Un polinucleótido inmunomodulador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polinucleótido inmunomodulador está estabilizado.
  6. 6.
    Un polinucleótido inmunomodulador de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el polinucleótido comprende un enlace fosforotioato.
  7. 7.
    Una composición inmunomoduladora que comprende un polinucleótido inmunomodulador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  8. 8.
    Una composición inmunomoduladora que comprende un antígeno y un polinucleótido inmunomodulador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  9. 9.
    Una composición inmunomoduladora de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  10. 10. Un complejo de polinucleótido inmunomodulador/microsoporte
    (IMP/MC), que comprende:
    un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, ligado a un microsoporte (MC) biodegradable, en donde dicho MC tiene un tamaño inferior a 10 �m.
  11. 11.
    Uso de un polinucleótido inmunomodulador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la preparación de un medicamento para modular una respuesta inmune.
  12. 12.
    El uso según la reivindicación 11, en donde dicho individuo padece un trastorno asociado con una respuesta inmune de tipo Th2, tal como alergia o asma, o en donde dicho individuo tiene una enfermedad infecciosa.
  13. 13.
    Uso de un polinucleótido inmunomodulador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la preparación de un medicamento para tratar una fibrosis pulmonar idiopática o una infección vírica.
  14. 14.
    Uso de un polinucleótido inmunomodulador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la preparación de un medicamento para emplear en un método para mejorar un síntoma de una enfermedad infecciosa o un trastorno relacionado con IgE.
  15. 15.
    El uso según la reivindicación 14, en donde dicha enfermedad infecciosa está causada por un agente patógeno celular.
  16. 16.
    El uso según la reivindicación 15, en donde dicha enfermedad infecciosa causada por un agente patógeno celular se selecciona entre una enfermedad micobacteriana, malaria, leishmaniosis, toxoplasmosis, esquistosomiasis y clonorquiasis.
  17. 17.
    El uso según la reivindicación 14, en donde dicho trastorno relacionado con IgE es alergia, un trastorno relacionado con la alergia o asma.
  18. 18.
    Un equipo de reactivos que comprende un polinucleótido inmunomodulador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, e instrucciones para el uso del polinucleótido inmunomodulador para la inmunomodulación de un individuo.
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Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7935675B1 (en) * 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
PT1077722E (pt) 1998-05-22 2006-12-29 Coley Pharm Group Inc Produtos e composições para utilização na indução da imunidade mucosal
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
EP1322655B1 (en) 2000-01-14 2007-11-14 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20040131628A1 (en) * 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US20030129251A1 (en) * 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
KR100917101B1 (ko) * 2000-08-04 2009-09-15 도요 보세키 가부시키가이샤 플렉시블 금속적층체 및 그 제조방법
CA2451974C (en) 2001-06-21 2014-10-14 Karen L. Fearon Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
US7785610B2 (en) * 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
US7666674B2 (en) 2001-07-27 2010-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo
AU2002318944A1 (en) * 2001-08-01 2003-02-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
JP4607452B2 (ja) * 2001-08-07 2011-01-05 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 免疫調節性組成物、製剤およびその使用方法
WO2003020884A2 (en) * 2001-08-14 2003-03-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Method for rapid generation of mature dendritic cells
IL160157A0 (en) * 2001-08-17 2004-07-25 Coley Pharm Group Inc Combination motif immune stimulation oligonucleotides with improved activity
US8466116B2 (en) 2001-12-20 2013-06-18 The Unites States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of CpG oligodeoxynucleotides to induce epithelial cell growth
AU2002366710A1 (en) 2001-12-20 2003-07-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
US8263091B2 (en) * 2002-09-18 2012-09-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating and preventing infections in immunocompromised subjects with immunostimulatory CpG oligonucleotides
EP1578954A4 (en) * 2002-12-11 2010-08-11 Coley Pharm Group Inc 5'-CPG NUCLEIC ACIDS AND USE METHOD
US8158768B2 (en) 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
PT1992635E (pt) * 2002-12-23 2012-03-20 Dynavax Tech Corp Oligonucleótidos de sequência imunoestimuladora e métodos de utilização dos mesmos
CA2508281C (en) 2002-12-23 2011-08-09 Vical Incorporated Method for producing sterile polynucleotide based medicaments
JP2006516099A (ja) * 2002-12-23 2006-06-22 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 分枝状の免疫調節化合物及び該化合物の使用方法
WO2004074454A2 (en) 2003-02-20 2004-09-02 University Of Connecticut Health Center Methods and compositions for the treatment of cancer and infectious disease using alpha (2) macroglobulin-antigenic molecule complexes
MXPA05013658A (es) * 2003-06-11 2006-03-02 Hybridon Inc Oligonucleotidos inmunomoduladores estabilizados.
EP3718635A1 (en) 2003-07-31 2020-10-07 Handylab, Inc. Processing particle-containing samples
US8852862B2 (en) 2004-05-03 2014-10-07 Handylab, Inc. Method for processing polynucleotide-containing samples
US20060014713A1 (en) * 2004-06-15 2006-01-19 Hybridon, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
MY159370A (en) * 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
CN101160401A (zh) * 2005-02-24 2008-04-09 科勒制药集团公司 免疫刺激寡核苷酸
AU2006220835B2 (en) 2005-03-04 2012-01-19 Dynavax Technologies Corporation Vaccines comprising oligonucleotides having immunostimulatory sequences (ISS) wherein the ISS are conjugated to antigens and stabilized by buffer conditions and further excipients
EP1874325A2 (en) * 2005-04-08 2008-01-09 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods for treating infectious disease exacerbated asthma
US20090143761A1 (en) * 2005-06-03 2009-06-04 Transdermal Patents Company, Llc Agent delivery system and uses of same
US10900066B2 (en) 2006-03-24 2021-01-26 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
US7998708B2 (en) 2006-03-24 2011-08-16 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
US11806718B2 (en) 2006-03-24 2023-11-07 Handylab, Inc. Fluorescence detector for microfluidic diagnostic system
ES2692380T3 (es) 2006-03-24 2018-12-03 Handylab, Inc. Método para realizar PCR con un cartucho con varias pistas
WO2008060604A2 (en) 2006-11-14 2008-05-22 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
US8765076B2 (en) 2006-11-14 2014-07-01 Handylab, Inc. Microfluidic valve and method of making same
AU2008276211B2 (en) 2007-07-13 2015-01-22 Handylab, Inc. Polynucleotide capture materials, and methods of using same
US8105783B2 (en) 2007-07-13 2012-01-31 Handylab, Inc. Microfluidic cartridge
US8182763B2 (en) 2007-07-13 2012-05-22 Handylab, Inc. Rack for sample tubes and reagent holders
US8287820B2 (en) 2007-07-13 2012-10-16 Handylab, Inc. Automated pipetting apparatus having a combined liquid pump and pipette head system
US9186677B2 (en) 2007-07-13 2015-11-17 Handylab, Inc. Integrated apparatus for performing nucleic acid extraction and diagnostic testing on multiple biological samples
KR20100053598A (ko) * 2007-08-01 2010-05-20 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 Ｔｌｒ９의 신규한 합성 효능제
US20090047260A1 (en) * 2007-08-17 2009-02-19 Wake Forest University Health Sciences Keratin biomaterials for cell culture and methods of use
US8552165B2 (en) * 2008-12-09 2013-10-08 Heather Davis Immunostimulatory oligonucleotides
WO2010093882A1 (en) * 2009-02-13 2010-08-19 Wake Forest University Health Sciences Keratin biomaterials for cell culture and methods of use
AU2011258165B2 (en) 2010-05-26 2016-11-17 Selecta Biosciences, Inc. Dose selection of adjuvanted synthetic nanocarriers
WO2012061717A1 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Selecta Biosciences, Inc. Modified nicotinic compounds and related methods
US9452212B2 (en) 2011-04-14 2016-09-27 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for eliciting an immune response against hepatitis B virus
JP6088487B2 (ja) 2011-04-15 2017-03-01 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 走査リアルタイムマイクロ流体熱サイクラーと同期熱サイクリング及び走査光学検出の方法
JP2014521687A (ja) 2011-07-29 2014-08-28 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド 体液性および細胞傷害性ｔリンパ球（ｃｔｌ）免疫応答を生成する合成ナノキャリア
WO2013025928A2 (en) 2011-08-17 2013-02-21 Keranetics Llc Methods for extracting keratin proteins
CA2845267C (en) 2011-08-17 2021-07-06 Keranetics Llc Low protein percentage gelling compositions
WO2013067202A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Handylab, Inc. Polynucleotide sample preparation device
US9827245B2 (en) 2013-03-15 2017-11-28 KeraNetics, LLC Keratin compositions comprising halofuginone
US10751412B2 (en) 2015-05-29 2020-08-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Combination of a PD-1 antagonist and CPG-C type oligonucleotide for treating cancer
CN107708706A (zh) 2015-05-29 2018-02-16 戴纳瓦克斯技术公司 用于治疗肺的癌症的多核苷酸Toll样受体9激动剂的肺内施用
CA3023143A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
JP7200093B2 (ja) 2016-09-15 2023-01-06 アイデラ・ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド がん治療用ｔｌｒ９アゴニストを用いた免疫調節
WO2018187706A2 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
EP3810634A4 (en) 2018-06-21 2022-07-27 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Mosaic influenza virus hemagglutinin polypeptides and uses thereof
CN109622086B (zh) * 2019-01-31 2021-10-15 河南科技大学 预置磁珠的微流控芯片、制造方法及微流控检测设备
EP3959216A4 (en) 2019-04-24 2023-01-11 Icahn School of Medicine at Mount Sinai ANTI-INFLUENZA B VIRUS NEURAMINIDASE ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2021178318A1 (en) * 2020-03-01 2021-09-10 Dynavax Technologies Corporation Coronavirus vaccines comprising a tlr9 agonist
DE112021004970T5 (de) 2020-09-22 2023-07-06 Trisalus Life Sciences, Inc. Krebstherapie unter verwendung von toll-like-rezeptor-agonisten
JP2024512765A (ja) 2021-04-01 2024-03-19 トリサルース・ライフ・サイエンシズ・インコーポレイテッド トール様受容体アゴニストを使用したがん治療
JP2024515881A (ja) 2021-04-29 2024-04-10 トリサルース・ライフ・サイエンシズ・インコーポレイテッド チェックポイント阻害剤を使用したがん治療
CA3245262A1 (en) * 2022-03-01 2023-09-07 Dynavax Technologies Corporation Immunogenic compositions comprising a recombinant neuraminidase and a CPG oligonucleotide adjuvant, and their uses

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US552391A (en) * 1895-12-31 Concentrating-indicator for grain-elevators
US4458066A (en) * 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4948882A (en) * 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4650675A (en) * 1983-08-18 1987-03-17 The Children's Medical Center Corporation Oligonucleotide conjugates
US5118802A (en) * 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5015733A (en) * 1983-12-20 1991-05-14 California Institute Of Technology Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups
US4849513A (en) * 1983-12-20 1989-07-18 California Institute Of Technology Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups
US5118800A (en) * 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US4828991A (en) * 1984-01-31 1989-05-09 Akzo N.V. Tumor specific monoclonal antibodies
US5093232A (en) * 1985-12-11 1992-03-03 Chiron Corporation Nucleic acid probes
US4910300A (en) * 1985-12-11 1990-03-20 Chiron Corporation Method for making nucleic acid probes
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5278302A (en) * 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5391723A (en) * 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5552391A (en) * 1990-01-16 1996-09-03 La Jolla Pharmaceutical Company Chemically-defined non-polymeric valency platform molecules and conjugates thereof
US5460831A (en) * 1990-06-22 1995-10-24 The Regents Of The University Of California Targeted transfection nanoparticles
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
US5849719A (en) * 1993-08-26 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Method for treating allergic lung disease
JPH07140592A (ja) * 1993-11-16 1995-06-02 Konica Corp ハロゲン化銀写真感光材料
WO1995026204A1 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
ATE509102T1 (de) 1994-07-15 2011-05-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
EP0879284B1 (en) 1996-01-30 2009-07-29 The Regents of The University of California Gene expression vectors which generate an antigen specific immune response and methods of using the same
US5879906A (en) * 1996-06-26 1999-03-09 Cambia Biosystems Llc Glucuronide repressors and uses thereof
ES2241042T3 (es) * 1996-10-11 2005-10-16 The Regents Of The University Of California Conjugados de polinucleotido inmunoestimulador/ molecula inmunomoduladora.
WO1998037919A1 (en) 1997-02-28 1998-09-03 University Of Iowa Research Foundation USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE IN THE TREATMENT OF LPS-ASSOCIATED DISORDERS
AU753688B2 (en) 1997-03-10 2002-10-24 Ottawa Civic Loeb Research Institute Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
CA2289741A1 (en) 1997-05-19 1998-11-26 Merck & Co., Inc. Oligonucleotide adjuvant
AU7690898A (en) 1997-05-20 1998-12-11 Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
WO1998055495A2 (en) * 1997-06-06 1998-12-10 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US6800744B1 (en) * 1997-07-02 2004-10-05 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to Streptococcus pneumoniae for diagnostics and therapeutics
DK1009413T3 (da) * 1997-09-05 2007-06-11 Univ California Anvendelse af immunstimulerende oligonukleotider til forebyggelse eller behandling af astma
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
JPH11209289A (ja) * 1998-01-22 1999-08-03 Taisho Pharmaceut Co Ltd 粘膜免疫誘起剤
ATE356630T1 (de) 1998-04-03 2007-04-15 Univ Iowa Res Found Verfahren und produkte zur stimulierung des immunsystems mittels immunotherapeutischer oligonukleotide und zytokine
EP1077708A1 (en) 1998-05-06 2001-02-28 University Of Iowa Research Foundation Methods for the prevention and treatment of parasitic infections and related diseases using cpg oligonucleotides
PT1077722E (pt) 1998-05-22 2006-12-29 Coley Pharm Group Inc Produtos e composições para utilização na indução da imunidade mucosal
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
JP2002521489A (ja) 1998-07-27 2002-07-16 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション ＣｐＧオリゴヌクレオチドの立体異性体および関連する方法
WO2000016804A1 (en) 1998-09-18 2000-03-30 Dynavax Technologies Corporation METHODS OF TREATING IgE-ASSOCIATED DISORDERS AND COMPOSITIONS FOR USE THEREIN
EP1117433A1 (en) 1998-10-09 2001-07-25 Dynavax Technologies Corporation Anti hiv compositions comprising immunostimulatory polynucleotides and hiv antigens
US8206749B1 (en) 1999-02-26 2012-06-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Microemulsions with adsorbed macromolecules and microparticles
WO2000054803A2 (en) 1999-03-16 2000-09-21 Panacea Pharmaceuticals, Llc Immunostimulatory nucleic acids and antigens
AU4343700A (en) * 1999-04-12 2000-11-14 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
US6977245B2 (en) * 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
WO2000067023A1 (en) 1999-04-29 2000-11-09 Coley Pharmaceutical Gmbh Screening for immunostimulatory dna functional modifyers
WO2000067787A2 (en) 1999-05-06 2000-11-16 The Immune Response Corporation Hiv immunogenic compositions and methods
CA2380947C (en) 1999-08-19 2011-11-01 Dynavax Technologies Corporation Methods of modulating an immune response using immunostimulatory sequences and compositions for use therein
CZ20021029A3 (cs) 1999-08-27 2002-08-14 Inex Pharmaceuticals Corp. Kompozice a její pouľití pro stimulaci sekrece cytokinů a indukci imunitní odpovědi
SK287400B6 (sk) 1999-09-25 2010-08-09 University Of Iowa Research Foundation Prostriedok s obsahom imunostimulačnej nukleovej kyseliny a jeho použitie na stimuláciu imunitnej reakcie
EP1220684B2 (en) 1999-09-27 2010-07-14 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US7223398B1 (en) 1999-11-15 2007-05-29 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions containing an immunostimulatory sequence linked to antigen and methods of use thereof
EP1322655B1 (en) 2000-01-14 2007-11-14 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
AT409085B (de) 2000-01-28 2002-05-27 Cistem Biotechnologies Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung zur immunmodulation und herstellung von vakzinen
US7157437B2 (en) * 2000-03-10 2007-01-02 Dynavax Technologies Corporation Methods of ameliorating symptoms of herpes infection using immunomodulatory polynucleotide sequences
AU9475001A (en) * 2000-09-26 2002-04-08 Hybridon Inc Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
CA2451974C (en) * 2001-06-21 2014-10-14 Karen L. Fearon Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same
JP4607452B2 (ja) 2001-08-07 2011-01-05 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 免疫調節性組成物、製剤およびその使用方法
EP1414490A1 (en) * 2001-08-10 2004-05-06 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory oligonucleotide formulations and methods for use thereof
WO2003020884A2 (en) 2001-08-14 2003-03-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Method for rapid generation of mature dendritic cells
IL160157A0 (en) 2001-08-17 2004-07-25 Coley Pharm Group Inc Combination motif immune stimulation oligonucleotides with improved activity

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