ES2347657T3 - Anticuerpos dirigidos contra il-22ra y asociados de union y procedimiento de uso en inflamacion. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de producción de un anticuerpo de un polipéptido en un animal no humano, en el que el polipéptido inoculado se selecciona del grupo (a) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 del aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 47 (Asp); (b) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 del aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 62 (Cys); (c) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 del aminoácido número 84 (Ala) al aminoácido número 97 (Ser) y (d) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 del aminoácido número 93 (Thr) al aminoácido número 120 (Met); y en el que el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido IL-22RA que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC DE ID. Nº 2 y la SEC DE ID. Nº 3 y que reduce la actividad de un polipéptido IL-22 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 6.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0001] Las citocinas son proteínas pequeñas solubles que median una variedad de efectos biológicos, incluyendo la regulación del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos celulares (véanse, por ejemplo, Arai y col., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul y Seder, Cell 76:241 (1994)). Las proteínas que constituyen el grupo de las citocinas incluyen interleucinas, interferones, factores estimulantes de colonias, factores de necrosis tumoral y otras moléculas reguladoras. Por ejemplo, la interleucina 17 humana es una citocina que estimula la expresión de interleucina 6, la molécula de adhesión intracelular 1, la interleucina 8, el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos y la expresión de la prostaglandina E2, y desempeña un papel en la maduración preferencial de precursores hematopoyéticos CD34+ a neutrófilos (Yao y col., J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiez y col., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)). [0002] Los receptores que se unen a citocinas están compuestos típicamente por una o más proteínas integrales de membrana que se unen a la citocina con elevada afinidad y transducen este evento de unión a la célula mediante porciones citoplasmáticas de ciertas subunidades de receptor. Los receptores de citocinas se han agrupado en varias clases basándose en similitudes en sus dominios extracelulares de unión a ligando. Por ejemplo, las cadenas de receptor responsables de la unión y/o transducción del efecto de los interferones son miembros de la familia de receptor de citocina de clase II, basada en una dominio extracelular característica de 200 restos. [0003] Las actividades in vivo que se han demostrado para las citocinas y sus receptores ilustran el potencial clínico y la necesidad de otras citocinas, receptores de citocina, agonistas de citocina y antagonistas de citocina. Por ejemplo, el potencial in vivo demostrado y la necesidad de antagonistas de moléculas proinflamatorias. [0004] El documento WO 99/07848 describe el receptor 11 de citocina de mamífero. El documento WO 02/12345 describe los receptores de citocina solubles Zcytor11. [0005] El documento WO 02/072607 describe un receptor de citocina heterodimérico soluble. [0006] Xie M-H y col., J. Biol. Chem., Vol. 275(40), 6 de octubre de 2000, páginas 31335-31339, describen IL-22, una citocina humana que señaliza mediante las proteínas CRF2-4 e IL-22R relacionadas con el receptor de interferón. [0007] La base de datos BIOSIS (en línea), nº de acceso PREV200100264637; y Nagalakshmi y col., FASEB Journal, nº 15 (5), 8 de marzo de 2001, página A1052, proporcionan IL-22 humana, un homólogo de IL-10 que fosforila STAT3 en células de carcinoma de colon que expresan la cadena IL-22R1. [0008] La presente invención se dirige a estas necesidades proporcionando antagonistas de las citocinas proinflamatorias IL-20 e IL-22. Dichos antagonistas de la presente invención, que pueden bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-22 o de ambas IL-20 e IL-22, son anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22R1. La invención proporciona adicionalmente usos para los mismos en enfermedades inflamatorias, así como composiciones y procedimientos relacionados.

1. Visión general

[0009] La presente memoria descriptiva describe usos novedosos de un receptor soluble designado “Zcytor11” o “IL-22RA” y de anticuerpos neutralizantes de receptores de citocina IL-22RA. La presente memoria descriptiva describe fragmentos y proteínas de fusión del polipéptido IL-22RA soluble para uso en enfermedades inflamatorias y autoinmunes humanas. Los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención, incluyendo los anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL22RA de la presente invención, se pueden usar para bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de cualquiera de IL-22 o IL-20, o de ambas IL-20 e IL-22, en el tratamiento de enfermedades humanas específicas tales como psoriasis, artritis psoriática, artritis, endotoxemia, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), colitis y otras afecciones inflamatorias dadas a conocer en la presente memoria. [0010] Se proporciona una secuencia de nucleótidos ilustrativa que codifica Zcytor11 (IL-22RA) humano por la SEC DE ID. Nº 1; el polipéptido codificado se muestra en la SEC DE ID. Nº 2. El IL-22RA es una subunidad del receptor de ambas IL-20 e IL-22. El Zcytor11 (IL-22RA) se da a conocer en la patente de EE.UU. de propiedad compartida con la presente nº 5.965.704, la publicación WIPO de propiedad compartida con la presente WO 02/12345 y la publicación WIPO de propiedad compartida con la presente WO 02/072607. El análisis de un clon de ADNc humano que codifica IL-22RA (SEC DE ID. Nº 1) reveló un marco abierto de lectura que codifica 574 aminoácidos (SEC DE ID. Nº 2) que comprende un dominio extracelular de unión a ligando de aproximadamente 211 restos de aminoácido (residuos 18-228 de las SEC DE ID. Nº 2; SEC DE ID. Nº 3), un dominio transmembrana de aproximadamente 23 restos de aminoácido (residuos 229-251 de la SEC DE ID. Nº 2) y un dominio intracelular de aproximadamente 313 restos de aminoácido (residuos 252 a 574 de la SEC DE ID. Nº 2). Por tanto, las moléculas descritas en la presente memoria incluyen polipéptidos que incluyen un dominio de unión a citocina que comprende los restos de aminoácido 18-228 de las SEC DE ID. Nº 2; SEC DE ID. Nº

3. En una realización del receptor soluble descrito en la presente memoria, se fusiona el IL-22R soluble con la región constante de la cadena pesada (mostrada representativamente en la SEC DE ID. Nº 4). Los expertos en la materia reconocerán que estos límites de dominio son aproximados. Es posible la delección de restos de los extremos de los dominios. [0011] Como se describe a continuación, la presente memoria descriptiva describe polipéptidos aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90%, o más de un 95% tal como un 96%, 97%, 98%, o más de un 99% o más, idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia 18-228 de la SEC DE ID. Nº 2, que se muestra también como la SEC DE ID. Nº 3, en la que el polipéptido aislado se une específicamente a un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID. Nº 3. Los polipéptidos ilustrativos incluyen polipéptidos que comprenden los restos de aminoácido de la SEC DE ID. Nº 2 o los restos de aminoácido de la SEC DE ID. Nº 3. Además, la presente memoria descriptiva describe polipéptidos aislados según se han dado a conocer anteriormente que se unen a IL-22 (por ejemplo, la secuencia polipeptídica de IL-22 humana como se muestra en la SEC DE ID. Nº 6). La secuencia de polinicleótidos de IL-22 humana se muestra en la SEC DE ID. Nº 5. La secuencia de polinicleótidos de IL-22 de ratón se muestra en la SEC DE ID. Nº 10, y el correspondiente polipéptido se muestra en la SEC DE ID. Nº 11. La presente memoria descriptiva describe polipéptidos aislados según se han dado a conocer anteriormente que se unen a IL-20 (por ejemplo, la secuencia polipeptídica de IL-20 humana como se muestra en la SEC DE ID. Nº 8; publicación WIPO nº WO 99/27103). La secuencia de polinicleótidos de IL-20 humana se muestra en la SEC DE ID. Nº 7. [0012] La presente memoria descriptiva describe polipéptidos aislados y epítopos que comprenden al menos 15 restos de aminoácido contiguos de una secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3. Los polipéptidos ilustrativos incluyen polipéptidos que comprenden o consisten en la SEC DE ID. Nº 3, un epítopo antigénico de la misma o un fragmento de unión a IL-20 o IL-22 funcional de la misma. Además, la presente memoria descriptiva describe polipéptidos aislados según se han dado a conocer anteriormente que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de IL-22 o IL-20.

[0013] La presente memoria descriptiva describe polipéptidos variantes de IL22RA en los que la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante comparte identidad con los restos de aminoácido de la SEC DE ID. Nº 3 seleccionados del grupo constituido por al menos un 70% de identidad, al menos un 80% de identidad, al menos un 90% de identidad, al menos un 95% de identidad o más de un 95% de identidad, tal como un 96%, 97%, 98% o más de un 99% o más de identidad, y en los que cualquier diferencia entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido variante y la correspondiente secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 es debida a una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. Dichas sustituciones de aminoácidos conservativas se describen en la presente memoria. Además, la presente memoria descriptiva describe polipéptidos aislados según se han dado a conocer anteriormente que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de IL22 o IL-20. [0014] La presente invención proporciona además anticuerpos y fragmentos de anticuerpo como se definen en las reivindicaciones que se unen específicamente a dichos polipéptidos. Los anticuerpos a modo de ejemplo incluyen anticuerpos neutralizantes, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales de murino, anticuerpos humanizados derivados de anticuerpos monoclonales de murino y anticuerpos monoclonales humanos. Los fragmentos de anticuerpo ilustrativos incluyen F(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Fab, Fv, scFv y unidades de reconocimiento mínimas. Los anticuerpos neutralizantes se unen preferiblemente a IL-22RA de tal modo que se bloquee, inhiba, antagonice o neutralice la interacción de IL-20 e IL-22 con IL-22RA; están también comprendidos por la presente invención los anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22RA tal que bloqueen, inhiban, reduzcan, antagonicen o neutralicen la unión de IL-20 o IL-22 a IL-22RA. Es decir, los anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22RA de la presente invención pueden unirse, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar cualquiera de IL-20 o IL-22 individualmente, o unirse, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar IL-20 e IL-22 simultáneamente. La presente memoria descriptiva describe composiciones que comprenden un portador y un péptido, polipéptido o anticuerpo descrito en la presente memoria. [0015] Además, la presente memoria descriptiva describe composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y al menos uno de dichos vectores de expresión o virus recombinantes que comprenden dichos vectores de expresión. La presente invención incluye adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y un polipéptido o anticuerpo descrito en la presente memoria. [0016] La presente memoria descriptiva describe anticuerpos antiidiotípicos, o fragmentos de anticuerpo antiidiotípico, que se unen específicamente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 o un fragmento de la misma. Un anticuerpo antiidiotípico ejemplar se une a un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido constituido por la SEC DE ID. Nº 3. [0017] La presente memoria descriptiva describe proteínas de fusión que comprenden un polipéptido IL-22RA y un resto de inmunoglobulina. En dichas proteínas de fusión, el resto de inmunoglobulina puede ser una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, tal como un fragmento Fc humano. La presente memoria descriptiva describe moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican dichas proteínas de fusión. [0018] La presente invención proporciona también anticuerpos policlonales y monoclonales como se definen en las reivindicaciones que se unen a polipéptidos que comprenden un dominio extracelular IL-22RA tal como receptores monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos, incluyendo receptores solubles. Además, dichos anticuerpos se pueden usar para antagonizar la unión de los ligandos de IL-22RA, IL-22 (SEC DE ID. Nº 6) e IL-20 (SEC DE ID. Nº 8), individual o conjuntamente, al receptor IL-22RA. [0019] Además, se ha mostrado sobreexpresión o regulación en exceso de IL-22 e IL-20 en muestras de piel humana con lesiones psoriáticas y con dermatitis atópica, sugiriendo que la IL-22, como la IL-20, está también implicada en la psoriasis humana, dermatitis atópica u otras enfermedades inflamatorias de la piel y los tejidos epiteliales. Además, como se describe en la presente memoria, la sobreexpresión de IL-20 o IL-22 en ratones transgénicos mostró un engrosamiento epidérmico y una implicación de células inmunitarias indicativos de un fenotipo psoriático; y además la inyección de IL-22 en ratones normales mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunitarias indicativos de un fenotipo psoriático que se anuló por el antagonista de receptor soluble IL-22RA2 (zcytor16; publicación WIPO nº WO 01/40467). Dichos datos in vivo sugieren adicionalmente que la IL-22 proinflamatoria está implicada en psoriasis, dermatitis atópica u otras enfermedades inflamatorias de la piel y los tejidos epiteliales. De esta forma, los antagonistas de la actividad de IL-22 e IL-20, tales como anticuerpos de los receptores solubles IL-22RA, incluyendo los anticuerpos monoclonales y neutralizantes dirigidos contra IL-22RA humanos de la presente invención, son útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas de ambas IL-22 e IL-20, individual o conjuntamente, en el tratamiento de psoriasis. Además, los antagonistas de la actividad de IL-22, tales como anticuerpos de los receptores solubles IL-22RA, incluyendo los anticuerpos monoclonales y neutralizantes anti-IL-22RA humanos de la presente invención, son útiles en el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias, por ejemplo, ya que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan IL22 e IL-20 (individual o simultáneamente) en el tratamiento de dermatitis atópica, EII, colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide y artritis psoriática, enfermedad respiratoria del adulto (ERA), choque séptico, insuficiencia multiorgánica, lesión pulmonar inflamatoria tal como asma o bronquitis, neumonía bacteriana, psoriasis, eccema, dermatitis atópica y de contacto y enfermedad inflamatoria intestinal tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn. [0020] Estos y otros aspectos de la invención resultarán evidentes en referencia a la siguiente descripción detallada.

2. Definiciones

[0021] En la descripción siguiente se usan extensamente una serie de términos. Se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar la comprensión de la invención. [0022] Como se usa en la presente memoria, “ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico” designa polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquiera de ligamiento, escisión, acción de endonucleasa y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos de origen natural (tales como ADN y ARN) o análogos de nucleótidos de origen natural (por ejemplo, formas enantioméricas α de nucleótidos de origen natural) o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en los restos de azúcar y/o en los restos de base de pirimidina o purina. Las modificaciones del azúcar incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más grupos hidroxilo por halógeno, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden funcionalizarse a éteres o ésteres. Además, el resto azúcar entero puede reemplazarse por estructuras estérica y electrónicamente similares tales como azaazúcares y análogos de azúcar carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en un resto básico incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Las modificaciones de ácido nucleico en un resto básico incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden estar ligados por enlaces fosfodiéster o análogos de dichos ligamientos. Los análogos de ligamientos fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares. El término “molécula de ácido nucleico” incluye también los denominados “ácidos nucleicos peptídicos”, que comprenden bases de ácido nucleico de origen natural o modificadas unidas a una cadena principal de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. [0023] La expresión “complemento de una molécula de ácido nucleico” designa una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria y una orientación inversa en comparación con una secuencia de nucleótidos de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5’ ATGCACGGG 3’ es complementaria de 5’ CCCGTGCAT 3’. [0024] La expresión “secuencia de nucleótidos degenerada” indica una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados en comparación con una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido. Los codones degenerados codifican tripletes diferentes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo de aminoácidos (concretamente, los tripletes GAU y GAC codifican cada uno Asp). [0025] La expresión “gen estructural” designa una molécula de ácido nucleico que se transcribe a ARN mensajero (ARNm), que se traduce entonces a una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico. [0026] Una “molécula de ácido nucleico aislada” es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que se ha separado del ADN genómico de una célula es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo de una molécula de ADN aislada es una molécula de ácido nucleico sintetizada químicamente que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que se ha aislado de una especie particular es menor que la molécula de ADN completa de un cromosoma de esa especie. [0027] Una “construcción de molécula de ácido nucleico” es una molécula de ácido nucleico, monocatenaria o bicatenaria, que se ha modificado por intervención humana para contener segmentos de ácido nucleico combinados y yuxtapuestos en una disposición no existente en la naturaleza. [0028] “ADN lineal” indica moléculas de ADN no circulares que tienen extremos 5’ y 3’ libres. El ADN lineal puede prepararse a partir de moléculas de ADN circulares cerradas, tales como plásmidos, mediante digestión o desestabilización física. [0029] “ADN complementario (ADNc)” es una molécula de ADN monocatenaria que se forma a partir de una plantilla de ARNm mediante la enzima transcriptasa inversa. Típicamente, se emplea un cebador complementario de porciones del ARNm para la iniciación de la transcripción inversa. Los expertos en la materia usan también el término “ADNc” para designar una molécula de ADN bicatenaria constituida por dicha molécula de ADN monocatenaria y su cadena de ADN complementaria. El término “ADNc” designa también un clon de una molécula de ADN monocatenaria y su cadena de ADN complementaria. El término “ADNc” designa también un clon de una molécula de ADNc sintetizada a partir de una plantilla de ARN. [0030] Un “promotor” es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. Típicamente, un promotor se localiza en la región 5’ no codificante de un gen, proximal al sitio de inicio transcripcional de un gen estructural. Los elementos de secuencia en los promotores que funcionan en el inicio de la transcripción se caracterizan a menudo por secuencias de nucleótidos de consenso. Estos elementos promotores incluyen sitios de unión a ARN polimerasa, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos específicos de diferenciación (DSE; McGehee y col., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), elementos de respuesta a AMP cíclico (CRE), elementos de respuesta sérica (SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1: 47 (1990)), elementos de respuesta a glucocorticoides (GRE) y sitios de unión para otros factores de transcripción tales como CRE/ATF (OReilly y col., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)), AP2 (Ye y col., J. Biol. Chem. 269: 25728 (1994)), SP1, proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) y factores octaméricos (véanse, en general Watson y col., eds., “Molecular Biology of the Gene”, 4ª ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987) y Lemaigre y Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994)). Si el promotor es un promotor inducible, entonces la velocidad de transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor. En contraposición, la velocidad de transcripción no está regulada por un agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo. Son también conocidos promotores reprimibles. [0031] Un “promotor mínimo” contiene las secuencias de nucleótidos esenciales para la función promotora, incluyendo la secuencia TATA y de inicio de la transcripción. Según esta definición, un promotor mínimo puede tener actividad detectable o no en ausencia de secuencias específicas que pueden potenciar la actividad o conferir actividad específica de tejido. [0032] Un “elemento regulador” es una secuencia de nucleótidos que modula la actividad de un promotor mínimo. Por ejemplo, un elemento regulador puede contener una secuencia de nucleótidos que se une a factores celulares, posibilitando la transcripción exclusiva o preferiblemente en células, tejidos u orgánulos particulares. Estos tipos de elementos reguladores están asociados normalmente con genes que se expresan de manera “específica de célula”, “específica de tejido” o “específica de orgánulo”. [0033] Un “potenciador” es un tipo de elemento regulador que puede aumentar la eficacia de la transcripción, independientemente de la distancia u orientación del potenciador respecto al sitio de inicio de la transcripción. [0034] “ADN heterólogo” designa una molécula de ADN, o una población de moléculas de ADN, que no existe en la naturaleza en una célula hospedadora dada. Las moléculas de ADN heterólogo de una célula hospedadora particular pueden contener ADN derivado de la especie celular hospedadora (concretamente ADN endógeno) a condición de que ese ADN hospedador esté combinado con ADN no hospedador (concretamente, ADN exógeno). Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN no hospedador que codifica un polipéptido ligado operativamente a un segmento de ADN hospedador que comprende un promotor de transcripción se considera que es una molécula de ADN heterólogo. A la inversa, una molécula de ADN heterólogo puede comprender un gen endógeno ligado operativamente con un promotor exógeno. Como otra ilustración, una molécula de ADN que comprende un gen derivado de una célula de tipo silvestre se considera que es ADN heterólogo si esta molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen de tipo silvestre. [0035] Un "polipéptido” es un polímero de restos de aminoácido unidos por enlaces peptídicos, tanto producido natural como sintéticamente. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 restos de aminoácido se designan habitualmente como “péptidos” [0036] Una “proteína” es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína puede comprender también componentes no peptídicos tales como grupos carbohidrato. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden añadirse a una proteína por la célula en que se produce la proteína, y variarán con el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente memoria en términos de sus estructuras de cadena principal de aminoácidos; los sustituyentes tales como grupos carbohidrato generalmente no se especifican, pero pueden estar presentes, no obstante. [0037] Un péptido o polipéptido codificado por una molécula de ADN no hospedador es un péptido o polipéptido “heterólogo”. [0038] Un "vector de clonación” es una molécula de ácido nucleico, tal como un plásmido, cósmido o bacteriófago, que tiene la capacidad de replicarse autónomamente en una célula hospedadora. Los vectores de clonación contienen típicamente uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción que permiten la inserción de una molécula de ácido nucleico de una forma determinable sin pérdida de la función biológica esencial del vector, así como secuencias de nucleótidos que codifican un gen marcador que es adecuado para uso en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores incluyen típicamente genes que proporcionan resistencia a tetraciclina o resistencia a ampicilina. [0039] Un “vector de expresión” es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula hospedadora. Típicamente, un vector de expresión comprende un promotor de transcripción, un gen y un terminador de transcripción. La expresión génica se dispone habitualmente bajo el control de un promotor, y dicho gen se dice que está “ligado operativamente” al promotor. De forma similar, están ligados operativamente un elemento regulador y un promotor mínimo si el elemento regulador modula la actividad del promotor mínimo. [0040] Un “hospedador recombinante” es una célula que contiene una molécula de ácido nucleico heteróloga, tal como un vector de clonación o vector de expresión. En el presente contexto, es un ejemplo de un hospedador recombinante una célula que produce IL-22RA a partir de un vector de expresión. En contraposición, puede producirse IL-22RA por una célula que es una “fuente natural” de IL-22RA, y que carece de un vector de expresión. [0041] Los “transformantes integrativos” son células hospedadoras recombinantes en las que se ha integrado ADN heterólogo en el ADN genómico de las células. [0042] Una "proteína de fusión” es una proteína híbrida expresada por una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos procedentes de al menos dos genes. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender al menos parte de un polipéptido IL-22RA fusionado con un polipéptido que se une a una matriz de afinidad. Dicha proteína de fusión proporciona un medio para aislar grandes cantidades de IL-22RA usando cromatografía de afinidad. [0043] El término “receptor” indica una proteína asociada a una célula que se une a una molécula bioactiva denominada “ligando”. Esta interacción media el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores pueden ser receptores unidos a membrana, citosólicos o nucleares; monoméricos (por ejemplo, receptor de hormona estimulante del tiroides; receptor adrenérgico β) o multiméricos (por ejemplo, receptor de PDGF, receptor de la hormona del crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6). Los receptores unidos a membrana se caracterizan por una estructura multidominio que comprende un dominio extracelular de unión a ligando y un dominio intracelular efector que está típicamente implicado en la transducción de señal. En ciertos receptores unidos a membrana, el dominio extracelular de unión a ligando y el dominio intracelular efector están localizados en polipéptidos separados que comprenden el receptor funcional completo. [0044] En general, la unión de ligando a receptor da como resultado un cambio conformacional en el receptor que causa una interacción entre el dominio efector y otras moléculas de la célula, que a su vez conduce a una alteración del metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos que a menudo están ligados a interacciones receptor-ligando incluyen transcripción génica, fosforilación, desfosforilación, aumentos en la producción de AMP cíclico, movilización de calcio celular, movilización de los lípidos de membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos. [0045] Un “receptor soluble” es un polipéptido receptor que no está unido a una membrana celular. Lo más frecuente es que los receptores solubles sean polipéptidos receptores de unión a ligando que carecen de dominios transmembrana y citoplasmático y de otras uniones ligamientos a la membrana celular tales como mediante glucofosfoinositol (gpi). Los receptores solubles pueden comprender restos de aminoácido adicionales tales como etiquetas de afinidad que posibilitan la purificación del polipéptido o posibilitan sitios para la unión del polipéptido a un sustrato, o secuencias de región constante de inmunoglobulina. Muchos receptores de superficie celular tienen contrapartidas solubles de origen natural que se producen a partir de fragmentos de ARNm de cortados y empalmados de forma alternativa tras proteólisis. Los receptores solubles pueden ser monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos, no comprendiendo generalmente los receptores multiméricos más de 9 subunidades, preferiblemente no comprendiendo más de 6 subunidades, y lo más preferiblemente no comprendiendo más de 3 subunidades. Se dice que los polipéptidos receptores están sustancialmente exentos de segmentos de polipéptidos transmembrana e intracelulares cuando carecen de suficientes porciones de estos segmentos para proporcionar anclaje a membrana o transducción de señal, respectivamente. Los receptores solubles de receptores de citocina de clase I y clase II comprenden generalmente el dominio extracelular de unión a citocina exento de dominio transmembrana y de dominio intracelular. Por ejemplo, los receptores solubles representativos incluyen receptores solubles de CRF2-4 (denominado IL10RB) (nº de acceso a Genbank Z17227) como se muestra en la SEC DE ID. Nº 44 y la SEC DE ID. Nº 45; un receptor soluble de IL-10RA (nº de acceso a Genbank U00672 y NM_001558) como se muestra en la SEC DE ID. Nº 46; un receptor soluble de pDIRS1 (denominado IL-20RB) (nº de acceso a Genbank AY358305) como se muestra en la SEC DE ID. Nº 47 y un receptor soluble de IL-22RA (patente de EE.UU. nº 5.965.704) como se muestra en la SEC DE ID. Nº 3. Está entre el conocimiento de un experto en la materia diseñar cuáles secuencias de una secuencia de citocina de clase I o clase II conocida comprenden el dominio extracelular de unión a citocina exento de dominio transmembrana e intracelular. Además, un experto en la materia puede determinar fácilmente, usando el código genético, los polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos de receptor soluble. [0046] El término “secuencia señal secretora” indica una secuencia de ADN que codifica un péptido (“un péptido secretor”) que, como componente de un polipéptido mayor, dirige al polipéptido mayor a través de una ruta secretora de una célula mediante el que se sintetiza. El polipéptido mayor se escinde habitualmente para retirar el péptido secretor durante el tránsito a través de la ruta secretora. [0047] Un “polipéptido aislado” es un polipéptido que está esencialmente exento de componentes celulares contaminantes tales como carbohidrato, lípido u otras impurezas proteicas asociadas al polipéptido en la naturaleza. Típicamente, una preparación de polipéptido aislado contiene el polipéptido en forma altamente purificada, concretamente, al menos aproximadamente un 80% puro, al menos aproximadamente un 90% puro, al menos aproximadamente un 95% puro, más de un 95% puro, tal como un 96%, 97% o 98% o más puro, o más de un 99% puro. Un modo de mostrar que una preparación de proteína particular contiene un polipéptido aislado es por la aparición de una sola banda después de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS) de la preparación de proteína y tinción del gel con azul brillante de Coomasie. Sin embargo, el término “aislado” no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas glucosiladas o derivatizadas de forma alternativa. [0048] Los términos “aminoterminal” y “carboxiterminal” se usan en la presente memoria para indicar posiciones en los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, se usan estos términos con referencia a una secuencia o porción particular de un polipéptido para indicar la proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia situada carboxiterminal a una secuencia de referencia en un polipéptido está localizada proximal al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo. [0049] El término “expresión” designa la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión implica la transcripción del gen estructural a ARNm y la traducción de ARNm a uno o más polipéptidos. [0050] La expresión “variante de corte y empalme” se usa en la presente memoria para indicar formas alternativas de ARN transcritas a partir de un gen. La variación de corte y empalme surge naturalmente mediante el uso de sitios de corte y empalme alternativos en una molécula de ARN transcrita, o menos habitualmente entre moléculas de ARN transcritas independientemente, y puede dar como resultado varios ARNm transcritos a partir del mismo gen. Las variantes de corte y empalme pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término variante de corte y empalme se usa también en la presente memoria para indicar un polipéptido codificado por una variante de corte y empalme de un ARNm transcrito a partir de un gen. [0051] Como se usa en la presente memoria, el término “inmunomodulador” incluye citocinas, factores de crecimiento de células madre, linfotoxinas, moléculas coestimulantes, factores hematopoyéticos y similares, y análogos sintéticos de estas moléculas. [0052] La expresión “par de complemento/anticomplemento” indica restos no idénticos que forman un par estable asociado no covalentemente en condiciones apropiadas. Por ejemplo, biotina y avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de un par de complemento/anticomplemento. Otros pares ejemplares de complemento/anticomplemento incluyen pares de receptor/ligando, pares de anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítopo), pares de polinucleótido codificante/no codificante y similares. Cuando es deseable la disociación posterior del par de complemento/anticomplemento, el par de complemento/anticomplemento tiene preferiblemente una afinidad de unión de menos de 109 M-1. [0053] Un “anticuerpo antiidiotípico” es un anticuerpo que se une al dominio de región variable de una inmunoglobulina. En el presente contexto, un anticuerpo antiidiotípico se une a la región variable de un anticuerpo dirigido contra IL-22RA, y por tanto un anticuerpo antiidiotípico imita un epítopo de IL-22RA. [0054] Un “fragmento de anticuerpo” es una porción de un anticuerpo tal como F(ab’)2, F(ab)2, Fab’, Fab y similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une al mismo antígeno que reconoce el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal dirigido contra IL-22RA se une a un epítopo de IL-22RA. [0055] El término “fragmento de anticuerpo” incluye también un polipéptido sintético o modificado por ingeniería genética que se une a un antígeno específico, tal como polipéptidos constituidos por la región variable de la cadena ligera, los fragmentos “Fv” constituidos por las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas polipeptídicas monocatenarias recombinantes en las que las regiones variables ligera y pesada están conectadas por un ligamiento peptídico (“proteínas scFV”) y unidades de reconocimiento mínimas constituidas por los restos de aminoácido que imitan la región hipervariable. [0056] Un “anticuerpo quimérico” es una proteína recombinante que contiene los dominios variables y regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo de roedor, mientras que el resto de la molécula de anticuerpo deriva de un anticuerpo humano. [0057] “Anticuerpos humanizados” son proteínas recombinantes en las que se han transferido las regiones determinantes de la complementariedad de murino desde un anticuerpo monoclonal de cadenas variables pesada y ligera de la inmunoglobulina de murino a un dominio variable humano. La construcción de anticuerpos humanizados para uso terapéutico en seres humanos que derivan de anticuerpos de murino, tales como aquellos que se unen a o neutralizan una proteína humana, está dentro de las habilidades de un experto en la materia. [0058] Como se usa en la presente memoria, “un agente terapéutico” es una molécula o átomo que está conjugado con un resto de anticuerpo produciendo un conjugado que es útil para terapia. Los ejemplos de agentes terapéuticos incluyen fármacos, toxinas, inmunomoduladores, quelantes, compuestos de boro, agentes fotoactivos o tintes y radioisótopos. [0059] Un “marcador detectable” es una molécula o átomo que puede conjugarse con un resto de anticuerpo produciendo una molécula útil para diagnóstico. Los ejemplos de marcadores detectables incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, agentes fluorescentes, iones paramagnéticos u otros restos marcadores. [0060] La expresión “marcado por afinidad” se usa en la presente memoria para indicar un segmento de polipéptido que se puede unir a un segundo polipéptido posibilitando la purificación o detección del segundo polipéptido o posibilitando sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, puede usarse como marcado por afinidad cualquier péptido o proteína para el que esté disponible un anticuerpo u otro agente de unión específica. Los marcajes de afinidad incluyen un tramo de polihistidina, proteína A (Nilsson y col., EMBO J. 4: 1075 (1985); Nilsson y col., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), glutation-S-transferasa (Smith y Johnson, Gene

67: 31 (1988)), marcado por afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)), sustancia P, péptido FLAG (Hopp y col., Biotechnology 6:1204 (1988)), péptido de unión a estreptavidina u otro epítopo antigénico o dominio de unión. Véase en general Ford y col., “Protein Expression and Purification” 2:95 (1991). Están disponibles moléculas de ADN que codifican marcajes de afinidad en suministradores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). [0061] Un “anticuerpo desnudo” es un anticuerpo entero, en contraposición a un fragmento de anticuerpo, que no está conjugado con un agente terapéutico. Los anticuerpos desnudos incluyen anticuerpos tanto policlonales como monoclonales, así como ciertos anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos quiméricos y humanizados. [0062] Como se usa en la presente memoria, el término “componente de anticuerpo” incluye tanto un anticuerpo entero como un fragmento de anticuerpo. [0063] Un “inmunoconjugado” es un conjugado de un componente de anticuerpo con un agente terapéutico o un marcador detectable. [0064] Como se usa en la presente memoria, el término “proteína de fusión de anticuerpo” designa una molécula recombinante que comprende un componente de anticuerpo y un componente de polipéptido IL-22RA. Los ejemplos de proteína de fusión de anticuerpo incluyen una proteína que comprende un dominio extracelular de IL-22RA y un dominio Fc o una región de unión a antígeno. [0065] Un “polipéptido diana” o un “péptido diana” es una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un epítopo y que se expresa en una célula diana tal como una célula tumoral o una célula que porta un antígeno de agente infeccioso. Los linfocitos T reconocen epítopos peptídicos presentados por una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad a un polipéptido diana o péptido diana, y lisan típicamente la célula diana o agrupan otras células inmunitarias en el sitio de la célula diana, destruyendo así la célula diana. [0066] Un “péptido antigénico” es un péptido que se unirá a una molécula de complejo mayor de histocompatibilidad formando un complejo MHC-péptido que se reconoce por un linfocito T, induciendo así una respuesta linfocítica citotóxica tras la presentación al linfocito T. Por tanto, los péptidos antigénicos son capaces de unirse a una molécula de complejo mayor de histocompatibilidad apropiada e inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos, tal como lisis celular o una liberación de citocina específica frente a la célula diana que se une a o expresa el antígeno. El péptido antigénico puede unirse, en el contexto de una molécula de complejo mayor de histocompatibilidad de clase I o clase II, a una célula presentadora de antígeno o a una célula diana. [0067] En eucariotas, la ARN polimerasa II cataliza la transcripción de un gen estructural para producir ARNm. Se puede diseñar una molécula de ácido nucleico para que contenga una plantilla de ARN polimerasa II en la que el transcrito de ARN tiene una secuencia que es complementaria de la del un ARNm específico. El transcrito de ARN se denomina un “ARN no codificante” y la molécula de ácido nucleico que codifica el ARN no codificante se denomina un “gen no codificante”. Las moléculas de ARN no codificantes son capaces de unirse a moléculas de ARNm, dando como resultado la inhibición de la traducción de ARNm. [0068] Un “oligonucleótido no codificante específico de IL-22RA” o un "oligonucleótido no codificante IL-22RA” es un oligonucleótido que tiene una secuencia (a) capaz de formar una cadena triple estable con una porción del gen IL22RA, o (b) capaz de formar una cadena doble estable con una porción de un transcrito de ARNm del gen IL-22RA. [0069] Una “ribozima” es una molécula de ácido nucleico que contiene un centro catalítico. El término incluye enzimas de ARN, ARN de autocorte y empalme, ARN de autoescisión y las moléculas de ácido nucleico que efectúan estas funciones catalíticas. Una molécula de ácido nucleico que codifica una ribozima se denomina un “gen de ribozima”. [0070] Una “secuencia de guía externa” es una molécula de ácido nucleico que dirige la ribozima endógena, ARNasa P, a una especie particular de ARNm intracelular, dando como resultado la escisión del ARNm por la ARNasa P. Una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de guía externa se denomina un “gen de secuencia de guía externa”. [0071] El término “gen variante de IL-22RA” designa moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es una modificación de la SEC DE ID. Nº 3. Dichas variantes incluyen polimorfismos de origen natural de genes IL-22RA, así como genes sintéticos que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas de la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3. Las formas variantes adicionales de los genes IL-22RA son moléculas de ácido nucleico que contienen inserciones o deleciones de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria. Puede identificarse un gen variante de IL-22RA, por ejemplo, determinando si el gen hibrida con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC DE ID. Nº 1, o su complemento, en condiciones rigurosas. [0072] Como alternativa, los genes variantes de IL-22RA se pueden identificar mediante comparación de secuencia. Dos secuencias de aminoácidos tienen “un 100% de identidad de secuencia de aminoácidos” si los restos de aminoácido de las dos secuencias de aminoácidos son iguales cuando se alinean para máxima correspondencia. De forma similar, dos secuencias de nucleótidos tienen “un 100% de identidad de secuencia de nucleótidos” si los residuos nucleotídicos de las dos secuencias de nucleótidos son iguales cuando se alinean para correspondencia máxima. Pueden efectuarse comparaciones de secuencia usando programas de software estándar tales como los incluidos en el paquete bioinformático LASERGENE, que se produce por DNASTAR (Madison, Wisconsin). Son bien conocidos por los expertos en la materia otros procedimientos para comparar dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos determinando el alineamiento óptimo (véanse, por ejemplo, Peruski y Peruski, “The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research” (ASM Press, Inc. 1997), Wu y col. (eds.), “Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," en Methods in Gene Biotechnology, páginas 123-151 (CRC Press, Inc. 1997) y Bishop (ed.), “Guide to Human Genome Computing”, 2ª edición (Academic Press, Inc. 1998)). Se describen a continuación procedimientos particulares para determinar la identidad de secuencia. [0073] Independientemente del procedimiento particular usado para identificar un gen variante de IL-22RA o polipéptido variante de IL-22RA, un gen variante o polipéptido codificado por un gen variante puede caracterizarse funcionalmente por la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo dirigido contra IL-22RA. Un gen variante de IL-22RA o polipéptido variante de IL-22RA puede caracterizarse funcionalmente también por la capacidad de unirse a su ligando, IL-22, usando un ensayo biológico o bioquímico descrito en la presente memoria. [0074] El término “variante alélica” se usa en la presente memoria para indicar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente mediante mutación y puede dar como resultado un polimorfismo fenotípico en las poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. El término variante alélica se usa también en la presente memoria para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. [0075] El término “ortólogo” indica un polipéptido o proteína obtenido a partir de una especie que es la contrapartida funcional de un polipéptido o proteína de una especie diferente. Las diferencias de secuencia entre ortólogos son el resultado de la especiación. [0076] “Parálogas” son proteínas distintas pero estructuralmente relacionadas creadas por un organismo. Se cree que las proteínas parálogas surgen por duplicación génica. Por ejemplo, globina α, globina β y mioglobina son parálogas entre sí. [0077] La presente invención incluye fragmentos funcionales de genes IL-22RA. Dentro del contexto de esta invención, un “fragmento funcional” de un gen IL-22RA designa una molécula de ácido nucleico que codifica una porción de un polipéptido IL22RA que es un dominio descrito en la presente memoria o que se une específicamente al menos a un anticuerpo dirigido contra IL-22RA. [0078] Debido a la imprecisión de los procedimientos analíticos estándar, los pesos moleculares y longitudes de polímeros se entiende que son valores aproximados. Cuando dicho valor se expresa como “aproximadamente” X, el valor indicado de X se entenderá que es exacto al ±10%.

3. Producción de polinucleótidos o genes IL-22RA [0079] Las moléculas de ácido nucleico que codifican un gen IL-22RA humano pueden obtenerse cribando una biblioteca de ADNc o genómico humano usando sondas de polinucleótidos basadas en la SEC DE ID. Nº 1. Estas técnicas son estándar y bien establecidas y pueden realizarse usando kits de clonación disponibles de suministradores comerciales. Véanse, por ejemplo, Ausubel y col. (eds.), “Short Protocols in Molecular Biology”, 3ª edición, John Wiley & Sons 1995; Wu y col., “Methods in Gene Biotechnology”, CRC Press, Inc. 1997; Aviv y Leder, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 69:1408 (1972); Huynh y col., "Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11," en “DNA Cloning: A Practical Approach” Vol. I. Glover (ed.), página 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) en las páginas 47-52. [0080] Las moléculas de ácido nucleico que codifican un gen IL-22RA humano pueden obtenerse también usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con

5 cebadores de oligonucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos basadas en las secuencias de nucleótidos del gen IL-22RA o su ADNc. Se proporcionan los procedimientos generales para cribar colecciones con PCR, por ejemplo, por Yu y col., “Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries”, en “Methods in Molecular Biology. Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications”,

10 White (ed.), Humana Press, Inc., 1993. Además, se describen las técnicas para usar PCR para aislar genes relacionados, por ejemplo, en Preston, “Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members”, en “Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications,” White (ed.), Humana Press, Inc. 1993. Como alternativa,

15 puede obtenerse un gen IL-22RA sintetizando moléculas de ácido nucleico usando oligonucleótidos largos mutuamente cebadores y las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria (véase, por ejemplo, Ausubel (1995)). Las técnicas establecidas de uso de la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la capacidad de sintetizar moléculas de ADN de al menos dos kilobases de longitud

20 (Adang y col., “Plant Molec. Biol.” 21:1131 (1993), Bambot y col., “PCR Methods and Applications” 2:266 (1993), Dillon y col., “Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes”, en “Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications”, White (ed.), páginas 263-268, (Humana Press, Inc. 1993 y Holowachuk y col., “PCR Methods Appl.” 4:299

25 (1995)). Para revisiones de la síntesis de polinucleótidos véanse, por ejemplo, Glick y Pasternak, “Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA” (ASM Press 1994), Itakura y col., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984) y Climie y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 87:633 (1990).

4. Producción de variantes del gen IL-22RA

30 [0081] La presente memoria descriptiva describe una variedad de moléculas de ácido nucleico, incluyendo moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos IL-22RA dados a conocer en la presente memoria. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente que, a la vista de la degeneración del código genético, es posible una considerable variación de secuencia entre estas moléculas de

35 polinucleótidos. Además, la presente memoria descriptiva describe polipéptidos receptores solubles monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos que comprenden al menos una subunidad de receptor IL-22RA que es sustancialmente homóloga del polipéptido receptor de SEC DE ID. Nº 3. Por tanto, la presente memoria descriptiva describe moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido

5 IL-22RA que comprenden nucleótidos degenerados de la SEC DE ID. Nº 1 y sus equivalentes de ARN. [0082] La Tabla 1 define el código de una letra para indicar posiciones degeneradas de nucleótidos. “Resoluciones” son los nucleótidos indicados por el código de una letra. “Complemento” indica el código de los nucleótidos

10 complementarios. Por ejemplo, el código Y indica C o T, y su complemento R indica A o G, siendo A complementario de T y siendo G complementario de C. Tabla 1

Nucleótido

Resolución Complemento Resolución

A

A

T T

C

C

G G

T

T

A A

R

A/G Y C/T

Y

C/T R A/G

M

A/C K G/T

K

G/T M A/C

S

C/G S C/G

W

A/T W A/T

H

A/C/T D A/G/T

B

C/G/T V A/C/G

V

A/C/G B C/G/T

D

A/G/T H A/C/T

N

A/C/G/T N A/C/G/T

[0083] Los codones degenerados, que comprenden todos los codones posibles de un aminoácido dado, se definen en la Tabla 2.

15 Tabla 2

Amino-ácido

Código una letra de Codones Codón degenerado

Cys

C TGC TGT TGY

Ser

S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN

Thr

T ACA ACC ACG ACT ACN

Pro

P CCA CCC CCG CCT CCN

Ala

A GCA GCC GCG GCT GCN

Gly

G GGA GGC GGG GGT GGN

Asn

N AAC AAT AAY

Asp

D GAC GAT GAY

Glu

E GAA GAG GAR

Gln

Q CAA CAG CAR

His

H CAC CAT CAY

Arg

R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN

Lys

K AAA AAG AAR

Met

M ATG ATG

Ile

I ATA ATC ATT ATH

Leu

L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN

Val

V GTA GTC GTG GTT GTN

Phe

F TTC TTT TTY

Tyr

Y TAC TAT TAY

Trp

W TGG TGG

Ter

- TAA TAG TGA TRR

Asn/Asp

B RAY

Gly/Gln

Z SAR

Cualquiera

C NNN

[0084] Un experto en la materia apreciará que se introduce cierta ambigüedad en la determinación de un codón degenerado, representativa de todos los posibles codones que codifican un aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado de serina (WSN) puede codificar, en algunas circunstancias, arginina (AGR), y el codón degenerado de 5 arginina (MGN) puede codificar, en algunas circunstancias, serina (AGY). Existe una relación similar entre los codones que codifican fenilalanina y leucina. Por tanto, algunos polinucleótidos comprendidos por la secuencia degenerada pueden codifican secuencias de aminoácidos variantes, pero un experto en la materia puede identificar fácilmente dichas secuencias variantes por referencia a las secuencias de aminoácidos

10 de la SEC DE ID. Nº 3. En las secuencias variantes puede ensayarse fácilmente la funcionalidad como se describe en la presente memoria. [0085] Diferentes especies pueden exhibir un “uso de codón preferido”. En general, véanse Grantham y col., Nucl. Acids Res. 8: 1893 (1980), Haas y col. Curr. Biol. 6:315 (1996), Wain-Hobson y col., Gene 13:355 (1981), Grosjean y Fiers, Gene

18:199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573 (1982), Sharp y Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (1995) y Makrides, Microbiol. Rev. 60:512 (1996). Como se usa en la presente memoria, el término “uso de codón preferido” o “codones preferidos” es un término de la materia referente a los codones de traducción de proteína que se usan más frecuentemente en células de una cierta especie, favoreciendo así a uno o a unos pocos representantes de los posibles codones que codifican cada aminoácido (véase la Tabla 2). Por ejemplo, el aminoácido treonina (Thr) puede estar codificado por ACA, ACC, ACG o ACT, pero en células de mamífero, ACC es el codón más habitualmente usado; en otras especies, por ejemplo, células de insecto, levadura, virus o bacterias, pueden preferirse codones de Thr diferentes. Los codones preferidos para una especie particular pueden introducirse en los polinucleótidos de la presente invención mediante una variedad de procedimientos conocidos en la materia. La introducción de secuencias de codón preferido en el ADN recombinante puede potenciar, por ejemplo, la producción de proteína haciendo la traducción de proteína más eficaz en un tipo celular o especie particular. Por lo tanto, las secuencias de codón degenerado dadas a conocer en la presente memoria sirven como molde para optimizar la expresión de polinucleótidos en diversos tipos celulares y especies usados habitualmente en la materia y dados a conocer en la presente memoria. Las secuencias que contienen codones preferidos pueden ensayarse y optimizarse para expresión en diversas especies, y ensayarse la funcionalidad como se da a conocer en la presente memoria. [0086] Puede aislarse un ADNc que codifica IL-22RA mediante una variedad de procedimientos, tales como sondeando con un ADNc humano completo o parcial o con uno o más conjuntos de sondas degeneradas basadas en las secuencias dadas a conocer. Puede clonarse también un ADNc usando la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores diseñados a partir de las secuencias de IL-22RA humano representativas dadas a conocer en la presente memoria. Además, puede usarse una colección de ADNc para transformar o transfectar células hospedadoras, y la expresión del ADNc de interés puede detectarse con un anticuerpo de polipéptido IL-22RA. [0087] Los expertos en la materia reconocerán que la secuencia dada a conocer en la SEC DE ID. Nº 1 representa un solo alelo de IL-22RA humano, y que se espera que aparezca variación alélica y corte y empalme alternativos. Las variantes alélicas de esta secuencia pueden clonarse sondeando ADNc o colecciones genómicas de diferentes individuos según procedimientos estándar. Las variantes alélicas de las secuencias de nucleótidos dadas a conocer en la presente memoria, incluyendo aquellas que contienen mutaciones silenciosas y aquellas en que las mutaciones dan como resultado cambios de secuencia de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención, así como las proteínas que son variantes alélicas de las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en la presente memoria. Se describen en la presente memoria moléculas de ADNc generadas a partir de ARNm cortados y empalmados de forma alternativa, que retienen las propiedades del polipéptido IL-22RA, así como los polipéptidos codificados por dichos ADNc y ARNm. Las variantes alélicas y variantes de corte y empalme de estas secuencias pueden clonarse sondeando colecciones de ADNc o genómicas de diferentes individuos o tejidos según procedimientos estándar conocidos en la materia. [0088] Usando los procedimientos discutidos anteriormente, una persona normalmente experta en la materia puede preparar una variedad de polipéptidos que comprenden una subunidad de receptor IL-22RA soluble que es sustancialmente homóloga de la SEC DE ID. Nº 1, o que codifica los aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3

o variantes alélicas de la misma y que retienen las propiedades de unión a ligando del receptor IL-22RA de tipo silvestre. Dichos polipéptidos pueden incluir también segmentos de polipéptidos adicionales como se da a conocer en general en la presente memoria. [0089] Las moléculas de ácido nucleico aisladas se pueden hibridar en condiciones rigurosas con moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos dadas a conocer en la presente memoria. Por ejemplo, dichas moléculas de ácido nucleico pueden hibridar en condiciones rigurosas con moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos de SEC DE ID. Nº 1, o con moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos complementaria de SEC DE ID. Nº 1, o fragmentos de las mismas. [0090] En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC menores que el punto de fusión térmico (Tm) de la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (a fuerza iónica y pH definidos) a la que un 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Después de la hibridación, las moléculas de ácido nucleico pueden lavarse para retirar las moléculas de ácido nucleico no hibridadas en condiciones rigurosas o en condiciones altamente rigurosas. Véanse, por ejemplo, Sambrook y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2ª edición (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel y col., (eds.), “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger y Kimmel (eds.), “Guide to Molecular Cloning Techniques”, (Academic Press, Inc. 1987 y Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). El software de análisis de secuencia tal como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), así como sitios de Internet, son herramientas disponibles para analizar una secuencia dada y calcular la Tm basándose en criterios definidos por el usuario. Está dentro de las capacidades de un experto en la materia adaptar las condiciones de hibridación y lavado para uso con un híbrido polinucleotídico particular. [0091] La presente memoria descriptiva describe polipéptidos IL-22RA aislados que tienen una identidad de secuencia sustancialmente similar a los polipéptidos de la SEC DE ID. Nº 3, o sus ortólogos. El término “identidad de secuencia sustancialmente similar” se usa en la presente memoria para indicar polipéptidos que tienen al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, tal como un 96%, 97%, 98%, o más de un 95% de identidad de secuencia con las secuencias mostradas en la SEC DE ID. Nº 3, o sus ortólogos. Por ejemplo, las variantes de receptores IL22RA y sus ortólogos se pueden usar para generar una respuesta inmunitaria y crear anticuerpos reactivos cruzados ante IL-22RA humano. Dichos anticuerpos pueden humanizarse y modificarse como se describe en la presente memoria, y usarse terapéuticamente para tratar psoriasis, artritis psoriática, EII, colitis, endotoxemia, así como en otras aplicaciones terapéuticas descritas en la presente memoria. [0092] La presente memoria descriptiva describe moléculas de ácido nucleico variantes de IL-22RA que pueden identificarse usando dos criterios: la determinación de la similitud entre el polipéptido codificado con la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 y un ensayo de hibridación. Dichas variantes de IL-22RA incluyen moléculas de ácido nucleico (1) que permanecen hibridadas con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEC DE ID. Nº 1 (o su complemento) en condiciones de lavado rigurosas, en las que el rigor de lavado es equivalente a 0,5x-2x SSC con 0,1% de SDS a 55-65ºC, y (2) que codifican un polipéptido que tiene al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o más de un 95%, tal como un 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3. Como alternativa, las variantes de IL-22RA se pueden caracterizar como moléculas de ácido nucleico (1) que permanecen hibridadas con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ NO:1 (o su complemento) en condiciones de lavado altamente rigurosas, en las que el rigor de lavado es equivalente a 0,1-0,2x SSC con 0,1% de SDS a 50-65ºC, y (2) que codifican un polipéptido que tiene al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o más de un 95%, tal como un 96%, 97%, 98%, o un 99% o más de identidad de secuencia con la secuencia de

5 aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3. [0093] El porcentaje de identidad de secuencia se determina mediante procedimientos convencionales. Véanse, por ejemplo, Altschul y col., Bull. Math. Bio.

48:603 (1986) y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992). Brevemente, se alinean dos secuencias de aminoácidos para optimizar las puntuaciones 10 de alinemiento usando una penalización de apertura de hueco de 10, una penalización de extensión de hueco de 1 y la matriz de puntuación “BLOSUM62” de Henikoff y Henikoff (ibid.) como se muestra en la Tabla 3 (los aminoácidos se indican por los códigos de una letra estándar). Se calcula entonces el porcentaje de identidad como: ([número total de coincidencias idénticas]/[longitud de la secuencia más larga más el

15 número de huecos introducidos en la secuencia más larga para alinear las dos secuencias]) x (100).

imagen1

[0094] Los expertos en la materia apreciarán que hay muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud “FASTA” de Pearson y Lipman es un procedimiento de 5 alineamiento de proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos dada a conocer en la presente memoria y la secuencia de aminoácidos de una supuesta variante de IL-22RA. El algoritmo FASTA fue descrito por Pearson y Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) y por Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990). Brevemente, FASTA caracteriza en primer 10 lugar la similitud de secuencia identificando las regiones compartidas por la secuencia

problema (por ejemplo, la SEC DE ID. Nº 2 o la SEC DE ID. Nº 3) y una secuencia de ensayo que tiene la mayor densidad de identidades (si la variable ktup es 1) o de pares de identidades (si ktup= 2), sin considerar sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos conservativas. Se vuelven a puntuar las diez regiones con la mayor densidad de identidades comparando la similitud de todos los aminoácidos emparejados usando una matriz de sustitución de aminoácidos, y se “recortan” los extremos de las regiones para incluir sólo aquellos residuos que contribuyen a la mayor puntuación. Si hay varias regiones con puntuaciones mayores que el valor de “corte” (calculado mediante una fórmula predeterminada basada en la longitud de la secuencia y el valor de ktup), entonces se examinan las regiones iniciales recortadas para determinar si las regiones pueden unirse formando un alineamiento aproximado con huecos. Finalmente, se alinean las regiones de mayor puntuación de las dos secuencias de aminoácidos usando una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math.

26:787 (1974)), que permite inserciones y deleciones de aminoácidos. Son parámetros ilustrativos del análisis FASTA: ktup= 1, penalización de apertura de hueco= 10, penalización de extensión de hueco= 1 y matriz de sustitución= BLOSUM62. Estos parámetros pueden introducirse en un programa FASTA modificando el archivo de matriz de puntuación (“SMATRIX”) como se explica en el apéndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990). [0095] Puede usarse también FAST para determinar la identidad de secuencia de moléculas de ácido nucleico usando una relación como se da a conocer anteriormente. Para comparaciones de secuencia de nucleótidos, el valor de ktup puede estar en el intervalo entre 1 y 6, preferiblemente de 3 a 6, lo más preferiblemente 3, con los demás parámetros ajustados como se describe anteriormente. [0096] La presente memoria descriptiva describe moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene un cambio de aminoácidos conservativo, en comparación con una secuencia de aminoácidos dada a conocer en la presente memoria. Por ejemplo, pueden obtenerse variantes que contienen una o más sustituciones de aminoácidos de la SEC DE ID. Nº 3, en las que se sustituye un alquilaminoácido por un alquilaminoácido en una secuencia de aminoácidos de IL22RA, se sustituye un aminoácido aromático por un aminoácido aromático en una secuencia de aminoácidos de IL-22RA, se sustituye un aminoácido que contiene azufre por un aminoácido que contiene azufre en una secuencia de aminoácidos de IL-22RA, se sustituye un aminoácido que contiene hidroxilo por un aminoácido que contiene hidroxilo en una secuencia de aminoácidos de IL-22RA, se sustituye un aminoácido ácido por un aminoácido ácido en una secuencia de aminoácidos de IL-22RA, se sustituye un aminoácido básico por un aminoácido básico en una secuencia de aminoácidos de IL-22RA o se sustituye un aminoácido monocarboxílico dibásico por un aminoácido monocarboxílico dibásico en una secuencia de aminoácidos de IL22RA. Entre los aminoácidos comunes, por ejemplo, se ilustra una “sustitución de aminoácidos conservativa” por una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina y (6) lisina, arginina e histidina. La tabla BLOSUM62 es una matriz de sustitución de aminoácidos derivada de aproximadamente 2.000 alineamientos múltiples locales de segmentos de secuencia proteica, que representan regiones altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff y Henikoff, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)). En consecuencia, se pueden usar las frecuencias de sustitución de BLOSUM62 para definir las sustituciones de aminoácidos conservativas que pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos de la presente invención. Aunque es posible diseñar sustituciones de aminoácidos basándose solamente en propiedades químicas (como se discute anteriormente), la frase “sustitución de aminoácidos conservativa” designa preferiblemente una sustitución representada por un valor de BLOSUM62 mayor de

1. Por ejemplo, una sustitución de aminoácidos es conservativa si la sustitución se caracteriza por un valor de BLOSUM62 de 0, 1, 2 ó 3. Según este sistema, las sustituciones de aminoácidos conservativas se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo, 1, 2 ó 3), mientras que las sustituciones de aminoácidos conservativas más preferidas se caracterizan por un valor de BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 ó 3). Las variantes particulares de IL-22RA se caracterizan por tener al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o más de un 95%, tal como un 96%, 97%, 98% o 99% o más identidad de secuencia con la correspondiente secuencia de aminoácidos (por ejemplo, SEC DE ID. Nº 3), en las que la variación de la secuencia de aminoácidos es debida a una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. [0097] Pueden introducirse cambios de aminoácidos conservativos en un gen IL22RA, por ejemplo, sustituyendo por nucleótidos los nucleótidos enumerados en la SEC DE ID. Nº 1. Dichas “variantes de aminoácidos conservativas” pueden obtenerse mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótido, mutagénesis de barrido de ligamiento, mutagénesis usando la reacción en cadena de la polimerasa y similares (véanse Ausubel (1995) y McPherson (ed.), “Directed Mutagenesis: A Practical Approach” (IRL Press 1991)). Puede identificarse un polipéptido variante de IL-22RA por la capacidad de unirse específicamente a anticuerpos dirigidos contra IL-22RA. [0098] Las proteínas descritas en la presente memoria pueden comprender también restos de aminoácido de origen no natural. Los aminoácidos de origen no natural incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido tiazolidincarboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3dimetilprolina, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. Son conocidos varios procedimientos en la materia para incorporar restos de aminoácido de origen no natural a proteínas. Por ejemplo, puede emplearse un sistema in vitro en el que se suprimen las mutaciones finalizadoras usando ARNt supresores químicamente aminoacilados. Los procedimientos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt son conocidos en la materia. La transcripción y traducción de plásmidos que contienen mutaciones finalizadoras se lleva a cabo típicamente en un sistema exento de células que comprende un extracto S30 de E. coli y enzimas y otros reactivos comercialmente disponibles. Las proteínas se purifican por cromatografía. Véanse, por ejemplo, Robertson y col., J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991), Ellman y col., Methods Enzymol. 202:301 (1991), Chung y col., Science 259:806 (1993) y Chung y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:10145 (1993). [0099] En un segundo procedimiento, se lleva a cabo la traducción en ovocitos de Xenopus mediante microinyección de ARNm mutado y ARNt de supresores químicamente aminoacilados (Turcatti y col., J. Biol. Chem. 271:19991 (1996)). En un tercer procedimiento, se cultivan células de E. coli en ausencia del aminoácido natural que ha de reemplazarse (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia del aminoácido o aminoácidos de origen no natural deseados (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). Se incorpora el aminoácido de origen no natural a la proteína en lugar de su contrapartida natural. Véase Koide y col., Biochem. 33:7470 (1994). Los restos de aminoácido de origen natural pueden convertirse en especies de origen no natural mediante modificación química in vitro. La modificación química puede combinarse con mutagénesis dirigida a sitio para ampliar adicionalmente el intervalo de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci.

2:395 (1993). [0100] Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, aminoácidos de origen no natural y aminoácidos no naturales pueden sustituir restos de aminoácido en IL-22RA. [0101] Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos descritos en la presente memoria pueden identificarse según procedimientos conocidos en la técnica tales como mutagénesis dirigida a sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081 (1989), Bass y col., Proc. Nat’l Acad Sci. USA 88:4498 (1991), Coombs y Corey, “Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering”, en “Proteins: Analysis and Design”, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). En la última técnica, se introducen mutaciones de alanina individuales en cada residuo de la molécula, y se ensaya en las moléculas mutantes resultantes la actividad biológica para identificar restos de aminoácido que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también Hilton y col., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996). [0102] Aunque el análisis de secuencia puede usarse para definir adicionalmente la región de unión a ligando de IL-22RA, los aminoácidos que desempeñan un papel en la actividad de unión de IL-22RA (tales como unión de IL-22RA al ligando IL-22, o a un anticuerpo dirigido contra IL-22RA) pueden determinarse también mediante análisis físico de la estructura, como se determina mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción electrónica o marcado por fotoafinidad, junto con mutación de los supuestos aminoácidos de sitio de contacto. Véanse, por ejemplo, de Vos y col., Science 255:306 (1992), Smith y col., J. Mol. Biol. 224:899 (1992) y Wlodaver y col., FEBS Lett. 309:59 (1992). [0103] Pueden realizarse múltiples sustituciones de aminoácidos y ensayarse usando procedimientos conocidos de mutagénesis y cribado, tales como los dados a conocer por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241:53 (1988)) o Bowie y Sauer (Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:2152 (1989)). Brevemente, estos autores dan a conocer procedimientos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones de un polipéptido, seleccionar un polipéptido funcional y secuenciar entonces los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros procedimientos que se pueden usar incluyen presentación de fago (por ejemplo, Lowman y col., Biochem. 30:10832 (1991), Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.223.409, Huse, publicación internacional nº WO 92/06204, y mutagénesis dirigida a región (Derbyshire y col., Gene 46:145 (1986) y Ner y col., DNA 7:127, (1988)). Además, puede usarse IL-22RA marcado con biotina o FITC para la clonación por expresión de ligandos de IL-22RA. [0104] Pueden generarse también variantes de las secuencias de nucleótidos y polipeptídicas de IL-22RA dadas a conocer mediante recombinación aleatoria de ADN como se da a conocer por Stemmer, Nature 370:389 (1994), Stemmer, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 91:10747 (1994) y la publicación internacional nº WO 97/20078. Brevemente, se generan moléculas de ADN variante mediante recombinación homóloga in vitro mediante la fragmentación aleatoria del ADN original seguido de reensamblaje usando PCR, dando como resultado mutaciones puntuales introducidas aleatoriamente. Esta técnica puede modificarse usando una familia de moléculas de ADN original, tales como variantes alélicas o moléculas de ADN de diferentes especies, para introducir una variabilidad adicional en el proceso. La selección o cribado de la actividad deseada, seguido de iteraciones adicionales de mutagénesis y ensayos, proporcionan una rápida “evolución” de las secuencias mediante la selección de mutaciones deseables mientras se selecciona simultáneamente contra cambios perjudiciales. [0105] Los procedimientos de mutagénesis como se dan a conocer en la presente memoria pueden combinarse con procedimientos de cribado automatizado de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos clonados mutagenizados en células hospedadoras. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos biológicamente activos, o polipéptidos que se unen a anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, pueden recuperarse de las células hospedadoras y secuenciarse rápidamente usando un equipo moderno. Estos procedimientos permiten la determinación rápida de la importancia de los restos de aminoácido individuales de interés, y pueden aplicarse a polipéptidos de estructura desconocida. [0106] La presente memoria descriptiva describe “fragmentos funcionales” de polipéptidos IL-22RA y moléculas de ácido nucleico que codifican dichos fragmentos funcionales. Pueden efectuarse análisis de detección rutinarios de moléculas de ácido nucleico para obtener fragmentos funcionales de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-22RA. Como ilustración, pueden digerirse moléculas de ADN que tienen la secuencia de nucleótidos de SEC DE ID. Nº 1 con nucleasa Bal 31 para obtener una serie de deleciones anidadas. Se insertan entonces los fragmentos en vectores de expresión en un marco de lectura apropiado y se aíslan los polipéptidos expresados y se ensaya su capacidad de unirse a anticuerpos dirigidos contra IL-22RA. Es una alternativa a la digestión con exonucleasas usar mutagénesis dirigida a oligonucleótido para introducir deleciones o codones de parada para especificar la producción de un fragmento deseado. Como alternativa, pueden sintetizarse fragmentos particulares del gen IL-22RA usando la reacción en cadena de la polimerasa. [0107] Este enfoque general se ejemplifica mediante estudios sobre el

5 truncamiento en cualquiera o ambos extremos de interferones que se ha resumido por Horisberger y Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995). Además, se describen técnicas estándar para el análisis funcional de proteínas, por ejemplo, por Treuter y col., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993), Content y col., “Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon”, en “Biological

10 Interferon Systems. Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems”, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman, “The EGF Receptor”, en “Control of Animals Cell Proliferation”, Vol. 1, Boynton y col., (eds.) páginas 169-199 (Academic Press 1985), Coumailleau y col., J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunaga y col., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi y col., Biochem.

15 Pharmacol. 50:1295 (1995) y Meisel y col., Plant Molec. Biol. 30:1 (1996). [0108] El análisis de las secuencias particulares dadas a conocer en la presente memoria proporciona un conjunto de fragmentos funcionales ilustrativos presentado en la Tabla 4. Los nucleótidos que codifican dominios variantes funcionales de IL-22RA humanos adicionales descritos en la presente memoria, no mostrados en la Tabla 4,

20 pueden determinarse con referencia a la SEC DE ID. Nº 1. Dichos fragmentos funcionales incluyen, por ejemplo, las siguientes secuencias de nucleótidos de SEC DE ID. Nº 1: nucleótidos 85-381, 206-717 y 85-717 de SEC DE ID. Nº 1 y las correspondientes secuencias de aminoácidos codificadas por las mismas como se muestra en la SEC DE ID. Nº 2 y la SEC DE ID. Nº 3 respectivamente.

25 Tabla 4

Rasgo de IL-22RA

Restos de aminoácido (SEC DE ID. Nº 2) Nucleótidos (SEC DE ID. Nº 1)

Primer dominio de Ig

18-116 85-381

Segundo dominio de Ig

125-228 206-717

Ambos dominios de Ig

18-228 85-717

[0109] La presente memoria descriptiva describe fragmentos funcionales de un gen IL-22RA que tiene cambios de aminoácidos en comparación con una secuencia de aminoácidos dada a conocer en la presente memoria. Puede identificarse una variante del gen IL-22RA basándose en la estructura mediante la determinación del nivel de 30 identidad con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos dadas a conocer, como

se discute anteriormente. Un enfoque alternativo para identificar un gen variante basándose en la estructura es determinar si una molécula de ácido nucleico que codifica un gen IL-22RA variante potencial puede hibridar con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, tal como la SEC DE ID. Nº 1. [0110] La presente memoria descriptiva describe el uso de fragmentos funcionales de polipéptidos IL-22RA, epítopos antigénicos, porciones portadoras de epítopo de polipéptidos IL-22RA y moléculas de ácido nucleico que codifican dichos fragmentos funcionales, epítopos antigénicos y porciones portadoras de epítopo de polipéptidos IL-22RA. Dichos fragmentos se usan para generar polipéptidos para uso en la generación de anticuerpos y asociados de unión que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de IL-22 o de ambas IL-20 e IL-22. Un polipéptido IL-22RA “funcional” o fragmento del mismo como se define en la presente memoria se caracteriza por su capacidad de bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad inflamatoria, proliferativa o diferenciativa de IL20 o IL-22, por su capacidad de inducir o inhibir funciones celulares especializadas o por su capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo dirigido contra IL-22RA, célula, IL-20 o IL-22. Como se describe previamente en la presente memoria, IL-22RA se caracteriza por una estructura de receptor de citocina de clase II y dominios según se describe en la presente memoria. Por tanto, la presente memoria descriptiva describe el uso de proteínas de fusión que comprenden:

(a)

moléculas polipeptídicas que comprenden uno o más de los dominios descritos anteriormente; y

(b)

fragmentos funcionales que comprenden uno o más de estos dominios. La otra porción polipeptídica de la proteína de fusión puede ser contribución de otro receptor de citocina de clase II tal como IL-10R, IL-13R, IL-20RA, IL-20RB, IL10RB (CRF2-4), IL-22R A2 o de un péptido señal secretor no nativo y/o no relacionado que facilite la secreción de la proteína de fusión. [0111] La presente memoria descriptiva describe fragmentos de polipéptidos o péptidos que comprenden una porción portadora de epítopo de un polipéptido IL22RA descrito en la presente memoria. Dichos fragmentos o péptidos pueden comprender un “epítopo inmunogénico” que es parte de una proteína que desencadena una respuesta de anticuerpo cuando se usa la proteína entera como inmunógeno. Los péptidos portadores de epítopo inmunogénicos pueden identificarse usando procedimientos estándar (véase, por ejemplo, Geysen y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 81:3998 (1983)).

[0112] En contraposición, los fragmentos de polipéptidos o péptidos pueden comprender un “epítopo antigénico”, que es una región de una molécula de proteína a la que puede unirse específicamente un anticuerpo. Ciertos epítopos consisten en una extensión lineal o contigua de aminoácidos, y la antigenicidad de dicho epítopo no está desestabilizada por agentes desnaturalizantes. Es sabido en la materia que se pueden usar péptidos sintéticos relativamente cortos que pueden imitar epítopos de una proteína para estimular la producción de anticuerpos contra la proteína (véase, por ejemplo, Sutcliffe y col., Science 219:660 (1983)). En consecuencia, los péptidos portadores de epítopos antigénicos, péptidos antigénicos, epítopos y polipéptidos descritos en la presente memoria son útiles para crear anticuerpos que se unan a los polipéptidos descritos en la presente memoria, así como para identificar y cribar anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22AR que son neutralizantes y que pueden unirse, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL22 e IL-20 (individual o conjuntamente). Dichos anticuerpos monoclonales neutralizantes de la presente invención pueden unirse a un epítopo antigénico de IL22RA. Se pueden usar los perfiles de hidrofilia de Hopp/Woods para determinar las regiones que tienen el potencial antigénico mayor en la SEC DE ID. Nº 3 (Hopp y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3824-3828. 1981; Hopp. J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986 y Triquier y col., Protein Engineering 11:153-169, 1998). El perfil está basado en una ventana deslizante de seis residuos. Se ignoraron los residuos G, S y T enterrados y H, Y y W expuestos. En IL-22RA, estas regiones pueden determinarse por un experto en la materia. Además, los epítopos antigénicos de IL-22RA en la SEC DE ID. Nº 3 como se predicen por una gráfica de Jameson-Wolf, por ejemplo usando el programa DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI) sirven como epítopos antigénicos preferidos, y pueden determinarse por un experto en la materia. Dichos epítopos antigénicos incluyen (1) los restos de aminoácido 1 (Pro) a 6 (Asp) de la SEQ ID N0:3; (2) los restos de aminoácido 26 (Ser) a 32 (Pro) de la SEC DE ID. Nº 3; (3) los restos de aminoácido 41 (Lys) a 47 (Asp) de la SEC DE ID. Nº 3; (4) los restos de aminoácido 49 (Val) a 62 (Cys) de la SEC DE ID. Nº 3; (5) los restos de aminoácido 41 (Lys) a 62 (Cys) de la SEC DE ID. Nº 3; (6) los restos de aminoácido 84 (Ala) a 97 (Ser) de la SEC DE ID. Nº 3; (7) los restos de aminoácido 103 (Thr) a 108 (Asp) de la SEC DE ID. Nº 3; (8) los restos de aminoácido 130 (Arg) a 135 (His) de la SEC DE ID. Nº 3; (9) los restos de aminoácido 164 (Gly) a 166 (Lys) de la SEC DE ID. Nº 3;

(10)

los restos de aminoácido 175 (Tyr) a 179 (Glu) de la SEC DE ID. Nº 3; (11) los restos de aminoácido 193 (Lys) a 196 (Ala) de la SEC DE ID. Nº 3; (12) los restos de

aminoácido 203 (Lys) a 209 (Thr) de la SEC DE ID. Nº 3. Los epítopos adicionales que incluyen los siguientes péptidos se generan potencialmente a partir de IL-22RA humano completo no reducido escindido con CnBr: péptido 6 (SEC DE ID. Nº 56), péptido 7 (SEC DE ID. Nº 57); péptido 8 (SEC DE ID. Nº 58); péptido 9 (SEC DE ID. Nº 59); péptido 10 (SEC DE ID. Nº 60) y péptido 11 (SEC DE ID. Nº 61). Las cisteínas están unidas por disulfuro, lo que da como resultado una posible unión entre los péptidos 7 (SEC DE ID. Nº 57) y 10 (SEC DE ID. Nº 60. Específicamente, la SEC DE ID. Nº 56 corresponde a los restos de aminoácido 1 (Pro) a 92 (Met) de la SEC DE ID. Nº 3; la SEC DE ID. Nº 57 corresponde a los restos de aminoácido 93 (Thr) a 120 (Met) de la SEC DE ID. Nº 3; la SEC DE ID. Nº 58 corresponde a los restos de aminoácido 121 (Ile) a 160 (Met) de la SEC DE ID. Nº 3, la SEC DE ID. Nº 59 corresponde a los restos de aminoácido 161 (His) a 185 (Met) de la SEC DE ID. Nº 3, la SEC DE ID. Nº 60 corresponde a los restos de aminoácido 186 (Ile) a 199 (Met) de la SEC DE ID. Nº 3 y la SEC DE ID. Nº 61 corresponde a los restos de aminoácido 200 (Cys) a 211 (Thr) de la SEC DE ID. Nº 3. Además, los residuos de SEC DE ID. Nº 2 (y los correspondientes residuos de SEC DE ID. Nº 3) que son importantes para la unión de ligando-receptor comprenden Tyr-60 y Phe-164, Tyr-93, Arg-112, Lys-210 y Glu-211 de la SEC DE ID. Nº 2 y (y los correspondientes residuos de la SEC DE ID. Nº 3). Además, los residuos primarios de la SEC DE ID. Nº 2 (y los correspondientes residuos de la SEC DE ID. Nº 3) que son importantes para dirigir la unión ligando-receptor comprenden Tyr-60 y Phe-164 de la SEC DE ID. Nº 2 (y los correspondientes residuos de la SEC DE ID. Nº 3), y los residuos secundarios comprenden los residuos Tyr-93, Arg-112, Lys-210 y Glu-211 de la SEC DE ID. Nº 2 (y los correspondientes residuos de la SEC DE ID. Nº 3). En realizaciones preferidas, los epítopos antigénicos a los que se unen los anticuerpos neutralizantes de la presente invención contendrían los residuos de la SEC DE ID. Nº 2 (y los correspondientes residuos de la SEC DE ID. Nº 3) que son importantes para la unión de ligando-receptor, por ejemplo, con IL22RA e IL-20 o IL-22 (individual o conjuntamente). [0113] Los péptidos y polipéptidos que portan epítopo antigénico pueden contener al menos de 4 a 10 aminoácidos, al menos de 10 a 15 aminoácidos, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada a conocer en la presente memoria. Dichos péptidos y polipéptidos que portan epítopo pueden producirse fragmentando un polipéptido IL-22RA o mediante síntesis peptídica química, como se describe en la presente memoria. Además, los epítopos pueden seleccionarse mediante presentación en fago de colecciones peptídicas aleatorias (véanse, por ejemplo, Lane y Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993) y Cortese y col., Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)). Se describen procedimientos estándar para identificar epítopos y producir anticuerpos a partir de péptidos pequeños que comprenden un epítopo, por ejemplo, por Mole, “Epitope Mapping”, en “Methods in Molecular Biology”, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992), Price, “Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies”, en “Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application”, Ritter y Ladyman (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995) y Coligan y col. (eds.), “Current Protocols in Immunology”, páginas 9.3.1-9.3.5 y páginas 9.4.1 - 9.4.11 (John Wiley & Sons 1997). [0114] Para cualquier polipéptido IL-22RA, incluyendo variantes y proteínas variantes y de fusión, un experto en la materia puede generar fácilmente una secuencia de polinicleótidos totalmente degenerada que codifica esa variante usando la información expuesta en las Tablas 1 y 2 anteriores. Además, los expertos en la materia pueden usar software estándar para diseñar variantes de IL-22RA basándose en las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos descritas en la presente memoria.

5. Producción de polipéptidos IL-22RA

[0115] Los polipéptidos descritos en la presente memoria, incluyendo polipéptidos completos, receptores monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos solubles, receptores completos, fragmentos de receptor (por ejemplo, fragmentos de unión a ligando y epítopos antigénicos), fragmentos funcionales y proteínas de fusión, pueden producirse en células hospedadoras recombinantes siguiendo técnicas convencionales. Para expresar un gen IL-22RA, debe ligarse operativamente una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido con secuencias reguladoras que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión, e introducirse a continuación en una célula hospedadora. Además de las secuencias reguladoras transcripcionales, tales como promotores y potenciadores, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras traduccionales y un gen marcador que sea adecuado para la selección de células que pueden portar el vector de expresión. [0116] Los vectores de expresión que son adecuados para la producción de una proteína extraña en células eucarióticas contienen típicamente (1) elementos de ADN procariótico que codifican un origen de replicación bacteriano y un marcador de resistencia a antibiótico para proporcionar el crecimiento y la selección del vector de expresión en un hospedador bacteriano; (2) elementos de ADN eucariótico que controlan la iniciación de la transcripción, tales como un promotor y (3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de los transcritos, tales como una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación. Como se discute anteriormente, los vectores de expresión pueden incluir también secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia secretora que dirige el polipéptido heterólogo a la ruta secretora de una célula hospedadora. Por ejemplo, un vector de expresión de IL-22RA puede comprender un gen IL-22RA y una secuencia secretora derivada de cualquier gen secretado. [0117] Las proteínas IL-22RA descritas en la presente memoria pueden expresarse en células de mamífero. Los ejemplos de células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen células de riñón de mono verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células de riñón embriónico humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de riñón de cría de hámster (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de riñón canino (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovario de hámster chino (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin y col., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), células de pituitaria de rata (GHI; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rata (H-4-II-E; ATCC CRL 1548); células de riñón de mono transformadas con SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) y células embriónicas de murino (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). [0118] Para un hospedador mamífero, las señales reguladoras transcripcionales y traduccionales pueden derivar de fuentes víricas de mamíferos, por ejemplo, adenovirus, papilomavirus bovino, virus de simio o similares, en los que las señales reguladoras están asociadas a un gen particular que tiene un alto nivel de expresión. Las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales adecuadas pueden obtenerse también a partir de genes de mamífero, por ejemplo, genes de actina, colágeno, miosina y metalotioneína. [0119] Las secuencias reguladoras transcripcionales incluyen una región promotora suficiente para dirigir la iniciación de la síntesis de ARN. Los promotores eucarióticos adecuados incluyen el promotor del gen metalotioneína I de ratón (Hamer y col., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), el promotor TK de herpesvirus (McKnight, Cell 31:355 (1982)), el promotor temprano de SV40 (Benoist y col., Nature 290:304 (1981)), el promotor del virus del sarcoma de Rous (German y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)), el promotor de citomegalovirus (Foecking y col., Gene 45:101 (1980)) y el promotor de virus de tumor mamario de ratón (véase, en general, Etcheverry, “Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture”, en “Protein Engineering: Principles and Practice”, Cleland y col. (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). [0120] Como alternativa, puede usarse un promotor procariótico, tal como el promotor de ARN polimerasa de bacteriófago T3, para controlar la expresión del gen IL-22RA en células de mamífero si el promotor procariótico está regulado por un promotor eucariótico (Zhou y col., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990) y Kaufman y col., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)). [0121] En ciertas realizaciones, se liga operativamente una secuencia de ADN que codifica un polipéptido receptor soluble IL-22RA, o un fragmento de un polipéptido IL-22RA, con otros elementos genéticos necesarios para su expresión, incluyendo generalmente un promotor y terminador de la transcripción, en un vector de expresión. El vector contendrá también habitualmente uno o más marcadores seleccionables y uno

o más orígenes de replicación, aunque los expertos en la materia reconocerán que, en ciertos sistemas, pueden proporcionarse marcadores seleccionables en vectores separados y que la replicación del ADN exógeno puede proporcionarse mediante integración en el genoma de la célula hospedadora. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es materia de diseño rutinario al nivel del experto en la materia. Se describen muchos de dichos elementos en la bibliografía y están disponibles por suministradores comerciales. Pueden transfectarse simultáneamente múltiples componentes de un complejo de receptor soluble en vectores de expresión individuales o estar contenidos en un solo vector de expresión. Dichas técnicas de expresión de múltiples componentes de complejos proteicos son bien conocidas en la técnica. [0122] Puede introducirse un vector de expresión en células hospedadoras usando una variedad de técnicas estándar incluyendo transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por liposoma, suministro mediado por microproyectiles, electroporación y similares. Las células transfectadas pueden seleccionarse y propagarse para proporcionar células hospedadoras recombinantes que comprenden el vector de expresión integrado establemente en el genoma de la célula hospedadora. Se describen las técnicas para introducir vectores en células eucarióticas y las técnicas para seleccionar dichos transformantes estables usando un marcador seleccionable dominante, por ejemplo, por Ausubel (1995) y por Murray (ed.), “Gene Transfer and Expression Protocols” (Humana Press 1991). [0123] Por ejemplo, un marcador seleccionable adecuado es un gen que proporciona resistencia al antibiótico neomicina. En este caso, la selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco de tipo neomicina tal como G-418 o similar. Se pueden usar también sistemas de selección para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso denominado como “amplificación”. La amplificación se lleva a cabo cultivando transfectantes en presencia de un bajo nivel de agente selectivo y aumentando entonces la cantidad de agente selectivo para seleccionar las células que producen altos niveles de productos de los genes introducidos. Es un marcador seleccionable amplificable adecuado la dihidrofolato reductasa (DHFR), que confiere resistencia al metotrexato. Se pueden usar también otros genes de resistencia a fármaco (por ejemplo, resistencia a higromicina, resistencia multifármaco, puromicina acetiltransferasa). Como alternativa, se pueden usar marcadores que introducen un fenotipo alterado tal como proteína fluorescente verde o proteínas de superficie celular tales como CD4, CD8, MHC de clase I o fosfatasa alcalina de placenta para clasificar las células transfectadas y las células no transfectadas mediante medios tales como clasificación por FACS o tecnología de separación de perlas magnéticas. [0124] Los polipéptidos IL-22RA pueden producirse también por células de mamífero cultivadas usando un sistema de administración vírico. Los virus a modo de ejemplo con este fin incluyen adenovirus, retrovirus, herpesvirus, virus Vaccinia y virus adenoasociados (AAV). El adenovirus, un virus de ADN bicatenario, es actualmente el vector de transferencia génica mejor estudiado para administración de ácido nucleico heterólogo (para una revisión, véanse Becker y col., Meth. Cell Biol.

43:161 (1994) y Douglas y Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). Las ventajas del sistema adenovírico incluyen el acomodo de insertos relativamente grandes de ADN, la capacidad de crecer hasta un alto título, la capacidad de infectar un amplio intervalo de tipos de células de mamífero y la flexibilidad que permite el uso con un gran número de vectores disponibles que contienen diferentes promotores. [0125] Al eliminar porciones del genoma adenovírico, pueden acomodarse insertos mayores (hasta 7 kb) de ADN heterólogo. Estos insertos pueden incorporarse al ADN vírico mediante unión directa o recombinación homóloga con un plásmido transfectado simultáneamente. Una opción es eliminar el gen E1 esencial del vector vírico, lo que da como resultado la incapacidad de replicar a menos que la célula hospedadora proporcione el gen E1. Las células 293 humanas infectadas con vector adenovírico (ATCC nº CRL-1573, 45504, 45505), por ejemplo, pueden crecer como células adherentes o en cultivo en suspensión a una densidad celular relativamente alta, produciendo cantidades significativas de proteína (véase Garnier y col., Cytotechnol.

15:145 (1994)).

[0126] El IL-22RA puede expresarse también en otras células eucarióticas superiores tales como células de ave, hongo, insecto, levadura o planta. El sistema de baculovirus proporciona un medio eficaz para introducir genes IL-22RA clonados en células de insecto. Los vectores de expresión adecuados están basados en el virus de la polihedrosis nuclear múltiple Autographa californica (AcMNPV) y contienen promotores bien conocidos tales como el promotor 70 de la proteína de choque térmico de Drosophila (hsp), el promotor del gen inmediato-temprano del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (ie-1) y el promotor temprano retardado 39K, el promotor de baculovirus p10 y el promotor de metalotioneína de Drosophila. Un segundo procedimiento de preparación de baculovirus recombinante utiliza un sistema basado en transposón descrito por Luckow (Luckow, y col., J. Virol. 67:4566 (1993)). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, se comercializa en el kit BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, PFASTBAC (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para desplazar el ADN que codifica el polipéptido IL-22RA a un genoma de baculovirus mantenido en E. coli en forma de un plásmido grande llamado un “bácmido”. Véanse Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, y col., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994) y Chazenbalk, y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en fase con ADN que codifica un marcaje epitópico en el extremo C o N del polipéptido IL-22RA expresado, por ejemplo, un marcaje epitópico Glu-Glu (Grussenmeyer y col., Proc. Nat’l Acad Sci. 82:7952 (1985)). Usando una técnica conocida en la materia, se transforma un vector de transferencia que contiene un gen IL-22RA en E. coli, y se criban los bácmidos que contienen un gen lacZ interrumpido, indicativo de baculovirus recombinante. El ADN de bácmido que contiene el genoma de baculovirus recombinante se aísla entonces usando técnicas comunes. [0127] El vector PFASTBAC ilustrativo puede modificarse en un grado considerable. Por ejemplo, el promotor de polihedrina puede retirarse y sustituirse por el promotor de proteína básica de baculovirus (también conocido como promotor Pcor, p6.9 o MP) que se expresa tempranamente en la infección por baculovirus, y se ha mostrado ventajoso para expresar proteínas secretadas (véanse, por ejemplo, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning y col., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994) y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). En dichos constructos de vector de transferencia, puede usarse una versión corta o larga del promotor de proteína básica. Además, pueden construirse vectores de transferencia que reemplacen las secuencias señal secretoras de IL-22RA nativas por secuencias señal secretoras derivadas de proteínas de insecto. Por ejemplo, puede usarse una secuencia señal secretora de ecdisteroide glucosiltransferasa (EGT), melitina de abeja melífera (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA), o gp67 de baculovirus (PharMingen: San Diego, CA) en constructos para reemplazar la secuencia señal secretora de IL-22RA nativa. [0128] Se usa el virus o bácmido recombinante para transfectar células hospedadoras. Las células hospedadoras de insecto adecuadas incluyen líneas celulares derivadas de 7PLB-Sf-21, una línea celular de ovario ninfal de Spodoptera frugiperda tal como Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE y Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), así como células Schneider-2 de Drosophila y la línea celular HIGH FIVEO (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (patente de EE.UU. nº 5.300.435). Se pueden usar medios exentos de suero comercialmente disponibles para cultivar y mantener las células. Son medios adecuados Sf900 II™ (Life Technologies) o ESF 921™ (Expression Systems) para las células Sf9 y Ex-cell0405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO™ (Life Technologies) para las células de T. ni. Cuando se usa virus recombinante, se cultivan típicamente las células desde una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 105 células a una densidad de 1-2 x 106 células, en cuyo momento se añade una disolución madre vírica recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 a 10, más típicamente cercana a 3. [0129] Se proporcionan técnicas establecidas para producir proteínas recombinantes en sistemas de baculovirus en Bailey y col., “Manipulation of Baculovirus Vectors”, en “Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols”, Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991), por Patel y col., “The baculovirus expresión system”, en “DNA Cloning 2: Expression Systems”, 2ª edición, Glover y col. (eds.), páginas 205-244 (Oxford University Press 1995), por Ausubel (1995) en las páginas 16-37 a 16-57, por Richardson (ed.), “Baculovirus Expression Protocols” (The Humana Press, Inc. 1995) y por Lucknow, “Insect Cell Expression Technology”, en “Protein Engineering: Principles and Practice”, Cleland y col. (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996). [0130] Las células fúngicas, incluyendo células de levadura, se pueden usar también para expresar los genes descritos en la presente memoria. Las especies de levadura de interés particular a este respecto incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Pichia methanolica. Los promotores adecuados para expresión en levadura incluyen los promotores de GAL1 (galactosa), PGK (fosfoglicerato cinasa), ADH (alcohol deshidrogenasa), AOX1 (alcohol oxidasa), HIS4 (histidinol deshidrogenasa) y similares. Se han diseñado muchos vectores de clonación de levadura y están fácilmente disponibles. Estos vectores incluyen vectores basados en YIp, tales como vectores YIp5, vectores YRp, tales como YRp17, vectores YEp tales como YEp13 y vectores YCp, tales como YCp19. Se dan a conocer procedimientos para transformar células de S. cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir de ellas, por ejemplo, por Kawasaki, patente de EE.UU. nº 4.599.311, Kawasaki y col., patente de EE.UU. nº 4.931.373, Brake, patente de EE.UU. nº 4.870.008, Welch y col., patente de EE.UU. nº 5.037.743 y Murray y col., patente de EE.UU. nº 4.845.075. Se seleccionan las células transformadas mediante el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, la resistencia a fármacos comunes

o la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente particular (por ejemplo, leucina). Es un sistema de vector adecuado para uso en Saccharomyces cerevisiae el sistema de vector POT1 dado a conocer por Kawasaki y col. (patente de EE.UU. nº 4.931.373), que permite seleccionar las células transformadas mediante crecimiento en medios que contienen glucosa. Los promotores y terminadores adecuados adicionales para uso en levadura incluyen aquellos de genes de enzimas glucolíticas (véanse, por ejemplo, Kawasaki, patente de EE.UU. nº 4.599.311, Kingsman y col., patente de EE.UU. nº

4.615.974

y Bitter, patente de EE.UU. nº 4.977.092) y genes de alcohol deshidrogenasa. Véanse también las patentes de EE.UU. nº 4.990.446, 5.063.154,

5.139.936

y 4.661.454. [0131] Son conocidos en la materia sistemas de transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa. Véanse, por ejemplo, Gleeson y col., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986) y Cregg, patente de EE.UU. nº

4.882.279.

Las células de Aspergillus pueden utilizarse según los procedimientos de McKnight y col., patente de EE.UU. nº 4.935.349. Se dan a conocer procedimientos para transformar Acremonium chrysogenum por Sumino y col., patente de EE.UU. nº

5.162.228.

Se dan a conocer procedimientos para transformar Neurospora por Lambowitz, patente de EE.UU. nº 4.486.533. [0132] Por ejemplo, se da a conocer el uso de Pichia methanolica como hospedador para la producción de proteínas recombinantes por Raymond, patente de EE.UU. nº 5.716.808, Raymond, patente de EE.UU nº 5.736.383, Raymond y col.,

Yeast 14:11-23 (1998) y en las publicaciones internacionales nº WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 y WO 98/02565. Las moléculas de ADN para uso en la transformación de P. methanolica se prepararán habitualmente en forma de plásmidos circulares bicatenarios que se linealizan preferiblemente antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, el promotor y el terminador en el plásmido pueden ser de un gen de P. methanolica, tal como un gen de utilización de alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen aquellos de genes de dihidroxiacetona sintasa (DHAS), formiato deshidrogenasa (FMD) y catalasa (CAT). Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma hospedador, se prefiere tener el fragmento de expresión entero del plásmido flanqueado en ambos extremos por secuencias de ADN hospedador. Es un marcador seleccionable adecuado para uso en Pichia methanolica un gen ADE2 de P. methanolica, que codifica fosforibosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21) y que permite crecer a células hospedadoras ade2 en ausencia de adenina. Para procesos industriales a gran escala, en que es deseable minimizar el uso de metanol, se pueden usar células hospedadoras en las que se eliminan ambos genes de utilización de metanol (AUG1 y AUG2). Para la producción de proteínas secretadas, las células hospedadoras pueden ser deficientes en los genes de proteasa vacuolar (PEP4 y PRB1). La electroporación se usa para facilitar la introducción de un plásmido que contiene ADN que codifica un polipéptido de interés en células de P. methanolica. Las células de P. methanolica pueden transformarse mediante electroporación usando un campo eléctrico a pulsos de descomposición exponencial que tiene una potencia de campo de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferiblemente de aproximadamente 3,75 kV/cm, y una constante temporal (t) de 1 a 40 ms, lo más preferiblemente de aproximadamente 20 ms. [0133] Los vectores de expresión pueden introducirse también en protoplastos de plantas, tejidos de plantas intactas o células de planta aisladas. Los procedimientos para introducir vectores de expresión en tejido de planta incluyen infección directa o cocultivo de tejido de planta con Agrobacterium tumefaciens, suministro mediado por microproyectiles, inyección de ADN, electroporación y similares. Véanse, por ejemplo, Horsch y col., Science 227:1229 (1985), Klein y col., Biotechnology 10:268 (1992) y Miki y col., “Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”, en “Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology”, Glick y col. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993). [0134] Como alternativa, los genes IL-22RA pueden expresarse en células hospedadoras procarióticas. Los promotores adecuados que se pueden usar para expresar polipéptidos IL-22RA en un hospedador procariótico son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen promotores capaces de reconocer las T4, T3, Sp6 y T7 polimerasas, los promotores PR y PL del bacteriófago lambda, los promotores trp, recA, de choque térmico, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA y lacZ de E. coli, promotores de B. subtilis, promotores de bacteriófagos de Bacillus, promotores de Streptomyces, el promotor int del bacteriófago lambda, el promotor bla de pBR322 y el promotor CAT del gen de cloranfenicol acetiltransferasa. Se han revisado los promotores procarióticos por Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson y col., “Molecular Biology of the Gene”, 4ª Ed. (Benjamín Cummins 1987) y por Ausubel y col. (1995). [0135] Los hospedadores procarióticos adecuados incluyen E. coli y Bacillus subtilus. Las cepas adecuadas de E. coli incluyen BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DHS, DH5I, DH5IF’, DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 y ER1647 (véanse, por ejemplo, Brown (ed.), “Molecular Biology Labfax” (Academic Press 1991)). Las cepas adecuadas de Bacillus subtilus incluyen BR151, YB886, MI119, MI120 y B170 (véase, por ejemplo, Hardy, “Bacillus Cloning Methods”, en “DNA Cloning: A Practical Approach”, Glover (ed.) (IRL Press 1985)). [0136] Cuando se expresa un polipéptido IL-22RA en bacterias tales como E. coli, el polipéptido puede retenerse en el citoplasma, típicamente en forma de gránulos insolubles, o puede dirigirse al espacio periplasmático mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se lisan y se recuperan y desnaturalizan los gránulos usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado puede replegarse entonces y dimerizarse diluyendo el desnaturalizante, tal como mediante diálisis frente a una disolución de urea y una combinación de glutation reducido y oxidado, seguido de diálisis frente a una disolución salina tamponada. En el segundo caso, el polipéptido puede recuperarse el espacio periplasmático en una forma soluble y funcional desestabilizando las células (por ejemplo, mediante sonicación o choque osmótico) para liberar los contenidos del espacio periplasmático y recuperar la proteína, obviando así la necesidad de desnaturalización y replegamiento. [0137] Los procedimientos para expresar proteínas en hospedadores procarióticos son bien conocidos de los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Williams y col., “Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies”, en “DNA Cloning 2: Expression Systems”, 2ª edición, Glover y col. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995), Ward y col., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”, en “Monoclonal Antibodies: Principles and Applications”, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995) y Georgiou, “Expression of Proteins in Bacteria”, en “Protein Engineering: Principles and Practice”, Cleland y col. (eds.), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)). [0138] Se proporcionan procedimientos estandarizados para introducir vectores de expresión en células de bacteria, levadura, insecto y planta, por ejemplo, por Ausubel (1995). [0139] Se proporcionan procedimientos generales para expresar y recuperar proteína extraña producida por un sistema de células de mamífero, por ejemplo, por Etcheverry, “Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture”, en “Protein Engineering: Principles and Practice”, Cleland y col. (eds.), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Se proporcionan técnicas estándar para recuperar proteína producida por un sistema bacteriano, por ejemplo, por Grisshammer y col., “Purification of overproduced proteins from E. coli cells”, en “DNA Cloning 2: Expression Systems”, 2ª edición, Glover y col. (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). Se describen procedimientos establecidos para aislar proteínas recombinantes de sistemas de baculovirus por Richardson (ed.), “Baculovirus Expression Protocols” (The Humana Press, Inc. 1995). [0140] Como alternativa, pueden sintetizarse péptidos mediante síntesis en fase sólida exclusiva, procedimientos en fase sólida parcial, condensación de fragmentos o síntesis en disolución clásica. Estos procedimientos de síntesis son bien conocidos por los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963). Stewart y col., “Solid Phase Peptide Synthesis” (2ª edición), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton y col., “Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach” (IRL Press 1989), Fields y Colowick, “Solid-Phase Peptide Synthesis”, “Methods in Enzymology” volumen 289 (Academic Press 1997) y Lloyd-Williams y col., “Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins” (CRC Press, Inc. 1997)). Las variaciones en las estrategias de síntesis química total, tales como “ligamiento químico nativo” y “ligamiento de proteína expresada” son también estándar (véanse, por ejemplo, Dawson y col., Science 266:776 (1994), Hackeng y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998) y Severinov y Muir. J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)).

[0141] Los péptidos y polipéptidos descritos en la presente memoria comprenden al menos 6, al menos 9 o al menos 15 restos de aminoácido contiguos de la SEC DE ID. Nº 3. Como ilustración, los polipéptidos pueden comprender al menos 6, al menos 9 o al menos 15 restos de aminoácido contiguos de la SEC DE ID. Nº 3. En ciertas realizaciones, los polipéptidos comprenden 20, 30, 40, 50, 100 o más residuos contiguos de estas secuencias de aminoácidos. Las moléculas de ácido nucleico que codifican dichos péptidos y polipéptidos son útiles como cebadores y sondas de la reacción en cadena de la polimerasa. [0142] Además, los polipéptidos IL-22RA y fragmentos de los mismos pueden expresarse como monómeros, homodímeros, heterodímeros o multímeros en células eucarióticas superiores. Dichas células se pueden usar para producir polipéptidos de receptor IL-22RA monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos que comprenden al menos un polipéptido IL-22RA (“receptores que comprenden IL22RA” o “polipéptidos receptores que comprenden IL-22RA”), o se pueden usar como células de ensayo en sistemas de cribado. En un aspecto, se produce un polipéptido que comprende el dominio extracelular de IL-22RA por una célula cultivada, y se usa la célula para cribar ligandos de receptor, incluyendo el ligando natural IL-22, así como agonistas y antagonistas del ligando natural. Para resumir este enfoque, se combina un ADN o gen que codifica el receptor con otros elementos genéticos necesarios para su expresión (por ejemplo, un promotor de la transcripción), y se inserta el vector de expresión resultante en una célula hospedadora. Se seleccionan las células que expresan el ADN y producen un receptor funcional y se usan en una variedad de sistemas de cribado. Cada componente del complejo receptor monomérico, homodimérico, heterodimérico y multimérico puede expresarse en la misma célula. Además, los componentes del complejo receptor monomérico, homodimérico, heterodimérico y multimérico pueden fusionarse también con un dominio transmembrana u otro resto de fusión de membrana para permitir el ensamblado del complejo y el cribado de transfectantes como se describe anteriormente. [0143] Para ensayar los anticuerpos antagonistas de IL-20 e IL-22 de la presente invención, las células de mamífero adecuadas para uso en la expresión de receptores que comprenden IL-22RA u otros receptores conocidos por unirse a IL-20 o IL-22 (por ejemplo, células que expresan IL-22RA/CRF2-4 e IL-20RA, IL-20RB, IL-22RA/IL20RB o IL-20RA/IL-20RB) y para transducción de una señal mediada por receptor, incluyen células que expresan otras subunidades de receptor que pueden formar un complejo funcional con IL-22RA (o IL-20RA). Estas subunidades pueden incluir aquellas de la familia del receptor de interferón o de otros receptores de citocina de clase II o clase I, por ejemplo, CRF2-4 (nº de acceso a Genbank Z17227), IL-10R (nº de acceso a Genbank U00672 y NM_001558), IL-22RA (patente de EE.UU. nº

5.965.704 de propiedad compartida con la presente), zcytor7 (IL-20RA) (patente de EE.UU. nº 5.945.511 de propiedad compartida con la presente), IL-20RA/IL-20RB (publicación WIPO nº WO 01/46232) e IL-9R. Se prefiere usar también una célula de la misma especie que el receptor a expresar. En una realización preferida, la célula depende de un factor de crecimiento hematopoyético suministrado exógenamente para su proliferación. Las líneas celulares preferidas de este tipo son la línea celular TF-1 humana (nº ATCC CRL-2003) y la línea celular AML-193 (nº ATCC CRL-9589), que son líneas celulares leucémicas humanas dependientes de GM-CSF, y BaF3 (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, (1985)), que es una línea celular pre-B de murino dependiente de IL-3. Otras líneas celulares incluyen células BHK, COS-1 y CHO. Las células hospedadoras adecuadas pueden modificarse por ingeniería genética para producir las subunidades de receptor u otros componentes celulares necesarios para la respuesta celular deseada. Este enfoque es ventajoso porque las líneas celulares pueden modificarse por ingeniería genética para expresar subunidades de receptor de cualquier especie, superando así las limitaciones potenciales que surgen de la especificidad de especie. Las especies ortólogas del ADNc de receptor humano pueden clonarse y usarse en líneas celulares de la misma especie, tales como ADNc de ratón en la línea celular BaF3. Las líneas celulares que dependen de un factor de crecimiento hematopoyético, tal como GM-CSF o IL-3, pueden modificarse así por ingeniería genética para volverse dependientes de otra citocina que actúa a través del receptor IL22RA, tal como IL-22. [0144] Se usan en ensayos de cribado en células que expresan un receptor funcional. Son conocidos en la materia una variedad de ensayos adecuados. Estos ensayos están basados en la detección de una respuesta biológica en una célula diana. Uno de dichos ensayos es un ensayo de proliferación celular. Se cultivan las células en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo y se detecta la proliferación celular, por ejemplo, midiendo la incorporación de timidina tritiada o mediante un ensayo colorimétrico basado en la degradación metabólica de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, (1983)). Un formato de ensayo alternativo usa células que se modifican adicionalmente por ingeniería genética para expresar un gen informador. El gen informador se liga a un elemento promotor que es sensible a la ruta ligada al receptor y el ensayo detecta la activación de la transcripción del gen informador. Un elemento promotor preferido a este respecto es un elemento de respuesta sérica, o SRE. Véase, por ejemplo, Shaw y col., Cell 56:563-572, (1989). Uno de dichos genes informadores preferidos es el gen de luciferasa (de Wet y col., Mol. Cell. Biol. 7:725, (1987)). Se detecta la expresión del gen de luciferasa mediante luminiscencia usando procedimientos conocidos en la materia (por ejemplo, Baumgartner y col., J. Biol. Chem. 269:29094-29101, (1994); Schenbom y Goiffin, Promega_Notes 41:11, 1993). Los kits de ensayo de actividad luciferasa están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Promega Corp., Madison, WI. Se pueden usar líneas celulares diana de este tipo para cribar colecciones de productos químicos, medios de cultivo acondicionados con células, caldos fúngicos, muestras de suelo, muestras de agua y similares. Por ejemplo, puede ensayarse un banco de muestras de medios acondicionados con células en una célula diana para identificar las células que producen ligando. Se usan entonces las células positivas para producir una colección de ADNc en un vector de expresión de mamífero, que se divide en agrupamientos, se transfecta a células hospedadoras y se expresa. Se ensayan entonces muestras de medios de las células transfectadas, con posterior división de agrupamientos, retransfección, subcultivo y reensayo de células positivas para aislar un ADNc clonado que codifica el ligando. [0145] Son conocidas en la materia o pueden construirse varias líneas celulares sensibles a IL-20, por ejemplo, la línea celular Baf3/DIRS1/cytoR11 (publicación WIPO nº WO 02/072607). Además, son conocidas varias líneas celulares sensibles a IL-22 (Dumontier y col., J. Immunol. 164:1814-1819, 2000; Dumoutier, L. y col., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000; Xie MH y col., J. Biol. Chem. 275: 31335-31339, 2000; Kotenko SV y col., J. Biol. Chem. 276:2725-2732, 2001), así como aquellas que expresan la subunidad de receptor de IL-22 IL-22RA. Por ejemplo, las siguientes células son sensibles a IL-22: TK-10 (XieMH y col., más arriba) (carcinoma renal humano); SW480 (nº ATCC CCL-228) (adenocarcinoma de colon humano); HepG2 (ATCC nº HB-8065) (hematoma humano); PC12 (nº ATCC CRL1721) (modelo de célula neuronal de murino; feocromocitoma de rata) y MES13 (nº ATCC CRL-1927) (línea celular mesangial de riñón de murino). Además, algunas líneas celulares que expresan IL-22RA (receptor de IL-22) son también candidatas para líneas celulares sensibles a IL-23: A549 (nº ATCC CCL-185) (carcinoma pulmonar humano); G-361 (nº ATCC CRL-1424) (melanoma humano) y Caki-1 (nº ATCC HTB-46) (carcinoma renal humano). Además, pueden construirse líneas celulares sensibles a IL-22, por ejemplo, la línea celular Baf3/cytoR11/CRF2-4 descrita en la presente memoria (publicación WIPO nº WO 02/12345). Estas células se pueden usar en ensayos para valorar la funcionalidad de IL-22RA como antagonista de IL-20 o IL-22 o factor antiinflamatorio. [0146] Un enfoque de cribado adicional descrito en la presente memoria incluye el uso de polipéptidos receptores híbridos. Estos polipéptidos híbridos se clasifican en dos clases generales. En la primera clase, el dominio intracelular de IL-22RA está unido al dominio de unión a ligando de un segundo receptor. Una segunda clase de polipéptidos receptores híbridos comprende el dominio extracelular (de unión a ligando) de IL-22RA (SEC DE ID. Nº 3) con un dominio intracelular de un segundo receptor, preferiblemente un receptor de citocina hematopoyético, y un dominio transmembrana. Los receptores monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos IL-22RA híbridos de esta segunda clase se expresan en células conocidas por ser capaces de responder a señales transducidas por el segundo receptor. Conjuntamente, estas dos clases de receptores híbridos posibilitan la identificación de un tipo celular sensible para el desarrollo de un ensayo para detectar IL-22 o IL-20. Además, dichas células se pueden usar en presencia de IL-22 o IL-20 para ensayar los antagonistas de receptor soluble descritos en la presente memoria en un ensayo de tipo competitivo. En dicho ensayo, una reducción de la proliferación o de la actividad de transducción de señal de IL-22 o IL-20 en presencia de un receptor soluble descrito en la presente memoria demuestra actividad antagonista. Además, los ensayos de unión a receptor soluble IL-22RA, ensayos basados en célula, se pueden usar también para valorar si un receptor soluble se une a, bloquea, inhibe, reduce, antagoniza o neutraliza la actividad de IL-22 o IL-20.

6. Producción de proteínas de fusión y conjugados de IL-22RA

[0147] Una clase general de análogos de IL-22RA son las variantes que tienen una secuencia de aminoácidos que es una mutación de la secuencia de aminoácidos dada a conocer en la presente memoria. Otra clase general de análogos de IL-22RA se proporciona por los anticuerpos antiidiotípicos y fragmentos de los mismos, como se describe a continuación. Además, se pueden usar como análogos anticuerpos recombinantes que comprenden dominios variables antiidiotípicos (véanse, por ejemplo, Monfardini y col., Proc. Assoc. Am. Physicians 108:420 (1996)). Puesto que los dominios variables de los anticuerpos antiidiotípicos de IL-22RA imitan a IL22RA, estos dominios pueden proporcionar actividad de unión a IL-22RA. Son conocidos por los expertos en la materia procedimientos de producción de anticuerpos catalíticos antiidiotípicos (véanse, por ejemplo, Joron y col., Ann. N Y Acad. Sci.

672:216 (1992), Friboulet y col., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229 (1994) y Avalle y col., Ann. N Y Acad. Sci. 864:118 (1998)). [0148] Se proporciona otro enfoque para identificar análogos de IL-22RA por el uso de colecciones combinatorias. Se proporcionan procedimientos para construir y cribar presentaciones en fago y otras colecciones combinatorias, por ejemplo, en Kay y col., “Phage Display of Peptides and Proteins” (Academic Press 1996), Verdine, patente de EE.UU. nº 5.783.384, Kay y col., patente de EE.UU. nº 5.747.334 y Kauffman y col., patente de EE.UU. nº 5.723.323. [0149] Los polipéptidos IL-22RA tienen usos tanto in vivo como in vitro. Como ilustración, puede añadirse una forma soluble de IL-22RA a un medio de cultivo celular para inhibir los efectos del ligando de IL-22RA producido por las células cultivadas. [0150] Las proteínas de fusión de IL-22RA se pueden usar para expresar IL-22RA en un hospedador recombinante y para aislar el IL-22RA producido. Como se describe a continuación, proteínas de fusión de IL-22RA particulares tienen también usos en diagnóstico y terapia. Un tipo de proteína de fusión comprende un péptido que guía un polipéptido IL-22RA desde una célula hospedadora recombinante. Para dirigir un polipéptido IL-22RA a la ruta secretora de una célula hospedadora eucariótica, se proporciona una secuencia señal secretora (también conocida como péptido señal, secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) en el vector de expresión de IL22RA. Aunque la secuencia señal secretora puede derivar de IL-22RA, una secuencia señal adecuada puede derivar también de otra proteína secretada o sintetizada de novo. La secuencia señal secretora está ligada operativamente a una secuencia que codifica IL-22RA de tal modo que las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y situadas para dirigir al polipéptido recién sintetizado a la ruta secretora de la célula hospedadora. Las secuencias señal secretoras se sitúan habitualmente 5’ de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal secretoras pueden situarse en otros sitios de la secuencia de nucleótidos de interés (véanse, por ejemplo, Welch y col., patente de EE.UU. nº 5.037.743; Holland y col., patente de EE.UU. nº 5.143.830). [0151] Aunque la secuencia señal secretora de IL-22RA u otra proteína producida por células de mamífero (por ejemplo, secuencia señal de activador de plasminógeno de tipo tejido como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 5.641.655) es útil para la expresión de IL-22RA en hospedadores mamíferos recombinantes, se prefiere una secuencia señal de levadura para expresión en células de levadura. Los ejemplos de secuencias señal de levadura adecuadas son aquellos derivados de la feromona de apareamiento de levadura factor α (codificado por el gen MFα1), invertasa (codificada por el gen SUC2) o fosfatasa ácida (codificada por el gen PHO5). Véase, por ejemplo, Romanos y col., "Expression of Cloned Genes in Yeast," en “DNA Cloning 2: A Practical Approach”, 2ª edición, Glover and Hames (eds.), páginas 123-167 (Oxford University Press 1995). [0152] Los polipéptidos receptores solubles IL-22RA pueden prepararse expresando un ADN truncado que codifica el dominio extracelular, por ejemplo, un polipéptido que contiene la SEC DE ID. Nº 3, o la correspondiente región de un receptor no humano. Se prefiere preparar los polipéptidos del dominio extracelular en una forma sustancialmente exenta de segmentos de polipéptidos transmembrana e intracelulares. Para dirigir la salida del dominio de receptor de la célula hospedadora, se liga el ADN del receptor a un segundo segmento de ADN que codifica un péptido secretor, tal como un péptido secretor t-PA. Para facilitar la purificación del dominio de receptor secretado, puede fusionarse con el polipéptido receptor una extensión C-terminal, tal como un marcaje de polihistidina, sustancia P, péptido Flag™ (Hopp y col., Biotechnology 6:1204-1210, (1988); disponible en Eastman Kodak Co., New Haven, CT) u otro polipéptido o proteína para el que esté disponible un anticuerpo u otro agente de unión específica. Además, los epítopos antigénicos de IL-22RA de los dominios extracelulares de unión a citocina se preparan también como se describe anteriormente. [0153] En un enfoque alternativo, puede expresarse un dominio extracelular de receptor IL-22RA u otra clase de componente receptor de citocina de clase I o II en forma de una fusión con regiones constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina, típicamente un fragmento Fc que contiene dos dominios de región constante y una región bisagra pero que carece de la región variable (véanse Sledziewski, AZ y col., patentes de EE.UU. nº 6.018.026 y 5.750.375). Los polipéptidos IL-22RA solubles de la presente invención incluyen dichas fusiones. Se muestra una de dichas fusiones en la SEC DE ID. Nº 4. Dichas fusiones se secretan típicamente en forma de moléculas multiméricas en las que las porciones de Fc están unidas por disulfuro entre sí y dos polipéptidos receptores están dispuestos en estrecha proximidad entre sí. Las fusiones de este tipo se pueden usar para purificación por afinidad del ligando asociado de la disolución, como herramienta de ensayo in vitro para bloquear, inhibir o reducir las señales in vitro titulando específicamente el ligando, y como antagonistas in vivo mediante su administración parenteral para unirse al ligando en circulación y retirarlo de la circulación. Para purificar el ligando, se añade una quimera IL-22RA-Ig a una muestra que contiene el ligando (por ejemplo, medios de cultivo acondicionados con células o extractos de tejido) en condiciones que faciliten la unión de receptor-ligando (típicamente temperatura, pH y fuerza iónica casi fisiológicos). Se separa entonces el complejo quimera-ligando de la mezcla usando proteína A, que se inmoviliza sobre un soporte sólido (por ejemplo, perlas de resina insolubles). Se eluye entonces el ligando usando técnicas químicas convencionales tales como con una sal o gradiente de pH. Como alternativa, la quimera misma puede unirse a un soporte sólido, llevándose a cabo la unión y elución como anteriormente. Las quimeras se pueden usar in vivo para regular las respuestas inflamatorias, incluyendo respuestas de fase aguda tales como amiloide A sérico (SAA), proteína C reactiva (CRP) y similares. Las quimeras con alta afinidad se administran por vía parenteral (por ejemplo, por inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa). Las moléculas en circulación se unen al ligando y se retiran de la circulación mediante procesos fisiológicos normales. Para uso en ensayos, se unen las quimeras a un soporte a través de la región Fc y se usan en un formato ELISA. [0154] Para ayudar a aislar asociados de unión anti-IL-22RA de la presente invención, puede emplearse ventajosamente un sistema de ensayo que usa un receptor de unión a ligando (o un anticuerpo, un miembro de un par de complemento/anticomplemento) o un fragmento de unión del mismo y un instrumento biosensor comercialmente disponible (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Dicho receptor, anticuerpo, miembro de un par de complemento/anticomplemento

o fragmento se inmoviliza sobre la superficie de un chip receptor. Se da a conocer el uso de este instrumento por Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991 y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993. Se une covalentemente un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento, usando la química de amina o sulfhidrilo, a fibras de dextrano que se unen a una película de oro en la celda de flujo. Se pasa una muestra de ensayo a través de la celda. Si está presente en la muestra un ligando, epítopo o miembro opuesto del par de complemento/anticomplemento, se unirá al receptor, anticuerpo o miembro inmovilizado, respectivamente, causando un cambio del índice de refracción del medio, que se detecta como un cambio de la resonancia de plasmón de superficie de la película de oro. Este sistema permite la determinación de las velocidades de entrada y salida, a partir de las cuales puede calcularse la afinidad de unión y la valoración de la estequiometría de unión. Como alternativa, puede analizarse la unión de ligando/receptor usando la tecnología SELDI™ (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA). Además, puede usarse la tecnología BIACORE, descrita anteriormente, en experimentos competitivos para determinar si diferentes anticuerpos monoclonales se unen al mismo o diferentes epítopos en el polipéptido IL-22RA, y como tales, se pueden usar para ayudar a la cartografía epitópica de los anticuerpos neutralizantes de la presente invención que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan IL-22 o ambas IL-20 e IL-22. [0155] Los polipéptidos receptores de unión a ligando se pueden usar también en otros sistemas de ensayo conocidos en la materia. Dichos sistemas incluyen análisis de Scatchard para la determinación de la afinidad de unión (véase Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) y ensayos calorimétricos (Cunningham y col., Science 253:545-48, 1991; Cunningham y col., Science 245:821-25, 1991). [0156] La presente memoria descriptiva describe una variedad de otras fusiones polipeptídicas y proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones polipeptídicas. Por ejemplo, puede prepararse un receptor IL-22RA soluble en forma de una fusión con una proteína dimerizante como se da a conocer en las patentes de EE.UU. nº 5.155.027 y 5.567.584. Las proteínas dimerizantes preferidas a este respecto incluyen dominios de la región constante de inmunoglobulina, por ejemplo IgCγI, y la cadena ligera κ humana. Las fusiones de inmunoglobulina-IL-22RA soluble pueden expresarse en células modificadas por ingeniería genética para producir una variedad de análogos multiméricos de receptor IL-22RA. Los dominios auxiliares pueden fusionarse con el receptor IL-22RA soluble para orientarlos a células, tejidos o macromoléculas específicos (por ejemplo, colágeno o células que expresan los ligandos de IL-22RA, IL-22 o IL-20). Puede fusionarse un polipéptido IL-22RA con dos o más restos, tales como un marcado por afinidad para purificación y un dominio de orientación. Las fusiones polipeptídicas pueden comprender también uno o más sitios de escisión, particularmente entre dominios. Véase Tuan y col., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996. [0157] En células bacterianas, a menudo es deseable expresar una proteína heteróloga como una proteína de fusión para reducida la toxicidad, aumentar la estabilidad y potenciar la recuperación de la proteína expresada. Por ejemplo, IL-22RA puede expresarse como una proteína de fusión que comprende un polipéptido de glutation S-transferasa. Las proteínas de fusión de glutation S-transferasa son típicamente solubles y fácilmente purificables a partir de lisados de E. coli en columnas de glutation inmovilizado. En enfoques similares, puede aislarse una proteína de fusión de IL-22RA que comprende un polipéptido de proteína de unión a maltosa con una columna de resina de amilosa, mientras que una proteína de fusión que comprende el extremo C-terminal de un gen de proteína A truncado puede purificarse usando IgG-Sepharose. Se describen las técnicas establecidas para expresar un polipéptido heterólogo en forma de proteína de fusión en una célula bacteriana, por ejemplo, por Williams y col., “Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies”, en “DNA Cloning 2: A Practical Approach”, 2ª edición, Glover and Hames (Eds.), páginas 15-58 (Oxford University Press 1995). Además, están disponibles sistemas de expresión comercialmente disponibles. Por ejemplo, el sistema de purificación de proteína Xa PINPOINT (Promega Corporation; Madison, WI) proporciona un procedimiento para aislar una proteína de fusión que comprende un polipéptido que se biotinila durante la expresión con una resina que comprende avidina. [0158] Los marcajes peptídicos que son útiles para aislar polipéptidos heterólogos expresados por células procarióticas o eucarióticas incluyen marcajes de polihistidina (que tienen afinidad por resina quelante de níquel), marcajes de c-myc, proteína de unión a calmodulina (aislada con cromatografía de afinidad por calmodulina), sustancia P, el marcaje RYIRS (que se une con anticuerpos anti-RYIRS), el marcaje Glu-Glu y el marcaje FLAG (que se une a anticuerpos anti-FLAG). Véanse, por ejemplo, Luo y col., Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996), Morganti y col., Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996) y Zheng y col., Gene 186:55 (1997). Están disponibles moléculas de ácido nucleico que codifican dichos marcajes peptídicos, por ejemplo, en Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO). [0159] Otra forma de proteína de fusión comprende un polipéptido IL-22RA y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, típicamente un fragmento Fc que contiene dos o tres dominios de región constante y una región bisagra pero que carece de la región variable. Como ilustración, Chang y col., patente de EE.UU. nº 5.723.125, describen una proteína de fusión que comprende un interferón humano y un fragmento Fc de inmunoglobulina humana. El extremo C del interferón está ligado al extremo N del fragmento Fc por un resto ligador peptídico. Es un ejemplo de un ligador peptídico un péptido que comprende principalmente una secuencia inerte para linfocitos T, que es inmunológicamente inerte. Un ligador peptídico ejemplar tiene la secuencia de aminoácidos: GGSGG SGGGG SGGGG S (SEC DE ID. Nº 9). En esta proteína de fusión, es un resto Fc ilustrativo una cadena γ4 humana, que es estable en disolución y tiene poca o ninguna actividad activadora de complemento. En consecuencia, la presente memoria descriptiva describe una proteína de fusión de IL22RA que comprende un resto IL-22RA y un fragmento Fc humano, en la que el extremo C del resto IL-22RA está unido al extremo N del fragmento Fc mediante un ligador peptídico, tal como un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 4. El resto IL-22RA puede ser una molécula de IL-22RA o un fragmento de la misma. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender el aminoácido de la SEC DE ID. Nº 3 y un fragmento Fc (por ejemplo, un fragmento de Fc humano) (SEC DE ID. Nº 4). [0160] En otra variación, una proteína de fusión de IL-22RA comprende una secuencia de IgG, un resto IL-22RA unido covalentemente al extremo aminoterminal de la secuencia de IgG y un péptido señal que está unido covalentemente al extremo aminoterminal del resto IL-22RA, en la que la secuencia de IgG consiste en los siguientes elementos en el siguiente orden: una región bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En consecuencia, la secuencia de IgG carece de un dominio CH1. El resto IL-22RA exhibe una actividad de IL-22RA, como se describe en la presente memoria, tal como la capacidad de unirse a un ligando de IL-22RA. Este enfoque general para producir proteínas de fusión que comprenden tanto porciones de anticuerpo como no anticuerpo se ha descrito por LaRochelle y col., documento EP 742830 (WO 95/21258). [0161] Las proteínas de fusión que comprenden un resto IL-22RA y un resto Fc se pueden usar, por ejemplo, como herramienta de ensayo in vitro. Por ejemplo, la presencia de un ligando de IL-22RA en una muestra biológica puede detectarse usando una proteína de fusión IL-22RA-inmunoglobulina, en la que se usa el resto IL-22RA para unirse al ligando, y se usa una macromolécula tal como proteína A o anticuerpo anti-Fc para unir la proteína de fusión a un soporte sólido. Dichos sistemas se pueden usar para identificar agonistas y antagonistas que interfieren con la unión de ligandos de IL-22RA, por ejemplo, IL-22 o ambos IL-20 e IL-22, a su receptor. [0162] Otros ejemplos de anticuerpos proteínas de fusión incluyen polipéptidos que comprenden un dominio de unión a antígeno y un fragmento de IL-22RA que contiene un dominio extracelular de IL-22RA. Dichas moléculas se pueden usar para orientar a tejidos particulares el beneficio de la actividad de unión a IL-22RA. [0163] La presente memoria descriptiva describe una variedad de otras fusiones polipeptídicas. Por ejemplo, puede intercambiarse parte o todo de un dominio o dominios que confieren una función biológica entre IL-22RA de la presente invención con el o los dominios funcionalmente equivalentes de otro miembro de la familia de receptor de citocina. Pueden expresarse fusiones polipeptídicas en células hospedadoras recombinantes para producir una variedad de análogos de fusión de IL22RA. Puede fusionarse un polipéptido IL-22RA con dos o más restos o dominios, tales como un marcado por afinidad para purificación y un dominio de orientación. Las fusiones polipeptídicas pueden comprender también uno o más sitios de escisión, particularmente entre dominios. Véase, por ejemplo, Tuan y col., Connective Tissue Research 34:1 (1996). [0164] Pueden prepararse proteínas de fusión mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia mediante la preparación de cada componente de la proteína de fusión y la conjugación química de los mismos. Como alternativa, puede generarse un polinucleótido que codifica ambos componentes de la proteína de fusión en el marco de lectura apropiado usando técnicas conocidas y expresarse mediante los procedimientos descritos en la presente memoria. Se describen procedimientos generales para la escisión enzimática y química de proteínas de fusión, por ejemplo, por Ausubel (1995) en las páginas 16-19 a 16-25. [0165] Los dominios de unión a IL-22RA se pueden caracterizar adicionalmente mediante el análisis físico de la estructura, como se determina por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcaje de fotoafinidad, junto con la mutación de los supuestos aminoácidos de sitio de contacto de agonistas de ligando de IL-22RA. Véanse, por ejemplo, de Vos y col., Science

255:306 (1992), Smith y col., J. Mol. Biol. 224:899 (1992) y Wlodaver y col., FEBS Lett. 309:59 (1992). [0166] La presente memoria descriptiva describe composiciones de IL-22RA químicamente modificadas en las que se liga un polipéptido IL-22RA con un polímero. Los polipéptidos IL-22RA ilustrativos son polipéptidos solubles que carecen de un dominio transmembrana funcional, tal como un polipéptido constituido por los restos de aminoácido de la SEC DE ID. Nº 3. Típicamente, el polímero es hidrosoluble de modo que el conjugado de IL-22RA no precipite en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. Es un ejemplo de un polímero adecuado aquel que se ha modificado para tener un solo grupo reactivo, tal como un éster activo para acilación o un aldehído para alquilación. De este modo, puede controlarse el grado de polimerización. Es un ejemplo de un aldehído reactivo el polietilenglicolpropionaldehído o derivados monoalcoxilo C1-C10 o ariloxilo del mismo (véase, por ejemplo, Harris y col., patente de EE.UU. nº 5.252.714). El polímero puede ser ramificado o no ramificado. Además, puede usarse una mezcla de polímeros para producir conjugados de IL-22RA. [0167] Los conjugados de IL-22RA usados para terapia pueden comprender restos poliméricos hidrosolubles farmacéuticamente aceptables. Los polímeros hidrosolubles adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), monometoxi-PEG, monoalcoxi C1-C10PEG, ariloxi-PEG, poli-(N-vinilpirrolidona)-PEG, tresilmonometoxi-PEG, PEGpropionaldehído, carbonato de bis-succinimidilo-PEG, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de propileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo glicerol), poli(alcohol vinílico), dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidrato. Los PEG adecuados pueden tener un peso molecular de aproximadamente 600 a aproximadamente 60.000, incluyendo por ejemplo, 5.000, 12.000, 20.000 y 25.000. Un conjugado de IL-22RA puede comprender también una mezcla de dichos polímeros hidrosolubles. [0168] Un ejemplo de un conjugado de IL-22RA comprende un resto IL-22RA y un resto poli(óxido de alquilo) unido al extremo N del resto IL-22RA. El PEG es un poli(óxido de alquilo) adecuado. Como ilustración, el IL-22RA puede modificarse con PEG, un proceso conocido como “pegilación”. La pegilación de IL-22RA puede llevarse a cabo mediante cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la materia (véanse, por ejemplo, el documento EP 0.154.316, Delgado y col., “Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems” 9:249 (1992), Duncan y Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994) y Francis y col., Int. J. Hematol. 68:1 (1998)). Por ejemplo, la pegilación puede efectuarse mediante una reacción de acilación o mediante una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva. En un enfoque alternativo, se forman conjugados de IL-22RA condensando PEG activado, en el que se ha reemplazado un grupo hidroxilo o amino terminal de PEG por un ligador activado (véase, por ejemplo, Karasiewicz y col., patente de EE.UU. nº 5.382.657). [0169] La pegilación mediante acilación requiere típicamente hacer reaccionar un derivado de éster activo de PEG con un polipéptido IL-22RA. Es un ejemplo de un éster de PEG activado el PEG esterificado con N-hidroxisuccinimida. Como se usa en la presente memoria, el término “acilación” incluye los siguientes tipos de ligamientos entre IL-22RA y un polímero hidrosoluble: amida, carbamato, uretano y similares. Los procedimientos para preparar IL-22RA pegilado mediante acilación comprenderán típicamente las etapas de (a) hacer reaccionar un polipéptido IL-22RA con PEG (tal como un éster reactivo de un derivado aldehído de PEG) en condiciones mediante las cuales uno o más grupos PEG se unan a IL-22RA, y (b) obtener el o los productos de reacción. Generalmente, las condiciones de reacción óptimas para reacciones de acilación se determinarán basándose en parámetros conocidos y los resultados deseados. Por ejemplo, cuanto mayor sea la relación de PEG:IL-22RA, mayor será el porcentaje de producto IL-22RA polipegilado. [0170] El producto de pegilación mediante acilación es típicamente un producto IL-22RA polipegilado, en el que los grupos amino ε de lisina se pegilan mediante un grupo ligante de acilo. Es un ejemplo de un ligamiento conector una amida. Típicamente, el IL-22RA resultante estará al menos un 95% mono-, di- o tripegilado, aunque pueden formarse algunas especies con mayores grados de pegilación dependiendo de las condiciones de reacción. Las especies pegiladas pueden separarse de los polipéptidos IL-22RA no conjugados usando procedimientos de purificación estándar, tales como diálisis, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y similares. [0171] La pegilación mediante alquilación implica generalmente hacer reaccionar un derivado aldehído terminal de PEG con IL-22RA en presencia de un agente reductor. Los grupos PEG pueden unirse al polipéptido mediante un grupo -CH2-NH. [0172] Además, pueden pegilarse anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o fragmentos de anticuerpo de la presente invención usando procedimientos de la materia y descritos en la presente memoria. [0173] La derivatización mediante alquilación reductiva para producir un producto monopegilado aprovecha la reactividad diferencial de los diferentes tipos de grupos amino primario disponibles para derivatización. Típicamente, la reacción se efectúa a un pH que permite aprovechar las diferencias de pKa entre los grupos amino ε de los residuos de lisina y el grupo amino α del residuo N-terminal de la proteína. Mediante dicha derivatización selectiva, se controla la unión de un polímero hidrosoluble que contiene un grupo reactivo tal como un aldehído a una proteína. La conjugación con el polímero ocurre predominantemente en el extremo N de la proteína, sin modificación significativa de otros grupos reactivos tales como los grupos amino de la cadena lateral de lisina. La presente invención proporciona una preparación sustancialmente homogénea de conjugados monopoliméricos de IL-22RA. [0174] La alquilación reductiva para producir una población sustancialmente homogénea de moléculas de conjugado de IL-22RA monopolimérico puede comprender las etapas de: (a) hacer reaccionar un polipéptido IL-22RA con un PEG reactivo en condiciones de alquilación reductiva a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo amino α en el extremo amino de IL-22RA, y (b) obtener el o los productos de reacción. El agente reductor usado para alquilación reductiva debería ser estable en disolución acuosa y capaz de reducir sólo la base de Schiff formada en el proceso inicial de alquilación reductiva. Los agentes reductores ilustrativos incluyen borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, dimetilaminoborano, trimetilaminoborano y piridinoborano. [0175] Para una población sustancialmente homogénea de conjugados de IL22RA monopolimeéricos, las condiciones de reacción de alquilación reductiva son aquellas que permiten la unión selectiva del resto polimérico hidrosoluble con el extremo N de IL-22RA. Dichas condiciones de reacción proporcionan generalmente diferencias de pKa entre los grupos amino de lisina y el grupo amino α en el extremo

N. El pH afecta también a la relación de polímero a proteína para usar. En general, si el pH es bajo, se deseará un gran exceso de polímero a proteína porque cuanto menos reactivo es el grupo α N-terminal, más polímero se necesita para conseguir condiciones óptimas. Si el pH es alto, el polímero:IL-22RA no tiene que ser tan alto porque están disponibles más grupos reactivos. Típicamente, el pH entrará en el intervalo de 3 a 9, o 3 a 6. Este procedimiento puede emplearse para preparar conjugados de receptor soluble que comprende IL-22RA homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos. [0176] Otro factor a considerar es el peso molecular del polímero hidrosoluble. Generalmente, cuanto mayor es el peso molecular de polímero, menor número de moléculas poliméricas que pueden unirse a la proteína. Para las reacciones de pegilación, el peso molecular típico es de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa o de aproximadamente 12 kDa a aproximadamente 25 kDa. La relación molar de polímero hidrosoluble a IL-22RA estará generalmente en el intervalo de 1:1 a 100:1. Típicamente, la relación molar de polímero hidrosoluble a IL-22RA será de 1:1 a 20:1 para polipegilación, y de 1:1 a 5:1 para monopegilación. [0177] Los procedimientos generales para producir conjugados que comprenden un polipéptido y restos poliméricos hidrosolubles son conocidos en la materia. Véanse, por ejemplo, Karasiewicz y col., patente de EE.UU. nº 5.382.657, Greenwald y col., patente de EE.UU. nº 5.738. 846, Nieforth y col., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996). Monkarsh y col., Anal. Biochem. 247:434 (1997)). Este procedimiento puede emplearse para preparar conjugados de receptor soluble que comprenden IL-22RA homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos. [0178] La presente memoria descriptiva describe composiciones que comprenden un péptido o polipéptido, tal como un receptor soluble o anticuerpo descrito en la presente memoria. Dichas composiciones pueden comprender adicionalmente un portador. El portador puede ser un portador orgánico o inorgánico convencional. Los ejemplos de portadores incluyen agua, disolución tampón, alcohol, propilenglicol, macrogol, aceite de sésamo, aceite de maíz y similares.

7. Aislamiento de polipéptidos IL-22RA

[0179] Los polipéptidos descritos en la presente memoria pueden purificarse al menos a aproximadamente un 80% de pureza, al menos a aproximadamente un 90% de pureza, al menos a aproximadamente un 95% de pureza o más de un 95%, tal como un 96%, 97%, 98% o más de un 99% de pureza, con respecto a macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y exentos de agentes infecciosos y pirogénicos. Los polipéptidos descritos en la presente memoria pueden purificarse también a un estado farmacéuticamente puro, que es mayor de 99,9% puro. En ciertas preparaciones, el polipéptido purificado está sustancialmente exento de otros polipéptidos, particularmente de otros polipéptidos de origen animal. [0180] Se pueden usar procedimientos de fraccionamiento y/o purificación convencionales para obtener preparaciones de IL-22RA purificado a partir de fuentes naturales (por ejemplo, fuentes de tejido humano), polipéptidos IL-22RA sintéticos y polipéptidos IL-22RA recombinantes y polipéptidos IL-22RA de fusión purificados a partir de células hospedadoras recombinantes. En general, se pueden usar precipitación con sulfato de amonio y extracción con ácido o caotrópico para el fraccionamiento de muestras. Las etapas de purificación ejemplares pueden incluir hidroxiapatito, exclusión por tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices especiales y similares. Son adecuados derivados de PEI, DEAE, QAE y Q. Los medios cromatográficos ejemplares incluyen aquellos medios derivatizados con grupos fenilo, butilo u octilo, tales como fenil-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butilo 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), octil-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tales como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas basadas en sílice, resinas celulósicas, perlas de agarosa, perlas de agarosa reticuladas, perlas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticuladas y similares que son insolubles en las condiciones en que se van a usar. Estos soportes pueden modificarse con grupos reactivos que permitan la unión de proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos carbohidrato. [0181] Los ejemplos de químicas de acoplamiento incluyen activación por bromuro de cianógeno, activación por N-hidroxisuccinimida, activación por epóxido, activación por sulfhidrilo, activación por hidrazida y derivados carboxilo y amino para químicas de acoplamiento de carbodiimida. Estos y otros medios sólidos son bien conocidos y ampliamente usados en la materia, y están disponibles de suministradores comerciales. La selección de un procedimiento particular para aislamiento y purificación de polipéptido es materia de diseño rutinario y se determina en parte por las propiedades del soporte elegido. Véanse, por ejemplo, “Affinity Chromatography: Principles & Methods” (Pharmacia LKB Biotechnology 1988) y Doonan, “Protein Purification Protocols” (The Humana Press 1996). [0182] Pueden idearse variaciones adicionales del aislamiento y purificación de IL-22RA por los expertos en la materia. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos antiIL-22A, obtenidos como se describe a continuación, para aislar grandes cantidades de proteína mediante purificación por inmunoafinidad. [0183] Los polipéptidos descritos en la presente memoria pueden aislarse también mediante la explotación de propiedades particulares. Por ejemplo, puede usarse cromatografía de adsorción de ión metálico inmovilizado (IMAC) para purificar proteínas ricas en histidina, incluyendo aquellas que comprenden marcajes de polihistidina. Brevemente, se carga en primer lugar un gel con iones metálicos divalentes formando un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Las proteínas ricas en histidina se adsorberán en esta matriz con afinidades diferentes, dependiendo del ión metálico usado, y se eluirán mediante elución competitiva, reduciendo el pH o usando agentes quelantes fuertes. Otros procedimientos de purificación incluyen la purificación de proteínas glucosiladas mediante cromatografía de afinidad por lectina y cromatografía de intercambio iónico (M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)). En realizaciones adicionales de la invención, puede construirse una fusión del polipéptido de interés y un marcado por afinidad (por ejemplo, proteína de unión a maltosa, un dominio de inmunoglobulina) para facilitar la purificación. Además, pueden explotarse las propiedades de unión a ligando del dominio extracelular de IL-22RA para la purificación, por ejemplo, de receptores solubles que comprenden IL-22RA; por ejemplo, usando cromatografía de afinidad en la que el ligando IL-22 está unido a una columna y el receptor que comprende IL22AR está unido y se eluye posteriormente usando procedimientos cromatográficos estándar. [0184] Pueden prepararse polipéptidos IL-22RA o fragmentos de los mismos mediante síntesis química, como se describe anteriormente. Los polipéptidos IL-22RA pueden ser monoméricos o multiméricos, glucosilados o no glucosilados, pegilados o no pegilados y pueden incluir o no un residuo de aminoácidos de metionina inicial.

8. Producción de anticuerpos de proteínas IL-22RA

[0185] Pueden obtenerse anticuerpos de IL-22RA, por ejemplo, usando el producto de un vector de expresión de IL-22RA o IL-22RA aislado a partir de una fuente natural como antígeno. Los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA particularmente útiles “se unen específicamente” a IL-22RA. Los anticuerpos se consideran de unión específica si los anticuerpos exhiben al menos una de las dos siguientes propiedades: (1) los anticuerpos se unen a IL-22RA con un nivel umbral de actividad de unión, y (2) los anticuerpos no reaccionan significativamente de forma cruzada con polipéptidos relacionados con IL-22RA. [0186] Con respecto a la primera característica, los anticuerpos se unen específicamente si se unen a un polipéptido, péptido o epítopo IL-22RA con una afinidad de unión (Ka) de 106 M-1 o mayor, preferiblemente de 107 M-1 o mayor, más preferiblemente de 108 M-1 o mayor, y lo más preferiblemente de 109 M-1 o mayor. La afinidad de unión de un anticuerpo puede determinarse fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci.

51:660 (1949)). Con respecto a la segunda característica, los anticuerpos no reaccionan significativamente de forma cruzada con moléculas peptídicas relacionadas, por ejemplo, si detectan IL-22RA pero no polipéptidos actualmente conocidos usando un análisis de transferencia Western estándar. Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos incluyen receptores de citocina conocidos. [0187] Los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA pueden producirse usando péptidos y polipéptidos portadores de epítopo antigénico de IL-22RA. Los péptidos y polipéptidos portadores de epítopo antigénico de la presente invención contienen una secuencia de al menos 9, o entre 15 y aproximadamente 30 aminoácidos, contenidos en la SEC DE ID. Nº 3 u otra secuencia de aminoácidos dada a conocer en la presente memoria. Sin embargo, los péptidos o polipéptidos que comprenden una mayor porción de una secuencia de aminoácidos de la invención, que contienen de 30 a 50 aminoácidos o cualquier longitud hasta e incluyendo la secuencia de aminoácidos entera de un polipéptido de la invención, son también útiles para inducir anticuerpos que se unen a IL-22RA. Es deseable que la secuencia de aminoácidos del péptido portador de epítopo se seleccione para proporcionar una solubilidad sustancial en disolventes acuosos (concretamente, la secuencia incluye residuos relativamente hidrófilos, mientras que se evitan típicamente los residuos hidrófobos). Además, pueden ser también deseables para la producción de anticuerpo secuencias de aminoácidos que contienen residuos de prolina.

[0188] Como ilustración, se identificaron los sitios antigénicos potenciales de IL22RA usando el procedimiento de Jameson-Wolf, Jameson y Wolf, CABIOS 4:181, (1988), como se ejecuta por el programa PROTEAN (versión 3.14) de LASERGENE (DNASTAR; Madison, WI). Se usaron los parámetros por defecto en este análisis. [0189] El procedimiento de Jameson-Wolf predice los determinantes antigénicos potenciales combinando seis subrutinas principales para la predicción estructural de proteína. Brevemente, se usó en primer lugar el procedimiento de Hopp-Woods, Hopp y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 78:3824 (1981) para identificar las secuencias de aminoácidos que representan las zonas de mayor hidrofilia local (parámetro: siete restos de media). En la segunda etapa, se usó el procedimiento de Emini, Emini y col.,

J. Virology 55:836 (1985) para calcular las probabilidades de superficie (parámetro: umbral de decisión de superficie (0,6) = 1). En tercer lugar, se usó el procedimiento Karplus-Schultz, Karplus y Schultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985) para predecir la flexibilidad de la cadena principal (parámetro: umbral de flexibilidad (0,2) = 1). En la cuarta y quinta etapas del análisis, se aplicaron las predicciones de estructura secundaria a los datos usando los procedimientos de Chou-Fasman, Chou, “Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition”, en “Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation”, Fasman (ed.), páginas 549-586 (Plenum Press 1990), y Garnier-Robson, Garnier y col., J. Mol. Biol. 120:97 (1978) (parámetros de Chou-Fasman: tabla de conformación= 64 proteínas; umbral de región α= 1,03; umbral de región β= 1,05; parámetros de Garnier-Robson: constantes de decisión de α y β= 0). En la sexta subrutina, se combinaron los parámetros de flexibilidad e hidropatía/accesibilidad al disolvente para determinar el valor de perfil de superficie, designado como “índice antigénico”. Finalmente, se aplicó una función de ensanchamiento de pico al índice antigénico, que ensancha los picos de gran superficie añadiendo un 20, 40, 60 u 80% del valor de pico respectivo para dar cuenta de la energía libre adicional derivada de la movilidad de regiones superficiales respecto a regiones interiores. Sin embargo, no se aplicó este cálculo a cualquier pico grande que residiera en una región helicoidal, puesto que las regiones helicoidales tienden a ser menos flexibles. [0190] Los resultados de este análisis indicaron que las siguientes secuencias de aminoácidos de la SEC DE ID. Nº 3 proporcionarían péptidos antigénicos adecuados: los perfiles de hidrofilia de Hopp/Woods se pueden usar para determinar las regiones que tienen el mayor potencial antigénico en la SEC DE ID. Nº 3 (Hopp y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986 y Triquier y col., Protein Engineering 11:153-169, 1998). El perfil está basado en una ventana deslizante de seis residuos. Se ignoraron los residuos G, S y T enterrados y los residuos H, Y y W expuestos. Además, los epítopos antigénicos de IL-22RA en la SEC DE ID. Nº 3, como se predice por una gráfica de Jameson-Wolf, por ejemplo usando el programa DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI), sirven como epítopos antigénicos preferidos, y pueden determinarse por un experto en la materia. Dichos epítopos antigénicos incluyen (1) los restos de aminoácido 1 (Pro) a 6 (Asp) de la SEC DE ID. Nº 3; (2) los restos de aminoácido 26 (Ser) a 32 (Pro) de la SEC DE ID. Nº 3;

(3) los restos de aminoácido 41 (Lys) a 47 (Asp) de la SEC DE ID. Nº 3; (4) los restos de aminoácido 49 (Val) a 62 (Cys) de la SEC DE ID. Nº 3; (5) los restos de aminoácido 41 (Lys) a 62 (Cys) de la SEC DE ID. Nº 3; (6) los restos de aminoácido 84 (Ala) a 97 (Ser) de la SEC DE ID. Nº 3; (7) los restos de aminoácido 103 (Thr) a 108 (Asp) de la SEC DE ID. Nº 3; (8) los restos de aminoácido 130 (Arg) a 135 (His) de la SEC DE ID. Nº 3; (9) los restos de aminoácido 164 (Gly) a 166 (Lys) de la SEC DE ID. Nº 3; (10) los restos de aminoácido 175 (Tyr) a 179 (Glu) de la SEC DE ID. Nº 3; (11) los restos de aminoácido 193 (Lys) a 196 (Ala) de la SEC DE ID. Nº 3 y (12) los restos de aminoácido 203 (Lys) a 209 (Thr) de la SEC DE ID. Nº 3. La presente invención contempla el uso de uno cualquiera de los péptidos antigénicos 1 a 12 para generar anticuerpos de IL-22RA o como herramienta para cribar o identificar anticuerpos monoclonales neutralizantes de la presente invención. La presente invención contempla también polipéptidos que comprenden al menos uno de los péptidos antigénicos 1 a 10. La presente invención contempla el uso de cualquier péptido o epítopo antigénico descrito en la presente memoria para generar anticuerpos de IL-22RA, así como para identificar y cribar anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22Ra que son neutralizantes y que pueden unirse, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-22 e IL-20 (individual o conjuntamente). [0191] Además, los antígenos adecuados incluyen también polipéptidos IL-22RA que comprenden un dominio de unión a citocina o dominio extracelular de IL-22RA dado a conocer anteriormente en combinación con otro dominio extracelular de citocina de clase I o II, tal como aquellos que forman polipéptidos IL-22RA solubles heterodiméricos o multiméricos tales como IL-22RA/CRF2-4, IL-22RA/zcytor11, IL22RA/zcytor7 y similares solubles. [0192] Pueden prepararse anticuerpos policlonales de proteína IL-22RA recombinante o de IL-22RA aislado de fuentes naturales usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Véanse, por ejemplo, Green y col.,

“"Production of Polyclonal Antisera”, en “Immunochemical Protocols” (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992) y Williams y col., “Expression of foreign proteins in

E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies”, en “DNA Cloning 2: Expression Systems”, 2ª edición, Glover y col. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995). La inmunogenicidad del polipéptido IL-22RA puede aumentarse mediante el uso de un coadyuvante tal como alúmina (hidróxido de aluminio) o coadyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para inmunización incluyen también polipéptidos de fusión, tales como fusiones de IL22RA o una porción del mismo con un polipéptido de inmunoglobulina o con proteína de unión a maltosa. El inmunógeno de polipéptido puede ser una molécula completa o una porción de la misma. Si la porción de polipéptido es “similar a hapteno”, dicha porción puede unirse o ligarse ventajosamente a un portador macromolecular (tal como hemocianina de lapa bocallave (KLH), seroalbúmina bovina (BSA) o toxoide del tétanos) para inmunización. [0193] Aunque se crean anticuerpos monoclonales típicamente en animales tales como caballos, vacas, perros, pollos, ratas, ratones, conejos, cobayas, cabras u ovejas, un anticuerpo dirigido contra IL-22RA de la presente invención puede derivar también de un anticuerpo de primate subhumano. Las técnicas generales para crear anticuerpos útiles en diagnóstico y terapia en babuinos pueden encontrarse, por ejemplo, en Goldenberg y col., publicación de patente internacional nº WO91/11465, y en Losman y col., Int. J. Cancer 46:310 (1990). [0194] Como alternativa, pueden generarse anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22RA. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales de roedores de antígenos específicos mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Kohler y col., Nature 256:495 (1975), Coligan y col. (eds.), “Current Protocols in Immunology”, Vol. 1, páginas 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) [“Coligan”], Picksley y col., “Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli”, en “DNA Cloning 2: Expression Systems”, 2ª edición, Glover y col. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)). [0195] Brevemente, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales inyectando ratones con una composición que comprende un producto génico de IL-22RA, verificando la presencia de producción de anticuerpo retirando una muestra de suero, retirando el bazo para obtener linfocitos B, fusionando los linfocitos B con células de mieloma para producir hibridomas, clonando los hibridomas, seleccionando los clones positivos que producen anticuerpos del antígeno, cultivando los clones que producen anticuerpos del antígeno y aislando los anticuerpos de los cultivos de hibridoma. [0196] Además, un anticuerpo dirigido contra IL-22RA de la presente invención puede derivar de un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos se obtienen a partir de ratones transgénicos que se han modificado por ingeniería genética para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a la exposición antigénica. En esta técnica, se introducen elementos del locus de cadena pesada y ligera humana en cepas de ratones derivadas de líneas de células madre embriónicas que contienen desestabilizaciones orientadas de los loci de cadena pesada y cadena ligera endógenos. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos de antígenos humanos, y los ratones se pueden usar para producir hibridomas secretores de anticuerpo. Se describen procedimientos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos, por ejemplo, por Green y col., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg y col., Nature 368:856 (1994) y Taylor y col., Int. Immun. 6:579 (1994). [0197] Pueden aislarse y purificarse anticuerpos monoclonales a partir de cultivos de hibridoma mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía por afinidad con proteína A-Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico (véanse, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2.9.3; Baines y col., “Purification of Immunoglobulin G (IgG)”, en “Methods in Molecular Biology”, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). [0198] Para usos particulares, puede ser deseable preparar fragmentos de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA. Dichos fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse, por ejemplo, mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse mediante digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos mediante procedimientos convencionales. Como ilustración, pueden producirse fragmentos de anticuerpo mediante la escisión enzimática de anticuerpos con pepsina, produciendo un fragmento de 5S denominado F(ab’)2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol, produciendo fragmentos monovalentes Fab’ de 3,5S. Opcionalmente, la reacción de escisión puede efectuarse usando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de los ligadores disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática que usa pepsina produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos procedimientos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, patente de EE.UU. nº 4.331.647, Nisonoff y col., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960), Porter, Biochem. J. 73:119 (1959), Edelman y col., en “Methods in Enzymology2 Vol. 1, página 422 (Academic Press 1967) y por Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4. [0199] Se pueden usar también otros procedimientos de escisión de anticuerpos, tales como la separación de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes, la escisión adicional de fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, a condición de que los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto. [0200] Por ejemplo, los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas VH y VL. Esta asociación puede ser no covalente, como se describe por Inbar y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 69:2659 (1972). Como alternativa, las cadenas variables pueden ligarse mediante un enlace disulfuro intermolecular o reticularse mediante productos químicos tales como glutaraldehído (véase, por ejemplo, Sandhu, Crit. Rev. Biotech.

12:437 (1992)). [0201] Los fragmentos Fv pueden comprender cadenas VH y VL que están conectadas por un ligador peptídico. Estas proteínas de unión a antígeno monocatenarias (scFv) se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL que están conectados por un oligonucleótido. Se inserta el gen estructural en un vector de expresión, que se introduce posteriormente en una célula hospedadora tal como E. coli. Las células hospedadoras recombinantes sintetizan una sola cadena polipeptídica con un péptido ligador que forma puente entre los dos dominios V. Se describen procedimientos para producir scFv, por ejemplo, por Whitlow y col., “Methods: A Companion to Methods in Enzymology” 2:97 (1991) (véanse también Bird y col., Science 242:423 (1988), Ladner y col., patente de EE.UU. nº 4.946.778, Pack y col., Bio/Technology 11:1271 (1993) y Sandhu, supra). [0202] Como ilustración, puede obtenerse un scFV exponiendo linfocitos al polipéptido IL-22RA in vitro, y seleccionando las colecciones de presentación de anticuerpo en fago o vectores similares (por ejemplo, mediante el uso de proteína o péptido IL-22RA inmovilizado o marcado). Los genes que codifican polipéptidos que tienen dominios de unión a polipéptido IL-22RA potenciales pueden obtenerse mediante el cribado de colecciones peptídicas aleatorias exhibidas en fago (presentación en fago) o en bacterias tales como E. coli. Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos pueden obtenerse de una serie de modos, tales como mediante mutagénesis aleatoria y síntesis polinucleotídica aleatoria. Estas colecciones de presentación de péptidos aleatorios se pueden usar para cribar péptidos que interaccionan con una diana conocida que puede ser una proteína o polipéptido, tal como un ligando o receptor, una macromolécula biológica o sintética o sustancias orgánicas o inorgánicas. Las técnicas para crear y cribar dichas colecciones de presentación de péptidos aleatorios son conocidas en la materia (Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.223.409, Ladner y col., patente de EE.UU. nº 4.946.778, Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.403.484, Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.571.698 y Kay y col., “Phage Display of Peptides and Proteins” (Academic Press, Inc. 1996)) y están disponibles comercialmente colecciones y kits de presentación de péptidos aleatorios para cribar dichas colecciones, por ejemplo, en CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Las colecciones de presentación de péptidos aleatorios pueden cribarse usando las secuencias de IL-22RA dadas a conocer en la presente memoria para identificar proteínas que se unen a IL22RA. [0203] Otra forma de fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una sola región determinante de la complementariedad (CDR). Los péptidos CDR (“unidades de reconocimiento mínimo”) pueden obtenerse construyendo genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Dichos genes se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable del ARN de células productoras de anticuerpo (véanse, por ejemplo, Larrick y col., “Methods: A Companion to Methods in Enzymology” 2:106 (1991), Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies”, en “Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application”, Ritter y col. (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995) y Ward y col., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”, en “Monoclonal Antibodies: Principles and Applications”, Birch y col., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)). [0204] Como alternativa, puede derivarse un anticuerpo dirigido contra IL-22Ra a partir de un anticuerpo monoclonal “humanizado”. Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen transfiriendo regiones determinantes de la complementariedad de ratón desde cadenas variables pesadas y ligeras de inmunoglobulina de ratón a un dominio variable humano. Se sustituyen entonces los residuos típicos de anticuerpos humanos en las regiones en fase de las contrapartidas de murino. El uso de componentes de anticuerpo derivados de anticuerpos monoclonales humanizados obvia los problemas potenciales asociados a la inmunogenicidad de las regiones constantes de murino. Se describen las técnicas generales para clonación de los dominios variables de inmunoglobulina de murino, por ejemplo, por Orlandi y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989). Se describen técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados, por ejemplo, por Jones y col., Nature 321:522 (1986), Carter y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992), Singer y col., J. Immun. 150:2844 (1993), Sudhir (ed.), “Antibody Engineering Protocols” (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, “Engineering Therapeutic Antibodies” en “Protein Engineering: Principles and Practice”, Cleland y col. (eds.), páginas 399-4.34 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) y por Queen y col., patente de EE.UU nº 5.693.762 (1997). [0205] Además, pueden pegilarse anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o fragmentos de anticuerpos de la presente invención usando procedimientos de la materia y descritos en la presente memoria. [0206] Pueden prepararse anticuerpos policlonales antiidiotípicos inmunizando animales con anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o fragmentos de anticuerpo, usando técnicas estándar. Véanse, por ejemplo, Green y col., “Production of Polyclonal Antisera”, en “Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols”, Manson (ed.), páginas 1-12 (Humana Press 1992). Véase también Coligan en las páginas 2.4.1-2.4.7. Como alternativa, pueden prepararse anticuerpos monoclonales antiidiotípicos usando anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o fragmentos de anticuerpo como inmunógenos con las técnicas descritas anteriormente. Como otra alternativa, pueden prepararse anticuerpos humanizados antiidiotípicos o anticuerpos de primate subhumano antiidioptípicos usando las técnicas anteriormente descritas. Se describen procedimientos para producir anticuerpos antiidiotípicos, por ejemplo, por Irie, patente de EE.UU. nº 5.208.146, Greene y col., patente de EE.UU. nº

5.637.677 y Varthakavi y Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875 (1996). [0207] Puede conjugarse un anticuerpo dirigido contra IL-22RA con un marcaje detectable formando un inmunoconjugado dirigido contra IL-22RA. Los marcajes detectables adecuados incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, un marcaje fluorescente, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje enzimático, un marcaje bioluminiscente u oro coloidal. Los procedimientos de preparación y detección de dichos inmunoconjugados marcados detectablemente son bien conocidos por los expertos en la materia y se describen con más detalle a continuación. [0208] El marcaje detectable puede ser un radioisótopo que se detecta por autorradiografía. Son isótopos particulamente útiles con el fin de la presente invención 3H, 125I, 131I, 35S y 14C. [0209] Los inmunoconjugados de IL-22AR pueden estar marcados también con un compuesto fluorescente. La presencia de un anticuerpo marcado fluorescentemente se determina exponiendo el inmunoconjugado a luz de la longitud de onda apropiada y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos marcadores fluorescentes incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficociacina, o-ftaldehído y fluorescamina. [0210] Como alternativa, los inmunoconjugados dirigidos contra IL-22RA pueden marcarse detectablemente acoplando un componente antibiótico a un compuesto quimioluminiscente. La presencia de inmunoconjugado marcado con quimioluminiscencia se determina detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes incluyen luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster oxalato. [0211] De forma similar, puede usarse un compuesto bioluminiscente para marcar inmunoconjugados dirigidos contra IL-22RA de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biológicos en que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de quimioluminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son útiles para marcaje incluyen luciferina, luciferasa y acuorina. [0212] Como alternativa, los inmunoconjugados dirigidos contra IL-22RA pueden marcarse detectablemente mediante ligamiento de un componente anticuerpo dirigido contra IL-22RA con una enzima. Cuando el conjugado dirigido contra IL-22RAenzima se incuba en presencia del sustrato apropiado, el resto enzimático reacciona con el sustrao produciendo un resto químico que puede detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorimétricos o visuales. Los ejemplos de enzimas que se pueden usar para marcar detectablemente inmunoconjugados poliespecíficos incluyen β-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina. [0213] Los expertos en la materia conocerán otros marcajes adecuados que pueden emplearse según la presente invención. La unión de restos marcadores a anticuerpos dirigidos contra IL-22RA puede conseguirse usando técnicas estándar conocidas en la materia. Se describe la metodología típica a este respecto por Kennedy y col., Clip. Chim. Acta 70:1 (1976), Schurs y col., Clin. Chim. Acta 81:1 (1977), Shih y col., Int’l

J. Cancer 46:1101 (1990), Stein y col., Cancer Res. 50:1330 (1990) y Coligan, más

arriba)

[0214] Además, la conveniencia y versatilidad de la detección inmunoquímica puede potenciarse usando anticuerpos dirigidos contra IL-22RA que se han conjugado con avidina, estreptavidina y biotina (véanse, por ejemplo, Wilchek y col. (eds.), “Avidin-Biotin Technology”, “Methods In Enzymology”, Vol. 184 (Academic Press 1990) y Bayer y col., “Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology”, en “Methods In Molecular Biology”, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992). [0215] Los procedimientos para efectuar inmunoensayos están bien establecidos. Véanse, por ejemplo, Cook y Self, “Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays”, en “Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application”, Ritter and Ladyman (eds.), páginas 180-208, (Cambridge University Press, 1995), Perry, “The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology”, en “Monoclonal Antibodies: Principles and Applications”, Birch and Lennox (eds.), páginas 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995) y Diamandis, “Immunoassay” (Academic Press, Inc. 1996). [0216] La presente memoria descriptiva describe kits para efectuar un ensayo de diagnóstico inmunológico para la expresión del gen IL-22RA. Dichos kits comprenden al menos un envase que comprende un anticuerpo dirigido contra IL-22RA, o un fragmento de anticuerpo. Un kit puede comprender también un segundo envase que comprende uno o más reactivos capaces de indicar la presencia de anticuerpo de IL22RA o fragmentos de anticuerpo. Los ejemplos de dichos reactivos incluyen marcajes detectables tales como un marcaje radiactivo, un marcaje fluorescente, un marcaje quimioluminiscente, un marcaje enzimático, un marcaje bioluminiscente, oro coloidal y similares. Un kit puede comprender también un medio para comunicar al usuario que los anticuerpos de IL-22RA o fragmentos de anticuerpo se usan para detectar la proteína IL-22RA. Por ejemplo, instrucciones escritas pueden afirmar que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo incluido puede usarse para detectar IL-22RA. El material escrito puede aplicarse directamente a un envase, o el material escrito puede proporcionarse en forma de inserto de envasado.

9. Uso de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA para antagonizar la unión de IL-22RA a IL-22 o a ambas IL-20 e IL-22

[0217] Las técnicas alternativas para generar o seleccionar anticuerpos útiles en la presente memoria incluyen la exposición in vitro de linfocitos a polipéptidos receptores IL-22RA solubles o fragmentos de los mismos, tales como epítopos antigénicos, y la selección de colecciones de presentación de anticuerpo en fago o vectores similares (por ejemplo, mediante el uso de polipéptidos de receptor IL-22RA soluble inmovilizado o marcado o fragmentos de los mismos, tales como epítopos antigénicos). Los genes codifican los polipéptidos que tienen dominios de unión potenciales tales como polipéptidos receptores IL-22RA solubles o fragmentos de los mismos, de tal modo que pueden obtenerse epítopos antigénicos cribando colecciones peptídicas aleatorias en exhibidas en fago (presentación en fago) o en bacterias tales como E. coli. Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos pueden obtenerse de una serie de maneras, tales como mediante mutagénesis aleatoria y síntesis polinucleotídica aleatoria. Estas colecciones de presentación de péptidos aleatorios se pueden usar para cribar péptidos que interaccionan con una diana conocida que puede ser una proteína o polipéptido, tal como un ligando o receptor, una macromolécula biológica o sintética o sustancias orgánicas o inorgánicas. Las técnicas para crear y cribar dichas colecciones de presentación de péptidos aleatorios son conocidas en la técnica (Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.223.409; Ladner y col., patente de EE.UU. nº 4.946.778; Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.403.484 y Ladner y col., patente de EE.UU. nº 5.571.698) y las colecciones de presentación de péptidos aleatorios y kits para cribar dichas colecciones están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Las colecciones de presentación de péptidos aleatorios pueden cribarse usando polipéptidos receptores IL-22RA solubles o fragmentos de los mismos, tales como las secuencias polipeptídicas epitópicas antigénicas dadas a conocer en la presente memoria para identificar proteínas que se unen a polipéptidos receptores que comprenden IL-22RA. Estos “polipéptidos de unión”, que interaccionan con polipéptidos receptores que comprenden IL-22RA soluble, se pueden usar para marcar células, para aislar péptidos homólogos mediante purificación por afinidad; pueden conjugarse directa o indirectamente con fármacos, toxinas, radionucleidos y similares. Estos polipéptidos de unión se pueden usar también en procedimientos analíticos tales como para cribar colecciones de expresión y actividad neutralizante, por ejemplo, para unirse, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la interacción entre el ligando IL-22 y el receptor, o la unión vírica a un receptor. Los polipéptidos de unión se pueden usar también para ensayos de diagnóstico para determinar los niveles en circulación de polipéptidos receptores que comprenden IL-22RA soluble; para detectar o cuantificar receptores que comprenden IL-22RA soluble o no soluble como marcador de una patología o enfermedad subyacente. Estos polipéptidos de unión pueden actuar también como “antagonistas” bloqueando o inhibiendo el receptor monomérico IL-22RA soluble o unido a membrana o la unión de polipéptido IL-22RA homodimérico, heterodimérico o multimérico (por ejemplo, a ligando) y la transducción de señal in vitro e in vivo. De nuevo, estos polipéptidos de unión sirven como polipéptidos receptores monoméricos anti-IL-22RA u homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos anti-IL-22RA, y son útiles para inhibir la actividad de IL-22 o de ambas IL-20 e IL-22, así como la actividad de receptor o la unión a proteína. Los anticuerpos creados por complejos receptores naturales de la presente invención, y los anticuerpos de unión a epítopo de IL-22RA y anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22RA, pueden ser realizaciones preferidas, ya que actúan más específicamente contra IL-22RA y pueden inhibir IL-22 o ambas IL-20 e IL-22. Además, la actividad antagonista y de unión de los anticuerpos de la presente invención puede ensayarse en ensayos de proliferación de IL-20 o IL-22, atrapamiento de señal, luciferasa o unión en presencia de IL-20 o IL22, respectivamente, y de receptores solubles que comprenden IL-22RA y otros ensayos biológicos o bioquímicos descritos en la presente memoria. [0218] Los anticuerpos de polipéptidos receptores IL-22RA solubles (por ejemplo, anticuerpos de la SEC DE ID. Nº 3) o fragmentos de los mismos, tales como epítopos antigénicos, se pueden usar para inhibir los efectos inflamatorios de IL-20, IL-22 o ambas IL-20 e IL-22 in vivo, para uso terapéutico contra psoriasis, dermatitis atópica, afecciones inflamatorias cutáneas, endotoxemia, artritis, asma, EII, colitis, artritis psoriática, artritis reumatoide u otras afecciones inflamatorias inducidas por IL-20 e IL-22; células marcadoras que expresan receptores IL-22RA; para aislar polipéptidos receptores que comprenden IL-22RA soluble mediante purificación de afinidad; para ensayos de diagnóstico para determinar los niveles en circulación de polipéptidos receptores que comprenden IL-22RA soluble; para detectar o cuantificar receptores que comprenden IL-22RA soluble como marcador de una patología o enfermedad subyacente; en procedimientos analíticos que emplean FACS; para cribar colecciones de expresión; para generar anticuerpos antiidiotípicos que pueden actuar como agonistas de IL-22 o IL-20 y como anticuerpos neutralizantes o antagonistas para unirse, bloquear, inhibir, reducir o antagonizar la función de receptor IL-22RA, o para unirse, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-22 y/o IL-20 (individual o conjuntamente) in vitro e in vivo. Los marcajes o marcadores directos adecuados incluyen radionucleidos, enzimas, sustratos, cofactores, biotina, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares; los marcajes o marcadores indirectos pueden ofrecer el uso de biotina-avidina u otros pares de complemento/anticomplemento como intermedios. Los anticuerpos de la presente memoria pueden estar también conjugados directa o indirectamente con fármacos, toxinas, radionucleidos y similares, y usarse estos conjugados para aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas in vivo. Además, se pueden usar in vitro anticuerpos de polipéptidos receptores que comprenden IL-22RA soluble,

o fragmentos de los mismos, para detectar polipéptidos receptores que comprenden IL22RA desnaturalizados o no desnaturalizados, o fragmentos de los mismos, en ensayos, por ejemplo, transferencias Western u otros ensayos conocidos en la materia. [0219] Los anticuerpos de receptor IL-22RA soluble o polipéptidos receptores homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos IL-22RA solubles son útiles para marcar células que expresan los correspondientes receptores y ensayar sus niveles de expresión, para purificación por afinidad, en ensayos de diagnóstico para determinar los niveles en circulación de polipéptidos receptores y para procedimientos analíticos que emplean clasificación celular activada por fluorescencia. Además, se pueden usar anticuerpos divalentes y anticuerpos antiidiotípicos como agonistas para imitar el efecto del ligando de IL-22RA, IL-22 o IL-20. [0220] Los anticuerpos de la presente memoria pueden conjugarse también directa

o indirectamente con fármacos, toxinas, radionucleidos y similares, y estos conjugados usarse para aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos o polipéptidos de unión que reconocen al receptor IL-22RA soluble o polipéptidos receptores IL-22RA solubles homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos se pueden usar para identificar o tratar tejidos u órganos que expresan una correspondiente molécula anticomplementaria (concretamente, un receptor soluble que comprende IL-22RA o unido a membrana). Más específicamente, los anticuerpos de polipéptidos receptores que comprenden IL-22RA soluble, o fragmentos bioactivos

o porciones de los mismos, pueden acoplarse con moléculas detectables o citotóxicas y suministrarse a un mamífero que tenga células, tejidos u órganos que expresen el receptor que comprende IL-22RA tal como cánceres que expresan IL-22RA. [0221] Las moléculas detectables adecuadas pueden unirse directa o indirectamente a polipéptidos que se unen a polipéptidos receptores que comprenden IL-22RA, tales como “polipéptidos de unión” (incluyendo los péptidos de unión dados a conocer anteriormente), anticuerpos o fragmentos bioactivos o porciones de los mismos. Las moléculas detectables adecuadas incluyen radionucleidos, enzimas,

sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las moléculas citotóxicas adecuadas pueden unirse directa o indirectamente al polipéptido o anticuerpo, e incluyen toxinas bacterianas o de planta (por ejemplo, toxina de la difteria, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina y similares), así como radionucleidos terapéuticos tales como yodo-131, renio-188 o itrio-90 (unidos directamente al polipéptido o anticuerpo,

o unidos indirectamente mediante un resto quelante, por ejemplo). Los polipéptidos de unión o anticuerpos pueden conjugarse también con fármacos citotóxicos tales como adriamicina. Para la unión indirecta de una molécula detectable o citotóxica, la molécula detectable o citotóxica puede conjugarse con un miembro de un par de complemento/anticomplemento, en el que el otro miembro se une al polipéptido de unión o porción de anticuerpo. Con estos fines, la biotina/estreptavidina es un par de complemento/anticomplemento ejemplar. [0222] En otra realización, se pueden usar proteínas de fusión de polipéptido de unión-toxina o proteína de fusión de anticuerpo-toxina para la inhibición o eliminación orientada a célula o tejido (por ejemplo, para tratar células o tejidos cancerosos). Como alternativa, si el polipéptido de unión tiene múltiples dominios funcionales (concretamente, un dominio de activación o un dominio de unión a ligando, más un dominio de orientación), una proteína de fusión que incluya sólo el dominio de orientación puede ser adecuada para dirigir una molécula detectable, una molécula citotóxica o una molécula complementaria a un tipo de célula o tejido de interés. En los casos en que la proteína de fusión que incluye sólo un dominio incluya una molécula complementaria, la molécula anticomplementaria puede conjugarse con una molécula detectable o citotóxica. Dichas proteínas de fusión de dominio-molécula complementaria representan por tanto un vehículo orientador genérico para suministro específico de célula/tejido de conjugados de molécula anti-complementaria detectable/citotóxica genéricos. [0223] En otra realización, se pueden usar proteínas de fusión de polipéptido de unión a IL-22RA-citocina o anticuerpo-citocina para potenciar la destrucción in vivo de tejidos diana (por ejemplo, cáncer de bazo, pancreático, de sangre, linfoide, de colon y médula ósea), si el polipéptido de unión-citocina o anticuerpo anti-receptor IL22 se orienta a la célula hiperproliferativa (véase, en general, Hornick y col., Blood 89:4437-47, 1997). Las proteínas de fusión descritas posibilitan la orientación de una citocina a un sitio de acción deseado, proporcionando así una concentración local elevada de citocina. Los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA monoméricos,

homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos adecuados se orientan a una célula o tejido indeseable (concretamente, un tumor o una leucemia) y la citocina fusionada media la lisis de células diana mejorada por células efectoras. Las citocinas adecuadas con este fin incluyen interleucina 2 y factor estimulante de la colonia de granulocitosmacrófagos (GM-CSF), por ejemplo. [0224] Como alternativa, se pueden usar polipéptidos de unión a receptor IL22RA o proteínas de fusión con anticuerpo descritos en la presente memoria para potenciar la destrucción in vivo de tejidos diana mediante la estimulación directa de una ruta apoptótica modulada por el receptor IL-22RA, dando como resultado la muerte celular de las células hiperproliferativas que expresan receptores que comprenden IL-22RA.

10. Usos terapéuticos de polipéptidos que tienen actividad de IL-22RA o anticuerpos de IL-22RA

[0225] Las secuencias de aminoácidos que tienen actividad IL-22RA soluble se pueden usar para modular el sistema inmunitario mediante la unión de los ligandos de IL-22RA IL-20 e IL-22 (individual o conjuntamente), y por tanto para evitar la unión del ligando de IL-22RA al receptor IL-22RA endógeno. En consecuencia, la presente memoria descriptiva describe el uso de proteínas, polipéptidos y péptidos que tienen actividad de IL-22RA (tales como polipéptidos IL-22RA solubles, fragmentos de polipéptido IL-22RA, análogos de IL-22RA (por ejemplo, anticuerpos antiidiotípicos anti-IL-22RA) y proteínas de fusión de IL-22RA) en un sujeto que carece de la cantidad adecuada de este polipéptido, o que produce un exceso de ligando de IL22RA. Los antagonistas de IL-22RA (por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra IL22RA) se pueden usar también para tratar un sujeto que produce un exceso de cualquier ligando de IL-22RA o de IL-22RA. Los sujetos adecuados incluyen mamíferos tales como seres humanos. Por ejemplo, dichos polipéptidos IL-22RA y anticuerpos dirigidos contra IL-22RA son útiles para unirse, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar IL-20 e IL-22 (individual o conjuntamente) en el tratamiento de psoriasis, dermatitis atópica, afecciones inflamatorias cutáneas, artritis psoriática, artritis, endotoxemia, asma, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), colitis y otras afecciones inflamatorias dadas a conocer en la presente memoria. [0226] Además, se ha mostrado que el receptor IL-22RA se une a un ligando denominado factor inducible por linfocitos T (IL-22) (SEC DE ID. Nº 6; Dumoutier,

L. y col., Proc. Nat’I. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000; la secuencia de IL-22 de ratón se muestra en Dumontier y col., J. Immunol. 164:1814-1819, 2000). Además, el receptor zcytor11 (IL-22RA) (patente de EE.UU. nº 5.965.704) y CRF2-4 de propiedad compartida con la presente se unen también a IL-22 en forma de heterodímero (véanse la publicación WIPO WO 00/24758; Dumontier y col., J. Immunol. 164:1814-1819, 2000; Spencer, SD y col., J. Exg. Med. 187:571-578, 1998; Gibbs, VC y Pennica Gene 186:97-101, 1997 (ADNc de CRF2-4); Xie, MH y col., J. Biol. Chem. 275: 31335-31339, 2000 y Kotenko, SV y col., J. Biol. Chem. 276:27252732, 2001). Además, el receptor IL-10β puede estar implicado como receptor de IL22, y se cree que es sinónimo de CRF2-4 (Dumoutier, L. y col., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000; Liu Y y col. J Immunol. 152; 1821-1829, 1994 (ADNc de IL10R). Además, se ha mostrado que el receptor IL-22RA se une a un ligando denominado IL-20 (SEC DE ID. Nº 8; publicación WIPO nº WO 99/27103). En realizaciones preferidas, la forma de receptor soluble de IL-22RA (SEC DE ID. Nº 3) es un monómero, homodímero, heterodímero o multímero que se une a, bloquea, inhibe, reduce, antagoniza o neutraliza IL-22 e IL-20 in vivo. Los anticuerpos y polipéptidos de unión de dicho IL-22RA monomérico, homodimérico, heterodimérico

o multimérico sirven también como antagonistas de la actividad de IL-22RA, y como antagonistas de IL-20 e IL-222 (individual o conjuntamente) como se describe en la presente memoria. [0227] Además, se ha descrito en la presente memoria y se ha demostrado que tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales neutralizantes anti-IL-22 se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de IL-22 e IL20 en ensayos de neutralización basados en célula. [0228] Se ha mostrado que IL-22 es inducida en presencia de IL-9, y se sospecha que está implicada en la promoción de respuestas inmunitarias de tipo Th1 e inflamación. La IL-9 estimula la proliferación, activación, diferenciación y/o inducción de la función inmunitaria en una variedad de formas y está implicada en asma, mastocitosis pulmonar y otras enfermedades, así como activa las rutas STAT. Los antagonistas de IL-22 o IL-9 pueden tener un uso beneficioso contra dichas enfermedades humanas. La presente invención proporciona dichos antagonistas novedosos de IL-22 como se describen en las reivindicaciones. [0229] Se ha mostrado que IL-22 está implicada en la regulación positiva de la producción de reactantes de fase aguda, tales como amiloide sérico A (SAA), α1antiquimotripsina y haptoglobina, y que la expresión de IL-22 aumenta tras la inyección de lipopolisacárido (LPS) in vivo, sugiriendo que la IL-22 está implicada en la respuesta inflamatoria (Dumoutier, L. y col., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 97:1014410149. 2000). La producción de proteínas de fase aguda, tales como SAA, se considera un mecanismo de supervivencia a corto plazo cuando la inflamación es beneficiosa; sin embargo, el mantenimiento de proteínas de fase aguda durante periodos más largos contribuye a la inflamación crónica y puede ser dañino para la salud humana. Para revisión, véanse Uhlar, CM y Whitehead, AS, Eur. J. Biochem. 265:501-523, 1999 y Baumann H. y Gauldie, J. Immunology Today 15:74-80, 1994. Además, la proteína de fase aguda SAA está implicada en la patogénesis de varias enfermedades inflamatorias crónicas, en la aterosclerosis y en la artritis reumatoide, y es la precursora de la proteína A amiloide depositada en la amiloidosis (Uhlar, CM y Whitehead, más arriba)). Por tanto, ya que la IL-22 actúa como una molécula proinflamatoria e induce la producción de SAA, serían útiles los antagonistas en el tratamiento de enfermedad inflamatoria y otras enfermedades asociadas a proteínas de respuesta en fase aguda inducidas por IL-22. Dichos antagonistas, como se describen en las reivindicaciones, se proporcionan por la presente invención. Un procedimiento de reducción de la inflamación inducida por IL-22 o inducida por IL-9 comprende administrar a un mamífero con inflamación una cantidad de una composición de receptor que comprende IL-22RA soluble suficiente para reducir la inflamación. Además, un procedimiento de supresión de una respuesta inflamatoria en un mamífero con inflamación puede comprender: (1) determinar el nivel de proteína A amiloide sérica;

(2) administrar una composición que comprende un polipéptido receptor de citocina IL-22RA soluble como se describe en la presente memoria en un vehículo farmacéuticamente aceptable; (3) determinar el nivel de proteína A amiloide sérica después de la administración; (4) comparar el nivel de proteína A amiloide sérica en la etapa (1) con el nivel de proteína A amiloide sérica en la etapa (3), en el que la falta de aumento o reducción del nivel de proteína A amiloide sérica es indicativa de la supresión de la respuesta inflamatoria. Las evidencias experimentales descritas en la presente memoria muestran que los antagonistas de IL-22, tales como receptores solubles y anticuerpos, reducen realmente los niveles de SAA en modelos in vivo de enfermedades inflamatorias, mostrando que la unión, bloqueo, inhibición, reducción, antagonismo o neutralización de IL-22 tiene efectos antiinflamatorios. [0230] Las evidencias indican que IL-20 y sus receptores están implicados en la psoriasis. Esta enfermedad cutánea multigénica se caracteriza por una aunmento en la proliferación de queratinocitos, una diferenciación alterada de queratinocitos y una infiltración de células inmunitarias en la piel. La primera serie de evidencias del papel de IL-20 en la psoriasis es la hiperqueratosis y epidermis engrosada observadas en los ratones transgénicos que se parece a las anormalidades psoriáticas humanas. Los números reducidos de tonofilamentos, que se cree que están relacionados con un defecto en la queratinización, son un rasgo notable de la psoriasis humana. Se han encontrado inclusiones intramitocondriales tanto en afecciones cutáneas hiperplásicas inducidas químicamente como de origen natural en ratones. La causa de las inclusiones y sus efectos sobre la función mitocondrial, si los hay, son desconocidos. Los ratones transgénicos para IL-20 exhiben muchas de las características observadas en la psoriasis humana. [0231] Además, los ARNm de receptor de IL-20 (tanto ARNm de IL-20RA como de IL-20RB) están notablemente regulados positivamente en piel psoriática humana en comparación con piel normal, sugiriendo adicionalmente un papel de IL-20 en la psoriasis. Ambas subunidades de receptor de IL-20 se expresan en queratinocitos por la epidermis y se expresan también en un subconjunto de células inmunitarias y endoteliales. Se propone que la expresión aumentada de un receptor de IL-20 activado puede alterar las interacciones entre células endoteliales, células inmunitarias y queratinocitos, conduciendo a la desregulación de la proliferación y diferenciación de queratinocitos. Además, los datos de ratones con desactivación génica descritos en la presente memoria, en los que el receptor IL-22RA está desactivado génicamente, muestran que el IL-22RA era necesario para los efectos inflamatorios inducidos por IL-20 en la piel de animales transgénicos. Estos resultados proporcionaron evidencias de que bloquear eficazmente la actividad de IL-22RA, por ejemplo mediante una desactivación génica de IL-22RA o de forma similar mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-22RA de la presente invención, reduciría de forma similar los efectos en la piel inducidos por IL-20, así como los efectos en la piel inducidos por IL-22, por ejemplo en psoriasis, EII, colitis u otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-20 y/o IL-22 incluyendo EII, artritis, asma, artritis psoriática, colitis, afecciones inflamatorias cutáneas y dermatitis atópica. [0232] Además, IL-20 estimula la transducción de señal en la línea celular HaCaT de queratinocitos humanos, apoyando una acción directa de este ligando novedoso en la piel. Además, las proteínas IL-1β, EGF y TNF-α, conocidas por ser activas en queratinocitos y por estar implicadas en las señales proliferativas y proinflamatorias en la piel, potencian la respuesta a IL-20. En ambas células HaCaT y BHK que expresan el receptor de IL-20, IL-20 señaliza a través de STAT3. [0233] Como se indica en la discusión anterior y los ejemplos siguientes, IL-20 está implicada en la patología de la psoriasis. La presente invención es en particular un uso para tratar psoriasis mediante la administración de agentes (como se definen en las reivindicaciones) que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan IL-20. Los antagonistas de IL-20 pueden ser anticuerpos, anticuerpos monocatenarios

o fragmentos de anticuerpos que se unen a IL-20 o al receptor de IL-20, por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, como se definen en las reivindicaciones. Los antagonistas evitarán así la activación del receptor de IL-20. Además, debido a que IL20 e IL-22 comparten a IL-22RA como receptor común, los antagonistas tales como IL-22RA soluble o anticuerpos, anticuerpos monocatenarios o fragmentos de anticuerpos que se unen al receptor IL-22RA se pueden usar para unirse, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar simultáneamente la actividad de IL-20 o de ambas IL-20 e IL-22. [0234] La psoriasis es una de las enfermedades dermatológicas más comunes, afectando hasta a un 1 a 2% de la población mundial. Es un trastorno cutáneo inflamatorio crónico caracterizado por pápulas eritematosas claramente marcadas y placas redondeadas cubiertas por escamas micáceas plateadas. Las lesiones cutáneas de la psoriasis son variablemente pruríticas. Las zonas traumatizadas desarrollan a menudo lesiones psoriáticas. Adicionalmente, otros factores externos pueden exacerbar la psoriasis, incluyendo infecciones, estrés y medicaciones, por ejemplo, litio, bloqueantes beta y antimaláricos. [0235] La variedad más común de psoriasis es la denominada de tipo placa. Los pacientes con psoriasis de tipo placa tendrán placas de crecimiento lento estable que permanecen básicamente sin cambios durante largos periodos de tiempo. Las zonas más comunes para que aparezca psoriasis de placa son codos, rodillas, hendidura glútea y cuero cabelludo. La implicación tiende a ser simétrica. La psoriasis inversa afecta a las regiones intertriginosas incluyendo axila, ingle, región submamaria y ombligo, y tiende también a afectar a cuero cabelludo, palmas de las manos y plantas de los piés. Las lesiones individuales son placas claramente marcadas pero pueden estar humedecidas debido a su localización. La psoriasis de tipo placa se desarrolla en general lentamente y sigue un curso indoloro. Raramente remite espontáneamente. [0236] La psoriasis eruptiva (psoriasis en gotas) es más frecuente en niños y adultos jóvenes. Se desarrolla agudamente en individuos sin psoriasis o en aquellos con psoriasis de placa crónica. Los pacientes presentan muchas pápulas escamosas eritematosas pequeñas, frecuentemente después de infección del tracto respiratorio superior con estreptococos betahemolíticos. Los pacientes con psoriasis pueden desarrollan también lesiones pustulares. Estas pueden localizarse en las palmas de las manos y las plantas de los pies o pueden estar generalizadas y asociadas a fiebre, malestar, diarrea y artralgias. [0237] Aproximadamente la mitad de todos los pacientes con psoriasis tienen implicación de las uñas de las manos, que aparece como fóvea puntiforme, engrosamiento de uña o hiperqueratosis subungueal. Aproximadamente un 5 a 10% de los pacientes con psoriasis tienen asociados síntomas articulares, y estos se encuentran muy frecuentemente en pacientes con implicación de las uñas de las manos. Aunque algunos tienen la aparición coincidente de artritis reumatoide clásica, muchos tienen enfermedad articular comprendida en uno de los cinco tipos asociados a la psoriasis:

(1) enfermedad limitada a una o pocas articulaciones pequeñas (70% de los casos); (2) una enfermedad de tipo artritis reumatoide seronegativa; (3) implicación de las articulaciones interfalángicas distales; (4) artritis destructiva grave con desarrollo de “artritis mutilante” y (5) enfermedad limitada a la espina dorsal. [0238] La psoriasis puede tratarse administrando agentes que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan IL-22, IL-20 o ambas de IL-20 e IL-22. Los antagonistas preferidos son un receptor soluble de IL-20 e IL-22, tal como IL22RA (SEC DE ID. Nº 3) o anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o anticuerpos monocatenarios que se unen al receptor IL-22RA, tales como los anticuerpos neutralizantes de la presente invención. Dichos antagonistas pueden administrarse solos o en combinación con otras terapias establecidas tales como lubricantes, queratolíticos, corticosteroides tópicos, derivados de vitamina D tópicos, antralina, antimetabolitos sistémicos tales como metotrexato, terapia con psoraleno y luz ultravioleta (PUVA), etretinato, isotretinoína, ciclosporina y el derivado de vitamina D3 tópico calcipotriol. Además, dichos antagonistas pueden administrarse a un individuo por vía subcutánea, intravenosa o transdérmica usando una crema o parche transdérmico que contiene el antagonista. Si se administra por vía subcutánea, el antagonista puede inyectarse en una o más placas psoriáticas. Si se administra por vía subcutánea, el antagonista puede administrarse directamente sobre las placas usando una crema, ungüento, pomada o disolución que contiene el antagonista. [0239] Los antagonistas de IL-20 o IL-22 pueden administrarse a una persona que tenga asma, bronquitis o fibrosis quística u otras enfermedades inflamatorias pulmonares para tratar la enfermedad. Los antagonistas pueden administrarse mediante cualquier procedimiento adecuado, incluyendo intravenoso, subcutáneo, lavado bronquial y el uso de inhalante que contiene el antagonista. [0240] El análisis de la distribución en tejido del ARNm correspondiente al ADNc de IL-22RA mostró que el nivel de ARN era máximo en placenta y bazo, y que el ligando al que se une IL-22RA (IL-22) está implicado en la inducción de respuesta inflamatoria, incluyendo la inducción de respuesta en fase aguda (Dumoutier, L. y col., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000). Por tanto, realizaciones particulares de la presente invención están dirigidas hacia el uso de anticuerpos dirigidos contra IL22RA, como se definen en las reivindicaciones, como antagonistas en enfermedades inflamatorias e inmunitarias o afecciones tales como psoriasis, artritis psoriática, dermatitis atópica, afecciones inflamatorias cutáneas, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, diverticulosis, asma, pancreatitis, diabetes de tipo I (DMID), cáncer pancreático, pancreatitis, enfermedad de Graves, cáncer de colon e intestinal, enfermedad autoinmunitaria, sepsis, transplante de órgano

o médula ósea; inflamación debida a endotoxemia, traumatismo, cirugía o infección; amiloidosis; esplenomegalia; enfermedad del injerto frente al hospedador y cuando se desea la inhibición de la inflamación, supresión inmunitaria, reducción de la proliferación de células hematopoyéticas, inmunitarias, inflamatorias o linfoides, macrófagos, linfocitos T (incluyendo células Th1 y Th2), la supresión de la respuesta inmunitaria a un patógeno o antígeno, u otros casos en que se desee la inhibición de las citocinas IL-22 o IL-20. [0241] Además, los anticuerpos o polipéptidos de unión que se unen a polipéptidos IL-22RA descritos en la presente memoria, y los polipéptidos IL-22RA mismos, son útiles para:

1) Bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la señalización mediante receptores de IL-20 o IL-22 en el tratamiento de inflamación aguda, inflamación como resultado de un traumatismo, lesión de tejido, cirugía, sepsis o infección y enfermedades inflamatorias crónicas tales como asma, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), colitis crónica, esplenomegalia, artritis reumatoide, episodios inflamatorios agudos recurrentes (por ejemplo, tuberculosis) y el tratamiento de amiloidosis y aterosclerosis, enfermedad de Castleman, asma y otras enfermedades asociadas a la inducción de respuesta en fase aguda.

2) Bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la señalización mediante receptores de IL-20 o IL-22 en el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como DMID, esclerosis múltiple (EM), lupus sistémico eritematoso (LSE), miastenia grave, artritis reumatoide y EII para evitar o inhibir la señalización en células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos, monocitos, leucocitos) mediante IL-22RA (Hughes C y col., J. Immunol. 153: 3319-3325, 1994). Se pueden usar también anticuerpos alternativos, tales como anticuerpos monoclonales (mAb) de receptores que comprenden IL-22RA, como antagonista para consumir células inmunitarias indeseadas para tratar una enfermedad autoinmunitaria. Asma, alergia y otras enfermedades atópicas pueden tratarse con un mAb contra, por ejemplo, receptores IL22RA solubles para inhibir la respuesta inmunitaria o para consumir células agresoras. El bloqueo, inhibición, reducción o antagonismo de la señalización mediante IL-22RA, usando los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención, puede beneficiar también a enfermedades de páncreas, riñón, pituitaria y células neuronales. Pueden beneficiarse DMID, DMNID, pancreatitis y carcinoma pancreático. El IL-22RA puede servir como diana para terapia de mAb de cáncer en que un mAb antagonista inhibe el crecimiento y orienta a la destrucción inmunomediada. (Holliger P y Hoogenboom, H. Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). Los mAb contra IL-22RA soluble pueden ser también útiles para tratar nefropatías tales como glomeruloesclerosis, nefropatía membranosa, amiloidosis (que afecta también al riñón entre otros tejidos), arteriosclerosis renal, glomerulonefritis de diversos orígenes, enfermedades fibroproliferativas del riñón, así como disfunción renal asociada a LSE, DMID, diabetes de tipo II (DMNID), tumores renales y otras enfermedades.

3) Agonizar, potenciar, aumentar o iniciar la señalización mediante receptores de IL-20 o IL-22 en el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como DMID, EM, LSE, miastenia grave, artritis reumatoide y EII. Los anticuerpos neutralizantes y monoclonales anti-IL-22RA pueden señalizar linfocitos u otras células inmunitarias para diferenciar, alterar la proliferación o cambiar la producción de citocinas o de proteínas de superficie celular que mejoran la autoinmunidad. Específicamente, la modulación de una respuesta de linfocitos T auxiliares a un patrón alternativo de secreción de citocina puede desviar una respuesta autoinmunitaria para mejorar la enfermedad (Smith JA y col., J. Immunol. 160:4841-4849, 1998). De forma similar, se pueden usar anticuerpos monoclonales heterodiméricos y multiméricos anti-IL-22RA soluble, anti-IL-22RA soluble/CRF2-4 para señalizar, consumir y desviar a células inmunitarias implicadas en asma, alergia y enfermedad atópica. La señalización mediante IL-22RA puede beneficiar también a enfermedades de páncreas, riñón, pituitaria y células neuronales. DMID, DMNID, pancreatitis y carcinoma pancreático pueden beneficiarse. El IL-22RA puede servir como diana para terapia con mAb de cáncer pancreático cuando un mAb de señalización inhibe el crecimiento canceroso y orienta a la destrucción inmunomediada (Tutt, AL y col., J. Immunol. 161: 3175-3185, 1998). De forma similar, el carcinoma de células renales puede tratarse con anticuerpos monoclonales de receptores que comprenden IL-22RA soluble de la presente invención. [0242] Los polipéptidos de IL-22RA solubles descritos en la presente memoria se pueden usar para unirse, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-22 o IL-20, individual o conjuntamente, en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, enfermedad atópica, DMNID, pancreatitis y disfunción renal como se describe anteriormente. Puede usarse una forma soluble de IL-22RA para promover una respuesta de anticuerpo mediada por células Th y/o para promover la producción de IL-4 u otras citocinas por linfocitos u otras células inmunitarias. [0243] Los receptores que comprenden IL-22RA soluble según se describe en la presente memoria son útiles como antagonistas de la citocina IL-20 o IL-22. Dichos efectos antagonísticos pueden conseguirse mediante la neutralización directa o la unión de IL-20 o IL-22. Además de los usos antagonísticos, los receptores solubles descritos en la presente memoria pueden unirse a IL-22 y actuar como proteínas portadoras de citocina IL-20 o IL-22, para transportar el ligando a tejidos, órganos y células diferentes en el cuerpo. Como tales, los receptores solubles descritos en la presente memoria pueden fusionarse o acoplarse con moléculas, polipéptidos o restos químicos que dirigen el complejo receptor soluble-ligando a un sitio específico, tal como un tejido, célula inmunitaria específica o tumor. Por ejemplo, en infección aguda o algunos cánceres, puede resultar beneficiosa la inducción de inflamación y proteínas de respuesta de fase aguda local por la acción de IL-22. Por tanto, los receptores solubles descritos en la presente memoria se pueden usar para dirigir específicamente la acción de IL-20 o IL-22. Véanse Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993 y Fernández-Botrán, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9: 497-513, 2000. [0244] Además, los receptores solubles descritos en la presente memoria se pueden usar para estabilizar IL-22 o IL-20, para aumentar la biodisponibilidad, la longevidad terapéutica y/o la eficacia del ligando mediante la estabilización del ligando ante degradación o aclaramiento, u orientando el ligando a un sitio de acción en el cuerpo. Por ejemplo, el complejo IL-6/IL-6R soluble de origen natural estabiliza IL-6 y puede señalizar mediante el receptor gp130. Véanse Cosman, D. más arriba) y Fernández-Botrán, R. más arriba) Además, puede combinarse IL-22RA con un ligando asociado tal como IL-22 para comprender un complejo ligando/receptor soluble. Dichos complejos se pueden usar para estimular respuestas de células que presentan una subunidad de receptor acompañante tal como, por ejemplo, pDIRS1 (IL-20RB) o CRF2-4 (IL-10RB). La especificidad celular de los complejos IL-22RA/ligando puede diferir de la observada para el ligando administrado solo. Además, los complejos pueden tener distintas propiedades farmacocinéticas tales que afecten a la semivida, la respuesta a la dosis y la especificidad de órgano o tejido. Por tanto, los complejos IL22RA/IL-22 o IL-22RA/IL-20 pueden tener actividad agonista para potenciar una respuesta inmunitaria o para estimular células mesangiales o estimular células hepáticas. Como alternativa, sólo los tejidos que expresan una subunidad de señalización que heterodimeriza con el complejo pueden verse afectados análogamente a la respuesta a complejos IL6/IL6R (Hirota H. y col., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 92:48624866, 1995; Hirano, T. en Thomason, A. (Ed.) “The Cytokine Handbook”, 3ª Ed., p. 208-209). Los complejos de receptor soluble/citocina de IL-12 y CNTF exhiben actividades similares. [0245] Además, la inflamación es una respuesta protectora del organismo para repeler un agente invasor. La inflamación es un evento en cascada que implica muchos mediadores celulares y humorales. Por un lado, la supresión de las respuestas inflamatorias puede dejar a un hospedador inmunocomprometido; sin embargo, si se deja sin tratar, la inflamación puede conducir a complicaciones graves incluyendo enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, psoriasis, artritis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria intestinal y similares), choque séptico e insuficiencia multiorgánica. De forma importante, estos diversos estados patológicos comparten mediadores inflamatorios comunes. Las enfermedades colectivas que se caracterizan por inflamación tienen un gran impacto sobre la morbilidad y mortalidad humanas. Por lo tanto, resulta evidente que las proteínas antiinflamatorias, tales como IL-22RA y anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, podrían tener un potencial terapéutico crucial para un vasto número de enfermedades humanas y animales, de asma y alergia a autoinmunidad y choque séptico.

1. Artritis [0246] La artritis, incluyendo osteoartritis, artritis reumatoide, articulaciones artríticas como resultado de lesión y similares, son afecciones inflamatorias comunes que se beneficiarían del uso terapéutico de proteínas antiinflamatorias tales como los polipéptidos IL-22RA de la presente invención. Por ejemplo, la artritis reumatoide (AR) es una enfermedad sistémica que afecta a todo el cuerpo y es una de las formas más comunes de artritis. Se caracteriza por la inflamación de la membrana que recubre la articulación, lo que causa dolor, rigidez, calor, enrojecimiento e hinchazón. Las células inflamatorias liberan enzimas que pueden digerir hueso y cartílago. Como resultado de la artritis reumatoide, el recubrimiento articulatorio inflamado, el sinovio, puede invadir y dañar hueso y cartílago, conduciendo al deterioro articular y a un dolor fuerte entre otros efectos fisiológicos. La articulación implicada puede perder su forma y alineamiento, dando como resultado dolor y pérdida de movimiento. [0247] La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inmunomediada caracterizada particularmente por inflamación y posterior lesión de tejido que conduce a una grave incapacidad y una elevada mortalidad. Se producen una variedad de citocinas localmente en las articulaciones reumatoides. Numeros estudios han demostrado que IL-1 y TNF-α, dos citocinas proinflamatorias prototípicas, desempeñan un papel importante en los mecanismos implicados en la inflamación sinovial y en la destrucción progresiva de la articulación. Es más, la administración de inhibidores de TNF-α e IL-1 en pacientes con AR ha conducido a una mejora drástica de los signos clínicos y biológicos de inflamación y a una reducción de los signos radiológicos de erosión ósea y destrucción de cartílago. Sin embargo, a pesar de estos alentadores resultados, un porcentaje significativo de pacientes no responde a estos agentes, sugiriendo que están también implicados otros mediadores en la fisiopatología de la artritis (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): 135-149, 2002). Uno de estos mediadores podría ser IL-20 o IL-22, y como tal una molécula que se una a o inhiba la actividad de IL-22 o IL-20, tal como polipéptidos IL-22RA o anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o asociados de unión, podría servir como producto terapéutico valioso para reducir la inflamación en artritis reumatoide y otras enfermedades artríticas. [0248] Hay varios modelos animales para artritis reumatoide conocidos en la materia. Por ejemplo, en el modelo de artritis inducida por colágeno (AIC), los ratones desarrollan artritis inflamatoria crónica que se parece estrechamente a la artritis reumatoide humana. Puesto que la AIC comparte rasgos inmunológicos y patológicos similares con la AR, esto la hace un modelo ideal para cribar compuestos antiinflamatorios humanos potenciales. El modelo de AIC es un modelo bien conocido en ratones que depende de que ocurra tanto una respuesta inmunitaria como una respuesta inflamatoria. La respuesta inmunitaria comprende la interacción de linfocitos B y linfocitos T CD4+ en respuesta a colágeno, que se administra como antígeno, y conduce a la producción de anticuerpos anticolágeno. La fase inflamatoria es el resultado de las respuestas de tejido a los mediadores de inflamación, como consecuencia de que algunos de estos anticuerpos reaccionan de forma cruzada con el colágeno nativo del ratón y activan la cascada de complemento. Es una ventaja de usar el modelo de AIC que los mecanismos básicos de patogénesis son conocidos. Se han identificado los epítopos de linfocitos T y linfocitos B relevantes en colágeno de tipo II y se han determinado diversos parámetros inmunológicos (por ejemplo, hipersensibildiad de tipo retardado y anticuerpo anticolágeno) e inflamatorios (por ejemplo, citocinas, quimiocinas y enzimas degradantes de matriz) respeco a la artritis inmunomediada, y por tanto se pueden usar para valorar la eficacia del compuesto de ensayo en el modelo de AIC (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams y col., Immunol. 89:9794-788, 1992; Myers y col., Life Sci. 61:1861-78, 1997 y Wang y col. Immunol. 92:8955-959, 1995). [0249] Se usó la administración de polipéptidos que comprenden IL-22RA2 soluble (zcytor16), tales como zcytor16-Fc4 u otras proteínas IL-22RA2 solubles y de fusión a estos ratones del modelo AIC para evaluar el uso de IL-22RA2 como antagonista de la IL-22 usado para mejorar los síntomas y alterar el curso de la enfermedad. Además, los resultados que muestran inhibición de IL-22 por IL-22RA2 proporcionan la demostración del concepto de que se pueden usar también otros antagonistas de IL-22, tales como IL-22RA o anticuerpos del mismo, para mejorar los síntomas y alterar el curso de la enfermedad. Puesto que el ligando de IL-22RA2, IL22, induce la producción de SAA, que está implicada en la patogénesis de la artritis reumatoide, y que se ha demostrado que IL-22RA2 es capaz de inhibir la actividad de IL-22 y SAA in vitro e in vivo, la administración sistémica o local de polipéptidos que comprenden IL-22RA2 tales como zcytor16-Fc4 u otros receptores solubles de IL-22 (por ejemplo, IL-22RA; SEC DE ID. Nº 3) y anticuerpos dirigidos contra IL-22RA y proteínas de fusión, puede suprimir potencialmente la respuesta inflamatoria en AR. La inyección de 10 µg de zcytor16-Fc (tres veces por semana durante 4 semanas) redujo significativamente la puntuación patológica (puntuación de pata, incidencia de inflamación o enfermedad). Otros productos terapéuticos potenciales incluyen polipéptidos IL-22RA, anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o anticuerpos anti-IL-22

o asociados de unión y similares. [0250] Un grupo ha mostrado que un anticuerpo dirigido contra IL-22 de ratón puede reducir los síntomas en un modelo AIC de ratón respecto a ratones de control, mostrando así conceptualmente que los polipéptidos IL-22RA solubles y anticuerpos neutralizantes de IL-22RA pueden ser beneficiosos para tratar enfermedades humanas. La administración de un solo anticuerpo monoclonal de rata específico de IL-22 de ratón (P3/1) redujo los síntomas de artritis en los animales cuando se introdujo profilácticamente o después de que se indujo en el modelo la artritis inducida AIC (publicación WIPO 02/068476; publicada el 9 de septiembre de 2002). Por lo tanto, los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención, como se definen en las reivindicaciones, incluyendo los anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22RA humanos de la presente invención, se pueden usar para neutralizar IL-22 e IL-20 en el tratamiento de enfermedades humanas específicas tales como psoriasis, artritis psoriática, endotoxemia, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), colitis y otras afecciones inflamatorias dadas a conocer en la presente memoria.

2. Endotoxemia [0251] La endotoxemia es una afección grave que resulta habitualmente de agentes infecciosos tales como bacterias y otros agentes patológicos infecciosos, sepsis, síndrome de choque tóxico o en pacientes inmunocomprometidos sometidos a infecciones oportunistas y similares. Las proteínas antiinflamatorias útiles terapéuticamente, tales como los polipéptidos y anticuerpos de IL-22RA de la presente invención, podrían ayudar a prevenir y tratar la endotoxemia en seres humanos y animales. Los polipéptidos IL-22RA, anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o anticuerpos anti-IL-22 o asociados de unión podrían servir como productos terapéuticos valiosos para reducir la inflamación y los efectos patológicos en la endotoxemia. [0252] La endotoxemia inducida por polisacárido (LPS) ocupa muchos de los mediadores proinflamatorios que producen efectos patológicos en las enfermedades infecciosas, y la endotoxemia inducida por LPS en roedores es un modelo ampliamente usado y aceptable para estudiar los efectos farmacológicos de agentes proinflamatorios

o inmunomoduladores potenciales. El LPS, producido en bacterias gramnegativas, es el principal agente causante en la patogénesis de choque séptico (Glausner y col., Lancet 338:732, 1991). Puede inducirse experimentalmente de hecho un estado similar al choque mediante una sola inyección de LPS en animales. Las moléculas producidas por células que responden a LPS pueden orientar a patógenos directa o indirectamente. Aunque estas respuestas biológicas protegen al hospedador frente a patógenos invasores, pueden causar también daño. Por tanto, la estimulación masiva de la inmunidad innata, que aparece como resultado de infección bacteriana gramnegativa grave, conduce a una producción en exceso de citocinas y otras moléculas y al desarrollo de un síndrome letal, el síndrome de choque séptico, que se caracteriza por fiebre, hipotensión, coagulación intravascular diseminada e insuficiencia multiorgánica (Dumitru y col. Cell 103:1071-1083, 2000). [0253] Estos efectos tóxicos de LPS están relacionados en su mayor parte con la activación de macrófagos que conduce a la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. Entre estos mediadores, el TNF parece desempeñar un papel crucial, como se indica por la prevención de la toxicidad por LPS mediante la administración de anticuerpos neutralizantes anti-TNF (Beutler y col., Science 229:869, 1985). Está bien establecido que 1 µg de inyección de LPS de E. coli en un ratón C57B1/6 dará como resultado aumentos significativos de IL-6, TNF-α, IL-1 y proteínas de fase aguda (por ejemplo SAA) en circulación aproximadamente 2 horas después de la inyección. La toxicidad de LPS parece estar mediada por estas citocinas, ya que la inmunización pasiva frente a estos mediadores puede dar como resultado una mortalidad reducida (Beutler y col., Science 229:869, 1985). Las estrategias de inmunointervención potencial para la prevención y/o el tratamiento de choque séptico incluyen mAb anti-TNF, antagonista de receptor de IL-1, LIP, IL-10 y G-CSF. [0254] Se usó la administración de polipéptidos que comprenden IL-22RA2 soluble, tales como Zcytor16-Fc4 u otras proteínas IL-22RA solubles y proteínas de fusión a este modelo inducido por LPS para evaluar el uso de IL-22RA2 para mejorar síntomas y alterar el curso de la enfermedad inducida por LPS. Además, los resultados que muestran inhibición de IL-22 por IL-22RA2 proporcionan la demostración del concepto de que se pueden usar también otros antagonistas de IL-22, tales como IL22RA o anticuerpos del mismo, para mejorar síntomas en el modelo inducido por LPS y alterar el curso de la enfermedad. El modelo mostró inducción de IL-22 por inyección de LPS y el tratamiento potencial de la enfermedad por polipéptidos IL22RA2. Puesto que el LPS induce la producción de IL-22 proinflamatorio, SAA u otros factores proinflamatorios, contribuyendo posiblemente a la patología de la endotoxemia, la neutralización de la actividad de IL-22, SAA u otros factores proinflamatorios por un antagonistas de polipéptido IL-22RA2 puede usarse para reducir los síntomas de endotoxemia, tales como se observan en choque endotóxico. Otros productos terapéuticos potenciales incluyen polipéptidos IL-22RA, anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o anticuerpos anti-IL-22 o asociados de unión y similares.

3. Enfermedad inflamatoria intestinal, EII [0255] En los Estados Unidos, aproximadamente 500.000 personas padecen enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que puede afectar a colon y recto (colitis ulcerosa) o a ambos intestinos delgado y grueso (enfermedad de Crohn). La patogénesis de estas enfermedades no está clara, pero implica la inflamación crónica de los tejidos afectados. Los polipéptidos IL-22RA, anticuerpos dirigidos contra IL22RA o anticuerpos anti-IL-22 o asociados de unión podrían servir como producto terapéutico valioso para reducir la inflamación y los efectos patológicos en EII y enfermedades relacionadas.

[0256] La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria del intestino grueso, denominado normalmente colon, caracterizada por la inflamación y ulceración de la mucosa o del recubrimiento más interno del colon. Esta inflamación causa que el colon se vacíe frecuentemente, dando como resultado diarrea. Los síntomas incluyen heces sueltas y calambres abdominales asociados, fiebre y pérdida de peso. Aunque la causa exacta de la CU es desconocida, investigaciones recientes sugieren que las defensas naturales del cuerpo actúan contra proteínas del cuerpo que el cuerpo cree que son extrañas (una “reacción autoinmunitaria”). Quizás debido a que se parecen a proteínas bacterianas del intestino, estas proteínas pueden fomentar o estimular el proceso inflamatorio que empieza a destruir el recubrimiento del colon. A medida que se destruye el recubrimiento del colon, se forman úlceras que liberan moco, pus y sangre. La enfermedad empieza habitualmente en la zona rectal y puede extenderse dado el caso por todo el intestino grueso. Episodios repetidos de inflamación conducen al engrosamiento de la pared del intestino y el recto con tejido cicatrizal. Puede aparecer muerte del tejido del colon o sepsis con la enfermedad grave. Los síntomas de colitis ulcerosa varían en gravedad y su inicio puede ser gradual o repentino. Los ataques pueden estar provocados por muchos factores, incluyendo infecciones respiratorias o estrés. [0257] Aunque no hay actualmente cura disponible para la CU, los tratamientos se centran en suprimir el proceso inflamatorio anormal en el recubrimiento del colon. Los tratamientos incluyen inmunosupresores corticosteroides (por ejemplo, azatioprina, mercaptopurina y metotrexato) y están disponibles aminosalicilatos para tratar la enfermedad. Sin embargo, el uso a largo plazo de inmunosupresores tales como corticosteroides y azatioprina puede dar como resultado efectos secundarios graves, incluyendo rarefacción ósea, cataratas, infección y efectos sobre hígado y médula ósea. En los pacientes en que las terapias actuales no son exitosas, la cirugía es una opción. La cirugía implica la extirpación del colon y el recto completos. [0258] Hay varios modelos animales que pueden imitar parcialmente la colitis ulcerosa crónica. El modelo más ampliamente usado es el modelo de colitis inducida por ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS)/etanol, que induce inflamación y ulceración crónicas en el colon. Cuando se introduce TNBS en el colon de ratones susceptibles mediante instilación intrarrectal, induce una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T en la mucosa colónica, en este caso conduciendo a una inflamación mucosa masiva caracterizada por una densa infiltración de linfocitos T y macrófagos por toda la pared del intestino grueso. Además, este cuadro histopatológico está acompañado por el cuadro clínico de pérdida de peso progresiva (consunción), diarrea hemorrágica, prolapso rectal y engrosamiento de la pared del intestino grueso (Neurath y col. Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000). [0259] Otro modelo de colitis usa dextranosulfato de sodio (DSS), que induce una colitis aguda manifestada por diarrea hemorrágica, pérdida de peso, acortamiento del colon y ulceración mucosa con infiltración de neutrófilos. La colitis inducida por DSS se caracteriza histológicamente por infiltración de células inflamatorias en la lámina propia, con hiperplasia linfoide, daño de cripta focal y ulceración epitelial. Estos cambios se cree que se desarrollan debido al efecto tóxido del DSS sobre el epitelio y mediante la fagocitosis de células de lámina propia y la producción de TNF-α e IFN-γ. A pesar de su uso común, siguen sin resolverse varias cuestiones referentes a los mecanismos de DSS sobre la relevancia para la enfermedad humana. El DSS se considera como un modelo independiente de linfocitos T porque se observa en animales deficientes en linfocitos T tales como ratones SCID. [0260] Puede usarse la administración de polipéptidos que comprenden IL-22RA2 soluble, tales como zcytor16-Fc4 u otras proteínas IL-22RA solubles y proteínas de fusión a estos modelos TNBS o DSS para evaluar el uso de IL-22RA para mejorar síntomas y alterar el curso de la enfermedad gastrointestinal. Además, los resultados que muestran inhibición de IL-22 por IL-22RA2 proporcionan una demostración del concepto de que se pueden usar también otros antagonistas de IL-22, tales como IL22RA o anticuerpos del mismo, para mejorar síntomas en los modelos de colitis/EII y alterar el curso de la enfermedad. Se observó la expresión aumentada de IL-22 en tejidos de colon de ratones DSS mediante PCR-FI, y la actividad sinérgica de IL-22 con IL-1β sobre líneas celulares intestinales. Indica que IL-22 puede desempeñar un papel en la respuesta inflamatoria en colitis, y la neutralización de la actividad de IL22 mediante la administración de polipéptidos IL-22RA2 es un enfoque terapéutico potencial para EII. Otros productos terapéuticos potenciales incluyen polipéptidos IL22RA, anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o anticuerpos anti-IL-22 o asociados de unión y similares.

4. Psoriasis [0261] La psoriasis es una afección cutánea crónica que afecta a más de 7 millones de estadounidenses. La psoriasis aparece cuando células de la piel nuevas crecen anormalmente, dando como resultado manchas inflamadas, hinchadas y escamosas de la piel en las que la piel vieja no se ha desprendido suficientemente rápido. La psoriasis de placa, la forma más común, se caracteriza por manchas inflamadas de la piel (“lesiones”) coronadas por escamas blancas plateadas. La psoriasis puede estar limitada a unas pocas placas o implicar zonas de moderadas a extensas de la piel, apareciendo lo más habitualmente en el cuero cabelludo, rodillas, codos y tronco. Aunque es altamente visible, la psoriasis no es una enfermedad contagiosa. La patogénesis de la enfermedad implica la inflamación crónica de los tejidos afectados. Los polipéptidos IL-22RA, anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o anticuerpos antiIL-22 y anti-IL-20 o asociados de unión podrían servir como productos terapéuticos valiosos para reducir la inflamación y los efectos patológicos en la psoriasis, otras enfermedades inflamatorias cutáneas, alergias cutáneas y mucosas y enfermedades relacionadas. [0262] La psoriasis es un trastorno inflamatorio de la piel mediado por linfocitos T que puede causar una considerable incomodidad. Es una enfermedad para la que no hay cura y que afecta a personas de todas las edades. La psoriasis afecta aproximadamente al 2% de las poblaciones de Europa y América del Norte. Aunque los individuos con psoriasis leve pueden controlar a menudo su enfermedad con agentes tópicos, más de un millón de pacientes en el mundo requieren terapia inmunosupresora ultravioleta o sistémica. Desgraciadamente, los inconvenientes y riesgos de la radiación ultravioleta y las toxicidades de muchas terapias limitan su uso a largo plazo. Además, los pacientes tienen habitualmente recurrencia de psoriasis, y en algunos casos rebote, poco después de detener la terapia inmunosupresora. [0263] La IL-20 es un homólogo novedoso de IL-10 que se ha demostrado que causa letalidad neonatal con anormalidades cutáneas, incluyendo diferenciación epidérmica aberrante en ratones transgénicos para IL-20 (Blumberg H. y col., Cell 104:9-19, 2001). El receptor de IL-20 se regula positivamente en gran medida en piel psoriática. Puesto que la IL-22 comparte una subunidad de receptor (zcytor11) con el receptor de IL-20, y que los ratones transgénicos de IL-22 exhiben un fenotipo similar, es posible que la IL-22 esté también implicada en las enfermedades inflamatorias cutáneas tales como psoriasis. La administración de polipéptido IL-22RA o antagonistas de anticuerpo dirigido contra IL-22RA, por vía subcutánea o tópica, puede reducir potencialmente la inflamación y síntomas. Otros productos terapéuticos potenciales incluyen polipéptidos IL-22RA, polipéptidos receptores zcytor11/CRF2-4 solubles, o anticuerpos anti-IL-22 o asociados de unión y similares. [0264] Además, se ha demostrado la expresión en exceso de IL-22 e IL-20 en lesiones psoriáticas humanas, sugiriendo que la IL-22, como IL-20, está también implicada en la psoriasis humana. Además, como se describe en la presente memoria, la expresión en exceso de IL-20 o IL-22 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunitarias indicativo de un fenotipo psoriático; y además la inyección de IL-22 en ratones normales mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunitarias indicativo de un fenotipo psoriático, que se eliminó por el antagonista de receptor soluble IL-22RA2 (zcytor16; publicación WIPO nº WO 01/40467). Dichos datos in vivo sugieren adicionalmente que la IL-22 proinflamatoria está implicada en la psoriasis. Como tales, los antagonistas de la actividad de IL-22 e IL-20, tales como receptores solubles IL-22RA y anticuerpos de los mismos, incluyendo los anticuerpos monoclonales y neutralizantes anti-IL-22RA humano de la presente invención, son útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas de ambas IL-20 e IL22 individual o conjuntamente en el tratamiento de psoriasis. Además, los antagonistas de la actividad de IL-22, tales como receptores solubles IL-2RA y anticuerpos de los mismos, incluyendo los anticuerpos monoclonales y neutralizantes anti-IL-22RA humano de la presente invención, son útiles en el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias, por ejemplo, como agentes que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan IL-22 e IL-20 en el tratamiento de dermatitis atópica, EII, colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide y enfermedad respiratoria en el adulto (ERA), choque séptico, insuficiencia multiorgánica, lesión inflamatoria pulmonar tal como asma o bronquitis, neumonía bacteriana, psoriasis, eccema, dermatitis atópica y de contacto y enfermedad inflamatoria intestinal tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn. [0265] Además, los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención se pueden usar en la prevención y terapia frente a la pérdida de peso asociada a una serie de enfermedades inflamatorias descritas en la presente memoria, así como para cáncer (por ejemplo, quimioterapia y caquexia) y enfermedades infecciosas. Por ejemplo, una gran pérdida de peso es un marcador clave asociado a modelos de septicemia, EM, AR y modelos tumorales. Además, la pérdida de peso es un parámetro clave para muchas enfermedades humanas incluyendo cáncer, enfermedades infecciosas y enfermedades inflamatorias. Se mostró pérdida de peso en ratones inyectados con IL-22RA adenovírica descrita en la presente memoria. En los anticuerpos anti-IL-22 y antagonistas de IL-22 tales como receptores IL-22RA solubles y anticuerpos de los mismos de la presente invención, así como receptores zcytor16 (IL-22RA2), puede ensayarse su capacidad de prevenir y tratar la pérdida de peso en ratones inyectados con IL-22 adenovírica descrita en la presente memoria. Son conocidos en la materia procedimentos de determinación del régimen profiláctico o terapéutico para dichos antagonistas de IL-22 y pueden determinarse usando los procedimientos descritos en la presente memoria. [0266] Los polipéptidos receptores IL-22RA solubles y anticuerpos de los mismos se pueden usar también en sistemas de diagnóstico para la detección de los niveles en circulación de ligando IL-22 o IL-20, y en la detección de IL-22 asociada a respuesta inflamatoria en fase aguda. En una realización relacionada, se pueden usar anticuerpos u otros agentes que se unen específicamente a receptores IL-22RA solubles descritos en la presente memoria para detectar polipéptidos receptores en circulación; a la inversa, se pueden usar los receptores IL-22RA solubles mismos para detectar los polipéptidos IL-22 o IL-20 en circulación o localmente activos. Niveles elevados o reducidos de polipéptidos ligando o receptor pueden ser indicativos de afecciones patológicas, incluyendo inflamación o cáncer. La IL-22 es conocida por inducir una respuesta inflamatoria en fase aguda asociada. Además, la detección de proteínas o moléculas de fase aguda tales como IL-20 o IL-22 puede ser indicativa de una afección inflamatoria crónica en ciertos estados patológicos (por ejemplo, psoriasis, artritis reumatoide, colitis, EII). La detección de dichas afecciones sirve para ayudar al diagnóstico de la enfermedad así como para ayudar al médico a elegir la terapia apropiada. [0267] La administración in utero de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22 o IL-20 puede usarse para mostrar la eficacia in vivo de modelos de enfermedad al reducir o eliminar el fenotipo cutáneo entontrado en crías transgénicas de IL-22 que sobreexpresan IL-22, o crías transgénicas de IL-20 que sobreexpresan IL-20. Hay precedentes en la materia de tratamiento in utero con anticuerpos monoclonales (mAb) neutralizantes. En un caso, el desarrollo del subconjunto B-1 de linfocitos B se afectó drásticamente mediante el tratamiento de ratones hembra preñadas con un mAb específico de la molécula específica de linfocitos B, CD19 (por ejemplo, Krop I. y col., Eur. J. Immunol. 26(1): 238-42, 1996). Krop. y col. inyectaron a ratones hembra preñadas por vía intraperitoneal 500 µg de mAb de rata anti-CD19 de ratón (o un Ab de control de isotipo coincidente de rata) en PBS empezando el día 9 de gestación, con inyecciones posteriores cada dos días hasta el nacimiento. Se inyectaron también a las crías una vez 500 µg de estos anticuerpos a los 10 días de edad. En otro caso, Tanaka y col., encontraron que el tratamiento in utero con anticuerpo monoclonal de la cadena β del receptor de IL-2 anulaba completamente el desarrollo de células epidérmicas dendríticas Thy-1+. Las dos subunidades distintas del receptor de IL-2, concretamente la cadena α (IL-2Rα) y la cadena β (IL-2Rβ), se expresan de modo casi mutuamente exclusivo a lo largo de la ontogenia del timo fetal. El bloqueo de IL-2Rβ, un componente de transducción de señal de IL-2R, mediante la administración de un mAb neutralizante a IL-2Rβ dio como resultado la desaparición completa y selectiva de células epidérmicas dendríticas cutáneas Thy-1+. El desarrollo de cualquier otro subconjunto de linfocitos T no estaba comprometido. Esto indicaba que la IL-2 desempeña un papel crucial en el desarrollo de células Vγ5+ fetales y sus descendientes (véase Tanaka, T. y col., Int Immunol. 4(4):487-9, 1992). Además, Schattemann GC y col. mostraron que se requiere PDGF-A para un desarrollo cardiovascular de murino normal usando un sistema in utero. Varias series de evidencias sugieren que se requiere la cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-A) para un desarrollo cardiovascular embrionario normal. La introducción de anticuerpos neutralizantes anti-PDGF-A en deciduas de ratón in utero dio como resultado la desestabilización selectiva de las interacciones ligando PDGF-A-receptor in vivo durante un periodo de 18-24 h y permitió la valoración de si se requiere PDGF-A para el desarrollo vascular y de cuándo se requiere (véase Schattemann GC y col., Dev. Biol. 176(1): 133-42, 1996). Estos resultados, así como otros descritos en la materia, proporcionan evidencias de que los mAb neutralizantes pueden desencadenar fuertes efectos in utero. De forma similar, pueden mostrarse los datos que muestran la eficacia de neutralizar IL-20 o IL-22 con anticuerpos monoclonales in vivo en modelos de enfermedad para reducir o eliminar el fenotipo cutáneo encontrado en crías transgénicas de IL-20 e IL-22 que sobreexpresan IL-20 y IL-22, respectivamente. Estos ratones transgénicos nacen con una apariencia cutánea “brillante”, debido al menos en parte a un engrosamiento de la epidermis como se describe en la presente memoria. Las crías TG de IL-20 que expresan niveles bastante bajos de citocina transgénica pueden recuperarse y sobrevivir a la crianza, pero los ratones TG de IL-22 mueren poco después del nacimiento, generalmente antes de los 5 días de edad. [0268] Por ejemplo, los anticuerpos neutralizantes de IL-20 incluyen anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales neutralizantes, que pueden unirse a epítopos antigénicos de IL-20 y neutralizar la actividad de IL-20. En consecuencia, los péptidos y polipéptidos de IL-20 que portan epítopos antigénicos son útiles para crear anticuerpos que se unen a los polipéptidos de IL-20 descritos en la presente memoria, así como para identificar y cribar anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-20, que son neutralizantes y que pueden unirse, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-20. Dichos anticuerpos monoclonales neutralizantes de la presente invención pueden unirse a un epítopo antigénico de IL-20. Dichos epítopos de la SEC DE ID. Nº 8 como se predice por la gráfica de Jameson-Wolf, por ejemplo usando el programa DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI), sirven como epítopos antigénicos preferidos, y pueden determinarse por un experto en la materia. Dichos epítopos antigénicos incluyen: los restos de aminoácido 42 (ILe) a 102 (Asp) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 42 (Ile) a 60 (Ile) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 42 (Ile) a 69 (Glu) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 42 (Ile) a 81 (Cys) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 42 (Ile) a 96 (Lys) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 42 (Ile) a 102 (Asp) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 60 (Ile) a 69 (Glu) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 60 (Ile) a 81 (Cys) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 60 (Ile) a 96 (Lys) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 60 (Ile) a 102 (Asp) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 69 (Glu) a 81 (Cys) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 69 (Glu) a 96 (Lys) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 69 (Glu) a 102 (Asp) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 81 (Cys) a 96 (Lys) de la SEC DE ID. Nº 8; los restos de aminoácido 81 (Cys) a 102 (Asp) de la SEC DE ID. Nº 8 y los restos de aminoácido 96 (Lys) a 102 (Asp) de la SEC DE ID. Nº 8. [0269] Además del resto de modelos de enfermedad descritos en la presente memoria, puede medirse in vivo la actividad de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA sobre tejido inflamatorio derivado de lesiones psoriáticas humanas usando un modelo de ratón con inmunodeficiencia combinada grave (SCID). Se han desarrollado varios modelos de ratón en los que se implantan células humanas en ratones inmunodeficientes (designados colectivamente como modelos de xenoinjerto); véanse, por ejemplo, Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18:513-22, 1994 y Flavell, DJ, Hematological Oncology 14:67-82, 1996. Como modelo de xenoinjerto in vivo para psoriasis, se implanta tejido cutáneo psoriático humano en el modelo de ratón SCID, y se expone al antagonista apropiado. Además, se pueden usar otros modelos animales de psoriasis en la materia para evaluar antagonistas de IL-20 e IL-22, tales como injertos de piel psoriática humana implantados en el modelo de ratón AGR129, y expuestos a un antagonista apropiado (por ejemplo, véase Boyman, O. y col., J. Exp. Med. Publicación en línea nº 20031482, 2004, incorporado a la presente como referencia). Los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de IL-22 o de ambas IL-20 e IL-22 son antagonistas preferidos, sin embargo, se pueden usar en este modelo anticuerpos antiIL-20 y anti-IL-22 (solos o en combinación), IL-22RA soluble, así como otros antagonistas de IL-20 e IL-22. De forma similar, se pueden usar en el modelo SCID tejidos o células humanos derivados de colitis, EII, artritis u otras lesiones inflamatorias para valorar las propiedades antiinflamatorias de los antagonistas de IL20 e IL-22 descritos en la presente memoria. [0270] Las terapias diseñadas para anular, retardar o reducir la inflamación usando anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o sus derivados, agonistas, conjugados o variantes pueden ensayarse mediante la administración de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o compuestos de IL-22RA solubles a ratones SCID que portan tejido inflamatorio humano (por ejemplo, lesiones psoriáticas y similares), o a otros modelos descritos en la presente memoria. La efiacia del tratamiento se mide y se evalúa estadísticamente como un efecto antiinflamatorio aumentado en la población tratada con el tiempo usando procedimientos bien conocidos en la materia. Algunos procedimientos ejemplares incluyen, pero sin limitación, medir, por ejemplo en un modelo psoriático, el grosor epidérmico, el número de células inflamatorias en la dermis superior y los grados de paraqueratosis. Dichos procedimientos son conocidos en la materia y se describen en la presente memoria. Por ejemplo, véanse Zeigler, M. y col. Lab. Invest. 81:1253, 2001; Zollner, T. M. y col. J. Clin. Invest. 109:671, 2002; Yamanaka, N. y col. Microbiol. Immunol. 45:507, 2001; Raychaudhuri, S. P. y col. Br.

J. Dermatol. 144:931, 2001; Boehncke, W. H y col. Arch. Dermatol. Res. 291:104,1999; Boehncke, W. H y col. J. Invest. Dermatol. 116:596, 2001; Nickoloff,

B. J. y col. Am. J. Pathol. 146: 580, 1995; Boehncke, W. H y col. J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997; Sugai, J., M. y col. J. Dermatol. Sci. 17:85, 1998 y Villadsen L.S. y col. J. Clin. Invest. 112:1571, 2003. La inflamación puede controlarse también con el tiempo usando procedimientos bien conocidos tales como citometría de flujo (o PCR) para cuantificar el número de células inflamatorias o lesionadas presentes en una muestra, puntuación (pérdida de peso, hemorragia rectal, longitud de colon) para EII, puntuación patológica de pata y puntuación de inflamación para el modelo de AR AIC. Por ejemplo, las estrategias terapéuticas apropiadas para ensayar en dicho modelo incluyen el tratamiento directo usando anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, otros antagonistas de IL-20 e IL-22 (individual o conjuntamente) o conjugados o antagonistas relacionados basándose en la interacción de desestabilización de los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA con sus ligandos IL-20 e IL-22, o para terapias basadas en células, utilizar anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o sus derivados, agonistas, conjugados o variantes. [0271] Además, la psoriasis es una enfermedad inflamatoria cutánea crónica que está asociada a queratinocitos epidérmicos hiperplásicos y células mononucleares infiltrativas, incluyendo linfocitos T de memoria CD4+, neutrófilos y macrófagos (Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996). Se cree actualmente que los antígenos ambientales desempeñan un papel significativo en el inicio y la contribución a la patología de la enfermedad. Sin embargo, es la pérdida de tolerancia a los autoantígenos lo que se cree que media la patología de la psoriasis. Se cree que las células dendríticas y linfocitos T CD4+ desempeñan un papel importante en la presentación y reconocimiento de antígeno que median la respuesta inmunitaria que conduce a la patología. Se ha desarrollado recientemente un modelo de psoriasis basado en el modelo de transferencia de CD4+CD45RB (Davenport y col., Internat. Immunopharmacol., 2:653-672). Se administran a los ratones anticuerpos anti-IL20, anti-IL22 o anticuerpos de IL20R y/o IL22R, tales como anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención, o IL-22RA soluble. La inhibición de las puntuaciones de enfermedad (lesiones cutáneas, citocinas inflamatorias) indica la eficacia de los antagonistas de IL-20 e IL-22 en la psoriasis, por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o receptores solubles IL-22RA, u otros antagonistas tales como anticuerpos contra IL-20 y/o IL-22 o sus receptores. Dermatitis atópica [0272] Tanto IL-20 como IL-2 se regulan positivamente en muestras de pacientes de dermatitis atópica (DA) humana. La DA es una enfermedad inflamatoria crónica común que se caracteriza por citocinas hiperactivadas del subconjunto 2 de linfocitos T auxiliares (Th2). Aunque la etiología exacta de la DA es desconocida, se han implicado múltiples factores, incluyendo respuestas inmunitarias Th2 hiperactivas, autoinmunidad, infección, alergenos y predisposición genética. Los rasgos clave de la enfermedad incluyen xerosis (sequedad de la piel), prurito (picazón de la piel), conjuntivitis, lesiones inflamatorias cutáneas, infección por Staphylococcus aureus, eosinofilia sanguínea elevada, elevación de IgE e IgG1 séricas y dermatitis crónica con infiltración de linfocitos T, mastocitos, macrófagos y eosinófilos. La colonización o infección con S. aureus se ha reconocido que exacerba la DA y perpetúa la cronicidad de esta enfermedad cutánea. [0273] La DA se encuentra a menudo en pacientes con asma y rinitis alérgica, y es frecuentemente la manifestiación inicial de enfermedad alérgica. Aproximadamente un 20% de la población de los países occidentales padece estas enfermedades alérgicas, y la incidencia de DA en países desarrollados es creciente por razones desconocidas. La DA empieza típicamente en la niñez y a menudo puede persistir durante la adolescencia hasta la madurez. Los tratamientos actuales para DA incluyen corticosteroides típicos, ciclosporina A oral, inmunosupresores no corticosteroides tales como tacrolimús (FK506 en forma de ungüento) e interferón γ. A pesar de la variedad de tratamientos para DA, los síntomas de muchos pacientes no mejoran, o tienen reacciones adversas a las medicaciones, requiriendo la búsqueda de otros agentes terapéuticos más eficaces. Los polipéptidos IL-22RA solubles y anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención, incluyendo los anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22RA de la presente invención, se pueden usar para neutralizar IL-22 e IL-20 en el tratamiento de enfermedades humanas específicas tales como dermatitis atópica, afecciones inflamatorias cutáneas y otras afecciones inflamatorias dadas a conocer en la presente memoria. [0274] Para uso farmacéutico, el IL-22RA soluble o anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención se formulan para suministro parenteral, particularmente intravenoso o subcutáneo, según procedimientos convencionales. La administración intravenosa será mediante inyección en bolo, liberación controlada, por ejemplo, usando minibombas u otra tecnología apropiada, o mediante infusión durante un periodo típico de una a varias horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína hematopoyética en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como disolución salina, disolución salina tamponada, dextrosa al 5% en agua o similares. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes de tamponación, albúmina para evitar la pérdida de proteína sobre las superficies del vial, etc. Cuando se utiliza dicha terapia de combinación, las citocinas pueden combinarse en una sola formulación o pueden administrarse en formulaciones separadas. Los procedimientos de formulación son bien conocidos en la materia y se dan a conocer, por ejemplo, en “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990, que se incorpora a la presente memoria como referencia. Las dosis terapéuticas estarán generalmente en el intervalo de 0,1 a 100 mg/kg de peso de paciente al día, preferiblemente de 0,5-20 mg/kg al día, con la dosis exacta determinada por el profesional clínico según estándares aceptados, teniendo en cuenta la naturaleza y gravedad de la afección que se va a tratar, las características del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel del experto en la materia. Las proteínas se administrarán habitualmente durante un periodo de hasta 28 días después de la quimioterapia o transplante de médula ósea o hasta conseguir un recuento de plaquetas >20.000/mm3, preferiblemente >50.000/mm3. Más habitualmente, las proteínas se administrarán durante una semana o menos, a menudo durante un periodo de uno a tres días. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz de IL-22RA soluble o anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención es una cantidad suficiente para producir un aumento clínicamente significativo de la proliferación y/o diferenciación de células progenitoras linfoides o mieloides, que se manifestará como un aumento de los niveles en circulación de células maduras (por ejemplo, plaquetas o neutrófilos). El tratamiento de trastornos de plaquetas se continuará por tanto hasta alcanzar un recuento de plaquetas de al menos 20.000/mm3, preferiblemente 50.000/mm3. El IL-22RA soluble o anticuerpos dirigidos contra IL22RA de la presente invención pueden administrarse también en combinación con otras citocinas tales como IL-3, -6 y -11; factor de células madre; eritropoyetina; GCSF y GM-CSF. En regímenes de terapia de combinación, las dosis diarias de otras citocinas serán generalmente: EPO, 150 U/kg; GM-CSF, 5-15 µg/kg; IL-3, 1-5 µg/kg y G-CSF, 1-25 µg/kg. La terapia de combinación con EPO, por ejemplo, está indicada en pacientes anémicos con bajos niveles de EPO. [0275] Generalmente, la dosificación de IL-22RA soluble administrado (o análogo

o proteína de fusión de IL-22RA) o anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, variará dependiendo de factores tales como la edad, peso, altura, sexo, estado médico genérico e historial médico previo del paciente. Típicamente, es deseable proporcionar al receptor una dosificación de IL-22RA soluble o anticuerpos dirigidos contra IL-22RA que esté en el intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de agente/peso corporal de paciente), aunque puede administrarse también una dosificación menor o mayor según dicten las circunstancias. [0276] La administración de IL-22RA soluble o anticuerpos dirigidos contra IL22RA a un sujeto puede ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, por perfusión a través de un catéter regional, o mediante inyección intralesional. Cuando se administran proteínas terapéuticas mediante inyección, la administración puede ser mediante infusión continua o mediante bolos únicos o múltiples. [0277] Las vías de administración adicionales incluyen oral, por mucosa-membrana, pulmonar y transcutánea. El suministro oral es adecuado para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas de proteinoides, microesferas de policianoacrilato y sistemas basados en lípidos (véase, por ejemplo, DiBase y Morrel, “Oral Delivery of Microencapsulated Proteins”, en “Protein Delivery: Physical Systems”, Sanders and Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). La viabilidad del suministro intranasal se ejemplifica por un modo tal como la administración de insulina (véanse, por ejemplo, Hinchcliffe e Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). Las partículas secas o líquidas que comprenden IL-22RA pueden prepararse e inhalarse con ayuda de dispersantes de polvo seco, generadores de aerosol líquido o nebulizadores (por ejemplo, Pettit y Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Este enfoque está ilustrado por el sistema de gestión de la diabetes AERX, que es un inhalador electrónico manual que suministra insulina aerosolizada a los pulmones. Los estudios han mostrado que se han suministrado proteínas de 48.000 kDa de tamaño a través de la piel a concentraciones terapéuticas con la ayuda de ultrasonido de baja frecuencia, lo que ilustra la viabilidad de la administración transcutánea (Mitragotri y col., Science 269:850 (1995)). El suministro transdérmico usando electroporación proporciona otro medio para administrar una molécula que tiene actividad de unión a IL-22RA (Potts y col., Pharm, Biotechnol. 10:213 (1997)). [0278] Puede formularse una composición farmacéutica que comprende un IL22RA soluble o anticuerpo dirigido contra IL-22RA según procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante los que las proteínas terapéuticas se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un “vehículo farmacéuticamente aceptable” si su administración puede tolerarse por un paciente receptor. La disolución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de vehículo farmacéuticamente aceptable. Otros portadores adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 19ª edición (Mack Publishing Company 1995). [0279] Con fines terapéuticos, se administran IL-22RA soluble o anticuerpo dirigido contra IL-22RA y un vehículo farmacéuticamente aceptable a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que una combinación de una molécula terapéutica de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administra en una “cantidad terapéuticamente eficaz” si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da como resultado un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor. Por ejemplo, un agente usado para tratar la inflamación es fisiológicamente significativo si su presencia alivia la respuesta inflamatoria.

[0280] Una composición farmacéutica que comprende IL-22RA (o análogo o proteína de fusión de IL-22RA) o anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22RA puede proporcionarse en forma líquida, en aerosol o en forma sólida. Las formas líquidas se ilustran por disoluciones inyectables y suspensiones orales. Las formas sólidas ejemplares incluyen cápsulas, comprimidos y formas de liberación controlada. La última forma se ilustra mediante minibombas osmóticas e implantes (Bremer y col., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, “Implants in Drug Delivery”, en “Drug Delivery Systems”, Ranade and Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer y col., “Protein Delivery with Infusion Pumas”, en “Protein Delivery: Physical Systems”, Sanders and Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey y col., “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant”, en “Protein Delivery: Physical Systems”, Sanders and Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)). [0281] Los liposomas proporcionan un medio para suministrar polipéptidos terapéuticos a un sujeto por vía intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutánea o mediante administración oral, inhalación o administración intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que consisten en una o más bicapas lipídicas que rodean compartimientos acuosos (véanse, en general, Bakker-Woudenberg y col., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Supl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993) y Ranade, “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers”, en “Drug Delivery Systems”, Ranade and Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Los liposomas son similares en composición a las membranas celulares y, como resultado, los liposomas pueden administrarse con seguridad y son biodegradables. Dependiendo del procedimiento de preparación, los liposomas pueden ser unilamelares o multilamelares, y los liposomas pueden variar en tamaño con diámetros en el intervalo de 0,02 µm a más de 10 µm. Puede encapsularse una variedad de agentes en liposomas: reparto de agentes hidrofóbicos en las bicapas y reparto de agentes hidrofílicos en el espacio o espacios acuosos internos (véase, por ejemplo, Machy y col., “Liposomes In Cell Biology And Pharmacology” (John Libbey 1987) y Ostro y col., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño de liposoma, el número de bicapas, la composición lipídica, así como la carga y características de superficie de los liposomas. [0282] Los liposomas pueden adsorberse sobre virtualmente cualquier tipo de célula y liberar entonces lentamente el agente encapsulado. Como alternativa, puede endocitarse un liposoma absorbido por células que son fagocíticas. La endocitosis es seguida por la degradación intralisosómica de los lípidos liposómicos y la liberación de los agentes encapsulados (Scherphof y col., Ann. N.Y. Acad Sci. 446:368 (1985)). Después de la administración intravenosa, se incorporan típicamente liposomas pequeños (de 0,1 a 1,0 µm) por células del sistema reticuloendotelial, localizadas principalmente en hígado y bazo, mientras que los liposomas mayores de 3,0 µm se depositan en el pulmón. Esta captación preferencial de liposomas menores por las células del sistema reticuloendotelial se ha usado para suministrar agentes quimioterapéuticos a macrófagos y a tumores del hígado. [0283] El sistema reticuloendotelial puede evitarse mediante varios procedimientos, incluyendo saturación con grandes dosis de partículas liposómicas o inactivación selectiva de macrófagos por medios farmacológicos (Claassen y col., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Además, la incorporación de fosfolípidos derivatizados con glucolípidos o polietilenglicol a membranas liposómicas se ha mostrado que da como resultado una captación significativamente reducida por el sistema reticuloendotelial (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)). [0284] Los liposomas pueden prepararse también para orientar a células u órganos particulares variando la composición fosfolipídica o insertando receptores o ligandos en los liposomas. Por ejemplo, los liposomas preparados con un alto contenido de un tensioactivo no iónico se han usado para orientar a hígado (Hayakawa y col., patente japonesa 04-244.018; Kato y col., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). Estas formulaciones se prepararon mezclando fosfatidilcolina de soja, α-tocoferol y aceite de ricino hidrogenado etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla a vacío y reconstituyendo entonces la mezcla con agua. Se ha mostrado también que una formulación liposómica de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esterilglucósido derivado de soja (SG) y colesterol (Ch) orienta al hígado (Shimizu y col., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)). [0285] Como alternativa, pueden unirse diversos ligandos orientadores a la superficie del liposoma, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, carbohidratos, vitaminas y proteínas de transporte. Por ejemplo, los liposomas pueden modificarse con derivados galactosil-lipídicos de tipo ramificado para orientar a receptores de asialoglucoproteína (galactosa), que se expresan exclusivamente en la superficie de células hepáticas (Kato y Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.

14:287 (1997); Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). De forma similar, Wu y col., Hepatology 27:772 (1998), han mostrado que marcar liposomas con asialofetuína conducía a una semivida plasmática acortada del liposoma y a una captación potenciada en gran medida de liposoma marcado con asialofetuína por los hepatocitos. Por otro lado, la acumulación hepática de liposomas que contienen derivados galactosil-lipídicos de tipo ramificado puede inhibirse mediante la preinyección de asialofetuína (Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). Los liposomas de albúmina sérica humana poliaconitilada proporcionan otro enfoque para orientar liposomas a células hepáticas (Kamps y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA

94: 11681 (1997)). Además, Geho y col. patente de EE.UU. nº 4.603.044, describen un sistema de suministro de vesícula liposómica dirigido a hepatocito que tiene especificidad por los receptores hepatobiliares asociados a las células metabólicas especializadas del hígado. [0286] En un enfoque más general para la orientación a tejido, se premarcan las células diana con anticuerpos biotinilados específicos de un ligando expresado por la célula diana (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). Después de la eliminación plasmática del anticuerpo libre, se administran liposomas conjugados con estreptavidina. En otro enfoque, se unen directamente los anticuerpos orientadores a liposomas (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). [0287] Los polipéptidos y anticuerpos pueden encapsularse en liposomas usando técnicas estándar de microencapsulación de proteína (véanse, por ejemplo, Anderson y col., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson y col., Cancer Res. 50: 1853 (1990) y Cohen y col., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving y col. “Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies”, en “Liposome Technology”, 2ª edición, Vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef y col., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Como se advierte anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener una variedad de componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados lipídicos de polietilenglicol (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)). [0288] Las microesferas poliméricas degradables se han diseñado para mantener altos niveles sistémicos de proteínas terapéuticas. Las microesferas se preparan a partir de polímeros degradables tales como poli(lactida-co-glicolida) (PLG), polianhídridos, poli(ortoésteres) y polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables, en las que se atrapan las proteínas en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, “Role of Polymers in Drug Delivery”, en “Drug Delivery Systems”, Ranade and Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos y Maskiewicz, “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery”, en “Protein Delivery: Physical Systems”, Sanders and Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus y col., Science 281:1161 (1998); Putney y Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Las nanoesferas recubiertas con polietilenglicol (PEG) pueden proporcionar también portadores para administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref y col., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)). [0289] La presente memoria descriptiva describe polipéptidos modificados químicamente que tienen actividad de unión a IL-22RA tal como receptores solubles IL-22RA monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos y antagonistas de IL-22RA, por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o polipéptidos de unión, o anticuerpos neutralizantes dirigidos contra IL-22RA, en los que un polipéptido está ligado a un polímero como se discute anteriormente. [0290] Pueden idearse otras formas de dosificación por los expertos en la materia como se muestra, por ejemplo, por Ansel y Popovich, “Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems”. 5ª edición (Lea&Febiger 1990), Gennaro (ed.), “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 19ª edición (Mack Publishing Company 1995) y por Ranade y Hollinger, “Drug Delivery Systems” (CRC Press 1996). [0291] Como ilustración, las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse en forma de kit que comprende un envase que comprende un polipéptido con un dominio extracelular de IL-22RA, por ejemplo, receptores solubles IL-22RA monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos, o un antagonista de IL-22RA (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a un polipéptido IL-22RA, o anticuerpo neutralizante anti-IL-22RA). Los polipéptidos terapéuticos pueden proporcionarse en forma de una disolución inyectable para dosis única o múltiples, o en forma de un polvo estéril que se reconstituirá antes de la inyección. Como alternativa, dicho kit puede incluir un dispersador de polvo seco, generador de aerosol líquido o nebulizador para administración de un polipéptido terapéutico. Dicho kit puede comprender información escrita sobre las indicaciones y el uso de la composición farmacéutica. Además, dicha información puede incluir una afirmación de que la composición de IL-22RA está contraindicada en pacientes con hipersensibilidad conocida a IL-22RA. [0292] Puede proporcionarse una composición farmacéutica que comprende anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, o asociados de unión (o fragmentos de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA, fusiones de anticuerpo, anticuerpos humanizados y similares) o receptor soluble IL-22RA en forma líquida, en un aerosol

o en forma sóldia. Las formas líquidas se ilustran por disoluciones inyectables, aerosoles, gotitas, disoluciones tópicas y suspensiones orales. Las formas sólidas ejemplares incluyen cápsulas, comprimidos y formas de liberación controlada. La última forma se ilustra por minibombas osmóticas e implantes (Bremer y col., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, “Implants in Drug Delivery”, en “Drug Delivery Systems”, Ranade and Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer y col., “Protein Delivery with Infusion Pumas”, en “Protein Delivery: Physical Systems”, Sanders and Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey y col., “Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant”, en “Protein Delivery: Physical Systems”, Sanders and Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)). Otras formas sólidas incluyen cremas, pastas, otras aplicaciones tópicas y similares. [0293] Los liposomas proporcionan un medio de suministrar polipéptidos terapéuticos a un sujeto por vía intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutánea o mediante administración oral, inhalación o administración intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que consisten en una o más bicapas lipídicas que rodean compartimientos acuosos (véanse, en general, Bakker-Woudenberg y col., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Supl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993) y Ranade, “Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers”, en “Drug Delivery Systems”, Ranade and Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Los liposomas son similares en composición a las membranas celulares y, como resultado, los liposomas pueden administrarse con seguridad y son biodegradables. Dependiendo del procedimiento de preparación, los liposomas pueden ser unilamelares o multilamelares, y los liposomas pueden variar en tamaño con diámetros en el intervalo de 0,02 µm a más de 10 µm. Puede encapsularse una variedad de agentes en liposomas: reparto de agentes hidrofóbicos en las bicapas y reparto de agentes hidrofílicos en el espacio o espacios acuosos internos (véase, por ejemplo, Machy y col., “Liposomes In Cell Biology And Pharmacology” (John Libbey 1987) y Ostro y col., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño de liposoma, el número de bicapas, la composición lipídica, así como la carga y características de superficie de los liposomas. [0294] Los liposomas pueden adsorberse sobre virtualmente cualquier tipo de célula y liberar entonces lentamente el agente encapsulado. Como alternativa, puede endocitarse un liposoma absorbido por células que son fagocíticas. La endocitosis es seguida por la degradación intralisosómica de los lípidos liposómicos y la liberación de los agentes encapsulados (Scherphof y col., Ann. N.Y. Acad Sci. 446:368 (1985)). Después de la administración intravenosa, se incorporan típicamente liposomas pequeños (de 0,1 a 1,0 µm) por células del sistema reticuloendotelial, localizadas principalmente en hígado y bazo, mientras que los liposomas mayores de 3,0 µm se depositan en el pulmón. Esta captación preferida de liposomas menores por las células del sistema reticuloendotelial se ha usado para suministrar agentes quimioterapéuticos a macrófagos y a tumores del hígado. [0295] El sistema reticuloendotelial puede evitarse mediante varios procedimientos, incluyendo saturación con grandes dosis de partículas liposómicas o inactivación selectiva de macrófagos por medios farmacológicos (Claassen y col., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Además, la incorporación de fosfolípidos derivatizados con glucolípidos o polietilenglicol a membranas liposómicas se ha mostrado que da como resultado una captación significativamente reducida por el sistema reticuloendotelial (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)). [0296] Los liposomas pueden prepararse también para orientar a células u órganos particulares variando la composición fosfolipídica o insertando receptores o ligandos en los liposomas. Por ejemplo, los liposomas preparados con un alto contenido de un tensioactivo no iónico se han usado para orientar a hígado (Hayakawa y col., patente japonesa 04-244.018; Kato y col., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). Estas formulaciones se prepararon mezclando fosfatidilcolina de soja, α-tocoferol y aceite de ricino hidrogenado etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla a vacío y reconstituyendo entonces la mezcla con agua. Se ha mostrado también que una formulación liposómica de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esterilglucósido derivado de soja (SG) y colesterol (Ch) orienta al hígado (Shimizu y col., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)). [0297] Como alternativa, pueden unirse diversos ligandos orientadores a la superficie del liposoma, tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, carbohidratos, vitaminas y proteínas de transporte. Por ejemplo, los liposomas pueden modificarse con derivados galactosil-lipídicos de tipo ramificado para orientar a receptores de asialoglucoproteína (galactosa), que se expresan exclusivamente en la superficie de células hepáticas (Kato y Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.

14:287 (1997); Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). De forma similar, Wu y col., Hepatology 27:772 (1998), han mostrado que marcar liposomas con asialofetuína conducía a una semivida plasmática acortada del liposoma y a una captación potenciada en gran medida de liposoma marcado con asialofetuína por los hepatocitos. Por otro lado, la acumulación hepática de liposomas que contienen derivados galactosil-lipídicos de tipo ramificado puede inhibirse mediante la preinyección de asialofetuína (Murahashi y col., Biol. Pharm. Bull. 20:259 (1997)). Los liposomas de albúmina sérica humana poliaconitilada proporcionan otro enfoque para orientar liposomas a células hepáticas (Kamps y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA

94: 11681 (1997)). Además, Geho y col. patente de EE.UU. nº 4.603.044, describen un sistema de suministro de vesícula liposómica dirigido a hepatocito que tiene especificidad por los receptores hepatobiliares asociados a las células metabólicas especializadas del hígado. [0298] En un enfoque más general para la orientación a tejido, se premarcan las células diana con anticuerpos biotinilados específicos de un ligando expresado por la célula diana (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). Después de la eliminación plasmática del anticuerpo libre, se administran liposomas conjugados con estreptavidina. En otro enfoque, se unen directamente los anticuerpos orientadores a liposomas (Harasym y col., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). [0299] Los anticuerpos neutralizantes anti-IL22RA y asociados de unión con actividad de unión a IL-22 o IL-20 o receptor soluble IL-22RA pueden encapsularse en liposomas usando técnicas estándar de microencapsulación de proteína (véanse, por ejemplo, Anderson y col., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson y col., Cancer Res. 50: 1853 (1990) y Cohen y col., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving y col. “Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies”, en “Liposome Technology”, 2ª edición, Vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef y col., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Como se advierte anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener una variedad de componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados lipídicos de polietilenglicol (Allen y col., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)). [0300] Las microesferas poliméricas degradables se han diseñado para mantener altos niveles sistémicos de proteínas terapéuticas. Las microesferas se preparan a partir de polímeros degradables tales como poli(lactida-co-glicolida) (PLG), polianhídridos, poli(ortoésteres) o polímeros de acetato de etilvinilo no biodegradables, en las que se atrapan las proteínas en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, “Role of Polymers in Drug Delivery”, en “Drug Delivery Systems”, Ranade and Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos y Maskiewicz, “Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery”, en “Protein Delivery: Physical Systems”, Sanders and Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus y col., Science 281:1161 (1998); Putney y Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Las nanoesferas recubiertas con polietilenglicol (PEG) pueden proporcionar también portadores para administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref y col., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)). [0301] La presente invención contempla también anticuerpos dirigidos contra IL22RA o asociados de unión modificados químicamente, por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra IL-22RA o receptor soluble IL-22RA, ligados con un polímero, como se discute anteriormente, como se define en las reivindicaciones. [0302] Pueden idearse otras formas de dosificación por los expertos en la materia, por ejemplo, por Ansel y Popovich, “Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems”. 5ª edición (Lea&Febiger 1990), Gennaro (ed.), “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 19ª edición (Mack Publishing Company 1995), y por Ranade y Hollinger, “Drug Delivery Systems” (CRC Press 1996). [0303] La presente invención contempla composiciones de anticuerpos anti-IL-22 y procedimientos y usos terapéuticos que comprenden un anticuerpo descrito en la presente memoria, como se define en las reivindicaciones. Dichas composiciones pueden comprender adicionalmente un portador. El portador puede ser un portador orgánico o inorgánico convencional. Los ejemplos de portadores incluyen agua, disolución tamponada, alcohol, propilenglicol, macrogol, aceite de sésamo, aceite de maíz y similares.

11. Producción de ratones transgénicos

[0304] Se ha mostrado la expresión en exceso de ambas IL-20 e IL-22 en lesiones psoriáticas humanas, sugiriendo que ambas IL-20 e IL-22 están implicadas en la psoriasis humana. Además, como se describe en la presente memoria, la expresión en exceso de IL-20 e IL-22 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunitarias, indicativos de un fenotipo psoriático; y además la inyección de IL-22 a ratones normales mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunitarias, indicativos de un fenotipo psoriático que se anuló por el antagonista de receptor soluble zcytor16 (IL-22RA2). Dichos datos in vivo sugieren adicionalmente que la IL-22 proinflamatoria está implicada en la psoriasis. Como tales, los antagonistas de la actividad de IL-22, tales como los anticuerpos neutralizantes y monoclonales anti-IL-22RA humano de la presente invención (como se define en la reivindicaciones), así como los receptores IL-22RA solubles, son útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas de IL-22 e IL-20 en el tratamiento de la psoriasis. Además, los agentes que se unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de IL22 o de ambas IL-20 e IL-22, tales como los anticuerpos neutralizantes y monoclonales anti-IL-22RA humano de la presente invención (como se define en las reivindicaciones), así como los receptores IL-22RA solubles, son útiles en el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias, por ejemplo, como antagonistas de IL-22 o de ambas IL-20 e IL-22 en el tratamiento de dermatitis atópica, EII, colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide y artritis psoriática, enfermedad respiratoria en el adulto (ERA), choque séptico, insuficiencia multiorgánica, lesión inflamatoria pulmonar tal como asma o bronquitis, neumonía bacteriana, psoriasis, eccema, dermatitis atópica y de contacto y enfermedad inflamatoria intestinal tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn y similares. [0305] En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento, como se define en las reivindicaciones, de producción de un anticuerpo de un polipéptido, en el que se selecciona el polipéptido inoculado del grupo constituido por: (a) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 desde el aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 47 (Asp); (b) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 desde el aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 62 (Cys); (c) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 desde el aminoácido número 84 (Ala) al aminoácido número 97 (Ser); (d) un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 desde el aminoácido número 93 (Thr) al aminoácido número 120 (Met); en el que el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido IL22RA (SEC DE ID. Nº 2 o SEC DE ID. Nº 3) y reduce la actividad de IL-22 (SEC DE ID. Nº 6). En una realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en el que el anticuerpo producido mediante el procedimiento reduce la actividad proinflamatoria de IL-22 (SEC DE ID. Nº 6). En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en el que el anticuerpo producido mediante el procedimiento neutraliza la interacción de IL-22 (SEC DE ID. Nº 6) con IL-22RA (SEC DE ID. Nº 2). En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en el que la neutralización por el anticuerpo se mide mostrando la neutralización de IL-22 (SEC DE ID. Nº 6) en un ensayo de neutralización basado en célula in vitro. En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en el que el anticuerpo producido mediante el procedimiento reduce la actividad proinflamatoria de ambas IL-20 (SEC DE ID. Nº 8) e IL-22 (SEC DE ID. Nº 6). En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en el que el anticuerpo producido mediante el procedimiento neutraliza la interacción de ambas IL-20 (SEC DE ID. Nº 8) e IL-22 (SEC DE ID. Nº 6) con IL-22RA (SEC DE ID. Nº 2). En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en el que la neutralización mediante el anticuerpo se mide mostrando la neutralización de ambas IL-20 (SEC DE ID. Nº 8) e IL-22 (SEC DE ID. Nº 6) en un ensayo de neutralización basado en célula in vitro. [0306] En otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo producido mediante el procedimiento dado a conocer en la presente memoria, que se une a un polipéptido de SEC DE ID. Nº 2 o SEC DE ID. Nº 3. En una realización, el anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo es (a) un anticuerpo policlonal, (b) un anticuerpo monoclonal de murino, (c) un anticuerpo humanizado derivado de (b), (d) un fragmento de anticuerpo, o (e) un anticuerpo monoclonal humano. En otra realización, el anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende adicionalmente un radionucleido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marcaje peptídico, partícula magnética o toxina. En otra realización, el anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende adicionalmente pegilación. En otra realización, el anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo es (a) un anticuerpo policlonal, (b) un anticuerpo monoclonal de murino, (c) un anticuerpo humanizado derivado de (b), (d) un fragmento de anticuerpo

o (e) un anticuerpo monoclonal humano. En otra realización, el anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende adicionalmente un radionucleico, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marcaje peptídico, partícula magnética, fármaco o toxina. En otra realización, el anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende adicionalmente pegilación. [0307] En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo que se une a un epítopo antigénico de un polipéptido que comprende una secuencia de restos de aminoácido como se muestra en la SEC DE ID. Nº 3 como se define en las reivindicaciones, y que reduce la actividad proinflamatoria de IL-22 (SEC DE ID. Nº 6). En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo reduce la actividad proinflamatoria de ambas IL-20 (SEC DE ID. Nº 8) e IL-22 (SEC DE ID. Nº 6). En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es (a) un anticuerpo monoclonal de murino, (b) un anticuerpo humanizado derivado de (a), (e) un fragmento de anticuerpo o (d) un anticuerpo monoclonal humano. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende adicionalmente un radionucleico, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marcaje peptídico, partícula magnética, fármaco o toxina. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende adicionalmente pegilación. [0308] En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento in vitro para reducir o inhibir la proliferación o diferenciación de células hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas inducida por IL-22, que comprende cultivar células de médula ósea o sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo como se define en las reivindicaciones suficiente para reducir la proliferación o diferenciación de las células hematopoyéticas en las células de médula ósea o sangre periférica en comparación con las células de médula ósea o sangre periférica cultivadas en ausencia de anticuerpo. En una realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en la que las células hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides. En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en la que las células linfoides son macrófagos o linfocitos T. [0309] En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso para reducir la inflamación inducida por IL-22 en un mamífero con inflamación de una cantidad de una composición de un anticuerpo según las reivindicaciones de la presente memoria suficiente para reducir la inflamación. [0310] En otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para reducir o inhibir la proliferación o diferenciación de células hematopoyéticas y células hematopoyéticas progenitoras inducidas por IL-22 e inducidas por IL-20, que comprende cultivar células de médula ósea o sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo como se da a conocer en la presente memoria suficiente para reducir la proliferación o diferenciación de las células hematopoyéticas en las células de médula ósea o sangre periférica en comparación con las células de médula ósea o sangre periférica cultivadas en ausencia del anticuerpo. En una realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en la que las células hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides. En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en la que las células linfoides son macrófagos o linfocitos T. [0311] En otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento de reducción de la inflamación inducida por IL-22 e inducida por IL-20 que comprende administrar a un animal con inflamación una cantidad de una composición de un anticuerpo como se da a conocer en la presente memoria suficiente para reducir la inflamación. [0312] En otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para reducir o inhibir la proliferación o diferenciación de células hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas inducidas por IL-22 e inducidas por IL-22, que comprende cultivar células de médula ósea o sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se da a conocer en la presente memoria suficiente para reducir la proliferación o diferenciación de las células hematopoyéticas en células de médula ósea o sangre periférica en comparación con células de médula ósea o sangre periférica cultivadas en ausencia de anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en la que las células hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides. En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en el que las células linfoides son macrófagos o linfocitos T. [0313] En otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento de reducción de la inflamación inducida por IL-22 e inducida por IL-20, que comprende administrar a un mamífero con inflamación una cantidad de una composición de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se da a conocer en la presente memoria suficiente para reducir la inflamación. [0314] En otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para reducir o inhiir la proliferación o diferenciación de células hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas inducidas por IL-22 e inducidas por IL-20, que comprende cultivar células de médula ósea o sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se da a conocer en la presente memoria suficiente para reducir la proliferación o diferenciación de células hematopoyéticas en células de médula ósea o sangre periférica en comparación con células de médula ósea o sangre periférica cultivadas en ausencia del anticuerpo. En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en la que las células hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides. En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en la que las células linfoides son macrófagos o linfocitos T. [0315] En otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento de reducción de la inflamación inducida por IL-22 e inducida por IL-20, que comprende administrar a un mamífero con inflamación una cantidad de una composición de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se da a conocer en la presente memoria suficiente para reducir la inflamación. [0316] En otro aspecto, la presente invención proporciona un uso para suprimir una respuesta inflamatoria en un mamífero con inflamación, en el que después de la administración de una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se define en las reivindicaciones en un vehículo farmacéuticamente aceptable, una falta de aumento o reducción del nivel de proteína A amiloide sérica es indicativa de supresión de una respuesta inflamatoria. [0317] En otro aspecto, la presente invención proporciona un uso, para tratar a un mamífero aquejado de una enfermedad inflamatoria en la que IL-22 desempeña un papel, de un antagonista de IL-22 tal que reduzca la inflamación, en el que el antagonista comprende (i) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se define en las reivindicaciones, y en el que se reduce la actividad inflamatoria de IL-22 (SEC DE ID. Nº 6). En una realización, el uso es como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica. En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica que comprende enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis, dermatitis atópica o psoriasis. En otra realización el uso es como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda. En otra realización, el uso es como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda que comprende endotoxemia, septicemia, síndrome de choque tóxico o enfermedad infecciosa. En otra realización, el uso es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o polipéptido de unión comprende adicionalmente un radionucleido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marcaje peptídico, partícula magnética, fármaco o toxina.

[0318] En otro aspecto, la presente memoria descriptiva describe un procedimiento para tratar un mamífero aquejado de una enfermedad inflamatoria en la que IL-22 e IL-20 desempeñan un papel, que comprende: administrar un antagonista de ambas IL-22 e IL-20 al mamífero tal que reduzca la inflamación, en el que el antagonista comprende (i) un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o polipéptido de unión que se une específicamente a un polipéptido o fragmento de polipéptido de IL22RA (SEC DE ID. Nº 3) o (ii) un polipéptido o fragmento de polipéptido de IL-22RA (SEC DE ID. Nº 3); y en el que se reduce la actividad inflamatoria de ambas IL-22 (SEC DE ID. Nº 6) e IL-20 (SEC DE ID. Nº 8). En una realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica. En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica que comprende enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis, dermatitis atópica o psoriasis. En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda. En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda que comprende endotoxemia, septicemia, síndrome de choque séptico o enfermedad infecciosa. En otra realización, el procedimiento es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o polipéptido de unión comprende adicionalmente un radionucleico, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marcaje peptídico, partícula magnética, fármaco o toxina. [0319] En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epítopo antigénico de IL-22RA humano (SEC DE ID. Nº 3) seleccionado del grupo constituido por: (a) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 desde el aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 47 (Asp); (Cys); (b) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 desde el aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 62 (Cys); (c) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 desde el aminoácido número 84 (Ala) al aminoácido número 97 (Ser); (d) un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 desde el aminoácido número 93 (Thr) al aminoácido número 120 (Met); en el que el anticuerpo reduce o neutraliza la actividad de ambas IL-22 (SEC DE ID. Nº 6) e IL-20 (SEC DE ID. Nº 8) humanas. En otra realización, el anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo se selecciona del grupo constituido por: (a) un anticuerpo monoclonal de murino, (b) un anticuerpo humanizado derivado de (a), (c) un fragmento de anticuerpo y (d) un anticuerpo monoclonal humano. En otra realización, el anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende adicionalmente pegilación. En otra realización, el anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo se selecciona del grupo constituido por:

(a) un anticuerpo monoclonal de murino, (b) un anticuerpo humanizado derivado de (a), (c) un fragmento de anticuerpo y (d) un anticuerpo monoclonal humano. En otra realización, el anticuerpo es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo comprende adicionalmente pegilación. [0320] En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso para tratar una afección patológica en un sujeto asociada a la actividad de IL-22RA del anticuerpo como se define en las reivindicaciones, tratando así dicha afección patológica. En una realización, el uso es como se describe anteriormente, en la que dicha afección patológica es una afección inflamatoria crónica. En otra realización, el uso es como se describe anteriormente, en la que dicha afección inflamatoria crónica comprende enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis, dermatitis atópica o psoriasis. En otra realización, el uso es como se describe anteriormente, en la que dicha afección patológica es una afección inflamatoria aguda. En otra realización, el uso es como se describe anteriormente, en la que dicha afección inflamatoria aguda comprende endotoxemia, septicemia, síndrome de choque tóxico o enfermedad infecciosa. [0321] En otro aspecto, la presente invención proporciona un uso, para tratar un mamífero aquejado de una enfermedad inflamatoria en la que IL-22RA desempeña un papel, de un antagonista de Il-22RA tal que reduzca la inflamación, en el que el antagonista comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se define en las reivindicaciones, en el que se reduce la actividad inflamatoria. En una realización, el uso es como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica que comprende enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis, dermatitis atópica o psoriasis. En otra realización, el uso es como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda. En otra realización, el uso es como se describe anteriormente, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda que comprende endotoxemia, septicemia, síndrome de choque tóxico o enfermedad infecciosa. En otra realización, el uso es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o polipéptido de unión comprende adicionalmente un radionucleido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marcaje peptídico, partícula magnética, fármaco o toxina. En otra realización, el uso es como se describe anteriormente, en la que el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o polipéptido de unión comprende adicionalmente pegilación. [0322] En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo como se define en las reivindicaciones para la fabricación de un medicamento para reducir la inflamación en un mamífero. [0323] La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes. Ejemplo 1 Purificación de polipéptido IL-22RA2-Fc4 a partir de células BHK 570 transfectadas [0324] A menos que se advierta otra cosa, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. Se usó el siguiente procedimiento para purificar el polipéptido IL-22RA2 (polipéptido receptor soluble maduro de los residuos 23 a 231 de la SEC DE ID. Nº 13; polinucleótidos como se muestra en la SEC DE ID. Nº 12) que contiene una fusión C-terminal con Fc4 humano (SEC DE ID. Nº 14), designado IL-22RA2-Fc4. Se filtraron aproximadamente 16.500 ml de medio acondicionado de células BHK 570 transfectadas con IL-22RA2-Fc4 a través de un filtro esterilizador de 0,2 µm y se suplementó entonces con una disolución de inhibidores de proteasa, a concentraciones finales de leupeptina 0,001 mM (Boerhinger-Mannheim, Indianápolis, IN), pepstatina 0,001 mM (Boerhinger-Mannheim) y Pefabloc 0,4 mM (Boerhinger-Mannheim). Se empaquetó una columna A50 de proteína Poros (20 ml de volumen de lecho, Applied Biosystems) y se lavó con 400 ml de PBS (Gibco/BRL). Se pasó el medio acondicionado suplementado por la columna a un caudal de 15 ml/minuto, seguido de lavado con 800 ml de PBS (BRL-Gibco). Se eluyó IL-22RA2-Fc4 de la columna con glicina 0,1 M, pH 3,0, y se recogieron directamente fracciones de 5 ml en 0,5 ml de Tris 2 M, pH 7,8, ajustando el pH final a 7,4 en las fracciones. [0325] Se caracterizó el rendimiento de la columna mediante transferencia Western de geles PAGE-SDS reductores del medio de partida y la pasada por la columna. La transferencia Western usó anticuerpo anti-IgG-HRP humana (Amersham), que mostró una proteína inmunoreactiva a 60.000 Da en el medio de partida, y nada en la pasada, sugiriendo una captura completa. Se caracterizaron las fracciones eluidas de proteína A50 mediante gel PAGE-SDS reductor. Este gel mostró una banda teñida intensamente con Coomasie a 60.000 Da en las fracciones 3 a 11. Se agruparon las fracciones 3 a 11.

[0326] Se concentró el agrupamiento de elución de proteína A50 de 44 ml a 4 ml usando un concentrador centrífugo Ultrafree Biomax de 30.000 Da (15 ml de volumen, Millipore). Se lavó una columna de filtración en gel Sephacryl S-300 (175 ml de volumen de lecho; Pharmacia) con 350 ml de PBS (BRL/Gibco). Se inyectó el agrupamiento concentrado en la columna con un caudal de 1,5 ml/min, seguido de lavado con 225 ml de PBS (BRL/Gibco). Se recogieron los picos eluidos en fracciones de 2 ml. [0327] Se caracterizaron las fracciones eluidas mediante geles PAGE-SDS reductores y no reductores teñidos con plata (Geno Technology). Los geles PAGESDS reductores teñidos con plata mostraron una banda teñida intensamente a 60.000 Da en las fracciones 14-31, mientras que los geles PAGE-SDS no reductores teñidos con plata mostraron una banda teñida intensamente a 160.000 Da en las fracciones 14

31. Las fracciones 1-13 mostraron muchas bandas de diversos tamaños. Se agruparon las fracciones 14-31 y se concentraron a 22 ml usando un concentrador centrífugo Ultrafree Biomax de 30.000 Da (15 ml de volumen, Millipore). Se filtró este concentrado a través de un filtro esterilizador Acrodisc de 0,2 µm (Pall Corporation). [0328] Se efectuó la concentración de proteína de las fracciones agrupadas concentradas mediante análisis BCA (Pierce, Rockford, IL), se tomaron alícuotas del material y se almacenaron a -80ºC según los procedimientos estándar. La concentración de las fracciones agrupadas era de 1,50 mg/ml. Ejemplo 2 Construcción de células BaF3 que expresan el receptor CRF2-4 (células BaF3/CRF24) y de células BaF3 que expresan el receptor CRF2-4 con células BaF3/CRF2-4/IL22RA del receptor IL-22RA) [0329] Se construyeron células BaF3 que expresan el receptor CFR2-4 completo usando 30 µg de un vector de expresión de CFR2-4 descrito a continuación. Se designaron las células BaF3 que expresan el receptor CFR2-4 como BaF3/CFR2-4. Se usaron estas células como control, se transfectaron adicionalmente con receptor IL22RA completo (patente de EE.UU. nº 5.965.704) y se usaron para construir una criba de actividad de IL-22 como se describe a continuación.

A. Construcción de células BaF3 que expresan el receptor CRF2-4 [0330] Se aisló la secuencia de ADNc completa de CRF2-4 (nº de acceso a Genbank Z17227) a partir de una colección de ADNc de la línea celular Daudi, y se clonó entonces en un vector de expresión pZP7P. [0331] Se mantuvo BaF3, una línea celular prelinfoide dependiente de interleucina 3 (IL-3) derivada de médula ósea de murino (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot y col., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), en medio completo (medio RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) suplementado con 10% de suero fetal de ternero termoinactivado, IL-3 de murino (mIL-3) 2 ng/ml (R & D, Minneapolis, MN), L-glutaMax-1™ Gibco BRL 2 mM, piruvato de sodio 1 mM (Gibco BRL) y antibiótico PSN (GIBCO BRL)). Antes de la electroporación, se preparó CRF2-4/pZP7P y se purificó usando un kit Qiagen Maxi Prep kit (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Para la electroporación, se lavaron células BaF3 una vez con medio RPMI exento de suero y se resuspendieron entonces en medio RPMI exento de suero a una densidad celular de 107 células/ml. Se mezcló 1 ml de células BaF3 resuspendidas con 30 µg de ADN del plásmido CRF2-4/pZP7P y se transfirió a cámaras de electroporación desechables separadas (GIBCO BRL). Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, se administraron a las células dos choques en serie (800 µF/300 V; 1180 µF/300 V) suministrados por un aparato de electroporación (CELL-PORATOR™; GIBCO BRL). Después de 5 minutos de tiempo de recuperación, se transfirieron las células electroporadas a 50 ml de medio completo y se dispusieron en un incubador durante 15-24 horas (37ºC, 5% de CO2). Se centrifugaron entonces las células y se resuspendieron en 50 ml de medio completo que contenía puromicina 2 µg/ml en un matraz T-162 para aislar el agrupamiento resistente a puromicina. Se ensayó en los agrupamientos de células BaF3 transfectadas, denominadas de aquí en delante células BaF3/CRF2-4, la capacidad de señalización como se describe a continuación. Además, se transfectaron estas células adicionalmente con receptor IL-22RA como se describe a continuación.

B. Construcción de células BaF3 que expresan receptores CRF2-4 e IL-22RA [0332] Se construyeron células BaF3/CRF2-4 que expresan el receptor IL-22RA completo como anteriormente, usando 30 µg de un vector de expresión de IL-22RA. Después de la recuperación, se seleccionaron los transfectantes usando zeocina 200 µg/ml y puromicina 2 µg/ml. Se designaron las células BaF3/CRF2-4 que expresan el receptor IL-22RA como células BaF3/CRF2-4/IL-22RA. Se usaron estas células para cribar la actividad de IL-22 así como la actividad antagonista de IL-22RA2 descrita en la presente memoria. Ejemplo 3

A. Cribado de actividad antagonista de IL-22 usando células BaF3/CRF2-4/IL-22RA usando un ensayo de proliferación con azul de Alamar [0333] Se usó IL-22-CEE purificado (ejemplo 4) para ensayar la presencia de actividad proliferativa como se describe a continuación. Se usó IL-22RA2-Fc4 purificado (ejemplo 1) para antagonizar la respuesta proliferativa de IL-22 en este ensayo como se describe a continuación. [0334] Se centrifugaron células BaF3/CRF2-4/IL-22RA y se lavaron en medio completo (medio RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) suplementado con 10% de suero fetal de ternero termoinactivado, BL-3 de murino (mIL-3) 2 ng/ml (R & D, Minneapolis, MN), L-glutaMax-1™ (Gibco BRL) 2 mM, piruvato de sodio 1 mM (Gibco BRL) y antibiótico PSN (GIBCO BRL)), pero sin mIL-3 (designado de aquí en adelante como “medio exento de mIL-3”). Se centrifugaron las células y se lavaron 3 veces para asegurar la retirada de mIL-3. Se contaron entonces las células en un hematocitómetro. Se sembraron las células en un formato de 96 pocillos a 5.000 células por pocillo en un volumen de 100 µl por pocillo usando el medio exento de mIL-3. [0335] Se valoró la proliferación de células BaF3/CRF2-4/IL-22RA usando la proteína IL-22-CEE diluida con medio exento de mIL-3 a concentraciones de 50, 10, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 ng/ml. Se añadieron 100 µl de la proteína diluida a las células BaF3/CRF2-4/IL-22RA. El volumen de ensayo total es de 200 µl. Se incubaron las placas de ensayo a 37ºC, 5% de CO2 durante 3 días, en cuyo momento se añadió azul de Alamar (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pocillo. Se incubaron de nuevo las placas a 37ºC, 5% de CO2 durante 24 horas. El azul de Alamar da una lectura fluorimétrica basada en el número de células vivas, y por tanto es una medida directa de la proliferación celular en comparación con un control negativo. Se incubaron de nuevo las placas a 37ºC, 5% de CO2 durante 24 horas. Se leyeron las placas en el lector de placas Fmax™ (Molecular Devices Sunnyvale, CA) usando el programa SoftMax™ Pro, a longitudes de onda de 544 (excitación) y 590 (emisión). Los resultados confirmaron la respuesta proliferativa dependiente de la dosis de las células BaF3/CRF2-4/IL-22RA ante IL-22-CEE. La respuesta, según se mide, era aproximadamente 15 veces superior al fondo en el extremo superior de 50 ng/ml hasta 2 veces de inducción en el extremo inferior de 0,06 ng/ml. Las células BaF3 de tipo silvestre y las células BaF3/CRF2-4 no proliferaban en respuesta a IL-22-CEE, mostrando que IL-22 es específica del receptor heterodimérico CRF2-4/IL-22RA. [0336] Para determinar si el IL-22RA2 es capaz de antagonizar la actividad de IL22, se repitió el ensayo descrito anteriormente usando IL-22RA2/Fc4 soluble purificado. Cuando se combinó IL-22 con IL-22RA2 a 10 µg/ml, se llevó hasta el fondo la respuesta a IL-22 a todas las concentraciones. Que la presencia de IL-22RA2 soluble anulara los efectos proliferativos de IL-22 demuestra que es un potente antagonista del ligando IL-22. Este ensayo puede usarse para ensayar otros antagonistas de la actividad de IL-22 descritos en la presente memoria, tales como anticuerpos dirigidos contra IL-22RA. Ejemplo 4 Purificación de IL-22-CEE a partir de células BHK 570 [0337] A menos que se advierta otra cosa, se llevaron a cabo todas las operaciones a 4ºC. Se usó el siguiente procedimiento para purificar polipéptido IL-22 que contiene el marcaje GluGlu C-terminal (EE) (SEC DE ID. Nº 15 o SEC DE ID. Nº 16). Se concentró medio acondicionado de células BHK que expresan IL-22-CEE con el cartucho espiral Amicon S10Y3 en ProFlux A30. Se añadió una disolución de inhibidor de proteasa al medio acondicionado concentrado a concentraciones finales de ácido etilendiaminotetraacético 2,5 mM (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), leupeptina 0,003 mM (Boehringer-Mannheim, Indianápolis, IN), pepstatina 0,001 mM (Boehringer-Mannheim) y Pefabloc 0,4 mM (Boehringer-Mannheim). Se retiraron muestras para análisis y se congeló el volumen bruto a -80ºC hasta que se inició la purificación. Se determinaron las concentraciones de proteína diana total del medio acondicionado concentrado mediante PAGE-SDS y análisis de transferencia Western con el anticuerpo conjugado anti-EE HRP. [0338] Se vertió una columna de aproximadamente 100 ml de G-Sepharose anti-EE (preparada como se describe a continuación) en una columna de vidrio Waters AP5 de 5 cm x 10 cm. Se empaquetó por flujo la columna y se equilibró en un BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4. Se descongeló el medio acondicionado concentrado, se filtró estéril por 0,2 µm, se ajustó el pH a 7,4 y se cargó entonces en la columna durante una noche con aproximadamente 1 ml/min de caudal. Se lavó la columna con 10 volúmenes de columna (VC) de disolución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y se eluyó entonces a flujo pistón con 200 ml de PBS (pH 6,0) que contenía péptido EE 0,5 mg/ml (Anaspec, San José, CA) a 5 ml/minuto. El péptido EE usado tiene la secuencia EYMPME (SEC DE ID. Nº 15). Se lavó la columna con 10 VC de PBS, y se eluyó entonces con 5 VC de glicina 0,2 M, pH 3,0. Se ajustó el pH de la columna eluida con glicina a 7,0 con 2 VC de 5x PBS y se equilibró entonces con PBS (pH 7,4). Se recogieron fracciones de 5 ml de toda la cromatografía de elución y se controló la absorbancia a 280 y 215 nm; se guardaron también los agrupamientos de pasada y lavado y se analizaron. Se analizó en las fracciones de pico de elución del polipéptido EE la proteína diana mediante tinción con plata de PAGE-SDS y transferencia Western con el anticuerpo anti-EE conjugado con HRP. Se agruparon las fracciones de elución polipeptídicas de interés y se concentraron de 60 ml a 5,0 ml usando un concentrador centrífugo de membrana de 10.000 Da de corte de peso molecular (Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante. [0339] Para separar la IL-22-CEE de otras proteínas copurificadas, se sometieron las fracciones agrupadas por elución de polipéptido concentrado a POROS HQ-50 (resina de intercambio aniónico fuerte de PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) a pH 8,0. Se vertió una columna de 1,0 x 6,0 cm y se empaquetó por flujo en un BioCad Sprint. Se cargó de contraiones la columna y se equilibró entonces con TRIS 20 mM pH 8,0 (tris(hidroximetilaminometano)). Se diluyó la muestra 1:13 (para reducir la fuerza iónica del PBS) y se cargó entonces en la columna Poros HQ a 5 ml/minuto. Se lavó la columna con 10 VC de Tris 20 mM, pH 8,0 y se eluyó entonces con un gradiente de 40 VC de Tris 20 mM/cloruro de sodio 1 M (NaCl) a 10 ml/minuto. Se recogieron fracciones de 1,5 ml de toda la cromatografía y se controló la absorbancia a 280 y 215 nm. Se analizaron las fracciones de pico de elución mediante tinción con plata de PAGE-SDS. Se agruparon las fracciones de interés y se concentraron a 1,5-2 ml usando un concentrador centrífugo de membrana de 10.000 Da de corte de peso molecular (Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante. [0340] Para separar el polipéptido IL-22-CEE del péptido EE libre y de cualquier proteína copurificada contaminante, se sometieron las fracciones concentradas agrupadas a cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Sephadex S200 de 1,5 x 90 cm (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada y cargada con PBS a un caudal de 1,0 ml/min usando un BioCad Sprint. Se recogieron fracciones de 1,5 ml durante toda la cromatografía y se controló la absorbancia a 280 y 215 nm. Se caracterizaron las fracciones pico mediante tinción con plata de PAGE-SDS y se agruparon sólo las fracciones más puras. Este material representaba polipéptido IL-22-CEE purificado. [0341] Se sometió finalmente este material purificado a una columna ActiClean Etox (Sterogene) de 4 ml para retirar cualquier endotoxina restante. Se pasó la muestra por la columna equilibrada con PBS 4 veces y se lavó entonces la columna de gravedad con un solo volumen de 3 ml de PBS, que se agrupó con la muestra “limpia”. Se filtró estéril entonces el material a 0,2 µm y se almacenó a -80ºC hasta que se tomaron alícuotas. [0342] En geles PAGE-SDS con transferencia Western, teñidos con azul de Coomasie y plata, el polipéptido IL-22-CEE era una banda principal. Se efectuó la medida de la concentración de proteína del material purificado mediante análisis BCA (Pierce, Rockford, IL), se tomaron alícuotas de la proteína y se almacenaron a -80ºC según procedimientos estándar. [0343] Para preparar Sepharose anti-EE, se lavó 3 veces un volumen de lecho de 100 ml de Sepharose-proteína G (Pharmacia, Piscataway, NJ) con 100 ml de PBS que contenía azida de sodio al 0,02% usando una unidad de filtración a 0,45 µm Nalgene de 500 ml. Se lavó el gel con 6,0 volúmenes de trietanolamina 200 mM, pH 8,2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO), y se añadió un volumen igual de disolución de anticuerpo EE que contenía 900 mg de anticuerpo. Después de una incubación durante una noche a 4ºC, se retiró el anticuerpo no unido lavando la resina con 5 volúmenes de TEA 200 mM como se describe anteriormente. Se resuspendió la resina en 2 volúmenes de TEA, se transfirió a un envase adecuado y se añadió dimetilpimilimidato-2 HCl (Pierce, Rockford, IL) disuelto en TEA a una concentración final de 36 mg/ml de gel de Sepharose-proteína G. Se agitó el gel a temperatura ambiente durante 45 min y se retiró el líquido usando la unidad de filtración descrita anteriormente. Se bloquearon entonces los sitios no específicos del gel incubando durante 10 min a temperatura ambiente con 5 volúmenes de etanolamina 20 mM en TEA 200 mM. Se lavó entonces el gel con 5 volúmenes de PBS que contenían azida de sodio al 0,02% y se almacenó en esta disolución a 4ºC. Ejemplo 5 Efectos in vivo del polipéptido IL-22 [0344] Se dividieron ratones (hembra, C57BL/6N, 8 semanas de edad; Charles River Labs, Kingston, NY) en tres grupos. Se preparó previamente un adenovirus que expresa un polipéptido IL-22 (SEC DE ID. Nº 6) usando procedimientos estándar. El día 0, se administró adenovirus original o con IL-22 al primer (n= 8) y segundo (n= 8) grupos, respectivamente, por la vena de la cola, recibiendo cada ratón una dosis de 1 x 1011 partículas en ~0,1 ml de volumen. El tercer grupo (n= 8) no recibió tratamiento. El día 12, se pesaron los ratones y se extrajo sangre de los ratones. Se analizaron en las muestras el hemograma completo (CBC) y la química sérica. Se detectaron elevaciones estadísticamente significativas de los recuentos de neutrófilos y plaquetas en las muestras de sangre del grupo administrado con adenovirus con IL-22 respecto al grupo tratado con adenovirus original. Se redujeron significativamente también los recuentos de linfocitos y eritrocitos del grupo administrado con adenovirus con IL-22 respecto al grupo tratado con adenovirus original. Además, los ratones tratados con adenovirus con IL-22 perdieron peso corporal, mientras que los ratones tratados con adenovirus original ganaron peso. Aumentó también el nivel sérico de IL-22 y se redujo el nivel de glucosa el día 3. En resumen, los ratones con adenovirus con IL-22 exhibieron una respuesta de fase aguda que puede iniciarse también por otras citocinas proinflamatorias tales como T citocinas NF-α, IL-1β y gp130. La respuesta de fase aguda es el conjunto de respuestas inflamatorias inmediatas iniciado por moléculas de reconocimiento de patrón. Las proteínas de fase aguda proporcionan una protección potenciada frente a microorganismos y modifican las respuestas inflamatorias por los efectos sobre el tráfico celular y la liberación de mediador. Por ejemplo, SAA tiene una potente función activadora de leucocitos que incluye la inducción de quimiotactismo, la potenciación de la adhesión de leucocitos a células endoteliales y una fagocitosis aumentada. La comprensión de los factores que inician y alteran la magnitud y duración de la respuesta de fase aguda representa una etapa importante en el desarrollo de nuevas terapias para enfermedades infecciosas e inflamatorias. [0345] Los resultados sugerían que la IL-22 afecta a la hematopoyesis, concretamente, la formación de células sanguíneas in vivo. Como tal, la IL-22 podría tener actividades biológicas que afectasen a diferentes células madre sanguíneas, dando como resultado así el aumento o reducción de los niveles de ciertas células sanguíneas diferenciadas en un linaje específico. Por ejemplo, la IL-22 parece reducir los linfocitos, lo que es debido probablemente a la inhibición de las células progenitoras responsables que dan lugar a células linfoides. La IL-22 reduce también los eritrocitos, apoyando la noción de que la IL-22 podría desempeñan un papel en anemia, infección, inflamación y/o respuestas inmunitarias al influir en las células sanguíneas implicadas en estos procesos. Podrían usarse antagonistas de IL-22, tales como anticuerpos o su receptor soluble IL-22RA2, como reactivos terapéuticos en estas enfermedades. [0346] Además, estos experimentos que usan adenovirus con IL-22 en ratones sugieren que la expresión en exceso de IL-22 aumenta el nivel de neutrófilos y plaquetas in vivo. Es concebible que haya otros factores (tales como citocinas y genes modificadores) implicados en las respuestas a IL-22 en todo el sistema animal. No obstante, estos datos apoyan fuertemente la implicación de IL-22 en la hematopoyesis. Por tanto, la IL-22 y sus receptores son reactivos/dianas adecuados para el diagnóstico y tratamiento de una variedad de trastornos tales como inflamación, trastornos inmunitarios, infección, anemia, cáncer hematopoyético y otros, y similares. Ejemplo 6 Ratones transgénicos que expresan IL-22 A. Generación de ratones transgénicos que expresan IL-22 de ratón [0347] Se prepararon fragmentos de ADN a partir de un vector transgénico que contiene las secuencias 5’ y 3’ flanqueantes del promotor específico linfoide EµCLCK, IL-22 de ratón (SEC DE ID. Nº 10; polipéptido mostrado en la SEC DE ID. Nº 11), el intrón II de insulina de rata, ADNc de IL-22 y la secuencia de poliA de hormona de crecimiento humano usando procedimientos estándar, y se usaron para microinyección en ovocitos de murino B6C3f1 (Taconic, Germantown, NY) fertilizados, usando un protocolo de microinyección estándar. Véase Hogan, B. y col., “Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994. [0348] Se identificaron 25 ratones transgénicos de IL-22 de ratón con el promotor específico linfoide EµLCK entre 154 crías. 11 de las crías transgénicas murieron a las horas del nacimiento, 9 crías transgénicas con apariencia brillante se sometieron a necropsia el día de nacimiento y 2 crecieron hasta adultos. Los niveles de expresión eran bajos en un animal adulto. Se prepararon los tejidos de las crías necropsiadas y se examinaron histológicamente como se describe a continuación. [0349] La apariencia brillante de las crías neonatas parecía estar asociada a una rigidez de la piel, como si se estuvieran secando, dando como resultado una reducción de la lactancia apropiada. Sus movimientos se volvieron rígidos en general.

B. Análisis genotípico y de expresión de ratones transgénicos [0350] A partir de la línea transgénica de ratón con IL-22 controlada por el promotor EµLck descrita anteriormente, se observaron anormalidades en las crías recién nacidas el día 1 (día de nacimiento) y se sacrificaron para recogida de tejidos. Se dio a todas las crías un único número de crotal, y se advirtieron aquellas designadas por tener un fenotipo cutáneo brillante en el momento del sacrificio. De las 12 crías, se observó que 6 tenían el fenotipo cutáneo brillante, con dos designadas como fenotipos “graves”. Se definieron los fenotipos graves como crías pequeñas con poca movilidad cuya piel era especialmente brillante y muy seca. Se recogió la piel del lado izquierdo de cada cría y se congeló el medio de embebición Tissue-Tek. [0351] El genotipado confirmó que la piel brillante era un buen indicador del estado transgénico, aunque no se recogieron datos de expresión. Se seccionaron bloques de piel congelados de 7 µm en un criostato y se tiñeron para buscar la presencia de CD3, CD4, CD8, macrófagos de ratón, linfocitos B, CD80 y MHC de clase II. El protocolo de tinción implicaba la unión de anticuerpos comercialmente disponibles al tejido, la detección con un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa y la reacción cromogénica DAB para visualizar la tinción.

[0352] Se encontró que los animales transgénicos tenían altos los MHC de clase II y CD80, que se tiñen por células presentadoras de antígeno y células dendríticas, respectivamente. El marcador de macrófago detectó también más células en los transgénicos graves y no graves que en los animales de tipo silvestre, aunque la distribución de estas células estaba muy localizada en la dermis superior. Los animales clasificados como de fenotipos graves tenían la tinción más robusta, mostrando los tres de estos marcadores un aumento drástico de la intensidad y número de células en comparación con el tipo silvestre. Esta variabilidad puede ser debida a una diferencia en el nivel de expresión de IL-22 en estas crias progenitoras transgénicas. Las células positivas de MHC de clase II se localizaban en la dermis superior dispuestas en agrupaciones abiertas sueltas, mientras que las células positivas de CD80 estaban predominantemente por debajo de la dermis en o justo por encima de la capa de músculo/grasa. Estas dos poblaciones no parecen superponerse. Todos los demás marcadores eran de tinción equivalente de todos los animales. La tinción con azul de toluidina para mastocitos reveló diferencias de ligeras a nulas entre los animales de tipo silvestre y transgénicos.

C. Evaluación microscópica de tejidos de ratones transgénicos: El IL-22 TG con promotor EµLck tiene una histología neonatal letal [0353] El día de nacimiento, se sacrificaron humanitariamente las crías de camadas que contienen transgénicos de IL-22 y se fijó el cuerpo entero por inmersión en formalina tamponada al 10%. Se sometieron a procesamiento adicional 6 crías transgénicas y 2 no transgénicas. Se advirtió que 4 de los 6 transgénicos tenían piel brillante en el momento del sacrificio. Se cortaron los tejidos fijados en 5 secciones (sección longitudinal de la cabeza y secciones transversales del tórax superior e inferior y del abdomen superior e inferior). Se embebieron los tejidos en parafina, se procesaron rutinariamente y se seccionaron a 5 µm (microtomo Jung 2065 Supercut, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y se tiñeron con H&E. Se evaluaron los tejidos teñidos bajo microscopio óptico (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY) por un patólogo veterinario con certificado de especialidad (ACVP). [0354] Por examen microscópico, se observó que la epidermis de dos de las crías transgénicas era más gruesa que la epidermis los otros seis ratones incluyendo los controles. No se advirtieron otras anormalidades en la piel y otros tejidos de ninguno de los ratones. Se tomaron imágenes de áreas representativas de la piel de regiones correspondientes al tórax y abdomen con la lente de objetivo de 40x y con una cámara digital CoolSnap (Roper Scientific, Inc., San Diego, CA) que se unió al microscopio.

Se determinó entonces el grosor de la epidermis usando software de histomorfometría (Scion Image para Windows (NIH Image), Scion Corp., Frederick, MD, v. B4.0.2). Los resultados mostrados en la Tabla 5 fueron los siguientes:

5

Tabla 5

Genotipo/fenotipo

Grosor medio de la piel torácica (µm) Grosor medio abdominal (µm) de la piel

No transgénico/ normal

5,2 5,4

Transgénico/ no brillante

5,0 6,7

Transgénico/ brillante

8,2 7,4

Transgénico/ todos

7,1 7,1

[0355] Había un número insuficiente de ratones para determinar la significación estadística, sin embargo, los transgénicos, especialmente aquellos con piel brillante, tendían a tener una epidermis más gruesa que los transgénicos no brillantes y los

5 controles no transgénicos. Los transgénicos brillantes pueden tener un mayor nivel de expresión de IL-22 que los transgénicos no brillantes, sin embargo, no se determinaron los niveles de expresión para estos ratones. Esto sugería un papel para IL-22 en psoriasis, artritis psoriática u otras afecciones inflamatorias cutáneas u otras enfermedades inflamatorias.

10 Ejemplo 7 Efectos in vivo del polipéptido IL-22

A. Los ratones infectados con adenovirus con IL-22 muestras inducción de SAA [0356] Se dividieron ratones (hembra, CS7BL/6N, de 8 semanas de edad; Charles River Labs, Kingston, NY) en tres grupos. Se preparó previamente un adenovirus que

15 expresa un polipéptido IL-22 (SEC DE ID. Nº 6) usando procedimientos estándar. El día 0, se administró adenovirus original o con IL-22 al primer (n= 8) y segundo (n= 8) grupos, respectivamente, por la vena de la cola, recibiendo cada ratón una dosis de ~1 x 1011 partículas en ~0,1 ml de volumen. El tercer grupo (n= 8) no recibió tratamiento. El día 12, se pesaron los ratones y se extrajo sangre de los ratones. El día 20 del

20 estudio, se sacrificaron los ratones, se registró el peso corporal y se recogieron sangre y tejidos para análisis. [0357] Se analizó en todas las muestras de sangre el hemograma completo (CBC) y la química sérica. Tanto el día 12 como el 20, se detectaron elevaciones estadísticamente significativas de los recuentos de neutrófilos y plaquetas en las

25 muestras de sangre del grupo administrado con adenovirus con IL-22 respecto al grupo tratado con adenovirus original. Los recuentos de linfocitos se redujeron significativamente también en el grupo administrado con adenovirus con IL-22 respecto al grupo tratado con adenovirus original el día 12, pero el día 20 se observó el efecto opuesto. Además, los ratones tratados con adenovirus con IL-22 perdieron peso corporal, mientras que los ratones tratados con adenovirus original ganaron peso. El nivel de glucosa se redujo significativamente en ambos puntos temporales en las muestras séricas del grupo administrado con adenovirus con IL-22 respecto al grupo tratado con adenovirus original. El nivel de seroalbúmina se redujo también significamente en ambos puntos temporales. Se redujeron significativamente los niveles de nitrógeno de urea en sangre el día 20. Aumentaron significativamente los niveles de globulina sérica en el grupo administrado con adenovirus con IL-22 respecto al grupo tratado con adenovirus original en ambos puntos temporales. Microscópicamente, un cambio histomorfológico observado atribuido a IL-22 era la regeneración tubular del riñón. Aunque no es infrecuente en ratones, había una incidencia y gravedad aumentada en este grupo de animales. La nefropatía se caracteriza por zonas multifocales de basofilia de células epiteliales tubulares corticales. [0358] Se llevó a cabo un experimento adicional, idéntico en diseño al descrito anteriormente, para verificar los resultados y recoger muestras adicionales. En este estudio, se registró el peso corporal cada tres días, se recogió sangre de los ratones 3 días después de la inyección de adenovirus y se sacrificaron los ratones para recogida de sangre y tejido el día 10 (n= 4 por grupo) y el día 20 (n= 4 por grupo). Se detectaron de nuevo recuentos de neutrófilos y plaquetas elevados en muestras de sangre del grupo administrado con adenovirus con IL-22 respecto al grupo tratado con adenovirus original. Este efecto era evidente para los neutrófilos el día 3, pero el recuento de plaquetas no fue significativamente diferente hasta el día 10. Se redujeron significativamente también los recuentos de linfocitos del grupo administrado con adenovirus con IL-22 respecto al grupo tratado con adenovirus original los días 3 y 10, pero no estaban elevados el día 20 como en el estudio previo. De nuevo, los ratones administrados con adenovirus con IL-22 perdieron peso durante el transcurso del estudio, mientras que los ratones tratados con virus de control y no tratados ganaron peso. Los parámetros de la química sérica eran consistentes con el estudio previo. Los hallazgos histológicos de regeneración tubular del riñón asociados al tratamiento con adenovirus con IL-22 se confirmaron también en este estudio. Esto era consistente con el hallazgo adicional de una proteinuria moderada en ratones administrados con adenovirus con IL-22 (día 20). [0359] Los resultados sugerían que la IL-22 afecta a la hematopoyesis, concretamente la formación de células sanguíneas in vivo. Como tal, la IL-22 podría tener actividades biológicas que afectasen a diferentes células madre sanguíneas, dando por tanto como resultado un aumento o reducción de los niveles de ciertas células sanguíneas diferenciadas en un linaje específico. Por ejemplo, la IL-22 parece reducir el nivel de linfocitos, lo que es debido probablemente a la inhibición de las células progenitoras responsables que dan lugar a células linfoides, apoyando la noción de que la IL-22 podría desempeñar un papel en anemia, infección, inflamación y/o enfermedades inmunitarias influyendo en las células sanguíneas implicadas en estos procesos. Podrían usarse antagonistas de IL-22, tales como anticuerpos o su receptor soluble IL-22RA2, como reactivos terapéuticos en estas enfermedades. [0360] Además, estos experimentos que usan adenovirus con IL-22 en ratones sugieren que la expresión en exceso de IL-22 aumenta el nivel de neutrófilos y plaquetas in vivo. Es concebible que haya otros factores (tales como citocinas y genes modificadores) implicados en las respuestas a IL-22 en todo el sistema animal. No obstante, estos datos apoyan fuertemente la implicación de IL-22 en la hematopoyesis. Por tanto, la IL-22, los anticuerpos anti-IL-22, receptores solubles IL-22RA (por ejemplo de SEC DE ID. Nº 3) y anticuerpos dirigidos contra IL-22RA son reactivos/dianas adecuados para el diagnóstico y tratamiento de una variedad de trastornos, tales como inflamación, trastornos inmunitarios, infección, anemia, cáncer hematopoyético y otros, y similares. [0361] La asociación de expresión de IL-22 con pérdida de peso, aparición de proteína SAA de fase aguda y perturbaciones metabólicas evidenciada por un nivel reducido de glucosa sérica, albúmina y nitrógeno de urea, sugiere que la IL-22 es una citocina que actúa en ciertas respuestas inflamatorias. Los ratones administrados con adenovirus con IL-22 pueden presentar un estado de inflamación crónica tal como el observado en EII, colitis ulcerosa, artritis, psoriasis, artritis psoriática, asma y similares. Ciertos procesos inflamatorios perjudiciales podrían inhibirse mediante el uso de un antagonista de IL-22 tal como anticuerpos anti-IL-22, y sus receptores tales como receptores solubles IL-22RA (por ejemplo, de SEC DE ID. Nº 3) y anticuerpos dirigidos contra IL-22RA y similares.

B. La IL-22 es una citocina proinflamatoria: nivel sérico de SAA en ratones adeno-IL

22: [0362] Se efectuó un ELISA para determinar el nivel de SAA en ratones adenoIL-22, usando un kit y protocolo de inmunoensayo de SAA de ratón (Biosource International, California, EE.UU.). Se sembraron patrones diluidos y muestras desconocidas junto con anticuerpo anti-SAA de ratón conjugado con HRP en placas de ensayo prerrecubiertas con anticuerpo anti-SAA de ratón. Se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC y se lavaron entonces según las instrucciones del kit. Se revelaron las placas durante 15 minutos a temperatura ambiente usando TMB y se detuvieron con H2SO4 2 M. Se leyó la absorbancia a 450 nm usando un Spectromax 190 (Molecular Devices, California, EE.UU.). Se analizaron los datos resultantes usando Softmax Pro (Molecular Devices, California, EE.UU.) y Excel (Microsoft Corp., Washington, EE.UU.). [0363] Los ratones infectados con adenovirus con IL-22 tenían niveles elevados de mSAA, más de 10 veces, respecto al control de adenovirus original.

C. Análisis de citometría de flujo de ratones infectados con adenovirus con IL-22 [0364] Para analizar los efectos de la expresión de IL-22 in vivo por adenovirus, se aislaron sangre periférica, bazo y médula ósea de ratones C57BL/6N infectados con adenovirus con IL-22 el día 10 y el día 20 después de la infección. Se recogieron aproximadamente 100 µl de sangre en tubos heparinizados y se consumieron entonces los eritrocitos mediante lisis hipotónica (las células se lisaron en 4,5 ml de H2O d durante ~5 s antes de añadir 1,5 ml de NaCl al 3,6%). Se trituraron los bazos entre dos cubreobjetos de vidrio congelados y se pasaron las células liberadas por una membrana Nytex (tamiz celular) y se sedimentaron. Se obtuvo la médula ósea triturando un fémur en un mortero y pasando las células por un tamiz celular (Falcon). Se resuspendieron las células en tampón de lavado de FACS (WB= BBSS/1% de BSA/Hepes 10 mM), se contaron con azul de tripano y se tomaron alícuotas de 1x106 células viables de cada tipo en tubos de poliestireno de 5 ml. Se lavaron las células y se sedimentaron, y se incubaron entonces durante 20 min en hielo con cócteles de anticuerpos monoclonales marcados fluorescentemente (FITC, PE y CyChrome) (PharMingen, San Diego, CA) que reconocen diversos marcadores de superficie celular usados para identificar subconjuntos de células inmunitarias particulares. Estos marcadores incluyen los siguientes (enumerados en los grupos de 3 ensayados). Para tinción en sangre: CD3, Gr1 y B220; para tinción en bazo: CD62L, CD44 y CD3; CD21, CD23 y B220; IgD, IgM y B220; CD11b, Gr1 y CD8; para tinción en médula ósea: CD11b, Gr1, CD3; IgD, IgM y B220. Se lavaron las células con 1,5 ml de WB, se sedimentaron y se resuspendieron entonces en 0,4 ml de WB y se analizaron en un FACScan usando software CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). [0365] Se encontró que la fracción de neutrófilos en la sangre de ratones tratados con adeno-IL-22 estaba elevada 4-13 veces el día 10 y 2-3 veces el día 20. El día 10, esta diferencia daba como resultado una reducción simultánea de la fracción de linfocitos y monocitos en la sangre. En la médula ósea, se encontró que el número total de linfocitos B se reducía ~1,5 veces mientras que el porcentaje de linfocitos B recirculantes maduros aumentaba y el número total de linfocitos B inmaduros caía ligeramente el día 10. El día 20, muchas de estas diferencias no eran evidentes, aunque se encontró un ligero aumento de la fracción de linfocitos B recirculantes maduros. En el bazo, el número total de linfocitos B se redujo ligeramente (1,5-2 veces) en los dos días ensayados, mientras que el día 20 la fracción de linfocitos B de zona marginal (CD21+CD23-B220+) aumentó 2 veces y el número de linfocitos B foliculares (CD21+CD23+B220+) cayó 2 veces. Los linfocitos B de zona marginal se considera que son la primera línea de defensa contra patógenos, ya que son más sensibles a los mitógenos de linfocitos B (por ejemplo, LPS) que los linfocitos B foliculares más comunes, y cuando se encuentran su antígeno asociado se diferencian muy rápidamente en células secretoras de anticuerpo. Es posible que la IL-22 potencie la conversión de linfocitos B foliculares a de zona marginal, o que consuma selectivamente las células foliculares menos maduras. Los cambios en los números de linfocitos B encontrados en la médula ósea pueden reflejar una diferenciación potenciada de linfocitos B pre/pro y/o inmaduros, o un flujo de entrada aumentado de linfocitos B recirculantes desde sangre/bazo, y quizás un aumento coincidente de salida de linfocitos B inmaduros a la periferia. El número real de linfocitos B BM maduros no aumenta, así que la IL-22 no puede potenciar su proliferación. Como alternativa, la IL-22 puede bloquear, reducir o inhibir la diferenciación de linfocitos B inmaduros y aumentar así la representación relativa de linfocitos B maduros.

D. El IL-22RA2-Fc4 neutraliza la actividad de IL-22 in vivo: ELISA de SAA que muestra que la expresión de SAA inducida por IL-22 se inhibe mediante la inyección de IL-22RA2-Fc4: [0366] Para valorar si el IL-22RA2 podría inhibir la inducción de SAA por IL-22, se dividieron ratones (hembra, C3H/HEJ, 8 semanas de edad; Jackson Labs, Bar Harbor, ME) en 5 grupos de 3 animales cada uno y se trataron mediante inyección IP de proteínas como se muestra en la Tabla 6 a continuación:

Tabla 6:

Nº de grupo

IL-22 IL-22RA2

Grupo 1:

- -

Grupo 2:

- 100 µg

Grupo 3:

3 µg -

Grupo 4:

3 µg 20 µg

Grupo 5:

3 µg 100 µg

[0367] Las inyecciones de IL-22RA2 precedieron a la inyección de IL-22 en 15 minutos. Se administraron ambas inyecciones de proteína por vía intraperitoneal. Se tomó una muestra de sangre de cada ratón antes del tratamiento, y entonces a las 2 y 6

5 horas después del tratamiento. Se preparó suero de cada una de las muestras para la medida de SAA e IL-22. [0368] Se efectuó un ELISA como se describe anteriormente para determinar el nivel de SAA en ratones tratados con IL-22 y un receptor soluble de IL-22, IL-22RA2Fc4, descrito en la presente memoria. Los ratones tratados con 3 µg de IL-22 junto con

10 IL-22RA2-Fc4 a concentraciones entre 20-100 µg mostraron una reducción del nivel de SAA inducida por IL-22 sola a los niveles de fondo, demostrando que el IL-22RA2 inhibía la actividad de inducción de SAA de IL-22 in vivo. Ejemplo 8 Expresión de IL-22 en el modelo de enfermedad inflamatoria intestinal de ratón

15 [0369] La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad multifactorial dividida en dos tipos: colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn (EC). La etiología de estas enfermedades no es actualmente conocida y las manifestaciones clínicas difieren. La CU está limitada al colon, y los síntomas incluyen diarrea hemorrágica, pérdida de peso y dolor abdominal. Los rasgos

20 macroscópicos de la CU incluyen úlceras punteadas y un colon acortado. En contraposición, la enfermedad de Crohn puede afectar también a otras partes del intestino. Los síntomas incluyen diarrea (que a menudo es menos hemorrágica que la observada en CU), un bajo grado de fiebre y dolor. Los rasgos macroscópicos incluyen intestino fibrótico y estenótico con estenosis, úlceras profundas, fisuras y fístulas.

25 [0370] Están disponibles varios modelos animales que imitan estas enfermedades humanas. Son tres modelos de colitis usados habitualmente para el cribado de nuevos fármacos el modelo de rata inducido por ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS), el modelo de transferencia de linfocitos T de ratón y el modelo inducido por dextranosulfato de sodio o DSS. El modelo de DSS derivaba del modelo del Dr. S. Murthy, que usa un sistema de puntuación del índice de actividad patológica (S.N.S. Murthy, “Treatment of Dextran Sulfate Sodium-Induced Murine Colitis by Intracolonic Cyclosporin, Digestive Diseases and Sciences”, Vol. 38, Nº 9 (septiembre de 1993), pág.1722-1734). [0371] En el presente estudio, resultó una colitis aguda cuando se alimentó a ratones DSS en su agua de bebida durante 6 días. Los animales exhibieron pérdida de peso y diarrea hemorrágica, imitando la afección de pacientes de CU. El mecanismo de lesión del DSS no está bien caracterizado, pero se cree que induce una respuesta inmunitaria inflamatoria no específica e imita los efectos ambientales sobre el intestino. Es posible que se produzca H2S, que podría ser tóxico para las células. Además, aparecen cambios en la flora bacteriana luminar. Se han mostrado monocitos, macrófagos y mastocitos activados en el colon. Los mediadores de los tres modelos animales incluyen prostaglandinas inflamatorias, metabolitos de leucotrieno y citocinas.

A. Procedimiento [0372] Se indujo la colitis mediante la ingestión de DSS en ratones hembra Swiss Webster de Charles River Laboratories. Los ratones eran de 10 y 11 semanas de edad al inicio del estudio. Se administró a los ratones DSS al 4% en el agua de bebida durante un periodo de 6 días (ratones tratados), o se administró sólo agua de bebida normal (ratones de control). Se usó una puntuación clínica del índice de actividad patológica (IAP), que comprende una combinación de medidas que incluyen calidad de las heces, sangre oculta y pérdida de peso. Se obtuvo el IAP diariamente para cada ratón empezando un día después del tratamiento con DSS. Después de 6 días, se retiró el DSS del agua de bebida de los ratones tratados. Se controlaron todos los ratones mediante la puntuación clínica del IAP hasta el sacrificio a los 2, 7 ó 10 días desde el inicio del estudio. En cada uno de los días 2 y 7, se sacrificaron cuatro ratones tratados con DSS y un ratón de control. El día 10, se sacrificaron cuatro ratones tratados con DSS y dos ratones de control. Para todos los animales después del sacrificio, se midió la longitud del colon. Se fijaron las secciones de colon en formalina tamponada neutra al 10% para análisis histológicos o se congelaron para extracción de ARNm.

B. Puntuación histológica y puntuación del índice de actividad patológica (IAP) [0373] Se obtuvieron las puntuaciones del índice histológico siguiendo el procedimiento de la referencia 1. Generalmente, se puntuaron con enmascaramiento las secciones de colon por un patólogo para puntuaciones de cripta, epitelio hiperplásico, distorsión e inflamación de cripta. [0374] Se graduó diariamente cada ratón según la puntuación clínica basada en pérdida de peso, consistencia de las heces y hemorragia intestinal. Se asignaron puntuaciones mayores para valores crecientes de pérdida de peso, diarrea y hemorragia. La puntuación diaria para cada ratón era el grado medio obtenido de los tres resultados/observaciones.

C. Resultados [0375] Las longitudes de colon de ratones tratados con DSS eran algo más cortas los días 7 y 10 que en los controles no tratados, pero los resultados pueden no ser significativos (no comprobados por una aplicación estadística). Las puntuaciones clínicas de IAP reflejaban una elevación de los síntomas patológicos en los ratones tratados con DSS similar a la observada en estudios anteriores que usaban este modelo. La sangre oculta era mayor aproximadamente los días 4 y 5, mientras que las heces sueltas eran más prevalentes los días 6 y 7. Los resultados de histopatología muestran que las puntuaciones patológicas eran diferentes que en los controles en todos los días de sacrificio, especialmente los días 7 (pico) y 10. Las puntuaciones de cribado histopatológico eran: controles= 0,5, ratones tratados con DSS el día 2= 8,8, ratones tratados con DSS el día 7= 21, ratones tratados con DSS el día 10= 18. Las puntuaciones clínicas e histopatológicas muestran que los ratones tratados con DSS tenían una enfermedad colónica significativa respecto a los controles no tratados. Las muestras de tejido congelado se usaron después para determinaciones de ARNm como se describe a continuación.

D. Expresión en tejido de ARN de IL-22 en muestras de colon de EII de murino usando PCR-FI: [0376] Para determinar la expresión relativa de ARN de IL-22 de ratón (SEC DE ID. Nº 10; SEC DE ID. Nº 11) en un modelo de enfermedad inflamatoria intestinal, se recogieron los colones distales de ratones tratados con DSS y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. En este experimento, se trataron los ratones con DSS y se tomaron muestras los días 2, 7 y 10 después del tratamiento. Se recogieron también muestras de ratones normales no tratados. Se aisló entonces el ARN de las muestras usando el kit estándar RNeasy Midiprep™ Kit (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. [0377] Las reacciones de PCR-FI usaron el “Superscript One-Step RT-PCR System with Platinum Taq” (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Cada 25 µl de reacción consistían en lo siguiente: 12,5 µl de 2X tampón de reacción, 0,5 µl (20

pmol/µl) de ZC39.289 (SEC DE ID. Nº 17), 0,5 µl (20 pmol/µl) de ZC39.290 (SEC DE ID. Nº 18), 0,4 µl de mezcla de TI/polimerasa Taq, 10 µl de agua exenta de ARNasa, 1,0 µl de ARN total (100 ng/µl). Se llevó a cabo la amplificación como sigue: un ciclo a 50ºC durante 30 minutos seguido de 35 ciclos a 94ºC, 30 s; 58ºC, 30 5 s; 72ºC, 60 s; acabando entonces con una extensión final a 72ºC durante 7 minutos. Se sometieron 8 a 10 µl del producto de reacción de PCR a electroforesis en gel de agarosa estándar usando un gel de agarosa al 2%. Se observó el tamaño de fragmento de ADNc predicho correcto como sigue: había una débil banda en ambas muestras del día 2. Dos de las tres muestras del día 3 generaron una banda fuerte, mientras que la 10 tercera muestra del día 7 generaba una banda muy fuerte. Las tres muestras del día 10 generaron una banda fuerte. Finalmente, las dos muestras de control “normales” no generaron ninguna banda. Estos resultados sugieren que puede haber una regulación positiva de IL-22 en ciertos tipos de respuestas inflamatorias en el colon, incluyendo aquellas asociadas a EII, CU y EC. Los datos se resumen en la Tabla 7 siguiente en 15 que la expresión relativa se puntuó como sigue: 0 = sin banda, 1= banda débil, 2=

banda fuerte; 3= banda muy fuerte.

Tabla 7

Tejido

Expresión relativa (0-3)

Colon normal

0

Colon normal

0

Día 2 después del tratamiento

1

Día 2 después del tratamiento

1

Día 7 después del tratamiento

3

Día 7 después del tratamiento

2

Día 7 después del tratamiento

2

Día 10 después del tratamiento

2

Día 10 después del tratamiento

2

Día 10 después del tratamiento

2

Ejemplo 9 El IL-22RA2 reduce los niveles de IL-6 y SAA en el modelo de artritis inducida por colágeno (AIC) en ratón

5 A. Modelo de artritis inducida por colágeno (AIC) en ratón [0378] Se dividieron ratones macho DBA/1J de 10 semanas de edad (Jackson Labs) en 3 grupos de 13 ratones/grupo. El día 21, se administró a los animales una inyección subcutánea de 50-100 µl de colágeno de tipo II de pollo 1 mg/ml formulado en coadyuvante completo de Freund (preparado por Chondrex, Redmond, WA), y 3

10 semanas después del día 0, se les administró una inyección de 100 µl (25 µg) de LPS de E. coli 0111:B4, preparado a 250 µg/ml a partir de una alícuota liofilizada (Sigma, St. Louis, MO). Se administró IL-22RA2 en forma de inyección intraperitoneal 3 veces por semana durante 4 semanas, del día 0 al día 25. Los dos primeros grupos recibieron 100 ó 10 µg de IL-22RA2 por animal por dosis, y el tercer grupo recibió el

15 vehículo de control, PBS (Life Technologies, Rockville, MD). Los animales empezaron a mostrar síntomas de artritis después de la inyección de LPS, desarrollando la mayoría de animales inflamación al cabo de 2-3 semanas. Se evaluó la extensión de la enfermedad en cada pata usando un calibre para medir el grosor de pata, y asignando una puntuación clínica (0-3) a cada pata: 0= normal, 0,5= dedo o

20 dedos inflamados, 1= inflamación leve de pata, 2= inflamación moderada de pata y 3= inflamación grave de pata, como se detalla a continuación. Control de la enfermedad: [0379] Los animales pueden empezar a mostrar señales de inflamación de pata poco después de la segunda inyección de colágeno, y algunos animales empiezan a tener señales de inflamación de dedos incluso antes de la segunda inyección de colágeno. La mayoría de los animales desarrolla artritis al cabo de 2-3 semanas de la inyección de recuerdo, pero algunos pueden requerir un periodo más largo de tiempo. La incidencia de la enfermedad en este modelo es típicamente de 95-100%, y se observan típicamente 0-2 casos que no responden (determinados después de 6 semanas de observación) en un estudio que usa 40 animales. Adviértase que, a medida que empieza la inflamación, puede aparecer una aparición transitoria común de inflamación de pata o dedo de bajo grado. Por esta razón, no se considera que un animal tenga enfermedad establecida hasta que ha desarrollado una hinchazón de pata marcada y persistente. [0380] Se observaron diariamente todos los animales para valorar el estado de la enfermedad en sus patas, lo que se realizó asignando una puntuación clínica cualitativa a cada una de las patas. Cada día, se puntúan las 4 patas de cada animal según su estado de enfermedad clínica. Para determinar la puntuación clínica, puede considerarse que la pata tiene 3 zonas, los dedos, la pata misma (pata delantera o trasera) y la articulación de muñeca o tobillo. Se advirtió la extensión y gravedad de la inflamación respecto a estas zonas incluyendo la observación en todos los dedos de cualquier hinchazón articular, uñas rotas o eritemas, la anotación de cualquier evidencia de edema o eritema en cualquiera de las patas, la anotación de cualquier pérdida de la demarcación anatómica de tendones o huesos y la evaluación en la muñeca o tobillo de cualquier edema o eritema, y la anotación de si la inflamación se extiende proximalmente a la pierna. La puntuación de pata de 1, 2 ó 3 estaba basada en primer lugar en la impresión global de gravedad, y en segundo lugar en cuántas zonas estaban implicadas. La escala usada para puntuación clínica se muestra a continuación. Puntuación clínica:

[0381]

0 = normal 0,5 = uno o más dedos implicados, pero sólo están inflamados los dedos 1 = inflamación leve que implica la pata (1 zona) y puede incluir uno o varios dedos 2 = inflamación moderada en la pata y puede incluir algunos de los dedos y/o muñeca/tobillo (2 zonas) 3 = inflamación grave en la pata, muñeca/tobillo y algunos o todos los dedos (3 zonas).

[0382] Se define enfermedad establecida como una puntuación cualitativa de inflamación de pata en el intervalo de 2 o más, que persiste durante una noche (dos días seguidos). Una vez está presente la enfermedad establecida, se registra el dato y se designa como el primer día de “enfermedad establecida” de ese animal. [0383] Se recogió sangre a lo largo del experimento para controlar los niveles séricos de anticuerpos anticolágeno. Se sacrificaron los animales el día 21 y se recogió la sangre para suero y CBC. Se recogió de cada animal una pata afectada en NBF al 10% para histología y se congeló otra en nitrógeno líquido y se almacenó a -80ºC para análisis de ARNm. Se recogieron también medio bazo, medio timo, medio nódulo linfático mesentérico, un lóbulo hepático y el riñón izquierdo en RNAlater para análisis de ARN, y medio bazo, medio timo, medio nódulo linfático mesentérico, el resto del hígado y el riñón derecho en NBF al 10% para histología. Se recogió el suero y se congeló a -80ºC para ensayos de inmunoglobulina y citocina. [0384] No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos cuando se analizaron las puntuaciones de pata y datos de medida, aunque se sugirió que un grupo de tratamiento que recibe IL-22RA2 puede haber tenido un retraso en el inicio y la progresión de la inflamación de la pata. No había diferencias significativas entre los grupos de cambios en el peso corporal, parámetros de CBC o niveles de anticuerpo anticolágeno. Estos resultados tempranos indican que el IL22RA2 no afecta adversamente al peso corporal, los eritrocitos o leucocitos o la producción de anticuerpos, pero puede ser capaz de reducir la inflamación. Están en proceso investigaciones adicionales sobre la dosificación, mecanismo de acción y eficacia (por ejemplo, ejemplo 10.

B. Datos de ELISA anti-colágeno en el modelo de AIC de ratón [0385] Se recogieron muestras de suero los días 0, 7, 14, 21 y 28 respecto a la fecha de exposición a LPS (día 0) del modelo de murino de artritis inducida por colágeno (Ejemplo 9A anterior). Se cribaron en las muestras de suero con ELISA los títulos de anticuerpo anticolágeno. No había efectos estadísticamente significativos del tratamiento de IL-22RA2 en los grupos de tratamiento con 100 µg o 10 µg sobre los niveles de anticuerpos anticolágeno en comparación con los controles de PBS. Se da continuación una descripción de los procedimientos y materiales de ELISA anticolágeno. [0386] Los reactivos usados para ELISA anticolágeno eran placas de microvaloración de 96 pocillos Maxisorp (NUNC, Rochester, NY), colágeno de tipo II de pollo (Chondrex, Redmond, WA), Super Block (Pierce, Rockford, IL), IgG+A+M (H+L) de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Zymed, South San Francisco, CA) y sustrato diclorhidrato de o-fenilendiamina (Pierce, Rockford, IL). Los tampones usados en todos los ensayos eran tampón diluyente B de ELISA (PBS +0,1% de BSA + 0,05% de Tween (Sigma, St. Louis, MO)), tampón de lavado C de ELISA (PBS + 0,05% de Tween) y tampón de revelado NovoD (citrato de sodio 0,063 M, ácido cítrico 0,037 M), H2O2 (Sigma) y H2SO4 1 N (VWR, Tukwilla, WA). [0387] Se recogieron aproximadamente 100 µl de sangre periférica por toma de sangre retroorbital en tubos separadores de suero (Becton Dickinson). Se recogió el suero mediante centrifugación (2-3 min, 16.000 x g, 4-6ºC) y se almacenó a -20ºC hasta el análisis. Para determinar los niveles de anticuerpo de Ig anticolágeno, se recubrieron placas NUNC con colágeno de tipo II de pollo 10 µg/ml (Chondrex, Redmond WA) y se incubaron durante una noche a 4ºC. Se lavaron las placas con ELISA C, se bloquearon (5 minutos, temperatura ambiente) con Super Block (Pierce, Rockford, IL) y se lavaron con ELISA C. Se añadieron muestras de suero diluidas (diluidas en ELISA B 5 veces desde 1:5000 a 1:625.000) a placas de ELISA por triplicado y se incubaron las placas durante una noche a 4ºC. Después de la incubación, se lavaron las placas con ELISA C y se añadió Ig-Fc de cabra anti-ratón marcada con peroxidasa (Zymed, 1:2000 en ELISA B). Se incubaron las placas (temperatura ambiente, 90 minutos), se aclararon de nuevo usando ELISA C y se reveló la actividad de HRP usando el sustrato diclorhidrato de o-fenilendiamina (10 ml de NovoD + 1 comprimido de OPD + 10 µl de H2O2, Pierce). Se detuvo la reacción con H2SO4 1 N. Se tomaron medidas de densidad óptica relativa de las muestras de suero a una dilución 1:25.000 a 490 nm usando un Spectra MAX 190, y se analizaron los datos usando software SoftMax Pro (Molecular Devices Corporation, Palo Alto, CA).

C. Análisis de IL-6 y SAA en el modelo de AIC de ratón [0388] Se recogieron muestras de suero el día 0 de ratones con AIC (Ejemplo 9A anterior) 4 h después de la administración de 25 µg de LPS por vía intraperitoneal. Se cribaron en las muestras las concentraciones de IL-6 y amiloide sérico A (SAA) mediante kits de ELISA comerciales adquiridos en Biosource International (Camarillo, CA) según las instrucciones del fabricante. [0389] Los niveles de IL-6 eran 9651 ± 1563 pg/ml, 10.865 ± 1478 pg/ml y

15.006 ± 2.099 pg/ml en los grupos de ratones sometidos a 100 µg de IL-22RA2, 10 µg de IL-22RA2 y control de PBS, respectivamente. La concentración en el grupo de ratones de AIC expuestos a la dosis de 100 µg de IL-22RA2 era significativamente menor en comparación con los ratones de control de PBS, con p = 0,351. Se calculó la significación estadísitica usando PLSD de Fisher con un nivel de significación del 5% (ABACUS Concepts, INC, Berkeley, CA). [0390] Además, las concentraciones de SAA eran 381 ± 40 µg/ml, 348 ± 37 µg/ml y 490 ± 50 µg/ml en los grupos de ratones sometidos a 100 µg de IL-22RA2, 10 µg de IL-22RA2 y grupos de control de PBS, respectivamente. La concentración de SAA en el grupo de ratones de AIC expuestos a la dosis de 10 µg de IL-22RA2 era significativamente menor en comparación con los ratones de control de PBS, con p = 0,0257. Se calculó la significación estadística usando PLSD de Fisher con un nivel de significación del 5% (ABACUS Concepts, INC, Berkeley, CA). Ejemplo 10 Los mAb anti-IL-22RA o mAb anti-IL-22 inhiben la gravedad de la enfermedad en un modelo de AIC de ratón [0391] El modelo de artritis inducida por colágeno (AIC) es un modelo de ratón para artritis reumatoide que refleja en gran medida la enfermedad observada en seres humanos (Moore, Methods Mol. Biol. 225:175-179, 2003: Waksman, Scand. J. Immunol., 56:12-34, 2002). Se inmunizan ratones con 2 dosis de colágeno emulsionado en CFA en la base de la cola. Esto da como resultado la hinchazón de las patas, que aumenta durante un periodo de tiempo y puede puntuarse tanto visualmente como medirse usando calibres. Además, los anticuerpos anticolágeno séricos se correlacionan bien con la gravedad de la enfermedad. Basándose en los datos que muestran que IL-20 e IL-22 inducen inflamación, se administran mAb anti-IL-22RA y anti-IL-22 a grupos de ratones inmunizados con colágeno, y se evalúan los efectos sobre las puntuaciones de enfermedad. Una reducción de las puntuaciones de pata y grosor de pata después de la administración de mAb anti-IL-22RA o mAb anti-IL-22 sugiere que IL-20 e IL-22 promueven la respuesta inmune continua en un modelo de autoinmunidad y que bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar su función puede inhibir trastornos autoinmunitarios. La inhibición de TNFα sérico y anticuerpos anticolágeno sugiere también que bloquear IL-22RA puede ser beneficioso en enfermedad autoinmunitaria. [0392] Por tanto, para determinar si los mAb anti-IL-22RA o mAb anti-IL-22 tienen efecto sobre la autoinmunidad, se ensayan en un modelo de artritis reumatoide en ratón, la artritis inducida por colágeno (AIC). Específicamente, se administran a los ratones DBA1J inyecciones de colágeno para inducir la artritis de tipo reumatoide. La inoculación el día 0 es una inyección subcutánea de un homogeneizado constituido por coadyuvante completo de Freund (CFA) y colágeno de tipo II (50-100 µl, preparado en forma de 2 mg/ml de colágeno). Se administra la inyección cerca de la base de la cola. El día 21, se administra una segunda inoculación, siendo la única diferencia que el homogeneizado se prepara usando coadyuvante incompleto de Freund (IFA), en lugar de CFA. Se miden diariamente las puntuaciones de pata y grosores. Los grupos de ratones reciben PBS, 20-200 µg de anticuerpo monoclonal de isotipo coincidente con el control o 20-200 µg de mAb anti-IL-22RA o mAb anti-IL-22 i.p, 2X o 3X/semana durante 1-4 semanas empezando en la segunda inyección de colágeno. Se controlan diariamente los ratones hasta el día 30. Se sacrifican los ratones el día 30, se toma suero para análisis de anticuerpo anti-colágeno y análisis de citocina sérica (TNFα). [0393] La inhibición de las puntuaciones de pata, grosor de pata, TNFα sérico y anticuerpos anticolágeno séricos mediante la administración de mAb anti-IL-22RA o anti-IL-22 sugiere que bloquear IL-22AR puede unirse, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar IL-22, e inhibir la respuesta inmunitaria continua en un modelo de autoinmunidad y puede inhibir trastornos autoinmunitarios. Ejemplo 11 Expresión del receptor de IL-22, IL-22RA, en el modelo de DSS de ratón [0394] Se efectuó una PCR-FI cuantitativa para medir los niveles de expresión de IL-22RA de ratón en los cólones de ratones con EII inducida por DSS (Ejemplo 8). Se aisló ARN de colon de ratón normal y de los cólones distales de ratones tratados con DSS los días de tratamiento 2, 7 y 10. Se efectuó la PCR-FI usando el instrumento y protocolos de Applied Biosystems 7700 TaqMan. Brevemente, se usó el software “Primer Express” para diseñar cebadores contra la secuencia de IL-22RA de ratón (ZC39776 (SEC DE ID. Nº 19) y ZC39777 (SEC DE ID. Nº 20)) y una sonda de TaqMan marcada con FAM/TAMRA (ZC38752 (SEC DE ID. Nº 21)) según las directrices de Applied Biosystems. Se añadieron 25 ng de ARN a cada reacción, junto con los reactivos de PE/Applied Biosystems TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents y los cebadores y sonda mencionados anteriormente. Se realizaron reacciones PCR-FI por duplicado en las siguientes condiciones: 50ºC durante 2 minutos, 60ºC durante 30 minutos, 95ºC durante 5 minutos, 40 ciclos de 94ºC durante 20 s y 60ºC durante 1 minuto. Se compararon los valores de expresión con una curva patrón de números conocidos de moléculas de un transcrito de ARN de IL-22RA de ratón sintético, y se reseña la expresión como el número absoluto de moléculas de IL-22RA de ratón por reacción. Los datos preliminares sugieren que la expresión de IL-22RA de ratón puede estar ligeramente regulada negativamente el día 7 y el día 10 en los cólones distales de ratones con EII inducida por DSS en comparación con los niveles de expresión en colon de ratón normal. Ejemplo 12 IL-22 e indicadores proinflamatorios en el modelo de endotoxemia leve: modelo de endotoxemia inducida por LPS en ratón

A. Modelo de endotoxemia inducida por LPS en ratón: Valoración de las citocinas proinflamatorias y de la temperatura corporal en el modelo de endotoxemia inducida por LPS en ratón [0395] Se diseñó un experimento in vivo para examinar el efecto de IL-22RA2 (IL-22RA2) en un modelo de endotoxemia leve por LPS en ratón. Para valorar inicialmente el modelo, se midieron las citocinas proinflamatorias y la temperatura corporal para recoger datos de referencia para el modelo. [0396] Brevemente, se inyectaron a ratones hembra Balb/c (CRL) de 6 meses 25 µg de LPS (Sigma) en PBS estéril por vía intraperitoneal (IP). Se recogieron muestras de suero a las 0, 1, 4, 8, 16, 24, 48 y 72 h de grupos de 8 ratones para cada punto temporal. Se ensayaron en las muestras de suero los niveles de citocina inflamatoria. Se midieron los niveles de IL-1b, IL-6, TNFα, IL-10 y proteína amiloide A sérica (SAA) usando kits ELISA comerciales adquiridos en Biosource International (Camarillo, CA). [0397] Los niveles de TNFα tenían un máximo de 4000 pg/ml y los niveles de IL10 eran de 341 pg/ml 1 h después de la inyección de LPS. A las 4 h después de la inyección de LPS, los niveles de IL-6, IL-1b e IL-10 eran de 6.100 pg/ml, 299 pg/ml y 229 pg/ml, respectivamente. Los niveles de SAA en suero eran de 0,405 mg/ml a las 4 h después de la inyección de LPS. Las concentraciones de SAA en suero siguieron aumentando a 3,9 mg/ml a las 24 h después de LPS, sin embargo, los niveles de SAA mayores de 1 a 2 mg/ml en suero son difíciles de medir exacta o reproduciblemente con el kit ELISA existente debido a interacciones entre SAA y otros componentes séricos. Estos resultados indicaban que se producían de hecho en este modelo citocinas proinflamatorias, además de IL-22 (Ejemplo 11B). Por tanto, se establecieron los siguientes criterios como marcadores biológicos del modelo de LPS de endotoxemia leve: niveles séricos de TNFα 1 h después de LPS, niveles séricos de IL-6 4 h después de LPS y niveles séricos de SAA 4 y 8 h después de LPS. [0398] Se controlaron las temperaturas corporales en un grupo separado de animales mediante dispositivos de telemetría implantados quirúrgicamente durante el transcurso del experimento de 72 h. Las temperaturas corporales en los ratones cayeron como máximo 2ºC desde 37,07ºC a 34,98ºC 30 minutos después de la inyección de LPS. [0399] La inyección de 100 µg de proteína de fusión IL-22RA2-Fc 30 minutos antes de la inyección de LPS redujo significativamente aproximadamente un 50% la inducción de SAA en los puntos temporales de 4 y 8 h, mientras que 10 µg de IL22RA2-Fc no tenían un efecto significativo. No hay ningún cambio significativo en el nivel de TNF-α ni IL-6. La inyección de IL-22RA2-Fc redujo el recuento de neutrófilos en circulación en el punto temporal de 1 h. Se mostró que la administración de IL-22RA2-Fc puede neutralizar la actividad de IL-22 en términos de inducción de SAA.

B. Detección de la actividad de IL-22 en suero de ratón en el modelo de endotoxemia inducida por LPS en ratón usando células BaF3/CRF2-4/IL-22RA en un ensayo de proliferación con azul de Alamar [0400] Se centrifugaron células BaF3/CRF2-4/IL-22RA, descritas en la presente memoria, se lavaron con PBS dos veces para asegurar la retirada de mIL-3, y se centrifugaron entonces una tercera vez y se resuspendieron en medio completo (RPMI 1640, 10% de FBS, 1% de GlutaMAX, 1% de piruvato de sodio) pero sin mIL-3 (de aquí en adelante designado como “medio exento de mIL-3”). Se contaron entonces las células en un hemocitómetro. Se sembraron las células en un formato de 96 pocillos a 5000 células por pocillo en un volumen de 100 µl por pocillo usando el medio exento de mIL-3. [0401] Se diluyó al 2% suero de los ratones con endotoxemia inducida por LPS del experimento descrito en el Ejemplo 11A anterior en medio exento de mIL-3 en la fila superior de la placa, y se diluyó entonces en serie 1:2 en las 7 filas restantes de la placa de 96 pocillos, dejando un volumen de 100 µl en cada pocillo. Se añadió entonces esto a 100 µl de células, para concentraciones séricas finales de 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%, 0,063%, 0,031%, 0,016% y 0,018% en un volumen de ensayo total de 200 µl. Se incubaron las placas de ensayo a 37ºC, 5% de CO2 durante 4 días, en cuyo momento se añadió azul de Alamar (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pocillo. Se incubaron de nuevo las placas a 37ºC, 5% de CO2 durante 16 horas. El azul de Alamar da una lectura fluorimétrica basada en el número de células vivas, y es por tanto una medida directa de la proliferación celular en comparación con un control negativo. Se leyeron las placas en un Wallac Victor 2 1420 Multilabel Counter (Wallac, Turku, Finlandia) a longitudes de onda de 530 (excitación) y 590 (emisión).

[0402] Los resultados no mostraron una proliferación significativa por encima de los niveles de fondo en los puntos temporales de 0 h, 1 h, 8 h y 16 h. Las muestras de suero del punto temporal de 4 h mostraron aumentos de 4 a más 10 veces de proliferación por encima del fondo, indicando la presencia de IL-22 en esas muestras.

5 C. Modelo de endotoxemia inducida por LPS en ratón: experimento para valorar los efectos de IL-22RA2 [0403] Se ensayó la capacidad del tratamiento con IL-22RA2 de afectar a indicadores proinflamatorios inducidos con una sola dosis de 25 µg de LPS IP en ratones. Se analizaron en todas las muestras SAA, IL-22 y recuentos de neutrófilos en

10 circulación. Se analizaron en subconjuntos de cada grupo los niveles de citocina particulares (se cribó en las muestras de 1 h TNF-α, en las muestras de 4 h se analizó IL-6). Se sacrificaron los animales en los puntos temporales indicados en la Tabla 8 a continuación y se recogieron sangre completa y suero y se hicieron alícuotas para análisis.

15 [0404] Se administró a 72 ratones C57BL/6N hembra (CRL) una sola dosis IP de IL-22RA2 como se describe en la Tabla 8 a continuación. Los ratones de control eran C57BL/6N (CRL). [0405] 30 minutos después, recibieron otra inyección IP de 25 µg de LPS (Sigma) en 100 µl, para iniciar la cascada de endotoxemia. Se sacrificaron ratones de cada

20 grupo en los correspondientes puntos temporales como se indica en la Tabla 8, se recogieron 50 µl de sangre completa para medir el número total de neutrófilos en circulación, se centrifugó el resto para suero y se hicieron alícuotas para diversos ensayos descritos en la presente memoria.

Tabla 8

Grupo

Nº Tratamiento LPS Sacrificio Muestras

A

8 100 µg de IL22RA2 IP 25 µg IP 30 después del trat. min 1 hora Alícuotas séricas Sangre para CBC

B

8 10 µg de IL22RA2 IP 25 µg IP 30 después del trat. min 1 hora Alícuotas séricas Sangre para CBC

C

8 200 µl de PBS IP 25 µg IP 30 después del trat. min 1 hora Alícuotas séricas Sangre para CBC

D

8 100 µg de IL22RA2 IP 25 µg IP 30 después del trat. min 4 horas Alícuotas séricas Sangre para CBC

E

8 10 µg de IL22RA2 IP 25 µg IP 30 después del trat. min 4 horas Alícuotas séricas Sangre para CBC

F

8 200 µl de PBS IP 25 µg IP 30 después del trat. min 4 horas Alícuotas séricas Sangre para CBC

G

8 100 µg de IL22RA2 IP 25 µg IP 30 después del trat. min 8 horas Alícuotas séricas Sangre para CBC

H

8 10 µg de IL22RA2 IP 25 µg IP 30 después del trat. min 8 horas Alícuotas séricas Sangre para CBC

J

8 200 µl de PBS IP 25 µg IP 30 min después del trat. 8 horas Alícuotas séricas Sangre para CBC

K

8 5 controles Ninguno Antes de LPS Alícuotas séricas Sangre para CBC

D. El IL-22RA2-Fc4 neutraliza la inducción de SAA in vivo: el ELISA de SAA que muestra que la expresión de SAA inducida por LPS en el modelo de endotoxemia inducida por LPS en ratón es inhibida por una inyección de IL-22RA2-Fc4: [0406] Para valorar si el IL-22RA2 podría inhibir la inducción de SAA en el

5 modelo de endotoxemia inducida por LPS en ratón, se inyectó en ratones IL-22RA2, 30 minutos antes de la inyección de LPS, como se muestra en la Tabla 8 del Ejemplo 11C anterior. [0407] Se efectuó un ELISA para determinar los niveles de SAA en las muestras de 4 h y 8 h usando el kit de inmunoensayo de SAA de ratón (BioSource International,

10 California) siguiendo las instrucciones del fabricante. En el punto temporal de 4 h, los ratones tratados con 100 µg o 10 µg de IL-22RA2 mostraron una reducción estadísticamente significativa dependiente de la dosis de los niveles de SAA respecto a los ratones inyectados con PBS. En el punto temporal de 8 h, los ratones tratados con 100 µg siguieron mostrando una reducción estadísticamente significativa de los niveles

15 de SAA respecto a los ratones inyectados con PBS. Esto indica que la presencia de IL22RA2 es capaz de inhibir la inducción de SAA por LPS in vivo. Ejemplo 13 Efectos in vivo del polipéptido IL-22 sobre la piel

A. Acantosis inducida por IL-22

20 [0408] Se dividieron ratones (hembra, C3H/HEJ, de 8 semanas de edad; Jackson Labs, Bar Harbor, ME) en tres grupos de 6 animales y un grupo de 4. Se administró IL-22 producida por BHK humanas mediante infusión continua mediante minibombas osmóticas, dando como resultado concentraciones locales y séricas de estado estacionario proporcionales a la concentración de IL-22 contenida en la bomba. Se

25 cargaron minobombas osmóticas Alzet (modelo 2002; Alza Corporation Palo Alto, CA) en condiciones estériles con proteína IL-22 (A601F, 0,22 ml) diluida en disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,0) a una concentración en la bomba de 2 mg/ml para los ratones del grupo 1, 0,2 mg/ml para los ratones del grupo 2, 0,02 mg/ml para los ratones del grupo 3 o 0 mg/ml (sólo diluyente) para los ratones del grupo 4. Se implantaron subcutáneamente las bombas en ratones mediante una incisión de 1 cm en la piel dorsal, y se cerró la piel con cierres de herida estériles. Estas bombas se diseñan para suministrar sus contenidos a una velocidad de 0,5 µl por hora durante un periodo de 14 días. Usando esta velocidad de infusión nominal, se calculó que los niveles de dosis eran de 24 µg/día, 2,4 µg/día, 0,24 µg/día y 0 µg/día para los grupos 1-4, respectivamente. [0409] Al final del periodo de 14 días, se sacrificaron los ratones y se recogió una muestra de aproximadamente 1 cm2 de piel que rodea la zona de la bomba de cada ratón. Se fijó la piel en formalina tamponada neutra al 10%. Se embebieron en parafina las muestras de piel fijadas con formalina, se procesaron rutinariamente, se seccionaron a 5 µm y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Se examinaron microscópicamente los tejidos con enmascaramiento por un patólogo veterinario con certificado de especialidad ACVP. Se advirtieron los cambios histológicos y se puntuó la gravedad de la acantosis (concretamente engrosamiento epidérmico) de manera subjetiva usando el siguiente sistema de puntuación: 0- normal, 1- acantosis mínima, 2- acantosis leve, 3- acantosis moderada y 4- acantosis grave. Además, se tomaron imágenes de la piel de grupos seleccionados con una cámara digital CoolSnap (Roper Scientific, Inc., San Diego, CA) y se midió el grosor epidérmico usando software de histomorfometría (Scion Image para Windows, v. 4.02, Scion Corp., Frederick, MD). [0410] La administración de IL-22 a 2,4 y 24 µg/día dio como resultado un engrosamiento epidérmico como se muestra por la puntuación media de acantosis (véase a continuación) consistentemente mayor que la observada en la piel del grupo de control. Además, los animales tratados con IL-22 tenían también infiltrados de células mononucleares en la epidermis. Estos infiltrados no se observaron en los controles tratados con vehículo. [0411] Se muestran las puntuaciones de acantosis de engrosamiento epidérmico y las medidas de grosor cutáneo (en unidades genéricas de píxeles) por grupos en la Tabla 9 siguiente, como sigue:

Tabla 9

Nº de grupo N= Bomba Acantosis media Grosor medido

1 6 24 µg de IL-22/día 3,0 ND

2 6 2,4 µg de IL-22/día 2,4 67,5

3 6 0,24 µg de IL-22/día 2,2 ND 4 4 Infusión de PBS 1,8 45,6

B. Efecto de IL-22RA2 sobre la acantosis inducida por IL-22 [0412] Se dividieron ratones (hembra, C3H/HEJ, 8 semanas de edad; Jackson Labs, Bar Harbor, ME) en ocho grupos de 8 animales cada uno. Se administró IL-22 mediante infusión constante por minibombas osmóticas, como se describe en el

5 Ejemplo 12A. Se cargaron minibombas osmóticas Alzet (modelo 2001; Alza Corporation Palo Alto, CA) en condiciones estériles con proteína IL-22 (A#601F, 0,22 ml) diluida en disolución salina tamponada con fosfato (pH 7,0) a una concentración en la bomba de 0,22 mg/ml para los grupos 1-2 de ratones, 0,45 mg/ml para los grupos 3-4 de ratones, 0,9 mg/ml para los grupos 5-6 de ratones o 0 mg/ml (sólo diluyente)

10 para los grupos 7-8 de ratones. Estas bombas se diseñan para suministrar sus contenidos a una velocidad de 0,5 µl por hora durante un periodo de 14 días. Usando esta velocidad de infusión nominal, se calculó que los niveles de dosis eran de 10 µg/día en los grupos 1-2, 5 µg/día en los grupos 3-4, 2,5 µg/día en los grupos 5-6 y 0 µg/día en los grupos 7-8. Para cada par de grupos a un nivel de dosis dado de IL-22, se

15 inyectó en uno de los grupos tres veces (días 1, 3 y 5) 0,1 mg de proteína IL-22RA2-Fc humana (descrita en la presente memoria) por vía intraperitoneal. Se inyectó en el otro grupo de la misma forma vehículo (PBS). [0413] El día 8 del estudio, se sacrificaron los ratones y se recogió una muestra de piel de aproximadamente 1 cm2 que rodeaba la zona de bomba de cada ratón. Se fijó la

20 piel en formalina tamponada neutra al 10%. Se embebieron en parafina las muestras de piel fijadas con formalina, se procesaron rutinariamente, se seccionaron a 5 µm y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Se examinaron microscópicamente los tejidos con enmascaramiento por un patólogo veterinario con certificado de especialidad ACVP. Se puntuó este estudio de manera diferente que el ejemplo anterior. Se determinó el

25 número de capas de la epidermis, desde el estrato basal al estrato granuloso. Basándose en los resultados, se puntuaron las secciones como sigue: 0- normal (2-3 capas), 1engrosamiento leve (3-4 capas), 2- engrosamiento moderado (4-6 capas) y 3- engrosamiento grave (>6 capas). [0414] La administración de IL-22 a 2,5, 5, 10 µg/día dio como resultado

30 engrosamiento epidérmico (véase la Tabla 10). Además, los animales tratados con IL22 tenían infiltrados de células mononucleares en la epidermis. Estos infiltrados no se observaron en los controles tratados con vehículo. La administración simultánea de 100 µg de IL-22RA2 (3 inyecciones) redujo la cantidad de engrosamiento epidérmico en ratones tratados con 5 µg de IL-22/día.

[0415] Se muestran las puntuaciones de acantosis de engrosamiento epidérmico por grupos en la Tabla 10 siguiente como sigue:

Tabla 10

Nº de grupo

N= Bomba Inyección Acantosis media

1

8 2,5 µg de IL22/día 100 µl de vehículo inyecciones) (3 1,1

2

8 2,5 µg de IL22/día 100 µg de IL-22RA2 inyecciones) (3 0,8

3

8 5 µg de IL22/día 100 µl de vehículo inyecciones) (3 2,0

4

8 5 µg de IL22/día 100 µg de IL-22RA2 inyecciones) (3 0,6

5

8 10 µg de IL22/día 100 µl de vehículo inyecciones) (3 2,0

6

8 10 µg de IL22/día IL-22RA2 (3 inyecciones) 1,9

7

8 Vehículo 100 µl de vehículo inyecciones) (3 0,0

8

8

Vehículo 100 µg de IL-22RA2 inyecciones) (3 0,0

Se observaron también engrosamiento epidérmico e infiltrados

5 inmunitarios en pieles psoriáticas humanas. El fenotipo cutáneo observado en inyección subcutánea con IL-22 indicaba adicionalmente el papel potencial de IL-22 en la patogénesis de la psoriasis. El hecho de que IL-22RA2-Fc pueda neutralizar el fenotipo cutáneo sugiere el uso potencial de otros antagonistas de IL-22, tales como anticuerpo neutralizante o receptor soluble de IL-22, para el tratamiento de psoriasis y

10 otras enfermedades inducidas por IL-22.

C. Efecto de receptores solubles IL-22RA y anticuerpos dirigidos contra IL-22RA sobre la acantosis inducida por IL-22 o IL-20 [0416] Se evalúa la actividad de receptores solubles IL-22RA, o un anticuerpo de IL-22RA, para inhibir la actividad in vivo de IL-22 o IL-20 de manera similar, usando

15 el criterio de valoración histológico de acantosis causada por infusión subcutánea de proteína IL-22 o IL-20. En un ejemplo de este modelo, se implantaron en ratones C3H/HEJ minibombas osmóticas subcutáneas como se describen en los ejemplos 12(A) y 12(B) anteriores. Durante el periodo de exposición a IL-22 o IL-20, se tratan los ratones mediante inyección con el anticuerpo monoclonal purificado de IL-22 o se inyectan de modo similar con vehículo como control. Al final del periodo de infusión con IL-22, se muestrearía la piel en la zona de la bomba para análisis histológico. De forma similar al receptor soluble IL-22RA2, el antagonista de receptor de IL-22, el antagonista de IL-22 o IL-20, los receptores solubles IL-22RA o anticuerpos dirigidos contra IL-22RA de la presente invención se espera que muestren una reducción del engrosamiento epidérmico e infiltrados de células inmunitarias causados por IL-22 o IL-20, y por tanto que sean útiles como antagonistas de IL-22 o IL-20 como agentes terapéuticos para psoriasis y otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-22 o IL-20. Ejemplo 14 La IL-22 está regulada positivamente en muestras de piel psoriática humana Muestras de ARN: [0417] Se obtuvieron muestras de piel normal así como de piel de pacientes psoriáticos. Las últimas incluían piel implicada en psosiaris de tipo placa estable y piel no implicada adyacente. Se aisló el ARN de muestras de piel humana usando procedimientos convencionales. Se ensayó la integridad y calidad de las muestras de ARN en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania).

Cebadores y sondas para PCR-FI cuantitativa [0418] Se ha descrito anteriormente una PCR-FI cuantitativa inmediata que usa el sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) (véanse Heid, C.A. y col., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. y col., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. y col., Endocrinology 139:4756-4764, 1998. Este procedimiento incorpora el uso de una sonda específica de gen que contiene tintes tanto informador como desactivador de fluorescencia. Cuando la sonda está intacta, se anula la emisión del tinte informador debido a la estrecha proximidad del tinte desactivador. Durante la extensión por PCR usando cebadores de codificación e inversos específicos de gen adicionales, se escinde la sonda por la actividad nucleolítica 5’ a 3’ de la ADN polimerasa rTth, que libera el tinte informador de la sonda dando como resultado un aumento de la emisión fluorescente. [0419] Los cebadores y sondas usados para los análisis de PCR-FI cuantitativa inmediata de la expresión de IL-22 se diseñaron usando el software de diseño de cebador Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores de IL-22 humana se diseñaron extendiendo una conexión intrón-exón para eliminar la amplificación de ADN genómico. El cebador de codificación, ZC42459 (SEC DE ID. Nº 22) y el cebador inverso, ZC42458 (SEC DE ID. Nº 23), se usaron en una reacción PCR (a continuación) a una concentración 800 nM para sintetizar un producto de 72 pb. Se sintetizó la correspondiente sonda de IL-22, ZC42460 (SEC DE ID. Nº 24) y se marcó en el laboratorio de ZymoGenetics. Se marcó la sonda de IL-22 en el extremo 5’ con un tinte fluorescente informador (6-carboxifluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3’ con un tinte desactivador de fluorescencia (6carboxitetrametilrrodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems).

C. PCR-FI cuantitativa inmediata [0420] Se determinaron los niveles relativos de ARNm de IL-22 analizando las muestras de ARN total usando el kit TaqMan EZ RTPCR Core Reagents (PE Applied Biosystems). Se preparó el transcrito con desprendimiento de IL-22 para generar una curva patrón usada para cuantificación. La curva consistía en diluciones en serie de 10 veces en el intervalo de aproximadamente 108 a 103 copias totales del mensaje completo de IL-22, con cada punto de la curva patrón analizado por triplicado. Se analizaron también en las muestras de ARN total de la piel por triplicado los niveles de transcrito de IL-22 humano y los niveles de hGUS como control endógeno. En un volumen total de 25 µl, se sometió cada muestra de ARN a una reacción PCR-FI TaqMan EZ (PE Applied Biosystems) que contenía: aproximadamente 25 ng de ARN total en agua tratada con DEPC (exenta de ADNasa/ARNasa); cebadores apropiados (ZC 42459 (SEC DE ID. Nº 22) y ZC 42458 (SEC DE ID. Nº 23) aproximadamente 800 nM; sonda apropiada (ZC 42460 (SEC DE ID. Nº 24) aproximadamente 100 nM); 1X tampón TaqMan EZ; acetato de manganeso 3 mM; 300 µM de cada d-CTP, d-ATP y d-GTP y 600 µM de d-UTP; ADN polimerasa rTth (0,1 U/µl) y AmpErase UNG (0,01 U/µl). Las condiciones de ciclación térmica de PCR eran como sigue: una etapa de tratamiento UNG inicial de un ciclo a 50ºC durante 2 minutos, seguido de una etapa de transcripción inversa (TI) de un ciclo a 60ºC durante 30 minutos, seguido de una desactivación de la etapa de UNG de un ciclo a 95ºC durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de amplificación a 94ºC durante 20 segundos y de 60ºC durante 1 minuto. [0421] Se determinaron los niveles relativos de ARN de IL-22 usando el procedimiento de curva patrón como se describe por el fabricante, PE Biosystems (Boletín del usuario nº 2: Sistema de detección de secuencia ABI Prism 7700, cuantificación relativa de la expresión génica, 11 de diciembre de 1997). Se usaron las medidas de hGUS para normalizar los niveles de IL-22. Se muestran los datos en la Tabla 11 siguiente.

Tabla 11

Muestra de piel

lL-22

Normal

0

No implicada

0

Implicada

1149

[0422] El ARN de IL-22 era indetectable en muestras de piel de pacientes

5 normales o de zonas no implicadas. En contraposición, había una drástica regulación positiva del mensaje de IL-22 en la piel implicada de pacientes de psoriasis. Estos datos apoyan una fuerte asociación de la enfermedad con IL-22 para psoriasis humana. [0423] Se mostró expresión en exceso de IL-22 en lesiones psoriáticas humanas, sugiriendo que la IL-22 está implicada en la psoriasis humana. Además, como se

10 describe en la presente memoria, la expresión en exceso de IL-22 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico e implicación autoinmunitaria indicativos de un fenotipo psoriático, y además la inyección de IL-22 en ratones normales mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunitarias indicativos de un fenotipo psoriático, que se anuló por el antagonista de receptor

15 soluble IL-22RA2. Dichos datos in vivo sugieren adicionalmente que la IL-22 proinflamatoria está implicada en la psoriasis. Como tales, los antagonistas de la actividad de IL-22, tales como los anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22 humana de la presente invención, así como los receptores solubles y anticuerpos de la misma, son útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias,

20 particularmente como antagonistas de IL-22 en el tratamiento de psoriasis. Además, los antagonistas de la actividad de IL-22, tales como los anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22 humana de la presente invención, así como los receptores solubles y anticuerpos de la misma, son útiles en el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias, por ejemplo, como antagonistas de IL-22 en el

25 tratamiento de dermatitis atópica, EII, colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide y artritis psoriática, enfermedad respiratoria en adultos (ERA), choque séptico, insuficiencia multiorgánica, lesión inflamatoria pulmonar tal como asma o bronquitis, neumonía bacteriana, psoriasis, eccema, dermatitis atópica y de contacto y enfermedad inflamatoria intestinal tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn.

30 Ejemplo 15 La IL-22 está regulada positivamente en muestras de piel de dermatitis atópica humana

[0424] Se obtuvieron muestras de piel normal (n= 4) así como de piel de pacientes con dermatitis atópica (n= 4). Se aisló ARN de muestras de piel humana usando procedimientos convencionales. Se ensayó la integridad y calidad de las muestras de ARN en el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania).

Cebadores y sondas para PCR-FI cuantitativa [0425] Se ha descrito anteriormente una PCR-FI cuantitativa inmediata que usa el sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) (véase Heid, C.A. y col., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson,

U.E.M.

y col., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. y col., Endocrinology 139:4756-4764, 1998. Este procedimiento incorpora el uso de una sonda específica de gen que contiene tintes tanto informador como desactivador de fluorescencia. Cuando la sonda está intacta, se anula la emisión del tinte informador debido a la estrecha proximidad del tinte desactivador. Durante la extensión por PCR usando cebadores de codificación e inversos específicos de gen adicionales, se escinde la sonda por la actividad nucleolítica 5’ a 3’ de la ADN polimerasa rTth, que libera el tinte informador de la sonda dando como resultado un aumento de la emisión fluorescente. [0426] Los cebadores y sondas usados para los análisis de PCR-FI cuantitativa inmediata de la expresión de IL-22 se diseñaron usando el software de diseño de cebador Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Los cebadores de IL-22 humana se diseñaron extendiendo una conexión intrón-exón para eliminar la amplificación de ADN genómico. El cebador de codificación, ZC42459 (SEC DE ID. Nº 22) y el cebador inverso, ZC42458 (SEC DE ID. Nº 23), se usaron en una reacción PCR (a continuación) a una concentración 800 nM para sintetizar un producto de 72 pb. Se sintetizó la correspondiente sonda de IL-22, ZC42460 (SEC DE ID. Nº 24) y se marcó en el laboratorio de ZymoGenetics. Se marcó la sonda de IL-22 en el extremo 5’ con un tinte fluorescente informador (6-carboxifluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3’ con un tinte desactivador de fluorescencia (6carboxitetrametilrrodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems).

C.

PCR-FI cuantitativa inmediata [0427] Se determinaron los niveles relativos de ARNm de IL-22 analizando las muestras de ARN total usando el kit TaqMan EZ RTPCR Core Reagents (PE Applied Biosystems). Se preparó el transcrito con desprendimiento de IL-22 para generar una curva patrón usada para cuantificación. La curva consistía en diluciones en serie de 10 veces en el intervalo de aproximadamente 108 a 103 copias totales del mensaje

completo de IL-22, con cada punto de la curva patrón analizado por triplicado. Se analizaron también en las muestras de ARN total de la piel por triplicado los niveles de transcrito de IL-22 humano y los niveles de hGUS como control endógeno. En un volumen total de 25 µl, se sometió cada muestra de ARN a una reacción PCR-FI TaqMan EZ (PE Applied Biosystems) que contenía: aproximadamente 25 ng de ARN total en agua tratada con DEPC (exenta de ADNasa/ARNasa); cebadores apropiados (ZC 42459 (SEC DE ID. Nº 22) y ZC 42458 (SEC DE ID. Nº 23) aproximadamente 800 nM; sonda apropiada (ZC 42460 (SEC DE ID. Nº 24) aproximadamente 100 nM); 1X tampón TaqMan EZ; acetato de manganeso 3 mM; 300 µM de cada d-CTP, d-ATP y d-GTP y 600 µM de d-UTP; ADN polimerasa rTth (0,1 U/µl); y AmpErase UNG (0,01 U/µl). Las condiciones de ciclación térmica de PCR eran como sigue: una etapa de tratamiento UNG inicial de un ciclo a 50ºC durante 2 minutos, seguido de una etapa de transcripción inversa (TI) de un ciclo a 60ºC durante 30 minutos, seguido de una desactivación de la etapa de UNG de un ciclo a 95ºC durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de amplificación a 94ºC durante 20 segundos y de 60ºC durante 1 minuto. [0428] Se determinaron los niveles relativos de ARN de IL-22 usando el procedimiento de curva patrón como se describe por el fabricante, PE Biosystems (Boletín del usuario nº 2: Sistema de detección de secuencia ABI Prism 7700, cuantificación relativa de la expresión génica, 11 de diciembre de 1997). Se usaron las medidas de hGUS para normalizar los niveles de IL-22. [0429] El ARNm de IL-22 era indetectable en muestras de piel de pacientes normales. En contraposición, había una drástica regulación positiva del mensaje de IL2 en 3 de las 4 muestras de pacientes de dermatitis atópica (aproximadamente 4002300 copias). Estos datos apoyan una fuerte asociación de la enfermedad con IL-22 para dermatitis atópica humana. [0430] Se mostró expresión en exceso de IL-22 en pieles con dermatitis atópica humana, sugiriendo que la IL-22 está implicada en la dermatitis atópica humana. Además, como se describe en la presente memoria, la expresión en exceso de IL-22 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunitarias indicativos de un fenotipo de dermatitis atópica, y además la inyección de IL-22 en ratones normales mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunitarias indicativos de un fenotipo de dermatitis atópica, que se anuló por el antagonista de receptor soluble IL-22RA2. Dichos datos in vivo sugieren adicionalmente que la IL-22 proinflamatoria está implicada en la dermatitis atópica. Como tales, los antagonistas de la actividad de IL-22, tales como los anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22 humana de la presente invención, así como los receptores solubles y anticuerpos de la misma, son útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas de IL-22 en el tratamiento de dermatitis atópica. Además, los antagonistas de la actividad de IL-22, tales como los anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22 humana de la presente invención, así como los receptores solubles y anticuerpos de la misma, son útiles en el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias, por ejemplo, como antagonistas de IL-22 en el tratamiento de dermatitis atópica, EII, colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide y artritis psoriática, enfermedad respiratoria en adultos (ERA), choque séptico, insuficiencia multiorgánica, lesión inflamatoria pulmonar tal como asma o bronquitis, neumonía bacteriana, dermatitis atópica, eccema, dermatitis atópica y de contacto y enfermedad inflamatoria intestinal tal como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn. Ejemplo 16 Anticuerpos policlonales anti-IL-22 humanos [0431] Se prepararon anticuerpos policlonales anti-IL-22 inmunizando dos conejos blancos de Nueva Zelanda hembra con el polipéptido IL-22 humano recombinante maduro purificado (restos de aminoácido 22 (Ala) a 167 (Ile) de la SEC DE ID. Nº 6), producido por células BHK (IL-22-BHK). Se administró a cada uno de los conejos una inyección intraperitoneal (ip) inicial de 200 µg de proteína purificada en coadyuvante completo de Freund seguido de inyecciones IP de recuerdo de 100 µg de péptido en coadyuvante incompleto de Freund cada tres semanas. 7 a 10 días después de la administración de la segunda inyección de recuerdo (3 inyecciones totales), se extrajo sangre a los animales y se recogió el suero. Se administraron entonces recuerdos a los animales y se extrajo sangre cada tres semanas. [0432] Se purificaron por afinidad los anticuerpos policlonales específicos deI L22 a partir de suero de conejo inmune usando una columna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB), que se preparó usando 10 mg de la proteína recombinante humana purificada específica de antígeno IL-22-BHK por g de CNBr-SEPHAROSE, seguido de 20x diálisis en PBS durante una noche. Se caracterizaron los anticuerpos específicos de IL-22 humana por ELISA usando 500 ng/ml de la proteína recombinante humana purificada IL-22-BHK como diana de anticuerpo. El límite inferior de detección (LID) del anticuerpo de conejo anti-IL-22 humana purificado por afinidad es de 280 pg/ml en su antígeno recombinante purificado específico IL-22-BHK humano.

[0433] Se caracterizaron adicionalmente los anticuerpos policlonales específicos de IL-22 por su capacidad de bloquear la actividad proliferativa celular (“ensayo de neutralización”) de IL-22-BHK humano recombinante purificado en células BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Ejemplo 2 y Ejemplo 3). Un exceso molar 50x de anticuerpos policlonales específicos de IL-22 humana era suficiente para inhibir la proliferación celular. Ejemplo 17 Anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22 humana [0434] Se prepararon anticuerpos monoclonales inmunizando 4 ratas hembra Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) con el polipéptido IL22 humano recombinante maduro purificado (restos de aminoácido 22 (Ala) a 167 (Ile) de la SEC DE ID. Nº 6), producido por células BHK (IL-22-BHK). Se administró a cada rata una inyección intraperitoneal (IP) inicial de 100 µg de proteína IL-22 recombinante humana purificada en coadyuvante completo de Freund (Pierce, Rockford, IL) seguido de inyección IP de recuerdo de 50 µg de la proteína recombinante purificada en coadyuvante incompleto de Freund cada dos semanas. 7 a 10 días después de la administración de la tercera inyección de recuerdo, se extrajo sangre a los animales y se recogió el suero. [0435] Se caracterizaron las muestras de sueros de rata específicos de IL-22 humana por ELISA usando las dianas de anticuerpo IL-22-BHK humano biotinilado 500 ng/ml, IL-22 de ratón biotinilada 500 ng/ml y muIL-22-E.coli biotinilada (R+D Systems, Minneapolis, MN). Las tres muestras de suero de rata tenían título de la diana de anticuerpo específica IL-22-BHK humano biotinilado a una dilución de 1:105 y de la diana de anticuerpo específica muIL-22-E.coli biotinilada a una dilución de 1:104. [0436] Se recogieron esplenocitos y células de nódulo linfático de dos ratas de título alto y se fusionaron con células de mieloma SP2/0 (de ratón) usando PEG 1500 en dos procedimientos de fusión separados (relación de fusión 4:1, esplenocitos a células de mieloma, “Antibodies, A Laboratory Manual”, E. Harlow and D.Lane, Cold Spring Harbor Press). Después de 10 días de crecimiento después de la fusión, se identificaron agrupamientos de hibridoma que producían anticuerpo específico mediante ELISA usando la proteína recombinante biotinilada humana IL-22BHK y la proteína recombinante biotinilada mulL-22-E.coli como dianas de anticuerpo separadas. Se analizaron adicionalmente en los agrupamientos de hibridoma positivos en ambos protocolos ELISA su capacidad de bloquear o reducir la actividad de proliferación celular (“ensayo de neutralización”) de muIL-22-E.coli recombinante purificada en células BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Ejemplo 2 y Ejemplo 3). [0437] Se clonaron los agrupamientos de hibridoma que producen resultados positivos por ELISA sólo o ELISA y “ensayo de neutralización” al menos dos veces mediante dilución limitante. [0438] Se caracterizaron los anticuerpos monoclonales purificados de medio de cultivo de tejido por su utilidad en un ELISA para la determinación cuantitativa de IL22 recombinante y nativa humana en muestras de suero de ratón y humano. Los dos anticuerpos seleccionados dieron como resultado un ensayo cuantitativo con un límite inferior de detección de aproximadamente 1 ng/ml de huIL-22-E.coli recombinante en 100% de suero humano. [0439] Se caracterizaron los anticuerpos monoclonales purificados de medio de cultivo de tejido por su capacidad de bloquear o reducir la actividad proliferativa de células (“ensayo de neutralización”) de huIL-22-E.coli o muIL-22-E.coli purificadas recombinantes en células BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Ejemplo 2 y Ejemplo 3). Se identificaron 6 anticuerpos monoclonales “neutralizantes” de esta manera. Los hibridomas que expresan los anticuerpos monoclonales de IL-22 humana descritos anteriormente se depositaron en el depósito para patentes de la American Type Tissue Culture Collection (ATCC; Manassas VA) como depósitos originales según el Tratado de Budapest y se les dieron los siguientes números de acceso ATCC: clon

266.16.1.4.4.1 (designación ATCC de depósito para patente PTA-5035); clon

266.5.1.2.2.3

(designación ATCC de depósito para patente PTA-5033); clon

267.17.1.1.4.1

(designación ATCC de depósito para patente PTA-5038); clon

267.4.1.1.4.1 (designación ATCC de depósito para patente PTA-5037); clon

266.12.6.1.3.2.1 (designación ATCC de depósito para patente PTA-5034); clon

266.19.1.10.5.2

(designación ATCC de depósito para patente PTA-5036) y clon

267.9.1.1.4.1

(designación ATCC de depósito para patente PTA-5353). Ejemplo 18 Anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22RA [0440] Se prepararon anticuerpos monoclonales inmunizando 4 ratas Lewis (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA) con la proteína de fusión recombinante escindida y purificada muIL-22RA-Fc (SEC DE ID. Nº 4). Se administró a cada rata una inyección intraperitoneal (IP) inicial de 100 µg de la proteína de fusión recombinante purificada en coadyuvante completo de Freund (Pierce, Rockford, IL) seguido de inyecciones IP de recuerdo de 50 µg de la proteína recombinante purificada en coadyuvante incompleto de Freund cada 2 semanas

durante 4 semanas. Después de las primeras 4 semanas de inmunizaciones, se administraron inyecciones IP de recuerdo de 50 µg de la proteína recombinante escindida y purificada acoplada al portador proteína hemocianina de lapa bocallave (KLH, Pierce, Rockford, IL) en coadyuvante incompleto de Freund cada 2 semanas durante 4 semanas. 7 a 10 días después de la administración de la cuarta inyección de recuerdo, se extrajo sangre a los animales y se recogió el suero. [0441] Se caracterizaron las muestras de suero de rata específico de muIL-22RA mediante ELISA usando 500 ng/ml de la proteína de fusión recombinante purificada muIL-22RA-Fc como diana de anticuerpo específica y una proteína de fusión no relacionada con diana de anticuerpo no específica. [0442] Se recogieron los esplenocitos de una rata de título alto y se fusionaron con células de mieloma SP2/0 (de ratón) en un protocolo de fusión mediado por PEG optimizado (Rockland Immunochemicals). Después de 12 días de crecimiento tras la fusión, se identificaron los agrupamientos de hibridoma productores de anticuerpo específico mediante ELISA usando 500 ng/ml de cada una de proteína de fusión recombinante muIL-22RA-Pc-Bv como diana de anticuerpo específica y una proteína de fusión no relacionada como diana de anticuerpo no específica. Se analizó adicionalmente sólo en los agrupamientos de hibridoma positivos de la diana de anticuerpo específica su capacidad de bloquear o reducir la actividad de proliferación celular (“ensayo de neutralización”) de muIL-22-E.coli purificada recombinante en células BaF3/CRF2-4/IL-22RA (Ejemplo 2 y Ejemplo 3) y la capacidad de unirse a células BaF3/CRF2-4/IL-22RA mediante análisis FACS (Ejemplo 2 y Ejemplo 3) como diana de anticuerpo. [0443] Se clonaron los agrupamientos de hibridoma que producen un resultado positivo específico en el ensayo ELISA y resultados positivos en FACS o el “ensayo de neutralización” al menos dos veces mediante dilución limitante. [0444] Se caracterizaron los anticuerpos monoclonales en medio de cultivo de tejido por su capacidad de bloquear o reducir la proliferación de células BaF3/CRF24/IL-22RA (Ejemplo 2 y Ejemplo 3) y se cultivaron en presencia de las proteínas recombinantes purificadas muIL-22-E.coli o huIL-22-BHK. Se han identificado 14 anticuerpos monoclonales “neutralizantes” y se han clonado 9 anticuerpos monoclonales. [0445] Se depositaron los hibridomas que expresan los anticuerpos monoclonales neutralizantes de IL-22RA de ratón descritos anteriormente en el depósito para patentes de la American Type Tissue Culture Collection (ATCC; Manassas VA) como

depósitos originales según el Tratado de Budapest, y se les dieron los siguientes números de acceso a ATTC: clon R2.1.1G11.1 (designación ATCC de depósito para patente PTA-6035); clon R2.1.5F4.1 (designación ATCC de depósito para patente PTA-6024); clon R2.1.5H8.1 (designación ATCC de depósito para patente PTA5 6025); clon R2.1.12G7.1 (designación ATCC de depósito para patente PTA-6036); clon R2.1.13C8.1 (designación ATCC de depósito para patente PTA-6037); clon R2.1.15E2.1 (designación ATCC de depósito para patente PTA-6038); clon R2.1.16C11.1 (designación ATCC de depósito para patente PTA-6039); clon R2.1.18C8.1 (designación ATCC de depósito para patente PTA-6040) y clon

10 R2.1.21G8.2 (designación ATCC de depósito para patente PT-6111). Ejemplo 19 Afinidad de unión de dos mAb de rata anti-Ms-IL-22RA [0446] Se inmovilizó anticuerpo de cabra específico anti-IgG-Fcγ de rata (Jackson) sobre un chip CM5 Biacore. Se optimizaó el ensayo para unir cada mAb

15 sobre la superficie de captura anti-rata y se inyectó entonces una serie de concentraciones de IL-22RA por los mAb para ver la asociación (Ka) y disociación (Kd). Después del ensayo preliminar, se observó unión no específica entre la proteína de fusión y la superficie de captura en el chip. Se adquirió un vial de IL-22RA que tenía el marcaje Fc4 escindido con trombina y se ensayó posteriormente, no mostrando

20 efectos de fondo. Después de cada proceso, se regeneró la superficie de nuevo a anticuerpo anti-rata con dos inyecciones de HCl 20 mM. Se generaron los datos para cada mAb y se usó software de evaluación (software BIAevaluation versión 3.2, Pharmacia BIAcore, Uppsala, Suecia) para valorar la cinética de la unión de anticuerpo dirigido contra IL-22RA a la proteína IL-22RA, como se muestra en la Tabla 12 a

25 continuación: Tabla 12 **Se muestran las constantes de velocidad de asociación (Ka) y disociación (Kd) en equilibrio para cada mAb anti-IL-22RA y los valores entran dentro de los límites del dispositivo. Chi2 designa la suma de los cuadrados de los restos entre las curvas de unión y las curvas de ajuste de la evaluación. Cuanto más cercano a 0, mayor confianza en los datos.

Clon R2.1.5F4.1** (designación ATCC de depósito para patente PTA-6024)

Clon R2.1.5E2.1** (designación ATCC de depósito para patente PTA-6038)

ka (M-1s-1)

1,49 x 106 ka (M-1s-1) 1,76 x 106

kd (s-1)

1,70 x 10-4 kd (s-1) 2,55 x 10-4

KA (M-1)

8,76 x 109 KA (M-1) 6,66 x 109

KD (M)

1,14 x 10-10 KD (M) 1,504 x 10-10

Chi2

2,08 Chi2 1,5

[0447] Como se muestra en la Tabla 12, ambos mAb anti-IL-22RA se unen fuertemente a la proteína IL-22RA, como se evidencia por la unión a concentración picomolar a IL-22RA (marcaje de Fc4 escindido con trombina). Este dato se muestra con una buena confianza basada en valores bajos de Chi2 y muestra que el mAb clon

5 R2.1.5F4.1 tiene una afinidad ligeramente mayor por el receptor IL-22RA. Ejemplo 20 Análisis inmunohistoquímico de la expresión de proteína IL-22 in vivo en muestras de tejido

A. Sumario

10 [0448] Se consiguió el análisis inmunohistoquímico (IHQ) de la expresión y localización de la proteína IL-22 usando anticuerpo monoclonal anti-IL-22 humano (anti-hIL-22) (mAb 266.19.1.10.5.2) en las siguientes muestras de tejido: Multi-Normal Grid y Tumor Grid humanas; pancreatitis humana, muestras de enfermedad pulmonar y renal; muestras de piel psoriática humana; INS IL-22 TG (expresada a

15 partir de promotor de insulina de rata) y páncreas de ratón WT; muestra de piel de ratón muIL-22-EµLCK TG y WT y muestra de colon de ratón DSS (WT e IL-22 KO). Además, se comparó el patrón de tinción del anticuerpo monoclonal anti-hIL-22 mAb

266.19.1.10.5.2 (Ejemplo 17) frente al anticuerpo policlonal (de conejo anti-hIL-22) (Ejemplo 16).

20 [0449] Se ensayaron los anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22 humana de rata mAb 266.16.1.4.4.1 y mAb 266.19.1.10.5.2 (Ejemplo 17) y se mostró que tiñen la mayoría de células BHK/IL-22 humanas (>50%) pero también algunas BHK/IL-22 de ratón (1-5%), y se usaron para investigar la distribución en tejido y expresión de IL22 en ambas muestras de paciente humano y modelo animal, y se usaron para

25 comparar el patrón de tinción con anticuerpo policlonal de conejo para confirmar los resultados.

B. Materiales y procedimientos [0450] Se seccionaron a 5 µm células y tejidos fijados con formalina y embebidos en parafina de fuentes humanas y modelos animales de ratón. Las células incluían

30 células BHL que expresan IL-22 humana o de ratón y de tipo silvestre como control positivo y control negativo, respectivamente. Los tejidos humanos incluían un portaobjetos de control multitejido (NormalGrid™; Biomeda, Foster City, CA) con 50 secciones de diversos tejidos humanos normales (por ejemplo, cerebro, glándula pituitaria, glándula suprarrenal, mama, riñón, corazón, estómago, intestino delgado, intestino grueso, hígado fetal, hígado, piel, páncreas, pulmón, amigdala, ovario, testículo, próstata, útero, placenta, tiroides y bazo); un portaobjetos de control multitejido (TumorGrid™; Biomeda, Foster City, CA) con 50 secciones de diversos tumores humanos (por ejemplo, adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma de hígado, adenocarcinoma de riñón, adenocarcinoma de colon, adenocarcinoma de mama, adenocarcinoma de tiroides, adenocarcinoma de estómago, adenocarcinoma de próstata, adenocarcinoma de páncreas, adenocarcinoma de ovario, linfoma, melanoma, sarcoma de Ewing, sarcoma epitelioide, sarcoma MFH, rabdosarcoma, carcinoide, carcinoma indiferenciado, mesotelioma, teretoma y seminoma); carcinoma de pulmón de CHTN (Cooperation Human Tissue Network, Cleveland, Ohio); páncreas normal, páncreas con pancreatitis crónica, pulmón con inflamación perivascular crónica, riñones con glomeruloesclerosis multifocal, glomerulonefritis mesangioproliferativa o glomérulos escleróticos de fibrosis intersticial de NDRI (National Disease Research Interchange, Filadelfia, PA); y muestras de piel psoriática de ser humano. Los tejidos de ratón incluían cólones del modelo animal de enfermedad inflamatoria intestinal (modelo de DSS dado a conocer en la presente memoria, ratones hembra Swiss Webster) y de IL-20 WT y KO del modelo animal de colitis (ratones con DSS, tipo silvestre y ratones hembra con IL-20 desactivado génicamente (IL-20)) tratados con vehículo o 4% de DSS en el agua de bebida durante 7 días; y muestras de piel de modelos animales transgénicos (TG) incluyendo animales de control y TG de mIL-22EµLCK TG y mIL-22-INS. Se tiñó una sección por bloque/portaobjetos con hematoxilina y eosina (H&E) para examen histológico y se tiñó inmunohistoquímicamente la sección consiguiente para expresión y localización de la proteína IL-22. [0451] Para inmunohistoquímica, se dispusieron secciones de célula y tejido en portaobjetos de microscopio ChemMate™ Capillary Gap Plus (BioTek, Winooski, Vermont), se secaron en estufa a 60ºC durante 60 minutos y se desparafinaron usando condiciones estándar de 3 x 5 minutos en xileno, 4 minutos en 100% de EtOH, 3 minutos en 100% de EtOH y 2 minutos en 95% de EtOH. Se sometieron entonces las secciones de tejido a un proceso de recuperación de epítopo inducido por enzima de 20 minutos a 37ºC con pepsina (NeoMarkers Fremont CA) seguido de una etapa de bloqueo de avidina/biotina realizada según las instrucciones de los fabricantes (Zymed, South San Francisco, CA). Se emplearon los protocolos inmunohistoquímicos de inmunotinción automatizada TechMate 500™ y de inmunoperoxidasa (IP) con sistema de detección por complejo de avidina-biotina (Ventana Biotek Systems, Tucson, AZ) para la tinción. La inmunotinción automatizada TechMate 500™ empleaba el principio de acción capilar y el protocolo IP utilizaba un tipo de inmunotinción designada como la técnica “sándwich”. Se prebloquearon las secciones con suero de cabra normal al 5% (Vector, Burlingame CA) en PBS durante 10 minutos, seguido de 1x lavado con tampón 1 (Signet, Dedham MA) y se incubaron entonces con un anticuerpo primario contra IL-22 (mAb 266.19.1.10.5.2) (Ejemplo 17), purificado por PAS a 2,04 mg/ml, y se diluyó a 1:800 durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido de 5x lavado con tampón 1. Se diluyó el anticuerpo primario en tampón de dilución de anticuerpo TechMate 500™ (Ventana). Se usó IgG de cabra anti-rata biotinilada (Vector) diluida a 1:200 más suero de cabra normal al 5% y leche desnatada desecada al 2,5% en PBS como anticuerpo de ligamiento secundario durante 25 minutos a temperatura ambiente, seguido de 1 x lavado con tampón 1 y 1x lavado con tampón 2 y 3 (Signet). Se sometieron entonces las secciones de tejido a 3 x 7 minutos de bloqueo con peróxido de hidrógeno (PH) al 3% (Ventana) seguido de 3x lavado con tampón 2 y 3. Se efectuó el marcado con inmunoperoxidasa con un kit DAB de peróxidos (Ventana), incubando con complejo de avidina-biotina (ABC) durante 30 minutos, seguido de 5X lavado con tampón 2 y 3 y diaminobencidina (DAB) durante 4 x 4 minutos seguido de 2x lavado con tampón 2 y 3 y 1x lavado con agua (Signet, nº de cat. 2340). Se contratiñeron entonces los tejidos con verde de metilo (Dako, nº de cat. S1962) durante 10 minutos seguido de 2x lavado con tampón 2 y 3 y 3x lavado con agua. El control incluía sueros primarios no inmunes, usando el control de isotipo primario de rata (Zymed) para reemplazar al anticuerpo primario. [0452] Se observó inmunotinción usando un microscopio Olympus BH-2 y se capturaron imágenes por la cámara digital CoolSNAP HQ (Roper Scientific, Tucson, AZ).

C. Resultados [0453] Líneas celulares de control positivo y negativo: mAb 266.19.1.10.5.2, un anticuerpo monoclonal anti-hIL-22, demostró tinción positiva tanto en células BHK que expresan IL-22 humana (+++) como en células BHK que expresan IL-22 de murino (+), y ninguna tinción en células BHK de tipo silvestre (-). Ninguna de las líneas celulares de BHK positivas y negativas teñidas con control negativo de isotipo de rata para reemplazar el anticuerpo primario mostraron tinción (-), lo que indicaba que el anticuerpo es específico del ligando IL-22. El anticuerpo no tenía inmunorreactividad cruzada con IL-22 humana y de ratón. [0454] Tejidos humanos: Se examinaron multi-Normal Grid y Tumor Grid humanos; muestras de enfermedad de páncreas, pulmón y riñón y muestras de piel psoriática humana. Estos tejidos humanos incluían 1) cerebro, glándula pituitaria, glándula suprarrenal, mama, riñón, corazón, estómago, intestino delgado, intestino grueso, hígado fetal, hígado, piel, páncreas, pulmón, amígdala, ovario, útero, testículo, placenta, tiroides y bazo en los portaobjetos de control multitejido (NormalGrid™)/tejidos humanos normales; 2) adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma de hígado, adenocarcinoma de riñón, adenocarcinoma de tiroides, adenocarcinoma de estómago, adenocarcinoma de próstata, adenocarcinoma de páncreas, adenocarcinoma de ovario, linfoma, melanoma, sarcoma de Ewing, sarcoma epitelioide, sarcoma MFH, rabdosarcoma, carcinoide, carcinoma indiferenciado, mesotelioma, teratoma y seminoma en los portaobjetos de control multitejido (TumorGrid™)/tejidos anormales/tumores humanos; 3) páncreas normal, páncreas con pancreatitis crónica, pulmón con inflamación perivascular crónica, carcinoma pulmonar, riñón con glomeruloesclerosis multifocal, riñón con glomerulonefritis mesangioproliferativa, riñón con glomérulos escleróticos de fibrosis intersticial de CHTN y/o NDRI. [0455] 4) Tejidos de ratón: Se examinaron páncreas de ratón INS IL-22 TG y WT. Las células diseminadas por los islotes en el páncreas de INS IL-22 TG demostarron una fuerte tinción positiva (+++) con el mAb 266.19.1.10.5.2 y el páncreas WT no mostró tinción (-). [0456] Comparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Se mostró que el anticuerpo policlonal anti-IL-22 (Ejemplo 16) era sensible, mientras que el anticuerpo monoclonal mAb 266.19.1.10.5.2 era específico. El anticuerpo policlonal mostró tinción positiva en células BHK que expresan IL-22 humana (+++), en células BHK que expresan IL-22 de murino (+), en diversas muestras de tejido humano y de ratón (+) y en los islotes de ratones INS mIL-22 TG (+++). Un mayor porcentaje de los islotes de los transgénicos (frente al tipo silvestre) contenía tinción positiva. La tinción en los islotes transgénicos estaba generalmente distribuida por el islote (+++) mientras que la tinción en los islotes de tipo silvestre estaba generalmente limitada a la perifera del islote (+). Sin embargo, este anticuerpo mostró también tinción no específica en células de control negativas BHK WT (+).

[0457] El mAb 266.19.1.10.5.2 mostró tinción positiva en células BHK que expresan IL-22 humana (+++), en células BHK que expresan IL-22 de murino (+) y en los islotes de ratones INC mIL-22 TG (+++). La tinción en los islotes transgénicos estaba distribuida generalmente por el islote (+++) mientras que los islotes de tipo silvestre demostraron tinción negativa (-). Ejemplo 21 La IL-20 está regulada positivamente en muestras de piel psoriática humana

A. Muestras de ARN: [0458] Se obtuvieron muestras de piel normal así como de piel de pacientes psoriáticos. La última incluía piel implicada en psoriasis y piel no implicada adyacente. Se aisló el ARN de muestras de piel humana usando procedimientos convencionales. Se ensayó la integridad y calidad de las muestras de ARN en el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania).

B. Cebadores y sondas para PCR-FI cuantitativa [0459] Se ha descrito anteriormente una PCR-FI cuantitativa inmediata que usa el sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) (véanse Heid, C.A. y col., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. y col., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. y col., Endocrinology 139:4756-4764, 1998. Este procedimiento incorpora el uso de una sonda específica de gen que contiene tanto tintes informador como desactivador de fluorescencia. Cuando la sonda está intacta, se anula la emisión del tinte informador debido a la estrecha proximidad del tinte desactivador. Durante la extensión por PCR usando cebadores de codificación e inversos específicos de gen adicionales, se escinde la sonda por la actividad nucleolítica 5’ a 3’ de la ADN polimerasa rTth, que libera el tinte informador de la sonda dando como resultado un aumento de la emisión fluorescente. [0460] Los cebadores y sondas usados para los análisis de PCR-FI inmediata de la expresión de IL-20 se diseñaron usando el software de diseño de cebador Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). El cebador de codificación, ZC40541 (SEC DE ID. Nº 25) y el cebador inverso, ZC40542 (SEC DE ID. Nº 26), se usaron en una reacción PCR (a continuación) a una concentración 800 nM para sintetizar un producto de 71 pb. Se sintetizó la correspondiente sonda de IL-20 TaqMan®, ZC40544 (SEC DE ID. Nº 27) y se marcó por PE Applied Biosystems. Se marcó la sonda de IL-20 en el extremo 5’ con un tinte fluorescente informador (6carboxifluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3’ con un tinte desactivador de fluorescencia (6-carboxitetrametilrrodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems).

C. PCR-FI cuantitativa inmediata [0461] Se determinaron los niveles relativos de ARNm de IL-20 analizando las muestras de ARN total usando el kit TaqMan EZ RTPCR Core Reagents (PE Applied Biosystems). Se preparó el transcrito con desprendimiento de IL-20 para generar una curva patrón usada para cuantificación. La curva consistía en diluciones en serie de 10 veces en el intervalo de aproximadamente 108 a 103 copias totales del mensaje completo de IL-20, con cada punto de la curva patrón analizado por triplicado. Se analizaron también en las muestras de ARN total de la piel por triplicado los niveles de transcrito de IL-20 humano y los niveles de hGUS como control endógeno. En un volumen total de 25 µl, se sometió cada muestra de ARN a una reacción PCR-FI TaqMan EZ (PE Applied Biosystems) que contenía: aproximadamente 25 ng de ARN total en agua tratada con DEPC (exenta de ADNasa/ARNasa); cebadores apropiados (ZC 40541 (SEC DE ID. Nº 25) y ZC 40542 (SEC DE ID. Nº 26) aproximadamente 800 nM; sonda apropiada (ZC40544 (SEC DE ID. Nº 27) aproximadamente 100 nM); 1X tampón TaqMan EZ; acetato de manganeso 3 mM; 300 µM de cada d-CTP, d-ATP y d-GTP y 600 µM de d-UTP; ADN polimerasa rTth (0,1 U/µl); y AmpErase UNG (0,01 U/µl). Las condiciones de ciclación térmica de PCR eran como sigue: una etapa de tratamiento UNG inicial de un ciclo a 50ºC durante 2 minutos, seguido de una etapa de transcripción inversa (TI) de un ciclo a 60ºC durante 30 minutos, seguido de una desactivación de la etapa de UNG de un ciclo a 95ºC durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de amplificación a 94ºC durante 20 segundos y de 60ºC durante 1 minuto. [0462] Se determinaron los niveles relativos de ARN de IL-20 usando el procedimiento de curva patrón como se describe por el fabricante, PE Biosystems (Boletín del usuario nº 2: Sistema de detección de secuencia ABI Prism 7700, cuantificación relativa de la expresión génica, 11 de diciembre de 1997). Se usaron las medidas de hGUS para normalizar los niveles de IL-20. Se muestran los datos en la Tabla 13 siguiente.

Tabla 13

Muestra de piel

IL-20

Normal

2903

No implicada

7233

Implicada

27.695

[0463] Aunque el ARNm de IL-20 era detectable en muestras de piel de pacientes

normales o de zonas no implicadas, había regulación positiva del mensaje de IL-20 en la piel implicada de pacientes psoriáticos. Las subunidades de receptor de IL-20, incluyendo IL-20RA, IL-22RA (IL-22RA) e IL-20RB, se expresaban en piel normal y enferma humana. Estos datos apoyan una fuerte asociación de la enfermedad con IL-20 en psoriasis humana. [0464] Se mostró expresión en exceso de IL-20 en lesiones psoriáticas humanas, sugiriendo que la IL-20 está implicada en la psoriasis. Además, como se describe en la presente memoria, la expresión en exceso de IL-20 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunitarias indicativos de un fenotipo psoriático. Dichos datos in vivo sugieren adicionalmente que la IL-20 está implicada en la psoriasis. Como tales, los antagonistas de la actividad de IL-20, tales como anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22RA de la presente invención, así como receptores solubles y anticuerpos de los mismos y anticuerpos monoclonales y neutralizantes de IL-20, son útiles terapéuticamente como antagonistas de IL-20 en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como psoriasis así como otras indicaciones como se dan a conocer en la presente memoria. Ejemplo 22 La IL-20 está regulada positivamente en muestras de piel con dermatitis atópica humana

A. Muestras de ARN: [0465] Se obtuvieron muestras de piel normal así como de piel de pacientes con dermatitis atópica. Se aisló el ARN de muestras de piel humana usando procedimientos convencionales. Se ensayó la integridad y calidad de las muestras de ARN en el Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania).

B. Cebadores y sondas para PCR-FI cuantitativa [0466] Se ha descrito anteriormente una PCR-FI cuantitativa inmediata que usa el sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) (véanse Heid, C.A. y col., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. y col., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. y col., Endocrinology 139:4756-4764, 1998. Este procedimiento incorpora el uso de una sonda específica de gen que contiene tanto tintes informador como desactivador de fluorescencia. Cuando la sonda está intacta, se anula la emisión del tinte informador debido a la estrecha proximidad del tinte desactivador. Durante la extensión por PCR usando cebadores de codificación e inversos específicos de gen adicionales, se escinde la sonda por la actividad nucleolítica 5’ a 3’ de la ADN polimerasa rTth, que libera el tinte informador de la sonda dando como resultado un aumento de la emisión fluorescente. [0467] Los cebadores y sondas usados para los análisis de PCR-FI inmediata de la expresión de IL-20 se diseñaron usando el software de diseño de cebador Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). El cebador de codificación, ZC40541 (SEC DE ID. Nº 25) y el cebador inverso, ZC40542 (SEC DE ID. Nº 26), se usaron en una reacción PCR (a continuación) a una concentración 800 nM para sintetizar un producto de 71 pb. Se sintetizó la correspondiente sonda TaqMan® de IL20, ZC40544 (SEC DE ID. Nº 27) y se marcó por PE Applied Biosystems. Se marcó la sonda de IL-20 en el extremo 5’ con un tinte fluorescente informador (6carboxifluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) y en el extremo 3’ con un tinte desactivador de fluorescencia (6-carboxitetrametilrrodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems).

C. PCR-FI cuantitativa inmediata [0468] Se determinaron los niveles relativos de ARNm de IL-20 analizando las muestras de ARN total usando el kit TaqMan EZ RTPCR Core Reagents (PE Applied Biosystems). Se preparó el transcrito con desprendimiento de IL-20 para generar una curva patrón usada para cuantificación. La curva consistía en diluciones en serie de 10 veces en el intervalo de aproximadamente 108 a 103 copias totales del mensaje completo de IL-20, con cada punto de la curva patrón analizado por triplicado. Se analizaron también en las muestras de ARN total de la piel por triplicado los niveles de transcrito de IL-20 humano y los niveles de hGUS como control endógeno. En un volumen total de 25 µl, se sometió cada muestra de ARN a una reacción PCR-FI TaqMan EZ (PE Applied Biosystems) que contenía: aproximadamente 25 ng de ARN total en agua tratada con DEPC (exenta de ADNasa/ARNasa); cebadores apropiados (ZC 40541 (SEC DE ID. Nº 25) y ZC 40542 (SEC DE ID. Nº 26) aproximadamente 800 nM; sonda apropiada (ZC40544 (SEC DE ID. Nº 27) aproximadamente 100 nM); 1X tampón TaqMan EZ; acetato de manganeso 3 mM; 300 µM de cada d-CTP, d-ATP y d-GTP y 600 µM de d-UTP; ADN polimerasa rTth (0,1 U/µl); y AmpErase UNG (0,01 U/µl). Las condiciones de ciclación térmica de PCR eran como sigue: una etapa de tratamiento UNG inicial de un ciclo a 50ºC durante 2 minutos, seguido de una etapa de transcripción inversa (TI) de un ciclo a 60ºC durante 30 minutos, seguido de una desactivación de la etapa de UNG de un ciclo a 95ºC durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de amplificación a 94ºC durante 20 segundos y de 60ºC durante 1 minuto. [0469] Se determinaron los niveles relativos de ARN de IL-20 usando el procedimiento de curva patrón como se describe por el fabricante, PE Biosystems (Boletín del usuario nº 2: Sistema de detección de secuencia ABI Prism 7700, cuantificación relativa de la expresión génica, 11 de diciembre de 1997). Se usaron las medidas de hGUS para normalizar los niveles de IL-20. [0470] El ARNm de IL-20 era detectable a un bajo nivel (aproximadamente 800 copias) en muestras de piel. En contraposición, había regulación positiva en pieles de pacientes con dermatitis atópica (aproximadamente 8600 copias). Las subunidades de receptor de IL-20, incluyendo IL-20RA, IL-22RA e IL-20RB, se expresan en piel normal y enferma humana. Estos datos apoyan una fuerte asociación de IL-20 con la dermatitis atópica humana. Se mostró expresión en exceso de IL-20 en pieles con dermatitis atópica humana, sugiriendo que la IL-20 está implicada en la dermatitis atópica humana. Además, como se describe en la presente memoria, la expresión en exceso de IL-20 en ratones transgénicos mostró engrosamiento epidérmico e implicación de células inmunitarias indicativos de un fenotipo de dermatitis atópica. Dichos datos in vivo sugieren adicionalmente que la IL-20 está implicada en la dermatitis atópica. Como tales, los antagonistas de la actividad de IL-20, tales como los anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22RA humana de la presente invención, así como receptores solubles y anticuerpos de los mismos y anticuerpos monoclonales y neutralizantes anti-IL-22RA humana, son útiles terapéuticamente como antagonistas de IL-20 en el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como dermatitis atópica, así como otras indicaciones como se da a conocer en la presente memoria. Ejemplo 23 Regulación positiva de IL-8 por IL-20 [0471] Se sembraron queratinocitos neonatales epidérmicos humanos (NHEK) normales (de Clonetics) en el paso 2 y se cultivaron hasta confluencia en placas de cultivo de tejido de 12 pocillos. Se adquirió KGM (medio de crecimiento de queratinocitos) en Clonetics. Cuando las células alcanzaron la confluencia, se lavaron con medio KGM menos factores de crecimiento = KBM (medio basal de queratinocitos). Se suprimió el suero a las células en KBM durante 72 horas antes de la adición de los compuestos de ensayo. Se usaron trombina 1 UI/ml y tripsina 25 nM como controles positivos. Se añadió 1 ml de medio/pocillo. Se usó KBM sólo como control negativo. [0472] Se preparó IL-20 en medio KBM y se añadió a concentraciones variables de 2,5 µg/ml hasta 618 ng/ml en un primer experimento y de 2,5 µg/ml hasta 3 ng/ml en un segudo experimento. [0473] Se incubaron las células a 37ºC, 5% de CO2 durante 48 horas. Se retiraron los sobrenadantes y se congelaron a -80ºC durante varios días antes de ensayar los niveles de IL-8 y GM-CSF. Se usaron el kit de inmunoensayo de IL-8 humana nº D8050 (RandD Systems, Inc.) y el kit de inmunoensayo de GM-CSF humano nº HSGMO (RandD Systems, Inc.) para determinar la producción de citocina siguiendo las instrucciones del fabricante. [0474] Los resultados indicaron que se inducía la expresión de IL-8 y GM-CSG por IL-20. Ejemplo 24 Regulación positiva de citocinas inflamatorias por IL-20 [0475] Se cultivó la línea celular de queratinocitos humanos HaCaT a 37ºC durante varios días después de confluencia en matraces de cultivo de tejido T-75. En este punto, se retiró el medio de crecimiento normal (DMEM + 10% de FBS) y se reemplazó por medio exento de suero. Se incubaron entonces las células durante 2 días a 37ºC. Se retiró entonces el DMEM y se trataron cuatro matraces de células por tratamiento en cada una de las siguientes condiciones durante 4 horas a 37ºC: IL-1α humana recombinante (rh) 5 ng/ml, IL-1α rh 20 ng/ml, IL-1α rh 5 ng/ml + IL-20 1 µg/ml, IL-20 1 µg/ml o IL-10 rh 10 ng/ml. [0476] Después del tratamiento de citocina, se retiró el medio y se lisaron las células usando una disolución de tiocianato de guanidinio. Se aisló el ARN total del lisado celular mediante una centrifugación de una noche en un gradiente de cloruro de cesio. El día siguiente, se resuspendió el sedimento de ARN en una disolución de TE/SDS y se precipitó con etanol. Se cuantificó entonces el ARN usando un espectrofotómetro seguido de tratamiento con ADNasa según la sección V.B del Manual del Usuario de Atlas™ cDNA Expression Arrays de Clontech (versión PT3140-1/PR9X390, publicado el 11/5/99). Se verificó la calidad de las muestras de ARN mediante cálculos de pureza basados en las indicaciones de las especificaciones y mediante visualización sobre gel de agarosa. Se excluyó la contaminación genómica de las muestras de ARN mediante análisis por PCR del gen de β-actina. [0477] Se siguieron los protocolos de Clontech para enriquecimiento con poliA+, síntesis de sonda e hibridación con matrices Atlas™ (véase anteriormente el manual del usuario plus Atlas™Pure Total RNA Labeling System, PT3231-1/PR96157, publicado el 22-6-99). Brevemente, se aisló ARN poliA+ a partir de 50 mg de ARN total usando perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (de Clontech, Palo Alto, CA) y un separador de partículas magnéticas. Se marcó entonces el ARN poliA+ con α32P-dATP por PCR-FI. Se usaron en la reacción cebadores CDS de Clontech específicos de los 268 genes de la matriz de citocina/receptor humana Atlas™ (nº de cat. 7744-1). Se aisló la sonda marcada usando cromatografía en columna y se contó el fluido de centelleo. [0478] Se prehibridaron matrices Atlas™ con Clontech ExpressHyb más ADN de esperma de salmón desnaturalizado térmicamente 100 mg/ml al menos 30 minutos a 68ºC con agitación continua. Se hibridaron entonces las membranas con 1,9 x 106 CPM/ml (un total 1,14 x 107 CPM) durante una noche a 68ºC con agitación continua. El día siguiente, se lavaron las membranas durante 30 minutos x 4 en 2X SSC, 1% de SDS a 68ºC, más durante 30 minutos x 1 en 0,1X SSC, 0,5% de SDS a 68ºC, seguido de un lavado final a temperatura ambiente durante 5 minutos en 2X SSC. Se dispusieron entonces las membranas de matriz en bolsas de plástico Kodak selladas y se expusieron a una pantalla Phosphorimager durante una noche a temperatura ambiente. El día siguiente, se exploraron las pantallas de fósforo y se analizaron usando el software AtlasImage™ 1.0 de Clontech. Genes regulados positivamente por IL-20:

[0479]

1.

El factor de necrosis tumoral (TNF) se regulaba positivamente 1,9-2,4 veces por IL-20.

2.

Los factores de crecimiento de placenta 1 y 2 (PLGF) se regulaban positivamente 1,9-2,0 veces por IL-20.

3.

El receptor de factor de coagulación II se regulaba positivamente 2,0-2,5 veces por IL-20.

4. El receptor de calcitonina se regulaba positivamente 2,2-2,3 veces por IL-20.

5.

La proteína TSG-6 de union a hialuronato inducible por TNF se regulaba positivamente 2,1-2,2 veces por IL-20.

6.

El precusor de receptor 1 de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor de tirosina proteína cinasa (FLT-1) (SFLT), se regulaba positivamente 2,1-2,7 veces por IL-20.

7.

La MRP-8 (proteína de unión a calcio en macrófagos relacionada con MIF) se regulaba positivamente 2,9-4,1 veces por IL-20.

8.

La MRP-14 (proteína de unión a calcio en macrófagos relacionada con MIF) se regulaba positivamente 3,0-3,8 veces por IL-20.

9. La relaxina H2 se regulaba positivamente 3,14 veces por IL-20.

10. El receptor III de factor de crecimiento transformante β (TGFβ) de 300 kDa se regulaba positivamente 2,4-3,6 veces por IL-20. Genes que muestran sinergia con el tratamiento con IL-20 + IL-1:

[0480]

1.

La proteína morfogénica ósea 2a se regulaba positivamente 1,8 veces con tratamiento con IL-20 sola, 2,5 veces con tratamiento con IL-1 sola y 8,2 veces con tratamiento con IL-20 e IL-1 conjuntamente.

2.

La MRP-8 se regulaba positivamente 2,9 veces con tratamiento con IL-20 sola, 10,7 veces con tratmiento con IL-1 sola y 18,0 veces con tratamiento con IL-20 e IL-1 conjuntamente.

3.

La proteína de diferenciación eritroide (EDF) se regulaba positivamente 1,9 veces con tratamiento con IL-20 sola, 9,7 veces con tratamiento con IL-1 sola y 19,0 veces con tratamiento con IL-20 e IL-1 conjuntamente.

4.

La MRP-14 (proteína de unión a calcio en macrófagos, relacionada con MIF) se regulaba positivamente 3,0 veces con tratamiento con IL-20 sola, 12,2 veces con tratamiento con IL-1 sola y 20,3 veces con tratamiento con IL-20 e IL-1 conjuntamente.

5.

El factor de crecimiento de tipo EGF de unión a heparina se regulaba positivamente 2,0 veces con tratamiento con IL-20, 14 veces con tratamiento con IL-1 sola y 25,0 veces con tratamiento con IL-20 e IL-1 conjuntamente.

6.

La proteína de tipo tromboglobulina β se regulaba positivamente 1,5 veces con tratamiento con IL-20 sola, 15 veces con tratamiento con IL-1 sola y 27 veces con tratamiento con IL-20 e IL-1 conjuntamente.

7.

El factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) se regulaba positivamente 1,7 veces con tratamiento con IL-20 sola, 25 veces con tratamiento con IL-1 sola y 48 veces con tratamiento con IL-20 e IL-1 conjuntamente.

8.

El factor quimiotáctico y activador de monocitos MCAF se regulaba positivamente 1,3 veces con tratamiento con IL-20 sola, 32 veces con tratamiento con IL-1 sola y 56 veces con tratamiento con Il-20 e IL-1 conjuntamente. Ejemplo 25 Fenotipo transgénico de IL-20 [0481] Se sobreexpresaron tanto IL-20 humana como de ratón en ratones transgénicos usando una variedad de promotores. Se usó inicialmente el promotor de albúmina de ratón específico de hígado, que dirige la expresión de IL-20 humana, en un intento de conseguir niveles en circulación de proteína. Se realizaron estudios

posteriores usando el promotor de queratina 14 (K14), que orienta principalmente la expresión a la epidermis y otros epitelios escamosos estratificados; el promotor de metalotioneína 1 de ratón, que da un patrón de expresión amplio y el promotor EµLCK, que promueve la expresión en células de linaje linfoide. Se obtuvieron resultados similares en los cuatro casos, posiblemente debido a que todos estos promotores dan lugar a niveles en circulación de IL-20. [0482] En todos los casos, las crías transgénicas que expresan el transgén de IL-20 eran menores que los compañeros de camada no transgénicos, tenían una apariencia brillante con piel tirante y arrugada y murieron a los pocos días después del nacimiento. Las crías tenían leche en sus estómagos, indicando que eran capaces de mamar. Estos ratones tenían extremidades, regiones de la cola, amígdala y boca hinchadas y tenían dificultades de movimiento. Además, los ratones eran enfermizos, carecían de tejido adiposo visible y tenían un desarrollo de oreja y dedos retardado. Los bajos niveles de expresión en hígado (menos de 100 moléculas de ARNm/célula) eran suficientes para la letalidad neonatal las y anormalidades cutáneas. Los ratones transgénicos sin un fenotipo visible no expresaban el transgén, no lo expresaban a niveles detectables o eran mosaicos. [0483] El análisis histológico de la piel de los ratones transgénicos para IL-20 mostró epidermis engrosada, hiperqueratosis y un estrato córneo compacto en comparación con los compañeros de camada no transgénicos. Se observaron ocasionalmente costras serocelulares (escaras). El análisis microscópico electrónico (ME) de la piel de ratones transgénicos mostró inclusiones lipoides intramitocondriales, gránulos de queratohialina moteados y relativamente pocos tonofilamentos, similar a lo observado en piel psoriática humana y en modelos de enfermedad cutánea en ratón. Además, muchos de los ratones transgénicos tenían linfocitos tímicos apoptóticos. No se detectaron otras anormalidades mediante análisis histopatológico. Estos resultados histológicos y de ME apoyan y extienden las alteraciones cutáneas macroscópicas observadas. Ejemplo 26 Construcción de vector de expresión para la expresión de IL-22RA-muFc humana soluble [0484] Se preparó una fusión de receptor soluble IL-22RA humano-muFc (indicada como IL-22RA-C(mG2a)) que contiene el dominio extracelular de IL-22RA fusionado con la región Fc de cadena pesada γ2a de murino (mG2a). Se construyó un plásmido que expresión que contenía IL-22RA-C(mG2a) mediante recombinació homóloga usando dos fragmentos de ADN separados y el vector de expresión pZMP40. Se generaron fragmentos de la secuencia de polinicleótidos de IL-22RA (SEC DE ID. Nº 1) y de mG2a (SEC DE ID. Nº 39) mediante amplificación por PCR usando los siguientes cebadores: (a) cebadores de IL-22RA ZC45.593 (SEC DE ID. Nº 28) y ZC45.592 (SEC DE ID. Nº 29); y (b) cebadores de mG2a ZC45.591 (SEC DE ID. Nº 30) y ZC45.594 (SEC DE ID. Nº 31). [0485] El primer fragmento contenía la región de codificación del dominio extracelular de IL-22RA, que se preparó usando un polinucleótido de IL-22RA (por ejemplo, SEC DE ID. Nº 1) como molde. El primer fragmento incluía una superposisión 5’ con una secuencia parcial del vector pZMP40, el segmento de IL2RA y una superposición 3’ que contenía una secuencia ligadora y una secuencia parcial de mG2a. Condiciones de PCR: 1 ciclo a 94ºC durante 5 minutos, 35 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, seguido de 55ºC durante 2 minutos, seguido de 72ºC durante 3 minutos y 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos. [0486] El segundo fragmento incluía una superposición 5’ con una secuencia ligadora y una secuencia parcial de IL-22RA, el segmento mG2a y una superposición 3’ que contenía una secuencia parcial del vector pZMP40. Se generó la región Fc de la cadena pesada 2a de IgG de murino (mG2a) (SEC DE ID. Nº 39) a partir de un clon de ADNc de la cadena pesada 2a de IgG de murino. La mG2a contiene los dominios de bisagra CH2 y CH3 de la región constante de cadena pesada 2a de IgG de murino. Condiciones de PCR: 1 ciclo a 94ºC durante 5 minutos, 35 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, seguido de 55ºC durante 2 minutos, seguido de 72ºC durante 3 minutos y 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos. [0487] Se procesaron las mezclas de reacción PCR en un gel de agarosa al 1% y se extrajo del gel una banda correspondiente a los tamaños de los insertos usando un kit de extracción de gel QIAquick™ (Qiagen). [0488] Se usó el plásmido pZMP40, que se cortó con BgIII, en una recombinación triple con ambos fragmentos de inserto de PCR. El plásmido pZMP40 es un vector de expresión de mamífero que contiene un módulo de expresión que tiene el promotor MPSV y múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias de codificación, un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcador seleccionable de mamífero que comprende un promotor, potenciador y origen de replicación de SV40, un gen DHFR y el terminador SV40, y las secuencias URA3 y CEN-ARS necesarias para selección y replicación en S. cerevisiae. Se construyó el plásmido pZMP40 a partir de pZMP21 (depositado en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, y designado nº PTA-5266) mediante la adición de varios sitios de enzima de restricción al poliligador. [0489] Se combinaron independientemente 100 µl de células de levadura competentes (S. cerevisiae) con 10 µl del ADN de inserto y 100 ng de vector pZMP40 cortado, y se transfirió la mezcla a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. Se sometió a electropulsos la mezcla de levadura/ADN usando unos ajustes del suministro eléctrico (BioRad Laboratories, Hercules, CA) de 0,75 kV (5 kV/cm), ∞ ohmios y 25 µF. Se añadieron 600 µl de sorbitol 1,2 M a la cubeta y se sembró la levadura en alícuotas de 100 µl, 300 µl sobre dos placas URA-D y se incubó a 30ºC. Después de aproximadamente 72 horas, se resuspendieron los transformantes de levadura Ura+ de una sola placa en 1 ml de H2O y se centrifugaron brevemente para sedimentar las células de levadura. Se resuspendió el sedimento celular en 0,5 ml de tampón de lisis (2% de Triton X-100, 1% de SDS, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Se añadieron los 500 µl de la mezcla de lisis a un tubo Eppendorf que contenía 250 µl de perlas de vidrio lavadas con ácido y 300 µl de fenol-cloroformo, se agitó con vórtex durante 3 minutos y se centrifugó durante 5 minutos en una centrífuga Eppendorf a velocidad máxima. Se transfirieron 300 µl de la fase acuosa a un tubo reciente, y se precipitó el ADN con 600 µl de etanol (EtOH) y 30 µl de acetato de sodio 3 M, seguido de centrifugación durante 30 minutos a velocidad máxima. Se decantó el tubo y se lavó el sedimento con 1 ml de etanol al 70%. Se decantó el tubo y se resuspendió el ADN en 30 µl de TE. [0490] Se realizó la transformación de células hospedadoras E. coli electrocompetentes (DH12S) usando 5 µl de prep. de ADN de levadura y 50 µl de células. Se sometieron a electropulsos las células a 2,0 kV, 25 µF y 400 ohmios. Después de la electroporación, se añadió 1 ml de SOC (2% de Bacto™ Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% de extracto de levadura (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, glucosa 20 mM) y se sembraron entonces las células en alícuotas de 50 µl y 200 µl sobre dos placas LB AMP (caldo LB (Lennox), 1,8% de Bacto™ Agar (Difco), ampicilina 100 mg/l). [0491] Se sometieron los insertos de tres clones de constructo a análisis de secuencia y se seleccionó un clon para cada constructo que contenía la secuencia correcta. Se aisló ARN de plásmido a mayor escala usando un kit disponible comercialmente (kit QIAGEN Plasmid Mega, Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. Ejemplo 27 Expresión y purificación del polipéptido IL-22RA-muFc soluble humano [0492] Se digirieron tres conjuntos de 200 µg de constructo IL-22RA-C(mG2a) (Ejemplo 22) cada uno con 200 unidades de Pvu I a 37ºC durante 3 horas y se precipitaron entonces con IPA y se centrifugaron en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se decantó el sobrenadante del sedimento y se lavó el sedimento con 1 ml de etanol al 70% y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó el tubo en una microcentrífuga durante 10 minutos a 14.000 rpm y se decantó el sobrenadante del sedimento. Se resuspendió entonces el sedimento en 750 µl de medio PF-CHO en un entorno estéril y se dejó incubar a 60ºC durante 30 minutos. Se centrifugaron las células 5E6 APFDXB 11 en cada uno de los tres tubos y se resuspendieron usando la disolución de ADN-medio. Se dispusieron las mezclas de ADN/célula en una cubeta de 0,4 cm de hueco y se sometieron a electroporación usando los siguientes parámetros: 950 µF, alta capacitancia y 300 V. Se retiraron entonces los contenidos de las cubetas, se agruparon, se diluyeron a 25 ml con medio PF-CHO y se dispusieron en un matraz agitado de 0,125 ml. Se dispuso el matraz en un incubador a 37ºC, 6% de CO2 y agitación a 120 rpm. [0493] Se sometió la línea celular a selección por nutriente seguido de amplificación por etapas de metotrexato (MTX) 100 nM a MTX 500 nM y finalmente a MTX 1 µM. Siguió a la amplificación por etapas una clasificación de células CD8. La clasificación de células CD8 se consiguió tomando un agrupamiento amplificado estable de MTX 1 µM y tiñendo aproximadamente 5 x 106 células con un anticuerpo monoclonal FITC anti-CD8 (BD PharMingen, nº de cat. 30324X) usando la concentración recomendada por el fabricante. Se procesaron las células teñidas y se clasificaron en un citómetro de flujo FACS Vantage (BD). Se recogió el 5% superior de las células y se cultivaron. Se confirmó la expresión por transferencia Western y se aumentó la escala de la línea celular y de la purificación de proteína usando los procedimientos estándar siguientes. Ejemplo 28 Neutralización de huIL-22RA por sueros de ratones inmunizados con huL22RA-mG2a [0494] Ensayo de neutralización basado en células para ensayar la inhibición de IL-20 y/o IL-22. Se usó la línea celular pre-B BaF3 dependiente de factor contransfectada con IL-22RA e IL-20RB (pDIRS1) (células BAF/IL-22RA/IL-20RB, Ejemplo 38) para valorar el potencial de neutralización de los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA antagonizando IL-20 en el receptor IL-22RA/IL-20RB. De forma similar, se usaron BaF3 cotransfectadas con IL-22RA e IL-10RB (CRF2-4) (células BAF/IL-22RA/CRF2-4; Ejemplo 2) para valorar el potencial de neutralización de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA antagonizando IL-22 en el receptor IL22RA/IL10RB. Se valoraron la proliferación en presencia de IL-20 o IL-22 en su línea celular que expresa receptor respectiva y la inhibición de dicha proliferación en presencia de anticuerpos antagonistas usando un ensayo con azul de Alamar como se describe en el Ejemplo 3. La inhibición de la proliferación en estas células es indicativo de actividad neutralizante en este ensayo.

B. El suero anti-IL-22RA neutraliza tanto IL-20 como IL-22 en un ensayo de neutralización basado en células [0495] Usando el ensayo descrito en el Ejemplo 28A, se añadió suero de ratones con desactivación génica de IL-22RA inmunizados con huIL-22RAmuG2a (Ejemplo 30(A)(1)) en forma de una dilución en serie al 1%, 0,5%, 0,25%, 0,13%, 0,06%, 0,03%, 0,02% y 0%. Se incubaron las placas de ensayo a 37ºC, 5% de CO2 durante 4 días, en cuyo momento se añadió azul de Alamar (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pocillo. Se incubaron de nuevo las placas a 37ºC, 5% de CO2 durante 16 horas. El azul de Alamer da una lectura fluorimétrica basada en el número de células vivas, y es por tanto una medida directa de la proliferación celular en comparación con un control negativo. Se leyeron las placas en un Wallac Victor 2 1420 Multilabel Counter (Wallac, Turku, Finlandia) a longitudes de onda de 530 (excitación) y 590 (emisión). Los resultados mostraron que el suero de los 7 animales inmunizados podía neutralizar la señalización tanto de huIL-22 como de huIL20 mediante huIL-22RA. Por ejemplo, a la concentración de un 1%, el suero de 5 animales (16517, 16518, 16519, 16520 y 16527) neutralizaba completamente la proliferación inducida por huIL-22, reduciéndose la inhibición de la proliferación de forma dependiente de la dosis a las concentraciones menores. Además, a la concentración de un 1%, el suero de otros dos animales (16471 y 16701) inhibía aproximadamente un 90% de la proliferación inducida por huIL-22, reduciéndose la inhibición de la proliferación de forma dependiente de la dosis a las concentraciones menores. Se forma similar, a las concentraciones de 1% y 0,5%, el suero de 5 animales (16517, 16518, 16519, 16520 y 16527) neutralizaba completamente la proliferación inducida por huIL-20, reduciéndose la inhibición de la proliferación de forma dependiente de la dosis a las concentraciones menores. Además, a la concentración de un 1%, el suero del animal 16701 neutralizaba completamente la proliferación inducida por huIL-20, reduciéndose la inhibición de la proliferación de forma dependiente de la dosis a las concentraciones menores. A la concentración de un 1%, el suero del animal 16471 neutralizaba aproximadamente un 95% de la proliferación inducida por huIL-20, reduciéndose la inhibición de la proliferación de forma dependiente de la dosis a las concentraciones menores. Por tanto, los sueros de los 7 animales eran capaces de neutralizar la proliferación inducida por IL-20 o IL-22 mediante el receptor huIL-22RA. Estos resultados demostraron adicionalmente que los anticuerpos de IL-22RA podían antagonizar de hecho la actividad de los ligandos proinflamatorios IL-20 e IL-22 a bajas concentraciones. [0496] Estos resultados proporcionaron evidencias adicionales de que bloquear eficazmente la actividad de IL-22RA mediante la unión a, bloqueo, inhibición, reducción, antagonismo o neutralización de la actividad de IL-20 o IL-22 (individual o conjuntamente), por ejemplo mediante un anticuerpo neutralizante de IL-22RA de la presente invención, podría ser ventajoso para reducir los efectos de IL-20 e IL-22 (solos o conjuntamente) in vivo y puede reducir la inflamación inducida por IL-20 y/o IL-22, tal como la observada en los efectos cutáneos inducidos por IL-20, así como los efectos cutáneos inducidos por IL-22, por ejemplo en psoriasis, EII, colitis u otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-20 y/o IL-22, incluyendo EII, artritis, asma, atritis psoriática, colitis, afecciones cutáneas inflamatorias y dermatitis atópica. Ejemplo 29 Generación de células P815/hIIr22RA e inmunización de ratones Generación de células P8 15ML-22RA e inyección en ratones para la generación de anticuerpos anti-hIL-22RA: [0497] Se tranfectaron células WT P815 Cells (nº ATCC TIB-64) con un vector plasmídico que contenía la secuencia de ADNc de hIL-22RA (por ejemplo, SEC DE ID. Nº 1) y un marcador de resistencia a puromicina seleccionable, usando el reactivo Fugene según el protocolo del fabricante (Roche, Indianápolis, IN). Se dispusieron las células en selección con puromicina 48 horas después de la transfección. Se clonaron los transfectantes resistentes a puromicina mediante dilución limitante, y se cribó su nivel de expresión en superficie celular de hIL-22RA por citometría de flujo, usando IL-22 humana biotinilada (huIL-22-biotina). Brevemente, se incubaron las células con huIL-22-biotina 5 µg/ml durante 30 minutos en hielo y se lavaron entonces. Se detectó entonces la unión de huIL-22-biotina a las células usando estreptavidina marcada con PE a 1:500. Se analizaron las células en un citómetro de flujo Facscan usando software Cellquest. (Becton Dickinson, San José, CA). [0498] Se cultivó el clon celular P815/IL-22RA y se recolectó entonces para inyección. Se recogieron las células, se lavaron tres veces con PBS, se contaron y se resuspendieron a 1x108 células por ml y se irradiaron con 10.000 rad. Se transfirió entonces la suspensión celular a una jeringuilla de 1 ml y se inyectó por vía intraperitoneal en ratones DBA/2. Se aplicó recuerdo a los ratones de manera idéntica 3 semanas después y se cribó en los sueros la unión a la línea celular transfectante de hIL-22RA. Brevemente, se diluyeron los sueros 1:100 en tampón Facs (HBSS, 2% de BSA, 0,02% de NaN3) y se incubaron entonces con células de riñón humano 293 bloqueadas con Fc que sobreexpresan hIL-22RA. Se detectó entonces la unión de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA a las células usando IgG de cabra anti-ratón conjugada con fluoresceína diluida 1:200 (Southern Biotech, Birmingham, AL). Se analizaron las células como se describe anteriormente. Se sometieron a recuerdo los ratones de nuevo un total de 3 veces más y se cribaron los sueros como se describe. Se seleccionaron dos ratones para fusión de hibridoma, usando procedimientos estándar en la materia para la generación de anticuerpos monoclonales (Ejemplo 25), basándose en el nivel de su unión de suero a los transfectantes de hIL-22RA. [0499] Se usa también el procedimiento anterior para la generación de células P815 que expresan receptores IL-22RA heterodiméricos tales como IL-22RA/CRF2-4 (células P815/IL-22RA/CRF2-4), IL-22RA/pDIRS (células P815/IL-22RA/pDIRS1) o IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1 (células P815/IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1), por ejemplo para inmunizar ratones para la generación de anticuerpos monoclonales contra IL22RA y receptores heterodiméricos que comprenden IL-22RA. Ejemplo 30 Generación de mAb de murino anti-IL-22RA humana (IL-22RA)

A. Inmunización para la generación de anticuerpos dirigidos contra IL-22RA:

(1)

Uso de IL-22RA-muFc soluble [0500] Se inmunizaron ratones de 6 a 12 semanas de edad con desactivación génica de IL-22RA (Ejemplo 26) mediante inyección intraperitoneal con 25-50 µg de proteína IL-22RA-muFc humana soluble (Ejemplo 23) mezclada 1:1 (v:v) con coadyuvante Ribi (Sigma) en un programa bisemanal. 7 a 10 días después de la tercera inmunización, se tomaron muestras de sangre mediante toma de sangre retroorbital, se recolectó el suero y se evaluó su capacidad de inhibir la unión de IL-22 o ambas IL-20 e IL-22 a IL-22RA en ensayos de neutralización (por ejemplo, descritos en la presente memoria) y para teñir células 293 transfectadas con IL-22RA frente a no transfectadas en un ensayo de tinción FACS. Los ratones seguían estando inmunizados y se tomaron muestras de sangre y se evaluaron como se describe anteriormente hasta que los títulos de neutralización alcanzaron una meseta. En ese momento, se inyectaron por vía intravascular a los ratones con los títulos de neutralización mayores 25-50 µg de

proteína IL-22RA-Fc soluble en PBS. 3 días después, se recolectaron bazo y nódulos linfáticos de estos ratones y se usaron para la generación de hibridoma, por ejemplo, usando células de mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) u otras líneas celulares apropiadas en la materia, usando procedimientos estándar conocidos en la materia (por ejemplo, véanse Kearney, J.F. y col., J. Immunol. 123: 1548-50, 1979 y Lane, R.D. J. Immunol. Methods 81:223-8, 1985).

(2)

Uso de transfectantes de P815 que expresan el receptor IL-22RA [0501] Se inmunizaron ratones DBA/2 hembra de 6 a 10 semanas de edad mediante inyección intraperitoneal con 1 x 105 células P815 vivas transfectadas, por ejemplo, células P815/IL-22RA, células P815/IL-22RA/CRF2-4, P815/IL22RA/pDIRS1 o P815/IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1 (Ejemplo 24) (por ejemplo, 0,5 ml a una densidad celular de 2 x 105 células/ml). Antes de la inyección, se mantienen las células en la fase de crecimiento exponencial. Para la inyección, se recolectan las células, se lavan tres veces con PBS y se resuspenden entonces en PBS a una densidad de 2 x 105 células/ml. En este modelo, los ratones desarrollan un tumor ascítico al cabo de 2-3 semanas y progresan hasta la muerte a las 4-6 semanas a menos que se haya provocado una respuesta inmunitaria al antígeno diana transfectado. A las 3 semanas, se reinmunizan los ratones sin hinchazón abdominal aparente (indicativa de ascitis) como anteriormente a intervalos de 2-3 semanas. 7 a 10 días después de la segunda inmunización, se toman muestras de sangre por toma de sangre retroorbital, se recolecta el suero y se evalúa su capacidad de inhibir la unión de IL-22 o ambas IL-20 e IL-22 a IL-22RA en ensayos de neutralización (por ejemplo, descritos en la presente memoria) y de teñir células 293 transfectadas con IL-22RA frente a no transfectadas en un ensayo de tinción FACS. Los ratones siguen estando inmunizados y se toman muestras de sangre y se evalúan como se describe anteriormente hasta que los títulos de neutralización alcanzan una meseta. En ese momento, se inyectan por vía intraperitineal en los ratones con los títulos de neutralización mayores 1 x 105 células P815 vivas transfectadas. 4 días después, se recolectan bazo y nódulos linfáticos de estos ratones y se usan para la generación de hibridoma, por ejemplo usando células de mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) u otras líneas celulares apropiadas de la materia, usando procedimientos estándar en la materia (por ejemplo, véanse Kearney,

J.F. y col., más arriba) y Lane, R.D. más arriba)). [0502] Una alternativa al esquema de inmunización anterior con células P815 vivas transfectadas implica la inyección intraperitoneal de 1-5 x 106 células transfectadas irradiadas cada 2-3 semanas. En este enfoque, ningún animal desarrolla ni muere por ascitis. En lugar de ello, se controla en los animales una respuesta inmunitaria neutralizante a IL-22RA en su suero como se expone anteriormente, partiendo de una toma de sangre después de la segunda inmunización. Una vez los títulos de neutralización han alcanzado un nivel máximo, se administra a los ratones con títulos mayores una inyección intraperitoneal prefusión de 5 x 106 células irradiadas y, 4 días después, se recolectan bazo y nódulos linfáticos de estos ratones y se usan para la generación de hibridoma, usando por ejemplo células de mieloma (P3X63-Ag8.653.3.12.11) u otras líneas celulares apropiadas en la materia, usando procedimientos conocidos en la materia (véanse, por ejemplo Kearney, J.F. y col., más arriba) y Lane, R.D. más arriba)).

B. Cribado en fusiones de hibridoma de anticuerpos que se unen a IL-22RA e inhiben la unión de IL-22 a IL-22RA. [0503] Se efectuaron dos cribados primarios diferentes en los sobrenadantes de hibridoma a los 8-10 días después de la fusión. Para el primer ensayo, se ensayó en los anticuerpos de los sobrenadantes su capacidad de unirse a proteína IL-22Ra-muFc humana soluble unida a placa mediante ELISA usando los reactivos de segunda etapa cadena ligera de cabra anti-kappa y anti-lambda de ratón conjugada con HRP para identificar los anticuerpos de ratón unidos. Para demostrar la especificidad por la porción IL-22RA de la proteína IL-22RA-muFc, se evaluó en los sobrenadantes positivos en el ensayo inicial una proteína irrelevante fusionada con la misma región Fc de murino (mG2a). Los anticuerpos en esos sobrenadantes que se unen a IL-22RAmuFc y no a la proteína de fusión que contiene muFc irrelevante se consideró que eran específicos de IL-22RA. Para el segundo ensayo, se evaluó en los anticuerpos de todos los sobrenadantes de hibridoma mediante ELISA su capacidad de inhibir la unión de IL-22 humana biotinilada a IL-22RA-muFc unido a placa. [0504] En todos los sobrenadantes que contienen anticuerpos que se unen específicamente a IL-22RA, tanto si inhibían la unión de IL-22 a IL-2RA o no en el ensayo ELISA, se ensayó posteriormente su capacidad de inhibir la unión (y el efecto proproliferativo concomitante) de IL-20 o IL-22 a células Baf3 transfectadas con IL22RA/IL-20RB e IL-22RA/CRF2-4, respectivamente. Se evaluó posteriormente en todos los sobrenadantes que eran positivos de neutralización en el ensayo de inhibición de IL-22 o ambos ensayos de inhibición de IL-20 e IL-22 su capacidad de teñir células Baf3 transfectadas con IL-22RA frente a no transfectadas mediante análisis FACS. Este análisis se diseñó para confirmar que la inhibición de la unión de IL-22 a IL22RA/CRF2-4, o la unión de IL-20 a IL-22RA/IL-20RB, era de hecho debida a un anticuerpo que se une específicamente al receptor IL-22RA. Adicionalmente, puesto que el análisis FACS se efectuó con un reactivo de segunda etapa anti-IgG, los resultados positivos de FACS específicos indican que el anticuerpo neutralizante era probable que fuera de clase IgG. De este modo, se identificó un pocillo maestro que se unía a IL-22RA en ELISA unida a placa, inhibía la unión de IL-22 a IL-22RA en el ensayo de inhibición basado en ELISA, bloqueaba la interacción de IL-20 e IL-22 con células Baf3 transfectadas con IL-22RA/IL-20RB e IL-22RA/CRF2-4 (Ejemplo 28), respectivamente, y era fuertemente positivo por tinción de ambas células Baf3 transfectadas con IL-22RA/IL-20RB e IL-22RA/CRF2-4 con un reactivo de segunda etapa IgG anti-ratón.

D. Clonación de hibridomas productores de anticuerpo específico anti-IL-22RA: [0505] Se clonó un hibridoma productor de un mAb anti-IL-22RA que neutraliza de forma cruzada la unión de IL-20 e IL-22 a células BaF3 transfectadas apropiadamente mediante el enfoque de dilución de baja densidad estándar (menos de 1 célula por pocillo). Aproximadamente 5-7 días después de la siembra, se cribó en los clones mediante ELISA la IL-22RA-muFc humana unida a placa seguido de un nuevo ensayo en pocillos positivos mediante ELISA de proteína de fusión que contiene muFc irrelevante como se describe anteriormente. Se confirmó adicionalmente en clones seleccionados, cuyos sobrenadantes se unían a IL-22RA-muFc y no a la proteína de fusión que contenía muFc irrelevante, la actividad de anticuerpo específica repitiendo ambos ensayos de neutralización así como el análisis FACS. Se clonaron todos los clones positivos de anticuerpo de IL-22RA seleccionados un mínimo de dos veces para ayudar a asegurar la clonalidad y para valorar la estabilidad de la producción de anticuerpo. Se efectuaron rondas adicionales de clonación y se cribó como se describe hasta que, preferiblemente, un 95% de los clones resultantes eran positivos de neutralización de la producción de anticuerpo dirigido contra IL-22RA.

E. Caracterización bioquímica de la molécula reconocida por mAb anti-IL-22RA: [0506] Se efectúa la confirmación bioquímica de que la molécula diana, IL-22RA, reconocida por el supuesto mAb anti-IL-22RA es de hecho IL-22RA mediante inmunoprecipitación estándar seguida de análisis por PAGE-SDS o procedimientos de transferencia Western, empleando ambos preparaciones de membrana solubles de células Baf3 transfectadas con IL-22RA frente a no transfectadas. Además, se usan preparaciones de membrana solubles de líneas celulares no transfectadas que expresan IL-22RA que muestran que los mAb reconocen la cadena de receptor nativo así como el transfectado. Como alternativa, se ensaya en los mAb su capacidad de inmunoprecipitación específica o de transferencia Western de la proteína IL-22RAmuFc soluble. Ejemplo 31 Neutralización de huIL-22RA por sueros de ratones inyectados con células P815 transfectadas con huIL-22RA [0507] Usando el ensayo de neutralización basado en células descrito en el Ejemplo 28, se añadió suero de ratones inyectados con células P815 vivas transfectadas con huIL-22RA (Ejemplo 30.A.2) en forma de dilución en serie a un 1%, 0,5%, 0,25%, 0,13%, 0,06%, 0,03%, 0,02% y 0%. Se incubaron las placas de ensayo a 37ºC, 5% de CO2 durante 4 días, en cuyo momento se añadió azul de Alamar (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pocillo. Se incubaron de nuevo las placas a 37ºC, 5% de CO2 durante 16 horas. Los resultados mostraron que el suero de cuatro de los animales podía neutralizar la señalización tanto de huIL-22 como de huIL20 mediante huIL-22RA. [0508] A la concentración de un 1%, el suero de 6 animales (7125, 7127, 7128, 7118, 7124 y 7117) neutralizaba entre 50% y 80% de la proliferación inducida por huIL-22, reduciéndose la inhibición de la proliferación de forma dependiente de la dosis a las concentraciones menores. Además, a la concentración de un 1%, el suero de 4 animales (7125, 7127, 7118 y 7117) neutralizaba entre 40% y 70% de la proliferación inducida por huIL20, reduciéndose la inhibición de la proliferación de forma dependiente de la dosis a las concentraciones menores. Estos resultados demostraban adicionalmente que los anticuerpos de IL-22RA podían antagonizar de hecho la actividad de los ligandos proinflamatorios IL-20 e IL-22 a bajas concentraciones. [0509] Estos resultados proporcionaron evidencias adicionales de que bloquear eficazmente la actividad de IL-22Ra mediante la unión a, bloqueo, inhibición, reducción, antagonismo o neutralización de la actividad de IL-20 o IL-22 (individual o conjuntamente), por ejemplo mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL22RA de la presente invención, podría ser ventajoso para reducir los efectos de IL-20 e IL-22 (solos o conjuntamente) in vivo y puede reducir la inflamación inducida por IL20 y/o IL-22, tal como la observada en efectos cutáneos inducidos por IL-20, así como en efectos cutáneos inducidos por IL-22, por ejemplo en psoriasis, EII, colitis u otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-20 y/o IL-22, incluyendo EII, artritis, asma, artritis psoriática, colitis, afecciones cutáneas inflamatorias y dermatitis atópica. Ejemplo 32 Fenotipo de ratones con desactivación génica de IL-22RA

A. Generación de ratones que portan modificaciones genéticas

1.

Generación de ratones transgénicos que expresan IL-20 de murino con un brillo neonatal a). Constructo para expresar IL-20 de murino a partir del promotor K14. [0510] Para investigar la función biológica de IL-20 in vivo, se preparó un constructo transgénico en el que la IL-20 de murino se promovía por el promotor K14 humano (véase también el Ejemplo 21). Se diseñaron oligonucleótidos para generar un fragmento de PCR que contiene una secuencia de consenso Kozak y la región de codificación de IL-20 de murino. Se diseñaron estos oligonucleótidos con un sitio FseI en el extremo 5’ y un sitio AscI en el extremo 3’ para facilitar la clonación en pRSK14, un vector transgénico estándar que contiene un promotor específico de queratinocito y célula epitelial humanos. [0511] Se llevaron a cabo reacciones PCR con aproximadamente 200 ng de molde IL-20 de murino (SEC DE ID. Nº 33) y oligonucleótidos diseñados para amplificar la totalidad de IL-20 (SEC DE ID. Nº 34). Se determinaron las condiciones de reacción de PCR usando procedimientos conocidos en la materia. Se separaron los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron usando un kit de extracción en gel QiaQuick™ (Qiagen). Se digirió el fragmento de ADN de tamaño correcto aislado con FseI y AscI (Boerhinger-Mannheim), se precipitó con etanol y se ligó en pRSK14, digerido anteriormente con FseI y AscI. El plásmido pRSK14, diseñado para expresar un gen de interés en ratones transgénicos de queratinocito y célula epitelial, contiene un módulo de expresión flanqueado por aproximadamente 3 kb de promotor K14 específico de queratina humana. [0512] Se sometió a electroporación aproximadamente 1 µl de reacción de ligamiento en células competentes DH10B ElectroMax™ (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) según las instrucciones del fabricante, se sembraron en placas LB que contenían ampicilina 100 µg/ml y se incubaron durante una noche. Se escogieron colonias y cultivaron en medio LB que contenía ampicilina 100 µg/ml. Se preparó ADN a escala minipreparativa a partir de los clones escogidos y se cribó el inserto de IL-20 de murino mediante digestión de restricción combinada con FseI y AscI, y posterior electroforesis en gel de agarosa. Se confirmó el constructo TG con insertos de ADNc correcto mediante análisis de secuencia. Se efectuaron maxipreparaciones del pRSK14-IL-20 de murino correcto. b) Generación y caracterización de ratones transgénicos para IL-20 K14

[0513] Se aisló un fragmento NotI de aproximadamente 4 Kb de longitud del vector transgénico (TG) que contenía secuencias flanqueantes 5’ y 3’ del promotor K14 específico de queratina, IL-20 de ratón (SEC DE ID. Nº 33; polipéptido mostrado en la SEC DE ID. Nº 34), el intrón Gormon, ADNc de IL-20 y las secuencias señal poliA de hormona de crecimiento humano. Se usó para microinyección en ovocitos de murino B6C3f1 fertilizados (Taconic, Germantown, NY). Se produjo la microinyección y producción de ratones transgénicos como se describe en Hogan, B. y col. “Manipulating the Mouse Embryo”, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994. [0514] Se usó una reacción PCR-FI TaqMan™ para cuantificar la expresión de ARN TG usando cebadores de PCR específicos de la porción señal de poliA de hormona de crecimiento humano del transgén. [0515] Todos los constructos TG que expresan IL-20 exhiben una alta tasa de mortalidad paranatal, y las crías TG que nacieron exhiben típicamente un fenotipo “brillante”. La apariencia brillante de las crías neonatas parecía estar asociada a una rigidez de la piel, como si se estuviera secando, dando como resultado una reducción de la lactancia apropiada. Sus movimientos se volvieron rígidos en general. Histopatológicamente, las crías brillantes tienen una epidermis engrosada y la capa de queratina estaba compactada. La mayoría de estas crías brillantes progenitoras murieron al cabo de los primeros 5 días, y las crías supervivientes y destetadas no expresaban generalmente el transgén (por análisis de transcrito) o eran quiméricas (por baja transmisión del transgén a la descendencia). [0516] Se estableció una línea que expresaba IL-20 de murino, promovida por el promotor K14. El nivel de expresión en la piel y el timo era bajo, y todos los neonatos nacieron con un fenotipo brillante. En general, esta línea tenía un 20% de descendencia TG, indicando que un 50-60% de crías transgénicas murieron in utero. (En un apareamiento hemicigótico, un 50% de la descendencia debería ser TG).

2.

Generación de ratones con expresión de IL-22RA anulada, ratones con desactivación génica de IL-22RA a) Generación de constructo con desactivación génica (KO) de IL-22RA de murino [0517] Para estudiar adicionalmente la función biológica de IL-22RA in vivo, se creó una cepa de ratón con desactivación génica (KO) para anular la expresión de IL22RA. En primer lugar, se usaron sondas de ADNc de IL-22RA para cribar una colección genómica de BAC 129/SvJ de ratón. Se identificaron y caracterizaron los clones que contenían el locus genómico de IL-22RA. Se muestra el polinucleótido de

IL-22RA de murino en la SEC DE ID. Nº 41 y el polipéptido en la SEC DE ID. Nº 42. [0518] Para crear un constructo con desactivación génica para la anulación de IL22RA, se preparó un vector con desactivación génica usando la técnica de clonación ET (Zhang y col. 1998. “A new logic for DNA engineering using recombination in E. coli” Nat. Genet. Vol. 20:123-8). Brevemente, el vector KO contiene un brazo 5’ de 1,8 kb (brazo corto), un marcador seleccionable IRES-LacZ/MClneo y un brazo 3’ de 10 kb (brazo largo) del gen de IL-22RA. En el vector KO, se reemplazaron los exones 2, 3 y 4, así como los intrones 2 y 3 de la secuencia genómica de IL-22RA, por el marcador seleccionable IRES-LacZ/MClneo, de modo que se generara una delección de aproximadamente 4,4 kb mediante recombinación homóloga en células ES. [0519] Después de la linealización del vector KO por la enzima de restricción PmeI, se sometió a electroporación en células 129/SvJ ES. Se efectuaron la selección de eventos de recombinación homóloga, así como la identificación de clones de ES recombinantes, como se describe en Robertson, E.J. y col. “Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach”, 2ª ed., IRL Press Limited, Oxford, 1987. b). Creación y análisis de ratones con expresión de IL-2RA anulada [0520] Se expandieron los clones de ES positivos, en los que aparece delección de los exones 2-4 y los intrones 2-3 del locus genómico de IL-22RA. Se inyectaron en blastocitos de ratones C57B1/6j. Después de una breve reexpansión de los blastocitos inyectados, se introdujeron en madres de acogida seudopreñadas para generar quimeras. Se efectuaron la inyección de blastocitos, la crianza de quimeras y la posterior transmisión de la línea germinal de IL-22RA mutada como se describe en Robertson, E.J. y col. “Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach”, 2ª ed., IRL Press Limited, Oxford, 1987. [0521] Se identificaron los ratones mutantes KO mediante una estrategia de genotipado por PCR. Se usaron tres cebadores de PCR, ZC22901 (SEC DE ID. Nº 35), ZC45039 (SEC DE ID. Nº 36) y ZC38573 (SEC DE ID. Nº 37) en una reacción PCR múltiple para detectar el alelo de tipo silvestre y el alelo mutante. Se alelo de tipo silvestre (WT) procura un fragmento de ADN de 229 pb de longitud, mientras que el alelo mutante genera un fragmento de ADN de 371 pb de longitud. [0522] El apareamiento de ratones hemicigóticos produce una relación normal de descendencia de tipo homocigótico (HOM), heterocigótico (Het) y silvestre (WT), así como una relación de sexos normal. Inspeccionar los ratones mediante un PhysioScreen (recogiendo peso corporal, peso de tejido, hemograma completo (CBC), química clínica, observación macroscópica e histopatología) no reveló diferencias aparentes entre los animales HOM, Het y WT.

B. El IL-22RA era necesario para la SAA inducida por IL-22: la ELISA de SAA muestra que la expresión de SAA inducida por IL-22 estaba ausente en ratones con desactivación génica de IL-22RA: [0523] Para valorar si IL-22RA era necesario para la inducción de SAA en ratones inyectados con IL-22, se inyectaron a ratones IL-22RA KO 5 µg de IL-22 y se tomó sangre 6 h después. [0524] Se efectuó un ELISA para determinar los niveles de SAA en las muestras de suero usando el kit de inmunoensayo de SAA de ratón (BioSource International, California) siguiendo las instrucciones del fabricante, con el suero diluido 1:1000. 4 de los 5 ratones WT mostraron niveles elevados de SAA en respuesta a la inyección de IL-22, mientras que 4 de los 5 ratones HOM IL-22RA KO mostraron niveles basales de SAA. Ambos ratones Het IL-22RA KO ensayados tenían niveles elevados de SAA, pero menores que los niveles de SAA elevados de los ratones WT. Esto indica que el IL-22RA era necesario para la inducción de SAA por IL-22. [0525] Estos resultados proporcionaron evidencias de que bloquear eficazmente la actividad de IL-22RA, por ejemplo mediante una desactivación génica de IL-22RA o de forma similar mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-22RA de la presente invención, reduciría de forma similar la inflamación inducida por IL-22, por ejemplo en psoriasis, EII, colitis, endotoxemia u otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-22.

C. El IL-22RA era necesario para el engrosamiento epitelial inducido por IL-22: la administración de proteína pura IL-22 mediante minibomba osmótica implantada subcutánea no causa el engrosamiento de la epidermis en ratones IL-22R KO [0526] Para valorar si el IL-22RA era necesario para el engrosamiento epitelial inducido por IL-22, se administró IL-22 por vía subcutánea a ratones IL-22RA KO HOM y WT mediante minibombas osmóticas. Las bombas suministraban IL-22 a una velocidad de 18,4 µl al día durante 7 días. 4 ratones IL-22RA KO HOM y 6 WT recibieron proteína IL-22, mientras que 3 HOM y 1 WT recibieron PBS. [0527] Se ensayaron muestras de suero de ratones tratados con IL-22 en un ensayo de proliferación de BaF3 para confirmar la presencia de IL-22. Las células BaF3 transfectadas con IL-22RA y CRF2-4 requieren la presencia de IL-22 o IL-3 de murino para proliferar. Se centrifugaron estas células y se lavaron en medio completo sin mIL3 (medio RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) suplementado con 10% de suero fetal de ternero termoinactivado, L-glutaMax-1™ 2 mM (Gibco BRL), piruvato de sodio 1 mM (Gibco BRL) y antibiótico PSN (GIBCO BRL)) (de aquí en adelante designado como “medio exento de mIL-3”). Se centrifugaron las células y se lavaron 3 veces para asegurar al retirada de mIL-3. Se contaron entonces las células en un hemacitómetro y se sembraron en un formato de 96 pocillos a 5000 células por pocillo en un volumen final de 200 µl por pocillo, usando el medio exento de mIL-3. El suero de ratón estaba presente en los pocillos a un 1%, 0,5%, 0,25% o 0,125%. Se incubaron las placas de ensayo a 37ºC, 5 de CO2 durante 3 días, en cuyo momento se añadió azul de Alamar (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pocillo. Se incubaron de nuevo las placas a 37ºC, 5% de CO2 durante 24 horas. El azul de Alamar da una lectura fluorimétrica basada en el número de células vivas, y era por tanto una medida directa de la proliferación celular en comparación con un control negativo. Se incubaron de nuevo las placas a 37ºC, 5% de CO2 durante 24 horas. Se leyeron las placas en un Wallac Victor 2 1420 Multilabel Counter (Wallac, Turku, Finlandia) a longitudes de onda de 530 (excitación) y 590 (emisión). Los resultados muestran que ninguno de los animales inyectados con PBS tenía actividad de IL-22, mientras que 1 de 1 animal Het, 2 de 4 animales HOM y 3 de 6 animales WT tenían actividad IL-22 detectable. La proliferación inducida por este suero se bloqueaba por la presencia de IL-22BP 1 µg/ml, probando que era específica de IL-22. [0528] Se fijaron por inmersión en formalina tamponada al 10% muestras de piel de ratones con desactivación génica (KO) de IL-22RA HOM, Het y de control WT tratados con IL-22 y no tratados. Se cortaron los tejidos y se embebieron en parafina, se procesaron rutinariamente, se seccionaron a 5 µm (microtomo Jung 2065 Supercut, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y se tiñeron con H&E. Se evaluaron los tejidos teñidos bajo microscopio óptico (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY) patólogo veterinario con certificado de especialidad ACVP. [0529] Se evaluó cada muestra de piel en una escala de 0 (nada) a 4 (grave) de gravedad de inflamación en el tejido que bordea el sitio de implantación de bomba en la hipodermis, en una escala de 0 (nada) a 3 (difusa) de extensión del engrosamiento epidérmico (acantosis) y se contó el número de capas epiteliales en la parte más gruesa de la epidermis. No se encontró diferencia entre los ratones HOM y los ratones WT a los que se había administrado PBS. Se agruparon los resultados de estos dos grupos en un grupo de PBS. Se determinaron la media y la desviación estándar para cada grupo de tratamiento y se mostró en la Tabla 14 siguiente.

Tabla 14

Tratamiento

Control de PBS HOM KO: IL22 WT: IL-22

Número de ratones

4 4 6

Engrosamiento epitelial

3,5 ± 1,0 3,2 ± 0,5 5,9 ± 2,3

Extensión de la acantosis

0,5 ± 1,0 0,2 ± 0,5 1,9 ± 1,3

Inflamación

1,5 ± 1,0 1,2 ± 1,0 2,0 ± 1,0

[0530] Los resultados mostraron una tendencia aumentada hacia engrosamiento epitelial y acantosis en ratones WT tratados con IL-22 y menos engrosamiento epitelial y acantosis en ratones IL-22RA HOM cuando se exponen a IL-22.

5 [0531] Estos resultados proporcionan evidencias de que bloquear eficazmente la actividad de IL-22RA, por ejemplo mediante una desactivación génica de IL-22RA o de forma similar mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-22RA de la presente invención, reduciría de forma similar los efectos cutáneos inducidos por IL22, por ejemplo en psoriasis, EII, colitis u otras enfermedades inflamatorias inducidas

10 por IL-22.

D. El IL-22RA era necesario para el brillo inducido por IL-20 de la piel de crías neonatas: el cruzamiento de ratones transgénicos que expresan IL-20 de murino con ratones IL-22RA KO produce crías transgénicas que no brillan [0532] Para valorar si IL-22RA era necesario para el brillo inducido por IL-20 de

15 crías TG neonatas, se cruzó el transgén K14 muIL-20 en la línea IL-22RA KO, y se observó en los neonatos el fenotipo brillante. [0533] Han nacido 69 crías con una relación genotípica mendeliana. Todos los TG con fondo Het KO eran brillantes, mientras que ninguno de los no TG ni TG con fondo HOM KO eran brillantes.

20 [0534] Se efectuó un ensayo de proliferación celular con azul de Alamar usando células BaF3 que expresan IL-20RA e IL-20RB para valorar la presencia de IL-20 en el suero de ratón. Estas células proliferarán en respuesta a IL-20 o IL-3 de murino. El procedimiento era el mismo que el descrito en la sección C anterior. Los resultados del ensayo mostraron que todos los ratones TG tenían una actividad de IL-20 comparable

25 y al mismo nivel que IL-20 TG con fondo C57BL/6N. La ausencia de cualquier fenotipo neonatal brillante indica que el fenotipo neonatal brillante dependía de la presencia de IL-22RA. El ensayo de proliferación mostró que todos los ratones TG tenían una actividad de IL-20 comparable, y al mismo nivel que IL-20 TG con fondo C57BL/6N. La ausencia de cualquier fenotipo neonatal brillante indica que el fenotipo neonatal brillante dependía de la presencia de IL-22RA. [0535] El día 3 después del parto, se sacrificaron humanitariamente las crías de las camadas que contenían K14 muIL-20 TG con fondo IL-22RA KO y se fijó por inmersión en formalina tamponada al 10% el cuerpo entero. Se cortaron los tejidos fijados en secciones transversales de tórax y abdomen, se embebieron en parafina, se procesaron rutinariamente, se seccionaron a 5 µm (microtomo Jung 2065 Supercut, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y se tiñeron con H&E. Se evaluaron los tejidos teñidos bajo un microscopio óptico (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY) con enmascaramiento por un patólogo veterinario con certificado de especialidad ACVP. Se advirtieron las anormalidades de tejido y se contó el número de capas epiteliales en la epidermis del tórax anterior dorsal. [0536] Se examinaron microscópicamente los tejidos de tres ratones IL-20 TG con fondo HOM IL-22RA KO (IL-20 TG/IL-22RA KO HOM) y tres no-TG con fondo IL22RRA HOM KO (no-TG/IL-22RA KO HOM) y se encontró que no contenían anormalidades. Se examinaron también tejidos de dos ratones IL-20 TG con fondo Het IL-22RA KO (IL-20 TG/IL-22RA KO Het). Los números de capas epiteliales en la epidermis eran similares en todos los animales. Sin embargo, la epidermis de los dos ratones IL-20 TG/IL-22RA KO Het era hipereosinofílica en comparación con los otros animales y exhibía una pérdida de granularidad en el estrato granuloso. No se advirtieron otras anormalidades en la piel u otros tejidos de ninguno de los ratones. [0537] Estos resultados proporcionan evidencias de que bloquear eficazmente la actividad de IL-22RA, por ejemplo mediante una desactivación génica de IL-22RA o de forma similar mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-22RA de la presente invención, reduciría de forma similar los efectos cutáneos inducidos por IL20, así como los efectos cutáneos inducidos por IL-22, por ejemplo en psoriasis, EII, colitis u otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-20 y/o IL-22, incluyendo EII, artritis, asma, artritis psoriática, colitis, afecciones cutáneas inflamatorias y dermatitis atópica. Ejemplo 33 Análisis de las imágenes histomorfométricas de ratones con desactivación génica de IL-22RA [0538] Se ha establecido una línea de ratones transgénicos (TG) k14 IL-20m, y los neonatos TG exhiben un fenotipo brillante. El transgén se expresa por el promotor k14, que dirige la expresión a las células productoras de queratina en la piel. Se ha establecido también una línea de ratones con desactivación génica (KO) de IL-22RA y no se han observado cambios significativos en los ratones no expuestos. Se cruzaron entre sí las dos líneas y se recogieron los neonatos que tenían los siguientes cuatro genotipos diferentes: (1) TG/-HOM: expresa el transgén k14 IL-20m en un fondo que no expresa IL-22RA; (2) TG/- Het: expresa el transgén k14 IL-20m en un fondo que

5 expresa algo de IL-22RA a partir de una copia del gen de IL-22RA; (3) WT/HOM: no expresa el transgén k14 IL-20m en un fondo que no expresa IL-22RA y (4) WT/Het: no expresa el transgén k14 IL-20m en un fondo que expresa algo de IL-22RA a partir de una copia del gen de IL-22RA. Se sacrificaron 34 crías neonatas de estos diversos genotipos el día 3, aproximadamente 48 horas después del parto (Tabla 15):

10 Tabla 15

TG/- HOM* (Grupo 1) TG/- Het* (Grupo 2) WT/HOM* (Grupo 3) WT/Het* (Grupo 4)

Total n= 10 n= 10 n= 9 n= 5

TG= transgénico, WT= tipo silvestre, HOM= homocigótico, Het= heterocigótico y n= número de crías

[0539] Se seccionó transversalmente cada cría en tres secciones (tórax craneal, tórax caudal y abdomen) del cuerpo y se desechó la cabeza. Se fijaron los especímenes de tejido, de 4,0-5,0 mm de grosor, en formalina tamponada neutra al 10%, se procesaron en bloques de parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para 15 examen histológico rutinario y análisis de imágenes histomorfométricas. Se eligió la epidermis de la zona dorsal de la médula espinal en cada muestra de tejido para análisis de imágenes histomorfométricas usando un microscopio Olympus BH-2, una cámara de vídeo (Dage-MTI, Michigan City, IN) y software BioQuant True Color para Windows 98 (R&M Biometrics, Inc. Nashville, TN 37209) con los siguientes ajustes: 20 Parámetro: aumentos 10X, desplazamiento cero 0; Matriz: longitud (µm); Medida: modo manual y aditivo. Se midieron individualmente 10 veces el grosor (µm) de la epidermis y el estrato córneo o capa cornificada de cada muestra de piel, con aproximadamente 0,1 mm de intervalo entre cada medida, en cada campo microscópico 10x y se obtuvieron el valor medio, DE y EEM mediante cálculo por 25 Excel. Se aleatorizaron todas las secciones y se midieron con enmascaramiento. Después de la medida, se desenmascararon las secciones y se asignaron los resultados a los grupos de tratamiento. Se clasificaron los resultados finales por grupo de tratamiento como sigue: 1. Grosor epidérmico medio (µm) en tórax craneal, tórax caudal y abdomen, y se subclasificaron entonces como (a) grosor epidérmico medio en 30 tórax craneal; (b) grosor epidérmico medio en tórax caudal y (c) grosor epidérmico medio en abdomen. 2. Grosor medio del estrato córneo (µm) en tórax craneal, tórax caudal y abdomen y se subclasificaron como (a) grosor medio del estrato córneo en tórax craneal, (b) grosor medio del estrato córneo en tórax caudal y (c) grosor medio del estrato córneo en abdomen. 3. Grosor medio de epidermis más estrato córneo en 5 tórax craneal, tórax caudal y abdomen. Se analizaron los datos resultantes usando el software GraphPad InStat (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA 92121). Se aplicó análisis de varianza monofactorial (ANOVA) para examinar la significación estadística de las diferencias en valores medios del grupo 1 al grupo 4. Se usó la prueba de comparaciones múltiples de Tukey-Kramer para la determinación de las diferencias

10 estadísticas en los valores medios entre dos grupos (*P< 0,05; **P< 0,01; ***P< 0,001; ****P< 0,0001). Las observaciones de P< 0,05 se consideraron significativas.

(1)

Resultados histomorfométricos

(a)

Grosor epidérmico medio (µm) en tórax craneal, tórax caudal y abdomen [0540] El grosor epidérmico aumentó significativamente en las crías transgénicas

15 de IL-20 que carecían de una copia del gen de IL-22RA (TG/- Het) frente a las crías transgénicas de IL-20 sin expresión de IL-22RA (TG/- HOM, P= 0,001***) y frente a los compañeros de camada de control (WT/HOM, P=0,001*** y WT/Het, P=0,001***), respectivamente (Tabla 16). Las crías TG/-Het mostraron un grosor aumentado de la epidermis no queratinizada posiblemente debido a hipertrofia de

20 queratinocitos. Este aumento podría implicar las tres capas no queratinizadas (basal, espinosa y granular) pero lo más a menudo afectaba a la capa de células espinosas. La epidermis de la cría TG/- Het aumentaba aproximadamente un 25% en grosor y la espina se volvía prominente. Mientras que la epidermis de las crías TG/- HOM era ligeramente más gruesa que en los controles (WT/HOM y WT/Het) y las estadísticas

25 no indicaban una diferencia significativa entre los grupos (P> 0,05). Se compararon también el grosor epidérmico en tórax craneal, tórax caudal y abdomen. La epidermis normalmente fina del abdomen es más gruesa que en el tórax caudal y en el tórax caudal más gruesa que en el tórax craneal (Tabla 16).

Tabla 16

TG/- HOM (N= 28) TG/- Het (N= 30) WT/HOM (N= 27) WT/Het (N= 15)

Media 32,58 ± 1,25 41,05 ± 2,04 31,31 ± 1,08 30,83 ± 1,43

Los resultados representan valores medios ± EEM. N= número de secciones medidas.

30 [0541] El epitelio escamoso de la piel en el tórax craneal de crías TG/-Het mostró un aumento de grosor acompañado por hipertrofia de las células epidérmicas (queratinocitos), sin embargo, no había diferencia estadística en comparación con los otros grupos, TG/-HOM, WT/HOM y WT/Het (P=0,1565, Tabla 17). Esto parece ser el resultado de un artefacto histológico, por ejemplo la variabilidad de sección a sección, la arquitectura natural de la epidermis o que no había mucho efecto en la piel

5 fina del tórax craneal. Nota: el procedimiento histológico o seccionamiento de tejido del tórax craneal podría descalificar al análisis histomorfométrico para obtener significación estadística. Tabla 17

TG/- HOM (N= 10) TG/- Het (N= 10) WT/HOM (N= 9) WT/Het (N= 5)

Media 29,8 ± 2,24 33,20 ± 2,24 27,28 ± 0,62 29,38 ± 1,77

Los resultados representan valores medios ± EEM. N= número de secciones medidas.

[0542] La IL-20 (TG/-) con una copia del gen de IL-22RA (Het) mostró un valor

10 medio aumentado del grosor epidérmico en comparación con TG/- HOM (P< 0,05*), WT/HOM (P< 0,001***) y WT/Het (P< 0,01*), respectivamente (Tabla 18). Las estadísticas indicaban una significación extrema entre los grupos (P< 0,0001****). La epidermis de TG/-Het aumentó aproximadamente un 29% la de WT/Het. El fenotipo de crías IL-20 (TG/-) con ausencia de IL-22RA (HOM) se parecía en parte al de las

15 crías que carecían de una copia del gen de IL-22RA (Het) asociado a una epidermis más gruesa que la de los compañeros de camada de control (WT/HOM y WT/Het), sin embargo, no se demostró una diferencia estadística en comparación con los controles (P> 0,05). La epidermis TG/-HOM aumentó aproximadamente un 14% la de WT/HOM. Al contrario que las crías IL-20 TG/-, las crías deficientes en receptor IL

20 22RAm (WT/HOM y WT/Het) demostraron un grosor epidérmico relativamente más fino. Notablemente, el resultado histomorfométrico del grosor epidérmico en el tórax caudal era un hallazgo consistente correlacionado con el grosor epidérmico medio en tórax craneal, tórax caudal y abdomen (Tabla 15), lo que indicaba que el procedimiento histológico y el seccionamiento de tejido del tórax caudal dieron lugar a

25 la mejor calidad de análisis de imágenes histomorfométricas.

Tabla 18

TG/- HOM (N= 10) TG/- Het (N= 10) WT/HOM (N= 9) WT/Het (N= 5)

Media 35,91 ± 1,37 43,79 ± 2,35 30,83 ± 1,86 30,94 ± 2,83

Los resultados representan valores medios ± EEM. N= número de secciones medidas.

[0543] Los resultados del grosor epidérmico medio en el abdomen (Tabla 19) fueron similares al tórax caudal (Tabla 18) excepto porque TG/- HOM no mostró diferencias en comparación con los compañeros de camada de control (WT/HOM y

5 WT/Het, P> 0,05). Había algunas variaciones en las secciones de tejido y también faltaban dos secciones, concretamente sin epidermis que cubre la zona dorsal del grupo TG/- HOM. Tabla 19

TG/- HOM (N= 10) TG/- Het (N= 10) WT/HOM (N= 9) WT/Het (N= 5)

Media 32,35 ± 1,44 46,33 ± 3,10 35,81 ± 1,90 32,16 ± 2,97

Los resultados representan valores medios ± EEM. N= número de secciones medidas.

(b) Grosor medio (µm) de estrato córneo en tórax craneal, tórax caudal y abdomen

10 [0544] A pesar del grosor epidérmico aumentado en las crías transgénicas de IL20 (TG/-) en un fondo que no expresa IL-22RA (HOM) o que expresa una copia del gen (Het), se observó un predominio de la reducción del grosor del estrato córneo o capa cornificada en las pieles TG/-HOM y TG/- Het en comparación con los compañeros de camada de control (WT/HOM y WT/Het) y la estadística indicaba una

15 significación extrema entre los grupos (P< 0,0001****, Tabla 20). Las crías TG/- Het mostraron cantidades reducidas de queratina de aproximadamente un 36%, 50% y 49% en la superficie de la epidermis frente a TG/-HOM (P< 0,01**), WT/HOM (P< 0,001***) y WT/Het (P< 0,001***), respectivamente. Las crías TG/- HOM mostraron una reducción significativa de aproximadamente un 22% en el grosor del estrato

20 córneo en comparación con su control (WT/HOM, P< 0,05*) y sólo una reducción de un 17% frente a WT/Het que no reveló significación estadística (P >0,05). El grosor del estrato córneo en las crías de control WT/HOM y WT/Het era aproximadamente el mismo. Aparentemente, el estrato córneo en el tórax caudal es más grueso que el del abdomen y el del abdomen es más grueso que el del tórax craneal.

25 Tabla 20

TG/- HOM TG/- Het WT/HOM WT/Het

(N= 8) (N= 10) (N= 9) (N= 5)

Media 33,26 ± 2,69 21,41 ± 1,27 42,54 ± 2,01 40,31 ± 3,82

Los resultados representan valores medios ± EEM. N= número de secciones medidas.

[0545] El grosor medio del estrato córneo en el tórax craneal (Tabla 21) se parecía al del tórax craneal, tórax caudal y abdomen (Tabla 20), sin embargo, se encontró una reducción significativa del estrato córneo sólo en TG/- Het frente a TG/- HOM (P< 0,05*) y frente a WT/HOM (P< 0,01**), respectivamente. La desviación estándar y 5 error estándar de la media eran altos, lo que podría ser debido a un mal seccionamiento, a la falta de muestras de piel, a la arquitectura natural de la epidermis

o a que no había mucho efecto sobre el tórax craneal. Nota: el procedimiento histológico o seccionamiento de tejido del tórax craneal podría descalificar al análisis histomorfométrico para obtener un resultado de calidad.

10

Tabla 21

TG/- HOM (N= 28) TG/- Het (N= 30) WT/HOM (N= 26) WT/Het (N= 14)

Media 34,96 ± 3,53 18,14 ± 3,99 40,47 ± 4,38 32,96 ± 8,11

Los resultados representan valores medios ± EEM. N= número de secciones medidas.

[0546] El resultado del grosor medio del estrato córneo en el tórax caudal (Tabla 22) era similar al de tórax craneal, tórax caudal y abdomen pero con tres excepciones:

(1) TG/- HOM frente a TG/- Het y TG/- HOM frente a WT/HOM no mostraron

5 diferencias estadísticas (P >0,05); (2) TG/- HOM frente a WT/Het mostró una diferencia significativa (P< 0,01**); (3) el estrato córneo en WT/Het engrosaba notablemente, lo que podría ser la consecuencia de un artefacto del procesamiento de tejido, por ejemplo, la queratina se hinchaba o expandía cuando se disponía en disolución hipotónica o se dejaba en el baño de agua demasiado tiempo.

10 Tabla 22

TG/- HOM (N= 10) TG/- Het (N= 10) WT/HOM (N= 8) WT/Het (N= 4)

Media 35,64 ± 3,4 24,22 ± 1,54 44,35 ± 3,51 53,77 ± 7,21

Los resultados representan valores medios ± EEM. N= número de secciones medidas.

[0547] Sólo TG/- HOM frente a WT/HOM y TG/- Het frente a WT/HOM mostraron una diferencia estadísticamente significativa, P< 0,05* y P< 0,001***, respectivamente (Tabla 23). Las crías TG/- exhibían una reducción del grosor del estrato córneo en el abdomen en comparación con sus compañeros de camada de

15 control (WT/HOM y WT/Het).

Tabla 23

TG/- HOM (N= 8) TG/- Het (N= 10) WT/HOM (N= 9) WT/Het (N= 4)

Media 28,84 ± 4,36 21,86 ± 1,30 42,45 ± 3,15 33,25 ± 3,96

Los resultados representan valores medios ± EEM. N= número de secciones medidas.

(c) Grosor medio (µm) de epidermis más estrato córneo en tórax craneal, tórax caudal y abdomen [0548] Las crías TG/- Het exhibían un aumento significativo de grosor epidérmico

5 y una reducción significativa de grosor del estrato córneo en comparación con los compañeros de camada de control (WT/HOM y WT/Het) y las crías TG/- HOM producían un resultado similar pero con un efecto mínimo (Tabla 24).

Tabla 24

TG/- HOM (N= 10) TG/- Het (N= 10) WT/HOM (N= 9) WT/Het (N= 4)

Estrato córneo 32,58 41,05 31,31 30,83 Epidermis 33,26 21,41 42,54 40,31

Los resultados representan valores medios. N= número de crías.

(d) Señalización de IL-20 mediante ambos IL-20RA e IL-22RA

10 [0549] La epidermis es un epitelio estratificado en renovación continua que depende de un equilibrio entre proliferación, diferenciación y muerte celular para la homeostasis. En epidermis normal, una capa basal mitóticamente activa da lugar a queratinocitos de diferenciación terminal que migran hacia fuera y se desprenden en última instancia de la superficie de la piel en forma de escamas enucleadas, la

15 queratina o capa cornificada se localiza en el estrato córneo. Aunque son conocidas muchas proteínas que funcionan manteniendo la homeostasis epidérmica, la coordinación molecular de estos eventos es mal comprendida. La IL-20 es una proteína de interacción con receptor novedosa y señaliza mediante receptores IL-20RA o IL22RA (IL-22RA) expresados en una capa de la piel asociada a la proliferación de

20 queratinocitos. Los neonatos transgénicos de IL-20 exhiben un fenotipo cutáneo anormal engrosado y brillante. La deficiencia de IL-22RAm (HOM) en ratones no mostró respuesta al tratamiento con IL-22, mientras que los ratones de tipo silvestre con el gen de IL-22RA y tratados con IL-22 mostraron un aumento significativo del grosor epidérmico (P< 0,001***, véanse los resultados en el análisis de imágenes

25 histomorfométricas de IL-22RAm KO/IL-22, PID 59.2). Para investigar si la ausencia de IL-22RA tiene efecto sobre el fenotipo brillante observado en neonatos TG K14 IL20m, se emparejaron ratones transgénicos que expresan ectópicamente IL-20 con deficientes de IL-22RA homocigóticos (HOM) o heterocigóticos (Het). Se efectuó anteriormente un análisis cuantitativo de imágenes del grosor epidérmico en el tórax caudal de unas pocas crías de este estudio (concretamente 19 crías, una sección por cría, para un total de 19 secciones) pero no se obtuvo una significación estadística debido al número limitado de animales estudiados y a la variación en los grupos. El objetivo del presente estudio era cuantificar histomorfométricamente más muestras de piel en tórax craneal, tórax caudal y abdomen de cada cría del mismo estudio (concretamente, 34 crías, 3 secciones por cría, para un total de 102 secciones) para explorar la biología de IL-20 y obtener resultados cuantitativos fiables. Para un análisis de imágenes eficaz, se aseguró de que la orientación de la piel en el bloque de parafina fuera consistente y que las muestras de piel se midieran de las mismas localizaciones respectivas en todos los individuos y grupos de crías. Se efectuaron dos clase de medidas: (1) se midió el grosor de la epidermis 10 veces por campo microscópico 10x en cada muestra de piel, cada una en el lado dorsal de la médula espinal, para investigar el papel de IL-20 en la mediación de la proliferación y diferenciación de queratinocitos; (2) se midió el grosor de la capa cornificada o estrato córneo de la misma manera para correlacionar los resultados con la apariencia de piel brillante en los neonatos TG de IL-20. [0550] El análisis de imágenes histomorfométricas del grosor epidérmico reveló que los neonatos TG/- Het, que expresan el transgén k14 IL-20m en un fondo que expresa algo de IL-22RA a partir de una copia del gen de IL-22RA, exhibían epidermis engrosada y los neonatos TG/- HOM, que expresan el transgén k14 IL-20m en un fondo que no expresa IL-22RA, no tenían un cambio significativo. El grosor epidérmico aumentó significativamente en crías transgénicas de IL-20 que carecían de una copia del gen de IL-22RA (TG/- Het) frente a las crías transgénicas de IL-20 que carecían de ambas copias de los genes de IL-22RA (TG/-HOM, P= 0,001***) y frente a los compañeros de camada de control (WT/HOM, P= 0,001*** y WT/Het, P= 0.001***). Las crías TG/- Het mostraron un grosor aumentado de la epidermis no queratinizada debido principalmente a la hipertrofia de los queratinocitos en la capa espinosa. La epidermis de la cría TG/- Het aumentaba aproximadamente un 25% en grosor, mientras que la epidermis de crías TG/-HOM era sólo ligeramente más gruesa, aumentaba aproximadamente un 4-5% de los controles (WT/HOM y WT/Het) y la estadística no indicaba una diferencia significativa entre TG/- HOM y su control WT/HOM (P> 0,05). [0551] Los resultados histomorfométricos del estrato córneo mostraron que, a pesar del engrosamiento epidérmico en neonatos TG/-Het, se observó una reducción predominante del grosor de queratina o capa cornificada en pieles TG/- HOM y TG/-Het en comparación con los compañeros de camada de control (WT/HOM y WT/Het) y la estadística indicó una significación extremada entre los grupos (P< 0,0001****). Las crías TG/- Het mostraron cantidades reducidas de queratina de aproximadamente un 36%, 50% y 49% en la superficie de la epidermis frente a TG/-HOM (P <0,01**), WT/HOM (P <0,001***) y WT/Het (P <0,001***), respectivamente. Las crías TG/- HOM mostraron una reducción significativa de aproximadamente un 22% en el grosor del estrato córneo en comparación con su control (WT/HOM, P< 0,05*) y una reducción de sólo un 17% frente a WT/Het (P> 0,05).El grosor del estrato córneo en las crías de control, WT/HOM y WT/Het, era aproximadamente el mismo. La reducción de grosor medio del estrato córneo en los neonatos TG/- HOM y TG/- Het parecía correlacionarse con el hallazgo macroscópico como tal, en el que a nivel macroscópico los neonatos IL-20 (TG)/IL-22RA (Het) parecen tener un brillo reducido (por ejemplo, con menos queratina), denominado lustre, mientras que los neonatos IL20 (TG)/IL-22RA (HOM) no brillan (por ejemplo, con más queratina). Histológicamente, la queratina del estrato córneo en las crías TG/- parecía estar más compacta que en las crías WT. Conjuntamente, la epidermis engrosada asociada a queratinocitos hipertróficos y la capa fina de estrato córneo en los neonatos transgénicos de IL-20 podrían explicar por qué exhibían un fenotipo de piel brillante. [0552] Se observaron una hipertrofia aumentada y una diferenciación terminal alterada de los queratinocitos en los neonatos transgénicos de IL-20 con una desactivación génica orientada de una copia del gen de IL-22RA (Het). La piel exhibía hipertrofia de queratinocitos pero no conseguía diferenciarse completamente, careciendo de queratina o estrato córneo. Los neonatos transgénicos de IL-20 con desestabilización de las dos copias de los genes de IL-22RA (HOM) exhibían un fenotipo que se parecía a la piel TG/- Het pero mostraron un efecto menor o mínimo (Figuras 12-15). Parece que la ausencia de IL-22RA (HOM) tiene un efecto parcial sobre el fenotipo brillante observado en neonatos TG K14 IL-20m y la ausencia de IL22RA (Het) tiene un efecto mínimo o nulo sobre el fenotipo brillante. En otras palabras, la señalización de IL-20, una proteína de interacción con receptor novedosa que señaliza mediante el receptor IL-20RA o IL-22RA (IL-22RA), probablemente no está obstruida por la expresión deficiente de una copia del gen de IL-22RA (Het) pero está parcialmente obstruida por la expresión deficiente de las dos copias del gen de IL22RA (HOM). [0553] Estos resultados proporcionan evidencias de que bloquear eficazmente la actividad de IL-22, por ejemplo mediante una desactivación génica de IL-22RA o de

5 forma similar mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante de IL-22RA de la presente invención, reduciría de forma similar los efectos cutáneos inducidos por IL20, así como los efectos cutáneos inducidos por IL-22, por ejemplo en psoriasis, EII, colitis u otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-20 y/o IL-22. Ejemplo 34

10 Efecto de IL-22 sobre ratones con desactivación génica de IL-22RA [0554] Se trataron 36 ratones incluyendo 23 IL-22RA KO (HOM) y 13 controles (WT) con IL-22 o PBS administrado por vía subcutánea mediante una minibomba implantada con un tubo o una minibomba sola (Tabla 25):

Tabla 25

HOM/PBS

HOM/IL-22 WT/PBS WT/IL-22

(grupo 1)

(grupo 2) (grupo 3) (grupo 4)

Macho

n =3 n= 10 n= 3 n= 8

Hembra

n= 0 n= 10 n= 0 n= 2

Total

n= 3 n= 20 n= 3 n =10

15 [0555] Se obtuvo una muestra de piel de 1,5-2,5 cm de longitud y 4,0-5,0 mm de grosor del sitio de bombeo de cada animal para examen histológico rutinario y análisis de imágenes histomorfométricas. Se fijaron todos los especímenes de tejido con formalina tamponada neutra al 10% y se procesaron en bloques de parafina. Se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) 6 secciones de segmento, de 5 µm de grosor y 10

20 µm de intervalo entre secciones adyacentes, con epitelio que cubre toda la superficie, de cada muestra de piel por animal. Se efectuó el análisis de imágenes histomorfométricas de las muestras de piel usando un microscopio Olympus BH-2, una cámara de vídeo (Dage-MTI, Michigan City, IN) y el software BioQuant True Color para Windows 98 (R&M Biometrics, Inc. Nashville, TN 37209) con el siguiente

25 ajuste: parámetro. 10X aumentos, desplazamiento cero 0; matriz: longitud (µm); medida: modo manual y aditivo. Se midió el grosor (µm) de la epidermis 5 veces en cada campo microscópico de 10x de un total de 4 campos capturados desde el centro a 0,4 cm de cada sección de piel (por ejemplo, un campo microscópico 10x = 0,1 cm y cuatro campos microscópicos 10x= 0,4 cm). Se midieron un total de 6 secciones de

30 cada animal y se obtuvieron el valor medio, DE y EEM mediante cálculo por Excel. Se aleatorizaron todas las secciones y se midieron con enmascaramiento. Después de la medida, se desenmascararon las secciones y se asignaron los resultados a los grupos de tratamiento. Se clasificaron los resultados finales por grupo de tratamiento como sigue:

1. Grosor epidérmico de ratones macho y hembra HOM y WT. 2. Grosor epidérmico

5 de ratones macho HOM y WT. Se analizaron los datos resultantes usando el software GraphPad InStat (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA 92121). Se aplicó análisis de varianza monofactorial (ANOVA) para examinar la significación estadística de las diferencias en valores medios del grupo 1 al grupo 4. Se usó la prueba de comparaciones múltiples de Tukey-Kramer y la prueba de t no pareada para analizar la

10 significación en los valores medios entre dos grupos. Las observaciones de P< 0,05 se consideraron significativas.

III. Resultados histomorfométricos

(1) Grosor epidérmico (µm) de ratones macho y hembra HOM y WT [0556] El grosor epidérmico aumentó significativamente en las pieles de ratón WT

15 tratadas con IL-22 (WT/IL-22) frente a los controles WT/PBS (P= 0,0001). La piel de ratón IL-22RAm KO tratada con IL-22 (HOM/IL-22) mostró un valor medio aumentado del grosor epidémico en comparación con los controles HOM/PBS, sin embargo la estadística no indicó una diferencia significativa entre los dos grupos (P> 0,05). Se observó una reducción predominante del grosor epidérmico en los ratones IL

20 22RA KO en comparación con los ratones WT (por ejemplo, HOM/IL-22 frente a WT/IL-22: P< 0,001) (Tabla 26). Tabla 26

HOM/PBS (N= 3) HOM/IL-22 (N= 19) WT/PBS (N= 3) WT/IL-22 (N= 10)

Media 14,15 ± 0,19 19,01 ± 1,03 23,34 ± 5,49 43,08 ± 1,85

Los resultados representan valores medios ± EEM. N= número de animales

(2) Grosor epidérmico (µm) de ratones macho HOM y WT [0557] El grosor epidérmico aumentó aproximadamente 2 veces en las pieles de

25 ratón macho WT tratadas con IL-22 (WT/IL-22) cuando se comparan con controles macho WT/PBS (P= 0,0001), sin embargo, la epidermis de ratón macho IL-22RAm KO tratada con IL-22 (HOM-IL-22) mostró sólo un ligaro aumento en comparación con los controles macho HOM/PBS (P> 0,05). Notablemente, los ratones IL-22RAm KO exhibieron una notable reducción del grosor epidérmico en comparación con su

30 control, los ratones macho WT (por ejemplo, HOM/PBS frente a WT/PBS: P< 0,05; HOM/IL-22 frente a WT/IL-22: P< 0,001) (Tabla 27).

Tabla 27

HOM/PBS (N= 3) HOM/IL-22 (N= 9) WT/PBS (N= 3)

WT/IL-22 (N= 8)

Media 14,15 ± 0,19 15,86 ± 0,75 23,34 ± 5,49

41,41 ± 1,71

Los resultados representan valores medios ± EEM

(3) Grosor epidérmico (µm) de ratones HOM y WT, macho frente a hembra [0558] La epidermis de ratones hembra se encontró más gruesa que la de ratones macho (por ejemplo, HOM/IL-22/macho frente a HOM/IL-22/hembra: P< 0,01;

5 WT/IL-22/macho frente a WT/IL-22/hembra: P< 0,05) (Tabla 28). Tabla 28

HOM/IL-22 (macho, N= 9) HOM/IL-22 (hembra, N= 10) WT/IL-22 (macho, N=8)

WT/IL-22 (hembra, N= 2)

Media 15,86 ± 0,75 21,85 ± 1,3 41,41 ± 1,71

49,75 ± 4,82

Los resultados representan valores medios ± EEM

(4) Grosor epidérmico (µm) de ratones HOM, bomba de IL-22 frente a bomba de IL22 con tubo [0559] Se encontró que la epidermis de ratones IL-22RAm KO (HOM) con

10 bomba de IL-22 y tubo era significativamente más gruesa que la de ratones IL-22RAm KO (HOM) con bomba sólo (P< 0,0001, mediante prueba de t no apareada) (Tabla 29).

Tabla 29

HOM w/bomba de IL-22 (M= 8 y F= 2, N= 10) HOM w/bomba de IL-22 con tubo (M= 2 y F= 8, N= 10)

Media 15,85 ± 0,65 23,30 ± 1,36

Los resultados representan valores medios ± EEM M: macho, F: hembra, N: número total de ratones

IV. Discusión

15 [0560] Tomado en conjunto, el objetivo de este estudio es caracterizar los efectos epidérmicos en pieles tratadas con IL-22 de ratones tanto IL-22RAm KO como WT y relacionar estos hallazgos con indicaciones clínicas. Se efectuó un análisis cuantitativo de imágenes para determinar el grosor de la epidermis en secciones de piel teñidas con H&E. Se midieron histomorfométricamente las muestras de piel de cada animal 120

20 veces (concretamente, 20 veces/cada sección x 6 secciones de segmento de cada ratón= 120 medidas) y se obtuvo el grosor epidérmico medio mediante cálculo por Excel. El estudio histomorfométrico demostró que la IL-22 daba como resultado un aumento significativo del grosor epidérmico, especialmente en ratones WT en presencia del receptor IL-22RA (P< 0,0001 por ANOVA, considerado extremadamente significativo) y mostraba menos efectos o mínimos sobre ratones IL22RAm KO (HOM) con ausencia del receptor IL-22RA (P> 0,05). El grosor epidérmico en ratones WT tratados con IL-22 aumentó aproximadamente un 43% más que en los tratados con PBS (por ejemplo, WT/PBS, P< 0,001), mientras que los ratones IL-22RAm KO (HOM) tratados con IL-22 mostraron sólo un aumento de un 26% de grosor epidérmico en comparación con el control (HOM/PBS, P> 0,05). Los ratones IL-22RAm KO exhibían una epidermis más fina cuando se comparaban con los ratones WT (P< 0,001). Globalmente, los efectos biológicos de IL-22 sobre piel de ratón sugieren que este factor podría estar implicado en la regulación del crecimiento y proliferación epidérmicos. Ejemplo 35 Farmacocinética de un anticuerpo monoclonal anti-IL-20 humano (clon nº 262.7.1.3.2.4) [0561] Se proporcionó el anticuerpo monoclonal de ensayo, mAb anti-IL-20 humano (clon nº 262.7.1.3.2.4) en 3x alícuotas de 3 ml a una concentración de 1,08 mg/ml (determinada por absorbancia UV a 280 nm) y se almacenó a -80ºC hasta el uso. El vehículo era 1X PBS (algo de NaPO4, NaCl 109 mM), pH 7,3. Se descongeló el mAb a temperatura ambiente antes del uso y se usaron las alícuotas 1 y 2 como se proporcionan para los grupos de dosificación IV y SC de 100 µg, respectivamente. Se diluyó 1:2 la mitad de la alícuota 3 en 1X PBS para el grupo de dosis SC de 50 µg y se diluyó 1:10 la segunda mitad de la alícuota 3 en 1X PBS para el grupo de dosis SC de 10 µg. Se recibieron ratones SCID hembra (n= 96) de Charles River Labs. Se comprobó la salud de los animales a su llegada y se albergaron por grupos (3 animales por jaula). Los ratones eran de 12 semanas de edad con un peso corporal medio de 22 g al inicio del estudio.

A. Protocolo de dosificación [0562] Se dispusieron aleatoriamente ratones SCID hembra (n= 24/grupo de dosis) en cuatro grupos de dosificación (véase la Tabla 30). Se administró al grupo 1 el mAb anti-huIL-20 mediante inyección IV de aproximadamente 93 µl en la vena de la cola y se administró a los grupos 2, 3 y 4 el mAb por inyección SC de aproximadamente 93 µl en el pescuezo.

B. Recogida de muestra [0563] Antes de la recogida de sangre, se anestesiaron totalmente los ratones con halotano o isofluorano. Se recogieron muestras de sangre mediante punción cardiaca para todos los puntos temporales excepto el punto temporal de 168 h (recogida

5 mediante toma de sangre ocular y se tomó sangre de nuevo de los mismos animales en el punto temporal de 504 h mediante punción cardiaca). Se recogió la sangre en tubos separadores de suero y se dejaron coagular durante 15 minutos. Se centrifugaron posteriormente las muestras durante 3 minutos a 14.000 rpm. Después de la centrifugación, se dispensaron alícuotas de 125-150 µl en tubos Eppendorf etiquetados

10 y se almacenaron inmediatamente a -80ºC hasta el análisis (Tabla 30). Tabla 30

Nº de grupo

Dosis (ROA) Animales Puntos temporales PK

1

100 µg (IV) 3 ratones/punto temporal* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 h

2

100 µg (SC)* 3 ratones/punto temporal* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 h

3

50 µg (SC) 3 ratones/punto temporal* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 h

4

10 µg (SC) 3 ratones/punto temporal* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 h

* Se usaron los mismos animales para los puntos temporales de 168 y 504 h

C. Cuantificación de las concentraciones de mAb anti-huIL-20 sérico por ELISA

[0564] Se desarrolló un ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA) y se 15 cualificó para analizar muestras de suero de ratón de animales dosificados con mAb

267.7.1.3.2.4 anti-IL-20 durante los estudios farmacocinéticos. Se diseñó este estudio para aprovechar un anticuerpo secundario comercialmente disponible y la detección colorimétrica usando TMB. Se modificaron las diluciones usadas para la curva patrón para mejorar la definición de la porción lineal de la curva patrón. Se tuvo en cuenta

20 una curva patrón en el intervalo de 100 ng/ml a 0,231 ng/ml con diluciones de 2 veces permitidas para la cuantificación de las muestras de suero de ratón. Se diluyeron las muestras QC a 1:100, 1:1000 y 1:10000 en suero de ratón SCID al 10% y se recalcularon a partir de la curva patrón.

D. Análisis farmacocinéticos [0565] Se descargaron los datos de concentración sérica frente al tiempo con el software WinNonlin Professional 4.0 (Pharsight, Inc.; Cary, NC) para análisis farmacocinético. Se usaron análisis no compartimentalizados para determinar los

5 parámetros farmacocinéticos basándose en los datos medios en cada punto temporal.

E. Resultados [0566] Se muestran las concentraciones de mAb anti-IL-20 humana después de la administración de 100 µg IV y 100, 50 y 10 µg SC en la Tabla 31:

Tabla 31

Tiempo (h)

Conc. a 100 µg IV (µg/ml) Conc. a 10 µg SC (µg/ml) Conc. a 50 µg SC (µg/ml) Conc. a 100 µg SC (µg/ml)

0,25

196 (12) LTR 0,101 (0,065) 0,481 (0,485)

1

154 (18) 0,356 (0,146) 1,61 (0,52) 3,48 (1,72)

4

118 (20) 2,42 (0,53) 10,4 (3,4) 19,7 (4,7)

8

112 (20) 3,41 (0,30) 18,9 (3,6) 40,2 (6,4)

24

103 (13) 4,95 (0,05) 26,3 (0,7) 50,1 (6,2)

72

101 (16) 4,27 (0,79) 21,0 (3,4) 43,4 (2,7)

168

45,6 (15,4) 2,92 (0,53) 19,6 (2,7) 37,6 (3,4)

336

36,4 (16,6) 3,60 (0,31) 23,5 (3,5) 34,4 (5,8)

504

28,8 (3,8) 2,74 (0,39) 20,5 (3,6) 25,7 (2,1)

LTR= indetectable

10 [0567] Después de la administración IV, el perfil de concentración de mAb frente al tiempo demostró una bajada biexponencial. Después de la administración SC, el mAb parecía tener una fase de absorción lenta, con la eliminación limitada por la velocidad de absorción. Se muestran en la Tabla 32 los parámetros farmacocinéticos basados en los datos medios de cada punto temporal:

15 Tabla 32 [0568] Después de la administración IV, el mAb demostró un aclaramiento muy bajo (CL = 0,002 ml/h) y una semivida de eliminación muy larga (t1/2, λz ~ 21 días). El mAb demostró un volumen de distribución en estado estacionario (Vss =1,3 ml) que es menor que el volumen sanguíneo de un ratón (~1,7 ml), sugiriendo que el mAb no se

Parámetros

Unidades 100 µg IV 10 µg SC 50 µg SC 100 µg SC

C0 (VI); Cmáx (SC)

µg/ml 212 4,95 26,3 50,1

Tmáx

h N/A 24 24 24

t1/2, λz

h 509 ND ND 612

AUC(0-t)

h·µg/ml 27059 1730 10845 18110

AUC(0-inf)

h·µg/ml 48269 ND ND 41561

AUC(% extrapolado)

% 43,9 ND ND 56,4

Vss (IV), Vz/F (SC)

ml/h 1,34 ND ND 2,12

CI (IV), CI/F (SC) (biodisponibilidad)

% N/A ND ND 86,1

ND: no determinable debido a la falta de datos en la fase de eliminación terminal del perfil de concentración frente al tiempo

5 distribuía sustancialmente fuera del compartimento vascular. La concentración máxima recalculada (C0) era mayor de lo esperado basándose en la dosis inyectada y el volumen de sangre del ratón. Esto, junto con el bajo Vss, sugiere que el mAb puede estar confinado en gran medida en la fracción sérica de la sangre. [0569] Después de la administración SC, los valores de Cmáx aumentaron

10 linealmente con la dosis. A la dosis de 100 µg SC, el mAb tenía una t1/2, λz de aproximadamente 25 días con aclaramiento y volumen aparente de distribución similares a después de la dosificación IV. La biodisponibilidad era del 86%. A las dos dosis SC menores, no pudieron estimarse la mayoría de parámetros farmacocinéticis debido a la falta de una fase de eliminación terminal medible, aunque las muestras se

15 tomaran después de 504 horas. La absorción del mAb después de dosificación SC parece alcanzar un estado estacionario con eliminación a lo largo de la duración del estudio. Ejemplo 36 Los antagonistas de IL-20 e IL-22 en el modelo de colitis y psoriasis CD4+CD45RBhi

20 (CD25-)

A. Sumario [0570] La transferencia de linfocitos T CD4+ CD45RBhi o CD4+CD25- a ratones SCID singénicos da como resultado colitis en los ratones. La cotrasferencia de linfocitos T reguladores (CD4+CD25+ o CD4+CD45RBlo) inhibe esta colitis. Después

25 de la transferencia de linfocitos T CD4+CD25- a ratones, si se inyecta adicionalmente a los ratones enterotoxina B estafilocóccica (SEB), los ratones no sólo desarrollan colitis, sino también psoriasis. Los anticuerpos contra IL-22RA, IL-20, IL-22, IL20R y/o IL-22R, o receptores solubles IL-22RA, se administran los días 0-21 después de la transferencia celular y se controlan los síntomas de colitis y psoriasis. La inhibición de la puntuación psoriática o colitis (histología) indica que la IL-21 puede inhibir estas enfermedades autoinmunes.

B. Diseño del estudio [0571] Se aíslan bazos y nódulos linfáticos inguinales de ratones B10.D2. Se forman suspensiones monocelulares y se cuentan. Usando el sistema Miltenyi Bead, se clasifican las células CD25+ por selección positiva. Se tiñen las células con CD25-PE (BD Pharmingen) a dilución 1:100 y se incuban durante 15 minutos. Se elimina por lavado el exceso de anticuerpo y se incuban las células con 10 µl de perlas anti-PE/106 células durante 20 minutos. Se lavan las células con PBS y se pasan por una columna LS (Miltenyi Biotech). Se retienen las células que pasan por la columna (CD25-) para análisis adicional. Se añade un cóctel de enriquecimiento de CD4 (Stem Cell Technologies) (1:100) a estas células CD25- y se incuban durante 15 minutos. Se lavan las células con PBS. Se añade una dilución 1:10 de tetrámero anti-biotina a las células durante 15 minutos seguido de un coloide magnético (60 µl/106 células) durante 15 minutos (todo de Stem Cell Technologies). Se pasan las células a través de una columna de selección negativa (1,27 cm, Stem Cell Technologies). Las células que pasan a través son las células CD4+CD25-. Se analiza la pureza usando citometría de flujo. Se inyectan 0,4 x 106 células i.v. en ratones SCID CB-17 no infectados con un volumen total de 200 µl. Se inyectan i.p. en los ratones 10 µg de SEB al día siguiente (d1). Se siguen los síntomas de psoriasis y colitis durante 2-5 semanas. Se puntúa en los ratones la enfermedad psoriática según los siguientes criterios: 0- sin lesiones, 1- lesiones leves en el cuello, 2- lesiones graves en cuello y espalda (tronco) 3- lesiones muy graves en cuello, espalda y vientre de los ratones. Se mide también el engrosamiento de oreja como medida de la gravedad de la enfermedad. Se inyectan i.p. a grupos de ratones PBS, 100 µg de anticuerpo de control o 10-110 µg de anticuerpos contra IL-22RA, IL-20, IL-22, IL-20R o IL-22R, o IL-22RA soluble los días 1-30 con diferentes regímenes de dosificación (3x/semana o 2x/semana).

C. Resultados y conclusión [0572] La inhibición de los síntomas psoriáticos y de colitis en ratones tratados con anticuerpo indica que la inhibición de la función de IL-20 y/o IL-22 puede inhibir los síntomas autoinmunitarios en este modelo de psoriasis y colitis. Ejemplo 37 Antagonistas de IL-20 e IL-22 en el modelo de psoriasis por transplante de SCID-hu [0573] La piel psoriática humana injertada en ratones SCID peude mantener sus rasgos psoriáticos clínicos, microscópicos ópticos e inmunohistoquímicos durante varias semanas. Este modelo proporciona un sistema para evaluar terapias que pretenden restaurar el tejido lesionado a un fenotipo normal. Una vez se injerta exitosamente la piel humana, pueden administrarse anticuerpos contra IL-22RA, IL20, IL-22, IL-20R y/o IL-22R, o receptores de IL-20 o IL-22 solubles durante varias semanas, y puede analizarse el grosor epidérmico para evaluar el efecto de estos antagonistas sobre la psoriasis.

B. Diseño del estudio [0574] Se obtienen biopsias por punción de 6 mm de grosor completo constituidas por la epidermis completa y varios mm de dermis de voluntarios adultos sanos y pieles lesionadas psoriáticas. Se obtienen 4 a 6 biopsias de cada donante. Se transplanta una biopsia de punción de cada donante a la superficie dorsal de ratones SCID receptores (CD-17, Taconic). Se mantienen los animales en un entorno exento de patógenos. Se inicia el tratamiento después del injerto exitoso (2-3 semanas después del transplante) como sigue: una biopsia para control negativo (PBS o mAb isotípico), una biopsia para control positivo (ciclosporina A) y 2-3 biopsias para tratamiento con mAb anti-IL22RA, anti-IL-20 humana, anti-IL-22 humana o receptores solubles de IL-20 o IL-22 (inyección intraperitoneal tres veces por semana durante 2-4 semanas en un programa de L-M-V).

C. Análisis cuantitativo: [0575] Se harán observaciones y valoraciones clínicas regularmente a lo largo de los experimentos, y se registrarán. Se valora la gravedad de las lesiones psoriáticas por escamación, induración y eritema con enmascaramiento. Los parámetros pueden puntuarse usando una escala de tres puntos: 0= falta completa de implicación cutánea; 1= implicación ligera; 2= implicación moderada; 3= implicación grave. Al final del periodo de dosificación, se sacrifica cada animal y se recogen los tejidos para histología e IHQ. (1) Parte de este tejido se fija con formalina al 10% y se tiñe con hematoxilina y eosina. Se mide el área epidérmica en función de los cambios en el grosor epidérmico por unidad de longitud usando software NIH Image. Se cuantifican múltiples áreas de cada transplante para proporcionar un valor alto de n y de área epidérmica media. (2) Número de células mononucleares inflamatorias por campo de alta potencia (0,103 x 0,135 mm) en la dermis superior. (3) El grado de paraqueratosis se estima en una escala arbitraria de 0 a 3, en la que 0 es sin paraqueratosis, 1 es paraqueratosis en menos de un tercio de la sección, 2 es paraqueratosis en más de un tercio pero menos de dos tercios de la sección y 3 es paraqueratosis es más de dos tercios de la sección. (4) El resto del tejido se teñirá con Ki67 (marcador de queratinocitos en proliferación) para evaluar el número de queratinocitos ciclantes de Ki67 por milímetro de longitud de la sección. La gravedad reducida de la psoriasis, medida mediante el grosor epidérmico, indica que la neutralización de la función de IL-20 e IL-22 puede ser eficaz en este modelo de psoriasis. Para cuantificar la gravedad reducida de la psoriasis, se mide el grosor epidérmico, el número de células inflamatorias en la dermis superior, los números de queratinocitos ciclantes de Ki67 y los grados de paraqueratosis. Los cuatro parámetros significamente reducidos para los grupos tratados en comparación con los ratones de control indican el uso terapéutico potencial de los antagonistas de IL-20 e IL-22. Ejemplo 38 Cribado de actividad antagonista de IL-20 usando células BaF3/IL-22RA/IL-20RB usando un ensayo de proliferación de azul de Alamar [0576] Se cotransfectó la línea celular BaF3 pre-B dependiente de factor con IL22RA e IL-20RB (véase el procedimiento del Ejemplo 3) y se trató con IL-20 a diversas concentraciones. Se valoró la proliferación usando un ensayo de azul de Alamar como se describe en el Ejemplo 3. La IL-20 estimulaba la proliferación de manera dependiente de la dosis a las concentraciones esperadas para una citocina, demostrando que la IL-20 se une a y activa el receptor IL-22RA/IL-20RB heterodimérico a las concentraciones esperadas para una citocina. Los controles negativos que contenían BaF3 no transfectadas no proliferaban. [0577] Para determinar si los anticuerpos dirigidos contra IL-22RA son capaces de antagonizar la actividad de IL-20, se efectúa el ensayo descrito anteriormente usando anticuerpo dirigido contra IL-22RA como antagonista de la actividad de IL-20. Cuando se combina IL-20 con dicho antagonista, la respuesta a IL-20 se reduce a los niveles de fondo. Que la presencia de un antagonista anule o reduzca los efectos proliferativos de IL-20 demuestra que es un antagonista del ligando IL-20. Este ensayo puede usarse para ensayar otros antagonistas de la actividad de IL-20 descritos en la presente memoria, tales como polipéptidos antagonistas que comprenden un receptor IL-22RA soluble. Ejemplo 39 Neutralización de la actividad de IL-20 e IL-22 por anticuerpo monoclonal antihuL22RA [0578] Usando el ensayo de neutralización basado en células descrito en el Ejemplo 28, se añadió un anticuerpo monoclonal anti-huIL-22RA de ratón purificado (Ejemplo 30(D)) en forma de una dilución en serie, por ejemplo, a 10 µg/ml, 5 µg/ml, 2,5 µg/ml, 1,25 µg/ml, 625 ng/ml, 313 ng/ml, 156 ng/ml y 78 ng/ml. Se incubaron las placas de ensayo a 37ºC, 5% de CO2 durante 4 días, en cuyo momento se añadió azul de Alamar (Accumed, Chicago, IL) a 200 µl/pocillo. Se incubaron de nuevo las placas a 37ºC, 5% de CO2 durante 16 horas. Los resultados mostraron que el anticuerpo monoclonal anti-huIL-22RA purificado podía neutralizar la señalización tanto de huIL22 como de huIL-20 mediante huIL-22RA. A la concentración de 10 µg/ml, el anticuerpo neutralizaba completamente la proliferación inducida por huIL-22 o huIL20, reduciéndose la inhibición de la proliferación de forma dependiente de la dosis a las concentraciones menores. Un mAb de ratón de control negativo de isotipo coincidente, ensayados a las concentraciones descritas anteriormente, no proporcionó inhibición de la proliferación de ninguna citocina. Estos resultados demuestran adicionalmente que los anticuerpos monoclonales de IL-22RA podrían antagonizar de hecho la actividad de los ligandos proinflamatorios IL-20 e IL-22 a bajas concentraciones. [0579] Estos resultados proporcionaron evidencias adicionales de que bloquear eficazmente la actividad de IL-22RA, por ejemplo mediante un anticuerpo neutralizante de IL-22RA de la presente invención, podría ser ventajoso para bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar los efectos de IL-20 e IL-22 (solos o conjuntamente) in vivo y quizás reducir la inflamación inducida por IL-20 y/o IL-22, tal como la observada en efectos cutáneos inducidos por IL-20 así como efectos cutáneos inducidos por IL-22, por ejemplo, en psoriasis, EII, colitis u otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-20 y/o IL-22, incluyendo EII, artritis, asma, artritis psoriática, colitis, afecciones cutáneas inflamatorias y dermatitis atópica. Ejemplo 40 Tratamiento de ratones hembra preñados transgénicos de IL-20 e IL-22 con anticuerpo monoclonal neutralizante anti-IL-22RA [0580] Para ensayar en el anticuerpo monoclonal (mAb) de rata anti-IL-22RA de ratón la actividad neutralizante in vivo, se inyectaron por vía intraperitonal a ratones transgénicos (TG) de IL-20 y TG IL-22 un mAb anti-IL-22RA de ratón. Se valora entonces en las crías recién nacidas la presencia o ausencia del fenotipo cutáneo “brillante” que caracteriza normalmente estas cepas de ratones. [0581] Específicamente, se cruzan ratones TG IL-20 (que se generan usando queratina 14) o TG IL-22 (usando el promotor de insulina) con hembras C57BL/6N en celo y se identifican las hembras preñadas por la presencia de un tapón vaginal el siguiente día. Se aparta cada hembra preñada en una jaula separada y se controla diariamente. Los grupos de tratamiento incluyen al menos 4 hembras preñadas cada uno, para permitir un análisis estadísticamente significativo tanto de crías TG como no TG. Basándose en la experiencia anterior con estos ratones TG, una camada tiene habitualmente entre aproximadamente 6 y 8 crías por camada, de las que entre 2 y 3 son TG+. [0582] De 7 a 9 días después de cruzar los ratones (edad embriónica 7-9; e7-9), se inyectan por vía intraperitoneal a las hembras 250-500 µg de mAb de rata anti-IL22RA de ratón (isotipo IgG2a de rata) en un volumen de 200-250 µl de PBS. Se usan agujas cortas a un ángulo de inyección bajo para evitar inyectar directamente en el útero. Se inyectan las hembras preñadas de esta manera 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes) durante 2 semanas (hasta el nacimiento) para acceder exitosamente a los embriones en desarrollo. Los grupos de control (de no menos de 4 ratones hembra preñados) incluyen lo siguiente: mAb IgG2a de rata de control isotípico, mAb anti-IL-22 humano/de ratón (isotipo IgG1 de rata) y un mAb IgG1 de rata de control isotípico. Como control para la neutralización de IL-20 de murino, se inyecta en las hembras preñadas una proteína de fusión IL-20R-Fc4 soluble que puede unirse a y neutralizar tanto IL-20 humana y de murino como una proteína de control Fc4. [0583] Los días 1 a 2 después del nacimiento, se controla estrechamente en las crías la aparición de un fenotipo de piel brillante. El día 2, se sacrifican las crías y se recoge una porción de la cola para aislamiento de ADN para determinar el genotipo (TG o no TG) de cada cría. Se recogen muestras de sangre para análisis histológico para valorar si las crías exhiben las capas de células epidérmicas engrosadas que caracterizan habitualmente a estos ratones TG. Se recoge también sangre del tronco de las crías (y una toma de sangre ocular de las madres un día después del nacimiento) para cuantificar, mediante ELISA, los niveles de mAb anti-IL-2RA en el suero de cada ratón. Debido a que estos mAb son potentes inhibidores de IL-20 y/o IL-22 in vivo, las crías TG tienen una piel normal (concretamente, sin engrosamiento epidérmico ni apariencia “brillante”). Ejemplo 41 Antagonistas de IL-20 e IL-22 en el modelo de psoriasis en cultivo de órgano [0584] La piel psoriática en placa humana puede mantenerse en cultivo orgánico, y los rasgos histológicos anormales de la piel lesionada se mantienen en ausencia de factores de crecimiento exógenos. Pueden administrarse anticuerpos contra IL-22RA, IL-20, IL-22, IL20R y/o IL-22R, o receptores solubles de IL-20 o IL-22, y pueden mejorarse los rasgos histológicos de la piel lesionada psoriática.

B. Diseño del estudio [0585] Se obtienen biopsias por punción de los 2 mm de grosor completos constituidas por la epidermis completa y varios mm de dermis de voluntarios adultos sanos o de piel lesionada psoriática. Inmediatamente después de la biopsia, se sumerge el tejido en medio de cultivo constituido por medio basal de queratinocitos (KBM) (Clonetics Inc, Walkersville, MD). Se suplementa el medio de cultivo con CaCl2 para llevar la concentración final de Ca2+ a 1,4 mM (Varani y col., 1993, 1994). Se incuban entonces las biopsias en pocillos de un disco de 96 pocillos que contiene 200 µl de KBM suplementado con Ca2+ con o sin tratamientos adicionales de anticuerpos contra IL-20, IL-22, IL-22RA humanos, o receptores solubles de IL-20 o IL-22. Se incuban los cultivos a 37ºC en atmósfera de 95% de aire y 5% de CO2 durante 8 días.

C. Análisis cuantitativo: [0586] Al final del periodo de incubación, se fija el tejido con formalina tamponada al 10% y se examina histológicamente después de tinción con hematoxilina y eosina. La apariencia del tejido psoriático expuesto a los anticuerpos o receptores solubles podía parecerse más estrechamente a la de los tejidos normales, incluyendo la siguiente observación: las células epiteliales basales inicialmente desorganizadas de forma irregular desarrollaban una apariencia más columnar cuando se restauraba la polaridad, las crestas interpupilares epidérmicas remitían, con menos zonas de expansión celular epitelial en el espacio dérmico y había menos degeneración global de las capas epidérmicas superiores. El modelo de cultivo de órgano proporciona un medio rápido y sensible para determinar si un compuesto particular tiene potencial como agente antihiperproliferativo. El rasgo histológico anormal puede mejorarse en presencia de un antagonista de IL-20 o IL-22, sugiriendo la eficacia de dicho agente en el tratamiento de psoriasis. Ejemplo 42 Cartografía de regiones de mIL22RA (zCytoR11m) de unión a los mAb neutralizantes R2.1.5F4.1 y R2.1.15E2.1

A. Epítopos en IL-22RA de murino a los que se unen anticuerpos monoclonales neutralizantes [0587] Los experimentos descritos a continuación estaban dirigidos a identificar una región o regiones en la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora soluble IL-22RA de murino (SEC DE ID. Nº 62) que eran importantes para la actividad de receptor, o para la unión de anticuerpo antagonista o neutralizante. La proteína IL-22RA-Fc de murino, que se escindió anteriormente con trombina para retirar la Fc, se

5 escindió entonces de forma C-terminal en los residuos de metionina de la secuencia mediante incubación con bromuro de cianógeno (CNBr). Se fraccionaron los péptidos generados por CNBr y se ensayó en las fracciones la actividad de unión como se detecta por ELISA y la reactividad por análisis Western usando anticuerpos monoclonales con propiedades neutralizantes, los clones R2.1.5F4.1 y R2.1.15E2.1.

10 [0588] Tras la escisión con CNBr, se generaron potencialmente los siguientes péptidos a partir de mIL-22RA completo no reducido (Tabla 33). En condiciones no reductoras, las cisteínas están unidas por disulfuro, lo que puede dar como resultado un ligamiento interno en el péptido 1 y un enlace entre los péptidos 3 y 5. Los residuos en negrita están potencialmente implicados en la unión a ligando, que corresponden a los

15 residuos de IL-22RA humana potencialmente implicados en la unión a ligando en la SEC DE ID. Nº 2 o la SEC DE ID. Nº 3, como se describe en el Ejemplo 42B. Específicamente, la SEC DE ID. Nº 48 corresponde a los restos de aminoácido 16 (His) a 83 (Met) de la SEC DE ID. Nº 42; la SEC DE ID. Nº 49 corresponde a los restos de aminoácido 84 (Glu) a 109 (Met) de la SEC DE ID. Nº 42, la SEC DE ID. Nº

20 50 corresponde a los restos de aminoácido 110 (Thr) a 137 (Met) de la SEC DE ID. Nº 42, la SEC DE ID. Nº 51 corresponde a los restos de aminoácido 138 (Leu) a 177 (Met) de la SEC DE ID. Nº 42 y la SEC DE ID. Nº 52 corresponde a los restos de aminoácido 163 (His) a 208 (Pro) de la SEC DE ID. Nº 42 o 163 (His) a 212 (Arg) de la SEC DE ID. Nº 62.

25 Tabla 33 1. Escisión con CNBr y aislamiento de fracciones peptídicas [0589] Se liofilizaron 50 µg de mIL22RA y se reconstituyeron en 180 µl de ácido fórmico (al 70%). Se añadió 1 µl de CNBr 5 M disuelto en acetonitrilo. Se mezcló la muestra y se dejó reaccionar durante 18 horas a temperatura ambiente en la oscuridad.

Número de péptido

De A Secuencia

Péptido de CNBr 1

1 68

No reducido: las cisteínas en el polipéptido 1 están ligadas

Péptido de CNBr 2

69 94 imagen1

Péptido de CNBr 3

95 122 imagen1

No reducido, los péptidos 3-5 están ligados

Péptido de CNBr 4

123 162

Péptido de CNBr 5

163 212

5 Se fraccionaron 150 µl de la mezcla de reacción mediante HPLC en fase inversa equipada con una columna analítica Zorbax SB300-C8. Se separaron los picos usando un gradiente que parte de 25% de acetonitrilo (con 0,085% de TFA) y 75% de agua (0,1% de TFA) y termina a 95% de acetonitrilo (0,085% de TFA) y 5% de agua (0,1% de TFA). El análisis UV mostró tres picos principales y dos minoritarios, que se

10 recogieron. Se dividió en dos cada fracción, se sometió una porción a ELISA y se liofilizó la otra porción y se reconstituyó en 150 µl de disolución salina tamponada con fosfato (PBS). El análisis UV de las fracciones de PBS confirmó la recuperación de todos los picos recogidos de la columna analítica. Se sometieron las fracciones de PBS a análisis Western.

15 2. ELISA [0590] Se diluyeron las fracciones de HPLC que contenían secuencias peptídicas de IL-22RA escindido con CNBr a una concentración igual estimada usando tampón de HPLC (90% de acetonitrilo, 10% de H2O, 0,09% de ácido trifuoroacético). Se cargaron las muestras en placas de microvaloración de 96 pocillos en 4 pocillos, cada

20 una a 100 µl/pocillo, y se dejaron secar durante una noche a temperatura ambiente en una campana de humos. Se lavaron las placas con tampón C de ELISA (PBS, 0,05% de Tween-20) y se bloquearon entonces con tampón B de ELISA (PBS, 0,1% de BSA, 0,05% de Tween-20) durante 2 horas a 37ºC. Se diluyeron dos anticuerpos monoclonales (mAb) de IL-22RA (clon R2.1.5F4.1 y clon R2.1.15E2.1) a 2 µg/ml en

25 ELISA B. Se añadió cada mAb a cada muestra de secuencia peptídica a 100 µl/pocillo y se incubaron las placas durante 60 minutos a 37ºC. Se lavaron las placas para retirar el anticuerpo no unido y se diluyó un segundo anticuerpo (IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (Jackson)) a 1 µg/ml en tampón ELISA B, y se añadió a todos los pocillos a 100 µl/pocillo. Se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC. Se lavaron los pocillos con tampón ELISA C y se incubaron entonces con sustrato TMB1 Component HRP Microwell (BioFx) durante 5 minutos. Se detuvo la reacción mediante la adición de reactivo Stop Reagent for TMB Microwell (BioFx) 450 nM y se leyó la absorbancia de las placas a 450 nm en un lector de placas ELISA Dynatech (Molecular Devices). [0591] Los resultados indican que el mAb R2.1.5F4.1 reaccionó con la fracción nº 4 de HPLC de la reacción mIL22RA-CNBr, lo que produjo también una banda en los experimentos de transferencia Western.

3. Western [0592] Se liofilizaron durante una noche a temperatura ambiente las fracciones de HPLC que contenían secuencias peptídicas de IL-22RA escindido con CNBr y se reconstituyeron con PBS. Se mezclaron entonces las muestras con tampón de muestra no reductor (Invitrogen) y se hirvieron durante 10 min. Se cargaron las muestras y se sometieron a electroforesis por PAGE-SDS en geles de Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen) usando tampón 1x MES-SDS Running Buffer (Invitrogen) y se transfirieron a nitrocelulosa (0,2 µm; Bio-Rad) en tampón de transferencia de metanol al 20%, todo a temperatura ambiente. Se dejaron secar los filtros durante una noche a temperatura ambiente. Se bloquearon los filtros con leche desnatada desecada al 10% en tampón A (Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, 0,05% de Igepal CA-630, NaCl 150 mM, 0,25% de gelatina) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se diluyó un anticuerpo monoclonal (mAb) de IL22RA (clon R2.1.5F4.1) a 2 µg/ml en tampón A que contenía 2,5% de leche desnatada desecada. Se incubaron las transferencias de este anticuerpo primario durante 1 h a temperatura ambiente. Después de la incubación, se lavaron las transferencia tres veces con tampón A y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con una dilución 1:5000 de anticuerpo secundario (IgG de cabra anti-rata conjugada con peroxidasa de rábano picante; Jackson, Inc) en tampón A con 2,5%% de leche desnatada desecada. Se lavaron entonces las transferencias, se revelaron con un sustrato quimioluminiscente (Lumi-Light Western Blotting Substrate; Roche) y se expusieron usando un formador de imágenes luminiscentes (Mannheim Boehringer Lumi-Imager). [0593] Usando una exposición de 30 minutos, el gel no reductor mostró bandas muy fuertes para las fracciones nº 4 y nº 5 junto con una banda débil para la fracción nº

3. Se ensayó también la fracción nº 4 positiva en ELISA. Secuenciación N-terminal de la fracción nº 4 activa [0594] De las 5 fracciones de péptidos de CNBr recogidas de la columna analítica en fase inversa, la fracción nº 4 mostró actividad en ELISA y era también positiva por transferencia Western. Para identificar los péptidos presentes en la fracción nº 4 activa, se sometió la muestra a degradación de Edman usando procedimientos bien conocidos.

5 Se identificaron tres extremos N de la fracción activa que eran consistentes con los péptidos 2 (SEC DE ID. Nº 49), 3 (SEC DE ID. Nº 50) y 5 (SEC DE ID. Nº 52). Estos resultados indicaban que los anticuerpos se unían a los péptidos 2 (SEC DE ID. Nº 49), 3 (SEC DE ID. Nº 50) y 5(SEC DE ID. Nº 52). Tabla 34

Degradación de Edman

Secuencia N-terminal Identificación de péptido

Primera secuencia obtenida a partir de la

fracción nº 4

Péptido CNBr 5 (SEC DE

Secuencia de mIL-22RA generada por CNBr

imagen1 ID. Nº 52)

Segunda secuencia obtenida a partir de la

fracción nº 4

Péptido CNBr 2 (SEC DE

Secuencia de mIL-22RA generada por CNBr

imagen1 ID. Nº 49)

Tercera secuencia obtenida a partir de la

fracción nº 4

Péptido CNBr 3 (SEC DE

Secuencia de mIL-22RA generada por CNBr

imagen1 ID. Nº 50)

10 Discusión [0595] Se aislaron 5 fracciones de una mezcla de péptidos mIL-22RA escindidos con CNBr. De estos, sólo la fracción nº 4 era activa en ELISA y positiva por Western. La degradación de Edman identificó a tres extremos N consistentes con los péptidos de CNBr 2 (SEC DE ID. Nº 49), 3 (SEC DE ID. Nº 50) y 5 (SEC DE ID. Nº 52) en la

15 fracción nº 4. En estas regiones, 6 residuos están potencialmente implicados en la unión a ligando. Estos residuos son Y93, R112, K210 y E211 de la SEC DE ID. Nº 42, que corresponden también a los residuos Y78, R97, K195 y E196 de la SEC DE ID. Nº

62. Los residuos Y60 y F164 de la SEC DE ID. Nº 42 están también implicados en la unión a ligando.

B. Epítopos en IL-22RA humano a los que se unen los anticuerpos monoclonales neutralizantes. [0596] Los experimentos descritos a continuación están dirigidos a identificar una región o regiones en el dominio extracelular de la secuencia de aminoácidos de la proteína IL-22RA humana (SEC DE ID. Nº 2) que son importantes para la actividad de receptor, o para antagonizar o neutralizar la unión a anticuerpo. Se escinde entonces de forma C-terminal una proteína IL-22RA receptora soluble humana (por ejemplo, que comprende la SEC DE ID. Nº 3, tal como IL-22RA-Fc escindida con trombina para retirar la Fc) en los residuos de metionina de la secuencia mediante incubación con bromuro de cianógeno (CNBr) u otro agente conocido en la materia que escinda la proteína humana en fragmentos definidos. Se fraccionan los péptidos generados por CNBr y se ensaya en las fracciones resultantes la actividad de unión como se detecta mediante ELISA y la reactividad mediante análisis Western usando anticuerpos monoclonales con propiedades neutralizantes. [0597] Se predice que 4 cisteínas están unidas por disulfuro con un patrón de ligamiento Cys71-Cys79 y Cys204-Cys217 de la SEC DE ID. Nº 2. Tras la escisión con CNBr, se generan potencialmente los siguientes péptidos a partir de IL-22RA humana completa no reducida: péptido 6 (SEC DE ID. Nº 56), péptido 7 (SEC DE ID. Nº 57); péptido 8 (SEC DE ID. Nº 58); péptido 9 (SEC DE ID. Nº 59); péptido 10 (SEC DE ID. Nº 60) y péptido 11 (SEC DE ID. Nº 61) (Tabla 35). Las cisteínas están unidas por disulfuro, lo que da como resultado un posible enlace entre los péptidos 7 (SEC DE ID. Nº 57) y 10 (SEC DE ID. Nº 60). Específicamente, la SEC DE ID. Nº 56 corresponde a los restos de aminoácido 1 (Pro) a 92 (Met) de la SEC DE ID. Nº 3; la SEC DE ID. Nº 57 corresponde a los restos de aminoácido 93 (Thr) a 120 (Met) de la SEC DE ID. Nº 3, la SEC DE ID. Nº 58 corresponde a los restos de aminoácido 121 (Ile) a 160 (Met) de la SEC DE ID. Nº 3, la SEC DE ID. Nº 59 corresponde a los restos de aminoácido 161 (His) a 185 (Met) de la SEC DE ID. Nº 3, la SEC DE ID. Nº 60 corresponde a los restos de aminoácido 186 (Ile) a 199 (Met) de la SEC DE ID. Nº 3 y la SEC DE ID. Nº 61 corresponde a los restos de aminoácido 200 (Cys) a 211 (Thr) de la SEC DE ID. Nº 3.

Tabla 35

Número de péptido

De A Secuencia

Péptido CNBr 6

1 92

Péptido CNBr 7

93 120

Péptido CNBr 8

121 160

Péptido CNBr 9

161 185

Péptido CNBr 10

186 199

Péptido CNBr 11

200 211

4. Escisión por CNBr y aislamiento de fracciones peptídicas, Western y ELISA y secuenciación N-terminal [0598] Se liofilizan aproximadamente 50 µg de IL-22RA humano y se 5 reconstituye, se fracciona, se recoge y se analiza usando análisis Western y ELISA como se describe en el Ejemplo 42A, para identificar las fracciones que contienen anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-22RA y aquellas que se unen a IL-22RA como se muestra por ELISA y análisis Western. En las fracciones de péptidos CNBr que se recogen de la columna analítica en fase inversa, se ensaya entonces la actividad

en ELISA y se confirman como positivos por transferencia Western. Para las fracciones positivas, se identifican los péptidos mediante degradación de Edman usando procedimientos bien conocidos. Discusión [0599] El péptido CNBr nº 5 de ratón (SEC DE ID. Nº 52) corresponde a los péptidos CNBr nº 9 y nº 10 humanos (SEC DE ID. Nº 59 y SED ID NO:60); el péptido CNBr nº 2 de ratón (SEC DE ID. Nº 49) corresponde al péptido CNBr nº 6 humano (SEC DE ID. Nº 56) y el péptido CNBr nº 3 de ratón (SEC DE ID. Nº 50) corresponde al péptido CNBr nº 7 humano (SEC DE ID. Nº 57). De las fracciones que se aíslan de la mezcla de péptidos de IL-22RA humano escindido con CNBr, 6 residuos en las regiones posibles están potencialmente implicados en la unión a ligando: los residuos de la SEC DE ID. Nº 2 (y residuos correspondientes de la SEC DE ID. Nº 3) que son importantes para la unión ligando-receptor comprenden Tyr-60 y Phe-164, Tyr-93, Arg-112, Lys-210 y Glu-211 de la SEC DE ID. Nº 2 (y los correspondientes residuos de la SEC DE ID. Nº 3). Además, los residuos primarios de la SEC DE ID. Nº 2 (y correspondientes residuos de la SEC DE ID. Nº 3) que son importantes para dirigir la unión de ligando-receptor comprenden Tyr-60 y Phe-164 de la SEC DE ID. Nº 2 (y los correspondientes residuos de la SEC DE ID. Nº 3), y los residuos secundarios comprenden los residuos Tyr-93, Arg-112, Lys-210 y Glu-211 de la SEC DE ID. Nº 2 (y los correspondientes residuos de la SEC DE ID. Nº 3). LISTADO DE SECUENCIAS

<110> ZymoGenetics, Inc.

<120> ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA IL-22RA Y ASOCIADOS DE UNIÓN Y PROCEDIMIENTOS DE USO EN INFLAMACIÓN

<130> 03-02PC

<150> US 60/457.481

<151> 24-03-2003

<150> US 60/523.295

<151> 17-11-2003

<160> 62

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

<210> 1

<211> 2831

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221>

CDS

<222>

(34)...(1755)

imagen2

imagen1

imagen1

imagen1

<210>

2

<211>

574

<212>

PRT

<213>5

Homo sapiens

<400>

2

imagen1

imagen1

<210>

3

<211>

211

<212>

PRT

<213>5

Homo sapiens

<400>

3

imagen1

<210>

4

<211>

541

<212>10

PRT

<213>

secuencia artificial

226

<220> <223> <400>

un polipéptido de fusión IL-22RA-Fc soluble 4

imagen1

imagen1

<210>

5

<211>

1116

<212>

ADN

<213>

Homo sapiens

5 <220>

<221>

CDS

<222>

(21)...(557)

<400>

5

imagen1

imagen1

<210>

6

<211>

179

<212>

PRT

<213>5

Homo sapiens

<400>

6

imagen1

<210>

7

<211>

926

<212>10

ADN

<213>

Homo sapiens

<220>

<221>

CDS

<222>

(45)...(575)

<221>15

variación

<222>

(188)...(188)

<223>

el nucleótido puede ser C o G en la posición 188

<400>

7

imagen1

<210>

8

<211>

176

<212>

PRT

<213>5

Homo sapiens

231

<220>

<221>

VARIANTE

<222>

(48)...(48)

<223>

el aminoácido en posición 48 puede ser D (Asp) o E (Glu)

<221>5

VARIANTE

<222>

48

<223>

Xaa = cualquier aminoácido

<400>

8

imagen1

10

<210>

9

<211>

16

<212>

PRT

<213>

secuencia artificial

15 <220>

<223>

ligador peptídico

<400>

9

imagen1

<210>

10

<210>

11

<210>

12

<211>

1050

<212>

ADN

<213>

Mus musculus

<220>

<221>5

CDS

<222>

(5)...(589)

<400>

10

imagen1

234

<211> <212> <213> <400>

194 PRT Mus musculus 11

imagen3

<211> 2149

<212> ADN

<213> Homo sapiens 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)...(693)

<400> 12

imagen1

imagen1

<210>

13

<211>

231

<212>

PRT

<213>5

Homo sapiens

<400>

13

imagen1

<210>

14

<211>

699

<212>

ADN

<213>5

secuencia artificial

<220>

<223>

marcaje C-terminal Fc4

<400>

14

imagen1

<210>10

15

<211>

6

<212>

PRT

<213>

secuencia artificial

238

<220> <223> <400>

marcaje peptídico Glu-Glu (CEE) 15

imagen1

<210>

16

<211>

10

<212>

PRT

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

marcaje peptídico Glu-Glu (CEE) con espaciador

<400>

16

imagen1

<210>

17

<211>

20

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador oligonucleotídico ZC39289

<400>

17

imagen1

<210>

18

<211>

20

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador oligonucleotídico ZC39290

<400>

18

imagen1

<210>

19

<211>

16

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador oligonucleotídico ZC39776

<400> 19

imagen1

<210>

20

<211>

16

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador oligonucleotídico ZC39777

<400>

20

imagen1

<210>

21

<211>

36

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

sonda ZC38752 TaqMan de IL-20 marcada con FAM/TAMRA

<400>

21

imagen1

<210>

22

<211>

16

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador de codificación ZC42459

<400>

22

imagen1

<210>

23

<211>

21

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador inverso ZC42458

<400>

23

imagen1

<210> 24

<211> 31

240

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

sonda ZC42460 TaqMan IL-22

<400>

24

imagen1

<210>

25

<211>

21

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador de codificación ZC40541

<400>

25

imagen1

<210>

26

<211>

20

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador inverso ZC40542

<400>

26

imagen1

<210>

27

<211>

25

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

sonda ZC40544 TaqMan® de IL-20

<400>

27

imagen1

<210>

28

<211>

57

<212>

ADN

<213>

Secuencia artificial

<220>

<223>

cebador oligonucleotídico ZC45593

<400>

28

<400>

36

imagen1

<210>

29

<211>

63

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador oligonucleotídico ZC45592

<400>

29

imagen1

<210>

30

<211>

63

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador oligonucleotídico ZC45591

<400>

30

imagen1

<210>

31

<211>

57

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador oligonucleotídico ZC45594

imagen4

<210>

32

<211>

531

<212>

ADN

<213>

Mus musculus

<220>

<221>

CDS

<222>

(1)...(531)

<400>

32

imagen1

<210>

33

<211>

176

<212>

PRT

<213>5

Mus musculus

<400>

33

imagen1

<210>

34

<211>

21

<212>

ADN

<213>5

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador oligonucleotídico ZC22901

imagen5

<210>10

35

<211>

21

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>15

cebador oligonucleotídico ZC45039

<400>

35

imagen1

<210>

36

<211>

23

<212>20

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador oligonucleotídico ZC38573

imagen1

<210>

37

<211>

22

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador oligonucleotídico ZC25223

<400>

37

imagen1

<210>

38

<211>

24

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

cebador oligonucleotídico ZC40128

<400>

38

imagen1

<210>

39

<211>

1473

<212>

ADN

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

dominio extracelular de IL-22RA con líder tPA y fusionado con la región

Fc de cadena pesada gamma 2a de murino (mG2a)

<221>

CDS

<222>

(1)...(1473)

<400>

39

imagen1

imagen1

imagen1

<210>

40

<211>

490

<212>

PRT

<213>5

secuencia artificial

<220>

<223>

dominio extracelular de IL-22RA con líder tPA y fusionado con la región

Fc de cadena pesada gamma 2a de murino (mG2a)

<400>

40

imagen1

<210>

41

<211>

1834

<212>

ADN

<213>

Mus musculus

5 <220>

<221>

CDS

<222>

(43)...(1788)

<400>

41

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210>

42

<211>

581

<212>

PRT

<213>5

Mus musculus

<400>

42

imagen1

imagen1

<210>

43

<211>

660

<212>

ADN

<213>5

Homo Sapiens

<220>

<221>

CDS

<222>

(1)...(660)

<400>

43

imagen1

<210>

44

<211>

220

<212>

PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44

imagen1

<210>

45

<211>5

199

<212>

PRT

<213>

Homo sapiens

<400>

45

imagen1

<210>

46

<211>

211

<212>

PRT

<213>5

Homo sapiens

<400>

46

imagen1

<210>

47

<211>

201

<212>

PRT

<213>5

Homo sapiens

<400>

47

imagen1

<210>

48

<211>

68

<212>

PRT

<213>5

Mus musculus

<400>

48

imagen1

<210> 49

<211> 26 10 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 49

imagen1

260

<210>

50

<211>

28

<212>

PRT

<213>

Mus musculus

<400>5

50

imagen1

<210> 51

<211> 40

<212> PRT 10 <213> Mus musculus

<400> 51

imagen1

<210> 52

<211> 50 15 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 52

imagen1

<210> 53 20 <211> 70

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 53 <210> 56

imagen1

<210>

54

<211>

46

<212>

PRT

<213>5

Mus musculus

<400>

54

imagen1

<210>

55

<211>

48

<212>10

PRT

<213>

Mus musculus

<220>

<221>

VARIANTE

<222>

6, 11, 13,

<223>15

Xaa = cualquier aminoácido

<400>

55

imagen1

<211> 92 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

imagen1

<210>

57

<211>

28

<212>5

PRT

<213>

Homo sapiens

<400>

57

imagen1

<210> 58 10 <211> 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

imagen1

15 <210> 59

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

imagen1

<210>

60

<211>

14

<212>

PRT

<213>5

Homo sapiens

<400>

60

imagen1

<210> 61

<211> 12 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

imagen1

<210>

62

<211>15

212

<212>

PRT

<213>

secuencia artificial

<220>

<223>

un receptor soluble IL-22RA de murino con sitio de escisión (Leu Val Pro

20

Arg) restante en el extremo C

<400>

62

imagen1

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

•

WO 9907848 A [0004]

•

WO 0212345 A [0004] [0010] [0145]

•

WO 02072607 A [0005] [0010] [0145]

•

US 5965704 A [0010] [0045] [0143] [0226] [0329]

•

WO 9927103 A [0011] [0226]

•

WO 0140467 A [0019] [0264]

•

US 5223409 A, Ladner [0103] [0202] [0217]

•

WO 9206204 A [0103]

•

WO 9720078 A [0104]

•

US 5300435 A [0128]

•

US 4599311 A, Kawasaki [0130]

•

US 4931373 A, Brake [0130]

•

US 4870008 A [0130]

•

US 5037743 A, Murray [0130] [0150]

•

US 4845075 A [0130]

•

US 4615974 A [0130]

•

US 4977092 A [0130]

•

US 4990446 A [0130]

•

US 5063154 A [0130]

•

US 5139936 A [0130]

•

US 4661454 A [0130]

•

US 4882279 A, Cregg [0131]

•

US 4935349 A, McKnight [0131]

•

US 5162228 A, Sumino [0131]

•

US 4486533 A, Lambowitz [0131]

•

US 5716808 A, Raymond [0132]

•

US 5736383 A, Raymond [0132]

•

WO 9717450 A [0132]

•

WO 9717451 A [0132]

•

WO 9802536 A [0132]

•

WO 9802565 A [0132]

45 • US 5945511 A [0143]

•

WO 0146232 A [0143]

•

US 5783384 A, Verdine [0148]

•

US 5747334 A [0148]

•

US 5723323 A, Kauffman [0148] 50 • US 5143830 A, Holland [0150]

•

US 5641655 A [0151]

•

US 6018026 A [0153]

•

US 5750375 A [0153]

•

US 5155027 A [0156] 55 • US 5567584 A [0156]

•

US 5723125 A, Chang [0159]

•

EP 742830 A, LaRochelle [0160]

•

WO 9521258 A [0160]

•

US 5252714 A, Harris [0166] 60 • EP 0154316 A [0168]

•

US 5382657 A, Karasiewicz [0168] [0177]

•

US 5738846 A, Greenwald [0177]

•

WO 9111465 A [0193] 65 • US 4331647 A, Goldenberg [0198]

•

US 4946778 A, Ladner [0201] [0202] [0217]

•

US 5403484 A, Ladner [0202] [0217]

•

US 5571698 A, Ladner [0202] [0217] 70 • US 5693762 A, Queen [0204]

•

US 5208146 A, Irie [0206]

•

US 5637677 A [0206]

•

WO 0024758 A [0226]

•

JP 4244018 A [0284] [0296] 75 • US 4603044 A, Geho [0285] [0297]

•

US 60457481 B [0600]

•

US 60523295 B [0600]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

•

Arai et al. Annu. Rev. Biochem., 1990, vol. 59, 783 [0001]

•

Mosmann. Curr. Opin. Immunol., 1991, vol. 3, 311 [0001]

•

Paul ; Seder. Cell, 1994, vol. 76, 241 [0001]

•

Yao et al. J. Immunol., 1995, vol. 155, 5483 [0001]

•

Fossiez et al. J. Exp. Med., 1996, vol. 183, 2593 [0001]

•

Xie M-H et al. J. Biol. Chem., 06 October 2000, vol. 275 (40), 31335-31339 [0006]

•

Nagalakshmi et al. FASEB Journal, 08 March 2001, vol. 5 (15), A1052 [0007]

•

McGehee et al. Mol. Endocrinol., 1993, vol. 7, 551 [0030]

•

Treisman. Seminars in Cancer Biol., 1990, vol. 1, 47 [0030]

•

OReilly et al. J. Biol. Chem., 1992, vol. 267, 19938 [0030]

•

Ye et al. J. Biol. Chem., 1994, vol. 269, 25728 [0030]

•

Loeken. Gene Expr., 1993, vol. 3, 253 [0030]

•

Molecular Biology of the Gene. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc, 1987 [0030]

•

Lemaigre ; Rousseau. Biochem. J., 1994, vol. 303, 1 [0030]

•

Nilsson et al. EMBO J., 1985, vol. 4, 1075 [0060]

•

Nilsson et al. Methods Enzymol., 1991, vol. 198, 3 [0060]

•

Smith ; Johnson. Gene, 1988, vol. 67, 31 [0060]

•

Grussenmeyer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 7952 [0060]

•

Hopp et al. Biotechnology, 1988, vol. 6, 1204 [0060]

•

Ford et al. Protein Expression and Purification, 1991, vol. 2, 95 [0060]

•

Peruski ; Peruski. The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research.ASM Press, Inc, 1997 [0072]

•

Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins. Methods in Gene Biotechnology. CRC Press, Inc, 1997, 123-151 [0072]

•

Guide to Human Genome Computing. Academic Press, Inc, 1998 [0072]

•

Slwrt Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1995 [0079]

•

Wu et al. Methods in Gene Biotechnology. CRC Press, Inc, 1997 [0079]

•

Aviv ; Leder. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1972, vol. 69, 1408 [0079]

•

Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11. Huynh et al. DNA Cloning: A Practical Approach. IRL Press, 1985, vol. I, 49 [0079]

•

Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries. Yu et al. Methods in Molecular Biology. Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications. Humana Press, Inc, 1993, vol. 15 [0080]

•

Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members. Preston. Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications. Humana Press, Inc, 1993, vol. 15 [0080]

•

Adang et al. Plant Molec. Biol., 1993, vol. 21, 1131 [0080]

•

Bambot et al.PCRMethods and Applications, 1993, vol. 2, 266 [0080]

•

Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes. Dillon et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications. Humana Press, Inc, 1993, vol. 15, 263-268 [0080]

•

Holowachuk et al. PCR Methods Appl., 1995, vol. 4, 299 [0080]

•

Glick ; Pasternak. Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA. ASM Press, 1994 [0080]

•

Itakura et al. Annu. Rev. Biochem., 1984, vol. 53, 323 [0080]

•

Climie et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1990, vol. 87, 633 [0080]

•

Grantham et al. Nucl. Acids Res., 1980, vol. 8, 1893 [0085]

•

Haas et al. Curr. Biol., 1996, vol. 6, 315 [0085]

•

Wain-Hobson et al. Gene, 1981, vol. 13, 355 [0085]

•

Grosjean ; Fiers. Gene, 1982, vol. 18, 199 [0085]

•

Holm. Nuc. Acids Res., 1986, vol. 14, 3075 [0085]

•

Ikemura. J. Mol. Biol., 1982, vol. 158, 573 [0085]

•

Sharp ; Matassi. Curr. Opin. Genet. Dev., 1994, vol. 4, 851 [0085]

•

Kane. Curr. Opin. Biotechnol., 1995, vol. 6, 494 [0085]

•

Makrides. Microbiol. Rev., 1996, vol. 60, 512 [0085]

•

Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 1989 [0090]

•

Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc, 1987 [0090]

•

Guide to Molecular Cloning Techniques. Academic Press, Inc, 1987 [0090]

•

Wetmur. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 1990, vol. 26, 227 [0090]

•

Altschul et al. Bull. Math. Bio., 1986, vol. 48, 603 [0093]

•

Henikoff ; Henikoff. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 10915 [0093]

•

Pearson ; Lipman. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1988, vol. 85, 2444 [0094]

•

Pearson. Meth. Enzymol., 1990, vol. 183, 63 [0094]

•

Needleman ; Wunsch. J. Mol. Biol., 1970, vol. 48, 444 [0094]

•

Sellers. SIAM J. Appl. Math., 1974, vol. 26, 787 [0094]

•

Henikoff ; Henikoff. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 10915 [0096]

•

Directed Mutagenesis: A Practical Approach. IRL Press, 1991 [0097]

•

Robertson et al. J. Am. Chem. Soc., 1991, vol. 113, 2722 [0098]

•

Ellman et al. Methods Enzymol., 1991, vol. 202, 301 [0098]

•

Chung et al. Science, 1993, vol. 259, 806 [0098]

•

Chung et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 10145 [0098]

•

Turcatti et al. J. Biol. Chem., 1996, vol. 271, 19991 [0099]

•

Koide et al. Biochem., 1994, vol. 33, 7470 [0099]

•

Wynn ; Richards. Protein Sci., 1993, vol. 2, 395 [0099]

•

Cunningham ; Wells. Science, 1989, vol. 244, 1081 [0101]

•

Bass et al. Proc. Nat’l Acad Sci. USA, 1991, vol. 88, 4498 [0101]

•

Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering. Coombs ; Corey. Proteins: Analysis and Design. Academic Press, Inc, 1998, 259-311 [0101]

•

Hilton et al. J. Biol. Chem., 1996, vol. 271, 4699 [0101]

•

de Vos et al. Science, 1992, vol. 255, 306 [0102] [0165]

•

Smith et al. J. Mol. Biol., 1992, vol. 224, 899 [0102] [0165]

•

Wlodaver et al.FEBSLett., 1992, vol. 309, 59 [0102] [0165]

•

Reidhaar-Olson ; Sauer. Science, 1988, vol. 241, 53 [0103]

•

Bowie ; Sauer. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1989, vol. 86, 2152 [0103]

•

Lowman et al. Biochem., 1991, vol. 30, 10832 [0103]

•

Derbyshire et al. Gene, 1986, vol. 46, 145 [0103]

•

Ner et al. DNA, 1988, vol. 7, 127 [0103]

•

Stemmer. Nature, 1994, vol. 370, 389 [0104]

•

Stemmer. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1994, vol. 91, 10747 [0104]

•

Horisberger ; Di Marco. Pharmac. Ther., 1995, vol. 66, 507 [0107]

•

Treuter et al. Molec. Gen. Genet., 1993, vol. 240, 113 [0107]

•

Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon. Content et al. Biological Interferon Systems. Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems. 1987, 65-72 [0107]

•

The EGF Receptor. Herschman et al. Control of Animals Cell Proliferation. Academic Press, 1985, vol. 1, 169-199 [0107]

•

Coumailleau et al. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, 29270 [0107]

•

Fukunaga et al. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, 25291 [0107]

•

Yamaguchi et al. Biochem. Pharmacol., 1995, vol. 50, 1295 [0107]

•

Meisel et al. Plant Molec. Biol., 1996, vol. 30, 1 [0107]

•

Geysen et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1983, vol. 81, 3998 [0111]

•

Sutcliffe et al. Science, 1983, vol. 219, 660 [0112]

•

Hopp et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1981, vol. 78, 3824-3828 [0112] [0190]

•

Hopp. J. Immun. Meth., 1986, vol. 88, 1-18 [0112] [0190]

•

Triquier et al. Protein Engineering, 1998, vol. 11, 153-169 [0112] [0190]

•

Lane ; Stephen. Curr. Opin. Immunol., 1993, vol. 5, 268 [0113]

•

Cortese et al. Curr. Opin. Biotechnol., 1996, vol. 7, 616 [0113]

•

Epitope Mapping. Mole. Methods in Molecular Biology. The Humana Press, Inc, 1992, vol. 10, 105-116 [0113]

•

Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies. Price. Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application. Cambridge University Press, 1995, 60-84 [0113]

•

Current Protocols in Immunology. John Wiley&Sons, 1997, 9.3.1-9.3.59.4.1-9.4.11 [0113]

•

Chasin et al. Som. Cell. Molec. Genet., 1986, vol. 12, 555 [0117]

•

Hamer et al. J. Molec. Appl. Genet., 1982, vol. 1, 273 [0119]

•

McKnight. Cell, 1982, vol. 31, 355 [0119]

•

Benoist et al. Nature, 1981, vol. 290, 304 [0119]

•

German et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1982, vol. 79, 6777 [0119]

•

Foecking et al. Gene, 1980, vol. 45, 101 [0119]

•

Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture. Etcheverry et al. Protein Engineering: Principles and Practice. John Wiley & Sons, Inc, 1996, 163-181 [0119]

•

Zhou et al. Mol. Cell. Biol., 1990, vol. 10, 4529 [0120]

•

Kaufman et al. Nucl. Acids Res., 1991, vol. 19, 4485 [0120]

•

Ausubel. Gene Transfer and Expression Protocols. Humana Press, 1991 [0122]

•

Becker et al. Meth. Cell Biol., 1994, vol. 43, 161 [0124]

•

Douglas ; Curiel. Science & Medicine, 1997, vol. 4, 44 [0124]

•

Garnier et al. Cytotechnol., 1994, vol. 15, 145 [0125]

•

Luckow et al. J. Virol., 1993, vol. 67, 4566 [0126]

•

Hill-Perkins ; Possee. J. Gen. Virol., vol. 71, 971 [0126]

•

Bonning et al. , J. Gen. Virol., 1994, vol. 75, 1551 [0126]

•

Chazenbalk ; Rapoport. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, 1543 [0126] [0127]

•

Grussenmeyer et al. Proc. Nat’l Acad Sci., vol. 82, 7952 [0126]

•

Hill-Perkins ; Possee. J. Gen. Virol., 1990, vol. 71, 971 [0127]

•

Bonning et al. J. Gen. Virol., 1994, vol. 75, 1551 [0127]

•

Manipulation of Baculovirus Vectors. Bailey et al. Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols. The Humana Press, Inc, 1991, vol. 7, 147-168 [0129]

•

The baculovirus expression system. Patel et al. DNA Cloning 2: Expression Systems. Oxford University Press, 1995, vol. 2, 205-244 [0129]

•

Ausubel. Baculovirus Expression Protocols. The Humana Press, Inc, 1995, 16-371657 [0129]

•

Insect Cell Expression Technology. Lucknow et al. Protein Engineering: Principles and Practice. John Wiley & Sons, Inc, 1996, 183-218 [0129]

•

Gleeson et al. J. Gen. Microbiol., 1986, vol. 132, 3459 [0131]

•

Raymond et al. Yeast, 1998, vol. 14, 11-23 [0132]

•

Horsch et al. Science, 1985, vol. 227, 1229 [0133]

•

Klein et al. Biotechnology, 1992, vol. 10, 268 [0133]

•

Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants. Miki et al. Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC Press, 1993, 67-88 [0133]

•

Glick. J. Ind. Microbiol. vol. 1, 277 [0134]

•

Watson et al. Molecular Biology of the Gene. 1987 [0134]

•

Molecular Biology Labfax. Academic Press, 1991 [0135]

•

Bacillus Cloning Methods. Hardy. DNA Cloning: A Practical Approach. IRL Press, 1985 [0135]

•

Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies. Williams et al. DNA Cloning 2: Expression Systems. Oxford University Press, 1995, 15 [0137]

•

Genetic Manipulation and Expression of Antibodies. Ward et al. Monoclonal Antibodies: Principles and Applications. Wiley-Liss, Inc, 1995, 137 [0137] [0203]

•

Expression of Proteins in Bacteria. Georgiou et al. Protein Engineering: Principles and Practice. John Wiley & Sons, Inc, 1996 [0137]

•

Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture. Etcheverry et al. Protein Engineering: Principles and Practice. Wiley-Liss, Inc, 163 [0139]

•

Purification of over-produced proteins from E. Coli cells. Grisshammer et al. DNA Cloning 2: Expresión Systems. Oxford University Press, 1995, vol. 2, 59-92 [0139]

•

Baculovirus Expression Protocols. The Humana Press, Inc, 1995 [0139]

•

Merrifield. 85. J. Am. Chem. Soc., 1963, 2149 [0140]

•

Stewart et al. Solid Phase Peptide Synthesis. Pierce Chemical Co, 1984 [0140]

•

Bayer ; Rapp. Chem. Pept. Prot., 1986, vol. 3, 3 [0140]

•

Atherton et al. Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. IRL Press, 1989 [0140]

•

Solid-Phase Peptide Synthesis. Fields ; Colowick. Methods in Enzymology. Academic Press, 1997, vol. 289 [0140]

•

Lloyd-Williams et al. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC Press, Inc, 1997 [0140]

•

Dawson et al. Science, 1994, vol. 266, 776 [0140]

•

Hackeng et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1997, vol. 94, 7845 [0140]

•

Dawson. Methods Enzymol., 1997, vol. 287, 34 [0140]

•

Muir et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1998, vol. 95, 6705 [0140]

•

Severinov ; Muir. J. Biol. Chem., 1998, vol. 273, 16205 [0140]

•

Palacios ; Steinmetz. Cell, 1985, vol. 41, 727-734 [0143] [0331]

•

Mosman. J. Immunol. Meth., 1983, vol. 65, 55-63 [0144]

•

Shaw et al. Cell, 1989, vol. 56, 563-572 [0144]

•

de Wet et al. Mol. Cell. Biol., 1987, vol. 7, 725 [0144]

•

Baumgartner et al. J. Biol. Chem., 1994, vol. 269, 29094-29101 [0144]

•

Schenbom ; Goiffin. Promega_Notes, 1993, vol. 41, 11 [0144]

•

Dumontier et al. J. Immunol, 2000, vol. 164, 1814-1819 [0145]

•

Dumoutier, L. et al. Proc. Nat’l. Acad. Sci., 2000, vol. 97, 10144-10149 [0145] [0229]

•

Xie MH et al. J. Biol. Chem, 2000, vol. 275, 31335-31339 [0145]

•

Kotenko SV et al. J. Biol. Chem., 2001, vol. 276, 2725-2732 [0145]

•

Monfardini et al. Proc. Assoc. Am. Physicians, 1996, vol. 108, 420 [0147]

•

Joron et al. Ann. N Y Acad. Sci., 1992, vol. 672, 216 [0147]

•

Friboulet et al. Appl. Biochem. Biotechnol., 1994, vol. 47, 229 [0147]

•

Avalle et al. Ann. N Y Acad. Sci., 1998, vol. 864, 118 [0147]

•

Kay et al. Phage Display of Peptides and Proteins. Academic Press, 1996 [0148]

•

Expression of Cloned Genes in Yeast. Romanos et al. DNA Cloning 2: A Practical Approach. Oxford University Press, 1995, 123-167 [0151]

•

Hopp et al. Biotechnology, 1988, vol. 6, 1204-1210 [0152]

•

Karlsson. J. Immunol. Methods, 1991, vol. 145, 229-40 [0154]

•

Cunningham ; Wells. J. Mol. Biol, 1993, vol. 234, 554-63 [0154]

•

Scatchard. Ann. NY Acad. Sci., 1949, vol. 51, 660-72 [0155]

•

Cunningham et al. Science, 1991, vol. 253, 545-48 [0155]

•

Cunningham et al. Science, 1991, vol. 245, 821-25 [0155]

•

Tuan et al. Connective Tissue Research, 1996, vol. 34, 1-9 [0156]

•

Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies. Williams et al. DNA Cloning 2: A Practical Approach. Oxford University Press, 1995, 15-58 [0157]

•

Luo et al. Arch. Biocliem. Biophys., 1996, vol. 329, 215 [0158]

•

Morganti et al. Biotechnol. Appl. Biochem., 1996, vol. 23, 67 [0158]

•

Zheng et al. Gene, 1997, vol. 186, 55 [0158]

•

Tuan et al. Connective Tissue Research, 1996, vol. 34, 1 [0163]

•

Delgado et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1992, vol. 9, 249 [0168]

•

Duncan ; Spreafico. Clin. Pharmacokinet., 1994, vol. 27, 290 [0168]

•

Francis et al. Int J Hematol, 1998, vol. 68, 1 [0168]

•

Nieforth et al. Clin. Pharmacol. Ther., 1996, vol. 59, 636 [0177]

•

Monkarsh et al. Anal. Biochem., 1997, vol. 247, 434 [0177]

•

Sulkowski. Trends in Biochem., 1985, vol. 3, 1 [0183]

•

Meth. Enzymol. 1990, vol. 182, 529 [0183]

•

Scatchard. Ann. NY Acad. Sci., 1949, vol. 51, 660 [0186]

•

Jameson ; Wolf. CABIOS, 1988, vol. 4, 181 [0188]

•

Hopp et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1981, vol. 78, 3824 [0189]

•

Emini et al. J. Virology, 1985, vol. 55, 836 [0189]

•

Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition. Chou-Fasman, Chou. Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation. Plenum Press, 1990, 549-586 [0189]

•

Garnier-Robson, Garnier et al. J. Mol. Biol., 1978, vol. 120, 97 [0189]

•

Production of Polyclonal Antisera. Green et al. Immunochemical Protocols. Humana Press, 1992, 1-5 [0192]

•

Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies. Williams et al. DNA Cloning 2: Expression Systems. Oxford University Press, 1995, vol. 2, 15 [0192]

•

Losman et al. Int. J. Cancer, 1990, vol. 46, 310 [0193]

•

Kohler et al. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0194]

•

Current Protocols in Immunology. John Wiley&Sons, 1991, vol. 1, 2.5.1-2.6.7 [0194]

•

Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli. Picksley et al. DNA Cloning 2: Expression Systems. Oxford University Press, 1995, vol. 2, 93 [0194]

•

Green et al. Nature Genet., 1994, vol. 7, 13 [0196]

•

Lonberg et al. Nature, 1994, vol. 368, 856 [0196]

•

Taylor et al. Int. Immun., 1994, vol. 6, 579 [0196]

•

Purification of ImmunoglobulinG(IgG). Baines et al. Methods in Molecular Biology. The Humana Press, Inc, 1992, vol. 10, 79-104 [0197]

•

Nisonoff et al. Arch Biochem. Biophys, 1960, vol. 89, 230 [0198]

•

Porter. Biochem. J., 1959, vol. 73, 119 [0198]

•

Edelman et al. Methods in Enzymology. Academic Press, 1967, vol. 1, 422 [0198]

•

Inbar et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1972, vol. 69, 2659 [0200]

•

Sandhu. Crit. Rev. Biotech., 1992, vol. 12, 437 [0200] [0204]

•

Whitlow et al. Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 1991, vol. 2, 97 [0201]

•

Bird et al. Science, 1988, vol. 242, 423 [0201]

•

Pack et al. Bio/Technology, 1993, vol. 11, 1271 [0201]

•

Kay et al. Phage Display of Peptides and Proteins. Academic Press, Inc, 1996 [0202]

•

Larrick et al. Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 1991, vol. 2, 106 [0203]

•

Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies. Courtenay-Luck et al. Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application. Cambridge University Press, 1995, 166 [0203]

•

Orlandi et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1989, vol. 86, 3833 [0204]

•

Jones et al. Nature, 1986, vol. 321, 522 [0204]

•

Carter et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 4285 [0204]

•

Singer et al. J. Immun., 1993, vol. 150, 2844 [0204]

•

Antibody Engineering Protocols. Humana Press, Inc, 1995 [0204]

•

Engineering Therapeutic Antibodies. Kelley et al. Protein Engineering: Principles and Practice. John Wiley & Sons, Inc, 1996, 399-4.34 [0204]

•

Production of Polyclonal Antisera. Green et al. Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols. Humana Press, 1992, 1-12 [0206]

•

Varthakavi ; Minocha. J. Gen. Virol., 1996, vol. 77, 1875 [0206]

•

Kennedy et al. Clip. Chim. Acta, 1976, vol. 70, 1 [0213]

•

Schurs et al. Clin. Chim. Acta, 1977, vol. 81, 1 [0213]

•

Shih et al. Int’l J. Cancer, 1990, vol. 46, 1101 [0213]

•

Stein et al. Cancer Res., 1990, vol. 50, 1330 [0213]

•

Avidin-Biotin Technology. Methods In Enzymology. Academic Press, 1990, vol. 184 [0214]

•

Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology. Bayer et al. Methods In Molecular Biology. The Humana Press, Inc, 1992, vol. 10, 149-162 [0214]

•

Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays. Cook ; Self. Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application. Cambridge University Press, 1995, 180-208 [0215]

•

The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology. Perry. Monoclonal Antibodies: Principles and Applications. Wiley-Liss, Inc, 1995, 107-120 [0215]

•

Diamandis. Immunoassay. Academic Press, Inc, 1996 [0215]

•

Hornick et al. Blood, 1997, vol. 89, 4437-47 [0223]

•

Dumoutier, L. et al. Proc. Nat’I. Acad. Sci., 2000, vol. 97, 10144-10149 [0226]

•

Dumontier et al. J. Immunol., 2000, vol. 164, 1814-1819 [0226]

•

Spencer, SD et al. J. Exg. Med., 1998, vol. 187, 571-578 [0226]

•

Gibbs, VC ; Pennica. Gene, 1997, vol. 186, 97-101 [0226]

•

Xie, MH et al. J. Biol. Chem, 2000, vol. 275, 31335-31339 [0226]

•

Kotenko, SV et al. J. Biol. Chem, 2001, vol. 276, 2725-2732 [0226]

•

Dumoutier, L. et al. Proc. Nat’l. Acad. Sci, 2000, vol. 97, 10144-10149 [0226] [0240]

•

Liu Y et al. J Immunol, 1994, vol. 152, 1821-1829 [0226]

•

Uhlar,CM ; Whitehead, AS. Eur. J. Biochem., 1999, vol. 265, 501-523 [0229]

•

Baumann H. ; Gauldie. J. Immunology Today, 1994, vol. 15, 74-80 [0229]

•

Hughes C et al. J. Immunol, 1994, vol. 153, 3319-3325 [0241]

•

Holliger P ; Hoogenboom, H. Nature Biotech., 1998, vol. 16, 1015-1016 [0241]

•

Smith JA et al. J. Immunol., 1998, vol. 160, 4841-4849 [0241]

•

Tutt, AL et al. J Immunol, 1998, vol. 161, 3175-3185 [0241]

•

Cosman, D. Cytokine, 1993, vol. 5, 95-106 [0243]

•

Fernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs, 2000, vol. 9, 497-513 [0243]

•

Hirota H. et al. Proc. Nat’l. Acad. Sci., 1995, vol. 92, 4862-4866 [0244]

•

The Cytokine Handbook. 208-209 [0244]

•

Gabay. Expert. Opin. Biol. Ther., 2002, vol. 2 (2), 135-149 [0247]

•

Wooley. Curr. Opin. Rheum., 1999, vol. 3, 407-20 [0248]

•

Williams et al. Immunol., 1992, vol. 89, 9794-788 [0248]

•

Myers et al. Life Sci., 1997, vol. 61, 1861-78 [0248]

•

Wang et al. Immunol., 1995, vol. 92, 8955-959 [0248]

•

Glausner et al. Lancet, 1991, vol. 338, 732 [0252]

•

Dumitru et al. Cell, 2000, vol. 103, 1071-1083 [0252]

•

Beutler et al. Science, 1985, vol. 229, 869 [0253]

•

Neurath et al. Intern. Rev. Immunol., 2000, vol. 19, 51-62 [0258]

•

Blumberg H et al. Cell, 2001, vol. 104, 9-19 [0263]

•

Krop I. et al. Eur. J. Immunol, 1996, vol. 26 (1), 238-42 [0267]

•

Tanaka, T. et al. Int Immunol., 1992, vol. 4 (4), 487-9 [0267]

•

Schattemann GC et al. Dev. Biol., 1996, vol. 176 (1), 133-42 [0267]

•

Cattan AR ; Douglas E. Leuk. Res., 1994, vol. 18, 513-22 [0269]

•

Flavell, DJ. Hematological Oncology, 1996, vol. 14, 67-82 [0269]

•

Boyman, O. et al. J. Exp. Med., 2004 [0269]

•

Zeigler, M. et al. Lab Invest, 2001, vol. 81, 1253 [0270]

•

Zollner, T. M. et al. J. Clin. Invest., 2002, vol. 109, 671 [0270]

•

Yamanaka, N. et al. Microbio.1 Immunol., 2001, vol. 45, 507 [0270]

•

Raychaudhuri, S. P. et al. Br. J. Dermatol., 2001, vol. 144, 931 [0270]

•

Boehncke, W. H et al. Arch. Dermatol. Res., 1999, vol. 291, 104 [0270]

•

Boehncke, W. H et al. J. Invest. Dermatol., 2001, vol. 116, 596 [0270]

•

Nickoloff, B. J. et al. Am. J. Pathol., 1995, vol. 146, 580 [0270]

•

Boehncke, W. H et al. J. Cutan. Pathol., 1997, vol. 24, 1 [0270]

•

Sugai, J., M. et al. J. Dermatol. Sci., 1998, vol. 17, 85 [0270]

•

Villadsen L.S. et al. J. Clin. Invest., 2003, vol. 112, 1571 [0270]

•

Christophers. Int. Arch. Allergy Immunol., 1996, vol. 110, 199 [0271]

•

Davenport et al. Internat. Immunopharmacol., vol. 2, 653-672 [0271]

•

Remington’s Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co, 1990 [0274]

•

Oral Delivery of Microencapsulated Proteins. DiBase ; Morrel. Protein Delivery: Physical Systems. Plenum Press, 1997, 255-288 [0277]

•

Hinchcliffe ; Illum. Adv. Drug Deliv. Rev., 1999, vol. 35, 199 [0277]

•

Pettit ; Gombotz. TIBTECH, 1998, vol. 16, 343 [0277]

•

Patton et al. Adv. Drug Deliv. Rev., 1999, vol. 35, 235 [0277]

•

Mitragotri et al. Science, 1995, vol. 269, 850 [0277]

•

Potts et al. Pharm, Biotechnol., 1997, vol. 10, 213 [0277]

•

Remington’s Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, 1995 [0278] [0302]

•

Bremer et al. Pharm. Biotechnol., 1997, vol. 10, 239 [0280] [0292]

•

Implants in Drug Delivery. Ranade. Drug Delivery Systems. CRC Press, 1995, 95123 [0280] [0292]

•

Protein Delivery with Infusion Pumps. Bremer et al. Protein Delivery: Physical Systems. Plenum Press, 1997, 239-254 [0280] [0292]

•

Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant. Yewey et al. Protein Delivery: Physical Systems. Plenum Press, 1997, 93-117 [0280] [0292]

•

Bakker-Woudenberg et al. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 1993, vol. 12 (1), 61 [0281] [0293]

•

Kim. Drugs, 1993, vol. 46, 618 [0281] [0293]

•

Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers. Ranade. Drug Delivery Systems. CRC Press, 1995, 3-24 [0281] [0293]

•

Machy et al. Liposomes In Cell Biology And Pharmacology. John Libbey, 1987 [0281] [0293]

•

Ostro et al. American J. Hosp. Pharm., 1989, vol. 46, 1576 [0281] [0293]

•

Scherphof et al. Ann. N.Y. Acad Sci., 1985, vol. 446, 368 [0282]

•

Claassen et al. Biochim. Biophys. Acta, 1984, vol. 802, 428 [0283] [0295]

•

Allen et al. Biochim. Biophys. Acta, 1991, vol. 1068, 133 [0283] [0295]

•

Allen et al. Biochim. Biophys. Acta, 1993, vol. 1150, 9 [0283] [0287] [0295] [0299]

•

Kato et al. Biol. Pharm. Bull., 1993, vol. 16, 960 [0284] [0296]

•

Shimizu et al. Biol. Pharm. Bull., 1997, vol. 20, 881 [0284] [0296]

•

Kato ; Sugiyama. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1997, vol. 14, 287 [0285] [0297]

•

Murahashi et al. Biol. Pharm. Bull., 1997, vol. 20, 259 [0285] [0297]

•

Wu et al. Hepatology, 1998, vol. 27, 772 [0285] [0297]

•

Kamps et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 1997, vol. 94, 11681 [0285] [0297]

•

Harasym et al. Adv. Drug Deliv: Rev., 1998, vol. 32, 99 [0286]

•

Harasym et al. Adv. Drug Deliv. Rev., 1998, vol. 32, 99 [0286] [0298]

•

Anderson et al. Infect. Immun., 1981, vol. 31, 1099 [0287] [0299]

•

Anderson et al. Cancer Res., 1990, vol. 50, 1853 [0287]

•

Cohen et al. Biochim. Biophys. Acta, 1991, vol. 1063, 95 [0287] [0299]

•

Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies. Alving et al. Liposome Technology. CRC Press, 1993, vol. III, 317 [0287] [0299]

•

Wassef et al. Meth. Enzymol., 1987, vol. 149, 124 [0287] [0299]

•

Gombotz ; Pettit. Bioconjugate Chem., 1995, vol. 6, 332 [0288] [0300]

•

Role of Polymers in Drug Delivery. Ranade. Drug Delivery Systems. CRC Press, 1995, 51-93 [0288] [0300]

•

Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery. Roskos ; Maskiewicz. Protein Delivery: Physical Systems. Plenum Press, 1997, 45-92 [0288]

•

Bartus et al. Science, 1998, vol. 281, 1161 [0288] [0300]

•

Putney ; Burke. Nature Biotechnology, 1998, vol. 16, 153 [0288] [0300]

•

Putney. Curr. Opin. Chem. Biol., 1998, vol. 2, 548 [0288]

•

Gref et al. Pharm. Biotechnol., 1997, vol. 10, 167 [0288] [0300]

•

Ansel ; Popovich. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Lea & Febiger, 1990 [0290] [0302]

•

Remington’s Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company [0290]

•

Ranade ; Hollinger. Drug Delivery Systems. CRC Press, 1996 [0290] [0302]

•

Scherphof et al. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1985, vol. 446, 368 [0294]

•

Anderson et al. Cancer Res, 1990, vol. 50, 1853 [0299]

•

Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery. Roskos ; Maskiewicz. Protein Delivey: Physical Systems. Plenum Press, 1997, 45-92 [0300]

•

Putney. Curr-. Opin. Chem. Biol, 1998, vol. 2, 548 [0300]

•

Mathey-Prevot et al. Mol. Cell. Biol., 1986, vol. 6, 4133-4135 [0331]

•

Hogan, B. et al. Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994 [0347]

•

Treatment of Dextran Sulfate Sodium-Induced Murine Colitis by Intracolonic Cyclosporin. S.N.S. Murthy. Digestive Diseases and Sciences. September 1993, vol. 38, 1722-1734 [0370]

• Moore. Methods Mol. Biol., 2003, vol. 225, 175-179 [0391] 5 • Waksman. Scand. J. Immunol, 2002, vol. 56, 12-34 n[0391]

•

Heid, C.A. et al. Genome Research, 1996, vol. 6, 986-994 [0418] [0425] [0459] [0466]

•

Gibson, U.E.M. et al. Genome Research, 1996, vol. 6, 995-1001 [0418] [0425] [0466]

10 • Sundaresan, S. et al. Endocrinology, 1998, vol. 139, 4756-4764 [0418] [0425] [0459] [0466]

•

Antibodies A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press [0436]

•

Gibson, U.E.M. et al. Genome Research, vol. 6, 995-1001 [0459]

• Kearney, J.F. et al. J Immunol., 1979, vol. 123, 1548-50 [0500] 15 • Lane, R.D. J Immunol Methods, 1985, vol. 81, 223-8 [0500]

•

Hogan, B. et al. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994 [0513]

•

Zhang et al. A new logic for DNA engineering using recombination in E. coli. Nat. Genet., 1998, vol. 20, 123-8 [0518]

20 • Robertson, E.J. et al. Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells: A Practical Approach. IRL Press Limited, 1987 [0520]

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de producción de un anticuerpo de un polipéptido en un animal no humano, en el que el polipéptido inoculado se selecciona del grupo constituido por:

   (a)

   un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 del aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 47 (Asp);

   (b)

   un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 del aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 62 (Cys);

   (c)

   un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 del aminoácido número 84 (Ala) al aminoácido número 97 (Ser) y

   (d)

   un polipéptido constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 del aminoácido número 93 (Thr) al aminoácido número 120 (Met);

   y en el que el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido IL-22RA que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEC DE ID. Nº 2 y la SEC DE ID. Nº 3 y que reduce la actividad de un polipéptido IL-22 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 6.

2. 2.

   El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo producido mediante el procedimiento reduce la actividad proinflamatoria del polipéptido IL-22.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo producido mediante el procedimiento neutraliza la interacción del polipéptido IL-22 con el polipéptido IL-22RA de SEC DE ID. Nº 2.

4. 4.

   El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la neutralización por el anticuerpo se mide mostrando la neutralización del polipéptido IL-22 en un ensayo de neutralización in vitro basado en células.

5. 5.

   Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epítopo antigénico de un polipéptido IL-22RA humano que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3, en el que dicho epítopo antigénico se selecciona del grupo de:

   (a)

   un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 del aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 47 (Asp);

   (b)

   un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 del aminoácido número 41 (Lys) al aminoácido número 62 (Cys);

   (c)

   un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 del aminoácido número 84 (Ala) al aminoácido número 97 (Ser) y

   (d)

   un epítopo constituido por la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 3 del aminoácido número 93 (Thr) al aminoácido número 120 (Met);

   en el que el anticuerpo reduce o neutraliza la actividad de un polipéptido IL-22 humano que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 6.

6. 6.

   El anticuerpo de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo reduce o neutraliza la actividad de ambos polipéptido IL-22 humano y polipéptido IL-20 humano que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC DE ID. Nº 8.

7. 7.

   El anticuerpo de la reivindicación 5 ó 6, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo de: (a) un anticuerpo monoclonal de murino, (b) un anticuerpo humanizado derivado de (a), (c) un fragmento de anticuerpo y (d) un anticuerpo monoclonal humano.

8. 8.

   El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que el anticuerpo comprende adicionalmente un radionucleido, enzima, sustrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marcaje peptídico, partícula magnética, fármaco o toxina.

9. 9.

   El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en el que el anticuerpo comprende adicionalmente pegilación.

10. 10.

    Un procedimiento in vitro para reducir o inhibir la proliferación o diferenciación inducidas por IL-22 de células hematopoyéticas y progenitoras de células hematopoyéticas que comprende cultivar células de médula ósea o sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5-9 suficiente para reducir la proliferación o diferenciación de las células hematopoyéticas en células de médula ósea o sangre periférica en comparación con células de médula ósea o sangre periférica cultivadas en ausencia del anticuerpo.

11. 11.

    El procedimiento de la reivindicación 10, en el que las células hematopoyéticas y células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides.

12. 12.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que las células linfoides son macrófagos o linfocitos T.

13. 13.

    Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5-9 para la fabricación de un medicamento para reducir la inflamación inducida por IL-22 en un mamífero.

14. 14.

    Uso de una composición que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5-9 en un vehículo farmacéutico aceptable para la fabricación de un medicamento para suprimir una respuesta inflamatoria en un mamífero con inflamación, en el que después de la administración una falta de aumento o reducción del nivel de proteína A amiloide sérica es indicativo de la supresión de una respuesta inflamatoria.

15. 15.

    Uso de un antagonista de IL-22 para la fabricación de un medicamento para tratar un mamífero aquejado de una enfermedad inflamatoria en la que IL-22 desempeña un papel, en el que el antagonista comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5-9, y en el que, después de la administración, se reduce la actividad inflamatoria de IL-22.

16. 16.

    Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicacione 5-9 para la fabricación de un medicamento para tratar una afección patológica en un sujeto asociada a la actividad inflamatoria de IL-22RA.

17. 17.

    Uso de un antagonista de IL-22RA para la fabricación de un medicamento para tratar un mamífero aquejado de una enfermedad inflamatoria en la que IL-22 desempeña un papel, en el que el antagonista comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5-9, y en el que, después de la administración, se reduce la actividad inflamatoria en el mamífero.

18. 18.

    Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica.

19. 19.

    Uso según la reivindicación 18, en el que la enfermedad inflamatoria crónica se selecciona de enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis, dermatitis atópica y psoriasis.

20. 20.

    Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria aguda.

21. 21.

    Uso según la reivindicación 20, en el que la enfermedad inflamatoria aguda

    5

    10 se selecciona de endotoxemia, septicemia, síndrome de choque tóxico y una enfermedad infecciosa.
22. 22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en el que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria pulmonar.

    15
23. 23. Uso según la reivindicación 22, en el que la enfermedad inflamatoria pulmonar se selecciona de asma, bronquitis y fibrosis quística.
24. 24. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, en el que la 20 enfermedad se selecciona de artritis reumatoide y artritis psoriática.
25. 25. Uso de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 15-17 para la fabricación de un medicamento para reducir la inflamación en un mamífero.