ES2348064T3

ES2348064T3 - Bebida de té fermentada y bebida de té.

Info

Publication number: ES2348064T3
Application number: ES06714285T
Authority: ES
Inventors: Rieko First Research Institute New Functional Products Endo; Satoko Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. Yamahira; Hiroshi Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. Okamatsu; Po Sheng Otsuka International Asia Arab Division Wu; Masamichi Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. Toba
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2005-02-23
Filing date: 2006-02-22
Publication date: 2010-11-29
Anticipated expiration: 2026-02-22
Also published as: AU2006216275B2; WO2006090729A1; KR101216251B1; MY142488A; EP1854363B8; CA2596794A1; CA2596794C; AU2006216275A1; US20100159072A1; JP4832425B2; EP1854363B1; TWI375519B; US8182849B2; EP1854363A1; EP1854363A4; CN101128122B; JPWO2006090729A1; CN101128122A; TW200635513A; KR20070105381A

Abstract

Bebida de fermentación a base de té que comprende un líquido de fermentación a base de té con por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065).

Description

CAMPO TÉCNICO

5 La presente invención se refiere a bebidas de fermentación a base de té y a bebidas de té.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

10 Lo siguiente es lo que se conoce hasta ahora.

(1) La fermentación tradicional de las hojas de té y los tés fermentados que

incluyen té goishi, té pu-erh, té miang, etc. 15

(2) Un té verde fermentado obtenido mediante el proceso siguiente: bacterias de la especie plantarum del género Lactobacillus (bacterias ácido-lácticas), que pueden multiplicarse en las hojas de té, se separan de las hojas de té y se cultivan en un medio líquido; y las hojas de té se sumergen en agua caliente, se dejan enfriar, se inoculan con

20 las bacterias cultivadas y se fermentan durante un periodo predeterminado (Documento 1 de Patente).

(3) Un procedimiento que puede producir una gran cantidad de bebida fermentada

procedente del té o del café, utilizando una levadura y bacterias en condiciones de fácil 25 producción y en un periodo de producción relativamente corto (Documento 2 de Patente).

(4) La inmunidad de las mucosas es el primer mecanismo filáctico utilizado cuando un patógeno se adhiere a la membrana de la mucosa (Documento 1 no de Patente).

30 (5) IgA secretora (S-IgA) en la mucosidad tiene actividad defensora contra los patógenos tales como bacterias, virus, etc. (Documentos 2 y 3 no de Patente) y neutraliza las toxinas producidas por los microorganismos (Documento 4 no de Patente).

[Documento 1 de Patente] Patente Japonesa 2876006

35 [Documento 2 de Patente] Publicación de Patente Japonesa no examinada nº 1997/220054

[Documento 1 no de Patente] Brandtzaeg, P., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 146: 13, 40 1989

[Documento 2 no de Patente] Czinn, S. J. et al., Vaccine 11: 637, 1993 [Documento 3 nº de Patente] Renegar, K. et al., J. Immunol. 146: 1972, 1991

45 [Documento 4 no de Patente] Brandtzaeg, P., APMIS 103:1, 1995; Kilian, M. et al., Microbiol. Rev. 52: 296, 1988

EXPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN

PROBLEMAS QUE DEBE RESOLVER LA INVENCIÓN

Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un té fermentado con bacterias de la especie plantarum del género Lactobacillus (bacterias ácido-lácticas) y un té que contiene las bacterias, presentando los tés una elevada producción de IgA que aumenta la actividad lo que no se ha conocido hasta ahora.

MEDIOS PARA RESOLVER EL PROBLEMA

Se ha presentado anteriormente una solicitud de patente sobre una invención que se refiere a Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065), que pueden presentar excelente actividad estimulante de inmunidad de las mucosas y actividad de mejora del mecanismo biofiláctico y son útiles como probióticos (Solicitud de Patente Japonesa nº 2003-297570, PCT/JP2004/012136).

Se ha llevado a cabo extensa investigación adicional y se descubrió que las bacterias ácido-lácticas descubiertas anteriormente, cuando se añaden a extractos de té, no afectan desfavorablemente el sabor o el aroma propios del té, mientras que conserva su excelente producción de IgA que potencia la actividad y la inmunidad de las mucosas que estimula la actividad. Se descubrió además que la fermentación (cultivo, proliferación) de estas bacterias ácido-lácticas puede llevarse a cabo fácilmente en extractos de té y que las bebidas de fermentación a base de té obtenidas de este modo conservan el sabor y el aroma propios del té sin efectos desfavorables y pueden presentar excelente actividad que aumenta la producción de IgA y actividad que estimula inmunidad de las mucosas procedente de estas bacterias ácido-lácticas. La presente invención se llevó a cabo como resultado de la investigación adicional basándose en estos descubrimientos.

La presente invención proporciona los apartados 1 a 23 siguientes.

1.: Bebida de fermentación a base de té que comprende un líquido de fermentación a base de té con una especie de bacteria ácido-láctica por lo menos seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065).

2.: Bebida de fermentación a base de té según el apartado 1 que contiene además un extracto de té.

3.: Bebida de fermentación a base de té según el apartado 1 ó 2, en la que la bacteria ácido-láctica está contenida en una cantidad eficaz para estimular la inmunidad de las mucosas.

4.: Bebida de fermentación a base de té según el apartado 1 ó 2, en la que la bacteria ácido-láctica está contenida en una cantidad eficaz para aumentar la producción de IgA.

5.: Bebida de fermentación a base de té según el apartado 1 ó 2, en la que el contenido de bacterias ácido-lácticas es de 104 ufc/ml a 108 ufc/ml.

6.: Bebida de fermentación a base de té según el apartado 1 ó 2, en la que el contenido de bacterias ácido-lácticas es de 105 ufc/ml a 107 ufc/ml.

7.: Bebida de té que comprende por lo menos una especie de bacteria del ácido láctico seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065) y un extracto de té.

8.: Bebida de té según el apartado 7, en la que la bacteria ácido-láctica está contenida en una cantidad eficaz para estimular la inmunidad de las mucosas.

9.: Bebida de té según el apartado 7, en la que la bacteria ácido-láctica está contenida en una cantidad eficaz para aumentar la producción de IgA.

10.: Bebida de té según el apartado 7, en la que el contenido de bacterias ácidolácticas es de 104 ufc/ml a 108 ufc/ml.

11.: Bebida de té según el apartado 7, en la que el contenido de bacterias ácidolácticas es de 105 ufc/ml a 107 ufc/ml.

12.: Procedimiento para producir la bebida de fermentación a base de té según el apartado 1, que comprende la etapa que consiste en cultivar, en un medio que contiene té, por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065).

13.: Procedimiento según el apartado 12, que comprende además la etapa que consiste en ajustar el contenido en bacterias ácido-lácticas de la bebida de fermentación a base de té entre 104 ufc/ml y 108 ufc/ml.

14.: Procedimiento según el apartado 12 ó 13, en el que el medio que contiene té es un extracto de té que puede contener un componente o componentes opcionales y tiene un Brix procedente del té de 0,10 a 0,50, y en el que el cultivo se realiza entre 25ºC y 50ºC durante 12 horas a 32 horas.

15.: Procedimiento según el apartado 12 ó 13, en el que el medio que contiene té es un extracto de té que puede contener un componente o componentes opcionales y tiene un Brix procedente del té de 0,18 a 0,30, y en el que el cultivo se realiza entre 30ºC y 40ºC durante 15 horas a 20 horas.

16.: Procedimiento para producir la bebida de fermentación a base de té según el apartado 2, que comprende las etapas siguientes:

(1): Cultivar, en un medio que contiene té, por lo menos una especie de bacteria de ácido láctico seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065), para obtener un líquido de fermentación a base de té; y

(2): añadir un extracto de té al líquido de fermentación a base de té obtenido en la etapa (1).

17.: Procedimiento según el apartado 16, en el que, en la etapa (2), el extracto de té se añade al líquido de fermentación a base de té de modo que la bebida de fermentación a base de té final tiene un Brix procedente del té de 0,10 a 0,50 y un contenido en bacterias ácido-lácticas de 104 ufc/ml a 108 ufc/ml.

18.: Procedimiento para producir la bebida de té según el apartado 7, que comprende la etapa de mezclado de por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065), con un extracto de té.

19.: Procedimiento según el apartado 18, en el que el extracto de té se mezcla con bacterias ácido-lácticas de modo que la bebida de té final tiene un Brix procedente del té de 0,10 a 0,50 y un contenido en bacterias ácido-lácticas de 104 ufc/ml a 108 ufc/ml.

20.: Utilización de por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065), para la producción de una bebida de fermentación a base de té con actividad estimulante de la inmunidad de las mucosas.

21.: Utilización de por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065), para la producción de una bebida de fermentación a base de té con actividad de aumento de producción de IgA.

22.: Utilización de por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065), para la producción de una bebida de té con actividad estimulante de la inmunidad de las mucosas.

23.: Utilización de por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065), para la producción de una bebida de té con actividad de aumento de producción de IgA.

En la bebida de fermentación a base de té y en la bebida de té de la presente invención, el sabor del té convencional se conserva escrupulosamente. En particular, la bebida de fermentación a base de té de la presente invención, a pesar de estar fermentada, presenta poco o ningún olor a fermentación o del sabor que es característico de los tés fermentados convencionales o similares. La bebida de fermentación a base de té y la bebida de té de la presente invención aumenta la producción de IgA y estimula la inmunidad de las mucosas.

Las bacterias ácido-lácticas específicas para su utilización en la bebida de fermentación a base de té y en la bebida de té de la presente invención, y la bebida de fermentación a base de té y la bebida de té de la presente invención, se describen con detalle a continuación.

Cepas de bacterias ácido-lácticas

Las cepas de bacterias ácido-lácticas para su utilización en la bebida de fermentación a base de té y en la bebida de té de la presente invención, se denominan Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP10065) (denominadas en adelante a veces en conjunto como “bacterias ácido-lácticas ONRIC”).

(1) Detección sistemática

(1-1) Microorganismos originarios

Los microorganismos originarios utilizados son las bacterias ácido-lácticas separadas de los contenidos intestinales humanos, de alimentos vegetales y de alimentos animales y conservadas en el Otsu Nutraceuticals Research Institute of Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.

(1-2) Procedimiento de detección sistemática

Se llevó a cabo la detección sistemática de las cepas de la bacteria diana utilizando un sistema de cultivo de células de los parches de Peyer de ratón que utiliza como índice la capacidad de provocar la producción de IgA. Los procedimientos detallados para la detección sistemática son los descritos a continuación en el Ejemplo 1 de ensayo.

(2): Microorganismos obtenidos por detección sistemática (2-1) Lactobacillus ONRIC b0239

(a): Características macroscópicas (a-1) Medio MRS con agar-agar Circular a ligeramente irregular, semiesférica, lisa, blanco lechoso

(a-2) Medio BL con agar-agar Circular a ligeramente irregular, semiesférica, lisa, pardo blanquecino

(b): Características macroscópicas Bacilo, inmóvil, sin esporas

(c): Temperatura óptima de crecimiento 30 a 33ºC

(d): Características fisiológicas y bioquímicas

Tinción Gram: positiva

Utilización de azúcar

Glicerol: -

Eritritol: -

D-arabinosa: -

L-arabinosa: -

Ribosa: ±

D-xilosa: ±

L-xilosa: -

Adonitol: -

β-metil-D-xilósido: -

Galactosa: +

D-glucosa: +

D-fructosa: +

D-manosa: +

L-sorbosa: -

Ramnosa: -

Dulcitol: -

Inositol: -

Manitol: -

Sorbitol: +

α-metil D-manósido: +

α-metil D-glucósido: ±

N-acetil-glucosamina: +

Amigdalina: +

Arbutina: +

Esculina: +

Salicina: +

Celobiosa: +

Maltosa: +

Lactosa: +

Melibiosa: +

Sacarosa: +

Trehalosa: +

Inulina -Melecitosa D-rafinosa + Almidón -Glucógeno -Xilitol β-genciobiosa + D-turanosa D-lixosa D-tagatosa D-fucosa L-fucosa D-arabitol ± L-arabitol -Gluconato 2-ceto-gluconato 5-ceto-gluconato

La cepa obtenida se identificó a partir de varias características anteriores, como

una cepa de Lactobacillus plantarum basándose en los criterios mostrados en el Manual of

Sistematic Bacteriology de Bergey, y se denominó Lactobacillus ONRIC b0239, y se

5 depositó en una corporación administrativa independiente, el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology International Patent Organism Depositary, AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón a 6 de agosto de 2003, con el número de registro de FERM P-19469. A continuación se transfirió a un depósito internacional bajo el Tratado de Budapest, y recibió un nº de registro de

10 FERM BP-10064.

(2-2) Lactobacillus ONRIC b0240

(a) Características macroscópicas

15 (a-1) Medio MRS con agar-agar

Circular a ligeramente irregular, semiesférica, lisa, blanco lechosa

20 (a-2) Medio BL con agar-agar

Circular a ligeramente irregular, semiesférica, lisa, pardo blanquecina

(b) Características macroscópicas 25

Bacilo, inmóvil, sin esporas

(c) Temperatura óptima de crecimiento

5 30 a 33ºC

(d) Características fisiológicas y bioquímicas

Tinción Gram: positiva

10

Utilización de azúcar

Glicerol -Eritritol D-arabinosa L-arabinosa -Ribosa ± D-xilosa L-xilosa -Adonitol β-metil-D-xilósido -Galactosa + D-glucosa + D-fructosa + D-manosa + L-sorbosa -Ramnosa -Dulcitol ± Inositol -Manitol + Sorbitol + α-metil D-manósido α-metil D-glucósido N-acetil-glucosamina + Amigdalina + Arbutina + Esculina + Salicina + Celobiosa + Maltosa + Lactosa + Melibiosa + Sacarosa + Trehalosa -Inulina -Melecitosa D-rafinosa + Almidón -Glucógeno -Xilitol β-genciobiosa + D-turanosa D-lixosa D-tagatosa D-fucosa L-fucosa D-arabitol L-arabitol -Gluconato 2-ceto-gluconato 5-ceto-gluconato

Sistematic Bacteriology de Bergey, y se denominó Lactobacillus ONRIC b0240, y se

5 depositó en una corporación administrativa independiente, el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology International Patent Organism Depositary, AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón a 6 de agosto de 2003, con el número de registro de FERM P-19470. A continuación se transfirió a un depósito internacional bajo el Tratado de Budapest, y recibió un nº de registro de

10 FERM BP-10065.

La inmunoestimulación notable de las mucosas y el aumento de la producción de

IgA conseguidos por la bacteria ácido-láctica ONRIC se considera que se producen de la

forma siguiente: las células M de los parches de Peyer, que son un constituyente del

15 sistema inmunitario intestinal, absorben un antígeno en el lumen. El antígeno es presentado a los linfocitos T CD4 por las células presentadoras de antígenos tales como los dendrocitos. Mientras que los linfocitos B inmaduros maduran en las células productoras de anticuerpo IgA por respuestas específicas para el antígeno de los linfocitos T, los linfocitos B se desplazan a la lámina propia de la mucosa para diferenciarse por último en las células productoras de anticuerpos IgA. Aunque no está claro cómo las bacterias ácido-lácticas ONRIC están implicadas en el mecanismo de aumento de la producción de IgA, por lo menos la absorción del antígeno por las células M de los parches de Peyer es necesaria para el aumento de producción de IgA debido a la presencia de bacterias ácido-lácticas ONRIC. Por consiguiente, las bacterias ácidolácticas ONRIC, se supone que funcionan como dicho antígeno. Para que sean funcionales como antígeno, las bacterias ácido-lácticas ONRIC no tienen que ser células viables. Las bacterias pueden esterilizarse por procedimientos de esterilización con calor convencionales.

Bebida de fermentación a base de té

La bebida de fermentación a base de té de la presente invención, comprende un líquido de fermentación a base de té de por lo menos una especie de bacteria ácidoláctica (bacteria ácido-láctica ONRIC) seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP10065) como ingrediente esencial.

El líquido de fermentación a base de té, que es un ingrediente esencial, puede prepararse cultivando la bacteria ácido-láctica ONRIC en un medio que contiene té. El líquido de fermentación a base de té de la presente invención, comprende la bacteria ácido-láctica ONRIC cultivada de este modo. En la presente invención, es posible utilizar el medio que contiene té después del cultivo y que comprende la bacteria ácido-láctica ONRIC como líquido de fermentación a base de té de la presente invención sin modificación.

En la presente memoria, el medio que contiene té puede ser un medio que contiene un disolvente adecuado (preferentemente agua fría o caliente) y hojas de té y/o hojas de té pulverizadas (por ejemplo, polvo); un extracto de té preparado extrayendo las hojas de té y/o hojas de té pulverizadas con un disolvente adecuado (preferentemente agua fría o caliente); o que comprende un polvo (extracto en polvo) obtenido preparando el extracto de té en un polvo utilizando un secador por pulverización, etc., en un disolvente adecuado (preferentemente agua fría o caliente). Los ejemplos de tés (hojas de té, Tea Sinensis) que pueden utilizarse como material para medio de cultivo incluyen los tés verdes, tales como sen-cha (té verde de grado medio), gyokuro (té verde de alta calidad), tés en rama, tés en polvo, ban-cha (té basto), houji-cha (té verde tostado), genmai-cha (té con arroz integral), ma-cha (té verde en polvo), etc; tés negros (té inglés), tés oolong, tés de color negro (té pu-erh, té miang, té goishi, etc.); y bebidas similares al té utilizando otras plantas tales como tés con hierbas, té rooibos, ten-cha (té dulce), tés hydrangea, etc. Estos tés pueden utilizarse solos o combinados.

Los ejemplos específicos de dichos tés incluyen té Tieguanyin, té Sezhong, té Shuixian, té Golden oolong, sen-cha, kabuse-cha, etc.

Cuando se utiliza agua fría, agua caliente, etc., que contiene uno o más de los tipos de té mencionados anteriormente y/o hojas pulverizadas, como medio que contiene té, no existe ninguna limitación sobre la cantidad de hojas de té y/o de hojas de té pulverizadas contenidas en el medio de cultivo. Sin embargo, la cantidad de hojas de té y/o de hojas de té pulverizadas utilizadas se seleccionan normalmente de tal manera que el Brix procedente del té del medio de cultivo resultante está comprendido en el intervalo entre 0,10 y 0,50 y preferentemente entre 0,18 y 0,30.

“Brix” normalmente indica el peso en seco soluble (g) por 100 g de solución y se mide utilizando un densímetro diferencial (por ejemplo, DD-5, densímetro diferencial digital fabricado por Atago, Co., Ltd.), un refractómetro, etc. Cuando una variedad de cuerpos sólidos solubles se disuelven en una solución, el Brix se expresa normalmente como el peso en seco soluble total de la misma. Sin embargo, en la presente memoria, “Brix procedente del té” significa el Brix obtenido a partir de los cuerpos sólidos solubles procedentes únicamente del té. En otras palabras, “Brix procedente del té” indica el peso en seco soluble (g) del té por 100 gramos de medio que contiene té, extracto de té, producto de bebida final, etc.

Cuando un extracto de las hojas de uno o más de los tipos de té mencionados anteriormente y/o de las hojas pulverizadas, se utiliza como un medio que contiene té, es posible utilizar un extracto obtenido extrayendo dichas hojas de té con agua fría o caliente de la misma manera que se sirve el té habitualmente. La concentración del extracto no está limitada, sin embargo, se selecciona normalmente de modo que el Brix procedente del té está comprendido entre 0,10 y 0,50 y preferentemente entre 0,18 y 0,30.

Cuando se ha de utilizar agua fría o caliente que contiene un extracto en polvo obtenido de las hojas de uno o más de los tipos de tés mencionados anteriormente como medio que contiene té, ejemplos específicos de extracto en polvo utilizable incluyen extracto en polvo de té verde FD, extracto en polvo de té de jazmín FD, extracto en polvo de té oolong FD (estos tres son preparados por San-Ei Gen FFI), extracto en polvo de té de cebada, extracto en polvo de té negro, extracto en polvo de té verde (estos tres son preparados por Takasago International Corporation), etc. Dichos extractos en polvo pueden utilizarse como medio de cultivo en forma de solución acuosa disueltos en agua fría o caliente. La cantidad de extracto en polvo añadida al agua fría o caliente no está limitada; sin embargo, se selecciona normalmente de modo que el Brix de la solución acuosa obtenida procedente del té está comprendido en el intervalo entre 0,10 y 0,50, y preferentemente entre 0,18 y 0,30.

El líquido de fermentación a base de té de la presente invención puede obtenerse, por ejemplo, inoculando bacterias ácido-lácticas ONRIC en el medio que contiene el té de modo que el medio contiene 104 a 108 ufc/ml de bacterias ácido-lácticas ONRIC y a continuación cultivando el medio entre 25 y 50ºC durante 12 a 32 horas.

Para el cultivo (fermentación) utilizando bacterias ácido-lácticas ONRIC, resulta preferido preparar un iniciador de antemano inoculando las bacterias ácido-lácticas en un medio de cultivo de fermentación apropiado. Un ejemplo representativo de dicho iniciador es un cultivo obtenido inoculando bacterias ácido-lácticas ONRIC en forma de cuerpos celulares conservados en frío, cuerpos celulares liofilizados, etc., en un medio de cultivo, tal como un medio de cultivo MRS o un medio de leche en polvo al 10%, esterilizado de la manera convencional entre 90 y 121ºC durante 5 a 20 minutos de antemano. El iniciador preparado de este modo contiene normalmente aproximadamente 104 a aproximadamente 107 ufc de bacterias ácido-lácticas ONRIC por gramo de cultivo.

El medio de cultivo de fermentación utilizado para el iniciador puede enriquecerse opcionalmente con sustancias que favorecen la fermentación para asegurar el buen crecimiento de las bacterias ácido-lácticas ONRIC, por ejemplo, varias fuentes de carbono, tales como glucosa, almidón, sacarosa, lactosa, dextrina, sorbitol, fructosa, etc., fuentes de nitrógeno, tal como peptona, etc.; vitaminas y minerales.

En cuanto a las condiciones cultivo, la temperatura de fermentación se selecciona generalmente del intervalo entre aproximadamente 25 y aproximadamente 50ºC, y preferentemente aproximadamente entre 30 y aproximadamente 40ºC, y el tiempo de fermentación se selecciona de dentro del intervalo entre aproximadamente 12 y aproximadamente 32 horas, y preferentemente aproximadamente 15 a aproximadamente 20 horas. Las condiciones de cultivo particularmente preferidas son 33ºC durante 16 horas.

Durante el cultivo (fermentación) de las bacterias ácido-lácticas ONRIC, el medio que contiene té puede enriquecerse con cantidades apropiadas de componentes opcionales, tales como nutrientes, etc., adecuados para el mantenimiento y el crecimiento de las bacterias ácido-lácticas. Los ejemplos específicos incluyen los nutrientes utilizados en medios para cultivar microorganismos, por ejemplo, varias fuentes de carbono, tales como glucosa, almidón, sacarosa, lactosa, dextrina, sorbitol, fructosa, etc., fuentes de nitrógeno, tal como peptona, etc.; vitaminas; minerales; oligoelementos (metales); y otros nutrientes. Los ejemplos de dichas vitaminas incluyen la vitamina B, vitamina D, vitamina C, vitamina E y vitamina K. Los ejemplos de dichos oligoelementos incluyen zinc, selenio, etc. Los ejemplos de otros de dichos nutrientes incluyen varios oligosacáridos, tales como los lactooligosacáridos, oligosacáridos de la soja, lactulosa, lactitol, fructooligosacáridos y galactooligosacáridos. La cantidad de dichos oligosacáridos que debe incorporarse no está particularmente limitada pero preferentemente se selecciona dentro de un intervalo de modo que la concentración de los mismos en la composición de la invención no es superior a aproximadamente 3% en peso.

El líquido de fermentación a base de té obtenido de este modo puede utilizarse como bebida de fermentación a base de té de la presente invención sin modificación. La bebida de fermentación a base de té de la presente invención puede también producirse disolviendo un extracto en polvo obtenido liofilizando el líquido de fermentación a base de té en agua, etc. Es también posible obtener la bebida de fermentación a base de té de la presente invención concentrando o diluyendo el líquido de fermentación a base de té obtenido de este modo con agua, etc., o añadiendo un extracto de té al líquido de fermentación a base de té. En la presente memoria, el extracto de té añadido al líquido de fermentación a base de té es el mismo que el obtenido extrayendo las hojas de té y/o las hojas de té pulverizadas utilizadas en el medio que contiene té con un disolvente adecuado (preferentemente agua fría o caliente). Es posible también utilizar un extracto de té disolviendo un polvo (extracto en polvo) obtenido al preparar el extracto de té en polvo utilizando un secador por atomización, etc., en agua fría, agua caliente, etc. La concentración del mismo no está limitada.

En ambos casos, es decir, si se utiliza un líquido de fermentación a base de té y un liofilizado del mismo, el contenido en bacterias ácido-lácticas ONRIC en la bebida de fermentación a base de té de la presente invención, se selecciona de manera adecuada dentro del intervalo de aproximadamente 104 a aproximadamente 108 ufc/ml, y preferentemente aproximadamente 105 a 107 ufc/ml. El contenido en bacterias ácidolácticas puede controlarse cambiando las condiciones de cultivo del medio que contiene té, el número de células inoculadas, etc., o concentrando o diluyendo el líquido de fermentación a base de té. Cuando se utiliza un extracto en polvo de fermentación a base de té, el contenido de bacterias ácido-lácticas ONRIC puede controlarse cambiando la cantidad del extracto en polvo añadido.

Cuando la bebida de fermentación a base de té de la presente invención se produce mezclando un líquido de fermentación a base de té con un extracto de té, el contenido del líquido de fermentación a base de té y el extracto de té no están limitados y pueden seleccionarse de manera adecuada de tal manera que la bebida de fermentación a base de té de la presente invención producida mezclando los dos ingredientes contiene las bacterias ácido-lácticas en el intervalo, por ejemplo, de 104 ufc/ml a 108 ufc/ml y preferentemente de 105 ufc/ml a 107 ufc/ml y el Brix procedente del té o de la bebida de fermentación a base de té está comprendido en el intervalo de 0,10 a 0,50 y más preferentemente de 0,18 a 0,30.

En la presente, ufc (unidad formadora de colonias) está representada por el recuento de células viables medidas por el método siguiente, y no significa que la bebida contenga realmente este número de células viables. En otras palabras, la bebida de la presente invención puede esterilizarse por procedimientos convencionales de esterilización con calor antes de convertirse en un producto final, y por consiguiente las células viables no es necesario que existan en el producto. En tal caso, el producto contiene células muertas equivalentes al recuento de células viables medido antes de la esterilización, alcanzando los efectos pretendidos por la presente invención. En la presente memoria, el número de células en una bebida sometido a esterilización está representado por el recuento de células viables medido antes de la esterilización.

“Medición del número de bacterias ácido-lácticas”

El recuento de células viables se determina cultivando un cultivo vertido a 33ºC utilizando un medio con agar-agar de recuento en placa que contiene BCP y haciendo el recuento de las colonias formadas. Como el recuento de células viables y la turbidez se correlacionan entre sí, si esta correlación entre el recuento de células viables y la turbidez se determina de antemano, el recuento de células viables puede calcularse por consiguiente determinando la turbidez en lugar del recuento de las células viables. La cantidad de bacterias ácido-lácticas ONRIC que debe incorporarse en la bebida de fermentación a base de té de la presente invención puede ajustarse de manera adecuada según el tipo de bebida que debe producirse, el tipo de bacteria ácido-láctica utilizado, etc., utilizando como guía el intervalo mencionado anteriormente.

La bebida de fermentación a base de té de la presente invención puede comprender además vehículos comestibles adecuados (materiales alimenticios), si es necesario, de la misma manera que los alimentos y bebidas habituales.

De este modo, se obtiene la bebida de fermentación a base de té de la presente invención. La bebida de fermentación a base de té de la presente invención así obtenida puede distribuirse asépticamente en recipientes adecuados para proporcionar los productos finales. Los productos obtenidos de este modo tienen el sabor propio del té así como la actividad estimulante de inmunidad de las mucosas o la actividad de aumento de la producción de IgA atribuible a las bacterias ácido-lácticas ONRIC.

La cantidad administrada (cantidad admitida) de la bebida de fermentación a base de té de la presente invención puede seleccionarse de manera adecuada según la edad, sexo, peso corporal y gravedad de la enfermedad del receptor, etc., y no está específicamente limitada. Generalmente la bebida de fermentación a base de té de la presente invención puede administrarse a un cuerpo humano en una cantidad al día que corresponde a un recuento de células viables, calculado como el número de bacterias ácido-lácticas ONRIC, de aproximadamente 106 a aproximadamente 1010 ufc. Por consiguiente dependiendo del recuento de células viables de la bebida, es preferible que la cantidad ingerida de bebida de fermentación a base de té de la presente invención sea aproximadamente 50 a aproximadamente 1.000 ml/día.

La presente invención suministra además la utilización de por lo menos un tipo de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065) para producir bebidas de fermentación a base de té con una actividad estimulante de inmunidad de las mucosas o actividad de mejora de la producción de IgA.

Bebida de té

La invención suministra también una bebida de té que contiene por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica (bacteria ácido-láctica ONRIC) seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065). Esta bebida de té contiene una bacteria ácido-láctica y extracto de té como ingredientes esenciales.

En la presente, las bacterias ácido-lácticas ONRIC pueden ser cuerpos celulares aislados del líquido de té fermentado utilizado para obtener una bebida de fermentación a base de té de la presente invención, o liofilizados de la misma.

Las bacterias ácido-lácticas utilizadas para producir la bebida de té de la presente invención pueden estar en forma de una solución de cultivo que contiene bacterias ácidolácticas ONRIC cultivadas en un medio de cultivo adecuado que no contiene té o puede estar en forma de una cepa de cuerpo celular de dicha solución de cultivo o de liofilizados de la misma.

Los ejemplos de un medio de cultivo exento de té incluyen el medio MRS descrito anteriormente, medio de leche desnatada en polvo al 10% y otros medios de cultivo nutritivos utilizados generalmente para cultivar bacterias ácido-lácticas, así como líquidos que contiene, por ejemplo, fluidos procedentes de vegetales o frutos, leche de soja (emulsión de soja), etc., como material de fermentación.

Las bacterias ácido-lácticas utilizadas para producir la bebida de té de la presente invención pueden estar en forma de un líquido de fermentación (solución del cultivo) obtenido cultivando las bacterias ácido-lácticas ONRIC en el líquido, o productos en bruto o purificados de dichos cultivos obtenidos utilizando el líquido de fermentación y liofilizados de los mismos.

Los vegetales y frutos para su utilización como material de fermentación incluyen cortes, exprimidos, moliendas, jugos exprimidos, productos tratados con enzimas y diluciones y concentraciones de los mismos. Los vegetales utilizables incluyen, por ejemplo, calabazas, zanahorias, tomates, pimientos morrones, apio, espinaca, batatas, maíz, remolachas, col rizada, perejil, berza y brécol. Los frutos utilizables incluyen, por ejemplo, manzanas, melocotones, plátanos, fresas, uvas, melones, naranjas y mandarinas.

Los cortes, exprimidos o moliendas de vegetales o frutos pueden obtenerse por ejemplo, por un procedimiento que comprende el lavado de por lo menos un vegetal y/o un fruto y cuando sea necesario, someterlo a un tratamiento de blanqueo, por ejemplo, colocándolo en agua caliente, y a continuación, cortándolo, pulverizándolo o moliéndolo, por medio de un exprimidor, mezclador, procesador de alimentos, pulverizador, MycolloiderTM (producto de Tokushu Kika Kogyo Co. Ltd.) o similar. Los zumos exprimidos pueden prepararse utilizando un filtro prensa, exprimidor-mezclador o similar. Los zumos exprimidos pueden prepararse también filtrando las moliendas a través de un filtro de tela

o similar. Los productos tratados con enzimas pueden prepararse dejando que la celulasa, pectinasa, protopectinasa o similar actúe en los cortes, exprimidos, moliendas o jugos exprimidos. Las diluciones incluyen diluciones acuosas 1 a 50 veces. Los concentrados incluyen los concentrados 1 a 100 veces por medios tales como la concentración por congelación, la concentración a presión reducida, etc.

La leche de soja, que es otro ejemplo específico de material de fermentación, puede prepararse a partir de materiales de soja de manera convencional. Los ejemplos de dichas leches de soja incluyen los homogeneizados preparados sumergiendo semillas de soja peladas en agua, pulverizando en húmedo las semillas de soja con un molino adecuado tal como un molino de coloides y homogeneizando el pulverizado de la manera convencional, y las soluciones en agua de la proteína de soja soluble en agua.

Para la fermentación utilizando bacterias ácido-lácticas, resulta preferido preparar un iniciador de antemano e inocular el material de fermentación con el iniciador. Un ejemplo representativo de dicho iniciador, es un cultivo obtenido inoculando las bacterias ácido-lácticas ONRIC en el medio de leche en polvo desnatada al 10% enriquecido con material de fermentación esterilizado de la manera convencional entre 90 y 121ºC durante 5 a 20 minutos de antemano y a continuación incubando las bacterias ácido-lácticas ONRIC. Un iniciador así preparado contiene normalmente aproximadamente 107 a aproximadamente 109 ufc de bacterias ácido-lácticas ONRIC por gramo de cultivo.

El material de fermentación utilizado para el iniciador puede enriquecerse opcionalmente con sustancias que favorecen la fermentación, que aseguran el buen crecimiento de las bacterias ácido-lácticas ONRIC, por ejemplo, varias fuentes de carbono, tales como glucosa, almidón, sacarosa, lactosa, dextrina, sorbitol, fructosa, etc.; fuentes de nitrógeno, tales como peptona, etc.; vitaminas y minerales.

En cuanto a las condiciones de cultivo, la temperatura de fermentación se selecciona generalmente dentro del intervalo comprendido aproximadamente 20 y aproximadamente 45ºC, y preferentemente entre aproximadamente 25 y 37ºC y el tiempo de fermentación se selecciona de entre el intervalo comprendido entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 horas.

El extracto de té, que es otro ingrediente esencial de la bebida de té de la presente invención, es el mismo que el añadido al líquido de fermentación a base de té al producir la bebida de fermentación a base de té descrita anteriormente de la presente invención.

Los contenidos de bacterias ácido-lácticas ONRIC y el extracto de té no están limitados y pueden seleccionarse de manera adecuada de tal manera que la bebida de té de la presente invención producida mezclando los dos ingredientes esenciales contiene las bacterias ácido-lácticas en el intervalo, por ejemplo, entre 104 ufc/ml y 108 ufc/ml, y preferentemente entre 105 ufc/ml y 107 ufc/ml, y el Brix procedente del té de la bebida de té está comprendido en el intervalo entre 0,10 y 0,50 y más preferentemente entre 0,18 y 0,30.

De este modo, se obtiene la bebida de té de la presente invención. La bebida de té de la presente invención, obtenida de este modo puede distribuirse asépticamente en recipientes adecuados para proporcionar los productos finales. El producto obtenido de este modo tiene el sabor propio del té así como la actividad estimulante de inmunidad de las mucosas o la actividad que aumenta la producción de IgA atribuible a las bacterias ácido-lácticas ONRIC.

La cantidad administrada (cantidad admitida) de la bebida de té de la presente invención puede seleccionarse de manera adecuada según la edad, sexo, peso corporal y gravedad de la enfermedad del receptor, etc., y no está específicamente limitada. Generalmente, la bebida de té de la presente invención puede administrarse a un cuerpo humano en una cantidad al día que corresponde a un recuento de células viables, calculado como el número de bacterias ácido-lácticas ONRIC, de aproximadamente 106 a aproximadamente 1010 ufc. Por consiguiente dependiendo del recuento de células viables de la bebida, resulta preferido que la cantidad admitida de bebida de fermentación a base de té de la presente invención sea aproximadamente 50 a aproximadamente 1.000 ml/día.

La presente invención suministra además la utilización de por lo menos un tipo de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065) para producir bebidas de té con una actividad estimulante de inmunidad de las mucosas o actividad de mejora de la producción de IgA.

EFECTOS DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una bebida de fermentación a base de té y una bebida de té que conserva el sabor propio y el gusto del té sin que estén afectados desfavorablemente, y tiene una actividad excelente de aumento de la producción de IgA y una actividad estimulante de la inmunidad de las mucosas. La ingestión de estas bebidas se supone que potencia la biofilaxis debida a la excelente actividad de aumento de la producción de IgA y de la actividad estimulante de la inmunidad de las mucosas.

Varios sabores y gustos, tales como, por ejemplo, un gusto ligero y acidez refrescante, un gusto ligero y sabor penetrante o un color pardo oscuro y sabor suave, puede comunicarse a la bebida de fermentación a base de té y a la bebida de té de la presente invención utilizando diferentes tipos de hojas de té como materias primas y/o diferentes proporciones del líquido de fermentación a base de té, de extracto de té, etc. Las bebidas de la invención tienen gusto y sabor constantemente agradable que son propios del té.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es un diagrama que presenta los efectos de la administración de Lactobacillus ONRIC b0240 sobre la producción de IgA de las células de los parches de Peyer.

La figura 2 es un gráfico que muestra la influencia de la administración de Lactobacillus ONRIC b0240 sobre la producción de IgA.

La figura 3 es un diagrama que presenta el cambio en la cantidad total de S-IgA en la saliva humana el día 21º tras la administración de Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) (2 x 109 ufc equivalente/día).

MEJOR MODO DE PONER EN PRÁCTICA LA INVENCIÓN

Los ejemplos proporcionados a continuación describen los procedimientos de producción para la bebida de fermentación a base de té y para la bebida de té de la presente invención, y los ejemplos de ensayo de las bacterias ácido-lácticas específicas y utilizadas en la bebida de fermentación a base de té y en la bebida a base de té de la presente invención. Los ejemplos y los ejemplos de ensayo se proporcionan a título ilustrativo de la presente invención con mayor detalle y no limitativo del alcance de la invención.

En los ejemplos y ejemplos de ensayo, los porcentajes están expresados en peso a menos que se indique de otra manera.

EJEMPLO 1

Procedimiento 1 de producción de bebidas de fermentación a base de té

(1) Producción de cultivo previo preliminar de células bacterianas conservadas en congelador

Se descongelaron 100 µl de Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065) conservados en congelador a -80ºC y se añadieron a 10 ml de medio líquido MRS (preparado por Difco) esterilizado en un autoclave a 121ºC durante 15 minutos. La mezcla resultante se sometió a cultivo estacionario a 33ºC durante 16 horas, preparando un líquido de cultivo preliminar previo del Lactobacillus ONRIC b0240 (recuento celular: aproximadamente 109 ucf/ml).

Cultivo preliminar

Se inocularon 100 µl del líquido de cultivo preliminar previo preparado anteriormente en 10 ml de medio líquido MRS (preparado por Difco) esterilizado en un autoclave a 121ºC durante 15 minutos, seguido de cultivo estacionario a 33ºC durante 16 horas, preparando un líquido de cultivo preliminar del Lactobacillus ONRIC b0240 (recuento celular: aproximadamente 109 ucf/ml).

Cultivo

Se inocularon 10 µl del líquido de cultivo preliminar preparado anteriormente en 1 l de medio líquido MRS (preparado por Difco) esterilizado en un autoclave a 121ºC durante 15 minutos, seguido de cultivo estacionario a 33ºC durante 16 horas, preparando un líquido de cultivo preliminar del Lactobacillus ONRIC b0240 (recuento celular: aproximadamente 109 ucf/ml).

Recogida y lavado

Se centrifugó 1 l del líquido de cultivo a 11.000 rpm durante 10 minutos para recoger las células bacterianas, seguido del lavado con solución salina tamponada con fosfato que se había esterilizado en un autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Se realizó una centrifugación adicional para recoger las células bacterianas. Se lavaron otra vez las células bacterianas recogidas con solución salina tamponada con fosfato que había sido esterilizada y se recogió por centrifugación. Por separado, se disolvieron 2 g de extracto en polvo de té verde (San-Ei Gen F.F.I., Inc.) en 1000 g de agua desionizada. Las células bacterianas recogidas se pusieron en suspensión en la solución, que se había esterilizado en un autoclave a 121ºC durante 15 minutos, y la suspensión se conservó a -80ºC. El recuento celular de las células bacterianas conservadas en congelador así obtenido fue de 1,6 x 109/ml.

(2) Producción de bebidas de fermentación a base de té

Se añadieron 3,4 g de extracto en polvo de té verde (San-Ei Gen F.F.I., Inc.) a 2000 g de agua desionizada y se calentó a 60ºC para disolver el extracto agitando a la misma temperatura durante 10 minutos. La solución obtenida se enfrió a temperatura ambiente, y se transfirieron 2.000 ml a una botella de reactivo esterilizada. El Brix de la solución procedente del té fue 0,32.

Se inocularon en el frasco de reactivo 200 µl de Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065, recuento de células 1,6 x 109 ufc/ml). El contenido del frasco de reactivo tras la inoculación se calentó a 33ºC durante 16 horas, seguido de cultivo estacionario, preparando un líquido de fermentación a base de té verde. El recuento de células bacterianas ácido-lácticas del líquido fue de 107 ufc/ml.

Por separado, 1.000 ml de agua desionizada con una temperatura de 93ºC se añadieron a 20 g de té oolong (Mitsui Norin Co., Ltd.), y se agitaron tres veces a intervalos de 6 minutos, es decir, al comienzo, medio y final. El líquido obtenido que contiene hoja de té se filtró con un filtro de acero inoxidable, y el filtrado se enfrió en un baño con hielo a aproximadamente 30ºC o menos. El filtrado enfriado se diluyó con 2000 ml de agua desionizada. El Brix del extracto de té obtenido procedente del té fue de 0,24.

Se mezclaron 1.000 ml de líquido de fermentación a base de té verde preparado anteriormente con 1.000 ml de té oolong (extracto de té). Se añadieron 500 mg/l de vitamina C a la mezcla. La mezcla líquida obtenida se esterilizó con calor y se vertió en recipientes adecuados, preparando las bebidas de fermentación a base de té de la invención.

Las bebidas de fermentación a base de té preparadas de este modo tenían un sabor ligero y acidez refrescante. El pH fue de 5,2 y el recuento celular fue de 5,2 x 106 ufc/ml.

Los ensayos de los ejemplos del ensayo siguientes demostraron que las bebidas de fermentación a base de té de la invención tienen una actividad de aumento de la producción de IgA y una actividad estimulante de la inmunidad de las mucosas excelentes.

EJEMPLO 2

Procedimiento 2 de producción de bebidas de fermentación a base de té

Se descongelaron 100 µl de Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065) conservadas en congelador a -80ºC y se añadieron a 10 ml de medio líquido MRS (preparado por Difco) esterilizado en un autoclave a 121ºC durante 15 minutos. La mezcla resultante se sometió a cultivo estacionario a 33ºC durante 16 horas, preparando un líquido de cultivo preliminar previo del Lactobacillus ONRIC b0240 (recuento celular: aproximadamente 109 ucf/ml).

Cultivo preliminar

Cultivo

Recogida y lavado

Se centrifugó 1 l del líquido de cultivo a 11.000 rpm durante 10 minutos para recoger las células bacterianas, seguido del lavado con solución salina tamponada con fosfato que se había esterilizado en un autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Se realizó una centrifugación adicional para recoger las células bacterianas. Se lavaron otra vez las células bacterianas recogidas con solución salina tamponada con fosfato que había sido esterilizada y se recogió por centrifugación. Por separado, se disolvieron 2 g de extracto en polvo de té verde (San-Ei Gen F.F.I., Inc.) en 1.000 g de agua desionizada. Las células bacterianas recogidas se pusieron en suspensión en la solución, que se había esterilizado en un autoclave a 121ºC durante 15 minutos, y la suspensión se liofilizó. El recuento celular de las células bacterianas conservadas en congelador obtenido de este modo fue de 3,7 x 109/ml.

(2) Producción de bebidas de fermentación a base de té

Se añadieron 4 g de extracto en polvo de té verde (San-Ei Gen F.F.I., Inc.) a 2.000 g de agua desionizada y se calentó a 60ºC para disolver el extracto agitando a la misma temperatura durante 10 minutos. La solución obtenida se enfrió a temperatura ambiente, y se transfirieron 2000 ml a una botella de reactivo. El Brix de la solución procedente del té fue 0,36.

Se inocularon en el frasco de reactivo 25 mg de Lactobacillus ONRIC b0240 liofilizado (FERM BP-10065, recuento de células 3,7 x 109 ufc/ml). El contenido del frasco de reactivo tras la inoculación se calentó a 33ºC durante 16 horas, y las células bacterianas se sometieron a cultivo estacionario (recuento estimado de células iniciales: 5 x 104 ufc/ml).

Se añadieron 500 mg/l de vitamina C al líquido de cultivo obtenido de este modo. La mezcla líquida obtenida se esterilizó con calor y se vertió en recipientes adecuados, preparando las bebidas de fermentación a base de té de la invención.

(3) Evaluación de la calidad de las bebidas de fermentación a base de té

Las bebidas de fermentación a base de té obtenidas presentaban las siguientes propiedades físicas.

pH: 4,75

Recuento de células: 4,1 x 106 ufc/ml (medido por el método para medir el recuento de células de bacterias ácido-lácticas de la Ley Japonesa Sanitaria para Alimentos)

Turbidez: 0,038 (medida con un espectrofotómetro U-3000 fabricado por Hitachi Ltd.)

Contenido de ácido láctico: 14,8 mg/100 ml (medido con un cromatógrafo de columna líquida de alta resolución fabricado por JASCO)

Contenido de ácido acético: 0,6 mg/100 ml (medido con un cromatógrafo de columna líquida de alta resolución fabricado por JASCO)

Contenido de ácido cítrico: 1,2 mg/100 ml (medido con un cromatógrafo de columna líquida de alta resolución fabricado por JASCO)

Brix procedente del té: 0,24 (medido con un refractómetro diferencial digital DD-5, fabricado por Atago Co., Ltd.)

Evaluación organoléptica: sabor y acidez del té (se tomaron muestras para evaluación del té experimental a 4ºC).

EJEMPLO 3

Procedimiento de producción 1 de bebidas de té

Se añadieron 1000 ml de agua desionizada con una temperatura de 93ºC a 40 g de té oolong (Mitsui Norin Co., Ltd.) y se agitó tres veces a intervalos de 6 minutos, es decir, al comienzo, a la mitad y al final. El líquido que contiene hojas de té obtenido se filtró con un filtro de acero inoxidable y el filtrado se enfrió en un baño con hielo a 30ºC o inferior. El Brix procedente del té del extracto de té obtenido fue de 0,96.

Por separado, se inoculó 1 ml de células bacterianas conservadas en el congelador de Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM P-10065) (preparadas en el Ejemplo 1-(1)) en

1.000 ml de solución acuosa que contiene 15% de jugo de zanahoria de cultivo a 33ºC durante 24 horas. El cultivo líquido se separó por centrifugación, y se esterilizó a 60ºC durante 10 minutos o más, preparando un líquido concentrado que contenía bacterias (contenido en células: aproximadamente 1010 ufc/ml).

Se añadieron 4 ml del líquido concentrado que contenía bacterias de Lactobacillus ONRIC b0240 a 1.000 ml del filtrado de té oolong (extracto líquido del té). Se añadieron 500 mg/l de vitamina C a la mezcla líquida obtenida, y la cantidad total se diluyó con agua hasta 4.000 ml. La mezcla líquida diluida se vertió en recipientes adecuados, produciendo productos de bebida de té de la invención.

Las bebidas de té obtenidas de este modo tenían un aroma ligero y un sabor intenso. El pH fue de 5,5 y el recuento de células fue de 2,6 x 107 ufc/ml.

Los ensayos de los ejemplos del ensayo siguientes demostraron que las bebidas de té de la invención tienen una actividad de aumento de la producción de IgA y una actividad estimulante de la inmunidad de las mucosas excelentes.

EJEMPLO 4

Procedimiento 2 de producción de bebidas de té

Las bebidas de té de la invención se prepararon siguiendo el procedimiento del Ejemplo 3 excepto que, como material de partida, se utilizó té pu-erh (Mitsui Norin Co., Ltd.) en lugar de té oolong y Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM P-10064 (células bacterianas conservadas en el frigorífico preparadas de la misma manera que en el Ejemplo 1-(1)) se utilizó en lugar de Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM P-10065).

Las bebidas de té de la invención presentaban color marrón oscuro, tenían un sabor suave y un gusto característico. El pH fue de 5,5 y el recuento de células fue de 2,6 x 107 ufc/ml.

EJEMPLO 5

Procedimiento 3 de producción de bebidas de fermentación a base de té

Las bebidas de fermentación a base de té de la invención se prepararon siguiendo el procedimiento del Ejemplo 2 excepto que se utilizó Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM P-10064) en lugar de té oolong y Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM P-10064) en lugar de Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM P-10065).

Las bebidas de fermentación a base de té de la invención tenían gusto a té y acidez. El pH fue de 5,0 y el recuento de células fue de 4,0 x 106 ufc/ml.

EJEMPLO 6

Procedimiento 4 de producción de bebidas de fermentación a base de té

Las bebidas de fermentación a base de té de la invención se prepararon siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1 excepto que, como material de partida, se utilizó extracto en polvo de té negro en lugar de extracto en polvo de té verde; se utilizó té negro en lugar de té oolong; y Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM P-10064 (células bacterianas conservadas en el frigorífico) se utilizó en lugar de Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM P10065).

Las bebidas de fermentación a base de té de la invención conservaron el sabor del té negro. El pH fue de 5,8 y el recuento de células fue de 1,2 x 107 ufc/ml.

EJEMPLO DE ENSAYO 1

En este Ejemplo, se determinaron in vitro las capacidades de inducción de la producción de IgA de las bacterias ácido-lácticas ONRIC utilizando el sistema de cultivo células de los parches de Peyer según los procedimientos descritos en Yasui et al., e Ikenaga et al. [Yasui, H. et al., Microbial Ecology in Hearth and Disease, 5, 155 (1992); Ikenaga, T. et al., Milk Science, 51, 27 (2002)]. Los procedimientos de ensayo son los siguientes:

(1) Animales experimentales

Se utilizaron ratones hembra de la cepa endogámica SPF/VAF BALB/c AnNCrj.

Los ratones del ensayo obtenidos se cuantificaron durante una semana. Durante el periodo de cuarentena, se suministró a discreción una dieta sólida MF (producto de Oriental Yeast Co., Ltd.) y agua del grifo.

(2): Método de cultivo de células de los parches de Peyer

Después del período de cuarentena, 80 ratones se dividieron en 8 grupos de 10 ratones cada uno de tal manera que el peso corporal medio de cada grupo era esencialmente el mismo. Después del agrupamiento, se sacrificaron 10 ratones cada día para extraer el intestino delgado y disecar los parches de Peyer del intestino delgado. Los parches de Peyer se enfriaron con hielo en un tubo de centrifugadora que contenía MEM [MEM de Eagle (producto de NISSUI), glutamina 2 mM (producto de GIBCO), piruvato sódico 1 mM (producto de GIBCO), y aminoácidos no esenciales de MEM (producto de GIBCO). Las células se pasaron a través de una malla para preparar una suspensión regular única y se lavaron bien con 5 ml de MEM. La suspensión celular se filtró y se centrifugó a 4ºC a 1.000 revoluciones/minuto durante 10 minutos. Después de la centrifugación, el sobrenadante del cultivo se retiró por aspiración y el precipitado se puso en suspensión en 5 ml de MEM. Una vez este procedimiento se había repetido dos veces, el precipitado se puso en suspensión en 10 ml de MEM que contenía FBS al 5% (producto de GIBCO), y se hizo el recuento de células viables de los parches de Peyer. La suspensión celular se inoculó en una placa de 96 pocillos para preparar una placa de cultivo celular.

(3): Preparación de las células de ensayo

Se utilizaron Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065) como células de ensayo. Estas bacterias se cultivaron en medios adecuados para su cultivo hasta alcanzar la fase de crecimiento estacionario y los cultivos resultantes se centrifugaron a continuación a 7.000 g durante 10 minutos (4ºC). Se lavaron las células tres veces con PBS(-) y se pusieron en suspensión en 5 ml de solución salina fisiológica. Para determinar el recuento de células, se midió la turbidez a 660 nm. Las células se esterilizaron a continuación al autoclave a 100ºC durante 30 minutos. Una turbidez de 1,0 a 660 nm se determinó que era equivalente a 2,0 x 109 células/ml.

(4) Determinación de la concentración de IgA en sobrenadantes de cultivo

Las células de los parches de Peyer preparadas anteriormente en el apartado (2) anterior se pusieron en suspensión en MEM que contenía 5% de FBS y se ajustaron a 2,5 x 106 células/ml, y se inocularon 200 µl de la suspensión en una placa de cultivo celular de 96 pocillos. Se añadieron a cada pocillo de la placa porciones de veinte µl de la suspensión celular de ensayo a una concentración de 2,0 x 109 células/ml preparadas anteriormente en el apartado (3) y se cultivaron a 37ºC en presencia de 5% de CO2 durante 7 días.

Se utilizaron veinte µl de LPS (lipopolisacárido) a una concentración de 50 µg/ml como referencia positiva en lugar de 20 µl de las células anteriores.

Posteriormente, las concentraciones totales de IgA de los sobrenadantes del cultivo resultantes se determinaron por ELISA utilizando un kit disponible en el mercado.

(5) Actividad de aumento de la producción de IgA de bacterias ácido-lácticas ONRIC

La Tabla 1 a continuación muestra la actividad de aumento de la producción de IgA de bacterias ácido-lácticas ONRIC en cuanto al índice de estimulación (S.I.), es decir, las concentraciones totales de IgA de sobrenadantes que contienen bacterias ácido-lácticas ONRIC tal como se determinó anteriormente en el apartado (4) en relación con la de un sobrenadante de cultivo de referencia preparado añadiendo 10 µl de PBS(-) a MEM y cultivando el medio exento de células de manera similar durante 7 días como referencia (1.0).

Los resultados del ensayo utilizando varias bacterias ácido-lácticas conocidas se muestran en las Tablas 1 a 4. Los resultados del ensayo de la referencia positiva LPS 50 µg/ml se indican como “referencia positiva (LPS)”. Las abreviaturas bajo “cepa nº” en las Tablas indican los depositarios de microorganismos siguientes:

ATTCC: American Type Culture Collection; Manassas, VA, EE.UU. JCM: Japan Collection of Microorganism, The Institute of Physical and Chemical Research, RIKEN. NRIC: NODAI Culture Collection Center, Tokyo University of Agriculture; Setagaya-ku, Tokio, Japon.

Tabla 1

Cepa nº: Género Especie Subesp. IgA S.I.

Referencia (PBS): 1

Referencia positiva (LPS): 13,1

ONRIC: b0239 Lactobacillus plantarum 5,61

ONRIC: b0240 Lactobacillus plantarum 6,31

ATCC: 43121 Lactobacillus acidophilus 1,10

JCM: 1059 Lactobacillus brevis 1,20

JCM: 1115 Lactobacillus buchneri 1,17

JCM: 1134 Lactobacillus casei casei 1,03

JCM: 1096 Lactobacillus curvatus 1,63

JCM: 1002 Lactobacillus delbrueckii bulgaricus 1,23

JCM: 1012 Lactobacillus delbrueckii delbrueckii 1,41

JCM: 1248 Lactobacillus delbrueckii lactis 1,31

JCM: 1173 Lactobacillus fermentum 1,08

JCM: 1131 Lactobacillus gasseri 1,15

JCM: 1155 Lactobacillus hilgardii 1,11

JCM: 2012 Lactobacillus johnsonii 1,11

JCM: 8572 Lactobacillus kefirgranum 1,08

JCM: 5818 Lactobacillus kefiri 1,21

JCM: 8130 Lactobacillus paracasei paracasei 1,11

JCM: 1171 Lactobacillus paracasei tolerans 1,11

JCM: 1149 Lactobacillus plantarum 1,66

JCM: 1551 Lactobacillus plantarum 1,14

JCM: 8341 Lactobacillus plantarum 1,18

JCM: 1112 Lactobacillus reuteri 1,15

ATCC: 7469 Lactobacillus rhamnosus 1,05

JCM: 1157 Lactobacillus sakei sakei 1,52

JCM: 1150 Lactobacillus salivarius salicinus 1,06

JCM: 1231 Lactobacillus salivarius salivarius 1,14

JCM: 9504 Lactobacillus suebicus 1,28

JCM: 5885 Pediococcus acidilactici (pentosaceus) 1,51

JCM: 5890 Pediococcus pentosaceus 1,44

JCM: 6124 Leuconostoc mesenteroides mesenteroides 1

NRIC: 0103 Enterococcus faecalis 1,06

NRIC: 0110 Enterococcus faecalis 1,08

NRIC: 0134 Lactobacillus brevis 1,07

NRIC: 0137 Lactobacillus brevis 1,13

NRIC: 1713 Lactobacillus brevis 1,08

NRIC: 1950 Lactobacillus brevis 1,12

NRIC: 1964 Lactobacillus brevis 1,07

NRIC: 1965 Lactobacillus brevis 1,07

Tabla 2

Cepa nº: Género Especie Subesp. IgA S.I.

NRIC 1042: Lactobacillus casei casei 1,00

NRIC 1597: Lactobacillus casei casei 0,96

NRIC 1917: Lactobacillus casei casei 1,01

NRIC 1941: Lactobacillus casei casei 1,02

NRIC 1962: Lactobacillus casei casei 1,00

NRIC 1963: Lactobacillus casei casei 1,05

NRIC 1968: Lactobacillus casei casei 1,07

NRIC 1975: Lactobacillus curvatus 1,02

NRIC 1976: Lactobacillus curvatus 1,14

NRIC 1977: Lactobacillus curvatus 1,04

NRIC 1978: Lactobacillus curvatus 1,11

NRIC 1979: Lactobacillus curvatus 0,99

NRIC 0191: Lactobacillus delbrueckii bulgaricus 1,07

NRIC 1682: Lactobacillus delbrueckii lactis 1,12

NRIC 0129: Lactobacillus fermentum 1,00

NRIC 0131: Lactobacillus fermentum 1,19

NRIC 0132: Lactobacillus fermentum 1,03

NRIC 0135: Lactobacillus fermentum 1,02

NRIC 0139: Lactobacillus fermentum 1,14

NRIC 0141: Lactobacillus fermentum 1,08

NRIC 0142: Lactobacillus fermentum 0.94

NRIC 0143: Lactobacillus fermentum 1,04

NRIC 0144: Lactobacillus fermentum 0,97

NRIC 0145: Lactobacillus fermentum 1,09

NRIC 0146: Lactobacillus fermentum 1,05

NRIC 0147: Lactobacillus fermentum 1,05

NRIC 1949: Lactobacillus fermentum 1,09

NRIC 1952: Lactobacillus fermentum 1,06

NRIC 1955: Lactobacillus fermentum 1,12

NRIC 1966: Lactobacillus hilgardii 0,94

NRIC 1967: Lactobacillus hilgardii 1,06

NRIC 1936: Lactobacillus paracasei paracasei 0,96

NRIC 1937: Lactobacillus paracasei paracasei 0,94

NRIC 1942: Lactobacillus paracasei paracasei 0,93

NRIC 1944: Lactobacillus paracasei paracasei 1,00

NRIC 1945: Lactobacillus paracasei paracasei 0,98

NRIC 1946: Lactobacillus paracasei paracasei 1,01

NRIC 1934: Lactobacillus paracasei tolerans 1,09

NRIC 1935: Lactobacillus paracasei tolerans 1,03

NRIC 1938: Lactobacillus paracasei tolerans 1,03

Tabla 3

Cepa nº Género: Género Especie Subesp. IgA S.I.

NRIC 1939: Lactobacillus paracasei tolerans 1,01

NRIC 1940: Lactobacillus paracasei tolerans 1,01

NRIC 1943: Lactobacillus paracasei tolerans 0,99

NRIC 1947: Lactobacillus paracasei tolerans 0,98

NRIC 0391: Lactobacillus pentosus 1,00

NRIC 0392: Lactobacillus pentosus 1,04

NRIC 0393: Lactobacillus pentosus 1,19

NRIC 0394: Lactobacillus pentosus 1,15

NRIC 1919: Lactobacillus plantarum 1,32

NRIC 1920: Lactobacillus plantarum 1,08

NRIC 1921: Lactobacillus plantarum 1,14

NRIC 1922: Lactobacillus plantarum 1,37

NRIC 1923: Lactobacillus plantarum 0,96

NRIC 1957: Lactobacillus plantarum 1,01

NRIC 1958: Lactobacillus plantarum 1,31

NRIC 1715: Lactobacillus reuteri 0,95

NRIC 1974: Lactobacillus reuteri 1,16

NRIC 1980: Lactobacillus reuteri 1,31

NRIC 1599: Lactobacillus sakei 0,97

NRIC 1600: Lactobacillus sakei 1,52

NRIC 1601: Lactobacillus sakei 1,07

NRIC 1602: Lactobacillus sakei 1,37

NRIC 1603: Lactobacillus sakei 1,03

NRIC 1575: Leuconostoc lactis 0,85

NRIC 1576: Leuconostoc lactis 0,92

NRIC 1578: Leuconostoc lactis 1,00

NRIC 1580: Leuconostoc lactis 1,03

NRIC 1582: Leuconostoc lactis 0,93

NRIC 1750: Leuconostoc lactis 1,03

NRIC 1087: Leuconostoc mesenteroides mesenteroides 1,33

NRIC 1507: Leuconostoc mesenteroides mesenteroides 1,02

NRIC 1541: Leuconostoc mesenteroides mesenteroides 0,90

NRIC 0124: Pediococcus acidilactici 0,93

NRIC 0122: Pediococcus pentosaceus 1,03

NRIC 0123: Pediococcus pentosaceus 0,96

NRIC 1913: Pediococcus pentosaceus 1,62

NRIC 1914: Pediococcus pentosaceus 1,05

NRIC 1915: Pediococcus pentosaceus 1,28

NRIC 0001: Saccharomyces cerevisiae 1,04

NRIC 0002: Saccharomyces cerevisiae 1,02

NRIC 0004: Saccharomyces cerevisiae 1,12

Tabla 4

Cepa nº Género: Género Especies Subesp. IgA S.I.

NRIC 0005: Saccharomyces cerevisiae 1,00

NRIC 0006: Saccharomyces cerevisiae 1,01

NRIC 0007: Saccharomyces cerevisiae 0,98

NRIC 0008: Saccharomyces cerevisiae 0,97

NRIC 0009: Saccharomyces cerevisiae 0,98

NRIC 0011: Saccharomyces cerevisiae 1,03

NRIC 0013: Saccharomyces cerevisiae 0,95

NRIC 0014: Saccharomyces cerevisiae 0,94

NRIC 0015: Saccharomyces cerevisiae 1,04

NRIC 0016: Saccharomyces cerevisiae 0,88

NRIC 0059: Saccharomyces cerevisiae 1,12

NRIC 0060: Saccharomyces cerevisiae 1,11

NRIC 1412: Saccharomyces cerevisiae 1,00

NRIC 1414: Saccharomyces cerevisiae 1,03

NRIC 1415: Saccharomyces cerevisiae 0,85

NRIC 1417: Saccharomyces cerevisiae 0,97

NRIC 1461: Saccharomyces cerevisiae 0,92

NRIC 1465: Saccharomyces cerevisiae 1,00

NRIC 1466: Saccharomyces cerevisiae 1,07

NRIC 1624: Saccharomyces cerevisiae 0,91

NRIC 1478: Saccharomyces cerevisiae 0,91

NRIC 1482: Saccharomyces cerevisiae 0,94

NRIC 1483: Saccharomyces cerevisiae 1,24

NRIC 1484: Saccharomyces cerevisiae 0,87

NRIC 1485: Saccharomyces cerevisiae 0,95

NRIC 1486: Saccharomyces cerevisiae 1,04

NRIC 1487: Saccharomyces cerevisiae 0,91

NRIC 1488: Saccharomyces cerevisiae 0,91

NRIC 1489: Saccharomyces cerevisiae 0,84

NRIC 1490: Saccharomyces cerevisiae 0,88

NRIC 1811: Saccharomyces cerevisiae 1,03

Como se muestra en las Tablas 1 a 4, considerando la producción de IgA de la

5 referencia PBS como 1, el S.I. medio de la referencia positiva es 13,1, lo que indica un fuerte aumento de la producción de IgA. Se confirmó así que este sistema de cultivo era útil para evaluar la producción de IgA de los parches de Peyer.

Una comparación de varias bacterias ácido-lácticas en cuanto a las capacidades 10 de inducción de la producción de IgA indica que las bacterias ácido-lácticas de la invención, Lactobacillus ONRIC b0239 y Lactobacillus ONRIC b0240, tienen valores de S.

I. de 5,61 y 6,31 respectivamente, y de este modo tienen capacidades inducción de la producción de IgA notablemente superior en comparación con otras cepas, cuyos valores de S. I. son 0,8-1,4.

La IgA inhibe la invasión bacteriana patógena, neutraliza los virus y toxinas, e inhibe la invasión de alérgenos alimenticios. El aumento de dicha IgA es importante para la defensa del hospedador.

EJEMPLO DE ENSAYO 2

En este Ejemplo, se determinaron in vitro las capacidades de inducción de la producción de Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065) de la siguiente manera.

(1) Animales experimentales y su alimentación

Se adquirieron cincuenta ratones macho BALB/c de 8 semanas de vida y se cuantificaron durante una semana. Durante el periodo de cuarentena y el periodo de prueba posterior, se suministró a discreción una dieta sólida de MF (producto de Oriental Yest Co., Ltd.) y agua del grifo.

Después del período de cuarentena, los ratones se dividieron en 3 grupos, es decir, un grupo de administración de solución salina fisiológica (15 ratones) y un grupo de administración de Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) (15 ratones).

(2) Preparación de Lactobacillus ONRIC b0240 para administración oral

Se prepararon Lactobacillus ONRIC b0240 (células viables y inviables) para administración oral por los métodos siguientes.

Células viables:

Se cultivó Lactobacillus ONRIC b0240 en medio MRS hasta que se alcanzó la fase de crecimiento estacionario y el cultivo resultante se centrifugó a 3.500 rmp durante 10 minutos (4ºC). Las células se sometieron a lavado de centrifugadora con solución salina fisiológica dos veces y se pusieron en suspensión en solución salina fisiológica para conseguir una concentración de 4 x 109 UFC/ml.

Células inviables:

La suspensión de células viables obtenidas de este modo se introdujo en el autoclave (calentado a 121ºC durante 15 minutos) y a continuación se sometió a ultrasonidos utilizando un sonicator de lavado (BRANSON 2510) durante 45 minutos.

(3) Procedimiento de ensayo

El Lactobacillus ONRIC b0240 (células viables) preparado en el apartado (2) se administró por vía oral a 15 ratones (5 + 5 + 5 = 15 ratones) del grupo de administración Lactobacillus ONRIC b0240 (células viables) durante 7 días (5 ratones), 14 días (5 ratones) o 21 días (5 ratones) cada mañana en una cantidad de 109 UFC/ 250 µl/ratón/día. Asimismo, el Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) preparadas en el apartado (2) se administró por vía oral a 15 ratones del grupo de administración Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) durante 7 días (5 ratones), 14 días (5 ratones) o 21 días (5 ratones). Después de sus respectivos periodos de administración, los ratones de cada grupo se sacrificaron por decapitación para extraer su sangre en tubos, que se centrifugó a 4ºC a 3.000 rotaciones/minuto durante 10 minutos para obtener sueros. Se prepararon células de los parches de Peyer por el siguiente procedimiento. Después de sacrificar los ratones en cada grupo, se extirpó el intestino delgado y se diseccionó con tijeras oftalmológicas para eliminar los parches de Peyer del intestino delgado. Se enfriaron los parches de Peyer con hielo en una placa de microvaloración de 24 pocillos que contenía un medio incompleto (RPMI 1640 que contenía 10 mg de Gentamicina). El cultivo resultante se pasó a través de una malla para preparar una suspensión celular individual y se lavó bien con 5 ml del medio incompleto. La suspensión celular obtenida se filtró y se centrifugó a 4ºC a 1.000 revoluciones/minuto durante 10 minutos. Tras la centrifugación, el sobrenadante del cultivo se eliminó por aspiración y el precipitado se puso en suspensión en 5 ml del medio incompleto. Una vez el procedimiento anterior consistente en lavado, filtración, centrifugación y eliminación por aspiración del sobrenadante de cultivo, se repitió una vez, se utilizó el precipitado resultante como células de los parches de Peyer.

Los ratones de referencia (15 ratones) en el grupo con administración de solución salina fisiológica se alojaron si administrar Lactobacillus ONRIC b0240 (células viables e inviables), y sus sueros y las células de los parches de Peyer se prepararon de la misma manera que anteriormente, 7 días (5 ratones), 14 días (5 ratones) o 21 días (5 ratones) después del comienzo del ensayo.

Ensayo de producción de IgA

Las células de los parches de Peyer (precipitados) preparadas de este modo se pusieron en suspensión en 0,5 ml de un medio completo (RPMI1640 que contiene Lglutamina 2 mM, mercaptoetanol 50 µM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/l de estreptomicina y 10% de FBS) y se ajustaron para conseguir una concentración celular de 2 x 106 células/ml. Después de contar el número de células viables, se inocularon 100 µl, de porciones de las suspensiones celulares en cada pocillo de una placa de cultivo de células de 96 pocillos.

Se evaluó por dos métodos, la cantidad de IgA producida por las células de los parches de Peyer, es decir, un método que comprende células de los parches de Peyer de cultivo tal como están y midiendo la cantidad de IgA producida, y un método que comprende cultivar las células de los parches de Peyer en un sistema de cultivo que contiene Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables), como una sustancia que estimula las célula de los parches de Peyer y midiendo la cantidad de IgA producida. Las condiciones utilizadas en este último método se consideran que son más próximas a las actuales en el medio in vivo. Más específicamente, cuando se administra por vía oral en esta prueba Lactobacillus ONRIC b0240 (células viables o inviables), es de esperar que las bacterias ácido-lácticas ingeridas proporcionen algunos estímulos a las células de los parches de Peyer.

El Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) como sustancia que estimula las células de los parches de Peyer, se prepararon según el procedimiento siguiente.

Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) para la estimulación de los parches de Peyer

La suspensión de Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) para administración bucal preparada anteriormente se diluyó más con un tampón de ácido fosfórico hasta conseguir una concentración de 107 UFC/ml (turbidez: 0,275 a 660 nm) y la suspensión de células bacterianas resultante se introdujo en el autoclave (calentado a 121ºC durante 15 minutos) y a continuación se sometió a ultrasonidos utilizando un baño de ultrasonidos de lavado (BRANSON 2510) durante 45 minutos.

En el método que utiliza la sustancia que estimula las células de los parches de Peyer, se añadieron a cada pocillo 10 µl de Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) para la estimulación de las células de los parches de Peyer y a continuación se añadió a cada pocillo RPMI1640 sin SFC para cultivar las células de los parches de Peyer a 37ºC en presencia de 5% de CO2 durante 7 días. En el método que no utiliza la sustancia que estimula las células de los parches de Peyer, se añadieron a cada pocillo 10 µl de solución salina fisiológica en lugar de los Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) y se siguió el mismo procedimiento que anteriormente para cultivar las células de los parches de Peyer.

(4) Medición

Los sobrenadantes del cultivo se aislaron de las soluciones del cultivo celular por centrifugación y se congelaron por almacenamiento a -80ºC hasta que se utilizaron para medir las concentraciones totales de IgA producida en los sobrenadantes del cultivo.

Las concentraciones totales de IgA de los sobrenadantes del cultivo y las concentraciones totales de IgG de los sueros se determinaron por ELISA utilizando kits disponibles en el mercado.

(5) Resultados

Las figuras 1 y 2 muestran los resultados (concentración de IgA y concentración de IgG), respectivamente.

La figura 1 es un diagrama de barras que presenta las concentraciones de IgA de los sobrenadantes del cultivo (µg/ml). En la figura 1 las barras blancas muestran los resultados del grupo de administración de la solución salina fisiológica de referencia (indicado como “solución salina fisiológica”). Las barras con trama muestran los resultados del grupo de administración de Lactobacillus ONRIC b0240 (células viables) (indicado como “células b0240 viables”). Las barras negras muestran los resultados del grupo de administración de Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) (indicado como “células b0240 inviables”). “Sin estímulos” indica aquellos casos en los que las células de los parches de Peyer de cada grupo se cultivaron en un sistema de cultivo que no contiene el Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables). “Estimulación celular” indica aquellos casos en los que las células de los parches de Peyer procedente de los ratones de cada grupo se cultivaron bajo la estimulación de Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) añadiendo el Lactobacillus ONRIC b0240 a un sistema de cultivo. Los resultados obtenidos utilizando 5 ratones en cada grupo se presentan como media ± desviación estándar (media ± SD). Los valores p mostrados anteriormente los resultados representan niveles de significación relativos al control en un Ensayo de la t de Student.

Los resultados representados en la figura 1 indican claramente lo siguiente:

(1) Administración en 7 días:

En el caso de la estimulación celular, el grupo de administración Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) presentaban un valor significativamente mayor comparado con el grupo de administración de solución salina fisiológica de referencia (p = 0,010).

(2) Administración en 14 días:

En el caso de falta de estimulación, el grupo de administración de Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) presentaba un valor significativamente superior (p = 0,048) (barra negra de falta de estimulación) al de referencia (sin estimulación después de la administración de solución salina fisiológica).

En el caso de estimulación celular, ambos grupos de administración de Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables y viables) presentaban valores significativamente superiores (p = 0,034 y p= 0,002, respectivamente) al de referencia (administración de solución salina fisiológica).

(3) Administración en 21 días:

En el caso de falta de estimulación, el grupo de administración de Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) presentaba un valor significativamente superior (p = 0,047) al del grupo de referencia.

En el caso de estimulación celular, ambos grupos de administración de Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables y viables) presentaban valores significativamente superiores (p = 0,015 y p= 0,005, respectivamente) al del grupo de referencia.

La figura 2 es un gráfico de barras que presenta la influencia de la administración de 21 días de Lactobacillus ONRIC b0240 sobre la producción de IgG. La concentración de IgG en el suero (µg/ml) se representa en ordenadas.

Los resultados mostrados en la figura 2 indican claramente que el grupo de administración de Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) presentaba una concentración de IgG en el suero significativamente superior (p = 0,0064) que el de referencia (administración de solución salina fisiológica), y el grupo de administración de Lactobacillus ONRIC b0240 (células viables) presentaba también una concentración de IgG en el suero significativamente mayor que la de referencia (administración de solución salina fisiológica).

Los resultados anteriores se consideran que deben producirse de la forma siguiente: Lactobacillus ONRIC b0240 provocan respuestas inmunitarias de las mucosas estimulando células inmunocompetentes en los parches de Peyer o en las células epiteliales de los intestinos y en las células inmunocompetentes circundantes que por ultimo aumentan la producción total de IgG de los parches de Peyer. Los resultados muestran además claramente que la administración de Lactobacillus ONRIC b0240 puede aumentar no solamente IgA sino también IgA en el suero.

Éstos sugieren que el aporte de bacterias ácido-lácticas ONRIC estimula no solamente la inmunidad de las mucosas sino también la inmunidad general de modo que las respuestas inmunitarias in vivo están doblemente estimuladas, permitiendo de este modo a un organismo hospedador defenderse desde el interior y exterior. Ya que no solamente las células viables sino también las células inviables presentan dicha actividad, cabe esperar que las bacterias ácido-lácticas ONRIC sean útiles en nuevos procedimientos probióticos tales como las vacunas bucales.

EJEMPLO DE ENSAYO 3

Este Ejemplo sirve para demostrar la eficacia de las bacterias ácido-lácticas ONRIC para prevenir la infección de la gripe en el aparato respiratorio inferior.

Para investigar los efectos protectores de la infección por IgA de bacterias ácidolácticas ONRIC, se utilizaron ratones modelo infectados en el aparato respiratorio inferior en el que los virus de la gripe (IFV) alcanzaron el aparato respiratorio inferior, y se evaluaron los efectos protectores de la infección del aporte de la composición fermentada preparada utilizando Lactobacillus ONRIC b0240, utilizando el número de días de supervivencia después de la infección como índice. El ensayo se realizó de la manera siguiente.

(1) Animales experimentales

Se pusieron en cuarentena ratones hembra endogámicos SPF/VA/VAF de 5 semanas de vida (cepa: BALB/c AnNCrj) adquiridos en Charles River Japan Inc. en las condiciones mostradas a continuación durante 4 días y se dividieron en 3 grupos (un grupo con agua destilada, un grupo con leche y un grupo con leche fermentada que contenía Lactobacillus ONRIC b0240) de tal manera que el peso corporal medio de cada grupo era esencialmente el mismo.

Suministro de alimentos: Dieta sólida de MF (producto de Oriental Yeast Co., Ltd.)/

alimentación libre.

Suministro de agua: agua de grifo/alimentación a discreción de la botella;

temperatura ambiente, 23 ± 2ºC ; humedad, 60 ± 10%.

Horas de luz: periodo con luz, 7:00 a 19:00

periodo de oscuridad, 19:00 a 7:00

(2) Método de ensayo

Se administraron sustancias de ensayo ((1) agua destilada,(2) leche de vaca o (3) leche fermentada que contenía Lactobacillus ONRIC b0240) con la dieta sólida de MF (producto de Oriental Yeast Co.,Ltd.) a los ratones de cada grupo (n = 45) durante 2 semanas.

La leche de vacas del ensayo se preparó diluyendo leche LL (Oaso producto de Rakunou Mothers (Kumamoto Dairy Cooperative Association) al 75% con agua destilada. La leche fermentada del ensayo que contenía Lactobacillus ONRIC b0240 se preparó utilizando Lactobacillus ONRIC b0240 en suspensión en solución acuosa al 10% de leche desnatada y congelada por almacenamiento a -80ºC como iniciador. El iniciador (recuento de células viables: 108 ufc) se añadió a 1 litro de leche de vaca y se fermentó a 33ºC durante 16 horas para conseguir un contenido de células de 5 x 107 ufc/ml, que se diluyó al 75% con agua destilada.

Las sustancias de ensayo se alimentaron a discreción mediante una botella de suministro de agua. La ingesta de alimento se calculó a partir de la reducción del peso de las sustancias de ensayo comparando los pesos iniciales de las sustancias de ensayo con los de después de la alimentación.

Dos semanas después del comienzo de la ingesta, los ratones en cada grupo se anestesiaron con “Ketalar” (hidrocloruro de cetamina) y se infectaron con IFV administrando 50 µl de una solución de IFV en una concentración de 10, 102 o 103 ufp/ 50 µl de PBS/ratón (15 ratones cada uno) por una cavidad nasal para inoculación nasal. Se comprobó cada día la supervivencia o muerte de los ratones en cada grupo. Desde el momento de la infección hasta la confirmación de la muerte los ratones tenían libre acceso a las sustancias del ensayo.

La cepa de IFV: A/PR/8/34/H1N1 almacenada en el Instituto de Investigación de Microorganismos de Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. se utilizó como cepa de IFV. La cepa se puso en suspensión en MEM que contenía 0,1% de BSA y HEPES 10 mM y se diluyó con PBS(+) para conseguir un contenido vírico de 10 a 103 ufp/50 µl, proporcionando de este modo una solución vírica para la inoculación de IFV. Se preparó PBS(+) disolviendo 9,55 g de PBS (-) en polvo (producto de Kojin-Bio Co.), 100,00 mg de CaCl2 anhidro y 46,90 mg de MgCl2 anhidro en agua destilada para preparar un volumen de 1.000 ml.

Resultados

Se comprobó el número de días de supervivencia después de la inoculación nasal de IFV de los ratones en cada grupo por observación cada mañana (8:30-9:00) y tarde

(17:30 -18:00), es decir, dos veces al día.

Cuando se inoculaba el virus a una concentración de 102 ufp/ratón, todos los ratones en el grupo de referencia (grupo de administración de agua destilada) y del grupo comparativo (grupo de administración de leche) murieron el día 7. Cuando se inoculó el virus a una concentración de 103 ufp/ratón, todos los ratones en los dos grupos murieron en la tarde del día 6. En cambio, el grupo de administración de leche fermentada que contenía Lactobacillus ONRIC b0240 presentaba una tendencia a prolongar el periodo de supervivencia de los ratones más que el grupo de referencia.

Cuando el virus se inoculaba el virus a una concentración de 10 ufp/ratón, el 70% o más de los ratones todavía sobrevivieron en todos los grupos el día 14; sobreviviendo el 86,7% de los ratones en el grupo de administración con leche fermentada que contenía Lactobacillus ONRIC b0240, demostrando de este modo una tendencia a prolongar la tasa de supervivencia en comparación con la del (80%) del grupo de referencia.

Se midió el peso de los ratones en cada grupo utilizando una escala electrónica cada dos días desde el comienzo de la ingesta de las sustancias de ensayo hasta el día de la infección, y a continuación se midió cada mañana después (8:30-9:00). La medición se realizó en los ratones supervivientes en cada día de medición y la media de todas las mediciones en los ratones en el mismo grupo se presenta como valor obtenido.

En todos los grupos se observó una reducción de peso ligera desde el día 2. La tendencia al cambio de peso era similar entre todos los grupos y no se observaron diferencias sustanciales.

Consideración

A partir de los resultados de este ensayo y de los resultados del ensayo mostrados en los Ejemplos 1 y 2 del ensayo, se concluye que las bacterias ácido-lácticas ONRIC y la composición fermentada que contiene el mismo, tienen efectos protectores contra la infección por IFV.

La presente invención proporciona bebidas de fermentación a base de té y bebidas de té que contienen bacterias ácido-lácticas ONRIC capaces de estimular la inmunidad de las mucosas y de aumentar la producción de IgA. La ingesta de los mismos puede inhibir la invasión de organismos patógenos a través de la mucosa, proporcionando de este modo efectos protectores al hospedador.

EJEMPLO DE ENSAYO 4

Este ejemplo sirve para demostrar la eficacia de la inoculación con bacterias ácidolácticas ONRIC (células inviables) para impedir la infección de la gripe en el aparato respiratorio inferior.

(1) Sustancia de ensayo.

Se utilizaron Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) como sustancia de ensayo.

(2) Animales experimentales

Se pusieron en cuarentena ratones hembra BALB/c Sic (SFP) de 5 semanas de vida adquiridos en Japan SLC, Inc. en las condiciones mostradas a continuación durante 7 días y se dividieron en grupos.

Suministro de alimentos: Dieta sólida de CRF-1 (producto de Oriental Yeast Co., Ltd.)/ alimentación libre.

Suministro de agua: agua de grifo esterilizada en un autoclave a 123ºC hasta 124ºC durante 100 minutos/alimentación a discreción de la botella; temperatura ambiente, 23 ± 2ºC ; humedad, 55 ± 15%.

Ventilación: 15 veces/hora.

Horas de luz: periodo con luz, 8:00 a 20:00 periodo de oscuridad, 20:00 a 8:00

(3) Preparación de los virus

Se infectaron células MDCK (células renales de perro; cepa RCB0995) con el virus de la gripe A (IFVA: cepas PR8) liofilizado y conservado en un frigorífico a temperatura ultrabaja) a M.O.I. (multiplicidad de infección) de 0,01 en el medio de cultivo celular (10% de FBS que contiene MEM de Eagle (Gibco) y se cultivaron a 37ºC durante 72 horas en presencia de 5% de CO2 (atenuación 1). Las células cultivadas continuamente durante 5 atenuaciones se produjeron en masa, y se sometieron a centrifugación con gradiente de sacarosa para separar y purificar un líquido vírico. El líquido vírico se dividió en fracciones de 1 ml y se almacenó a -80ºC en un frigorífico a temperatura ultrabaja hasta el comienzo de los experimentos. Parte del líquido vírico se diluyó 10 veces para confirmar la degeneración celular, determinando de este modo el valor del virus (TCID50).

(4) Procedimiento de ensayo

(4-1) Grupos

Los ratones se dividieron en 6 grupos (4 grupos inoculados con virus y 2 grupos inoculados sin virus). La concentración de virus inoculado de los 4 grupos fue de 107,5 TCID50/ml. Se asignaron a cada grupo 10 ratones por grupo inoculados con virus de forma segura. Se dio a los ratones un número de identificación y se les asignó al azar. El número de ratones no inoculados con virus fue también de 10.

(4-2) Administración de sustancias de ensayo

Una vez terminadas la cuarentena y la inspección, se administraron por vía oral a la fuerza 0,2 ml de la sustancia de ensayo a cada ratón hembra BALB/c de 6 semanas de vida, que había sido alimentado previamente durante una semana, una vez al día todo el periodo de ensayo. Las concentraciones de las sustancias de ensayo se seleccionaron de modo que las cantidades de la sustancia de ensayo administrada fueron 500, 100 ó 20 mg/ml por kg de peso corporal. Se administró por separado solución salina fisiológica a las referencias negativas de la misma manera.

(4-3) Inoculación de IFVA

0,2 ml de hidrocloruro de cetamina diluido 20 veces (50 mg/ml fabricado por Sankyo Co., Ltd.) y 0,1 ml de droperidol diluído 20 veces (2,5 mg/ml fabricado por Sankyo Co., Ltd.) por cada 20 g de peso del animal se administraron por vía intramuscular a la pata trasera de cada ratón hembra BALB/c de 6 semanas de vida en el orden del número asignado a cada ratón. A los ratones se había administrado continuamente por vía oral la sustancia de ensayo o la solución salina fisiológica durante tres semanas. Después de la inyección, se sometió a los ratones a anestesia general. Bajo anestesia general, se inoculó por vía nasal 50 µl de IFVA preparado en el apartado (3) anterior a la cavidad

5 nasal derecha de cada ratón. Por separado, se inyectaron 50 µl de solución salina fisiológica a los grupos no inoculados con virus.

(4-4) Determinación de la tasa de supervivencia

10 Se comprobaron los ratones mediante observación durante 2 semanas después de la inoculación de IFVA. La tasa de supervivencia se determinó multiplicando por 100 el valor obtenido al dividir el número de animales supervivientes inoculados con IFVA por el número total de cada grupo.

15 (5) Aplicación estadística

La significación de la diferencia entre los grupos de referencia experimentales y

cada grupo administrado con la sustancia de ensayo se analizó por el ensayo de la H de

KrusKal-Wallis o el ensayo de la U de Mann-Whitney. El nivel de significación fue inferior

20 al 5%. La significación de la diferencia por supervivencia (periodo de tiempo) durante el periodo de observación se analizó por el ensayo de Fisher.

(6) Resultados

25 En la Tabla 5 se muestran los resultados.

Tabla 5

Dosis (cantidad) de Lactobacillus ONRIC b0240 (mg/kg de peso corporal): Número de ratones Tasa de supervivencia Duración de la supervivencia (días)

Grupos: 500 10 8/10 (80,0%) 13,1

inoculados con: 100 10 3/10 (30%) 9,2

IFVA: 20 10 0/10 (0,0%) 8,5

-(solución salina fisiológica): 10 0/10 (0,0%) 8,5

Grupos inoculados sin: 500 10 10/10 (100,0%) 14,0

IFVA: -(solución salina fisiológica) 10 10/10 (100,0%) 14,0

30 Para los animales infectados con virus, la tasa de supervivencia y la duración media de la supervivencia del grupo de administración de solución salina fisiológica fueron 0% y 8,5 días, respectivamente. En contraste, la tasa de supervivencia y la duración media de la supervivencia de los grupos administrados con la sustancia de ensayo, es decir, un grupo de administración de 500 mg/kg, un grupo de administración de 100 mg/kg y un

35 grupo de administración de 20 mg/kg fueron de 80,0% y 13,1 días, 30,0% y 9,2 días y 0% y 8,5 días, respectivamente. Para la duración de la supervivencia durante el periodo de observación tras la infección vírica y la tasa de supervivencia al final del periodo de observación, el grupo administrado con 500 mg/kg de la sustancia de ensayo presentaba un valor significativamente superior comparado con el grupo de referencia (P=0,0002 y P=0,0007, respectivamente). Para los animales que no habían sido infectados con virus, la tasa de supervivencia y la duración media de la supervivencia del grupo administrado con la sustancia de ensayo y del grupo no administrado con la sustancia de ensayo fueron ambos del 100% y de 14,0 días.

EJEMPLO DE ENSAYO 5

Este ensayo se realizó para demostrar el efecto de la administración continua de bacterias ácido-lácticas ONRIC (células inviables) sobre la cantidad de producción de IgA en la saliva humana.

Se sometieron al ensayo 20 hembras adultas, y se dividieron en dos grupos, es decir, un grupo administrado con agua (grupo de referencia) y un grupo administrado con Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) (2 x 109 UFC equivalentes/día) referido a la cantidad total de S-IgA en la saliva humana durante la detección sistemática.

Durante el ensayo, se administró agua o agua que contenía Lactobacillus ONRIC b0240 (recuento de células bacterianas: 2 x 109 UFC equivalentes, 200ml/día). Antes y después se administró la sustancia de ensayo, las cantidades totales de S-IgA en la saliva humana se midieron de la forma siguiente.

Se lavó la boca con agua destilada en un tiempo dado el día de la recogida de saliva. Cinco minutos después del lavado, se recogió saliva con salivettes durante un minuto y se pesó. Según la cantidad de secreción de saliva, esta etapa se repitió dos o tres veces. Durante la recogida, se midió con precisión el periodo de recogida con un cronómetro y se registró. La saliva obtenida se almacenó en frío a 4ºC hasta la centrifugación. La muestra se centrifugó a 2.500 rpm durante 10 minutos el mismo día, y se eliminó el precipitado. Cuando la cantidad de sobrenadante obtenido era pequeña, se realizaba otra centrifugación. El sobrenadante se recogió en un microtubo de 1,5 ml y se conservó en congelador a -30ºC hasta la medición. La medición se realizó utilizando una muestra diluida 2.000 veces con un líquido de bloqueo (gelatina de pez) (SIGMA, St. Louis, MO) 1 g/50 ml en PBS incluyendo 0,05% de monolaurato de polioxietileno sorbitán (equivalente a Tween 20, Nakalai Tesque Inc., Kyoto). La concentración de IgA se determinó por ELISA (anticuerpo preliminar: IgA anti-humana de conejo (DAKO, Dinamarca), anticuerpo secundario: IgA anti-humana de conejo marcada con HRP (DAKO), anticuerpo estándar: IgA SECRETORA HUMANA PURIFICADA (Cappel, Aurora, OH). La cantidad total de S-IgA se calculó multiplicando la cantidad de secreción de saliva por minuto por la concentración de S-IgA.

La cantidad de S-IgA total en el aumento de saliva durante el ensayo se obtuvo sustrayendo la cantidad total de IgA en la saliva antes de administrar con la sustancia de ensayo a partir de la cantidad total de S-IgA en la saliva el día 21º después de la administración de la sustancia de ensayo. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 3. Para la cantidad de S-IgA total en el aumento de saliva durante el ensayo, el grupo (52,21 ± 24,41 µg) administrado con Lactobacillus ONRIC b0240 (células inviables) (2 x 109 ufc equivalente/día) presentaban un valor significativamente mayor en comparación con el grupo (-21,81 ± 28,33 µg) administrado con agua. La diferencia fue estadísticamente significativa (p=0,0001).

Claims

Reivindicaciones

1.

Bebida de fermentación a base de té que comprende un líquido de fermentación a base de té con por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065).
2.

Bebida de fermentación a base de té según la reivindicación 1, que contiene además un extracto de té.
3.

Bebida de fermentación a base de té según la reivindicación 1, en la que la bacteria ácido-láctica está contenida en una cantidad eficaz para estimular la inmunidad de las mucosas.
4.

Bebida de fermentación a base de té según la reivindicación 1, en la que la bacteria ácido-láctica está contenida en una cantidad eficaz para aumentar la producción de IgA.
5.

Bebida de fermentación a base de té según la reivindicación 1, en la que el contenido de bacterias ácido-lácticas es de 104 ufc/ml a 108 ufc/ml.
6.

Bebida de fermentación a base de té según la reivindicación 1, en la que el contenido de bacterias ácido-lácticas es de 105 ufc/ml a 107 ufc/ml.
7.

Bebida de té que comprende por lo menos una especie de bacteria del ácido láctico seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065) y un extracto de té.
8.

Bebida de té según la reivindicación 7, en la que la bacteria ácido-láctica está contenida en una cantidad eficaz para estimular la inmunidad de las mucosas.
9.

Bebida de té según la reivindicación 7, en la que la bacteria ácido-láctica está contenida en una cantidad eficaz para aumentar la producción de IgA.
10.

Bebida de té según la reivindicación 7, en la que el contenido de bacterias ácido-lácticas es de 104 ufc/ml a 108 ufc/ml.
11. Bebida de té según la reivindicación 7, en la que el contenido de bacterias

ácido-lácticas es de 105 ufc/ml a 107 ufc/ml.
12.

Procedimiento para producir la bebida de fermentación a base de té según la reivindicación 1, que comprende la etapa que consiste en cultivar, en un medio que contiene té, por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065).
13.

Procedimiento según la reivindicación 12, que comprende además la etapa que consiste en ajustar el contenido en bacterias ácido-lácticas de la bebida de fermentación a base de té entre 104 ufc/ml y 108 ufc/ml.
14.

Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el medio que contiene té es un extracto de té que puede contener un componente o componentes opcionales y presenta un Brix procedente del té de 0,10 a 0,50, y en el que el cultivo se realiza a de 25ºC a 50ºC durante 12 horas a 32 horas.
15.

Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el medio que contiene té es un extracto de té que puede contener un componente o componentes opcionales y presenta un Brix procedente del té de 0,18 a 0,30, y en el que el cultivo se realiza a de 30ºC a 40ºC durante 15 horas a 20 horas.
16.

Procedimiento para producir la bebida de fermentación a base de té según la reivindicación 2, que comprende las etapas siguientes:

(1)

cultivar, en un medio que contiene té, por lo menos una especie de bacteria de ácido láctico seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065), para obtener un líquido de fermentación a base de té; y

(2)

añadir un extracto de té al líquido de fermentación a base de té obtenido en la etapa (1).
17.

Procedimiento según la reivindicación 16, en el que, en la etapa (2), el extracto de té se añade al líquido de fermentación a base de té de modo que la bebida de fermentación a base de té final presenta un Brix procedente del té de 0,10 a 0,50 y un contenido en bacterias ácido-lácticas de 104 ufc/ml a 108 ufc/ml.
18.

Procedimiento para producir la bebida de té según la reivindicación 7, que comprende la etapa de mezclado de por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065), con un extracto de té.
19.

Procedimiento según la reivindicación 18, en el que el extracto de té se mezcla con las bacterias ácido-lácticas de modo que la bebida de té final presenta un Brix procedente del té de 0,10 a 0,50 y un contenido en bacterias ácido-lácticas de 104 ufc/ml a 108 ufc/ml.
20.

Utilización de por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065), para la producción de una bebida de fermentación a base de té con actividad estimulante de la inmunidad de las mucosas.
21.

Utilización de por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065), para la producción de una bebida de fermentación a base de té con actividad de aumento de la producción de IgA.
22.

Utilización de por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065), para la producción de una bebida de té con actividad estimulante de la inmunidad de las mucosas.
23.

Utilización de por lo menos una especie de bacteria ácido-láctica seleccionada de entre el grupo constituido por Lactobacillus ONRIC b0239 (FERM BP-10064) y Lactobacillus ONRIC b0240 (FERM BP-10065), para la producción de una bebida de té con actividad de aumento de la producción de IgA.