ES2348203T3

ES2348203T3 - Eritrovirus y sus aplicaciones.

Info

Publication number: ES2348203T3
Application number: ES98958322T
Authority: ES
Inventors: Antoine Garbarg-Chenon; Quang Tri Nguyen; Veronique Auguste
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-03
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2018-12-03
Also published as: CA2311297A1; WO1999028439A3; US7291452B1; CA2311297C; ATE469169T1; US20080248528A1; JP2001525163A; FR2771751B1; AU1440399A; PT1037916E; EP1037916B1; WO1999028439A2; DE69841687D1; EP1037916A2; AU757453B2; JP4831864B2; DK1037916T3; FR2771751A1; US8105610B2

Abstract

Un eritrovirus variante en relación al eritrovirus de tipo B19, denominado eritrovirus de tipo V9, caracterizado por que presenta una divergencia genética < o igual al 6% con la secuencia SEC ID Nº:1, y por que su genoma se hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una de las secuencias SEC ID Nº:45 a 80, 108 y 110 y por que dicho eritrovirus V9 no puede reconocerse molecularmente como un genoma del eritrovirus B19, ya que presenta una divergencia genética superior o igual al 10% sobre el conjunto del genoma en comparación con las secuencias del eritrovirus B19.

Description

La presente invención se refiere a secuencias nucleicas procedentes de un eritrovirus humano, a sus fragmentos así como a sus aplicaciones, como reactivo de diagnóstico y como agente inmunógeno.

Los estudios seroepidemiológicos muestran que la infección por parvovirus B19, recientemente renombrado eritrovirus B19, se ha extendido común y ampliamente en todo el mundo.

En Europa, la seroprevalencia para el eritrovirus B19 es aproximadamente del 10% en sujetos menores de 5 años, aproximadamente del 50% en los sujetos de más de 20 años y superior al 90% en las personas mayores.

La tasa elevada de seroprevalencia sugiere que el eritrovirus B19 es muy contagioso. Durante las epidemias, la tasa de transmisión a sujetos en estrecho contacto es del 10 al 60%, siendo principalmente por aire la vía de transmisión (secreciones respiratorias).

El eritrovirus B19 es un virus específicamente humano. La infección aguda conlleva frecuentemente a una erupción cutánea maculo-papulosa benigna en niños (megaleritema epidérmico o 5ª enfermedad). Las artralgias pueden venir acompañadas de erupción y excepcionalmente volverse crónicas.

En los pacientes ya portadores de una anemia hemolítica crónica (drepanocitosis, talasemia, déficit en piruvato quinasa…), habitualmente se produce una crisis eritroblástica aguda transitoria que ocasiona una anemia aguda arregenerativa transitoria.

La infección primaria aguda por el eritrovirus B19 es particularmente peligrosa en gestantes con un riesgo de transmisión al feto calculado del 30%. El riesgo de mortalidad fetal se calcula entre el 5 y el 9% por anemia, insuficiencia hepática, insuficiencia cardiaca y anasarca feto placentaria.

Las infecciones crónicas del eritrovirus B19 se encuentran esencialmente en los sujetos inmunodeprimidos (leucemia mieloide crónica, déficit inmunitario humoral y celular, injertos de órgano o de médula, enfermedades del SIDA).

En pacientes VIH-1 seropositivos, la infección crónica por eritrovirus B19 es responsable de la anemia crónica, pero también puede actuar sobre los otros linajes (neutropenia y sobre todo trombopenia). La ausencia de suficiente respuesta inmunitaria humoral en estos pacientes permite la instalación de una eritroviremia crónica y explica a la vez la eritroblastopenia crónica y la ausencia de otros síntomas tales como la erupción o las artralgias.

El eritrovirus B19 es un virus de ADN genómico unicatenario de aproximadamente 5,4 kbases; es el único eritrovirus catalogado hasta ahora; todas las fuentes que se han secuenciado y que han sido objeto de una publicación en los bancos de secuencias (GenBank o EMBL) presentan una escasa variabilidad genética, (98% de similitud de secuencia de nucleótidos sobre el conjunto del genoma y el 96% de similitud sobre la región VP1) (R.O. SHADE, J. Virol., 1986, 58, 3, 921-936, B19-AU).

El diagnóstico virológico de infecciones por eritrovirus B19 se basa esencialmente en la detección del genoma viral, en la medida en la que el cultivo no puede realizarse de manera rutinaria.

Para las infecciones agudas, por eritrovirus B19 (infecciones primarias), esta detección puede realizarse por amplificación génica (PCR), pero también por hibridación (transferencia puntual), teniendo en cuenta el título viral, habitualmente muy elevado durante las infecciones primarias (hasta 1014 ml en suero); sin embargo, el título viral es mucho más bajo durante infecciones crónicas y sólo es factible un método de detección por amplificación génica.

Estas técnicas de detección dependen de la variabilidad genética del virus investigado; de los reactivos, preparados a partir de secuencias conocidas del eritrovirus B19, que no permiten detectar las infecciones por eritrovirus que varían, ni por amplificación génica, ni por serodiagnóstico B19.

De hecho, los ensayos serodiagnósticos existentes son específicos del eritrovirus B19 (Solicitud Internacional PCT WO 91/12269; Solicitud Internacional PCT WO 96/09391 (IDEIA Parvovirus B19 IgG et IgM, DAKO; Parvovirus B19 IgG et IgM Enzyme Inmunoassay, BIOTRIN)).

Como consecuencia, las técnicas de detección indicadas anteriormente corren el riesgo de producir resultados negativos tanto a nivel nucleico como en lo que concierne a la respuesta de anticuerpos.

La puesta de manifiesto y la consideración de nuevas variantes son importantes para desarrollar:

-: reactivos de detección y de diagnóstico de infecciones por eritrovirus en seres humanos (serodiagnóstico, PCR, hibridación), suficientemente sensibles y específicos, es decir que no conducen a resultados falsos negativos o falsos positivos,

-: composiciones adecuadas para proteger frente a todas las infecciones por eritrovirus (vacunas) y

-: composiciones adecuadas para tratar una infección por eritrovirus variante (sueroterapia, anticuerpos monoclonales).

Los inventores han tenido por objeto proporcionar las secuencias procedentes del eritrovirus, adecuadas para permitir la detección de un eritrovirus variante (denominado eritrovirus de tipo V9), es decir genéticamente alejado del eritrovirus B19.

La presente invención tiene por objeto un eritrovirus variante con respecto al eritrovirus de tipo B19, denominado eritrovirus de tipo V9, caracterizado por que presenta una divergencia genética < o igual al 6% con la secuencia SEC ID Nº:1, y por que su genoma se hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una de las secuencias SEC ID Nº:45 a 80, 108 y 110 y por que dicho eritrovirus V9 no puede reconocerse molecularmente como un genoma de eritrovirus B19, ya que presenta una divergencia genética superior o igual al 10% sobre el conjunto del genoma con respecto a las secuencias del eritrovirus B19.

El genoma viral de dicho eritrovirus V9 está considerado como genéticamente alejado del eritrovirus B19.

La presente invención también tiene por objeto un polinucleótido, caracterizado por que se selecciona del grupo constituido por:

a) el genoma del eritrovirus del tipo V9 tal como se define anteriormente, cuyo genoma presenta una secuencia seleccionada del grupo constituido por:

-: las secuencias que presentan una divergencia genética  al 10% sobre el conjunto del genoma con respecto a las secuencias del eritrovirus B19 y que presentan una divergencia genética inferior o igual al 6% con respecto a la SEC ID Nº:1, y

-: las secuencias que pueden hibridarse en condiciones rigurosas con una de las secuencias SEC ID Nº:45 a 80, 108 y 110, y

b) el polinucleótido de secuencia SEC ID Nº:1 que representa el 95% del genoma del eritrovirus V9 tal como se define anteriormente, incluyendo todas las secuencias codificantes.

Se entiende por condiciones rigurosas, en el sentido de la presente invención, las

siguientes condiciones:  hibridación durante 3 a 24 h en un tampón 1XSSC que contiene el 50% de formamida, a 42ºC y

 3 lavados de 15 min. en un tampón 2XSSC, a 60ºC. La secuencia SEC ID Nº:1, que corresponde aproximadamente al 90% del genoma de un eritrovirus de tipo V9 y que incluye todas las secuencias codificantes, presenta un mapa de restricción diferente al de los eritrovirus B19, particularmente en lo que concierne a los sitios BamHI (cualquier sitio), HindIII (un sólo sitio) y PvuII (cinco sitios). De manera más precisa, la secuencia SEC ID Nº:1 presenta un perfil de restricción diferente al del eritrovirus B19, particularmente por los sitios de restricción siguientes: Acc I, Afl III, Alw I, AlwN I, Apa I, Ava I, Ava II, Avr II, BamH I, Ban I, Ban II, BbeI, Bbs I, BceF I, Bcg I, Bcn I, Bgl II, Bsg I, BsiE I, Bsm I, BsmA I, Bsp 120 I, BspH I, BspM I, BsrF I, Bst1107 I, BstE II, BstU I, Bstu36 I, Dnp I, Dra II, Dsa I, Eae I, Eag I, Ear I, Ecl136 I, EcoN I, Eco 109 I, EcoRI, Ehe I, Fok I, Hae I, Hae III, Hga I, HgiA I,Hha I, Hinc II, Hind III, hinP I, Hpa I Kas I, Mae II, Mbo I, Mcr I, Msc I, Mun I, Nar I Nci I, Nco I, Nsi I, NspI, Nsp7524 I, NspB II, NspC I, PflM I, Pme I, Ppu10 I, PpuM I, Pst I, Pvu II, Sac I, Sau3A I, Sca I, SfaN I, Sfc I, Sma I, Spe I, Sph I, Ssp I, Stu I, Sty I Swa I Tth11 I, Xba I, Xma I y sus isoesquizómeros, de acuerdo con las figuras 7.1 a 7.3.

La presente invención también tiene por objeto un fragmento de la secuencia SEC ID Nº:1, tal como se define anteriormente, caracterizado por que representa una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de dicho eritrovirus V9, seleccionada del grupo constituido por las secuencias:

-SEC ID Nº:81 correspondiente a las posiciones 328-2340 de la SEC ID Nº:1, que codifica la proteína NS1,

-: SEC ID Nº:83 que corresponde a las posiciones 1796-2017 de la SEC ID Nº:1, que codifica la proteína de 7,5 kDa,

-: SEC ID Nº:85 que corresponde a las posiciones 2336-4678 de la SEC ID Nº:1, que codifica la proteína VP1,

-: SEC ID Nº:87 que corresponde a las posiciones 2336-3016 de la SEC ID Nº:1, que codifica la proteína VP1u,

-: SEC ID Nº:89 que corresponde a las posiciones 2523-2828 de la SEC ID Nº:1, que codifica la proteína X,

-: SEC ID Nº:91 que corresponde a las posiciones 3017-4678-de la SEC ID Nº:1, que codifica la proteína VP2 y

-: SEC ID Nº:93 que corresponde a las posiciones 4488-4883 de la SEC ID Nº:1, que codifica la proteína de 11 kDa. De acuerdo con un modo de realización ventajoso de dicho fragmento, éste se selecciona del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 y Nº:110, sus secuencias complementarias, las secuencias de al menos 17 nucleótidos, procedentes de estas secuencias y las secuencias que comprenden dichas secuencias y por que es adecuado para servir de sonda o de cebador en la identificación específica de un eritrovirus de tipo V9 o de un eritrovirus afín.

De acuerdo con otro modo de realización ventajoso de dicho fragmento, éste se selecciona del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:2 a 44, 105 a 107, 109 y 111 a 121 y las secuencias complementarias de las secuencias anteriores y es adecuado para servir de sonda o cebador para el diagnóstico diferencial de eritrovirus.

La secuencias SEC ID Nº: 105 a 121 también se denominan respectivamente como se indica a continuación: SEC ID Nº : 105 (E1905f), 106 (E1987r), 107 (E2076f), 108 (E2151r), 109 (E2406r), 110 (E2149rs), 111 (E2717f), 112 (E2901r), 113 (e1855f), 114 (e2960r), 115 (e1863f), 116 (e2953), 117 (e2435fStul/BgIII), 118 (e4813rEcoRI), 119 (e3115fBamHI), 120 (e4813rBamHI) y 121 (e1954fp). Las secuencias complementarias de las secuencias anteriores, los fragmentos procedentes de las secuencias anteriores de al menos 17 nucleótidos o sus secuencias complementarias también se incluyen en la presente solicitud.

En el sentido de la presente invención, se entiende por secuencia nucleica o secuencia nucleotídica (secuencia de ADN o de ARN) una de las secuencias, tales como las definidas anteriormente y sus secuencias complementarias (secuencias anti-sentido) así como las secuencias que comprenden una o más de dichas secuencias o fragmentos de estas.

La invención también incluye fragmentos nucleotídicos complementarios de los anteriores así como fragmentos modificados con respecto a los anteriores, por eliminación o adición de nucleótidos en una proporción de aproximadamente el 15%, con respecto a la longitud de los fragmentos anteriores y/o modificados al nivel de la naturaleza de los nucleótidos, ya que los fragmentos nucleotídicos modificados conservan una capacidad de hibridación con la secuencia de AND o de ARN del eritrovirus V9, análoga a la que presentan los fragmentos correspondientes no modificados.

Algunos de estos fragmentos son específicos y se utilizan como sonda o cebador; se hibridan específicamente con un eritrovirus V9 o con un eritrovirus afín; se entiende por virus afín al eritrovirus V9, un eritrovirus que presenta una divergencia genética < o igual al 6%; estos fragmentos se seleccionan del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:45-80 y Nº:108 y 110, o sus secuencias complementarias, las secuencias procedentes de esas secuencias de al menos 17 nucleótidos y las secuencias que comprenden dichas secuencias y encuentran aplicación en la identificación específica de un eritrovirus V9 o de un eritrovirus afín.

Otros de estos fragmentos se utilizan como cebadores, para la amplificación de secuencias procedentes de un eritrovirus de tipo V9 o afín, tal como la secuencia SEC ID Nº:1; estos cebadores se seleccionan del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:2-44, las secuencias SEC ID Nº:105-109 y 111-121 o sus secuencias complementarias y las secuencias, de al menos 17 nucleótidos, procedentes de dichas secuencias.

Cuando se trata de cebadores, dichos fragmentos también incluyen las secuencias antisentido.

Dichas secuencias encuentran su aplicación para la identificación diferencial de eritrovirus (eritrovirus B19 y eritrovirus V9), asociadas con sondas tales como se definen anteriormente y/o enzimas de restricción convenientes.

Dichos cebadores comprenden preferentemente entre 17 y 30 nucleótidos; los cebadores preferidos son los siguientes: las secuencias SEC ID Nº:105 (posiciones 1797-1815 de la secuencia SEC ID Nº:1); que corresponde a un fragmento de la secuencia SEC ID Nº:10, la secuencia SEC ID Nº:16 (posiciones 1899-1879 de la secuencia SEC ID Nº:1), que corresponde a un fragmento de la secuencia antisentido de la secuencia SEC ID Nº:11, la secuencia SEC ID Nº:107 (posiciones 1968-1987 de la secuencia SEC ID Nº:1), que corresponde a un fragmento de la secuencia SEC ID Nº:13, la secuencia SEC ID Nº:108 (posiciones 2061-2043 de la secuencia SEC ID Nº:1), que corresponde a un fragmento de la secuencia antisentido de la secuencia SEC ID Nº:58, la secuencia SEC ID Nº:109 (posiciones 2317-2298 de la secuencia SEC ID Nº:1) que corresponde a un fragmento de la secuencia antisentido de la secuencia antisentido de la secuencia SEC ID Nº:16, la secuencia SEC ID Nº:111 (posiciones 2609-2627 de la secuencia SEC ID Nº:1), que corresponde a un fragmento de la secuencia SEC ID Nº: 19 y la secuencia

SEC ID Nº:112 (posiciones 2812-2793 de la secuencia SEC ID Nº:1), que corresponde a un fragmento de la secuencia antisentido de la secuencia SEC ID Nº:23.

Los pares de cebadores preferidos son los siguientes:

-: par A: cebadores SEC ID Nº:111 y SEC ID Nº:112;

-: par B: cebadores SEC ID Nº:105 y SEC ID Nº:106;

-: par C: una de las secuencias SEC ID Nº:2-44, 105, 106, 107, 109, 111 ó 102 y una de las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 ó 110;

-: par D: cebador SEC ID Nº:107 y cebador SEC ID Nº:109;

-: par E: dos cebadores seleccionados entre las secuencias SEC ID Nº:2-44, 105, 106, 107, 109, 111 ó 112;

- par F: dos cebadores seleccionados entre las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 ó 110. Estos diferentes cebadores pueden utilizarse, de acuerdo con el fragmento amplificado, como cebador sentido o como cebador antisentido. La presente invención también tiene por objeto sondas, caracterizadas por que se seleccionan del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108, 110 y 121. La presente invención también tiene por objeto un plásmido, caracterizado por que comprende un polinucleótido tal como se define anteriormente o un fragmento de la secuencia SEC ID Nº:1 tal como se define anteriormente. De acuerdo con un modo de realización ventajoso de dicho plásmido, este incluye la secuencia SEC ID Nº:1 (PCD. V9. C22). La presente invención también tiene por objeto la utilización de una molécula de ácidos nucleicos seleccionada entre las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 y 110, sus secuencias complementarias, las secuencias de al menos 17 nucleótidos, procedentes de estas secuencias, eventualmente marcadas con un marcador apropiado, para la preparación de un reactivo de diagnóstico para la detección diferencial de eritrovirus de tipo V9. Entre los marcadores apropiados, pueden citarse, isótopos radiactivos, enzimas, fluorocromos, marcadores químicos (biotina…), haptenos (digoxigenina…) y los anticuerpos o análogos de bases apropiadas. La presente invención también tiene por objeto un procedimiento de

diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, por hibridación y/o amplificación génica, realizado a partir de una muestra biológica, que procede y se caracteriza por que comprende:

(1): una etapa en la que se pone en contacto una muestra biológica a analizar con al menos una sonda de la secuencia SEC ID Nº:45-80, 108 ó 110 y

(2): una etapa en la que se detecta por cualquier medio apropiado el o los productos resultantes de la interacción de la secuencia de nucleótidos del eritrovirus-sonda.

De manera preferida, la hibridación comprende una pre-hibridación, que se realizada en un tampón que comprende 50-60% de formamida; 1-5X SSC; 2% de reactivo de bloqueo (Blocking buffer, Boehringer Mannheim, Meylan, Francia); 0,1% de N-lauril sarcosina; 0,01-5% de SDS a 40-70ºC durante 90 min, después se realiza la hibridación en un tampón de 3 ml de la misma composición con 10 l de sonda marcada a 40-70ºC durante 1-30 horas.

De acuerdo con dicho procedimiento, puede comprender, previo a la etapa (1):

 una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica, y  al menos un ciclo de amplificación génica

La etapa de amplificación génica se realiza particularmente usando una de las técnicas de amplificación génica siguientes: amplificación por la Q-replicasa (I. Haruna et al., Proc. Nat. Acad. Sci. Estados Unidos, 1965, 54, 579-587), PCR (reacción de polimerización en cadena) (R.K. Saiki et al., 1986, Nature, 324:163-6), LCR (ligase chain reaction (reacción en cadena de ligasa)). (F. Barany, Proc. Nat. Acad. Sci. Estados Unidos, 1991, 88, 189-193), ERA (end-run amplification (amplificación de proceso final)) (C. Adams et al, 1994, Novel amplification technologies for DNA/RNA-based diagnostics meeting, San Francisco, CA, Estados Unidos), CPR (cycling probe reaction (reacción de sondas cíclicas)) (P. Duck et al., Biotechniques, 1990, 9, 142-147) o SDA (strand displacement amplification (amplificación por desplazamiento de hebra)) (GT. Walker, 1994, SDA: novel amplification technologies for DNA/RNA-based diagnostics meeting, San Francisco, CA, Estados Unidos).

De acuerdo con un modo de realización ventajoso de dicho procedimiento, los ciclos de amplificación se realizan usando un par de cebadores seleccionado del grupo constituido por:

-: el par A: cebadores SEC ID Nº:11 y SEC ID Nº:112;

-: el par B: cebadores SEC ID Nº:105 y SEC ID Nº:106;

-: el par C: una de las secuencias SEC ID Nº:2-44, 105, 106, 107, 109, 111 ó 112 y una de las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 ó 110;

-: el par D: cebador SEC ID Nº:107 y cebador SEC ID Nº:109;

-: el par E: dos cebadores seleccionados entre las secuencias SEC ID Nº:2-44, 105, 106, 107, 109, 111 ó 112; y

- el par F: dos cebadores seleccionados entre las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 ó 110. Cuando se utiliza el par A, el producto de amplificación se explora ventajosamente por acción de la enzima de restricción Apa I (GGGCCC): el producto de amplificación de un genoma B19 se escinde por Apa I (generando dos fragmentos de 149 y 55 pares de bases (pb)) mientras que el producto de amplificación de un genoma V9 no se

selecciona por Apa I (un fragmento de 204 pb); una electroforesis sobre gel de agarosa o de acrilamida permite distinguir estos fragmentos de restricción.

Cuando se utiliza el par B, el producto de amplificación se explora ventajosamente por acción de una de las siguientes enzimas de restricción: BgIII (AGATCT) o MunI (CAATTG); de esta manera se obtienen diferentes fragmentos según se trate de un eritrovirus V9 o B19; un fragmento que comprende un sitio de restricción BgIII es específico del eritrovirus V9 variante tal como se define anteriormente, mientras que los eritrovirus B19 comprenden en esta zona, un sitio MunI. El producto de amplificación de un genoma B19 se escinde por MunI (generando 2 fragmentos de 36 y 67 pb) y no se escinde por BgIII (un fragmento de 103 pb) mientras que el producto de amplificación de un genoma V9 se escinde por BgIII (2 fragmentos de 19 y 84 pb) y no se escinde por MunI (un fragmento de 103 pb); una electroforesis sobre gel de agarosa o de acrilamida permite distinguir estos diferentes fragmentos de restricción.

Cuando se utiliza el par C (un cebador que puede hibridarse con todos los eritrovirus y un cebador que puede hibridarse de manera específica con el eritrovirus V9) o el par F (dos cebadores que pueden hibridarse de manera específica con el eritrovirus V9), el genoma V9 se amplifica mientras que no hay amplificación específica con el genoma B19.

Cuando se utiliza el par D, el producto de amplificación se explora ventajosamente por hibridación con una sonda específica marcada del eritrovirus V9, seleccionada entre las secuencias SEC ID Nº:58-60 y 110, preferentemente por hibridación con la sonda de secuencia SEC ID Nº:110; el producto de amplificación de un genoma V9 se hibrida de manera específica con estas sondas y particularmente la sonda de la secuencia SEC ID Nº:110, mientras que el producto de amplificación de un genoma B19 no se hibrida con las sondas citadas anteriormente.

Cuando se utiliza el par E, el producto de amplificación se explora mediante cualquier procedimiento de hibridación con una sonda específica del eritrovirus V9 seleccionada entre las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 y 110; en este caso, el producto de amplificación de un genoma V9 se hibrida con la sonda, pero no el producto de amplificación de un genoma B19.

La invención tiene además por objeto un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado a partir de una muestra biológica, cuyo procedimiento se caracteriza por que comprende:

 una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus,

eventualmente presente en la muestra biológica,  al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores B tal como se ha definido anteriormente y

 la detección del producto amplificado en parte por hibridación con la sonda de la secuencia SEC ID Nº:121 y en parte por la acción de la enzima de restricción MunI.

La invención también tiene por objeto un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado a partir de una muestra biológica, cuyo procedimiento se caracteriza por que comprende:

eventualmente presente en la muestra biológica,  al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores A tal como se ha definido anteriormente y  la detección del producto amplificado por acción de la enzima ApaI.

La invención también tiene por objeto un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado a partir de una muestra biológica, cuyo procedimiento se caracteriza por que comprende:  una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus,

eventualmente presente en la muestra biológica,

 al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores C tal como se ha definido anteriormente y  la detección de producto amplificado.

La invención además tiene por objeto un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado a partir de una muestra biológica, cuyo procedimiento se caracteriza por que comprende:

eventualmente presente en la muestra biológica,  al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores D tal como se ha definido anteriormente y

 la detección del producto amplificado por hibridación con una sonda cuya secuencia se selecciona del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:58-60 y 110.

eventualmente presente en la muestra biológica,  al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores E tal como se ha definido anteriormente y

 la detección del producto amplificado por hibridación con una sonda cuya secuencia se selecciona del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 y 110.

eventualmente presente en la muestra biológica,  al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores F tal como se ha definido anteriormente y

 la detección del producto amplificado.

La invención también tiene por objeto el uso de las secuencias descritas anteriormente, para realizar un proceso de hibridación o de amplificación génica de secuencias nucleicas de eritrovirus, para el diagnóstico in vitro de la posible infección de un individuo por un eritrovirus.

La presente invención también tiene por objeto un proceso de exploración y de tipificación de un eritrovirus V9 o afín, caracterizado por que comprende poner en contacto una sonda seleccionada del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 y 110, sus secuencias complementarias, las secuencias de al menos 17 nucleótidos, procedentes de estas secuencias y las secuencias que comprenden dichas secuencias, eventualmente marcada con el ácido nucleico del virus a tipificar y la detección del híbrido, ácido nucleico-sonda, obtenido.

La presente invención presenta una proteína, caracterizada por que está codificada por un polinucleótido de acuerdo con la invención o bien un fragmento de la secuencia SEC ID Nº:1 de acuerdo con la invención.

Dicha proteína, presenta una secuencia seleccionada del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:82, 86, 88 y 92.

La presente descripción también presenta un péptido, caracterizado porque representa un fragmento de una proteína tal como se ha definido anteriormente, seleccionada del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:95 a 104.

Por péptido se entiende, en lo sucesivo en este documento, tanto las proteínas como los péptidos, tales como se han definido anteriormente.

Dichos péptidos son particularmente adecuados para que los anticuerpos inducidos por un eritrovirus V9 los reconozcan y/o para inducir la producción de anticuerpos anti-eritrovirus V9.

Dichos péptidos se seleccionan particularmente entre las secuencias SEC ID Nº:82 (proteína NS1), SEC ID Nº:86 (proteína VP1), SEC ID Nº:88 (proteína VP1 única), SEC ID Nº:92 (proteína VP2) y SEC ID Nº:95-104, es decir, fragmentos de la proteína VP1 [péptido VP1a (SEC ID Nº:95); péptido VP1b (SEC ID Nº:96), péptido VP1c (SEC ID Nº:97), péptido VP1d (SEC ID Nº:98); péptido VP1e (SEC ID Nº:99) y péptido VP1f (SEC ID Nº:100)] o fragmentos de la proteína VP2 [péptido VP2a (SEC ID Nº:101); péptido VP2b (SEC ID Nº:102); péptido VP2c (SEC ID Nº:103); péptido VP2d (SEC ID Nº:104)] así como los péptidos derivados que comprenden de 7 a 50 aminoácidos.

La presente descripción también tiene composiciones inmunógenas que comprenden una o más proteínas tales como se las definidas anteriormente.

La descripción también presenta anticuerpos, caracterizados por que reconocen, entre las proteínas del eritrovirus, únicamente la (o las) del eritrovirus variante, tal como se ha definido anteriormente.

La presente descripción también presenta un procedimiento de detección inmunológico de una infección por eritrovirus V9, realizado a partir de una muestra biológica, caracterizado por que comprende:

-: para la detección de anticuerpos anti-eritrovirus V9, la puesta en contacto una muestra biológica con una proteína o un péptido de acuerdo con la invención (serodiagnóstico),

-: para la detección de proteínas virales de eritrovirus V9, la puesta en contacto de una muestra

biológica, con un anticuerpo de acuerdo con la invención; revelándose la lectura del resultado por un medio apropiado, particularmente EIA, ELISA, RIA, fluorescencia.

A modo de ilustración, tal método de diagnóstico in vitro de acuerdo con la invención comprende la puesta en contacto una muestra biológica extraída de un paciente, con anticuerpos o péptidos de acuerdo con la invención, y la detección usando cualquier procedimiento apropiado, particularmente usando anti-inmunoglobulinas marcadas, complejos inmunológicos formados entre los antígenos o los anticuerpos de eritrovirus eventualmente presentes en la muestra biológica y dichos anticuerpos o dichos péptidos, respectivamente.

Los reactivos de acuerdo con la invención son particularmente útiles para la detección de eritrovirus V9 y afines en gestantes, en pacientes VIH positivos que presentan una anemia y/o una trombopenia crónica, injertos de órgano o de médula y pacientes que presenten una anemia aguda central y cuyos ensayos de detección del eritrovirus B19 son negativos.

La invención también tiene por objeto un kit de diagnóstico de eritrovirus, caracterizado por que incluye al menos un par de cebadores de acuerdo con la invención y/o una sonda de acuerdo con la invención.

Además de las disposiciones anteriores, la invención también comprende otras disposiciones, que surgirán de la siguiente descripción, que se refiere a ejemplos de realización del procedimiento objeto de la presente invención así como a los dibujos adjuntos, en los que:

-: las figuras 1, 2 y 3 ilustran los árboles filogenéticos del eritrovirus V9: figura 1: árbol filogenético de la secuencia completa del eritrovirus; figura 2: árbol filogenético de los genes NS1 del eritrovirus; figura 3: árbol filogenético de los genes VP1 del eritrovirus;

-: las figuras 4, 5 y 6 representan las distancias genéticas de las secuencias completas del eritrovirus (figura 4), de los genes NS1 (figura 5) y genes VP1 (figura 6) de eritrovirus.

- la figura 7 ilustra el mapa de restricción de la secuencia ID Nº:1. Sin embargo, debe entenderse bien, que estos ejemplos se proporcionan

únicamente como ilustración del objeto de la invención, ya que no constituyen de ninguna manera una limitación.

EJEMPLO 1: Obtención de secuencias de acuerdo con la invención.

Se clonó un fragmento de restricción Aat II/ Aat II de 5028 pb, que representa casi la totalidad (95%) del genoma de la variante V9, en el vector de secuenciación pcDNA 2.1 (Invitrogen, Noruega) de la siguiente manera.

El ADN viral monocatenario se extrajo del suero de un paciente que presentaba una crisis eritoblastopénica aguda usando una columna del kit QIAamp Blood (Qiagen S.A., Francia). Mediante una etapa de hibridación en un tampón de NaCl 50 mM a 56ºC durante 16 horas, el ADN viral se transformó en ADN bicatenario. Después 1,3 g de ADN viral bicatenario se sometió a la enzima de restricción Aat II (18 U) a 37ºC durante 2 horas, después, la enzima de restricción se inactivó a 65ºC durante 15 minutos. El producto se dializó en una membrana de acetato y de nitrato de celulosa Millipore VSWPO13000 frente a agua durante 2 horas. El fragmento de restricción Aat II /Aat II del ADN viral bicatenario preparado de esta manera se congeló a -20ºC esperando la etapa de ligamiento.

El vector pcDNA 2.1 se modificó para recibir el fragmento Aat II por mutagénesis dirigida por inserción: el sitio de restricción Eag I del multi-sitio de clonaje se suprimió y se sustituyó por un sitio Aat II. El vector pcDNA 2.1a producido de esta manera, se amplificó en un cultivo bacteriano y se purificó usando un Kit QIAfilter Plasmid Maxi (Qiagen S.A., Francia). Después, 3 g del vector pcDNA 2.1 se sometieron a un proceso de restricción por la enzima Aat II a 37ºC durante 1 hora, después se desfosforiló mediante la fosfatasa alcalina de camarón (Boehringer Mannheim, Meylan Francia). Las enzimas se inactivaron a 65ºC durante 15 minutos.

El ligamiento se realizó a una proporción molar vector/inserto de ADN viral de 1/l o 50 ng de vector y 100 ng de inserto de ADN viral, preparados como se ha descrito anteriormente, usando 1 U de ligasa T4 (Life Technologies, Francia) a 24ºC durante 16 horas. Después de la dilución a 1/2, el producto de ligamiento se calentó a 65ºC para inactivar la ligasa T4 después se enfrió en hielo. Se realizó la electroporación de las bacterias electro competentes Sure (Stratagene, Heidelberg Alemán) con 2 ó 4 l de esta solución de ligamiento (1000 V, 50 F, 200 ) después se incubaron con 1 ml de medio SOC (Life Technologies, Francia) durante 1 hora antes de colocarse en un medio de caldo Luria con Agar (Life Technologies, Francia) que contenía 100 g/ml de amoxicilina, 15 g/ml de tetraciclina, 100 g/ml de IPTG y 50 g/ml de X-gal.

Se seleccionaron veinticuatro colonias blancas (recombinantes); su plásmido se extrajo por mini-preparación de ADN y un mapa de restricción resumen (Aat II, Aat II + BamH I, BamH I, BamH I + Bgl II, Hind II) permitió seleccionar 2 clones recombinantes con un inserto de tamaño y un mapa de restricción compatibles con un inserto de ADN viral V9.

Estos 2 clones (2 y 22) se secuenciaron usando un secuenciador automático ABI 377 (Perkin Elmer, Francia): que contenían además un inserto de 5028 pb, las 2 secuencias son idénticas salvo en la posición 1165 (A y G para los clones 2 y 22 respectivamente). La secuencia directa del ADN viral V9 permitió detectar que la G en la posición 1165 era la correcta, por tanto es el clon 22 el que se ha seleccionado (PCD.V9.C22) cuya secuencia corresponde a la SEC ID Nº:1.

Las figuras 1 a 6 muestran las distancias genéticas que existen entre el eritrovirus V9 y el eritrovirus B19. En estas figuras, las diferencias de las secuencias del eritrovirus se representan por su mnemotécnico en el GeneBank (publicación 103.0 octubre 1997).

EJEMPLO 2: Diagnóstico de un eritrovirus de tipo V9 por hibridación de ADN (transferencia puntual o transferencia por ranuras o micro-placa) con una sombra específica.

El ADN viral se extrajo, por ejemplo, usando una columna del Kit QIAamp Blood (Qiagen S.A., Francia) o cualquier otro procedimiento de ácidos nucleicos, procedente una muestra biológica (sangre, suero, plasma, líquido amniótico, médula ósea, tejidos). El ADN en solución se desnaturalizó a 95ºC durante 2 minutos después se enfrió en hielo, se transfirió a una membrana de nylon o acetato de celulosa por filtración al vacío, después se fijó (calentamiento de la membrana a 80 ºC durante 1 hora). A continuación, la membrana se hibridó en condiciones rigurosas con una sonda de ADN o ARN específica de V9, tal como la secuencia SEC ID Nº:1 o su complementaria o fragmento de esta, en particular las secuencias SEC ID Nº:45 a SEC ID Nº:80 y 110 o su complementaria o un fragmento de estas secuencias marcadas de manera apropiada. Este marcaje puede ser un marcaje con un radio-elemento (32P, 33P, 35S, 3H, 14C o cualquier otro radioisótopo), un marcaje en frío (biotina, marcador fluorescente, digoxigenina o cualquier otra molécula que pueda acoplarse o incorporarse en un fragmento de ADN o ARN y que pueda detectar un anticuerpo específico o un quelato de rutenio). En el caso de un marcaje por un elemento radiactivo, el revelado se efectúa por auto-radiografía o cualquier otro procedimiento que permita la detección de la emisión del radio isótopo (tal como el Phosphorimager, Molecular Dynamics, Bondoufle, Francia). En el caso de un marcaje con biotina, el revelado se efectúa usando un conjugado enzima/estreptavidina y un sustrato de revelado adecuado. En el caso de un marcaje fluorescente, el revelado se realiza usando un fluoro-Imager (Molecular Dynamics, Bondoufle, Francia) o cualquier otro aparato capaz de detectar la emisión de fluorescencia. En el caso de un marcaje con digoxigenina (o con otro antígeno) el revelado se realiza usando un anticuerpo anti-digoxigenina (o específico del antígeno utilizado para el marcaje), acoplado directamente a una enzima (fosfatasa alcalina, peroxidasa o cualquier otra enzima), o de manera indirecta por un anticuerpo anti-digoxigenina (o específico del antígeno utilizado para el marcaje) y un anticuerpo acoplado a una enzima. Para el revelado se utiliza un sustrato adaptado a la enzima del conjugado. En el caso de un marcaje por quelato de rutenio (como el TBR) el revelado se efectúa por una reacción de electroquimioluminiscencia (G.F. Blanckburn et al., Clin, Chem., 1991, 37:1536-1539).

Una variante de esta técnica comprende la fijación del ADN viral sobre una microplaca o cualquier otro soporte sólido y la hibridación con una sonda marcada como se ha indicado anteriormente.

Otra variante de esta técnica comprende la fijación de una sonda no marcada sobre una microplaca o cualquier otro soporte sólido y la hibridación con el ADN viral de la muestra que previamente se habrá marcado.

EJEMPLO 3: Diagnóstico de un eritrovirus de tipo V9 por amplificación génica (PCR o polymerase chain reaction (reacción en cadena de la polimerasa)) e hibridación:

Se extrae ADN viral procedente de una muestra biológica (sangre, suero, plasma, líquido amniótico, médula ósea, tejidos), usando una columna del kit QIAamp Blood (Qiagen S.A., Francia) o cualquier otro procedimiento de extracción de ácidos nucleicos.

La PCR se realizó de acuerdo con el método descrito por Saiki et al. (Nature, 1986, 324:163-66) con 10 l de solución de ADN en un volumen final de 100 l de mezcla de reacción (KCl 50 mM; Tris-HCl 10 Mm, pH 8,3; MgCl2 2,5 mM; dNTP 200 M; 25 pmoles de oligonucleótidos sentido y antisentido) con 1,5 UI de AmpliTaq Gold TM (Perkin Elmer, Francia). Los cebadores de amplificación son oligonucleótidos de 20 a 25 unidades seleccionados para amplificar solamente el ADN de la variante V9: es decir los 2 cebadores (sentido y antisentido) son fragmentos de las secuencias específicas de V9 (SEC ID Nº:45 a 80, 108 y 110) o sus complementarias, es decir uno de los cebadores se selecciona entre esas secuencias específicas de V9 (SEC ID Nº:45-80, 108 y 110) o sus complementarios mientras que el otro cebador se selecciona entre las secuencias que pueden hibridarse con los eritrovirus B19 así como también con los eritrovirus V9 (SEC ID Nº:2 a 44, 105-107, 109 y 111-112) o sus complementarias. Los ciclos de temperaturas se imponen en la mezcla de reacción mediante un termociclador (T9600, Perkin Elmer, Francia) de acuerdo con el siguiente programa:

1 ciclo:

- 6 minutos a 95ºC 5 ciclos:

-60 segundos a 95ºC

-: 30 segundos a 60ºC

-: 30 segundos a 72ºC 45 ciclos:

-: 30 segundos a 95ºC

-: 30 segundos a 60ºC

-: 30 segundos a 72ºC 1 ciclo:

- 5 minutos a 72ºC El producto de amplificación se depositó sobre un gel de agarosa al 1,3% para someterse a una separación electroforética y a una transferencia sobre una membrana de nylon cargada por capilaridad de acuerdo con una técnica convencional (Sambrook J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). La sonda es un oligonucleótido de 20-30 unidades, fragmento de una secuencia específica de V9 (SEC ID Nº:45 a 80, 108 y 110) o sus complementarias. La sonda se marcó en 3' por DIG-dUTP usando el kit DIG Oligonucleotide Tailing (Boehringer Mannheim, Meylan, Francia). La membrana de transferencia se prehibridó en un tampón que comprendía (50% de formamida, 5X SSC; 2% de reactivo de bloqueo (Boehringer Mannheim, Meylan, Francia); 0,1% de N-lauril sarcosina; 0,02% de SDS), a 42ºC durante 90 minutos. La hibridación se realizó en 3 ml de un tampón de la misma composición con 10 µl de sonda marcada a 42 ºC durante 16 horas. La membrana se lavó 2 veces en tampón 2X SSC; SDS al 0,1% a 60ºC durante 10 minutos y después 2 veces en tampón 1X SSC; SDS al 1% a 60ºC durante 10 minutos. A continuación se

reveló la membrana con el kit de detección luminiscente DIG (Boehringer Mannheim, Meylan, Francia) y una auto-radiografía.

EJEMPLO 4: Diagnóstico de grupo y diagnóstico diferencial de los eritrovirus B19 y V9 por amplificación génica e hibridación:

Se extrae ADN viral procedente de una muestra biológica (sangre, suero, plasma, líquido amniótico, médula ósea, tejidos) usando una columna del kit QIAamp Blood (Qiagen S.A., Francia) o cualquier otro procedimiento de extracción de ácidos nucleicos.

La PCR se realizó de acuerdo con el método descrito por Saiki et al. (Nature, 1986, citado anteriormente) con 10 l de la solución de ADN en un volumen final de 100 l de mezcla de reacción (KCl 50 mM; Tris-HCl 10 mM, pH 8,3; MgCl2 2,5 mM; 200 M de dNTP, 25 pmoles de oligonucleótidos sentido y antisentido) con 1,5 UI y de AmpliTaq Gold TM (Perkin Elmer, Francia). Los cebadores de amplificación son oligonucleótidos de 20 a 25 unidades seleccionados para amplificar el ADN de B19 y de la variante V9: los 2 cebadores (sentido y antisentido) son fragmentos de secuencias que pueden hibridarse con los eritrovirus B19 así como también con los eritrovirus V9 (SEC ID Nº:2 a 44, 105-107, 109, 111-112) o sus complementarias. Los ciclos de temperaturas se imponen en la mezcla de reacción mediante un termociclador (T9600, Perkin Elmer, Francia) de acuerdo con el siguiente programa:

1 ciclo:

- 6 minutos a 95ºC 5 ciclos:

-60 segundos a 95ºC

-: 30 segundos a 60ºC

-: 30 segundos a 72ºC 45 ciclos:

-: 30 segundos a 95ºC

-: 30 segundos a 60ºC

-: 30 segundos a 72ºC 1 ciclo:

- 5 minutos a 72ºC El producto de amplificación se depositó sobre un gel de agarosa al 1,3%, para someterse a una separación electroforética y una transferencia sobre una membrana de nylon cargada por capilaridad de acuerdo con una técnica convencional (J. Sambrook et al., 1989, citado anteriormente). La sonda es un oligonucleótido de 20-30 unidades, fragmento de una secuencia específica de V9 (SEC ID Nº:45-80, 108 y 110) o sus complementarias, o bien específica de B19 o, finalmente, que también se hibrida con B19 así como con V9 (SEC ID Nº:2 a 44 ó 105-107, 109, 111-112), si se busca realizar un diagnóstico de grupo. La sonda se marcó en 3' por DIGdUTP usando el kit DIG Oligonucleotide Tailing (Boehringer Mannheim, Meylan, Francia).

La membrana de transferencia se prehibridó e hibridó en las mismas condiciones que las expuestas en el ejemplo 3.

EJEMPLO 5: Diagnóstico de grupo y diagnóstico diferencial de los eritrovirus de tipo B19 y V9 por amplificación génica y enzimas de restricción.

La PCR NS1a se realizó de acuerdo con el método descrito por Saiki et al. con 5 l de la solución de ADN en un volumen final de 50 l de mezcla de reacción (KCl 50 mM; Tris-HCl 10 mM, pH 8,3; MgCl2 2,5 mM; 200 M de dNTP, 12,5 pmoles de oligonucleótidos sentido y antisentido) con 1,5 UI de AmpliTaq Gold TM (Perkin Elmer, Francia) y el par cebador B (cebador sentido e1905f, SEC ID Nº:105; y cebador antisentido e1987r SEC ID Nº:106) utilizando los siguientes ciclos de temperatura (sobre un termociclador T9700, Perkin Elmer, Francia):

-1 ciclo: 6 minutos a 94ºC

-5 ciclos: 30 segundos a 90ºC 1 minuto a 55ºC 1 minuto a 72ºC

-45 ciclos: 30 segundos a 94ºC 30 segundos a 60ºC 30 segundos a 72ºC

-1 ciclo: 7 minutos a 72ºC Sobre un gel de agarosa al 2%, se depositó una alícuota del producto de amplificación (10 l) para someterse a una separación electroforética y a una transferencia sobre una membrana de nylon cargada por capilaridad de acuerdo con una técnica convencional (J. Sambrook et al., 1989, citado anteriormente). La membrana se hibridó con una sonda de oligonucleótidos de 30 unidades, e1954fp (SEC ID Nº:121): ACCAGTATCAGCAGCAGTGGTGGTGAAAGCTCTGAA, fragmento de la secuencia SEC ID Nº:11. Esta sonda permite una detección de los eritrovirus del tipo B19 y V9. Una alícuota del producto de amplificación (10 l) se sometió a la acción de la enzima de restricción MunI durante 2 horas y después se sometió a una separación

electroforética sobre un gel de agarosa al 2%. Como se ha descrito anteriormente, si hay escisión el tipo de eritrovirus es B19 y si no hay escisión es V9. Resultados de la PCR NS1a:

Setenta y nueve muestras recuperadas, indeterminadas o positivas débiles con la antigua PCR para B19 (Lefrene, et al., Transfusion, 1995, 35:389-391) se exploraron usando la nueva PCR NS1a (eritrovirus consenso, secuencias de acuerdo con la invención). Sobre las 79 muestras exploradas, 31 son positivas y se tipificaron usando la enzima de restricción Mun I: se recuperaron 18 (58%) del tipo B19 y 13 (42%) del tipo V9.

Las muestras positivas en la PCR NS1a pudieron amplificarse sobre 1110 pb mediante una PCR anidada (PCR S1S2) usando el par de cebadores e1855f (SEC ID Nº:113) y e2960r (SEC ID Nº:114) para la primera etapa de amplificación de 30 ciclos (PCRS1), y el par de cebadores e1863f (SEC ID Nº:115) y e2953r (SEC ID Nº:116) para la segunda etapa de amplificación de 50 ciclos (PCRS2). Se recuperaron 15 muestras positivas en la PCR S1S2 y se secuenciaron sobre 1110 pb (13 del tipo B19 en PCR NS1A y 2 del tipo variante). El análisis de las secuencias mostró que:

-los cebadores B (cebador sentido e 1905f, SEC ID Nº:105; y el cebador antisentido e1987r, SEC ID Nº:106) se conservan perfectamente mediante cualquiera de las 15 secuencias (del tipo B19 y variante) así como por cualquiera de las secuencias conocidas de B19, lo que confirma su interés para una utilización en un ensayo de diagnóstico consenso para el B19 y el V9.

-la sonda e1954fp (SEC ID Nº:121), fragmento de la secuencia SEC ID Nº:1, también se conserva bien mediante las 15 secuencias así como mediante todas las secuencias conocidas de B19,

-las secuencias de B19 forman un grupo muy homogéneo con una divergencia menor del 1,2% entre ellas (7 secuencias B19 de GeneBank y las 13 secuencias de B19 de este estudio),

-por último para las 2 secuencias tipificadas del eritrovirus variante por PCR NS1a con la digestión MunI, se observó una divergencia menor del 4,5% con V9.

EJEMPLO 6: Clonación de genes capsidiales VP1 y VP2 de V9 en un vector de expresión baculovirus:

Primera etapa:

- clonación del gen VP1 en un plásmido bacteriano Se amplificó el gen VP1 de V9 por PCR de acuerdo con el método descrito por Saiki et al. (Nature, 1986, 324:163-166) con 10 l de una dilución 10-2 de ADN viral V9 en un volumen final de 100 l de mezcla de reacción (Tris-HCl 20 mM pH 8,8; KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM; MgSO4 2 mM; Triton X-100 al 0,1%; 0,1 mg/ml de BSA; dNTP 0,2 mM; 25 pmoles de cebadores sentido (e2435fStul/BgIII: AAAGGCCTAGATCTTGTAGATTATGAGTAAAAC, SEC ID Nº:117) y antisentido (e4813rEcoRI: CGGAATTCGGTGGGTGACGGTTCCTG, SEC ID Nº:118) con 2,5 U de Pfu Turbo TM (Stratagene, Francia). Los cebadores de amplificación se seleccionaron sobre la secuencia V9 de cada lado el genVP1, para facilitar la clonación su extremo 5' se modificó por

adición de uno o más sitios de restricción (indicados por su nombre). Los ciclos de temperaturas impuestos en la mezcla de reacción son los siguientes: 1 ciclo:

-: 1 minuto a 94ºC 20 ciclos:

-: 1 minuto a 94ºC

-: 1 minuto a 55ºC

-: 2,5 minutos a 72ºC 1 ciclo:

- 10 minutos a 72ºC El producto de amplificación del gen VP1 se purificó usando una columna de sílice (kit de purificación QIAquick PCR, Qiagen, Francia), después se sometió a la acción de enzimas de restricción Stu I y EcoR I. Después de la inactivación de las enzimas de restricción

por calor (20 minutos a 65ºC), el fragmento del gen VP1 se purificó por diálisis frente a H2O sobre un filtro de 0,025 m (VSWP01300, Millipore).

El plásmido pBacPAK8 (Clontech, Francia) se sometió a la acción de enzimas de restricción Stu I y EcoR I, a continuación, la fosforilasa alcalina de camarón (Boehringer, Francia) desfosforiló el vector. Después de la inactivación de las enzimas de restricción por calor (20 minutos a 65ºC), el kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen) purificó el plásmido.

El ligamiento se realizó con 50 ng del plásmido pBacPAK8 y 100 ng del fragmento VP1 (preparados como se ha descrito anteriormente) con la ligasa de T4 (Life Technologies, Francia). Después de la inactivación de la ligasa de T4 mediante calor (10 min a 65ºC), se realizó la electroporación de 2 l de producto de ligamiento diluido a 1/2 con agua con 25 l de bacterias electro competentes (Epicurian Coli Sure Electroporation-Competent cells, Stratagene). Las bacterias electroporadas se volvieron a recoger inmediatamente en 1 ml de medio SOC (2% de triptona, 0,5% de extractos de levadura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM y 20 mM de glucosa), se incubaron durante 1 hora a 37ºC con agitación. Después, 10 l, 100 l y 890 l de bacterias transformadas se colocaron en frascos de gelatina Lennox (10 g/l de peptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl y 13 g/l de agar) que contenían 50 g/ml de ampicilina. Después de 24 horas de incubación a 37ºC, se subcultivaron 24 colonias por construcción en 5 ml de medio Lennox con 50 g/ml de ampicilina y se incubaron durante 24 horas a 37ºC con agitación.

El ADN plasmídico se extrajo por mini-lisis alcalina usando el kit QIAprep 8 Turbo miniprep (Qiagen) y se analiza mediante restricción Stu I/EcoR I y Kpn I/Hind III con objeto de determinar la presencia del inserto y su orientación. El clon pB8-VP1.C5 se seleccionó y el plásmido recombinante se verificó por secuenciación.

-: clonación del gen VP2 en un plásmido bacteriano Se amplificó el gen VP2 de V9 por PCR de acuerdo con el método por Saiki et al. (Nature, 1986, 324:163-166) con 10 l de una dilución 10-2 de ADN viral V9 en un volumen final de 100 l de mezcla de reacción (Tris-HCl 20 mM pH 8,8; KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM; MgSO4 2 mM; Triton X-100 al 0,1%; 0,1 mg/ml de BSA; dNTP 0,2 mM; 25 pmoles de cebadores sentido (e3115fBamHI: CACGGATCCATACCCCAGCATGACTTCAG, SEC ID Nº:119) y antisentido (e4813rBamHI: CACGGATCCGGTGGGTGACGGTTCCTG, SEC ID Nº:120)) con 2,5 U de Pfu Turbo TM (Stratagene, Francia). Los cebadores de amplificación se seleccionaron sobre la secuencia V9 de cada lado el genVP2, para facilitar la clonación su

extremo 5' se modificó por la adición de uno o más sitios de restricción (indicados por su nombre). Los ciclos de temperaturas impuestos en la mezcla de reacción son los siguientes: 1 ciclo:

-: 1 minuto a 94ºC 20 ciclos:

-: 1 minuto a 94ºC

-: 1 minuto a 60ºC

-: 2,5 minutos a 72ºC 1 ciclo:

- 10 minutos a 72ºC El producto de amplificación del gen VP2 se purificó usando una columna de sílice (Qiaquick PCR Purification Kit, Qiagen, Francia), después se sometió a la acción de la enzima de restricción BamH I. El kit de purificación QIAquick PCR (Qiagen) purificó el fragmento del gen VP2. El plásmido pBacPAK8 (Clontech, Francia) se sometió a la acción de la enzima de restricción BamH I, a continuación, la fosforilasa alcalina de camarón (Boehringer, Francia) desfosforiló el vector. Después de la inactivación de la fosfatasa alcalina de camarón por calor (20 minutos a 65ºC), el plásmido se purificó por extracción con fenol/cloroformo y se precipitó con etanol. El ligamiento se realizó con 50 ng de plásmido pBacPAK8 y 100 ng de fragmento VP2 (preparados como se ha indicado anteriormente) con la ligasa de T4 (Life Technologies, Francia). Después de la inactivación de la ligasa de T4 por calor (10 min a 65ºC), se realizó la electroporación de 2 l de producto de ligamiento diluido a 1/2 con agua con 25 l de bacterias electro competentes (Epicurian Coli Sure Electroporation-Competent cells, Stratagene). Las bacterias electroporadas se volvieron a recoger inmediatamente en 1 ml de medio SOC, se incubaron durante 1 hora a 37ºC en agitación. Después, 10 l, 100 l y 890 l de bacterias transformadas se colocaron en frascos de gelatina Lennox que contenían 50 g/ml de ampicilina. Después de 24 horas de incubación a 37ºC, se subcultivaron 24 colonias por construcción en 5 ml de medio Lennox con 50 g/ml de ampicilina y se incubaron durante 24 horas a 37ºC con agitación. El ADN plasmídico se extrajo por minilisis alcalina usando el Kit QIAprep 8 Turbo miniprep (Qiagen) y se analizó por restricción de BamH I y Sac I con objeto de determinar la presencia del inserto y su orientación. El clon pB8-VP2.C20 se seleccionó y el plásmido recombinante se verificó por secuenciación: se observó una base A delecionada justo aguas arriba del ATG iniciador de VP2, pero esta mutación no se tiene en cuenta: no genera la

expresión de VP2. Segunda etapa:

- Construcción del baculovirus recombinante que expresa VP1 El plásmido pB8-VP1.C5 se cotransfectó con el baculovirus BacPAk6 linealizado por Bsu361 (BacPAKTM Baculovirus Expression System, Clontech) en células de insecto SF9 mediante lipofectina. Se efectuaron 2 aislamientos por el método de intervalos de lisis, los

intervalos aislados se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, a continuación, la membrana se hibridó con una sonda de ADN específica del gen VP1 de V9.

De esta manera se seleccionó el baculovirus recombinante BacPAK6-pB8VP1.C4.2. La expresión de la proteína se verificó por transferencia de Western sobre una base celular de células SF9 infectadas con este baculovirus recombinante. Se observó una banda de VP1 del tamaño esperado (aproximadamente 80 kDa) pero que sólo reconoció el anticuerpo monoclonal anti-VP1-B19 (Argene, Francia). Es posible que este anticuerpo monoclonal sólo reaccione de manera cruzada con la proteína VP1 de V9.

Después de PCR por los cebadores Bac1 y Bac2 (Clontech), se verificó la clonación en el baculovirus por secuenciación.

- Construcción del baculovirus recombinante que expresa VP2 El plásmido pB8-VP2.C20 se cotransfectó con el baculovirus BacPAk6 linealizado por Bsu361 (BacPAKTM Baculovirus Expression System, Clontech) en células de insecto SF9 mediante lipofectina. Se efectuaron 2 aislamientos por el método de intervalos de lisis, los intervalos aislados se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, a continuación, la membrana se hibridó con una sonda de ADN específica del gen VP2 de V9. De esta manera se seleccionó el baculovirus recombinante BacPAK6-pB8VP2.C1.3 La expresión de la proteína se verificó por transferencia de Western sobre un sedimento celular de células SF9 infectadas con este baculovirus recombinante. El anticuerpo monoclonal anti-VP2-B19 (Argene, Francia) detectó bien una proteína con un peso molecular aparente de aproximadamente 58 kDa que también es bien visible sobre el gel de acrilamida. Por microscopía electrónica se observan pseudo partículas virales de aproximadamente 20 a 30 nm de diámetro en los sobrenadantes del cultivo de las células SF9 después de la infección de un baculovirus recombinante que expresa la proteína VP2 de V9. El tamaño y el aspecto de las pseudo partículas virales obtenidas son, en todos los aspectos, de acuerdo con los descritos para el B19. Esta observación confirma que el baculovirus produce la proteína VP2 de V9 en forma nativa, por lo que puede formar cápsides vacías por auto-ensamblaje. Después de PCR por los cebadores Bac1 y Bac2 (Clontech), se verificó la

clonación en el baculovirus por secuenciación

Tercera etapa:

Las proteínas VP1 y VP2 de V9 expresadas en baculovirus se purificarán para utilizarse como antígeno diana para nuevos ensayos serológicos para el diagnóstico de infecciones por eritrovirus V9.

Como se revela de lo anterior, la invención no se limita a estos 2 modos de ejecución, realización y aplicación que se han descrito de manera más explícita; incluye, por el contrario todas las variantes que pueden venir a la mente del especialista en la materia, sin separarse del ámbito, ni del alcance de la presente invención.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> NGUYEN, Quang Tri GARBARG-CHENON, Antoine AUGUSTE, Véronique HOSPITAL DE ASISTENCIA PÚBLICA DE PARIS

<120> ERITROVIRUS HUMANO, FRAGMENTOS DE DICHO VIRUS ASÍ COMO SUS APLICACIONES

<130> BLOcp1020/3P

<140>

<141>

<150> FR9715197

<151> 03-12-1997

<160> 121

<170> PatentIn Vers. 2.0

<210> 1

<211> 5028

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 23

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 2 ACTTCTGACT GGGAACCACT AAC 23

<210> 3

<211> 29

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 3 TTTAGAGATG GAGAGCAGTT TATAGAAAA 29

<210> 4

<211> 35

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 4 TGGAATAATG AAAACTTTCC ATTTAATGAT GTAGC

<210> 5

<211> 20

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 5 TTGGTGGTCT GGGATGAAGG 20

<210> 6

<211> 20

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 6 ACAGAGGCTG ATGTACAACA 20

<210> 7

<211> 21

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 7 TGGTGTAATG CACAAAGCTG G 21

<210> 8

<211> 31

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 8 CCACTATGAA AACTGGGCAA TAAACTACAC A

<210> 9

<211> 17

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 9 TTTGATTTCC CTGGAAT 17

<210> 10

<211> 23

<212> ADN <213> eritrovirus

<400> 10 AATGCAGATG CCCTCCACCC AGA 23

<210> 11

<211> 64

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 11

imagen1

<210> 12

<211> 25

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 12 TGAAACCCCG CGCTCTAGTA CGCCC 25

<210> 13

<211> 55

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 13 TCCCCGGGAC CAGTTCAGGA GAATCATTTG TCGGAAGCCC AGTTTCCTCC GAAGT

<210> 14

<211> 20

<212> ADN

<213> eritrovirus <400> 14 CAGTTTCGTG AACTGTTAGT 20

<210> 15

<211> 24

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 15 GCTTGGTATA ATGGATGGAA ATTT 24

<210> 16

<211> 26

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 16 AAAAAATGTG CTTACCTGTC TGGATT

<210> 17

<211> 18

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 17 CTTAAAAACT CTCCAGAC 18

<210> 18

<211> 19

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 18 TATATAGTCA TCATTTTCA 19

<210> 19

<211> 43

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 19 CATGGACAGT TATCTGACCA CCCCCATGCC TTATCATCCA GTA 43

<210> 20

<211> 19

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 20 TGCAGAACCT AGAGGAGAA 19

<210> 21

<211> 47

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 21 ATGCAGTATT ATCTAGTGAA GACTTACACA AGCCTGGGCA AGTTAGC 47

<210> 22

<211> 49

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 22 TACCCGGTAC TAACTATGTT GGGCCTGGCA ATGAGCTACA AGCTGGGCC 49

<210> 23

<211> 39

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 23 GACAGTGCTG CAAGGATTCA TGACTTTAGG TATAGCCAA 39

<210> 24

<211> 22

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 24 TGGCTAAGTT GGGAATAAAT CC 22

<210> 25

<211> 23

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 25 TTAAAAAATA TAAAAAATGA AAC 23

<210> 26

<211> 53

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 26 TACTTTACTT TAAAAGGTGC AGCTGCCCCT GTGGCCCATT TTCAAGGAAG TTT

<210> 27

<211> 23

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 27 TACAACGCCT CAGAAAAATA CCC 23

<210> 28

<211> 26

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 28 TCTGCAGAAG CCAGCACTGG TGCAGG 26

<210> 29

<211> 23

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 29 TTAGATTTTA ATGCTTTAAA TTT 23

<210> 30

<211> 32

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 30 TTAGAGTTTC AGCACTTAAT TGAAAATTAT GG

<210> 31

<211> 20

<212> ADN

<213> eritrovirus <400> 31 ACAGGAATAA ATGCCATTTC 20

<210> 32

<211> 24

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 32 GACAAAGAGT ATCAGCAAGG GGTA 24

<210> 33

<211> 26

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 33 AGATTTCCAA ATGAAAAAGA ACAGCT

<210> 34

<211> 18

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 34 TCAGCTGTGG AGTAAAAT 18

<210> 35

<211> 23

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 35

TTAGATGACA GTTTTAAAAC TCA: 23

<210> 36 <211> 21 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 36 CCTCAAATAT TTTTAAAAAT A: 21

<210> 37 <211> 34 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 37 TACCACAAAG TGGGCCAATT GGAGGTATTA AATC: 34

<210> 38 <211> 23 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 38 ATGGGAATTA CTACTTTAGT TCA: 23

<210> 39 <211> 62 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 39

imagen1

<210> 40 <211> 29 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 40 GGATATGAAA AGCCTGAAGA ATTGTGGAC: 29

<210> 41 <211> 30 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 41 GCCAAAAGCC GTGTGCACCC ATTGTAAACA: 30

<210> 42 <211> 21 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 42 TCCCCACCGT GTCCTCAGCC A: 21

<210> 43 <211> 109 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 43

imagen1

<210> 44

<211> 103

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 44

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<210> 45 10 <211> 210

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400>: 45

<400>: 47

imagen2

<210> 46

<211> 30

<212> ADN

<213> eritrovirus

20

<400> 46

ATTTATACTA ACTTTTAATT TACTAACATG: 30

<210> 47

25: <211> 100

<212> ADN

<213> eritrovirus

imagen1

<210> 48

<211> 117

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 48

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10 <210> 49

<211> 183

<212> ADN

<213> eritrovirus

15 <400> 49

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<210> 50

<211> 670 <212> ADN 20 <213> eritrovirus

<400>: 50

<400>: 53

imagen1

5: <210> 51 <211> 36 <212> ADN <213> eritrovirus

10: <400> 51 TCCATTTAAT GATGTAGCGG GGAAAAGTTT GGTGGT36

15: <210> 52 <211> 46 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 52 CTGGGATGAA GGCATTATTA AGTCCACTAT TGTGGAAGCT GCAAAA: 46

20: <210> 53 <211> 84 <212> ADN <213> eritrovirus

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5: <210> 54 <211> 60 <212> ADN <213> eritrovirus

10: <400> 54 AGCAATGGTG GCATGCTAAA ACATTACATT TGTTGTGAGT GGTAATACCA CTACAACTGT

15: <210> 55 <211> 76 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 55

imagen3

<210> 56

<211> 30

<212> ADN

<213> eritrovirus

25

<400> 56

ATGTACAACA ATGGCTAACT TGGTGTAATG: 30

<210> 57

30: <211> 28

<212> ADN <213> eritrovirus

5: <400> 57 CACAAAGCTG GAGCCACTAT GAAAACTG 28

10: <210> 58 <211> 98 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 58

imagen1

<210> 59 15 <211> 134

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 59

imagen3

<210> 60

<211> 100 <212> ADN 25 <213> eritrovirus

<400> 60

imagen1

<210> 61

<211> 30

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 61 ACCTGTCTGG ATTACAAAGT TTTGTAGATT

<210> 62

<211> 102

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 62

imagen1

<210> 63

<211> 114

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 63

imagen1

<210> 64

<211> 22

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 64 TCTCCAGACC TATATAGTCA TC 22

<210> 65

<211> 23

<212> ADN <213> eritrovirus

<400> 65 ATTTTCAGAG CCATGGACAG TTA: 23

<210> 66 <211> 30 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 66 ATCATCCAGT AACAGTAGTG CAGAACCTAG: 30

<210> 67 <211> 39 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 67 CAAGCTGGGC CTCCGCAGAA TGCTGTGGAC AGTGCTGCA: 39

<210> 68 <211> 56 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 68 GGAATAAATC AAATAT 56: CTTATACACA TTGGACGGTA GCAGATGAAG AATTGTTAAA

<210> 69 <211> 51 <212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 69

AAAAAATGAA ACAGGGTTTC AAGCACAAGC AGTAAAAGAT TACTTTACTT T 51

<210> 70

<211> 37

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 70 AAGGAAGTTT ACCGGAAGTG CCCGCGTACA ACGCCTC 37

<210> 71

<211> 42

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 71 AGAAAAATAC CCCAGCATGA CTTCAGTTAA CTCTGCAGAA GC 42

<210> 72

<211> 255

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 72

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30 <210> 73

<211> 33 <212> ADN <213> eritrovirus

5: <400> 73 TTTAAATTTG TTTTTCTCAC CATTAGAGTT TCA 33

10: <210> 74 <211> 725 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 74

imagen1

<210> 75

<211> 49 20 <212> ADN

<213> eritrovirus <400> 75 TGCCATTTCA CATGGACAAA CCACTTATGG AAATGCTGAG GACAAAGAG 49

<210> 76

<211> 30

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 76 TATCAGCAAG GGGTAGGAAG ATTTCCAAAT 30

<210> 77

<211> 180

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 77

imagen1

<210> 78

<211> 64

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 78

imagen1

<210> 79

<211> 152

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 79

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<210> 80

<211> 260

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 80

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10 <210> 81

<211> 2013

<212> ADN

<213> eritrovirus

15 <400> 81

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<210> 82

<211> 671

<212> PRT

<213> eritrovirus

<400> 82

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<210> 83

<211> 222

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 83

imagen1

<210> 84

<211> 74 10 <212> PRT

<213> eritrovirus

<400> 84

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15 <210> 85

<211> 2343

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 85

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<210> 86

<211> 781

<212> PRT

<213> eritrovirus

<400> 86

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<210> 87

<211> 681

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 87

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<210> 88

<211> 227

<212> PRT

<213> eritrovirus

<400> 88

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<210> 89

<211> 306

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 89

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5

<210> 90

<211> 102

<212> PRT

<213> eritrovirus 10

<400> 90

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<210> 91

<211> 1662

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 91

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<210> 92

<211> 554

<212> PRT

<213> eritrovirus

<400> 92

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<210> 93

<211> 396

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 93

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<210> 94

<211> 132

<212> PRT

<213> eritrovirus

<400> 94

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<210> 95

<211> 40

<212> PRT

<213> eritrovirus

<400> 95

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10 <210> 96

<211> 21

<212> PRT

<213> eritrovirus

<400> 96

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<210> 97

<211> 24

<212> PRT

<213> eritrovirus

<400> 97

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<210> 98

<211> 21

<212> PRT

<213> eritrovirus

<400> 98

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<210> 99

<211>: 22 20 <212> PRT

<213> eritrovirus

<400> 99

<210> 100

<211> 21

<212> PRT

<213> eritrovirus

<400> 100

<210> 101

<211>: 32 10 <212> PRT

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<213> eritrovirus

<400> 101

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15 <210> 102

<211> 21

<212> PRT

<213> eritrovirus

20 <400> 102

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<210> 103

<211> 37

<212> PRT 25 <213> eritrovirus

<400> 103

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<210> 104

<211> 28

<212> PRT

<213> eritrovirus

<400> 104

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10: <210> 105 <211> 19 <212> ADN <213> eritrovirus

15 20: <400> 105 TGCAGATGCC CTCCACCCA <210> 106 <211> 21 <212> ADN <213> eritrovirus 19

<400> 106 GCTGCTTTCA CTGAGTTCTT C: 21

25: <210> 107 <211> 20 <212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 107 GACCAGTTCA GGAGAATCAT 20

<210> 108 <211> 19 <212> ADN <213> eritrovirus

<400> 108 ATCGGCAAGC GGCGTGTAA 19

<210> 109

<211> 20

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 109 ATCCAGACAG GTAAGCACAT 20

<210> 110

<211> 21

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 110 21 ATCGGCAAGC GGCGTGTAAA A 21

<210> 111

<211> 19

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 111 19 CATGCCTTAT CATCCAGTA 19

<210> 112

<211> 20

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 112 20 TTGGCTATAC CTAAAGTCAT

<210> 113

<211> 19

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 113 CACTATGAAA ACTGGGCAA 19

<210> 114

<211> 19

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 114 19 ACAATTCTTC ATCTGCTAC 19

<210> 115

<211> 21

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 115 AAACTGGGCA ATAAACTACA C

<210> 116

<211> 20

<212> ADN <213> eritrovirus

<400> 116 CTTCATCTGC TACCGTCCAA 20

<210> 117

<211> 33

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 117 AAAGGCCTAG ATCTTGTAGA TTATGAGTAA AAC

<210> 118

<211> 26

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 118 CGGAATTCGG TGGGTGACGG TTCCTG 26

<210> 119

<211> 29

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 119 CACGGATCCA TACCCCAGCA TGACTTCAG

<210> 120

<211> 26

<212> ADN

<213> eritrovirus

<400> 120 CACGGATCCG GTGGGTGACG GTTCCTG: 26

5: <210> 121 <211> 36 <212> ADN <213> eritrovirus

10: <400> 121 ACCAGTATCA GCAGCAGTGG TGGTGAAAGC TCTGAA 36

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un eritrovirus variante en relación al eritrovirus de tipo B19, denominado eritrovirus de tipo V9, caracterizado por que presenta una divergencia genética < o igual al 6% con la secuencia SEC ID Nº:1, y por que su genoma se hibrida específicamente en condiciones rigurosas con una de las secuencias SEC ID Nº:45 a 80, 108 y 110 y por que dicho eritrovirus V9 no puede reconocerse molecularmente como un genoma del eritrovirus B19, ya que presenta una divergencia genética superior o igual al 10% sobre el conjunto del genoma en comparación con las secuencias del eritrovirus B19.
2.

Un polinucleótido caracterizado porque se selecciona del grupo constituido por:

a) el genoma del eritrovirus de tipo V9 tal como se define en la reivindicación 1, presentando este genoma una secuencia seleccionada del grupo constituido por:

-

las secuencias que presentan una divergencia genética  10% sobre el conjunto del genoma en comparación con las secuencias del eritrovirus B19 y que presentan una divergencia genética menor o igual al 6% en comparación con la SEC ID Nº:1, y

-

las secuencias que pueden hibridarse en condiciones rigurosas con una de las secuencias SEC ID Nº: 45 a 80, 108 y 110 y

b) el polinucleótido de la secuencia SEC ID Nº:1, que representa el 95% del genoma del eritrovirus V9 tal como se define en la reivindicación 1, incluyendo todas las secuencias codificantes.
3.

Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado por que presenta un perfil de restricción de acuerdo con las figuras 7.1 a 7.3.
4.

Un fragmento de la secuencia SEC ID Nº:1, caracterizado por que representa una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de dicho eritrovirus V9, seleccionada del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:81, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº:85, SEC ID Nº:87, SEC ID Nº:89, SEC ID Nº:91 y SEC ID Nº:93.
5.

Un fragmento de la secuencia SEC ID Nº:1, caracterizado por que se selecciona del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 y Nº:110, sus secuencias complementarias, las secuencias de al menos 17 nucleótidos, resultantes de estas secuencias y las secuencias que comprenden dichas secuencias y por que es adecuado para su uso como una sonda o cebador en la identificación específica de un eritrovirus de tipo V9 o un eritrovirus que presenta una divergencia genética menor o igual al 6% en comparación con la SEC ID Nº:1.
6.

Un fragmento de la secuencias SEC ID Nº:1, caracterizado por que se selecciona del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:2 a 44, 105 a 107, 109 y 111 a 121 y las secuencias complementarias de las secuencias anteriores, y por que es adecuado para su uso como una sonda o cebador para el diagnóstico diferencial de eritrovirus.
7.

Pares de cebadores, caracterizados por que se seleccionan del grupo constituido por:

-

el par A: cebadores SEC ID Nº:111 y SEC ID Nº:112;

-

el par B: cebadores SEC ID Nº:105 y SEC ID Nº:106

- el par C: una de las secuencias SEC ID Nº:2-44, 105, 106, 107, 109, 111 ó 112 y una de las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 ó 110;

- el par D: cebador SEC ID Nº:107 y cebador SEC ID Nº:109;

-

el par E: dos cebadores seleccionados entre las secuencias SEC ID Nº:2-44, 105, 106, 107, 109, 111 ó 112; y

-

el par F: dos cebadores seleccionados entre las secuencias SEC ID Nº: 45-80, 108 ó 110.
8.

Sondas, caracterizadas por que se seleccionan del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:45 a 80, 108, 110 y 121.
9.

Un plásmido, caracterizado por que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3 o un fragmento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
10.

Un plásmido de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que incluye la secuencia SEC ID Nº:1.
11.

El uso de una molécula de ácido nucleico seleccionada entre las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 y 110, sus secuencias complementarias, las secuencias de al menos 17 nucleótidos, resultantes de estas secuencias, eventualmente marcadas con un marcador apropiado, para la preparación de un reactivo de diagnóstico para la detección diferencial de eritrovirus de tipo V9.
12.

Procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, por hibridación y/o amplificación génica, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

(1)

una etapa en la que la muestra biológica a analizar se pone en contacto con al menos una sonda de las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 ó 110 y

(2)

una etapa en la que el producto (o productos) resultante de la interacción entre la secuencia de nucleótidos del eritrovirus y la sonda se detecta mediante cualquier medio apropiado.
13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado por que, antes de la etapa (1), comprende:

- una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica, y

- al menos un ciclo de amplificación génica.
14.

Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que los ciclos de amplificación se realizan usando un par de cebadores de acuerdo con las reivindicación 7.
15.

Un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

-

una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,

-

al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores B tal como se define en la reivindicación 7 y

-

la detección del producto amplificado en parte por hibridación con la sonda de la secuencia SEC ID Nº:121 y en parte por la acción de la enzima de restricción MunI.
16. Un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

-

una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,

-

al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores A tal como se define en la reivindicación 7 y

-

la detección del producto amplificado por acción de la enzima de restricción ApaI.
17. Un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

-

una etapa de extracción de ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,

-

al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores C tal como se define en la reivindicación 7 y

- la detección del producto amplificado.
18. Un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

-

una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,

-

al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores D tal como se define en la reivindicación 7 y

-

la detección del producto amplificado por hibridación con una sonda cuya secuencia se selecciona del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:58-60 y 110.
19. Un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

-

una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,

-

al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores E tal como se define en la reivindicación 7 y

-

la detección del producto amplificado por hibridación con una sonda cuya secuencia se selecciona del grupo constituido por las secuencias SEC ID Nº:45-80, 108 y 110.
20. Un procedimiento de diagnóstico rápido y diferencial de eritrovirus, realizado en una muestra biológica, caracterizándose dicho procedimiento por que comprende:

-

una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,

-

al menos un ciclo de amplificación génica usando el par de cebadores F tal como se define en la reivindicación 7 y

- la detección del producto amplificado.
21.

El uso de las secuencias tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 para la implementación de un procedimiento de hibridación o de amplificación génica de las secuencias de nucleótidos del eritrovirus para el diagnóstico in vitro de una posible infección de un individuo por un eritrovirus.
22.

Procedimiento de exploración y de tipificación de un eritrovirus V9 o afín, caracterizado por que comprende poner en contacto una sonda seleccionada del grupo constituido por los fragmentos de acuerdo con la reivindicación 5, eventualmente marcada, con

5 el ácido nucleico del virus a tipificar, eventualmente marcado y la detección del híbrido ácido nucleico-sonda obtenido.
23. Kit de diagnóstico de eritrovirus, caracterizado por que incluye al menos un par de cebadores de acuerdo con la reivindicación 7 y/o una sonda de acuerdo con la reivindicación