ES2348237T3 - Uso de anticuerpos anti-cd40 antagonistas para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula que expresa CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa, por lo que cuando se une dicho anticuerpo monoclonal al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, se inhibe el crecimiento o diferenciación de dicha célula, para uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto humano con leucemia linfocítica crónica (CLL), comprendiendo el procedimiento la administración a dicho sujeto de una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CD-40 humano, seleccionándose dicho anticuerpo anti-CD40 monoclonal humano del grupo constituido por: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12; y d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a procedimientos para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica usando anticuerpo monoclonales anti-CD40 antagonistas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La leucemia linfocítica crónica (CLL) es un cáncer de células B caracterizado por proliferación y acumulación de células neoplásticas en médula ósea, sangre, nódulos linfáticos y el bazo. CLL es el tipo más común de leucemia en adultos en el hemisferio occidental. La incidencia de CLL aumenta en la población en envejecimiento, siendo la edad media en el momento del diagnóstico de 65 años. Los protocolos de tratamiento actuales incluyen agentes quimioterapéuticos tales como fludarabina, 2clorodeoxiadenosina (cladribina), cloroambucilo, vincristaina, pentostatina, ciclofosfamida, alemtuzumab (campath-1H), doxorubicina, y prednisona. La fludarabina es el quimioterapéutico más efectivo con tasas de respuesta de 17 a 74%, pero CLL llega a ser frecuentemente refractario a cursos repetidos del fármaco (Rozman and Montserrat (1995) NEJM 2133:1052).

La tasa de superviviencia media de paciente con CLL es de nueva años, si bien algunos pacientes con genes de inmunoglobulina mutados tienen un pronóstico más favorable. Véase, por ejemplo, Rozman and Montserrat (1995) NEJM 2133:1052) y Keating y col. (2003) Hematol. 2003:153. En casos en los que CLL se ha transformado en linfoma de células grandes, las supervivencia media cae a menos de un año; de forma similar, casos de leucemia prolinfocítica tienen una pronóstico peor que CLL clásica (Rozman and Montserrat (1995) NEJM 2133:1052). Hasta la fecha no se ha obtenido evidencia de una cura.

CD40 es un antígeno de superficie celular de 55 kDa presente en la superficie de las células B normales y células B neoplásicas humanas, células dendríticas, células presentadoras de antígenos (APC), células endoteliales, células monocíticas y epiteliales. La unión del ligando CD40 al antígeno CD40 en la membrana de la célula B proporciona una señal coestimulatoria positiva que estimula la activación y proliferación de células B, dando lugar a la maduración de células B en una célula de plasma que secreta altos niveles de inmunoglobulina soluble. Las células transformadas de pacientes con linfomas de células B de bajo y alto grado, leucemia linfoblástica aguda de células B, CLL, leucemia mieloblástica y enfermedad de Hodgkin expresan CD40. Las células B malignas de diversos tumores de linaje de células B expresan un alto nivel de CD40 y parecen

depender de la señalización de CD40 para la supervivencia y proliferación. Esto hace del antígeno CD40 una diana potencial para la terapia anti-cáncer. Dado el mal pronóstico para pacientes con leucemia linfocítica crónica se necesitan protocolos de tratamiento alternativos.

Los documentos WO 01/83755, WO 02/28480 y WO 02/28904 describen anticuerpos capaces de unirse a CD40, procedimientos para producir estos anticuerpo y procedimientos para su uso.

Ellmark y col (Immunology 2002, 106, 456-463) describe la modulación de la interacción del ligando CD40-CD40 usando fragmentos de anticuerpo de cadena simple anti-CD40 humanos.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula que expresa CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa, por lo que cuando se une dicho anticuerpo monoclonal al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, se inhibe el crecimiento o diferenciación de dicha célula, para uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto humano con leucemia linfocítica crónica (CLL), comprendiendo el procedimiento la administración a dicho sujeto de una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CD-40 humano, seleccionándose dicho anticuerpo anti-CD40 monoclonal humano del grupo constituido por: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo

monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543;

b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12;

c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº12;y

d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12

que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva. La invención también proporciona el uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo

monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula que expresa CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano con leucemia linfocítica crónica (CLL), por lo que cuando se une dicho anticuerpo monoclonal al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, se inhibe el crecimiento o diferenciación de dicha célula, seleccionándose dicho anticuerpo anti-CD40 monoclonal humano del grupo constituido por: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo

monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543;

b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12;

c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº12;y

d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva. La invención también proporciona un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano

que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40, para uso en un procedimiento de inhibición del crecimiento de células de leucemia linfocítica crónica (CLL) que expresan antígeno CD40, comprendiendo el procedimiento la puesta en contacto de dichas células con una cantidad efectiva del anticuerpo anti-CD40 monoclonal, seleccionándose dicho anticuerpo del grupo constituido por:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543;

b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12;

c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº12;y

d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva. La invención también proporciona el uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo

monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a antígeno CD40

en la fabricación de un medicamento para la inhibición del crecimiento de células de

leucemia linfocítica crónica (CLL) que expresan antígeno CD40, estando dicho anticuerpo

monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une a antígeno CD40,

seleccionándose dicho anticuerpo del grupo constituido por:

a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543;

b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12;

c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº12;y

d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva, La invención también proporciona un procedimiento in vitro para la inhibición del

crecimiento de células de leucemia linfocítica crónica (CLL) que expresan antígeno CD40, comprendiendo dicho procedimiento la puesta en contacto de dichas células con una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-CD40 monoclonal humano que es capaz de unirse específicamente a dicho antígeno CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40, seleccionándose dicho anticuerpo del grupo constituido por: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo

monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543;

b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12;

c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº12;y

d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva. Otros aspectos de la invención se presentan en las reivindicaciones adjuntas.

BREVE RESUMEN DE LA DIVULGACIÓN

Se describen procedimientos para el tratamiento de un sujeto humano con leucemia linfocítica crónica (CLL), que comprenden la administración al sujeto de una anticuerpo anti-CD40 o un fragmento de unión al antígeno del mismo que está exento de actividad agonista significativa cuando se une a un antígeno CD40 o una célula que expresa CD40 humano. Se describen también procedimientos para la inhibición del crecimiento de células de CLL que expresan antígeno CD40.

Los anticuerpos anti-CD40 antagonistas adecuados para uso en la presente

invención tienen una fuerte afinidad por CD40 y se caracterizan por una constante de equilibrio de disociación (KD) de al menos 10-6 M, de preferencia al menos 10-7 M hasta aproximadamente 10-8 M, de más preferencia al menos aproximadamente 10-8 M hasta aproximadamente 10-12 M. Estos anticuerpos monoclonales y sus fragmentos de unión al antígeno son capaces de unirse específicamente a antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana. Están exentos de actividad agonista significativa pero exhiben actividad antagonista cuando se unen al antígeno CD40 en las células humanas. En una realización, el anticuerpo anti-CD40 o su fragmento muestra actividad antagonista cuando se une a antígeno CD40 en células B normales humanas. En otra realización el anticuerpo anti-CD40 o su framgneto muestra actividad antagonista cuando se une a antígeno CD40 en células B humanas malignas. Los anticuerpos monoclonales adecuados tienen regiones constantes humanas; prefriblemente también tienen regiones marco humanizadas completa o parcialmente; y lo más preferiblemente son anticuerpos completamente humanos o sus fragmentos de unión al antígeno. Los ejemplos de tales anticuerpos monoclonales son los anticuerpos denominados en el presente documento como CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que se pueden producir de forma recombinante; los anticuerpos monoclonales producidos por las líneas celulares de hibridoma denominadas 131.2F8.5.9 (a la que se hace referencia en el presente documento como la línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hace referencia en el presente documento como la línea celular 12.12); un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia mostrada en SEC ID Nº 6, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 7; la secuencia mostrada en SEC ID Nº 8, las secuencias mostradas en SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 7, y las secuencias mostradas en SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 8; un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia mostrada en SEC ID Nº 2, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 4, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 5, las secuencias mostradas SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 4, y las secuencias mostradas SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 5; un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia mostrada en SEC ID Nº 1, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 3, y las secuencias mostradas en SEQ ID Nº 1 y SEC ID Nº 3; y los fragmentos de estos anticuerpos monoclonales que se unen al antígeno que retienen la capacidad de unirse específicamente al CD40 humano, y que están exentos de actividad agonista significativa pero que exhiben actividad antagonista cuando se unen al antígeno CD40 en las células humanas, como se demuestra para células B normales y neoplásticas humanas que expresan CD40. Los ejemplos de tales anticuerpos monoclonales también incluyen un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal producido par la línea celular de hibridoma 12.12 o 5.9; un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº 10 o SEC ID Nº 12; un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 en un ensayo de unión competitivo; y un anticuerpo monoclonal que es un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR

12.12 o cualquiera de los anticuerpos monoclonales anteriores, donde el fragmento retiene la capacidad de unión específica al antígeno CD40 humano.

En una realización de la divulgación, los procedimientos de tratamiento comprenden administrar a un paciente una dosis terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende anticuerpos antagonistas anti CD40 antagonistas adecuados o sus fragmentos de unión al antígeno. Una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 o su fragmento está en el intervalo desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg, o desde aproximadamente 7 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. Se reconoce que el procedimiento de tratamiento puede comprender una administración única de una dosis terapéuticamente eficaz o múltiples administraciones de una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo antagonista antagonista anti CD40 o sus fragmentos de unión al antígeno.

Los anticuerpos antagonistas anti CD40 identificados en el presente documento como adecuados para uso en los procedimientos de la invención pueden modificarse. Las modificaciones de estos anticuerpos antagonistas anti CD40 incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti CD40 quiméricos inmunológicamente activos, anticuerpos anti CD40 humanizados y anticuerpos anti CD40 murinos inmunológicamente activos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 presenta las secuencias de aminoácidos para las cadenas ligeras y pesadas del mAb CHIR-12.12. Las regiones líder (residuos 1-20 de SEC ID Nº 2), variable (residuos 21-132 de SEC ID Nº 2), y constante (residuos 133-239 de SEC ID Nº 2) de la cadena ligera se muestran en la Figura 1A. Las regiones líder (residuos 1-19 de SEC ID Nº 4), variable (residuos 20-139 de SEC ID Nº 4), y constante (residuos 140-469 de SEC ID Nº 4) de la cadena pesada se muestran en la Figura 1B. La región constante alternativa para la cadena pesada del mAb CHIR-12.12 mostrada en la Figura 1B refleja una sustitución de un residuo alanina por un residuo serina en la posición 153 de SEC ID Nº 4. La secuencia completa para esta variante de la cadena pesada del mAb CHIR

12.12 se presenta en SEC ID Nº 5. La Figura 2 muestra las secuencias codificadoras para la cadena ligera (Figura 2A; SEC ID Nº 1) y la cadena pesada (Figura 2B; SEC ID Nº 3) para el mAb CHIR-12.12.

La Figura 3 presenta las secuencias de aminoácidos para las cadenas ligera y pesada del mAb CHIR-5.9. Las regiones líder (residuos 1-20 de SEC ID Nº 6), variable (residuos 21-132 de SEC ID Nº 6), y constante (residuos 133-239 de SEC ID Nº 6) de la cadena ligera se muestran en la Figura 3A. Las regiones líder (residuos 1-19 de SEC ID Nº 7), variable (residuos 20-144 de SEC ID Nº 7), y constante (residuos 145-474 de SEC ID Nº 7) de la cadena pesada se muestran en la Figura 3B. La región constante alternativa para la cadena pesada del mAb CHIR-5.9 mostrada en la Figura 3B refleja una sustitución de un residuo alanina por un residuo serina en la posición 158 de SEC ID Nº

7. La secuencia completa para esta variante de la cadena pesada del mAB CHIR-5.9 se presenta en la SEC ID Nº 8.

La Figura 4 muestra la secuencia codificadora (Figura 4A; SEC ID Nº 9) para la isoforma corta del CD40 humano (secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4B; SEC ID Nº 10), y la secuencia codificadora (Figura 4C; SEC ID Nº 11) para la isoforma larga del CD40 humano (secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4D).

La figura 5 muestra que el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 inhibe la proliferación mediada por CD40L de células de cáncer en pacientes con CLL (n = 9) a las 48 horas (figura 5A) y 72 horas (figura 5B).

La figura 6 muestra que el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 no presenta un efecto estimulatorio en células de paciente con CLL (n = 9) a las 48 horas (figura 6A) y 72 horas (figura 6B).

La figura 7 muestra lisis celular mediada por ADCC de línea celular de CLL EHEB por anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 frente al anticuerpo monoclonal Rituxan®.

La Figura 8 muestra la temperatura de fusión de CHIR-12.12 en formulaciones de diferente pH medidas por calorimetría diferencial de barrido (DSC). DESCRIPCIÓN DETALLADA

“Tumor”, según se usa en el presente documento, se refiere a todo crecimiento y

proliferación de células neoplásicas, sea maligno o benigno, y a todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.

Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren a, o describen, la afección fisiológica en mamíferos que está típicamente caracterizada por el crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, linformas y leucemias.

Los “anticuerpos” y las “inmunoglobulinas” (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de unión para un antígeno, las inmunoglobulinas incluyen tanto a los anticuerpos como a otras moléculas análogas a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno. Los polipéptidos del último tipo son producidos, por ejemplo, en niveles bajos por el sistema linfático y en niveles aumentados por los mielomas.

El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y abarca los anticuerpos totalmente estructurados, fragmentos de anticuerpos que pueden unirse al antígeno (por ejemplo, Fab’, F’(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena simple, fragmentos divalentes o diabodies), y péptidos recombinantes que comprenden los anteriores.

El término “anticuerpo monoclonal” según se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que se dan en la naturaleza que pueden estar presentes en cantidades menores.

Los “anticuerpos nativos” y las “inmunoglobulinas nativas” son usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena ligera y pesada también tiene enlaces disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio de variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de las cadenas ligera y pesada.

El término “variable” se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables tanto en los dominios de las cadenas ligeras como de las cadenas pesadas. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones de marco (FR). Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración lámina β, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan la estructura de la lámina β, y en algunos casos forman parte de la misma. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión del antígeno de los anticuerpos (véase Kabat y col. (1991) NIH Publ. Nº 91-3242, Vol. I, páginas 647-669).

Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la unión del receptor de FC (FcR), la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos, la opsonización, la iniciación de la citotoxicidad dependiente del complemento y la desgranulación de los mastocitos.

El término “región hipervariable” cuando se usa en el presente documento se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión del antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una “región determinante de complementariedad” o “CDR” (es decir, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed., Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD) y/o los residuos de un “bucle hipervariable” (es decir, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 2632(H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Clothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Los residuos del “marco” o “FR” son los residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable.

Los “fragmentos de anticuerpos” comprenden una parte de un anticuerpo intacto, de preferencia la región de unión al anticuerpo o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2 y fragmentos Fv; fragmentos divalentes; anticuerpos lineales (Zapata y col. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062); moléculas de anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, llamados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento residual “Fc”, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina da un fragmento F(ab’)2 que tiene dos sitios de combinación con el antígeno y aún es capaz de formar un entrecruzamiento con el antígeno.

“Fv” es el fragmento mínimo del anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión del antígeno completo. En una especie Fv de dos cadenas, esta región está constituida por un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en estrecha asociación, no covalente. En una especie Fv de cadena única, un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera pueden estar unidos covalentemente por un conector peptídico flexible tal que las cadenas ligera y pesada pueden asociarse en una estructura “dimérica” análoga a la de una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis CDR confieren la especificidad de unión al antígeno para el anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una menor afinidad que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab’ por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la denominación en el presente documento para el Fab’ en el que el(los) residuo(s) cisteína de los dominios constantes tiene(n) un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se producían originalmente como pares de fragmentos Fab’ que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

Las “cadenas ligeras” de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente diferentes, llamados kappa (κ) y lambda (λ), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Según la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras y las configuraciones tridimensionales de las subunidades de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Los isotipos diferentes tienen funciones efectoras diferentes. Por ejemplo, los isotipos IgG1 e IgG3 humanos median la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC).

La palabra “marcador” cuando se utiliza en el presente documento se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directamente o indirectamente a los anticuerpos para generar un anticuerpo “marcado”. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto

o composición de sustrato que es detectable. Los radionúclidos que pueden servir como marcadores detectables incluyen, por ejemplo, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 y Pd-109. El marcador puede también ser una entidad no detectable tal como una toxina.

El término “antagonista” se utiliza en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea parcial o totalmente, inhibe o neutraliza una actividad biológica de una diana nativa dada a conocer en el presente documento o su transcripción o traducción.

“Vehículos” según se usa en el presente documento incluye los vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, que son no tóxicos para la célula o el mamífero que se expone al mismo en las dosis y concentraciones utilizadas. Frecuentemente el vehículo fisiológicamente aceptable es una disolución acuosa de pH tamponado. Los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluido el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (con menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluidos glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, polietilenglicol (PEG) y Pluronics. La administración “en combinación con” otro u otros agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (al mismo tiempo) y la administración consecutiva en cualquier orden.

Una “célula huésped”, según se usa en el presente documento, se refiere a un microorganismo o a una célula o línea celular de eucariota cultivada como una entidad unicelular que puede usarse, o se ha usado, como receptor de un vector recombinante u otros polinucleótidos de transferencia, e incluye a la progenie de la célula original que se ha transfectado. Se entiende que la progenie de una célula única puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN genómico o total a la original, por las mutaciones naturales, accidentales o deliberadas.

“Células efectoras humanas” son leucocitos que expresan uno o más FcR y que realizan funciones efectoras. De preferencia, las células expresan al menos FcγRIII y llevan a cabo la función efectora de citotoxicidad mediada por células dependiente de antígenos (ADCC). Los ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células citolíticas naturales (NK), monocitos, macrófagos, eosinófilos y neutrófilos, siendo las de preferencia las PBMC y las células NK. Los anticuerpos que tienen actividad ADCC son típicamente del isotipo IgG1 o IgG3. Nótese que además de aislar anticuerpos IgG1 e IgG3, tales anticuerpos que median la ADCC pueden generarse modificando una región variable de un anticuerpo que no media la ADCC o un fragmento de región variable formando una región constante del isotipo IgG1 o IgG3.

Los términos “receptor de Fc” o “FcR” se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR de preferencia es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR de preferencia es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye a los receptores de las subclases FcγRI, FcγRII y FcγRIII, incluidas las variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativas de estos receptores. Los receptores FcγRII incluyen FcγRIIA (un “receptor activador”) y FcγRIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor activador FcγRIIA contiene un motivo de activación inmuno receptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcγRIIB contiene un motivo de inhibición inmuno receptor basado en tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234). Los FcR se recopilan en Ravetch and Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Capel y col. (1994) Immunomethods 4: 25-34; y de Haas y col. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126: 330-341. Otros FcRs, incluidos los que se identificarán en el futuro, están abarcados por el término “FcR” en el presente documento.

El término incluye también el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer y col. (1976) J. Immunol. 117: 587 y Kim y col. (1994) J. Immunol. 24: 249 (1994)).

Hay varias maneras de producir anticuerpos humanos. Por ejemplo, pueden inmortalizarse células secretoras por medio de la infección con el virus de Epstein-Barr (EBV). Sin embargo, las células infectadas con EBV son difíciles de clonar y usualmente producen sólo rendimientos relativamente bajos de inmunoglobulina (James and Bell (1987) J. Immunol Methods 100: 5-40). En el futuro, posiblemente podría lograrse la inmortalización de células B humanas mediante la introducción de una combinación definida de genes transformadores. Esa posibilidad se destaca por medio de una reciente demostración de que la expresión de la subunidad catalítica de telomerasa junto con la oncoproteína grande de SV40 y un alelo oncogénico de H-ras dio como resultado la conversión tumorigénica de células fibroblásticas y epiteliales humanas normales (Hahn y col. (1999) Nature 400: 464-468). Ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas (Jakobovits y col. (1993) Nature 362: 255-258; Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13: 65-93; Fishwild y col. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 845-851; Mendez y col. (1997) Nat. Genet. 15: 146-156; Green (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23; Tomizuka y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727; recopilado en Little y col. (2000) Immunol. Today 21: 364-370). Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota de la región de unión de cadenas pesadas (JH) del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición completa de producción de anticuerpos endógenos (Jakobovits y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 25512555). La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulinas humanas de línea germinal en tales ratones mutantes de línea germinal da como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el desafío con antígenos (Jakobovits y col. (1993) Nature 362: 255-258). Mendez y col. (1997) (Nature Genetics 15: 146-156) han generado una línea de ratones transgénicos que, cuando se desafían con un antígeno, generan anticuerpos totalmente humanos de alta afinidad. Esto se logró por la integración en la línea germinal de loci megabase de cadenas pesadas y cadenas ligeras humanas en los ratones con deleción en el segmento endógeno JH como se describió anteriormente. Estos ratones (tecnología XenoMouse® II (Abgenix; Fremont, California)) albergan 1.020 kb del locus de cadena pesada humana que contiene aproximadamente 66 genes de VH, regiones DH y JH completas, y tres regiones constantes diferentes, y también albergan 800 kb del locus κ humano que contiene 32 genes de Vκ, segmentos Jκ y genes de Cκ. Los anticuerpos producidos en estos ratones se asemejan mucho a los que se observan en seres humanos en todos los aspectos, incluidos la reorganización genética, la estructura y el repertorio. Los anticuerpos humanos se expresan de preferencia sobre anticuerpos endógenos por deleción en el segmento endógeno que evita la reorganización genética en el locus murino. Tales ratones pueden inmunizarse con un antígeno de interés particular.

Los sueros de tales animales inmunizados pueden seleccionarse para reactividad de anticuerpo frente al antígeno inicial. Los linfocitos pueden aislarse de ganglios linfáticos o de células del bazo y además pueden seleccionarse para células B seleccionando las células CD138 negativas y CD19 positivas. En un aspecto, tales cultivos de células B (BCC) pueden fusionarse a células de mieloma para generar hibridomas como se detalló anteriormente.

En otro aspecto, tales cultivos de células B pueden seleccionarse además para reactividad frente al antígeno inicial, de preferencia. Tal selección incluye ELISA con la proteína diana/antígeno, un ensayo de competición con anticuerpos conocidos que se unen al antígeno de interés, y unión in vitro a células CHO u otras células transfectadas de manera transitoria que expresan el antígeno diana.

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para el tratamiento de sujetos humanos que presentan leucemia linfocítica crónica (CLL). Los procedimientos implican el tratamiento con un anticuerpo anti CD40 descrito en este documento, o uno de sus fragmentos de unión al antígeno, en el que la administración del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno promueve una respuesta terapéutica positiva en el sujeto que se somete a este procedimiento de terapia. Los anticuerpos anti CD40 adecuados para uso en los procedimientos de la invención se unen específicamente al antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana y están exentos de actividad agonista significativa, pero exhiben actividad antagonista cuando se unen al antígeno CD40 en una célula humana que expresa CD40, como se demuestra para células B humanas normales y neoplásticas que expresan CD40, incluyendo células de CLL. Estos anticuerpos anti CD40 y sus fragmentos de unión al antígeno se denominan en el presente documento anticuerpos anti CD40 antagonistas. Tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a estos, los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 totalmente humanos que se describen a continuación y los anticuerpos monoclonales que tienen las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12, también descritos a continuación.

Estos anticuerpos monoclonales que se pueden producir de forma recombinante se describen a continuación.

Los anticuerpos que tienen las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 incluyen anticuerpos que interfieren de manera competitiva con la unión de CD40 y/o se unen a los mismos epítopos que CHIR-5.9 y CHIR-12.12. Un experto podría determinar si un anticuerpo interfiere de manera competitiva con CHIR-5.9 o CHIR-12.12 usando procedimientos convencionales, conocidos en la técnica.

Cuando estos anticuerpos se unen a CD40 expuesto en la superficie de las células humanas, tales como células B humanas, los anticuerpos están exentos de actividad agonista importante; en algunas realizaciones, su unión a CD40 expuesto en la superficie de las células de células humanas da lugar a la inhibición de proliferación y diferenciación de estas células humanas. Por consiguiente, los anticuerpos anti CD40 antagonistas adecuados para uso en la invención incluyen aquellos anticuerpos monoclonales que pueden exhibir actividad antagonista hacia las células humanas que expresan el antígeno de superficie celular CD40. Anticuerpos anti CD40 antagonistas

Los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 representan anticuerpos anti CD40 antagonistas adecuados para uso en la presente invención. Los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son anticuerpos monoclonales anti CD40 totalmente humanos del isotipo IgG1 producidos a partir de las líneas celulares de hibridoma 131.2F8.5.9 (a la que se hace referencia en el presente documento como la línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hace referencia en el presente documento como la línea celular 12.12). Estas líneas celulares se crearon usando esplenocitos de ratones xenotípicos inmunizados que contienen el locus de cadena pesada de IgG1 humana y el locus de cadena κ humana (tecnología XenoMouse®; Abgenix; Fremont, California). Las células del bazo se fusionaron con las células de mieloma SP2/0 de ratón (Sierra BioSource). Las hibridomas resultantes se subclonaron varias veces para crear las líneas celulares monoclonales estables 5.9 y 12.12. Otros anticuerpos de la invención pueden prepararse de manera similar usando ratones transgénicos para loci de inmunoglobulina humana o por otros procedimientos conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento.

Las secuencias de aminoácidos para las regiones líder, variable y constante para la cadena ligera y cadena pesada para el mAb CHIR-12.12 se presentan en las Figuras 1A y 1B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº 2 (secuencia completa para la cadena ligera del mAb CHIR-12.12), SEC ID Nº 4 (secuencia completa para la cadena pesada para el mAb CHIR-12.12) y SEC ID Nº 5 (secuencia completa para una variante de la cadena pesada para el mAb CHIR-12.12 presentada en SEC ID Nº 4, donde la variante comprende una sustitución del residuo alanina por serina en la posición de 153 de SEC ID Nº 4). Las secuencias de nucleótidos que codifican la cadena ligera y la cadena pesada para el mAb CHIR-12.12 se presentan en las Figuras 2A y 2B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº 1 (secuencia codificadora para la cadena ligera para el mAb CHIR-12.12) y SEC ID Nº 3 (secuencia codificadora para la cadena pesada para el mAb CHIR-12.12). Las secuencias de aminoácidos para las regiones líder, variable y constante para la cadena ligera y cadena pesada del mAb CHIR-5.9 se presentan en las Figuras 3A y 3B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº 6 (secuencia completa para la cadena ligera del mAb CHR-5.9), SEC ID Nº 7 (secuencia completa para la cadena pesada del mAb CHIR-5.9) y SEC ID Nº 8 (secuencia completa para una variante de la cadena pesada del mAb CHIR-5.9 presentada en SEC ID Nº 7, donde la variante comprende una sustitución del residuo alanina por serina en la posición de 158 de SEC ID Nº 7). Además, los hibridomas que expresan los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se han depositado en la ATCC con una denominación de depósito de patente de PTA-5542 y PTA-5543, respectivamente.

Además de la actividad antagonista, resulta de preferencia que los anticuerpos anti CD40 de esta invención tengan otro mecanismo de acción contra una célula tumoral. Por ejemplo, los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 nativos tienen actividad ADCC. Como alternativa, las regiones variables de los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 pueden expresarse en otro isotipo de anticuerpos que tenga actividad ADCC. También es posible conjugar formas nativas, formas recombinantes o fragmentos de CHR-5.9 o CHIR-12.12 que se unen al antígeno a una citotoxina, un agente terapéutico, o un ión metálico radioactivo o radioisótopo, como se indica en este documento a continuación.

Los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen a CD40 soluble en ensayos de tipo ELISA, evitan la unión del ligando de CD40 al CD40 de la superficie celular, y desplazan el ligando de CD40 previamente unido, según se determina por ensayos de citometría de flujo. Los anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 compiten uno con el otro por la unión a CD40 pero no con 15B8, el anticuerpo monoclonal anti CD40 descrito en el documento WO 82/28904. Cuando se prueban in vitro los efectos en la proliferación de células B de sujetos humanos normales, CHIR-5.9 y CHIR-12.12 actúan como anticuerpos anti CD40 antagonistas. Además, CHIR-5.9 y CHIR-12.12 no inducen fuerte proliferación de linfocitos humanos de sujetos normales. Estos anticuerpos son capaces de matar las células diana que expresan CD40 por citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). La afinidad de unión de CHIR-5.9 por el CD40 humano es de 1,2 x 10-8 M y la afinidad de unión de CHIR-12.12 es de 5 x 10-10 M, según se determina por medio del ensayo Biacore™.

Los anticuerpos anti CD40 antagonistas adecuados para uso en la presente invención exhiben una fuerte afinidad de unión de sitio único por el antígeno CD40 de superficie celular. Los anticuerpos monoclonales de la invención exhiben una constante de equilibrio de disociación (KD) para CD40 de al menos 10-5 M, al menos 3 X 10-5 M, de preferencia al menos 10-6 M hasta 10-7 M, de más preferencia al menos 10-8 M hasta aproximadamente 10-12 M, medida usando un ensayo convencional tal como Biacore™. El análisis Biacore se conoce en la técnica y se proporcionan detalles en el “BIAapplications handbook”. Los procedimientos descritos en el documento WO 01/27160 pueden usarse para modular la afinidad de unión.

Se entiende por “antígeno CD40”, “antígeno CD40 de superficie celular”, “receptor de CD40” o “CD40” una glicoproteína transmembranaria que pertenece a la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (véase, por ejemplo las Patentes de EEUU Nº 5.674.492 y 4.708.871; Stamenkovic y col. (1989) EMBO 8: 1403; Clark (1990) Tissue Antigens 36: 33; Barclay y col. (1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (2ª ed.; Academic Press, San Diego)). Se han identificado dos isoformas de CD40 humano, codificadas por variantes de transcripción con cortes y empalmes alternativos de este gen. La primera isoforma (también conocida como la “isoforma larga” o “isoforma 1”) se expresa como un polipéptido precursor de 277 aminoácidos (SEC ID Nº 12 (informada primero en GenBank con Nº de acceso CAA43045, e identificada como isoforma 1 en GenBank con Nº de acceso NP 001241), codificado por SEC ID Nº 11 (véase Nº de acceso de GenBank X60592 y NM 001250)), que tiene una secuencia señal representada por los primeros 19 residuos. La segunda isoforma (también conocida como la “isoforma corta” o “isoforma 2”) se expresa como un polipéptido precursor de 203 aminoácidos (SEC ID Nº 10 (Nº de acceso de GenBank NP 690593), codificado por SEC ID Nº 9 (Nº de acceso de GenBank NM 152854)), que también tiene una secuencia señal representada por los primeros 19 residuos. Los polipéptidos precursores de estas dos isoformas de CD40 humano comparten en común sus primeros 165 residuos (es decir, los residuos 1-165 de SEC ID Nº 10 y SEC ID Nº 12). El polipéptido precursor de la isoforma corta (mostrado en SEC ID Nº 10) está codificado por una variante de transcripción (SEC ID Nº 9) que carece de un segmento codificador, que da lugar a un cambio del marco de traducción; la isoforma de CD40 resultante contiene un extremo C terminal más corto y diferente (residuos 166-203 de SEC ID Nº 10) del que está contenido en la isoforma larga de CD40 (extremo C terminal mostrado en los residuos 166-277 de SEC ID Nº 12). Para los fines de la presente invención, el término “antígeno CD40”, “antígeno CD40 de superficie celular”, “receptor de CD40” o “CD40” abarca tanto la isoforma corta como la larga de CD40. Los anticuerpos anti CD40 de la presente invención se unen a un epítopo de CD40 humano que se encuentra en la misma situación dentro de la isoforma corta o la isoforma larga de este antígeno de superficie celular como se señala a continuación en el presente documento.

El antígeno CD40 está expuesto en la superficie de una diversidad de tipos celulares, según se describe en otras partes en el presente documento. Por “expuesto en la superficie” y “expresado en la superficie” se entiende que todo o una parte del antígeno CD40 está expuesto al exterior de la célula. El antígeno CD40 expuesto o expresado puede estar total o parcialmente glicosilado.

Por “actividad agonista” se entiende que la sustancia funciona como un agonista. Un agonista se combina con un receptor en una célula e inicia una reacción o actividad que es similar a la misma que se inicia por el ligando natural del receptor. Por ejemplo, un agonista de CD40 induce, pero no se limita a, cualquiera o todas las siguientes respuestas: proliferación y diferenciación de células B, producción de anticuerpos, adhesión intercelular, generación de memoria de células B, cambio de isotipo, regulación ascendente de la expresión en la superficie celular de MHC clase II y CD80/86, y secreción de citocinas proinflamatorias tales como IL-8, IL-12 y TNF. Por “actividad antagonista” se entiende que la sustancia funciona como un antagonista. Un antagonista de CD40 evita o reduce la inducción de cualquiera de las respuestas inducidas por la unión del receptor de CD40 a un ligando agonista, en particular CD40L. El antagonista puede reducir la inducción de una o más de las respuestas a la unión de agonistas en un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, de preferencia 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, de más preferencia 70%, 80%, 85% y de mayor preferencia 90%, 95%, 99% ó 100%. Los procedimientos para medir la especificidad de unión y la actividad de antagonista de anticuerpos anti CD40 y ligandos de CD40 son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, ensayos de unión competitiva convencionales, ensayos para controlar la secreción de inmunoglobulinas por las células B, ensayos de proliferación de células B, ensayos de proliferación de células B análogos a Banchereau, ensayos de células T ayudantes para la producción de anticuerpos, ensayos de proliferación de células B con coestimulación y ensayos para regulación ascendente de marcadores de activación de células B. Véase, por ejemplo, los ensayos dados a conocer en el documento WO 00/75348 y en la Patente de EEUU Nº 6.087.329.

Por actividad antagonista “significativa” se entiende una actividad agonista de al menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 100% superior a la actividad agonista inducida por una sustancia neutra o un control negativo según se mide en el ensayo de una respuesta de células B. De preferencia, la actividad agonista “significativa” es una actividad agonista que es al menos 2 veces mayor o al menos 3 veces mayor que la actividad agonista inducida por una sustancia neutra o un control negativo según se mide en el ensayo de una respuesta de células B. Por consiguiente, por ejemplo, cuando la respuesta de células B de interés es la proliferación de células B, la actividad agonista “significativa” sería la inducción de un nivel de proliferación de células B que es al menos 2 veces mayor o al menos 3 veces mayor que el nivel de proliferación de células B inducido por una sustancia neutra o un control negativo. En una realización, una inmunoglobulina no específica, por ejemplo IgG1, que no se une a CD40 sirve como el control negativo. Una sustancia “exenta de actividad agonista significativa” exhibirá una actividad agonista de no más que aproximadamente 25% mayor que la actividad agonista inducida por una sustancia neutra o un control negativo, de preferencia no más que aproximadamente 20% mayor, 15% mayor, 10% mayor, 5% mayor, 1% mayor, 0.5% mayor, o incluso no más que aproximadamente 0,1% mayor que la actividad agonista inducida por una sustancia neutra o un control negativo según se mide en un ensayo de una respuesta de células B. Los anticuerpos anti CD40 antagonistas útiles en los procedimientos de la presente invención están exentos de actividad agonista significativa como se señaló anteriormente cuando se unen a un antígeno CD40 en una célula humana. En una forma de realización de la invención, el anticuerpo anti CD40 antagonista está exento de actividad agonista significativa en una respuesta de células B. En otra forma de realización de la invención, el anticuerpo anti CD40 antagonista está exento de actividad agonista significativa en ensayos de más de una respuesta de células B (por ejemplo, proliferación y diferenciación, o proliferación, diferenciación y producción de anticuerpos).

Según se utiliza en el presente documento “anticuerpo anti CD40” abarca cualquier anticuerpo que reconoce específicamente el antígeno CD40 de superficie de células B, incluidos anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena única, y sus fragmentos tales como Fab, F(ab’)2, Fv, y otros fragmentos que retienen la función de unión al antígeno del anticuerpo anti CD40 original. Son de particular interés para la presente invención los anticuerpos anti CD40 antagonistas que comparten las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos anteriormente.

Por consiguiente, además de los anticuerpo monoclonales CHIR-5.9 y CHIR12.12, otros anticuerpos que serían útiles en la práctica de la presente invención descritos en este documento incluyen, pero sin limitarse a estos, los siguientes: (1) los anticuerpos monoclonales producidos por las líneas celulares de hibridoma denominadas 131.2F8.5.9 (a la que se hace referencia en el presente documento como línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hace referencia en el presente documento como línea celular 12.12), depositadas en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 y Depósito de Patente Nº PTA-5543, respectivamente; (2) un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia mostrada en SEC ID Nº 2, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 4, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 5, las secuencias mostradas en SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 4, y por las secuencias mostradas en SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 5; (3) un anticuerpo monoclonal que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia mostrada en SEC ID Nº 6, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 7, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 8, las secuencias mostradas en SEQ ID NO:6 y SEC ID Nº 7, y por las secuencias mostradas en SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 8; (4) un anticuerpo monoclonal que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº 1, la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº 3, y las secuencias de nucleótidos mostradas en SEC ID Nº y SEC ID Nº 3; (5) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma 5.9 o la línea celular de hibridoma 12.12; (6) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº 10 o SEC ID Nº 12; (7) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12 en un ensayo de unión competitiva; y (8) un anticuerpo monoclonal que es un fragmento del anticuerpo monoclonal CHIR

12.12 o CHIR-5.9 que se une al antígeno o los anticuerpos monoclonales anteriores en los puntos anteriores (1)-(7), en los que el fragmento retiene la capacidad de unirse específicamente al antígeno CD40 humano. Los expertos reconocerán que los anticuerpos anti-CD40 antagonistas y los fragmentos de unión al antígeno de estos anticuerpos adecuados para uso en los procedimientos descritos en este documento incluyen anticuerpos anti-CD40 antagonistas y sus fragmentos de unión al antígeno, que se producen de forma recombinante usando procedimientos bien conocidos en la ténica y descritos en este documento a continuación, e incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que se han producido de forma recombinante. Producción de anticuerpos anti CD40

Los anticuerpos anti CD40 antagonistas para uso en la presente invención pueden producirse mediante cualquier procedimiento de producción de anticuerpos conocido por los expertos en la técnica. Pueden prepararse sueros policlonales por medio de procedimientos convencionales. En general, primero se utiliza una disolución que contiene el antígeno CD40 para inmunizar a un animal adecuado, de preferencia un ratón, rata, conejo o cabra. Los conejos o cabras son de preferencia para la preparación de sueros policlonales por el volumen de suero que puede obtenerse y la disponibilidad de anticuerpos anti conejo y anti cabra marcados.

Pueden prepararse sueros policlonales en un animal transgénico, de preferencia un ratón que lleva loci de inmunoglobulina humana. En una realización de preferencia, se usan células Sf9 que expresan CD40 como el inmunógeno. La inmunización también puede llevarse a cabo mezclando o emulsionando la disolución que contiene el antígeno en disolución salina, de preferencia en un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund, e inyectando por vía intravenosa la mezcla o emulsión por vía parenteral (generalmente por vía subcutánea o intramuscular). Típicamente es suficiente una dosis de 50-200 µg/inyección. La inmunización se estimula por lo general 2-6 semanas más tarde con una o más inyecciones de la proteína en disolución salina, de preferencia usando adyuvante incompleto de Freund. Como alternativa, pueden también generarse anticuerpos mediante inmunización in vitro usando procedimientos conocidos en la técnica, que para los fines de esta invención se considera equivalente a la inmunización in vivo. Los antisueros policlonales se obtienen por extracción de sangre de los animales inmunizados en un recipiente de vidrio o de plástico, incubando la sangre a 25 ºC durante una hora, seguido por la incubación a 4 ºC durante 2-18 horas. El suero se recupera por centrifugación (por ejemplo, 1.000 g x durante 10 minutos). Pueden obtenerse aproximadamente 20-50 ml por extracción de sangre de conejos.

La producción de células Sf9 (Spodoptera frugiperda) se da a conocer en la Patente de EEUU Nº 6.004.552. En resumen, se combinaron secuencias que codifican CD40 humano en un baculovirus usando vectores de transferencia. Los plásmidos se cotransfectaron con ADN de baculovirus de tipo silvestre en células Sf9. Las células Sf9 infectadas con baculovirus recombinante se identificaron y se purificaron como clones.

De preferencia el anticuerpo es monoclonal en la naturaleza. Por “anticuerpo monoclonal” se entiende un anticuerpo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posible mutaciones que se presentan naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. El término no está limitado con respecto a la especie o la fuente del anticuerpo. El término abarca inmunoglobulinas completas, así como fragmentos tales como Fab, F(ab')2, Fv y otros que retienen la función de unión al antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico, es decir, el antígeno CD40 de superficie celular en la presente invención. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo ya que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que es necesaria la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizan según la presente invención pueden obtenerse por el procedimiento de hibridomas descrito por primera vez por Kohler y col. (1975) Nature 256: 495, o pueden producirse por los procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Patente de EEUU Nº 4.816.567). Los “anticuerpos monoclonales” pueden aislarse también de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en, por ejemplo, Clackson y col. (1991) Nature 352: 624-628; Marks y col. (1991) J Mol. Biol. 222: 581-597; y en la Patente de EEUU Nº 5.514.548.

Por “epítopo” se entiende la parte de la molécula antigénica para la que se produce un anticuerpo y a la que se unirá el anticuerpo. Los epítopos pueden comprender residuos lineales de aminoácidos (es decir, los residuos en el epítopo están organizados consecutivamente uno después de otro en forma lineal), residuos no lineales (a los que se hace referencia en el presente documento como “epítopos no lineales”; estos epítopos no están organizados de forma consecutiva), o residuos de aminoácidos tanto lineales como no lineales.

La expresión “epítopo del antígeno CD40” según se utiliza en el presente documento se refiere a una estructura molecular en tres dimensiones (bien lineal o conformacional) que es capaz de tener inmunorreactividad con los anticuerpos monoclonales anti CD40 de esta invención, excluyendo el propio antígeno CD40. Los epítopos del antígeno CD40 pueden comprender proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos, hidratos de carbono, lípidos y otras moléculas, pero para los fines de la presente invención son más comúnmente proteínas, oligopéptidos cortos, miméticos de oligopéptidos (es decir, compuestos orgánicos que imitan las propiedades de unión al anticuerpo del antígeno CD40), o sus combinaciones. Los miméticos de oligopéptidos adecuados se describen, entre otros, en la solicitud de PCT US 91/04282.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando el procedimiento de Kohler y col. (1975) Nature 256: 495-496, o una de sus modificaciones. Típicamente, se inmuniza un ratón con una disolución que contiene el antígeno. La inmunización puede llevarse a cabo mezclando o emulsionando la disolución que contiene el antígeno en disolución salina, de preferencia en un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund, e inyectando la mezcla o emulsión por vía parenteral. Puede usarse cualquier procedimiento de inmunización conocido en la técnica para obtener anticuerpos monoclonales de la invención. Tras la inmunización del animal, se extirpa el bazo (y de manera opcional, varios ganglios linfáticos grandes) y se separan las células individuales. Las células del bazo pueden seleccionarse aplicando una suspensión de células a una placa o pocillo recubierto con el antígeno de interés. Las células B que expresan la inmunoglobulina unida a membrana específica para el antígeno se unen a la placa y no se eliminan por aclarado. A continuación se induce la fusión de las células B resultantes,

o de todas las células separadas del bazo, con células de mieloma para formar hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo. Las células resultantes se plaquean por dilución en serie y se realiza el ensayo de producción de anticuerpos que se unen específicamente al antígeno de interés (y que no se unen a antígenos no relacionados). A continuación se cultivan los hibridomas que secretan el anticuerpo monoclonal (mAb) seleccionado in vitro (por ejemplo, en frascos de cultivo tisular o reactores de fibras huecas), o in vivo (como ascitis en ratones).

Como una alternativa al uso de de hibridomas, el anticuerpo se puede producir en una línea celular tal como una línea de células CHO, como se describe en las patentes de Estados Unidos nº 5.545.403; 5.545.405 y 5.998.144. En resumen, la línea celular se transfecta con vectores capaces de expresar una cadena ligera y una cadena pesada, respectivamente. Transfectando las dos proteínas en vectores separados, pueden producirse anticuerpos quiméricos. Otra ventaja es la glicosilación correcta del anticuerpo.

Los anticuerpos monoclonales contra CD40 son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las secciones dedicadas a antígenos de células B en McMichael, ed. (1987; 1989). Leukocyte Typing III and IV (Oxford University Press, Nueva York); Patentes de EEUU Nº 5.674.492; 5.874.082; 5.677.165; 6.056.959; documento WO 00/63395; documentos de Publicación Internacional Nº WO 02/28905 y WO 02/28904; Gordon y col. (1988) J. Immunol. 140: 1425; Valle y col. (1989) Eur. J. Immunol. 19: 1463; Clark y col. (1986) PNAS 83: 4494; Paulie y col. (1989) J. Immunol. 142: 590; Gordon y col. (1987) Eur. J. Immunol. 17: 1535; Jabara y col. (1990) J. Exp. Med. 172: 1861; Zhang y col. (1991) J. Immunol. 146: 1836; Gascan y col. (1991) J. Immunol. 147: 8; Banchereau y col. (1991) Clin. Immunol. Spectrum 3: 8; y Banchereau y col. (1991) Science 251: 70. Son de particular interés para la presente invención los anticuerpos anti CD40 antagonistas dados a conocer en el presente documento que comparten las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos anteriormente.

Además, la expresión “anticuerpo anti CD40” según se utiliza en el presente documento abarca anticuerpos quiméricos anti CD40; tales anticuerpos anti CD40 quiméricos para uso en la invención tienen las características de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos en el presente documento. Por anticuerpos “quiméricos” se entiende que de más preferencia se obtienen usando técnicas de ácido desoxirribonucleico recombinante y que comprenden tanto componentes humanos (incluidas especies inmunológicamente “relacionadas”, por ejemplo, chimpancé) como no humanos. Rituxan® es un ejemplo de un anticuerpo quimérico con una región variable murina y una región constante humana. Para los fines de la presente invención, la región constante del anticuerpo quimérico es de más preferencia sustancialmente idéntica a la región constante de un anticuerpo natural humano; la región variable del anticuerpo quimérico de más preferencia se obtiene de una fuente no humana y tiene la especificidad antigénica deseada para el antígeno CD40 de superficie celular. La fuente no humana puede ser cualquier fuente de vertebrado que pueda usarse para generar anticuerpos contra un antígeno CD40 humano de superficie celular o material que comprenda un antígeno CD40 humano de superficie celular. Tales fuentes no humanas incluyen, pero no se limitan a, roedores (por ejemplo, conejo, rata, ratón, etc.; véase, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 4.816.567, incorporada a esta invención como referencia) y primates no humanos (por ejemplo, mono del viejo mundo, simio, etc.; véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.750.105 y 5.756.096). Según se usa en el presente documento, la frase “inmunológicamente activo” cuando se usa en referencia a anticuerpos anti CD40 quiméricos significa un anticuerpo quimérico que se une a CD40 humano.

Anticuerpos anti-CD40 humanizados representan anticuerpos anti-CD40 adicionales adecuados para uso en la invención. Por “humanizado” se entienden formas de anticuerpos anti CD40 que contienen una secuencia mínima derivada de secuencias de inmunoglobulinas no humanas. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que están reemplazados residuos de una región hipervariable (también conocida como región determinante de complementariedad o CDR) del receptor por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. La expresión “región determinante de complementariedad” se refiere a las secuencias de aminoácidos que juntas definen la afinidad y especificidad de unión de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina nativa. Véase, por ejemplo, Chothia y col. (1987) J. Mol. Biol.

196: 901-917; Kabat y col. (1991) U.S. Dept of Health and Human Services, Publicación NIH Nº 91-3242). La expresión “región constante” se refiere a la parte de la molécula de anticuerpo que confiere funciones de efector. En trabajos anteriores dirigidos a la producción de anticuerpos no inmunogénicos para uso en terapia de enfermedades humanas, se sustituyeron regiones constantes de ratón por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de los anticuerpos humanizados del sujeto se obtuvieron de inmunoglobulinas humanas. Sin embargo, estos anticuerpos humanizados aún provocaron una respuesta inmune no deseada y potencialmente peligrosa en seres humanos y hubo pérdida de afinidad. Los anticuerpos anti CD40 humanizados para uso en la presente invención tienen características de unión similares a las exhibidas por los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos en el presente documento.

La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann y col. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen y col. (1988) Science 239: 1534-1536), sustituyendo secuencias de un anticuerpo humano por las correspondientes CDR o secuencias CDR de roedores o roedores mutantes. Véase también las Patentes de EEUU Nº 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. En algunos casos, los residuos dentro de las regiones marco de una o más regiones variables de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes residuos no humanos (véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; y 6.180.370). Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para refinar más el rendimiento del anticuerpo (por ejemplo, para obtener la afinidad deseada). En general, en anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en el que todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones y col. (1986) Nature 331: 522-525; Riechmann y col. (1988) Nature 332: 323-329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596. Por consiguiente, tales anticuerpos “humanizados” pueden incluir anticuerpos en los que sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos del marco están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Véase también la Patente de EEUU Nº 6.180.370, y el documento de Publicación Internacional WO 01/27160, en los que se dan a conocer anticuerpos humanizados y técnicas para producir anticuerpos humanizados que tienen mejor afinidad para un antígeno predeterminado.

También están abarcados por el término anticuerpos anti CD40 los anticuerpos anti CD40 xenogénicos o modificados producidos en un huésped mamífero no humano, más particularmente un ratón transgénico, caracterizados por loci de inmunoglobulina (Ig) endógena inactivados. En tales animales transgénicos, los genes endógenos competentes para la expresión de las subunidades ligera y pesada de las inmunoglobulinas del huésped se convierten en no funcionales y se sustituyen con los loci análogos de inmunoglobulina humana. Estos animales transgénicos producen anticuerpos humanos en ausencia sustancial de subunidades ligera o pesada de inmunoglobulina del huésped. Véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.877.397 y

5.939.598.

De preferencia, los anticuerpos totalmente humanos contra CD40 se obtienen inmunizando ratones transgénicos. Uno de tales ratones se obtiene usando tecnología XenoMouse® (Abgenix; Fremont, California), y se da a conocer en las Patentes de EEUU Nº 6.075.181, 6.091.001 y 6.114.598. Para producir los anticuerpos que se dan a conocer en el presente documento, se inmunizaron ratones transgénicos para el locus de cadena pesada de IgG1 humana y el locus de cadena ligera κ humana con células Sf9 que expresan CD40 humano. Los ratones también pueden ser transgénicos para otros isotipos. Los anticuerpos totalmente humanos útiles en los procedimientos de la presente invención se caracterizan por tener propiedades de unión similares a las exhibidas por los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos en el presente documento.

Los fragmentos de los anticuerpos anti CD40 son adecuados para uso en la invención siempre que retengan la afinidad deseada del anticuerpo de longitud total. Por consiguiente, un fragmento de un anticuerpo anti CD40 retendrá la capacidad para unirse al antígeno CD40 de superficie de las células B. Tales fragmentos se caracterizan por tener propiedades similares al anticuerpo anti CD40 antagonista de longitud total correspondiente, es decir, los fragmentos se unirán específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana, y están exentos de actividad agonista significativa pero exhiben actividad antagonista cuando se unen a un antígeno CD40 en una célula humana que expresa CD40. En el presente documento se hace referencia a estos fragmentos como fragmentos “que se unen al antígeno”.

Los fragmentos de un anticuerpo que se unen al antígeno adecuados comprenden una parte de un anticuerpo de longitud total, por lo general la región de unión al antígeno

o una de sus regiones variables. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, F(ab’)2 y Fv y moléculas de anticuerpos de cadena simple. Por “Fab” se entiende un fragmento monovalente de una inmunoglobulina que se une al antígeno que está compuesto por la cadena ligera y parte de la cadena pesada. Por F(ab’)2 se entiende un fragmento bivalente de una inmunoglobulina que se une al antígeno que contiene ambas cadenas ligeras y parte de ambas cadenas pesadas. Por “Fv de cadena simple” o fragmentos “sFv” del anticuerpo se entiende fragmentos que comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica simple. Véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030 y 5.856.456. Por lo general, el polipéptido Fv comprende además un conector de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun (1994) en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg and Moore (Springer-Verlag, Nueva York), páginas 269-315. Los fragmentos de los anticuerpos anti CD40 antagonistas que se unen al antígeno dados a conocer en el presente documento también pueden conjugarse a una citotoxina para producir la lisis de las células cancerosas diana, como se describe a continuación en el presente documento.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos generadas usando las técnicas descritas en, por ejemplo, McCafferty y col. (1990) Nature 348: 552-554 (1990) y en la Patente de EEUU Nº 5.514.548. Clackson y col. (1991) Nature 352: 624-628 y Marks y col. (1991) J. Mol. Biol.

222: 581-597 describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (del orden de nM) por mezcla aleatoria de cadenas (Marks y col. (1992) Biol/Technology 10:779-783), así como por infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse y col. (1993) Nucleic, Acids Res. 21: 2265-2266). Por consiguiente, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtuvieron por digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto y col. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) y Brennan y col. (1985) Science 229: 81). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente por medio de células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de la biblioteca de anticuerpos de fagos analizada anteriormente. Como alternativa, los fragmentos Fab’-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y pueden acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter y col. (1992) Bio/Technology 10: 163-167). Según otro enfoque, los fragmentos F(ab’)2 pueden aislarse directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Otra técnica para la producción de fragmentos de anticuerpos resultará evidente para el experto en la técnica.

Los anticuerpos anti CD40 antagonistas útiles en la presente invención incluyen los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR 12.12 dados a conocer en el presente documento así como los anticuerpos que difieren de estos anticuerpos pero que retienen las CDR; y los anticuerpos con una o más adicion(es), delecion(es) o sustitución(es), en los que la actividad antagonista se mide por inhibición de la proliferación y/o diferenciación de las células B. La invención también abarca los anticuerpos anti CD40 antagonistas desinmunizados, que pueden producirse como se describe en, por ejemplo, los documentos de Publicación Internacional Nº WO 98/52976 y WO 0034317. De esta manera, los residuos dentro de los anticuerpos anti CD40 antagonistas de la invención se modifican para convertir a los anticuerpos en no inmunogénicos o menos inmunogénicos para los seres humanos manteniendo al mismo tiempo su actividad antagonista hacia las células humanas que expresan CD40, en los que tal actividad se mide por medio de los ensayos señalados en otra parte en el presente documento. También se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones las proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo anti CD40 antagonista de la invención, o uno de sus fragmentos, cuyas proteínas de fusión pueden sintetizarse o expresarse a partir de vectores de polinucleótidos correspondientes, como se conoce en la técnica. Tales proteínas de fusión se describen con referencia a la conjugación de anticuerpos como se señala a continuación.

Los anticuerpos de la presente invención pueden tener variaciones de secuencia producidas usando los procedimientos descritos en, por ejemplo, los documentos de Publicación de Patente Nº EP 0 983 303 A1, WO 00/34317 y WO 98/52976. Por ejemplo, se ha mostrado que las secuencias dentro de la CDR pueden provocar que un anticuerpo se una a MAC Clase II y desencadenar una respuesta de células T ayudantes no deseada. Una sustitución conservadora puede permitir que el anticuerpo retenga la actividad de unión y aún pierda su capacidad para desencadenar una respuesta de células T no deseada. Cualquiera de tales sustituciones conservadoras o no conservadoras puede realizarse usando procedimientos reconocidos en la técnica, tales como los señalados en otra parte en el presente documento, y los anticuerpos resultantes se encontrarán dentro del alcance de la invención. Los anticuerpos variantes pueden probarse de manera rutinaria para verificar su actividad antagonista, afinidad y especificidad usando los procedimientos descritos en el presente documento.

Un anticuerpo producido por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, o cualquier otro procedimiento no dado a conocer en el presente documento, se encontrará dentro del alcance de esta descripción si posee al menos una de las siguientes actividades biológicas: inhibición de la secreción de inmunoglobulinas por las células B periféricas humanas normales estimuladas por células T; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de células B periféricas humanas normales estimuladas por células T Jurkat; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de células B periféricas humanas normales estimuladas por células que expresan CD40L o ligando de CD40 soluble; e inhibición de la proliferación de células B malignas humanas como se señala a continuación. Véanse los ensayos descritos en Schultze y col. (1998) Proc. Natl. Acad Sci. USA 92: 8200-8204; Denton y col. (1998) Pediatr. transplant. 2: 6-15; Evans y col. (2000) J. Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Lederman y col. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3: 77-86; Coligan y col. (1991) Current Protocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom y col. (1993) Immunology 79: 439-444; y Patentes de EEUU Nº 5.674.492 y 5.847.082.

Un ensayo representativo para detectar anticuerpos anti CD40 antagonistas específicos para los epítopos del antígeno CD40 identificado en el presente documento es un “ensayo de unión competitiva”. Los ensayos de unión competitiva son ensayos serológicos en los que el desconocido se detecta y cuantifica por su capacidad para inhibir la unión de un ligando conocido marcado a su anticuerpo específico. Esto también se conoce como un ensayo de inhibición competitiva. En un ensayo de unión competitiva representativo, se precipita el polipéptido CD40 marcado por medio de anticuerpos candidato en una muestra, por ejemplo, en combinación con anticuerpos monoclonales surgidos contra uno o más epítopos de los anticuerpos monoclonales de la invención. Los anticuerpos anti CD40 que reaccionan específicamente con un epítopo de interés pueden identificarse seleccionando una serie de anticuerpos preparados contra una proteína CD40 o fragmento de la proteína que comprende el epítopo particular de la proteína CD40 de interés. Por ejemplo, para CD40 humano, los epítopos de interés incluyen epítopos que comprenden residuos de aminoácido lineales o no lineales de la isoforma corta del CD40 humano (véase GenBank Nº de acceso NP 690593) presentada en la Figura 4B (SEC ID Nº 10), codificada por la secuencia presentada en la Figura 4A (SEC ID Nº 9; véase también GenBank Nº de acceso M 152854), o de la isoforma larga de CD40 humano (véase GenBank Nº de acceso CAA43045 y NP 001241) presentada en la Figura 4D (SEC ID Nº 12), codificada por la secuencia presentada en la Figura 4C (SEC ID Nº 11; véase GenBank Nº de acceso X60592 y MN 001250). Como alternativa, podrían usarse ensayos de unión competitiva con anticuerpos anti CD40 antagonistas adecuados identificados anteriormente para seleccionar los anticuerpos monoclonales comparables a los anticuerpos identificados anteriormente.

Los anticuerpos utilizados en tales inmunoensayos pueden estar marcados o no marcados. Los anticuerpos no marcados pueden utilizarse en aglutinación; los anticuerpos marcados pueden utilizarse en una amplia diversidad de ensayos, usando una amplia diversidad de marcadores. La detección de la formación de un complejo antígeno-anticuerpo entre un anticuerpo anti CD40 y un epítopo de interés puede facilitarse fijando una sustancia detectable al anticuerpo. Los medios de detección adecuados incluyen el uso de marcadores como radionúclidos, enzimas, coenzimas, fluorescentes, quimioluminiscentes, cromógenos, complejos enzima sustrato o cofactores, inhibidores de enzimas, complejos de grupos prostéticos, radicales libres, partículas, colorantes y similares. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa del rábano picante, fosfatasa alcalina, β-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes apropiados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material fluorescente es el luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de material radiactivos adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. Tales reactivos marcados pueden utilizarse en una diversidad de ensayos conocidos, tales como radioinmunoensayos, inmunoenzayos enzimáticos, por ejemplo, ELISA inmunoensayos fluorescentes y similares. Véase, por ejemplo, Patentes de EEUU Nº 3.766.162; 3.791.932; 3.817.837; y 4.233.402.

Cualquiera de los anticuerpos anti CD40 antagonistas o sus fragmentos de anticuerpos descritos previamente pueden conjugarse antes del uso en la presente invención. Los procedimientos para producir anticuerpos conjugados son conocidos en la técnica. Por consiguiente, el anticuerpo anti CD40 puede marcarse usando una marcación indirecta o un enfoque de marcación indirecta. Por “marcación indirecta” o “enfoque de marcación indirecta” se entiende que un agente quelante se une covalentemente a un anticuerpo y se inserta al menos un radionúclido en el agente quelante. Véase, por ejemplo, los agentes quelantes y radionúclidos descritos en Srivagtava and Mease (1991) Nucl. Med. Bio. 18: 589-603. Los marcadores adecuados incluyen fluoróforos, cromóforos, átomos radiactivos (especialmente 32P y 125I), reactivos densos a electrones, enzimas y ligandos que tienen parejas de unión específicas. Las enzimas se detectan normalmente por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa del rábano picante se detecta usualmente mediante su capacidad para convertir 3,3’,5,5’tetrametilbenzidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. “Pareja de unión específica” se refiere a una proteína capaz de unirse a una molécula de ligando con alta especificidad, como por ejemplo en el caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para éste. Otras parejas de unión específica incluyen biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, y las numerosas parejas de receptor-ligando conocidas en la técnica. Debería entenderse que la descripción anterior no pretende categorizar los diversos marcadores en diferentes clases, ya que el mismo marcador puede servir en varios modos diferentes. Por ejemplo, 125I puede servir como un marcador radioactivo o como un reactivo denso en electrones. HRP puede servir como enzima o como antígeno para un mAb. Además, pueden combinarse diversos marcadores para el efecto deseado. Por ejemplo, los mAb y la avidina también requieren marcadores en la práctica de esta invención: por consiguiente, puede marcarse un mAb con biotina, y detectarse su presencia con avidina marcada con 125I, o con un mAb antibiotina marcado con HRP. Otras permutaciones y posibilidades serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, y se consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente invención.

Como alternativa, el anticuerpo anti CD40 puede marcarse usando “marcación directa” o un “enfoque de marcación directa”, en el que un radionúclido se fija covalentemente a un anticuerpo (típicamente a través de un residuo de aminoácido). Los radionúclidos de preferencia se proporcionan en Srivagtava and Mease (1991) supra. El enfoque de marcación indirecta es particularmente de preferencia. Véase también, por ejemplo, los documentos de Publicación Internacional Nº WO 00/52031 y WO 00/52473, en los que se usa un conector para fijar el marcador radiactivo a los anticuerpos; y las formas marcadas de anticuerpos anti CD40 descritas en la Patente de EEUU Nº

6.015.542.

Además, un anticuerpo (o su fragmento) puede conjugarse a un resto terapéutico como una citotoxina, un agente terapéutico, iones metálicos radiactivos o radioisótopos. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las células. Algunos ejemplos incluyen taxol, citochalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y sus análogos y homólogos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, fludarabina, 2clorodeoxiadenosina, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5fluorouracildecarbacina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) Los radioisótopos incluyen, pero no se limitan a, I-131, I-123, I125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 y similares. Los conjugados de la invención pueden utilizarse para modificar una respuesta biológica determinada; no debe entenderse que el resto del fármaco esté limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto del fármaco puede ser una proteína o un polipéptido que tenga una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina de difteria; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, interferón alfa, interferón beta, factor de crecimiento de los nervios, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, activador tisular del plasminógeno, o, modificadores de respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina 1 (“IL-1”), interleucina 2 (“IL-2”), interleucina-6 (“IL-6”), factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (“GM-CSF”), factor estimulador de colonias de granulocitos (“G-CSF”) u otros factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugar tales restos terapéuticos a anticuerpos son bien conocidas. Véase, por ejemplo, Amon y col. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld y col. (Alan R. Liss, Inc.), páginas 243-256; ed. Hellstrom y col. (1987) "Antibodies for Drug Delivery," en Controlled Drug Delivery, ed. Robinson y col. (2ª ed; Marcel Dekker, Inc.), páginas 623-653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies ’84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera y col. páginas 475-506 (Editrice Kurtis, Milán, Italia, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin y col. (Academic Press, Nueva York, 1985), páginas 303-316; y Thorpe y col. (1982) Immunol. Rev. 62: 119-158.

Como alternativa, un anticuerpo puede conjugarse a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpos como se describe en la Patente de EEUU Nº

4.676.980. Además, pueden utilizarse conectores entre los marcadores y los anticuerpos de la invención (véase Patente de EEUU Nº 4.831.175). Los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno pueden marcarse directamente con yodo, indio, itrio radiactivos o con otras partículas radiactivas conocidas en la técnica (Patente de EEUU Nº 5.595.721). El tratamiento puede estar constituido por una combinación de tratamiento con anticuerpos conjugados y no conjugados administrados en forma simultánea o consecutiva (documentos WO 00/52031 y WO 00/52473). Variantes de anticuerpos anti CD40 antagonistas

En la presente invención pueden utilizarse variantes de los anticuerpos anti CD40 antagonistas biológicamente activas adecuadas. Tales variantes retendrán las propiedades de unión deseadas del anticuerpo anti CD40 antagonista original. Por lo general, en la técnica están disponibles procedimientos para producir variantes de anticuerpos.

Por ejemplo, pueden prepararse variantes de secuencias de aminoácidos de un

anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12 descritos en el presente documento, por medio de mutaciones en la secuencia de ADN clonada que codifica el anticuerpo de interés. Los procedimientos para mutagénesis y alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 488-492; Kunkel y col. (1987) Methods Enzymol. 154: 367-382; Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York); Patente de EEUU Nº 4.873.192; y las referencias citadas en la misma. En el modelo de Dayhoff y col. (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) puede encontrarse orientación para sustituciones adecuadas de aminoácidos que no afectan la actividad biológica del polipéptido de interés. Las sustituciones conservadoras, tales como los intercambios de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares, pueden ser de preferencia. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen, pero no se limitan a, Gly⇔Ala, Val⇔Ile⇔Leu, Asp⇔Glu, Lys⇔Arg, Asn⇔Gln y Phe⇔Trpo⇔Tyr.

En la construcción de variantes del polipéptido de interés del anticuerpo anti CD40 antagonista, las modificaciones se realizan de manera tal que las variantes sigan teniendo la actividad deseada, es decir, afinidad de unión similar y sean capaces de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula humana y estén exentas de actividad agonista significativa pero que exhiban actividad antagonista cuando se unen a un antígeno CD40 en una célula humana que expresa CD40. Obviamente, cualquier mutación realizada en el ADN que codifica la variante polipéptido no deben colocar a la secuencia fuera del marco de lectura y de preferencia no creará regiones complementarias que podrían producir estructura de ARNm secundaria. Véase Publicación de Solicitud de Patente Nº 75.444.

Además, la región constante de un anticuerpo anti CD40 antagonista puede mutarse para alterar la función efectora en una serie de formas. Por ejemplo, véase la Patente de EEUU Nº 6.737.056B1 y la Publicación de Solicitud de Patente Nº 2004/0132101A1, que dan a conocer mutaciones de Fc que optimizan la unión del anticuerpo a los receptores de Fc.

De preferencia, las variantes de un anticuerpo anti CD40 antagonista de referencia tienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos 70% o 75% de homología de secuencia, de preferencia al menos 80% u 85% de homología de secuencia, de más preferencia al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ó 95% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos para la molécula del anticuerpo anti CD40 antagonista de referencia, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12 descritos en el presente documento, o con una parte más corta de una molécula de anticuerpo de referencia. De más preferencia, las moléculas comparten al menos 96%, 97%, 98% ó 99% de homología de secuencia. Para los fines de la presente invención, el porcentaje de homología de secuencia se determina usando el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con parámetros de penalización de hueco abierto de 12 y penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de

62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se enseña en Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489. Una variante puede, por ejemplo, diferir del anticuerpo anti CD40 antagonista de referencia en tan pocos como 1 a 15 residuos de aminoácidos, tan pocos como 1 a 10 residuos de aminoácidos, tal como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o incluso 1 residuo de aminoácido.

Con respecto a la alineación óptima de dos secuencias de aminoácidos, el segmento contiguo de la secuencia de aminoácidos variante puede tener residuos de aminoácidos adicionales o residuos de aminoácidos delecionados con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia. El segmento contiguo utilizado para la comparación con la secuencia de aminoácidos de referencia incluirá al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos y puede tener 30, 40, 50 o más residuos de aminoácidos. Pueden hacerse correcciones para homología de secuencia asociadas con huecos o sustituciones conservadoras de residuos (véase el algoritmo de búsqueda de Smith-Waterman).

La estructura química exacta de un polipéptido capaz de unirse específicamente a CD40 y que retiene la actividad antagonista, en particular cuando se une al antígeno CD40 en células B malignas, depende de una serie de factores. Como en la molécula están presentes grupos amino y carboxilo ionizables, puede obtenerse un polipéptido particular como una sal ácida o básica, o en forma neutra. Todas las preparaciones que retienen su actividad biológica cuando se colocan en condiciones ambientales adecuadas están incluidas en la definición de anticuerpos anti CD40 antagonistas en el presente documento. Además, puede aumentarse la secuencia de aminoácidos principal del polipéptido por derivatización con restos de azúcar (glicosilación) o por otras moléculas complementarias tales como lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. También puede aumentarse por conjugación con sacáridos. Ciertos aspectos de tal aumento se realizan a través de sistemas de procesamiento postraduccionales del huésped productor; otras de tales modificaciones pueden introducirse in vitro. En cualquier caso, tales modificaciones están incluidas en la definición de un anticuerpo anti CD40 usada en el presente documento siempre que no se destruyan las propiedades de antagonista del anticuerpo anti CD40. Se espera que tales modificaciones puedan afectar cuantitativamente o cualitativamente la actividad, ya sea aumentando o disminuyendo la actividad del polipéptido, en los diversos ensayos. Además, pueden modificarse residuos de aminoácidos individuales en la cadena por oxidación, reducción u otra derivatización, y el polipéptido puede escindirse para obtener fragmentos que retengan la actividad. Tales alteraciones que no destruyen la actividad antagonista no retiran a la secuencia del polipéptido de la definición de anticuerpos anti CD40 de interés según se utiliza en el presente documento.

La técnica proporciona orientación sustancial con respecto a la preparación y al uso de las variantes de polipéptidos. En la preparación de las variantes de anticuerpos anti CD40, un experto en la técnica puede determinar fácilmente qué modificaciones a la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de la proteína nativa darán como resultado una variante que sea adecuada para uso como un componente terapéuticamente activo de una composición farmacéutica utilizada en los procedimientos descritos en este documento. Procedimientos de terapia usando los anticuerpos anti CD40 antagonistas de la invención

Los procedimientos dados a conocer en el presente documento están dirigidos al uso de anticuerpos anti CD40 antagonistas para tratar sujetos (es decir, pacientes) que tienen leucemia linfocítica crónica (CLL), en donde las células de este cáncer expresan el antígeno CD40. Por “células de leucemia linfocítica crónica que expresan CD40” se entiende las células de CLL que expresan el antígeno CD40. El tratamiento exitoso de CLL depende de cómo de avanzado esté el cáncer en el momento del diagnóstico, y de si el sujeto ha sufrido o sufrirá otros procedimientos de terapia en combinación con administración de anticuerpo anti-CD40. Los procedimientos para detectar la expresión de CD40 en células son muy conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, técnicas de PCR, inmunohistoquímica, citometría de flujo, transferencia Western, ELISA y similares.

Se puede usar una pluralidad de criterios para clasificar el grado de CLL. Los procedimientos descritos en esta invención se pueden usar para tratar CLL casificado de acuerdo con el sistema de clasificación de Rai-Binet. En el sistema de Rai, hay cinco grados: grado 0 en el que sólo está presente la linfocitosis; grado I en el que está presente lifadenopatía; grado II en el que están presentes esplenomegalia, linfadenopatía

o ambas; grado III en el que están presentes anemia, organomegalia o ambas (se define progresión por pérdida de peso, fatiga, fiebre, organomegalia masiva, y un rápido aumento del recuento de lifocitos); y grado IV en el que están presentes anemia, trombocitopenia, organomegalia o una combinación de los mismos. Con el sistema de clasificación de Binet hay sólo tres categorías: grado A en el que está presente linfocitosis y se agrandan menos de tres nódulos linfáticos (este grado está incluido en todos los pacientes de grado 0 según Rai, la mitad de pacientes en grado 1 según Rai, y una tercera parte de pacientes en grado II según Rai); grado B, en el que están implicados tres o más nódulos linfáticos; y grado C en el que están presentes anemia o trombocitopenia, o ambos. El sistema de clasificación de Rai-Binet se puede combinar con medidas de mutación de los genes de inmunoglobulina para proporcionar una caracterización más exacta del grado de la enfermedad. La presencia de genes de inmunoglobulina mutados se correlaciona con mejor pronóstico.

Los procedimientos de la presente divulgación son aplicables al tratamiento de CLL clasificada de acuerdo con cualquiera de los anteriores criterios. Justamente al poder usarse estos criterios para caracterizar los grados progresivos de la enfermedad, estos mismos criterios, es decir, anemia, linfadenopatía, organomegalia, trombocitopenia y mutación de genes de inmunoglobulina, se pueden controlar para valora la eficacia del tratamiento.

En el presente documento se define “tratamiento” como la aplicación o administración de un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno a un paciente, o la aplicación o administración de un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno a un tejido aislado o línea celular de un sujeto, en el que el sujeto tiene CLL, un síntoma asociado con CLL, o una predisposición hacia el desarrollo de CLL, siendo el objetivo curar, sanar, calmar, aliviar, alterar, remediar, mejorar o afectar CLL, cualquier síntoma asociado a CLL o la predisposición al desarrollo de CLL. Por “tratamiento” también se entiende la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno a un sujeto, o la aplicación o administración de una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno a un tejido aislado o una línea celular de un sujeto, que tiene CLL, un síntoma asociado con CLL o una predisposición al desarrollo de CLL, siendo el objetivo curar, sanar, calmar, aliviar, alterar, remediar, mejorar o afectara CLL, los síntomas de CLL o la predisposición al desarrollo de CLL.

Se entiende por “actividad antitumoral” una reducción en la tasa de proliferación o acumulación de células malignas que expresan CD40, y por consiguiente un descenso en la tasa de crecimiento de un tumor existente o en un tumor que surge durante la terapia, y/o la destrucción de células neoplásicas (tumor) existentes o células neoplásicas formadas nuevas, y por consiguiente un descenso en el tamaño global de un tumor durante la terapia. La terapia con al menos un anticuerpo anti CD40 (o su fragmento de unión al antígeno) provoca una respuesta fisiológica que es ventajosa con respecto al tratamiento de CLL en un humano, donde la enfermedad comprende células que expresan antígeno CD40. Se reconoce que los procedimientos descritos en este documento pueden ser útiles en la prevención de otras consecuencias tumorales de células de CLL que surjan durante la terapia.

De conformidad con los procedimientos descritos en el presente documento, al menos un anticuerpo anti CD40 antagonista (o su fragmento de unión al antígeno) tal como se define en otras partes en el presente documento se utiliza para promover una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento o prevención de CLL. Por “respuesta terapéutica positiva” con respecto al tratamiento del cáncer se entiende una mejora en la enfermedad asociada con la actividad antitumoral de estos anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno, y/o una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad. Es decir, puede observarse un efecto antiproliferativo, prevención de otras consecuencias del tumor, una reducción del tamaño del tumor, una reducción en la cantidad de células cancerosas y/o una disminución en uno o más síntomas mediados por la estimulación de las células que expresan CD40. Por consiguiente, por ejemplo, una mejora de la enfermedad puede ser caracterizada como una respuesta completa. Por “respuesta completa” se entiende la ausencia de enfermedad clínicamente detectable con normalización de cualquier estudio radiográfico, de médula ósea y de líquido cefalorraquídeo (LCR), previamente anormal. Tal respuesta debe persistir durante al menos un mes después del tratamiento según los procedimientos descritos en este documento. Como alternativa, una mejora en la enfermedad puede clasificarse como una respuesta parcial. Por “respuesta parcial” se entiende una disminución de al menos el 50 % en todas las cargas tumorales que pueden medirse (es decir, la cantidad de células tumorales presentes en el sujeto) en ausencia de nuevas lesiones y que persiste durante al menos un mes. Tal respuesta es aplicable sólo a los tumores que pueden medirse.

La respuesta del tumor puede evaluarse para cambios en la morfología del tumor (es decir, carga general del tumor, tamaño del tumor y similares) utilizando técnicas de detección tales como la exploración de imágenes de resonancia magnética (RM), imágenes de rayos x, exploración por tomografía computerizada (TC), citometría de flujo

o análisis de clasificador de células activado por fluorescencia (FACS), imágenes bioluminiscentes, por ejemplo, imágenes con luciferasa, imágenes de gammagrafía ósea y recogida de muestras de biopsias de tumor incluyendo la aspiración de médula ósea (AMO). Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el sujeto que se somete a terapia con el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede experimentar el efecto ventajoso de una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad.

Por “dosis o cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad eficaz” se entiende una cantidad de anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al anticuerpo que, cuando se administra da lugar a una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un sujeto con CLL. En algunas realizaciones de la invención, una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti CD40 o su fragmento está en el intervalo desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg, o desde aproximadamente 7 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. Se reconoce que el procedimiento de tratamiento puede comprender una única administración de una dosis terapéuticamente eficaz o múltiples administraciones de una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno.

Otra realización de la divulgación es el uso de anticuerpos anti CD40 antagonistas para el control de diagnóstico de los niveles proteicos en el tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse por el acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa del rábano picante, la fosfatasa alcalina, la βgalactosidasa o la acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material fluorescente incluye el luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen la luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I 35S o 3H.

Los anticuerpos anti CD40 antagonistas se pueden usar en combinación con quimioterapéuticos, sólos o en combinación con cirugía o procedimientos procedimientos quirúrgicos (por ejemplo, esplenectomía, hepatectomía, linfadenectomía, leucoforesis, transplante de médula ósea, y similares); terapia de radiación; quimioterapia, otra terapia anticancerosa con anticuerpos monoclonales, esteroides, terapia con IL-2 e interferonaalfa para el tratamiento de CLL. De esta manera , los anticuerpos anti CD40 antagonistas descritos en el presente documento, o sus fragmentos de unión al antígeno, se administran en combinación con al menos otra terapia contra el cáncer, incluidas, pero no limitadas a, cirugía, terapia con radiación, quimioterapia, otra terapia anticancerosa con anticuerpos monoclonales (por ejemplo, alemtuzumab (Campath®), que se dirige al antígeno de superficie de célula CD52 en células B malignas; rituximab (Rituxan®), que se dirige al antígeno de superficie de células CD20 en células B malignas, u otro anticuerpo anti-CD20 terapéutico, por ejemplo, el anticuerpo HuMax-CD20 totalmente humano, R1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), o anticuerpo anti CD20 dirigido al antígeno CD23 en células B malignas); terapia con interferona-alfa, terapia con interleuquina-2 (IL-2), terapia con IL2, IL-15 o IL-21, o terapia con esteroides, en las que la terapia anticancerosa adicional se administra antes de, durante, o posteriormente a la terapia con el anticuerpo anti CD40. Por consiguiente, cuando las terapias combinadas comprenden la administración de un anticuerpo anti CD40 o su fragmento de unión al antígeno en combinación con la administración de otro agente terapéutico, como con quimioterapia, terapia de radiación, o terapia con interferona-alfa, IL-2 y/o esteroides, los procedimientos descritos en este documento abarcan la coadministración, usando formulaciones separadas de una formulación farmacéutica única, y la administración consecutiva en cualquier orden. Cuando los procedimientos descritos en este documento comprenden regímenes terapéuticos combinados, estas terapias pueden darse de manera simultánea, es decir, el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno se administra simultáneamente o dentro del mismo período de tiempo que la otra terapia contra el cáncer (es decir, las terapias tienen lugar simultáneamente, pero el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno no se administra precisamente en el mismo momento que la otra terapia contra el cáncer). Como alternativa, el anticuerpo anti CD40 de la presente invención o su fragmento de unión al antígeno puede también administrarse antes de, o posteriormente a la otra terapia contra el cáncer. La administración secuencial de las diferentes terapias contra el cáncer puede realizarse independientemente de que el sujeto tratado responda al primer curso de terapia para disminuir la posibilidad de remisión o recaída. Cuando las terapias combinadas comprenden la administración del anticuerpo anti CD40 o su fragmento de unión al antígeno con administración de un agente citotóxico, preferiblemente el anticuerpo anti CD40 o su fragmento de unión al antígeno, se administra antes de administrar el agente citotóxico.

En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos anti CD40 antagonistas descritos en este documento, o sus fragmentos de unión al antígeno, se administran en combinación con quimioterapia, y opcionalmente en combinación con transplante autólogo de médula ósea, en las que el anticuerpo y el(los) agente(s) quimioterapéuticos pueden administrarse de manera secuencial, en cualquier orden, o simultáneamente (es decir, de manera simultánea o dentro del mismo período de tiempo). Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, fludarabina, clorambucilo, vincristina, pentostatina, 2-clorodeoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida, doxorubicina y prednisona.

Por consiguiente, por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CH1R-5.9, o su fragmento de unión al antígeno se administra en combinación con fludarabina. En una de tales realizaciones, el anticuerpo anti CD40 antagonista se administra antes de la administración de fludarabina. En realizaciones alternativas, el anticuerpo anti CD40 antagonista se administra después del tratamiento con fludarabina. En aún otras realizaciones, la fludarabina se administra de manera simultánea con el anticuerpo anti CD40 antagonista.

En otras realizaciones de la divulgación, se administra clorambucilo, un agente alquilante, en combinación con un anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en este documento, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno. En una de tales formas de realización, el anticuerpo anti CD40 antagonista se administra antes de la administración del clorambucilo. En realizaciones alternativas, el anticuerpo anti CD40 antagonista se administra después del tratamiento con clorambucilo. En aún otras realizaciones, el clorambucilo se administra de manera simultánea con el anticuerpo anti CD40 antagonista.

En aún otras realizaciones, pueden combinarse regímenes que contienen antraciclina tales como CAP (ciclofosfamida, doxorubicina más prednisona) y CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona más doxorubicina) con la administración de un anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en este documento, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno. En una de tales realizaciones, el anticuerpo anti CD40 antagonista se administra antes de la administración de los regímenes que contienen antraciclina. En otras realizaciones, el anticuerpo anti CD40 antagonista se administra después del tratamiento con regímenes que contienen antraciclina. En aún otras realizaciones, el régimen que contiene antraciclina se administra de manera simultánea con el anticuerpo anti CD40 antagonista.

En realizaciones alternativas, un anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en el presente documento, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, se administra en combinación con alemtuzumab (Campath®; distribuido por Berlex Laboratories, Richmond, California). Alemtuzumab es un anticuerpo monoclonal recombinante humanizado (Campath-1H) que está dirigido al antígeno CD52 expresado en células B malignas. En una de tales realizaciones, el anticuerpo anti CD40 antagonista se administra antes de la administración de alemtuzumab. En otras realizaciones, el anticuerpo anti CD40 antagonista se administra después del tratamiento con alemtuzumab. En aún otras formas de realización, el alemtuzumab se administra de manera simultánea con el anticuerpo anti CD40 antagonista.

En otras realizaciones, los anticuerpos anti CD40 antagonistas descritos en este documento, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, se pueden usar en combinación con otro agente que tenga propiedades anti-angiogénicas, tal como talidomida, o interferona-alfa. Estos últimos agentes pueden ser efectivos cuando un sujeto es resistente a terapia de primera línea. De forma alternativa se pueden administrar los anticuerpos anti-CD40 antagonistas a un sujeto en combinación con quimioterapia de alta dosis, sólos o con transplante autólogo de médula ósea.

En realizaciones alternativas, un anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en este documento, por ejemplo el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, se puede usar en combinación con otros agentes inmunoterapéuticos, de forma reseñable IL-2, IL-2, un agente que se sabe que aumenta la cantidad de células efectoras citolíticas naturales (NK) en los pacientes tratados, puede administrarse antes de, o conjuntamente con, el anticuerpo anti CD40 antagonista de la invención. Esta cantidad aumentada de células NK efectoras puede dar lugar a mayor actividad ADCC del anticuerpo anti CD40 antagonista administrado.

Además, también puede usarse terapia de combinación con dos o más agentes terapéuticos y un anticuerpo anti CD40 descrito en el presente documento para el tratamiento de CLL. Sin estar limitados, los ejemplos incluyen la terapia de combinación triple, en la que dos agentes quimioterapéuticos se administran en combinación con un anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en este documento, y en la que un agente terapéutico y otro anticuerpo monoclonal anticanceroso (por ejemplo, alemtuzumab, rituximab, u otro anticuerpo anti CD20, por ejemplo, el anticuerpo HuMax-CD20 totalmente humano, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), o anticuerpo anti-CD23) se administran en combinación con un anticuerpo anti CD40 antagonista descrito en este documento. Los ejemplos de tales combinaciones incluyen, pero no se limitan a, combinaciones de fludarabina, ciclofosfamida, y el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno; y combinaciones de fludarabina, un anticuerpo anti CD20, por ejemplo, rituximab (Rituxan®; IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California), y el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR 12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno. Formulaciones farmacéuticas y modos de administración

Los anticuerpos anti CD40 antagonistas de esta invención se administran en una concentración que es terapéuticamente eficaz para prevenir o tratar leucemia linfocítica crónica. Para lograr este objetivo, los anticuerpos pueden formularse usando una diversidad de excipientes aceptables conocidos en la técnica. Típicamente, los anticuerpos se administran por medio de inyección, ya sea por vía intravenosa o por vía subcutánea. Los procedimientos para llevar a cabo esta administración son conocidos por los expertos en la técnica. También es posible obtener composiciones que pueden administrarse por vía tópica o por vía oral, o que pueden ser capaces de transmitirse a través de membranas mucosas.

La administración intravenosa se realiza de preferencia por medio de infusión durante un período de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 horas, de más preferencia durante aproximadamente 1 hasta aproximadamente 8 horas, de más preferencia aún durante aproximadamente 2 hasta aproximadamente 7 horas, todavía de más preferencia durante aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 horas, dependiendo del anticuerpo anti CD40 que se administra. La infusión inicial con la composición farmacéutica puede administrarse durante un período de aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 horas con infusiones posteriores administradas de manera más rápida. Las infusiones posteriores pueden administrarse durante un período de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 horas, incluyendo, por ejemplo, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 4 horas, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 horas, o aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2 horas.

Una composición farmacéutica de la invención está formulada para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de posibles vías de administración incluyen la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa (IV), intramuscular (IM), intradérmica, subcutánea (SC), o la infusión), oral y pulmonar (por ejemplo, inhalación), nasal, transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las disoluciones

o suspensiones usadas para aplicaciones parenterales, intradérmicas o subcutáneas pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, disolución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para ajustar la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples fabricados de vidrio o de plástico.

Los anticuerpos anti CD40 se proporcionan típicamente por medio de técnicas convencionales en un tampón farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, disolución salina estéril, agua tamponada estéril, propilenglicol, combinaciones de los anteriores, etc. En Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990) se describen procedimientos para preparar agentes que pueden administrarse por vía parenteral. Véase también, por ejemplo, el documento WO 98/56418, que describe formulaciones farmacéuticas de anticuerpos estabilizadas adecuadas para usar en los procedimientos descritos en el presente documento.

Un experto en la técnica puede determinar fácilmente sin excesiva experimentación la cantidad de al menos un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento a administrar. Los factores que influyen en el modo de administración y la respectiva cantidad de al menos un anticuerpo anti CD40 antagonista (o su fragmento) incluyen, pero se limitan a, la gravedad de la enfermedad, la historia de la enfermedad, y la edad, altura, peso, salud y condición física del individuo que se somete al tratamiento. De manera similar, la cantidad de anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento a administrar dependerá del modo de administración y de si el sujeto se someterá a una monodosis o a dosis múltiples de este agente antitumoral. Por lo general, al aumentar el peso del sujeto sometido al tratamiento, resulta de preferencia una dosis más alta del anticuerpo anti CD40 o su fragmento. La dosis del anticuerpo anti CD40 o su fragmento a administrar está en el intervalo desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, de preferencia en el intervalo de 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg. Por consiguiente, por ejemplo, la dosis puede ser de 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg o 50 mg/kg.

En otra realización de la divulgación, el procedimiento comprende la administración de dosis múltiples de anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento. El procedimiento puede comprender la administración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o más dosis terapéuticamente eficaces de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento. La frecuencia y duración de administración de las dosis múltiples de las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpo anti CD40 o su fragmento pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica sin excesiva experimentación. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo puede incluir un tratamiento único o, de preferencia, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo de preferencia, se trata al sujeto con anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal, una vez por semana durante aproximadamente entre 1 y 10 semanas, de preferencia aproximadamente entre 2 y 8 semanas, de más preferencia aproximadamente entre 3 y 7 semanas, y aún de más preferencia durante aproximadamente 4, 5, ó 6 semanas. El tratamiento puede llevarse a cabo anualmente para prevenir la recaída o tras la indicación de la recaída. También se apreciará que la dosis eficaz de anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno usado para el tratamiento puede aumentar o disminuir en el transcurso de un tratamiento particular. Los cambios en la dosis pueden ser el resultado y pueden resultar evidentes a partir de los resultados de los ensayos de diagnóstico como se describe en el presente documento. Por consiguiente, en una forma de realización, el régimen de dosificación incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti CD40 o su fragmento en los días 1, 7, 14 y 21 de un período de tratamiento. En otra forma de realización, el régimen de dosificación incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti CD40 o su fragmento en los días 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de una semana en un período de tratamiento. Otras formas de realización incluyen un régimen de dosificación que tiene una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti CD40 o su fragmento en los días 1, 3, 5 y 7 de una semana en un período de tratamiento; un régimen de dosificación incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti CD40 o su fragmento en los días 1 y 3 de una semana en un período de tratamiento; y un régimen de dosificación de preferencia que incluye una primera administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti CD40 o su fragmento en el día 1 de una semana en un período de tratamiento. El período de tratamiento puede comprender 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año. Los períodos de tratamiento pueden ser consecutivos o pueden estar separados uno de otro por un día, una semana, 2 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año.

En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno varía desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,5 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg, o desde aproximadamente 7 mg/kg hasta aproximadamente 12 mg/kg. Por consiguiente, por ejemplo, la dosis de cualquier anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno, por ejemplo el anticuerpo monoclonal anti-CD40 CHIR-12.12 o CHIR-5.9 o su fragmento de unión al antígeno, puede ser de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, u otra dosis semejante que esté dentro el intervalo desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg. La misma dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede administrarse a lo largo de cada semana de dosificación del anticuerpo. Como alternativa, pueden usarse diferentes dosis terapéuticamente eficaces de un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno durante el

transcurso de un período de tratamiento.

En otras realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz inicial de un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno según se define en otra parte en el presente documento puede estar en el intervalo de dosificación inferior (es decir, desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg) con dosis posteriores dentro del intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg).

En realizaciones alternativas, la dosis terapéuticamente eficaz inicial de un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno según se define en otra parte en el presente documento puede estar en el intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg) con dosis posteriores dentro del intervalo de dosificación inferior (es decir, desde 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg). Por consiguiente, en una forma de realización, la dosis terapéuticamente eficaz inicial del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno es de aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 35 mg/kg, incluyendo aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg y aproximadamente 35 mg/kg, y las posteriores dosis terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno son de aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo aproximadamente 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg.

En algunas realizaciones de la divulgación, la terapia con anticuerpo anti CD40 antagonista se inicia administrando una “dosis de carga” del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno al sujeto que necesita terapia con anticuerpos anti CD40 antagonistas. Por “dosis de carga” se entiende una dosis inicial del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno que se administra al sujeto, en la que la dosis del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno administrado está dentro del intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg). La “dosis de carga” puede administrarse como una única administración, por ejemplo, una infusión única en la que el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se administra por vía IV, o como administraciones múltiples, por ejemplo, infusiones múltiples en las que el anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se administra por vía IV, siempre que la “dosis de carga” completa se administre en un período de aproximadamente 24 horas. Tras la administración de la “dosis de carga”, se administra a continuación una o más dosis terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno al sujeto. Pueden administrarse dosis terapéuticamente eficaces posteriores, por ejemplo, según un programa de dosificación semanal, o una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o una vez cada cuatro semanas. En tales formas de realización, las dosis terapéuticamente eficaces posteriores generalmente están en el intervalo de dosificación inferior (es decir, desde 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg).

Como alternativa, en algunas formas de realización, tras la “dosis de carga”, las posteriores dosis terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno se administran según un “programa de mantenimiento”, en el que la dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se administra una vez al mes, una vez cada 6 semanas, una vez cada dos meses, una vez cada 10 semanas, una vez cada tres meses, una vez cada 14 semanas, una vez cada cuatro meses, una vez cada 18 semanas, una vez cada cinco meses, una vez cada 22 semanas, una vez cada seis meses, una vez cada 7 meses, una vez cada 8 meses, una vez cada 9 meses, una vez cada 10 meses, una vez cada 11 meses, o una vez cada 12 meses. En tales formas de realización, la dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno está en el intervalo de dosificación inferior (es decir, desde 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg), en particular cuando las dosis posteriores se administran en intervalos más frecuentes, por ejemplo, una vez cada dos semanas hasta una vez al mes, o dentro del intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg), en particular cuando las dosis posteriores se administran en intervalos menos frecuentes, por ejemplo, cuando las dosis posteriores se administran separadas por aproximadamente un mes hasta aproximadamente 12 meses.

Los anticuerpos anti CD40 antagonistas presentes en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento para usar en los procedimientos dados a conocer en el presente documento pueden ser nativos o pueden obtenerse por medio de técnicas recombinantes y pueden ser de cualquier fuente, incluidas las fuentes de mamíferos tales como, por ejemplo, ratón, rata, conejo, primate, cerdo y ser humano. De preferencia tales polipéptidos se obtienen de una fuente humana, y de más preferencia son proteínas humanas, recombinantes de líneas celulares de hibridoma.

Las composiciones farmacéuticas útiles en los procedimientos dados a conocer en el presente documento pueden comprender variantes biológicamente activas de los anticuerpos anti CD40 antagonistas de la invención. Tales variantes deben retener la actividad biológica deseada del polipéptido nativo tal que la composición farmacéutica que comprende el polipéptido variante tenga el mismo efecto terapéutico que la composición farmacéutica que comprende el polipéptido nativo cuando se administra a un sujeto. Es decir, el anticuerpo anti CD40 variante servirá como componente terapéuticamente activo en la composición farmacéutica de manera similar a la observada para el anticuerpo antagonista nativo, por ejemplo CHIR-5.9 o CHIR-12.12 como se expresa por la línea celular de hibridoma 5.9 ó 12.12, respectivamente. En la técnica están disponibles procedimientos para determinar si un anticuerpo anti CD40 variante retiene la actividad biológica deseada, y sirve por consiguiente como un componente terapéuticamente activo en la composición farmacéutica. La actividad biológica de las variantes del anticuerpo puede medirse usando ensayos específicamente diseñados para medir la actividad del anticuerpo antagonista nativo, incluidos los ensayos descritos en este documento.

Cualquier composición farmacéutica que comprenda un anticuerpo anti CD40 antagonista que tenga las propiedades de unión descritas en el presente documento como el componente terapéuticamente activo puede usarse en los procedimientos dados a conocer en el presente documento. Por consiguiente, las composiciones líquidas, liofilizadas o secadas por pulverización que comprenden uno o más de los anticuerpos anti CD40 antagonistas de la invención pueden prepararse como una disolución o suspensión acuosa o no acuosa para la posterior administración a un sujeto de acuerdo con los procedimientos dados a conocer en el presente documento. Cada una de estas composiciones comprenderá al menos uno de los anticuerpos anti CD40 antagonistas de la presente invención como un componente terapéuticamente o profilácticamente activo. Por “componente terapéuticamente o profilácticamente activo” se entiende que el anticuerpo anti CD40 está específicamente incorporado en la composición para provocar una respuesta terapéutica o profiláctica con respecto al tratamiento, la prevención o el diagnóstico de una enfermedad o afección en un sujeto cuando se administra la composición farmacéutica a ese sujeto. De preferencia la composición farmacéutica comprende agentes estabilizantes, agentes de carga adecuados, o ambos para reducir al mínimo los problemas asociados con la pérdida de estabilidad y actividad biológica de las proteínas durante la preparación y el almacenamiento.

Pueden añadirse compuestos de formulación a las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti CD40 antagonista de la invención. Estos compuestos de formulación pueden incluir, pero se limitan a, aceites, polímeros, vitaminas, hidratos de carbono, aminoácidos, sales, tampones, albúmina, tensioactivos o agentes de carga. Los hidratos de carbono de preferencia incluyen azúcares o alcoholes de azúcar tales como mono-, di-o polisacáridos, o glucanos solubles en agua. Los sacáridos o glucanos pueden incluir fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, sucrosa, dextrano, pullulano, dextrina, ciclodextrina α y β, almidón soluble, hidroxietil almidón y carboximetilcelulosa, o sus mezclas. Se define “alcohol de azúcar” como un hidrocarburo C4 a C8 que tiene un grupo hidroxilo e incluye galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol, glicerol y arabitol. Estos azúcares o alcoholes de azúcar pueden usarse de manera individual o en combinación. La concentración del azúcar o de alcohol de azúcar está entre 1,0% y 7% p/v., de más preferencia entre 2,0% y 6,0% p/v. Los aminoácidos de preferencia incluyen formas levógiras (L) de carnitina, arginina, y betaína; sin embargo, pueden añadirse otros aminoácidos. De preferencia los polímeros incluyen polivinilpirrolidona (PVP) con un peso molecular promedio entre 2.000 y 3.000, o polietilenglicol (PEG) con un peso molecular promedio entre 3.000 y 5.000. Los tensioactivos que pueden añadirse a la formulación se muestran en los documentos EP Nº 270.799 y 268.110.

Además, los anticuerpos pueden modificarse químicamente por conjugación covalente a un polímero para, por ejemplo, aumentar su semivida de circulación. Los polímeros de preferencia y los procedimientos para ligarlos a péptidos, se muestran en las Patentes de EEUU Nº 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; y 4.609.546. Los polímeros de preferencia son polioles polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general: R(O-CH2 --CH2)n O--R donde R puede ser hidrógeno, o un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol. De preferencia, el grupo protector tiene entre 1 y 8 carbonos, de más preferencia es metilo. El símbolo n es un número entero positivo, de preferencia entre 1 y 1.000, de más preferencia entre 2 y 500. El PEG tiene de preferencia un peso molecular promedio entre

1.000 y 40.000, de más preferencia entre 2.000 y 20.000, de mayor preferencia entre

3.000 y 12.000. De preferencia, el PEG tiene al menos un grupo hidroxilo, de más preferencia es un grupo hidroxi terminal. Este es el grupo hidroxi que se activa de preferencia para reaccionar con un grupo amino libre en el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo y la cantidad de los grupos reactivos pueden variarse para obtener un PEG/anticuerpo de la presente invención conjugado de manera covalente.

Los polioles polioxietilados solubles en agua también son útiles en la presente invención. Estos incluyen sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado (POG), y otros. Resulta de preferencia el POG. Una razón es porque la estructura central glicerol del glicerol polioxietilado es la misma estructura central que se presenta en la naturaleza en, por ejemplo, animales y seres humanos en los mono-, di-, triglicéridos. Por consiguiente, esta ramificación no será considerada necesariamente como un agente extraño en el cuerpo. El POG tiene un peso molecular de preferencia en el mismo intervalo que PEG. La estructura para el POG se muestra en Knauf y col. (1988)

J. Bio. Chem. 263:15064-15070, y puede encontrarse un análisis de conjugados POG/IL2 en la Patente de EEUU Nº. 4.766.106.

Otro sistema de administración de fármacos para aumentar la semivida circulatoria es el liposoma. Los procedimientos para preparar los sistemas de administración de liposomas se analizan en Gabizon y col. (1982) Cancer Research 42:4734; Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649:129; y Szoka (1980) Ann. Rev. Bioplsys. Eng. 9:467. En la técnica se conocen otros sistemas de administración de fármacos y están descritos, por ejemplo, en Poznansky y col. (1980) Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed., Oxford, N.Y.) páginas 253-315; Poznansky (1984) Pharm Revs 36:277.

Los compuestos de formulación a incorporar en una composición farmacéutica deberían proporcionar estabilidad del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno. Es decir, el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno deberá retener su estabilidad física y/o química y deberá tener la actividad biológica deseada, es decir, una o más de las actividades definidas anteriormente en el presente documento, incluidas, pero no limitadas a, inhibición de la secreción de inmunoglobulinas por células B periféricas humanas normales estimuladas por células T; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales estimuladas por células T de Jurkat; inhibición de la supervivencia y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales estimuladas por células que expresan CD40L o ligando de CD40 soluble (sCD40L); inhibición de señales intracelulares antiapoptóticas de “supervivencia” en cualquier célula estimulada por sCD40L o CD40L de fase sólida; inhibición de la transducción de señal de CD40 en cualquier célula tras la unión con sCD40L o CD40L de fase sólida; e inhibición de la proliferación de células B humanas malignas como se señaló en otra parte en este documento.

Los procedimientos para controlar la estabilidad de las proteínas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Jones (1993) Adv Drug Delivery Rev. 10:2990; Lee, ed. (1991) Peptide y Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York); y los ensayos de estabilidad que se dan a conocer en el presente documento a continuación. En general, la estabilidad de las proteínas se mide a una temperatura elegida durante un período de tiempo especificado. En realizaciones de preferencia, una formulación farmacéutica de anticuerpo estable proporciona estabilidad del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno cuando se almacena a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) durante al menos 1 mes, al menos 3 meses, o al menos 6 meses, y/o es estable aproximadamente a 2-8 ºC durante al menos 6 meses, al menos 9 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses.

Una proteína tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición farmacéutica, se considera que mantiene su estabilidad física en un momento dado si no muestra signos visuales (es decir, decoloración o pérdida de transparencia) o signos que pueden medirse (por ejemplo, usando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o dispersión de luz UV) de precipitación, agregación, y/o desnaturalización en esa composición farmacéutica. Con respecto a la estabilidad química, una proteína tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición farmacéutica, se considera que mantiene su estabilidad química en un momento dado si las medidas de estabilidad química son indicativas de que la proteína (es decir, el anticuerpo) mantiene su actividad biológica de interés en esa composición farmacéutica. Los procedimientos para controlar los cambios en la estabilidad química son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, procedimientos para detectar formas químicamente alteradas de la proteína tales como el resultado la degradación, usando, por ejemplo, SDS-PAGE, SEC, y/o espectrometría de masas por tiempo de vuelo de desorción/ionización de láser asistida por matriz; y degradación asociada con cambios en la carga molecular (por ejemplo, asociada con desamidación), usando, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico. Véase, por ejemplo, los procedimientos que se dan a conocer en el presente documento a continuación.

Se considera que un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno, cuando se formula en una composición farmacéutica, mantiene una actividad biológica deseada en un momento dado si la actividad biológica deseada en ese momento está aproximadamente dentro del 30%, de preferencia aproximadamente dentro del 20% de la actividad biológica deseada exhibida en el momento en que se preparó la composición farmacéutica según se determina en un ensayo adecuado para la actividad biológica deseada. Los ensayos para medir la actividad biológica deseada de los anticuerpos anti CD40 antagonistas dados a conocer en el presente documento, y sus fragmentos que se unen al antígeno, pueden llevarse a cabo como se describe en los Ejemplos en el presente documento. Véase también los ensayos descritos en Schultze y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:8200-8204; Denton y col. (1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans y col. (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman y col. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan y col. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom y col. (1993) Immunology 79:439-444; y las Patentes de EEUU Nº 5.674.492 y 5.847.082.

En algunas formas de realización de la invención, el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno se formula en una formulación farmacéutica líquida. El anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede prepararse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluidos los procedimientos dados a conocer anteriormente en el presente documento. En una forma de realización, el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno se produce de manera recombinante en una línea celular CHO.

Tras su preparación y purificación, el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede formularse como una formulación farmacéutica líquida de la manera expuesta en el presente documento. Cuando el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno debe almacenarse antes de su formulación, pueden congelarse, por ejemplo, a ≤ -20 ºC, y a continuación descongelarse a temperatura ambiente para otra formulación. La formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno. La cantidad de anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno presente en la formulación tiene en consideración la vía de administración y el volumen de dosis deseado.

De esta manera, la composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 40,0 mg/ml, aproximadamente 1,0 mg/ml hasta aproximadamente 30,0 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 20,0 mg/ml, o aproximadamente 15,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml. En algunas formas de realización, la composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5,0 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 10,0 mg/ml, aproximadamente 10,0 mg/ml hasta aproximadamente 15,0 mg/ml, aproximadamente 15,0 mg/ml hasta aproximadamente 20,0 mg/ml, aproximadamente 20,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, aproximadamente 25,0 mg/ml hasta aproximadamente 30,0 mg/ml, aproximadamente 30,0 mg/ml hasta aproximadamente 35,0 mg/ml, aproximadamente 35,0 mg/ml hasta aproximadamente 40,0 mg/ml, aproximadamente 40,0 mg/ml hasta aproximadamente 45,0 mg/ml, o aproximadamente 45,0 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml. En otras formas de realización, la composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno en una concentración de aproximadamente 15:0 mg/ml, aproximadamente 16,0 mg/ml, aproximadamente 17,0 mg/ml, aproximadamente 18,0 mg/ml, aproximadamente 19,0 mg/ml, aproximadamente 20,0 mg/ml, aproximadamente 21,0 mg/ml, aproximadamente 22,0 mg/ml, aproximadamente 23,0 mg/ml, aproximadamente 24,0 mg/ml, o aproximadamente 25,0 mg/ml. La composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno y un tampón que mantiene el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, incluyendo aproximadamente pH 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, y otros valores semejantes dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0. En algunas formas de realización, el tampón mantiene el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente 7,0, aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5, o aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,0.

En la formulación puede usarse cualquier tampón adecuado que mantenga el pH de la formulación líquida del anticuerpo anti CD40 en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, siempre que la estabilidad fisicoquímica y la actividad biológica deseada del anticuerpo se mantengan como se señaló anteriormente en el presente documento. Los tampones incluyen pero no se limitan a, ácidos convencionales y sus sales, donde el contraión puede ser, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o magnesio. Los ejemplos de ácidos convencionales y su sales que pueden usarse para tamponar la formulación farmacéutica líquida incluyen, pero no se limitan a, tampones de ácido succínico o succinato, ácido cítrico o citrato, ácido acético o acetato, ácido tartárico

o tartrato, ácido fosfórico o fosfato, ácido glucónico o gluconato, ácido glutámico o glutamato, ácido aspártico o aspartato, ácido maleico o maleato y ácido málico o malato. La concentración del tampón en la formulación puede ser desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, incluyendo aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores semejantes dentro del intervalo de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM. En algunas formas de realización, la concentración del tampón en la formulación es desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, incluyendo aproximadamente 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, u otros valores semejantes dentro del intervalo de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM.

En algunas realizaciones de la invención, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR 12,12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno y tampón succinato o tampón citrato a una concentración que mantiene el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, de preferencia aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,5. Por “tampón succinato” o “tampón citrato” se entiende un tampón que comprende una sal de ácido succínico o una sal de ácido cítrico, respectivamente. En una realización de preferencia, el contraión de succinato o citrato es el catión sodio, por consiguiente el tampón es succinato de sodio o citrato de sodio, respectivamente. Sin embargo, se espera que sea eficaz cualquier catión. Otros posibles cationes de succinato o de citrato incluyen, pero no se limitan a, potasio, amonio, calcio y magnesio. Como se señaló anteriormente, la concentración del tampón succinato o citrato en la formulación puede ser desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, incluyendo aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores semejantes dentro del intervalo desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM. En algunas formas de realización, la concentración de tampón en la formulación va desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, incluyendo aproximadamente 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, o aproximadamente 15 mM. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml, o aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, y tampón succinato o citrato, por ejemplo, tampón succinato de sodio o citrato de sodio, a una concentración de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 20 mM, aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, de preferencia aproximadamente 10 mM.

Cuando es deseable que la formulación farmacéutica líquida sea prácticamente isotónica, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0 puede comprender además una cantidad de un agente de isotonicidad suficiente para hacer que la formulación sea prácticamente isotónica. Por "prácticamente isotónica" se entiende que la formulación acuosa tiene una osmolaridad de aproximadamente 240 mmol/kg hasta aproximadamente 360 mmol/kg, de preferencia aproximadamente 240 hasta aproximadamente 340 mmol/kg, de más preferencia aproximadamente 250 hasta aproximadamente 330 mmol/kg, aún de más preferencia aproximadamente 260 hasta aproximadamente 320 mmol/kg, de mayor preferencia aún aproximadamente 270 hasta aproximadamente 310 mmol/kg. Los procedimientos para determinar la isotonicidad de una disolución son conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Setnikar y col. (1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48:628.

Los expertos en la técnica están familiarizados con una diversidad de solutos farmacéuticamente aceptable útiles para proporcionar isotonicidad en las composiciones farmacéuticas. El agente de isotonicidad puede ser cualquier reactivo capaz de ajustar la presión osmótica de la formulación farmacéutica líquida de la presente invención hasta un valor prácticamente igual al de un líquido corporal. Es deseable utilizar un agente de isotonicidad fisiológicamente aceptable. Por consiguiente, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, puede comprender además componentes que pueden usarse para proporcionar isotonicidad, por ejemplo, cloruro de sodio; aminoácidos tales como alanina, valina y glicina; azúcares y alcoholes de azúcares (polioles), incluidos, pero no limitados a, glucosa, dextrosa, fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, trehalosa, glicerol, sorbitol, y xilitol; ácido acético, otros ácidos orgánicos y sus sales, y cantidades relativamente menores de citratos o fosfatos. El experto en la técnica conocerá otros agentes que son adecuados para proporcionar la tonicidad óptima de la formulación líquida.

En algunas realizaciones de preferencia, la formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0 comprende además cloruro de sodio como el agente de isotonicidad. La concentración de cloruro de sodio en la formulación dependerá de la contribución de otros componentes a la tonicidad. En algunas realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 250 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 200 mM, aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 125 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente 125 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 130 mM hasta aproximadamente 170 mM, aproximadamente 130 mM hasta aproximadamente 160 mM, aproximadamente 135 mM hasta aproximadamente 155 mM, aproximadamente 140 mM hasta aproximadamente 155 mM, o aproximadamente 145 mM hasta aproximadamente 155 mM. En una de tales formas de realización, la concentración de cloruro de sodio es aproximadamente 150 mM. En otra de tales realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es aproximadamente 150 mM, el tampón es tampón succinato de sodio o citrato de sodio en una concentración de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y la formulación tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, o aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprenden el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml o aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, aproximadamente cloruro de sodio 150 mM, y aproximadamente succinato de sodio o citrato de sodio 10 mM, a un pH de aproximadamente pH 5,5.

La degradación proteica por congelación descongelación o cizallamiento mecánico durante el procesamiento de una formulación farmacéutica líquida de la presente invención puede inhibirse incorporando tensioactivos en la formulación para disminuir la tensión superficial en la interfase disolución-aire. Por consiguiente, en algunas formas de realización, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR 5,9, o su fragmento de unión al antígeno, un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, y comprende además un tensioactivo. En otras realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, un agente de isotonicidad tal como cloruro de sodio en una concentración de aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, y comprende además un tensioactivo.

Los tensioactivos típicos utilizados son tensioactivos noiónicos, incluidos los ésteres de polioxietilensorbitol tales como polisorbato 80 (Tween 80) y polisorbato 20 (Tween 20); ésteres de polioxipropileno-polioxietileno tales como Pluronic F68; alcoholes de polioxietileno tales como Brij 35; simeticona; polietilenglicol tal como PEG400; lisofosfatidilcolina; y polioxietilen-p-t-octilfenol tal como Triton X-100. La estabilización clásica de compuestos farmacéuticos por medio de tensioactivos o emulsivos se describe, por ejemplo, en Levine y col. (1991) J. Parenteral Sci. Technol. 45(3): 160-165. Un tensioactivo de preferencia utilizada en la práctica de la presente invención es polisorbato 80. Cuando se incluye un tensioactivo, éste se añade típicamente en una cantidad desde aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 1,0% (p/v), aproximadamente 0,001 % hasta aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 0,4%, aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,005% hasta aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,005% hasta aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,01% hasta aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,01% hasta aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,03% hasta aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,03% hasta aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,05% hasta aproximadamente 0,5%, o aproximadamente 0,05% hasta aproximadamente 0,2%.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, el tampón es tampón succinato de sodio o citrato de sodio en una concentración de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM; la formulación tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, o aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5; y la formulación comprende además un tensioactivo, por ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad desde aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 1,0% o aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 0,5%. Tales formulaciones pueden comprender opcionalmente un agente de isotonicidad, tal como cloruro de sodio en una concentración de aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 150 mM. En otras formas de realización, la formulación farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml o aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml, incluyendo aproximadamente 20,0 mg/ml; cloruro de sodio aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, incluyendo cloruro de sodio aproximadamente 150 mM; succinato de sodio o citrato de sodio a una concentración de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 20 mM; incluyendo succinato de sodio o citrato de sodio aproximadamente 10 mM; cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, incluyendo aproximadamente 150 mM; y opcionalmente un tensioactivo, por ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad desde aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 1,0%, incluyendo aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 0,5%; donde la formulación farmacéutica líquida tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 5,5, aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5, o aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,0.

La formulación farmacéutica líquida puede estar esencialmente libre de conservantes y otros vehículos, excipientes, o estabilizadores señalados anteriormente en el presente documento. Como alternativa, la formulación puede incluir uno o más conservantes, por ejemplo, agentes antibacterianos, vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables descritos en el presente documento anteriormente con la condición de que no afecten de manera adversa la estabilidad fisicoquímica del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno. Los ejemplos de vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables incluyen, pero no se limitan a, otros agentes tamponadores, codisolventes, tensioactivos, antioxidantes incluidos ácido ascórbico y metionina, agentes quelantes tales como EDTA, complejos de metales (por ejemplo, complejos Zn-proteína), y polímeros biodegradables tales como poliésteres. Puede encontrarse una discusión detallada de formulación y selección de vehículos, excipientes e isomolitos farmacéuticamente aceptables en Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990).

Una vez que la formulación farmacéutica líquida u otra composición farmacéutica descrita en el presente documento está preparada, puede liofilizarse para evitar la degradación. Los procedimientos para liofilizar composiciones líquidas son conocidos por los expertos en la técnica. Justo antes de usar, la composición puede reconstituirse con un diluyente estéril (disolución de Ringer, agua destilada o disolución salina, por ejemplo) que puede incluir otros componentes. Tras la reconstitución, la composición se administra de preferencia a los sujetos usando los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Uso de anticuerpos anti CD40 antagonistas en la fabricación de medicamentos

La presente invención también proporciona el uso de un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de CLL en un sujeto, en el que el medicamento está coordinado con tratamiento con al menos otra terapia contra cáncer. Por “coordinado” se entiende que el medicamento se usará antes, durante, o después del tratamiento del sujeto con al menos otra terapia contra el cáncer. Los ejemplos de otras terapias contra el cáncer incluyen, pero no se limitan a estas, las descritas anteriormente en este documento, es decir, cirugía; terapia con radiación; quimioterapia; cuando sea apropiado en combinación con transplante autólogo de médula ósea, donde ejemplos de otras terapias contra cáncer incluyen, pero sin limitarse a estas, cirugía; terapia con radiación; quimioterapia; cuando sea apropiado en combinación con transplante autólogo de médula ósea, donde agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a estos, fludarabina o fosfato de fludarabina, clorambucilo, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida, doxorubicina, prednisona, y sus combinaciones, por ejemplo, regímenes que contienen antraciclina tales como CAP (ciclofosfamida, doxorubicina más prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona más doxorubicina), VAD (vincritsina, doxorubicina, más dexametasona), MP (melfalán más prednisona), y otros agentes citotóxicos y/o terapéuticos usados en quimioterapia tales como mitoxantrona, daunorubicina, idarubicina, asparaginasa, y antimetabolitos, incluidos, pero no limitados a, citarabina, metotrexato, 5-fluorouracilo decarbazina, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina y nelarabina; otra terapia anticancerosa con anticuerpos monoclonales (por ejemplo, alemtuzumab (Campath®) u otro anticuerpo anti CD52 dirigido a la glicoproteína de superficie celular CD52 en células B malignas; rituximab (Rituxan®), el anticuerpo HuMaxCD20 totalmente humano, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), o cualquier otro anticuerpo anti CD20 terapéutico dirigido al antígeno CD20 en células B malignas; anticuerpo anti CD19 (por ejemplo, MT103, un anticuerpo biespecífico); anticuerpo anti CD22 (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal humanizado epratuzumab); bevacizumab (Avastin®) u otro anticuerpo anticanceroso dirigido al factor de crecimiento vascular endotelial humano; anticuerpo anti CD22 dirigido al antígeno CD22 en células B malignas (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal BL-22, una toxina alfaCD22); anticuerpo α-M-CSF dirigido al factor estimulante de colonias de macrófagos; anticuerpos dirigidos al activador del receptor del factor kappaB nuclear (RANK) y su ligando (RANKL); anticuerpo anti CD23 dirigido al antígeno CD23 en células B malignas (por ejemplo, IDEC-152); anticuerpo anti CD38 dirigido al antígeno CD38 en células B malignas; anticuerpos dirigidos a los receptores del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (anticuerpos anti MHC) expresados en células B malignas; otros anticuerpos anti CD40 (por ejemplo, SGN-40) dirigidos al antígeno CD40 en células B malignas; y anticuerpos dirigidos al receptor 1 del ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL-R1) (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal agonista humano HGS-ETR1) expresado en una cantidad de tumores sólidos y tumores de origen hematopoyético); terapia del cáncer basada en moléculas pequeñas, incluidos, pero no limitados a, inhibidores de microtúbulos y/o topoisomerasa (por ejemplo, el inhibidor mitótico dolastatina y análogos de dolastatina; el agente de unión a tubulina T900607; XL119; y el inhibidor de la topoisomerasa aminocamptotecina), SDX-105 (clorhidrato de bendamustina), ixabepilona (un análogo de epotilona, también llamado BMS-247550), inhibidores de proteincinasa C, por ejemplo, midostaurina ((PKC-412, CGP 41251, N-benzoilstaurosporina), pixantrona, eloxatina (un agente antineoplásico), ganite (nitrato de galio), Thalomid® (talidomida), derivados inmunomoduladores de la talidomida (por ejemplo, revlimid (anteriormente revimid)), Affinitak™ (inhibidor antisentido de proteincinasa C-alfa), SDX-101 (R-etodolac, que induce la apoptosis de linfocitos malignos), análogos de nucleósidos purina de segunda generación tales como clofarabina, inhibidores de la producción de la proteína Bcl-2 por células cancerosas (por ejemplo, los agentes antisentido oblimersen y Genasense®), inhibidores de proteasoma (por ejemplo, Velcade™ (bortezomib)), inhibidores de cinasas de molécula pequeña (por ejemplo, CHIR-258), inhibidores de VEGF de molécula pequeña (por ejemplo, ZD-6474), inhibidores de la proteína del choque térmico (HSP) 90 de molécula pequeña (por ejemplo, 17-AAG), agentes inhibidores de desacetilasas de histonas de molécula pequeña (por ejemplo, HPC híbrido/polar de citodiferenciación) tales como ácido suberanilohidroxámico (SAHA), y FR-901228 y agentes apoptóticos tales como Trisenox® (trióxido de arsénico) y Xcytrin® (motexafina gadolinio); terapias contra el cáncer basadas en vacunas/inmunoterapia, incluidas, pero no limitadas a, enfoques de vacunas (por ejemplo, Id-KLH, oncofago, vitaletina), inmunoterapia personalizada o inmunoterapia activa de idiotipo (por ejemplo, MyVax® Personalized Immunotherapy, denominada formalmente GTOP-99), Promune® (CpG 7909, un agonista sintético para el receptor de tipo toll 9 (TLR9)), terapia con interferón alfa, terapia con interleucina 2 (IL-2), terapia con IL-12, terapia con IL-15 y terapia con IL-21; terapia con esteroides; u otra terapia contra el cáncer; en las que el tratamiento con la terapia adicional contra el cáncer, o terapias adicionales contra el cáncer, se realizan antes, durante, o posteriormente al tratamiento del sujeto con el medicamento que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno, como se señaló anteriormente en el presente documento. En una realización de este tipo, la presente invención proporciona el uso del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de CLL en un sujeto, en el que el medicamento está coordinado con tratamiento con al menos otra terapia contra cáncer como se indica en este documento anteriormente.

Por consiguiente, por ejemplo, en algunas realizaciones, la invención proporciona el uso del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de CLL en un sujeto, en el que el medicamento está coordinado con tratamiento con quimioterapia, seleccionándose la quimioterapia del grupo constituido por fludarabina, clorambucilo, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida, doxorubicina y prednisona, y regímenes que contienen antraciclina tales como CAP (ciclofosfamida, doxorubicina más prednisona), CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona más doxorubicina) y cualquier combinación de los mismos; en la que el medicamento se va a usar antes, durante, o posteriormente al tratamiento del sujeto con la otra terapia contra el cáncer o, en el caso de terapias de combinación múltiples, bien antes, durante, o posteriormente al tratamiento del sujeto con las otras terapias contra el cáncer.

En otras realizaciones la invención proporciona el uso del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de mieloma múltiple en un sujeto, en el que el medicamento está coordinado con tratamiento con al menos otro anticuerpo anti-cáncer seleccionado del grupo constituido por alemtuzumab (Campath®) u otro anticuerpo anti CD52 dirigido a la glicoproteína de superficie celular CD52 en células B malignas; rituximab (Rituxan®), el anticuerpo HuMax-CD20 totalmente humano, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®), ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), o cualquier otro anticuerpo anti CD20 terapéutico dirigido al antígeno CD20 en células B malignas; anticuerpo anti CD23 dirigido al antígeno CD23 en células B malignas (por ejemplo, IDEC-152); y anticuerpo anti CD22 dirigido al antígeno CD22 en células B malignas (por ejemplo, el anticuerpo BL-22, una toxina alfaCD22); y cualquier combinación de los mismos; en la que el medicamento se va a usar antes, durante, o posteriormente al tratamiento del sujeto con la otra terapia contra el cáncer o, en el caso de terapias de combinación múltiple, bien antes, durante, o posteriormente al tratamiento del sujeto con las otras terapias contra el cáncer.

Aún en otras realizaciones la presente invención proporciona el uso del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de CLL en un sujeto, en el que el medicamento está coordinado con tratamiento con al menos otra teapia contra cáncer basada en moléculas pequeñas seleccionada del grupo constituido por SDX-101 (Retodolac, que induce la apoptosis de linfocitos malignos), análogos de nucleósidos purina de segunda generación tales como clofarabina, inhibidores de la producción de la proteína Bcl-2 por células cancerosas (por ejemplo, los agentes antisentido oblimersen y Genasense®), inhibidores de proteasoma (por ejemplo, Velcade™ (bortezomib)), agentes inhibidores de desacetilasas de histonas de molécula pequeña (por ejemplo, HPC híbrido/polar de citodiferenciación), agentes tales como ácido suberanilohidroxámico (SAHA), y FR-901228) y cualquier combinación de los mismos; o con otra terapia contra cáncer, por ejemplo, inmunización con gen CD154 (por ejemplo ISF-154); en la que el medicamento se va a usar antes, durante, o posteriormente al tratamiento del sujeto con la otra terapia contra el cáncer o, en el caso de terapias de combinación múltiple, bien antes, durante, o posteriormente al tratamiento del sujeto con las otras terapias contra el cáncer.

En algunas realizaciones, el medicamento que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 descrito en este documento, o su fragmento de unión al antígeno está coordinado con tratamiento con otras dos terapias contra cáncer. Sin pretender limitarse, ejemplos incluyen la coordinación del medicamento con el tratamiento con dos agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, coordinación con tratamiento con fludarabina y ciclofosfamida; y coordinación del medicamento con tratamiento con un agente quimioterapéutico, por ejemplo, fludarabina y otro anciuerpo monoclonal anti-canceroso, por ejemplo, alemtuzurnab, rituximab u otro anticuerpo anti CD20 incluyendo el anticuerpo HuMaxCD20 totalmente humano, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/I-131 tositumomab (Bexxar®) y ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), o anticuerpo anti-CD23. Cuando el medicamento que comprende el anticuerpo anti-CD40 antagonista está coordinado con otras dos terapias contra cáncer, el uso del medicamento puede ser antes, durante, o tras el traamiento del sujeto con una o las dos otras terapias contra cáncer.

La invención también proporciona el uso de un anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 descrito en este documento, o su fragmento de unión al antígeno en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de CLL en un sujeto, en el que el medicamento se usa en un sujeto que ha recibido tratamiento previo con al menos otra terapia contra el cáncer. Por “pretratado” o “tratamiento previo” se entiende que el sujeto ha sido tratado con una o más terapias contra el cáncer antes de recibir el medicamento que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno. “Pretratado” o “tratamiento previo” incluye sujetos que han sido tratados con al menos otra terapia contra el cáncer, o terapias con tra el cáncer, en el plazo de 2 años, en el plazo de 18 meses, en el plazo de 1 año, en el plazo de 6 meses, en el plazo de 2 meses, en el plazo de 6 semanas, en el plazo de 1 mes, en el plazo de 4 semanas, en el plazo de 3 semanas, en el plazo de 2 semanas, en el plazo de 1 semana, en el plazo de 6 días, en el plazo de 5 días, en el plazo de 4 días, en el plazo de 3 días, en el plazo de 2 días, o incluso en el plazo de 1 día antes del inicio del tratamiento con el medicamento que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 que se describe en este documento, o su fragmento de unión al antígeno. No es necesario que el sujeto haya sido un paciente que responde al tratamiento previo con la anterior terapia contra el cáncer, o anteriores terapias contra el cáncer. Por consiguiente, el sujeto que recibe el medicamento que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno podría haber respondido, o podría no haber respondido al tratamiento previo con la anterior terapia contra el cáncer, o a una o más terapias anteriores contra el cáncer donde el tratamiento previo comprendía múltiples terapias contra el cáncer, por ejemplo, cirugía y quimioterapia; cirugía y otra terapia con anticuerpo anti-cáncer; quimioterapia y otra terapia con anticuerpo anti-cáncer; o cirugía, quimioterapia, y otra terapia con anticuerpo anti-cáncer.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la invención también proporciona el uso de un anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 descrito en este documento, o su fragmento de unión al antígeno en la fabricación de un medicamento que se usa en un sujeto en necesidad de tratamiento de CLL, donde el sujeto ha sido tratado previamente con una o más de las siguientes terapias contra el cáncer: cirugía; terapia con radiación; quimioterapia, opcionalmente en combinación con transplante autólogo de médula ósea; donde agentes quimioterapéuticos adecuados incluyen, pero sin limitarse a estos, fludarabina, clorambucilo, cladrabina, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina, ciclofosfamida, doxorubicina, prednisona, y sus combinaciones, por ejemplo, regímenes que contienen antraciclina tales como CAP (ciclofosfamida, doxorubicina más prednisona) y CHOP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona más doxorubicina), otra terapia anticancerosa con anticuerpos monoclonales (por ejemplo, alemtuzumab (Campath®); rituximab (Rituxan®) u otro anticuerpo anti CD50 terapéutico; u otro anticuerpo anti-CD23 dirigido al antígeno CD23 en células B malignas); terapia con interferona alfa; terapia con interleuquina-2 (IL-2); terapia con IL-2, IL-5 o IL-21; o terapia con esteroides.

“Tratamiento” en el contexto de uso coordinado de un medicamento descrito en el presente documento con otra u otras terapias contra el cáncer se define en el presente documento como la aplicación o administración del medicamento o de la otra terapia contra el cáncer a un sujeto, o la aplicación o administración del medicamento u otra terapia contra el cáncer a un tejido aislado o línea celular de un sujeto, en el que el sujeto tiene leucemia linfocítica crónica, un síntoma asociado con tal cáncer, o una predisposición a desarrollar tal cáncer, siendo la finalidad curar, sanar, calmar, aliviar, alterar, remediar, mejorar o afectar el cáncer, cualquier síntoma asociado del cáncer, o la predisposición a desarrollar el cáncer.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no como limitación. PARTE EXPERIMENTAL Introducción

Los anticuerpos anti CD40 antagonistas usados en los ejemplos a continuación son CHIR-5.9 y CHIR-12.12. Los anticuerpos anti CD40 CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son anticuerpos monoclonales (mAb) anti CD40 humano del subtipo IgG1 humana generados por inmunización de ratones transgénicos que llevan el locus de cadena pesada de IgG1 humana y el locus de cadena ligera κ humana (tecnología XenoMouse®; Abgenix; Fremont, California). Se usaron como inmunógeno células de insecto SF9 que expresan el dominio extracelular CD40.

De forma resumida, se fusionaron esplenocitos de ratones inmunizados con células de mieloma murino SP 2/0 o P 3 x 63Ag8.653 en una relación de 10:1 usando polietilenglicol al 50% como está descrito previamente por de Boer y col. (1988) J. Immunol. Meth. 113:143. Las células fusionadas se resuspendieron en medio IMDM completo suplementado con hipoxantina (0,1 mM), aminopterina (0,01 mM), timidina (0,016 mM), y hIL-6 0,5 ng/ml (Genzyme, Cambridge, Massachusetts). A continuación se distribuyeron las células fusionadas entre los pocillos de placas de cultivo tisular de 96 pocillos, de manera que cada una contenía 1 hibridoma en crecimiento en promedio.

Tras 10-14 días se analizaron los sobrenadantes de las poblaciones de hibridomas para detectar la producción de anticuerpos específicos. Para la detección de anticuerpos específicos por los clones de hibridoma, se combinaron los sobrenadantes de cada pocillo y se probaron para especificidad de actividad anti-CD 40 por ELISA en primer lugar. A continuación se usaron los positivos para tinción fluorescente de células de las células B transformadas con VEB como se describió para el ensayo FACS anteriormente. Las células de hibridomas positivos se clonaron dos veces por dilución limitante en IMDM/FBS que contenía hIL-6 0,5 ng/ml.

Se fusionó un total de 31 bazos de ratones con las células SP2/0 de mieloma de ratón para generar 895 anticuerpos que reconocen el CD40 recombinante en ELISA. En promedio aproximadamente el 10% de los hibridomas producidos usando tecnología Abgenix XenoMouse® pueden contener la cadena ligera lambda de ratón en lugar de la cadena kappa humana. Se seleccionar los anticuerpos que contenían cadena ligera lambda de ratón y se descartaron. Se seleccionó una subserie de 260 anticuerpos que también mostraban unión al CD40 de superficie celular para otro análisis. Los hibridomas estables seleccionados durante una serie de procedimientos de subclonación se usaron para más caracterización en ensayos de unión y funcionales.

Se identificaron clones de otros 7 hibridomas que tenían actividad antagonista. Basado en su potencia antagonista relativa y actividades de ADCC, se seleccionaron dos 5 clones de hibridoma para posterior evaluación. Se denominan 131.2F8.5.9 (5.9) y

153.8E2.D10,D6.12.12 (12.12).

Tabla 1. Resumen de la serie de datos incial con anticuerpos IgG1 anti CD40 CHIR

5.9 y CHIR-12.12

Hibridoma madre

Clones de hibridoma unión a la superficie celular Antagonista ADCC CDC CMCC# Secuencia de ADN de la región V

131.2F5

131.2F5.8.5.9 +++ +++ ++ - 12047 Si

153.8E2

158.8E2D10D6.12.12 +++ +++ ++++ - 12056 Si

La línea del hibridoma 131.2F5.8.5.9 (CMCC#12047) y la línea de hibridoma

10 153.8E2.D10.D6.12.12 de ratón se han depositado en la American Type Culture Collection [ATCC; 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209 (EEUU)] con el Número de Depósito de Patente Nº PTA-5542 y Nº PTA-5543, respectivamente.

Los ADNc que codifican las regiones variables de los anticuerpos candidato se amplificaron por PCR, se clonaron y se secuenciaron. Las secuencias de aminoácido 15 para la cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo CHIR-12.12 se presentan en las Figuras 1A y 1B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº 2 (cadena ligera para mAb CHIR-12.12) y SEC ID Nº 4 (cadena pesada para mAb CHIR-12.12). En la Figura 1B se muestra una variante de la cadena pesada para mAb CHIR-12.12 (véase también SEC ID Nº 5), que difiere de la SEC ID Nº 4 porque tiene un residuo alanina sustituido por un 20 residuo serina en la posición 153 de SEC ID Nº 4. Las secuencias de nucleótidos que codifica la cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo CHIR-12.12 se presentan en las Figuras 2A y 2B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº 1 (secuencia codificadora para cadena ligera para mAb CHIR-12.12) y SEC ID Nº 3 (secuencia codificadora para cadena pesada para mAb CHIR-12.12). Las secuencias de aminoácido para la cadena 25 ligera y cadena pesada del anticuerpo CHIR-5.9 se presentan en las Figuras 3A y 3B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº 6 (cadena ligera para mAb CHIR-5.9) y SEC ID Nº 7 (cadena pesada para mAb CHIR-5.9). En la Figura 3B se muestra una variante de la cadena pesada para mAb CHIR-5.9 (véase también SEC ID Nº 8), que difiere de la SEC ID Nº 7 porque tiene un residuo alanina sustituido por un residuo serina en la

posición 158 de SEC ID Nº 7.

Como se espera para los anticuerpos derivados de hibridomas independientes, hay una variación sustancial en las secuencias de nucleótidos en las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Se cree que la diversidad en la región de CDR3 de VH determina de manera significativa la especificidad del anticuerpo.

Como se muestra por medio del análisis FACS, CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen específicamente al CD40 humano y pueden prevenir la unión del ligando de CD40. Ambos mAb pueden competir con la unión previa del ligando de CD40 al CD40 de la superficie celular. La afinidad de unión de CHIR-5.9 al CD40 humano es de 1,2 x 10-8 M y la afinidad de unión de CHIR-12.12 al CD40 humano es de 5 x 10-10 M.

Los anticuerpos monoclonales CHIR-12.12 y CHIR-5.9 son fuertes antagonistas e inhiben la proliferación mediada por ligando de CD40 in vitro de células B normales, así mismo inhiben la proliferación mediada por ligando de CD40 in vitro de células de cáncer en pacientes NHL y CLL. In vitro, ambos anticuerpos matan células de cáncer primarias de pacientes NHL por ADCC. Se observó actividad anti-tumor dependiente de la dosis en un modelo de linfoma de humano de xenoinjerto.

La leucemia linfocítica crónica de células B (CLL) se caracteriza por acumulación in vivo de células CD5+B longevas. No obstante cuando se cultivan in vitro, las células de CLL mueren rápidamente por apoptosis. La protección frente a la apoptosis in vivo se cree que resulta del suministro de señales de supervivencia del microambiente. La estimulación de CD40 de células de CLL por ligando CD40 se identifica por ser una de esas señales de supervivencia.

Los siguientes estudios se emprendieron para determinar si mAbs CHIR-5.9 y CHIR-12.12 anti-CD40 antagonistas muestran las siguentes propiedades: (1) se unen a células de pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL); (2) promueven la muerte celular en células de pacientes con CLL mediante bloqueo de señales de supervivencia inducidas por ligando de CD40; (3) tienen alguna actividad estimulatoria/inhibitoria por sí mismas para células de leucemia linfocítica crónica (CLL) ; y/o (4) median la ADCC como un modo de acción. Ejemplo 1: CHIR-5.9 y CHIR-12.12 pueden bloquear la supervivencia y la proliferación mediadas por CD40 de células cancerosas de pacientes con CLL

Los anticuerpos candidatos pueden bloquear la supervivencia y la proliferación mediadas por CD40 de células cancerosas de pacientes con CLL. Se cultivaron células de CLL de pacientes en suspensión sobre células CHO que expresan CD40L fijadas con formaldehído bajo dos condiciones diferentes: adición de anticuerpo IgG de isotipo humano (control); y adición de anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o CHIR-12.12. Todos los anticuerpos se añadieron en concentraciones de 1, 10 y 100 µg/ml en ausencia de IL-4. Los recuentos de células se realizaron a las 24 y 48 horas por medio de ensayo MTS. Se recuperaron números de células reducidos de los cultivos tratados con CHIR-5.9 (n = 6) y

5 CHIR-12.12 (n = 2) comparados con el grupo de control. Las mayores diferencias en los números de células entre los cultivos tratados con mAb anti CD40 y tratados con anticuerpo de control se observaron en el punto temporal de 48 horas. Estos datos se resumen en la Tabla 2.

10 Tabla 2.El efecto de los anticuerpos candidatos en la supervivencia y la proliferación inducidas por CD40 de células cancerosas de pacientes con CLL medido a las 48 horas tras iniciar el cultivo

Paciente Nº

Conc. Ab µg/ml Número relativo de células % de reducción en el número de células *

IgG1

CHIR5.9/5.11 CHIR12.12 CHIR 5.95.11 CHIR12.12

1

1 10 100 269,31 101,58 130,71 25,27 33,07 40,16 ND ND ND 90,62 67,44 69,28 ND ND ND

2

1 10 100 265,55 227,57 265,99 75,8 128,5 6,4 ND ND ND 71,46 43,53 97,59 ND ND ND

3

1 10 100 85,9 70,44 77,65 35,39 39,51 20,95 ND ND ND 58,80 43,91 73,02 ND ND ND

4

1 10 100 80,48 63,01 55,69 15,03 19,51 3,65 ND ND ND 81,32 69,04 93,45 ND ND ND

5

1 10 100 90,63 78,13 63,53 91,66 82,28 86,47 89,59 60,41 39,59 -1,14 -5,31 -36,11 1,15 22,68 37,68

6

1 10 100 130,21 131,77 127,08 77,6 78,13 76,56 71,88 73,96 82,29 40,40 40,71 39,75 44,80 43,87 35,25

Paciente Nº

Conc. Ab µg/ml Número relativo de células % de reducción en el número de células *

IgG1

CHIR5.9/5.11 CHIR12.12 CHIR 5.95.11 CHIR12.12

* % de reducción comparado con Ab de control = 100 – (Ab de prueba/Ab de control) * 100

Un segundo estudio reveló resultados similares. En este estudio se cultivaron

células de CLL primarias de 9 pacinetes en suspensión sobre células de CHO fijadas con

formaldehído que expresan CD40L en presencia a ausencia de 1, 10 o 100 µg/ml de mAb

5 CHIR-12.12 anti-CD40 de la forma descrita anteriormente, usando IgG no específico como el control. Después de 48 y 72 horas, se midió la proliferación de los cultivos como se indicaba anteriormente. En ausencia de mAb CHIR-12.12 anti-CD40, las células de CLL primarias bien resistían la muerte celular espontánea o bien proliferaban. Este efecto fue inhibido en presencia de mAb CHIR-12.12, que reestablecía la muerte de células de

10 CLL. Por tanto, estos resultados demuestran la inhibición de proliferación de células de CLL inducida por CD40 con el mAb CHIR-12.12 anti-CD40 a las 48 y 72 horas. Véanse las Figuras 5A y 5B. Se llevaron a cabo experimentos similares en células de CLL no estimuladas en presencia de mAb CHIR-12.12 sólo. El mAb CHIR-12.12 (10 µg/ml) solo no inducía la

15 proliferación de CLL y por tanto no presentaba un efecto estimulatorio en células de CLL en comparación con el IgG de control (10 µg/ml) a las 48 y 72 horas. Véanse las Figuras 6A y6B. Ejemplo 2: Capacidad de mAb CHIR-12.12 anti-CD40 para lisar líneas celulares de leucemia linfocítica crónica (CLL) por citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo

20 (ADCC) Se cultivó la línea celular de CLL EHEB con mAb CHIR-12.12 anti-CD40 antagonista o el anticuerpo anti-CD20 Rituxan® (IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego, California) y células NK humanas recién aisladas de donadores de sangre voluntarios normales como células efectoras. Se midió la lisis específica en porcentaje en

25 base a la liberación de marcador de células diana. El mAb CHIR-12.12 anti-CD40 mostró actividad de lisis de una forma dependiente de la dosis y alcanzó niveles de lisis máximos a 0,1 µg/ml (Figura 7). Como se muestra en la Figura 7, mAb CHIT-12.12 inducía mayor lisis celular mediada por ADCC que Rituxan® (lisis específica máxima con mAb CHIR-12.12 = 27,2% frente a lisis específica máxima

con Rituxan® = 16,2%; p = 0,007). En base a estos resultados, estaban presentes aproximadamente 10 veces más sitios de unión para anticuerpo anti-CD20 que para anticuerpo anti-CD40 en las células diana (véase la tabla 3), indicativo de que menos moléculas de CD40 son expresadas en la línea celular de CLL EHEB cuando se 5 comparan con la expresión de CD20. De hecho la línea celular diana CLL expresaba 509,053 + 13,560 moléculas CD20 en comparación con 48,416+584 moléculas CD40. Por tanto el mayor ADCC mediado por mAb CHIR-12.12 no era debido a la mayor densidad de moléculas CD40. Por tanto la mayor ADCC mediada por mAb CHIR-12.12 no era debida a la mayor densidad de moléculas de CD40 en esta línea celular de CLL en

10 comparación con las moléculas de CD20. Tabla 3: relación de sitio de unión de línea celular EHEB diana

Línea celular

% de lisis máximo Relación de sitios máxima CD20/CD40 de unión

mAb CHIR-12.12

Rituxan®

EHEB

27,19 16,21 10,51

Ejemplo 3: CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen a un epítopo diferente que 15B8 en CD40 Los anticuerpos monoclonales candidatos CHIR-5.9 y CHIR-12.12 compiten uno

15 con el otro por la unión al CD40 pero no con 15B8, un mAb IgG2 anti CD40 (véase documento de Publicación Internacional Nº WO 02/28904). Se diseñaron estudios de unión competitiva de anticuerpos usando Biacore con chips biosensores CM5 con proteína A inmovilizada por medio de acoplamiento de aminas, que se usó para capturar anti CD40, CHIR-12.12, o 15B8. Se observaron las curvas de unión de

20 asociación/disociación normales con concentraciones variables de CD40-his (datos no mostrados). Para los estudios de competición, se capturaron CHIR-12.12 o 15B8 en la superficie de la proteína A. Posteriormente se hizo fluir un complejo CD40-his / Fab de CHIR-5.9 (CD40 100 nM: Fab de CHIR-5.9 1 µM), en concentraciones variables, a través de la superficie modificada. En el caso de CHIR-12.12, no se observó asociación del

25 complejo, que indica que CHIR-5.9 bloquea la unión de CHIR-12.12 a CD40-his. Para 15B8, se observó asociación del complejo Fab CHIR-5.9 que indica que CHIR-5.9 no bloquea la unión de 15B8 al sitio de unión de CD40. Sin embargo, la tasa de disociación del complejo aumentó drásticamente (datos no mostrados).

También se determinó que 15B8 y CHIR-12.12 no compiten por la unión de CD4030 his. Este experimento se llevó a cabo capturando CHIR-12.12 en el chip biosensor de proteína A, bloqueando los sitios residuales de proteína A con hIgG1 control, uniendo

CD40-his y a continuación haciendo fluir 15B8 sobre la superficie modificada. 15B8 se unió bajo estas condiciones indicando que CHIR-12.12 no bloquea la unión de 15B8 al CD40. Ejemplo 4: Propiedades de unión de CHIR-12.12 y CHIR-5.9 mAb

5 Se inmovilizó proteína A en chips biosensores CM5 a través de acoplamiento de aminas. Se capturaron anticuerpos monoclonales anti-CD40 humanos, en una concentración de 1,5 µg/ml, sobre la superficie modificada del biosensor durante 1,5 minutos a 10 µl/min. Se hizo fluir CD40-his recombinante soluble sobre la superficie del biosensor en concentraciones variables. El anticuerpo y el antígeno se diluyeron en

10 HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P al 20 0,005% (HBSEP). Se determinaron las constantes cinéticas y de afinidad usando el programa informático Biaevaluation con un ajuste de interacción modelo/global de 1:1.

Como se muestra en la Tabla 4 a continuación, hay una diferencia de 121 veces en la tasa de disociación de CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que da como resultado una afinidad 15 24 veces mayor para CHIR-12.12. Tabla 4: resumen de propiedades de unión de anticuerpos anti-CD40 CHIR-5.9 y CHIR

12.12

Anticuerpo

ka (M-1 seg-1) kd (seg-1) KD (nM)

Anti-CD40,CHIR-5.9

(12,35 ± 0,64) x 105 (15,0 ± 1,3) x 10-3 12,15 ± 0,35

Anti-CD40,CHIR-12.12

(2,41 ± 0,13) x 105 (1,24 ± 0,06) x 10-4 0,51 ± 0,02

Para determinar la localización del epítopo en CD40 reconocido por los

20 anticuerpos monoclonales CHIR-12.12 y CHIR-5.9, se realizaron análisis SDS-PAGE y transferencia Western. Se separó CD40 purificado (0,5 µg) en un gel NUPAGE al 4-12% bajo condiciones reductoras y no reductoras, se transfirió a membranas PVDF, y se realizó el sondeo con anticuerpos monoclonales en una concentración de 10 µg/ml. Las transferencias se sondearon con IgG anti humano conjugada con fosfatasa alcalina y se

25 desarrolló usando el sustrato estabilizado Azul Western® para fosfatasa alcalina (Promega). Los resultados indican que el anticuerpo monoclonal anti CD40 CHIR12.12 reconoce epítopos tanto en la forma no reducida como en la forma reducida de CD40, exhibiendo la forma no reducida de CD40 mayor intensidad que la forma reducida de

30 CD40 (Tabla 15; transferencias no mostradas). El hecho de que el reconocimiento fuera positivo para ambas formas de CD40 indica que este anticuerpo interactúa con un epítopo conformacional, parte del cual es una secuencia lineal. El anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 reconoce principalmente la forma no reducida de CD40 sugiriendo que este anticuerpo interactúa principalmente con un epítopo conformacional (Tabla 5; transferencias no mostradas).

Tabla 5. Identificación de dominios.

Dominio 1

Dominio 2 Dominio 3 Dominio 4

mAb CHIR-12.12

- + - -

mAb CHIR-5.9

- + - -

mAb 15B8

+ - - -

5

Para realizar un mapa de la región antigénica en CD40, se clonaron los cuatro dominios extracelulares de CD40 y se expresaron en células de insecto como proteínas de fusión GST. La secreción de los cuatro dominios se aseguró con una señal de secreción GP67. El sobrenadante de las células de insecto se analizó por análisis SDS

10 PAGE y transferencia Western para identificar el dominio que contenía el epítopo. El anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 reconoce un epítopo en el Dominio 2 tanto bajo condiciones reductoras como no reductoras (Tabla 6; transferencias no mostradas). Por el contrario, el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 exhibe reconocimiento muy débil para el Dominio 2 (Tabla 6; transferencias no mostradas). Ninguno de estos anticuerpos

15 reconoce los Dominios 1, 3 ó 4 en este análisis. Tabla 6. Análisis del Dominio2.

Reducido

No reducido

mAb CHIR-12.12

++ +++

mAb CHIR-5.9

+ +

Para definir con más precisión el epítopo reconocido por el mAb CHIR-12.12, se sintetizaron péptidos del Dominio 2 extracelular de CD40, que corresponde a la secuencia 20 PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQ-KGTSETDTICT (residuos 61-104 de la secuencia mostrada en SEC ID Nº 10 o SEC ID Nº 12). Se generaron membranas de síntesis SPOTs (Sigma) conteniendo treinta y cinco péptidos 10-meros con un desplazamiento de 1 aminoácido. Se realizó el análisis de transferencia Western con mAb CHIR-12.12 y anti IgG humana marcado con beta galactosidasa como anticuerpo 25 secundario. Se desmontó la transferencia y se volvió a sondear con mAb CHIR-5.9 para

determinar la región reconocida por este anticuerpo.

Los análisis SPOTs sondando con anticuerpo monoclonal anti CD40 CHIR-12.12 en una concentración de 10 µg/ml dieron reacciones positivas con las transferencias 18 a

22. La región de la secuencia cubierta por estos péptidos se muestra en la Tabla 7.

Tabla 7.Resultados de análisis SPOTs con sondeo con anticuerpo monoclonal anti CD40 CHIR-12.12.

Número de transferencia

Región de la secuencia

18

HQHKYCDPNL (residuos 78-87 de SEC ID Nº: 10 o 12)

19

QHKYCDPNLG (residuos 79-88 de SEC ID Nº: 10 o 12)

20

HKYCDPNLGL (residuos 80-89 de SEC ID Nº: 10 o 12)

21

KYCDPNLGLR (residuos 81-90 de SEC ID Nº: 10 o 12)

22

YCDPNLGLRV (residuos 82-91 de SEC ID Nº: 10 o 12)

Estos resultados corresponden a un epítopo lineal de: YCDPNL (residuos 82-87 de la secuencia mostrada en SEC ID Nº:10 o SEC ID Nº 12). Este epítopo contiene Y82, 10 D84 y N86, que se ha predicho que están implicados en la interacción CD40-ligando de

CD40.

Los análisis SPOTs con mAb CHIR-5.9 mostraron un débil reconocimiento de los

péptidos representados por las transferencias 20-22 mostradas en la Tabla 8, sugiriendo

implicación de la región YCDPNLGL (residuos 82-89 de la secuencia mostrada en SEC

15 ID Nº 10 o SEC ID Nº 12) en su unión a CD40. Debe señalarse que los mAb CHIR-12.12 y CHR-5.9 compiten uno con el otro por la unión a CD40 en el análisis BIACORE. Tabla 8. Resultados de análisis SPOTs con sondeo con anticuerpo monoclonal anti CD40 CHIR-5.9.

Número de transferencia

Región de la secuencia

20

HKYCDPNLGL (residuos 80-89 de SEC ID Nº: 10 o 12)

21

KYCDPNLGLR (residuos 81-90 de SEC ID Nº: 10 o 12)

22

YCDPNLGLRV (residuos 82-91 de SEC ID Nº: 10 o 12)

Los epítopos lineales identificados por los análisis SPOTs están dentro del módulo

B1 de CD40. La secuencia del módulo B1 de CD40 es:

HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC (residuos 80-103 de SEC ID Nº 10 o 12).

Dentro del epítopo lineal identificado para CHIR-12.12 está C83. Se sabe que este residuo de cisteína forma un enlace disulfuro con C103. Es probable que el epítopo conformacional del mAb CHIR-12.12 contenga este enlace disulfuro (C83-C103) y/o aminoácidos vecinos conformacionalmente próximos a C103. Ejemplo 6: CHIR-12.12 bloquea las vías de supervivencia y de señal de CD40 mediadas por CD40L en células B humanas normales

El ligando de CD40 soluble (CD40L) activa las células B e induce diversos aspectos de respuestas funcionales, incluidos el aumento de la supervivencia y la proliferación, y la activación de las vías de señales de NFκB, ERK/MAPK, PI3K/Akt y p38. Además, la estimulación de CD40 mediada por CD40L proporciona señales de supervivencia por reducción de PARP escindido e inducción de proteínas antiapoptóticas, XIAP y Mcl-1, en células B normales. La estimulación de CD40 mediada por CD40L también recluta TRAF2 y TRAF3 para la unión al dominio citoplasmático de CD40.

Los siguientes estudios demuestran que CHIR-12.12 inhibió directamente todos estos efectos de la estimulación en las células B humanas normales. Por ejemplo, el tratamiento con CHIR-12.12 dio como resultado el aumento de escisión de caspasa-9, caspasa-3 y PARP así como la reducción de XIAP y Mcl-1 de una manera dependiente del tiempo y de la dosis, restaurando la apoptosis de las células B. El tratamiento con CHIR-12.12 también inhibió la fosforilación de IκB cinasa (IKK) α y β (vía de NFκB), ERK, Akt y p38 en respuesta a la estimulación de CD40 mediada por CD40L. Además, se encontró que CHIR-12.12 no provocó estos efectos apoptóticos sin la estimulación inicial de CD40 mediada por CD40L. CHIR-12.12 inhibió la supervivencia mediada por ligando de CD40 al inducir la escisión de PARP

En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos, a las 2 horas, 6 horas, 18 horas y 26 horas. Se detectaron controles de caspasa 9 escindida, caspasa 3 escindida, PARP escindida y β actina en los lisados celulares por transferencia Western.

En resumen, se observó que la estimulación de CD40 mediada por CD40L proporcionó señales de supervivencia ya que no dio lugar a aumentos de caspasa 9 escindida, caspasa 3 escindida o PARP escindida con el tiempo, indicando que las células no estaban sufriendo apoptosis. Sin embargo, el tratamiento con CHIR-12.12 dio como resultado un aumento de estos productos de escisión, indicando que el tratamiento con CHIR-12.12 anuló los efectos de la unión de CD40L en las señales de supervivencia en las células B normales estimuladas con cCD40L, restaurando la apoptosis de las células B (datos no mostrados).

CHIR-12.12 inhibió la expresión de proteínas antiapoptóticas de “supervivencia”

En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos, a las 2 horas, 6 horas, 18 horas y 26 horas. Se detectaron controles de Mcl-1, XIAP, CD40 y β actina en los lisados celulares por transferencia Western. En resumen, la estimulación con sCD40L dio como resultado la expresión sostenida de Mcl-1 y XIAP con el tiempo. Sin embargo, el tratamiento de las células estimuladas con sCD40L con CHIR-12.12 dio como resultado una disminución en la expresión de estas proteínas con el tiempo (datos no mostrados). Como Mcl-1 y XIAP son señales de “supervivencia” capaces de bloquear la vía apoptótica, estos resultados demuestran que el tratamiento con CHIR-12.12 elimina el bloqueo contra la apoptosis en las células B normales estimuladas con sCD40L. El tratamiento con CHIR-12.12 inhibió la fosforilación de IKK α (Ser180) e IKK β (Ser 181) en células B normales.

En estos experimentos, se estimularon 1,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se detectaron los controles de IKK α (Ser180) e IKK β (Ser 181) y de IKK β total en los lisados celulares por transferencia Western.

En resumen, la estimulación por medio de sCD40L dio como resultado la fosforilación de IKK α (Ser180) e IKK β (Ser 181) con el tiempo; sin embargo, el tratamiento con CHIR-12.12 anuló esta respuesta a la estimulación de sCD40L en las células B normales (datos no mostrados). El tratamiento con CHIR-12.12 inhibió la supervivencia mediada por ligando de CD40 de una manera dependiente de la dosis.

En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (0,01, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a las 24 horas. Se detectaron los controles de PARP escindida y β actina en los lisados celulares por transferencia Western.

Brevemente, el tratamiento con CHIR-12.12 dio como resultado el aumento de escisión de PARP en células estimuladas con sCD40L de una manera dependiente de la dosis y, por consiguiente, anuló la vía de señales de supervivencia en las células B normales estimuladas con sCD40L (datos no mostrados). CHIR-12.12 inhibió la expresión de proteínas antiapoptóticas de “supervivencia” de una manera dependiente de la dosis.

En estos experimentos, se estimularon 0,6 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió CHIR-12.12 (0,5, 2 y 10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a las 22 horas. Se detectaron los controles de Mcl-1, XIAP, PARP escindida y β actina en los lisados celulares por transferencia Western.

Brevemente, el tratamiento con CHIR-12.12 redujo la expresión de Mcl-1 y XIAP y aumentó la expresión de PARP en células estimuladas con sCD40L de una manera dependiente de la dosis y, por consiguiente, anuló estos bloqueos a la vía apoptótica en las células B normales estimuladas con sCD40L (datos no mostrados). CHIR-12.12 no afecta la expresión de proteínas antiapoptóticas, PARP escindida y XIAP, en ausencia de señales de CD40L soluble.

En estos experimentos, se estimularon 1,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95%) con CHIR-12.12 (10 µg/ml) e IgG de control sola (es decir, las células no se estimularon previamente con sCD40L antes de añadir el anticuerpo). Las células se recogieron a las 0, 4, 14 y 16 horas. Se detectaron los controles de XIAP, PARP escindida y β actina en los lisados celulares por transferencia Western.

Brevemente, los resultados muestran que sin estimulación de sCD40L, las células expresaron concentraciones aumentadas de PARP escindida, mientras que la expresión de XIAP permaneció constante, tanto en las células tratadas con IgG de control como en las tratadas con CHIR-12.12 (datos no mostrados). Estos datos indican que CHIR-12.12 no provoca apoptosis en las células B humanas normales sin estimulación de CD40L. CHIR-12.12 inhibe la fosforilación de IKKα (Ser180) e IKKβ (Ser181), Akt, ERK y p38 en las células B normales.

En estos experimentos, se privaron de suero en medio que contenía FBS al 1% 1,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95%) y se estimularon con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). Los cultivos se trataron con CHIR-12.12 (1 y 10 µg/ml) e IgG de control. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se detectaron fosfo-IKKα, fosfoIKKβ, IKKβ total, fosfoERK, ERK total, fosfo-Akt, Akt total, fosfo-p38 y p38 total en los lisados celulares por transferencia Western.

En resumen, la estimulación con sCD40L dio como resultado aumentos en la fosforilación de IKKα/β, fosforilación de ERK, fosforilación de Akt y fosforilación de p38, por consiguiente dando lugar a la supervivencia y/o proliferación de las células. El tratamiento de las células con CHIR-12.12 anuló los efectos de la estimulación de sCD40L en estas vías de señales en las células B normales (datos no mostrados). CHIR 12.12 inhibe las vías de señales tales como PI3K y MEK /ERK en la cascada de señales de CD40.

En estos experimentos, se privaron de suero en medio que contenía FBS al 1% 1,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95%) y se estimularon con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU). Los cultivos se trataron también con CHIR-12.12 (1 y 10 µg/ml), Wortmanin (un inhibidor de PI3K/Akt, 1 y 10 µM), LY 294002 (un inhibidor de PI3K/Akt; 10 y 30 µM) y PD 98095 (un inhibidor de MEK, 10 y 30 µg/ml). Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se detectaron fosfoERK, fosfo-Akt, Akt total, fosfo-IKKα/β y total en los lisados celulares por transferencia Western.

En resumen, los resultados muestran que CHIR-12.12 anuló la fosforilación de todas estas moléculas de transducción de señales, mientras que los inhibidores de transducción de señales mostraron sólo anulación específica de las señales, indicando que CHIR-12.12 probablemente inhibe en una etapa anterior a estas moléculas de transducción de señales mediadas por la estimulación por CD40L (datos no mostrados). CHIR-12.12 inhibe la unión de las moléculas de señal TRAF2 y TRAF3 al dominio citoplásmico de CD40 en las células B normales.

En estos experimentos, se privaron de suero durante cuatro horas en medio que contenía FBS al 1% 4,0 x 106 células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95%) y se estimularon con sCD40L 1 µg/ml (Alexis Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU) durante 20 minutos. Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se inmunoprecipitó CD40 usando anti CD40 policlonal (Santa Cruz Biotechnology, CA), y se sondeó en una transferencia Western con mAb anti TRAF2 (Santa Cruz Biotechnology, CA), mAb anti TRAF3 (Santa Cruz Biotechnology, CA), y mAb anti CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA).

En resumen, los resultados muestran que TRAF2 y TRAF3 precipitaron conjuntamente con CD40 tras la estimulación de sCD40L. Por el contrario, el tratamiento con CHIR-12.12 anuló la formación del complejo de señal CD40-TRAF2/3 en células B normales estimuladas con sCD40L. No hubo cambios en la expresión de CD40 (datos no mostrados).

Sin estar ligados por la teoría, los resultados de estos experimentos, y los resultados en los ejemplos resumidos anteriormente, indican que el anticuerpo CHIR

12.12 es un anticuerpo monoclonal anti CD40 antagonista de acción dual que tiene una única combinación de atributos. Este anticuerpo monoclonal totalmente humano bloquea las vías de señales de CD40 mediadas por CD40L para la supervivencia y la proliferación de las células B; este antagonismo da lugar finalmente a la muerte celular. CHIR-12.12 también media el reconocimiento y la unión por las células efectoras, iniciando la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Una vez que CHIR-12.12 está unido a las células efectoras, se liberan las enzimas citolíticas, dando lugar a la apoptosis y lisis de las células B. CHIR-12.12 es un anticuerpo antitumoral más potente que rituximab cuando se compara en modelos de tumores preclínicos. Ejemplo 7: Formulación farmacéutica líquida para anticuerpos anti CD40 antagonistas

El objetivo de este estudio fue investigar los efectos del pH de la disolución en la estabilidad del anticuerpo anti CD40 antagonista CHIR-12.12 por medio de procedimientos biofísicos y bioquímicos para seleccionar el entorno de disolución óptimo para este anticuerpo. Los resultados de calorimetría diferencial de barrido (DSC) mostraron que la estabilidad de la conformación de CHIR-12.12 es óptima en formulaciones que tienen pH 5,5-6,5. Basado en una combinación de análisis SDSPAGE, HPLC de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) y HPLC de intercambio catiónico (CEX-HPLC), la estabilidad fisicoquímica de CHIR-12.12 es óptima a un pH de aproximadamente 5,0-5,5. En vista de estos resultados, una formulación farmacéutica líquida recomendada que comprende este anticuerpo es una formulación que comprende CHIR-12.12 en una concentración de aproximadamente 20 mg/ml formulada en succinato de sodio aproximadamente 10 mM, cloruro de sodio aproximadamente 150 mM y que tiene un pH de aproximadamente pH 5,5. Materiales y procedimientos

El anticuerpo CHIR-12.12 utilizado en los estudios de formulación es un anticuerpo monoclonal humano producido por un proceso de cultivo de células CHO. Este mAb tiene un peso molecular de 150 kDa y está constituido por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas unidas juntas por enlaces disulfuro. Está dirigido contra el receptor de CD40 de superficie celular en las células que expresan CD40, incluidas las células B normales y malignas, para el tratamiento de diversos tipos de cáncer y enfermedades autoinmunes/inflamatorias.

La sustancia del fármaco anti CD40 utilizada para este estudio fue un lote a granel

5 de anti CD40 (CHIR-12.12) purificado obtenido de células CHO. La composición de la sustancia del fármaco era de anticuerpo CHIR-12.12 9,7 mg/ml en citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, a pH 6,5. La muestra de control en el estudio era la sustancia del fármaco recibida, seguida por congelación a ≤ -60 ºC, descongelación a TA y probada junto con muestras de estabilidad en los puntos temporales predeterminados.

10 Las muestras de estabilidad se prepararon por diálisis de la sustancia del fármaco contra disoluciones de diferentes pH y la concentración de CHIR-12.12 en cada una de las muestras se determinó por UV 280 tal como se presenta en la Tabla 9. Tabla 9. Formulaciones de CHIR-12.12.

Composición tampón

pH Concentración de CHIR-12.12 (mg/ml)

Citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM

4,5 9,0

Succinato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM

5,0 9,3

Succinato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM

5,5 9,2

Citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM

6,0 9,7

Citrato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM

6,5 9,4

Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM

7,0 9,4

Fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM

7,5 9,5

Glicina 10 mM, cloruro de sodio 150 mM

9,0 9,5

15 La estabilidad fisicoquímica del anticuerpo CHIR-12.12 en las diversas formulaciones se ensayó usando los siguientes protocolos.

Calorimetría diferencial de barrido (DSC)

La estabilidad conformacional de diferentes muestras de formulaciones se controló usando un MicroCal VP-DSC tras calentar de 15 ºC hasta 90 ºC a razón de 1 ºC/min. SDS-PAGE

Se estimó la fragmentación y la agregación usando gel Tris-glicina al 4-20% bajo condiciones no reductoras y reductoras. Se detectaron las proteínas por medio de tinción con azul Coomassie. Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC-HPLC)

La fragmentación y agregación de proteínas también se midió por medio de un sistema de HPLC Water Alliance con una columna Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL, con fosfato de sodio 100 mM, pH 7,0 como fase móvil a un caudal de 0,7 ml/min. Cromatografía de intercambio catiónico (CEX-H PLC)

La degradación relacionada con el cambio de cargas se midió usando un sistema de HPLC Waters 600s con una columna Dionex Propac WCX-10, con HEPES 50 mM, pH 7,3 como fase móvil A y HEPES 50 mM que contenía NaCl 500 mM, pH 7,3 como fase móvil B a un caudal de 0,5 ºC/min. Resultados y discusión Estudio de estabilidad conformacional.

El desplegamiento térmico de CHIR-12.12 reveló al menos dos transiciones térmicas, que representan probablemente el desplegamiento y fusión de los dominios Fab y Fc, respectivamente. A temperaturas más altas, la proteína presumiblemente agregó, dando lugar a pérdida de la señal de DSC. Con la finalidad de seleccionar la formulación, se definió la temperatura de transición térmica más baja como la temperatura de fusión, Tf, en este estudio. La Figura 8 muestra la temperatura de fusión térmica como una función de los pH de las formulaciones. Las formulaciones a pH 5,5-6,5 proporcionaron anti CD40 con estabilidad conformacional superior como se demuestra por las temperaturas de fusión térmica más elevadas. Análisis SDS-PAGE.

Las muestras de formulaciones de CHIR-12.12 a pH 4,5-9,0 se incubaron a 40 ºC durante 2 meses y se sometieron al análisis SDS-PAGE (datos no mostrados). Bajo condiciones no reductoras, se observaron especies con peso molecular (PM) de 23 kDa y 2,7 kDa en formulaciones con pH superior a 5,5, y se observaron especies con PM de 51 kDa en todas las formulaciones, pero aparecieron menos a pH 5,0-5,5. Pudo verse una especie con PM de 100 kDa a pH 7,5 y pH 9,0,

Bajo condiciones reductoras, CHIR-12.12 se redujo en cadenas pesadas y cadenas ligeras libres con PM de 50 kDa y 24 kDa, respectivamente. Las especies de 100 kDa parecieron no ser totalmente reducibles y aumentaron con el aumento del pH de la disolución, sugiriendo que podría existir asociación covalente diferente de disulfuro en las moléculas. Como había otras especies con identidades desconocidas en SDS-PAGE, la comparación de estabilidad para cada formulación se basa en la pureza restante de

5 CHIR-12.12. Las formulaciones a pH 5,0-6,0 proporcionaron un entorno más estable para CHIR-12.12. Se detectaron pocos agregados por medio de SDS-PAGE (datos no mostrados).

Análisis SEC-HPLC.

El análisis SEC-HPLC detectó el CHIR-12.12 intacto como la especie del pico

10 principal, una especie de agregación como una especie de pico anterior separada de la especie del pico principal, una especie de fragmento grande como un pico meseta en la parte posterior de la especie del pico principal, y se detectaron especies de fragmentos pequeños posteriores a las especies del pico principal. Tras la incubación a 5 ºC y 25 ºC durante 3 meses, se detectaron cantidades insignificantes de fragmentos y agregados de

15 proteínas (<1,0%) en las formulaciones anteriores y las especies del pico principal de CHIR-12.12 siguieron teniendo más del 99% de pureza (datos no mostrados). Sin embargo, se desarrollaron gradualmente fragmentos tras el almacenamiento a 40 ºC y se formaron más fragmentos a pH 4,5 y pH 6,5-9,0, como se muestra en la Tabla 21. Tras incubar las formulaciones de CHIR-12.12 a 40 ºC durante 3 meses, se detectó

20 aproximadamente 2-3% de agregados en pH 7,5 y pH 9,0, mientras que se detectó menos del 1% de agregados en las formulaciones a otros pH (datos no mostrados). Los resultados de SEC-HPLC indican que CHIR-12.12 es más estable a un pH de aproximadamente 5,0-6,0,

25 Tabla 10. Resultados de SEC-HPLC de muestras de estabilidad de CHIR-12.12 bajo condiciones de tiempo real y de almacenaje acelerado.

Muestra

Pico principal % Fragmentos %

t=0

40 °C 1 40 °C 2 40 °C 3 t=0 40 °C 1 40 °C 2 40 °C 3

m

m

m

m

m

m

Control

99,4 99,2 99,9 99,5 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0

pH 4,5

99,4 93,2 86,0 81,3 <1,0 6,4 13,2 18,1

pH 5,0

99,8 98,7 91,3 89,2 <1,0 <1,0 7,8 10,2

pH 5,5

99,8 98,9 91,4 90,6 <1,0 <1,0 7,6 8,8

pH 6,0

99,6 97,7 90,4 87,3 <1,0 1,9 8,2 11,7

pH 6,5

99,3 93,4 89,0 86,9 <1,0 5,6 9,9 12,4

pH 7,0

99,2 93,9 87,4 85,1 <1,0 5,5 11,1 13,5

Muestra

Pico principal % Fragmentos %

t=0

40 °C 1 40 °C 2 40 °C 3 t=0 40 °C 1 40 °C 2 40 °C 3

m

m

m

m

m

m

pH 7,5

99,1 92,8 84,4 81,9 <1,0 6,4 12,9 16,2

pH 9,0

99,3 82,4 61,6 50,6 <1,0 15,4 36,2 47,6

Análisis CEX-FIPLC.

El análisis CEX-HPLC detectó el CHIR-12.12 intacto como la especie del pico principal, las variantes ácidas eluyeron más temprano que las especies del pico principal 5 y las variantes de adición de lisina en el extremo C terminal eluyeron después de las especies de pico principal. La Tabla 11 muestra la dependencia de los porcentajes de las especies restantes de CHIR-12.12 del pico principal y las variantes ácidas en el pH de la disolución. La muestra de control ya contenía un alto grado de especies ácidas (aproximadamente 33%), probablemente debido a los procesos de fermentación de etapa 10 temprana y purificación. La susceptibilidad de CHIR-12.12 a las disoluciones de pH más alto se evidencia por dos hechos. Primero, la muestra de la formulación inicial a pH 9 (t = 0) ya generaba 12% más especies ácidas que el control. Segundo, el porcentaje de especies ácidas aumentó bruscamente con el aumento del pH. La degradación relacionada con el cambio de cargas se debe probablemente a la desamidación. Los

15 datos anteriores indican que este tipo de degradación de CHIR-12.12 se redujo al mínimo a pH de aproximadamente 5,0-5,5.

Tabla 11. Porcentaje de área de picos por CEX-HPLC para CHIR-12.12 en formulaciones de diferente pH bajo condiciones de tiempo real y de almacenamiento acelerado.

Muestra

Pico principal % Variantes ácidas %

t=0

5 ºC 25 ºC 40 ºC 40 ºC t=0 5 ºC 25 ºC 40 ºC 40 ºC

3 m

3 m

1 m 2 m 3 m 3 m 1 m 2 m

Control

49,2 49,8 49,8 49,2 50,3 32,0 33,7 33,7 32,0 33,6

pH 4,5

48,5 49,7 43,7 39,7 30,0 32,5 32,6 38,0 44,2 56,4

pH 5,0

49,6 49,8 48,3 40,6 31,4 32,7 31,8 35,0 44,3 57,1

pH 5,5

50,7 50,3 48,1 40,0 30,2 32,6 31,8 37,8 48,9 63,3

pH 6,0

50,2 49,9 47,9 37,4 23,9 33,1 33,6 38,5 54,9 72,7

pH 6,5

49,4 49,9 42,3 29,7 14,6 33,3 33,6 47,7 65,2 84,6

pH 7,0

49,7 49,9 21,9 - - 34,4 36,4 64,4 - -

pH 7,5

49,3 48,3 12,7 - - 35,5 40,1 79,2 - -

pH 9,0

41,3 31,8 - - - 44,7 59,9 - - -

Conclusión

El pH tiene un efecto significativo en la estabilidad conformacional y fisicoquímica de CHIR-12.12. Se determinó que la degradación relacionada con el cambio de cargas es la principal vía de degradación para CHIR-12.12, que se redujo al mínimo a pH 5,0-5,5. En base a los datos de estabilidad general, una formulación farmacéutica líquida recomendada que comprende este anticuerpo es una formulación que comprende CHIR

12.12 a una concentración de aproximadamente 20 mg/ml formulada en succinato de sodio aproximadamente 10 mM, cloruro de sodio aproximadamente 150 mM, y que tiene un pH de aproximadamente 5,5. Ejemplo 8: Estudios clínicos con CHIR-5.9 y CHIR-12.12

Objetivos clínicos

El objetivo general es proporcionar una terapia eficaz para leucemia linfocítica crónica (CLL) convirtiendo estos cánceres en dianas con una IgG1 anti CD40. La señal para estas enfermedades se determina en fase I aunque puede obtenerse alguna medición de actividad en fase I. Inicialmente, el agente se estudia como un agente único, pero se combinará con otros agentes, quimioterapéuticos, y otros anticuerpos a medida que proceda el desarrollo. Fase I

•

Evaluar la seguridad y la farmacocinética – aumento de dosis en sujetos con leucemia linfocítica crónica (CLL).

•

Elegir la dosis en base a la seguridad, tolerabilidad y cambio en los marcadores séricos de CD40. En general se busca una dosis máxima tolerable (DMT) pero pueden resultar adecuadas otras indicaciones de eficacia (depleción células B CD40+, etc.) para buscar la dosis.

•

Considerar más de una dosis cuando pueda ser necesario encontrar alguna dosis en fase II.

•

Los pacientes se dosifican semanalmente con toma de muestras para farmacocinética (Pk) en tiempo real. Inicialmente la dosis máxima permitida es un ciclo de 4 semanas. La Pk puede ser muy variable según la enfermedad estudiada, densidad de CD40, etc.

•

Este(os) ensayo(s) está(n) abierto(s) a sujetos con CLL.

•

La decisión para interrumpir o continuar los estudios se basa en la seguridad, dosis y pruebas preliminares de actividad antitumoral.

•

La actividad del fármaco, determinada por la tasa de respuesta, se determina en la Fase

II.

• Identificar dosi(s) para la Fase II.

Fase II

Se iniciarán varios ensayos en sujetos con CLL. Puede probarse más de una dosis y más de un programa en una configuración aleatorizada de fase II. Dirigirse a una población de CLL que ha fracasado con los cuidados convencionales 5 actuales (fallos de quimioterapia)

imagen1 La decisión para interrumpir o continuar con el estudio se basa en la prueba del concepto terapéutico en Fase II

imagen1 Determinar si puede usarse un marcador sustituto como indicación temprana para

la eficacia clínica 10 imagen1 Identificar las dosis para la Fase III

Fase III

La fase III dependerá de cuándo se detecta la señal en la fase II y de qué terapias competidoras se consideran el patrón de referencia. Si la señal se detecta en una etapa de la enfermedad en la que no hay patrón de referencia de terapia, entonces podrá servir

15 un estudio de un único brazo, bien controlado, como un ensayo fundamental. Si hay agentes competidores que se consideran patrones de referencia, entonces se realizan estudios directos.

Al experto en la técnica a la que pertenecen estas invenciones con el beneficio de los hallazgos presentados en las descripciones precedentes y los dibujos asociados, se le 20 ocurrirán muchas modificaciones y otras realizaciones de las invenciones descritas en este documento. En cualquier caso se debe entender que las invenciones no se limitan a las realizaciones específicas descritas y tales modificaciones y otras realizaciones se pretende que estén incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y lista de realizaciones descritas en el prsesente documento. Aunque se usan términos específicos

25 en el mismo, estos se usan en sentido genérico y descriptivo únicamente y no para fines limitativos.

LISTADO DE SECUENCIAS

30 <110> Aukeman, Lea Long, Li Luqman, Mohammad Yabannavar, Asha Zaror, Isabel

35

<120> Uso de anticuerpos anti-CD40 monoclonales antagonista para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica

<130> PP22708.002 (284267)

<150> 60/611.794

<151> 2004-09-21

<150> 60/565.710

<151> 2004-04-27

<150> 60/525.579

<151> 2003-11-26

<150> 60/517.337

<151> 2003-11-04

<160> 12

<170> FastSEQ para Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 720

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia codificadora para cadena ligera del anticuerpo anti CD40 12.12 humano

<221> CDS

<222> (1)...(720)

<400> 1

imagen2

imagen2

<210> 2

<211> 239

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera del anticuerpo anti CD40 12.12 humano

<400> 2 <210> 3

imagen2

<211> 2016

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia codificadora para cadena pesada del anticuerpo anti CD40 12.12 humano (con intrones)

<400> 3

imagen2

<210> 4 5 <211> 469

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Cadena pesada del anticuerpo anti CD40 12.12 humano

<400> 4

imagen2

<210> 5

<211> 469

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada de la variante del anticuerpo anti CD40 12.12 humano

<400> 5

imagen2

imagen2

<210> 6

<211> 239

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena ligera del anticuerpo anti CD40 5.9 humano

<400> 6

imagen2

<210> 7

<211> 474

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena pesada del anticuerpo anti CD40 5.9 humano

<400> 7

imagen2

<210> 8

<211> 474

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

<220>

<223> Cadena pesada de la variante del anticuerpo anti CD40 5.9 humano

10

<400> 8

imagen2

imagen2

<210> 9

<211> 612

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(612)

<221> característica miscelánea

<222> (0)...(0)

<223> Secuencia codificadora para la isoforma corta del CD40 humano

<400> 9

imagen2

<210> 10

<211> 203

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

imagen2

10 <210> 11

<211> 834

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15 <220>

<221> CDS

<222> (1)...(834)

<221> característica miscelánea 20 <222> (0)...(0)

<223> Secuencia codificadora para la isoforma larga del CD40 humano

<400> 11

5

10

15

20 5

imagen2

10

imagen2

<210> 12

<211> 277

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

imagen2

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula que expresa CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa, por lo que cuando se une dicho anticuerpo monoclonal al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, se inhibe el crecimiento o diferenciación de dicha célula, para uso en un procedimiento de tratamiento de un sujeto humano con leucemia linfocítica crónica (CLL), comprendiendo el procedimiento la administración a dicho sujeto de una cantidad efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CD-40 humano, seleccionándose dicho anticuerpo anti-CD40 monoclonal humano del grupo constituido por: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo

   monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543;

   b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12;

   c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº12;y

   d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
2. 2. Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula que expresa CD40 humano, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano con leucemia linfocítica crónica (CLL), por lo que cuando se une dicho anticuerpo monoclonal al antígeno CD40 expresado en la superficie de dicha célula, se inhibe el crecimiento o diferenciación de

   dicha célula, seleccionándose dicho anticuerpo anti-CD40 monoclonal humano del grupo

   constituido por:

   a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543;

   b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12;

   c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº12;y

   d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
3. 3. Un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a un antígeno CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40, para uso en un procedimiento de inhibición del crecimiento de células de leucemia linfocítica crónica (CLL) que expresan antígeno CD40, comprendiendo el procedimiento la puesta en contacto de dichas células con una cantidad efectiva del anticuerpo anti-CD40 monoclonal, seleccionándose dicho anticuerpo del grupo constituido por: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo

   monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543;

   b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12;

   c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº12;y

   d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
4. 4. Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a antígeno CD40 en la fabricación de un medicamento para la inhibición del crecimiento de células de leucemia linfocítica crónica (CLL) que expresan antígeno CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une a antígeno CD40, seleccionándose dicho anticuerpo del grupo constituido por: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo

   monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543;

   b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12;

   c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº12;y

   d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
5. 5. Un procedimiento in vitro para la inhibición del crecimiento de células de leucemia linfocítica crónica (CLL) que expresan antígeno CD40, comprendiendo dicho procedimiento la puesta en contacto de dichas células con una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-CD40 monoclonal humano que es capaz de unirse específicamente a

   dicho antígeno CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista

   significativa cuando se une al antígeno CD40, seleccionándose dicho anticuerpo del

   grupo constituido por:

   a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543;

   b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12;

   c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº12;y

   d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
6. 6. El anticuerpo, uso o procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho anticuerpo anti-CD40 monoclonal humano se selecciona del grupo constituido por:

   (i)

   un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene los residuos 44-54, 70-76 y 109-117 de SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 6;

   (ii)

   un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 50-54, 69-84 y 114-121 de SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 7;

   (iii) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene los residuos 46-52, 70-72 y 111-116 de SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 6; y

   (iv) un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene los residuos 45-51, 72-74 y 115-120 de SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 7.
7. 7. El anticuerpo, uso o procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho anticuerpo anti-CD40 monoclonal humano comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

   (i)

   los residuos 21-132 de SEC ID Nº 2;

   (ii)

   los residuos 21-239 de SEC ID Nº 2;

   (iii) SEC ID Nº 2;

   (iv)

   los residuos 20-139 de SEC ID Nº 4;

   (v)

   los residuos 20-469 de SEC ID Nº 4;

   (vi)

   SEC ID Nº 4;

   (vii) los residuos 20-469 de SEC ID Nº 5;

   (viii) SEC ID Nº 5;

   (ix)

   los residuos 21-132 de SEC ID Nº 2 y los residuos 20-139 de SEC ID Nº 4;

   (x)

   los residuos 21-239 de SEC ID Nº 2 y los residuos 20-469 de SEC ID Nº 4;

   (xi)

   los residuos 21-239 de SEC ID Nº 2 y los residuos 20-469 de SEC ID Nº 5;

   (xii) SEC ID Nº2 ySEC ID Nº 4; y

   (xiii) SEC ID Nº 2ySECID Nº5.
8. 8. El anticuerpo, uso o procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho anticuerpo anti-CD40 monoclonal humano comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

   (i)

   los residuos 21-132 de SEC ID Nº 6;

   (ii)

   los residuos 21-239 de SEC ID Nº 6;

   (iii) SEC ID Nº 6;

   (iv)

   los residuos 20-144 de SEC ID Nº 7;

   (v)

   los residuos 20-474 de SEC ID Nº 7;

   (vi)

   SEC ID Nº 7;

   (vii) los residuos 20-474 de SEC ID Nº 8;

   (viii) SEC ID Nº 8;

   (ix)

   los residuos 21-132 de SEC ID Nº 6 y los residuos 20-144 de SEC ID Nº 7;

   (x)

   los residuos 21-239 de SEC ID Nº 6 y los residuos 20-474 de SEC ID Nº 7;

   (xi)

   los residuos 21-239 de SEC ID Nº 6 y los residuos 20-474 de SEC ID Nº 8

   (xii) SEC ID Nº6 ySEC ID Nº 7; y

   (xiii) SEC ID Nº 6ySECID Nº8.
9. 9. El anticuerpo, uso o procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo constituido por el anticuerpo CHIR-5.9 producido por la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o CHIR-12.12 producida por la línea celular de hibridoma

   5 depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543.

10. 10.

    El anticuerpo, uso o procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho anticuerpo monoclonal se une al antígeno CD40 humano con una afinidad (KD) de al menos 10-6 M.

11. 11.

    El anticuerpo, uso o procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho anticuerpo monoclonal se une al antígeno CD40 humano con una afinidad (KD) de al menos 10-8 M.

    10

    15 12. El anticuerpo, uso o procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho anticuerpo monoclonal es un fragmento de unión al antígeno de dicho anticuerpo monoclonal anti-CD40, en el que dicho fragmento retiene la capacidad de unirse específicamente a dicho antígeno CD40 humano.

    20 13. El anticuerpo, uso o procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho fragmento se selecciona del grupo constituido por un fragmento Fab, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv y un fragmento Fv de cadena única.
12. 14. El anticuerpo, uso o procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el 25 que dicho anticuerpo monoclonal se produce en una línea celular CHO.