ES2348238T3 - Procedimientos de terapia para tumores sólidos que expresan el antígeno de superficie celular cd40. - Google Patents
Procedimientos de terapia para tumores sólidos que expresan el antígeno de superficie celular cd40. Download PDFInfo
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse específicamente al antígeno CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40, seleccionándose dicho anticuerpo del grupo constituido por: a) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543; b) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-87 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12; c) un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos 82-89 de la secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº 12; y d) un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva. para uso en el tratamiento de un sujeto humano con un tumor sólido que comprende células del carcinoma que expresa el antígeno CD40.
Description
Procedimientos de terapia para tumores sólidos
que expresan el antígeno de superficie celular CD40.
La invención se refiere a medicamentos para el
tratamiento, y a procedimientos in vitro para la inhibición
del crecimiento de, tumores sólidos usando anticuerpos humanos
anti-CD40 antagonistas, comprendiendo los tumores
sólidos células del carcinoma que expresan el antígeno de superficie
celular CD40.
CD40 es un antígeno de superficie celular de 55
kDa presente en la superficie de las células B normales y células B
neoplásicas humanas, células dendríticas, células presentadoras de
antígenos (APC), células endoteliales, células monocíticas y
epiteliales, algunos carcinomas epiteliales y muchos tumores
sólidos, incluyendo cánceres de pulmón, mama, ovario y colon. Las
células transformadas de pacientes con linfomas de células B de bajo
y alto grado, leucemia linfoblástica aguda de células B, mieloma
múltiple, leucemia linfocítica crónica y enfermedad de Hodgkin
expresan el antígeno CD40. La expresión de CD40 también se detecta
en dos tercios de los casos de leucemia mieloblástica aguda y en
50% de los linfomas relacionados con el SIDA. Las células B
malignas de diversos tumores de linaje de células B expresan un alto
grado de CD40 y parecen depender de la señal de CD40 para la
supervivencia y proliferación. Carcinomas que expresan CD40 incluyen
carcinoma de vejiga urinaria (Paulie y col. (1989) J. Immunol. 142:
590-595; Braesch-Andersen y col.
(1989) J. Immunol. 142: 562-567), carcinoma de mama
(Hirano y col. (1999) Blood 93: 2999-3007; Wingett y
col. (1998) Breast Cancer Res. Treat. 50: 27-36);
cáncer de próstata (Rokhlin y col. (1997) Cancer Res. 57:
1758-1768), carcinoma de células renales (Klutz y
col. (1997) Cancer Res. 57: 891-899), carcinoma
nasofaringeal no diferenciado (UNPC) (Agathanggelou y col. (1995)
Am. J. Pathol. 147: 1152-1160), carcinoma de células
escamosas (SCC) (Amo y col. (2000) Eur. J. Dermatol. 10:
438-442; Posner y col. (1999) Clin. Cancer Res. 5:
2261-2270), carcinoma papilar del tiroides (Smith y
col. (1999) Thyroid 9: 749-755), melanoma maligno
cutáneo (van den Oord y col. (1996) Am. J. Parasol. 149:
1953-1961), mieloma múltiple (Maloney y col. (1999)
Semin. Hematol. 36 (1 Suppl 3): 30-33), células de
Hodgkin y Reed-Sternberg (células cebadas) (Gruss y
col. (1994) Blood 84: 2305-2314), carcinoma gástrico
(Yamaguchi y col. (2003) Int. J. Oncol. 23 (6):
1697-702), sarcomas (véase, por ejemplo, Lollini y
col. (1998) Clin. Cancer Res. 4 (8): 1843-849,
discussing human osteosarcoma and Ewing's sarcoma), y carcinoma de
hígado (véase, por ejemplo, Sugimoto y col. (1999) Hepatology 30
(4): 920-26, discussing human hepatocellular
carcinoma).
El antígeno CD40 está relacionado con el
receptor del factor de crecimiento de los nervios (NGF) humano, el
receptor del factor de necrosis tumoral \alpha
(TNF-\alpha), y Fas, sugiriendo que CD40 es un
receptor para un ligando con funciones importantes en la activación
de las células B. Se ha demostrado que juega un papel crítico en el
desarrollo y función de las células B normales. La expresión de CD40
en las APC desempeña una función coestimuladora importante en la
activación de linfocitos T ayudantes y linfocitos T citotóxicos. El
receptor de CD40 se expresa en células T activadas, plaquetas
activadas y en células de músculo liso vascular inflamadas. Los
receptores de CD40 pueden encontrarse también en eosinófilos,
membranas sinoviales en la artritis reumatoide, en fibroblastos
dérmicos y en otras células no linfoides. La unión de CDL40 al
receptor de CD40 estimula la proliferación y diferenciación de las
células B, la producción de anticuerpos, el cambio de isotipo y la
generación de memoria de células B. Mediante algunas células del
carcinoma muestra altos niveles de expresión de CD40, no se
entiende bien el papel de la señalización de CD40 en relación a la
expresión de CD40 en estas células de cáncer.
El documento
WO-A-96/18413 desvela el tratamiento
de carcinomas en células epiteliales, y la prevención de
proliferación de células epiteliales, usando un conector del
receptor CD40. El conector del receptor de CD40 se puede usar junto
con al menos un agente anti-neoplástico y/o inductor
de CD40. Se describen anticuerpos inmunoregulatorios en el
documento WO-A-02/060485, que
describe una terapia de anticuerpo de combinación para el
tratamiento de cánceres de células B usando un anticuerpo
inmunoregulatorio, especialmente un anticuerpo
anti-B7, anti-CD23 o
anti-CD40L y un anticuerpo de eliminación de células
B, especialmente anti-CD19,
anti-CD20, anti-CD22 o
anti-CD37.
Se representan una mayoría de casos de cáncer
con los denominados tumores sólidos. Dada su alta incidencia, se
necesitan procedimientos para el tratamiento de estos cánceres.
La invención proporciona un anticuerpo
monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse
específicamente al antígeno CD40, estando dicho anticuerpo
monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une
al antígeno CD40, seleccionándose dicho anticuerpo del grupo
constituido por:
a) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal
CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de
hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543;
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b) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-87 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12;
c) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-89 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12; y
d) un anticuerpo monoclonal que compite con el
anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse
de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito
de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva,
para uso en el tratamiento de un sujeto humano
con un tumor sólido que comprende células del carcinoma que expresa
el antígeno CD40.
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La invención también proporciona el uso de una
cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal anti CD40 humano que es
capaz de unirse específicamente al antígeno CD40 en la fabricación
de un medicamento para el tratamiento de un sujeto humano con un
tumor sólido que comprende células de carcinoma que expresan el
antígeno CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de
actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40,
seleccionándose dicho anticuerpo del grupo constituido por:
a) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal
CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de
hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543;
b) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-87 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12;
c) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-89 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12; y
d) un anticuerpo monoclonal que compite con el
anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse
de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito
de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
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La invención también proporciona un
procedimiento in vitro para inhibir el crecimiento de un
tumor sólido que comprende células de carcinoma que expresan el
antígeno CD40, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto
dichas células con una cantidad eficaz de un anticuerpo monoclonal
anti CD40 humano que es capaz de unirse específicamente a dicho
antígeno CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de
actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40,
seleccionándose dicho anticuerpo del grupo constituido por:
a) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal
CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de
hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543;
b) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-87 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12;
c) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-89 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12; y
d) un anticuerpo monoclonal que compite con el
anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse
de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito
de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
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La invención también proporciona un anticuerpo
monoclonal anti CD40 humano que es capaz de unirse específicamente
al antígeno CD40, estando dicho anticuerpo monoclonal exento de
actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40,
seleccionándose dicho anticuerpo del grupo constituido por:
a) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal
CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de
hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543;
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b) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-87 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12;
c) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-89 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12; y
d) un anticuerpo monoclonal que compite con el
anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse
de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito
de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva,
para uso en la inhibición del crecimiento de un
tumor sólido que comprende células de carcinoma que expresan
antígeno CD40.
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La invención también proporciona el uso de una
cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal
anti-CD40 humano que es capaz de unirse
específicamente al antígeno CD40 en la fabricación de un medicamento
para la inhibición del crecimiento de un tumor sólido que comprende
células de carcinoma que expresa el antígeno CD40, estando dicho
anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa
cuando se une al antígeno CD40, seleccionándose dicho anticuerpo del
grupo constituido por:
a) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal
CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de
hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543;
b) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-87 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12;
c) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-89 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12; y
d) un anticuerpo monoclonal que compite con el
anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse
de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito
de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
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Otros aspectos de la invención se presentan en
las reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se desvelan procedimientos de tratamiento de un
tumor sólido en un sujeto, en el que las células de carcinoma del
tumor sólido expresan el antígeno de superficie celular CD40. Los
procedimientos comprenden el tratamiento del sujeto con un
anticuerpo monoclonal anti-CD40 antagonista o un
fragmento de unión al antígeno del mismo que está exento de
actividad agonista significativa cuando se une al antígeno CD40 en
una célula que expresa CD40 humana. La unión del anticuerpo
monoclonal anti-CD40 antagonista (o fragmento de
unión al antígeno adecuado del mismo que comprende la porción Fc
del anticuerpo anti-CD40 antagonista) a antígeno
CD40 expresado en células del carcinoma da lugar a citotoxicidad
mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCC) -citólisis
dependiente de estas células del carcinoma. En algunas
realizaciones, los anticuerpos anti-CD40
antagonistas se administran en combinación con uno o más protocolos
de terapia de cáncer distintos, incluyendo, pero sin limitarse a
estos, cirugía, terapia con radiación; quimioterapia, terapia con
citosina, u otro anticuerpo monoclonal que se prevea para uso en el
tratamiento del tumor sólido. Tumores sólidos que se pueden tratar o
prevenir con los procedimientos de la presente descripción
incluyen, pero sin limitarse a estos, cáncer de ovarios, pulmón (por
ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas del carcinoma de
células escamosas, adenocarcinoma, y tipos de carcinoma de células
grandes, y cáncer de células pequeñas del pulmón), mama, colon,
riñón (incluyendo, por ejemplo, carcinomas de células renales),
vejiga, hígado (incluyendo, por ejemplo, carcinomas
hepatocelulares), gástrico, de cuello uterino, próstata,
nasofaringeal, tiroides (por ejemplo, carcinoma papilar de
tiroides), y cánceres de piel tales como melanoma, y sarcomas
(incluyendo, por ejemplo, osteosarcomas y sarcomas de Ewing). Se
desvelan también procedimientos para la inhibición del crecimiento
de tumores sólidos que comprenden células de carcinoma que expresan
CD40.
Los anticuerpos adecuados para uso en los
procedimientos de la invención incluyen los anticuerpos monoclonales
descritos en el presente documento, que tienen una fuerte afinidad
por CD40 y se caracterizan por tener una constante de equilibrio de
disociación (K_{D}) de al menos 10^{-6} M, de preferencia al
menos 10^{-7} M hasta aproximadamente 10^{-8} M, de más
preferencia al menos aproximadamente 10^{-8} M hasta
aproximadamente 10^{-12} M. Los anticuerpos monoclonales y sus
fragmentos de unión al antígeno que son adecuados para uso en los
procedimientos de la invención son capaces de unirse específicamente
a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula
humana, particularmente una célula de carcinoma humano de un tumor
sólido. Están exentos de actividad agonista significativa pero
exhiben actividad antagonista cuando se unen al antígeno CD40 en
las células humanas. Como se demuestra para células B normales y
neoplásticas humanas que expresan CD40. Los anticuerpos
monoclonales adecuados tienen regiones humanas constantes; de
preferencia tienen también regiones del marco total o parcialmente
humanizadas; y de mayor preferencia son anticuerpos completamente
humanos o sus fragmentos de unión al antígeno.
Los ejemplos de tales anticuerpos monoclonales
son los anticuerpos denominados en el presente documento como
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que se pueden
producir de forma recombinante; los anticuerpos monoclonales
producidos por las líneas celulares de hibridoma denominadas
131.2F8.5.9 (a la que se hace referencia en el presente documento
como la línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hace
referencia en el presente documento como la línea celular 12.12);
un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo constituido por la secuencia mostrada en SEC
ID Nº 6, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 7; la secuencia
mostrada en SEC ID Nº 8, las secuencias mostradas en SEC ID Nº 6 y
SEC ID Nº 7, y las secuencias mostradas en SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº
8; un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la secuencia
mostrada en SEC ID Nº 2, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 4, la
secuencia mostrada en SEC ID Nº 5, las secuencias mostradas SEC ID
Nº 2 y SEC ID Nº 4, y las secuencias mostradas SEC ID Nº 2 y SEC ID
Nº 5; un anticuerpo monoclonal que comprende una secuencia de
aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo
constituido por la secuencia mostrada en SEC ID Nº 1, la secuencia
mostrada en SEC ID Nº 3, y las secuencias mostradas en SEQ ID Nº 1
y SEC ID Nº 3; y los fragmentos de estos anticuerpos monoclonales
que se unen al antígeno que retienen la capacidad de unirse
específicamente al CD40 humano, y que están exentos de actividad
agonista significativa pero que exhiben actividad antagonista
cuando se unen al antígeno CD40 en las células humanas, como se
demuestra para células B normales y neoplásticas humanas que
expresan CD40. Los ejemplos de tales anticuerpos monoclonales
también incluyen un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo
capaz de unirse al anticuerpo monoclonal producido par la línea
celular de hibridoma 12.12 o el anticuerpo monoclonal producido por
la línea celular del hibridoma 5.9; un anticuerpo monoclonal que se
une a un epítopo que comprende los residuos 82-87
de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº 10 o SEC ID Nº
12; un anticuerpo monoclonal que compite con el anticuerpo
monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9 en
un ensayo de unión competitivo; y un anticuerpo monoclonal que es
un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o cualquiera de los anticuerpos
monoclonales anteriores, donde el fragmento retiene la capacidad de
unión específica al antígeno CD40 humano y muestra actividad
antagonista cuando se une a este antígeno, como se demuestra para
células B normales y neoplásticas humanas que expresan CD40.
En una realización de la divulgación, los
procedimientos de tratamiento comprenden administrar a un paciente
una dosis terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica
que comprende anticuerpos antagonistas anti CD40 antagonistas
adecuados o sus fragmentos de unión al antígeno. Una dosis
terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 o su fragmento
está en el intervalo desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta
aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta
aproximadamente 15 mg/kg, o desde aproximadamente 7 mg/kg hasta
aproximadamente 12 mg/kg. Se reconoce que el procedimiento de
tratamiento puede comprender una administración única de una dosis
terapéuticamente eficaz o múltiples administraciones de una dosis
terapéuticamente eficaz del anticuerpo antagonista antagonista anti
CD40 o sus fragmentos de unión al antígeno.
Los anticuerpos antagonistas anti CD40
identificados en el presente documento como adecuados para uso en
los procedimientos de la invención pueden modificarse. Las
modificaciones de estos anticuerpos antagonistas anti CD40
incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti CD40 quiméricos
inmunológicamente activos, anticuerpos anti CD40 humanizados y
anticuerpos anti CD40 murinos inmunológicamente activos.
La Figura 1 presenta las secuencias de
aminoácidos para las cadenas ligeras y pesadas del mAb
CHIR-12.12. Las regiones líder (residuos
1-20 de SEC ID Nº 2), variable (residuos
21-132 de SEC ID Nº 2), y constante (residuos
133-239 de SEC ID Nº 2) de la cadena ligera se
muestran en la Figura 1A. Las regiones líder (residuos
1-19 de SEC ID Nº 4), variable (residuos
20-139 de SEC ID Nº 4), y constante (residuos
140-469 de SEC ID Nº 4) de la cadena pesada se
muestran en la Figura 1B. La región constante alternativa para la
cadena pesada del mAb CHIR-12.12 mostrada en la
Figura 1B refleja una sustitución de un residuo alanina por un
residuo serina en la posición 153 de SEC ID Nº 4. La secuencia
completa para esta variante de la cadena pesada del mAb
CHIR-12.12 se presenta en SEC ID Nº 5.
La Figura 2 muestra las secuencias codificadoras
para la cadena ligera (Figura 2A; SEC ID Nº 1) y la cadena pesada
(Figura 2B; SEC ID Nº 3) para el mAb CHIR-12.12.
La Figura 3 presenta las secuencias de
aminoácidos para las cadenas ligera y pesada del mAb
CHIR-5.9. Las regiones líder (residuos
1-20 de SEC ID Nº 6), variable (residuos
21-132 de SEC ID Nº 6), y constante (residuos
133-239 de SEC ID Nº 6) de la cadena ligera se
muestran en la Figura 3A. Las regiones líder (residuos
1-19 de SEC ID Nº 7), variable (residuos
20-144 de SEC ID Nº 7), y constante (residuos
145-474 de SEC ID Nº 7) de la cadena pesada se
muestran en la Figura 3B. La región constante alternativa para la
cadena pesada del mAb CHIR-5.9 mostrada en la Figura
3B refleja una sustitución de un residuo alanina por un residuo
serina en la posición 158 de SEC ID Nº 7. La secuencia completa para
esta variante de la cadena pesada del mAB CHIR-5.9
se presenta en la SEC ID Nº 8.
La Figura 4 muestra la secuencia codificadora
(Figura 4A; SEC ID Nº 9) para la isoforma corta del CD40 humano
(secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4B; SEC ID Nº 10), y
la secuencia codificadora (Figura 4C; SEC ID Nº 11) para la isoforma
larga del CD40 humano (secuencia de aminoácidos mostrada en la
Figura 4D).
La figura 5 muestra actividad de citotoxicidad
mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) de anticuerpos
monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12
en las líneas celulares de cáncer de ovarios SKO3 (figura 5A) y Hey
(figura 5B), la línea celular de cáncer de células escamosas de la
piel A431 (figura 5C) y la línea celular de cáncer de colon HCT116
(figura 5D).
La figura 6 muestra actividad de citotoxicidad
mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) de anticuerpos
monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12
en las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB231
(figura 6A) y MDA-MB435 (figura 6B) y las líneas
celulares de cáncer de pulmón NCI-H460 (figura 6C) y
SK-MES-1 (figura 6D).
La Figura 7 demuestra la actividad antitumoral
in vivo de los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 (donatado 5.9 en la figura) y
CHIR-12.12 (denotado 12.12 en la figura) usando un
modelo de cáncer de colon por xenoinjerto basado en la línea celular
HCT116 del carcinoma de colon humano.
La figura 8 muestra los efectos de anticuerpo
monoclonal anti-CD40 administrado por vía
intraperitoneal CHIR-12.12 (denotado 12.12 en la
figura) o anticuerpo monoclonal anti-HER2 Herceptin®
en porcentaje de supervivencia en un modelo murtino ortotópico no
estadificado de cáncer de ovarios usando la línea celular de cáncer
de ovarios humana SKOV3i.p.1.
La figura 9 compara los efectos de anticuerpo
monoclonal administrado por vía intraperitoneal frente a vía
intravenosa CHIR-12.12 (denontado 12.12 en la
figura) o Herceptin® en porcentaje de supervivencia en un modelo
murino ortópico no estadificado de cáncer de ovarios usando la línea
celular de cáncer de ovarios humana SKOV3i.p.1.
La Figura 10 demuestra la actividad antitumoral
in vivo de los anticuerpos monoclonales
CHIR-12.12 (denotado 12.12 en la figura) y
CHIR-5.9 (donatado 5.9 en la figura) frente a la
observada para Herceptin® usando un modelo murino estadificado de
cáncer de ovarios basado en la línea celular de cáncer de ovarios
humana SKOV3i.p.1.
La Figura 11 muestra la temperatura de fusión de
CHIR-12.12 en formulaciones de diferente pH medidas
por calorimetría diferencial de barrido (DSC).
"Tumor", según se usa en el presente
documento, se refiere a todo crecimiento y proliferación de células
neoplásicas, sea maligno o benigno, y a todas las células y tejidos
precancerosos y cancerosos. El término "tumor sólido" se
refiere a un cáncer o carcinoma de tejidos corporales distintos de
sangre, médula ósea y sistema linfoide.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se
refieren a, o describen, la afección fisiológica en mamíferos que
está típicamente caracterizada por el crecimiento celular no
regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a,
cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon,
cáncer de hígado, cáncer gástrico, prostata y cáncer de piel.
Los "anticuerpos" y las
"inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las
mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos
exhiben especificidad de unión para un antígeno, las
inmunoglobulinas incluyen tanto a los anticuerpos como a otras
moléculas análogas a anticuerpos que carecen de especificidad de
antígeno. Los polipéptidos del último tipo son producidos, por
ejemplo, en niveles bajos por el sistema linfático y en niveles
aumentados por los mielomas.
El término "anticuerpo" se usa en el
sentido más amplio y abarca los anticuerpos totalmente
estructurados, fragmentos de anticuerpos que pueden unirse al
antígeno (por ejemplo, Fab', F'(ab)2, Fv, anticuerpos de
cadena simple, fragmentos divalentes o diabodies), y péptidos
recombinantes que comprenden los anteriores.
El término "anticuerpo monoclonal" según se
usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de
una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir,
los anticuerpos individuales que comprenden la población son
idénticos excepto por las posibles mutaciones que se dan en la
naturaleza que pueden estar presentes en cantidades menores.
Los "anticuerpos nativos" y las
"inmunoglobulinas nativas" son usualmente glicoproteínas
heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de
dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H)
idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un
enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces
disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de
inmunoglobulinas. Cada cadena ligera y pesada también tiene enlaces
disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada
tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido por un
número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio
variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante en su otro
extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con
el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio de
variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de
la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoácidos particulares
forman una interfaz entre los dominios variables de las cadenas
ligera y pesada.
El término "variable" se refiere al hecho
de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente
en secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y la
especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno
particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye
uniformemente a lo largo de los dominios variables de los
anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamados regiones
determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables
tanto en los dominios de las cadenas ligeras como de las cadenas
pesadas. Las partes más altamente conservadas de los dominios
variables se denominan regiones de marco (FR). Los dominios
variables de las cadenas ligeras y pesadas nativas comprenden cada
uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una
configuración lámina \beta, conectadas por tres CDR, que forman
bucles que conectan la estructura de la lámina \beta, y en algunos
casos forman parte de la misma. Las CDR en cada cadena se mantienen
juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las CDR de
la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión del
antígeno de los anticuerpos (véase Kabat y col. (1991) NIH Publ. Nº
91-3242, Vol. I, páginas
647-669).
Los dominios constantes no participan
directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero
exhiben diversas funciones efectoras, tales como la unión del
receptor de FC (FcR), la participación del anticuerpo en la
toxicidad celular dependiente de anticuerpos, la opsonización, la
iniciación de la citotoxicidad dependiente del complemento y la
desgranulación de los mastocitos.
El término "región hipervariable" cuando se
usa en el presente documento se refiere a los residuos de
aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión del
antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos
de una "región determinante de complementariedad" o "CDR"
(es decir, los residuos 24-34 (L1),
50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el
dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1),
50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el
dominio variable de la cadena pesada; Kabat y col. (1991) Sequences
of Proteins of Immunological Interest (5th ed., Public Health
Service, National Institute of Health, Bethesda, MD) y/o los
residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, los residuos
26-32 (L1), 50-52 (L2) y
91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena
ligera y 26-32(H1), 53-55
(H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la
cadena pesada; Clothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:
901-917). Los residuos del "marco" o "FR"
son los residuos del dominio variable diferentes de los residuos de
la región hipervariable.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden
una parte de un anticuerpo intacto, de preferencia la región de
unión al anticuerpo o la región variable del anticuerpo intacto. Los
ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab',
F(ab')2 y fragmentos Fv; fragmentos divalentes; anticuerpos
lineales (Zapata y col. (1995) Protein Eng. 8(10):
1057-1062); moléculas de anticuerpos de cadena
simple; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de
fragmentos de anticuerpos. La digestión con papaína de los
anticuerpos produce dos fragmentos idénticos de unión al antígeno,
llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión
al antígeno, y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja
su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con
pepsina da un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de
combinación con el antígeno y aún es capaz de formar un
entrecruzamiento con el antígeno.
"Fv" es el fragmento mínimo del anticuerpo
que contiene un sitio de reconocimiento y unión del antígeno
completo. En una especie Fv de dos cadenas, esta región está
constituida por un dímero de un dominio variable de cadena pesada y
uno de cadena ligera en estrecha asociación, no covalente. En una
especie Fv de cadena única, un dominio variable de cadena pesada y
uno de cadena ligera pueden estar unidos covalentemente por un
conector peptídico flexible tal que las cadenas ligera y pesada
pueden asociarse en una estructura "dimérica" análoga a la de
una especie Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres
CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de
unión al antígeno en la superficie del dímero
V_{H}-V_{L}. En conjunto, las seis CDR
confieren la especificidad de unión al antígeno para el anticuerpo.
Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv
que comprende sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la
capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una menor
afinidad que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante
(C_{H}1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los
fragmentos Fab' por la adición de unos pocos residuos en el extremo
carboxi terminal del dominio C_{H}1 de la cadena pesada que
incluye una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo.
Fab'-SH es la denominación en el presente documento
para el Fab' en el que el(los) residuo(s) cisteína de
los dominios constantes tiene(n) un grupo tiol libre. Los
fragmentos de anticuerpos F(ab')2 se producían originalmente
como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre
ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos
de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden
asignarse a uno de dos tipos claramente diferentes, llamados kappa
(\kappa) y lambda (\lambda), basándose en las secuencias de
aminoácidos de sus dominios constantes.
Según la secuencia de aminoácidos del dominio
constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden
asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de
inmunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de
estas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo,
IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de las
cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de
inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu,
respectivamente. Las estructuras y las configuraciones
tridimensionales de las subunidades de las diferentes clases de
inmunoglobulinas son bien conocidas. Los isotipos diferentes tienen
funciones efectoras diferentes. Por ejemplo, los isotipos IgG1 e
IgG3 humanos median la actividad de citotoxicidad mediada por
células dependiente de anticuerpos (ADCC).
La palabra "marcador" cuando se utiliza en
el presente documento se refiere a un compuesto o composición
detectable que se conjuga directamente o indirectamente a los
anticuerpos para generar un anticuerpo "marcado". El marcador
puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores
radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un
marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un
compuesto o composición de sustrato que es detectable. Los
radionúclidos que pueden servir como marcadores detectables
incluyen, por ejemplo, I-131,
I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 y Pd-109. El marcador puede también ser una entidad no detectable tal como una toxina.
I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 y Pd-109. El marcador puede también ser una entidad no detectable tal como una toxina.
El término "antagonista" se utiliza en el
sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea parcial
o totalmente, inhibe o neutraliza una actividad biológica de una
diana nativa dada a conocer en el presente documento o su
transcripción o traducción.
"Vehículos" según se usa en el presente
documento incluye los vehículos, excipientes o estabilizadores
farmacéuticamente aceptables, que son no tóxicos para la célula o
el mamífero que se expone al mismo en las dosis y concentraciones
utilizadas. Frecuentemente el vehículo fisiológicamente aceptable es
una disolución acuosa de pH tamponado. Los ejemplos de vehículos
fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato,
citrato, succinato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluido
el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (con menos
de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina
sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales
como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina,
glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos,
disacáridos y otros carbohidratos incluidos glucosa, manosa o
dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares
tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales
tales como el sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN,
polietilenglicol (PEG) y Pluronics. La administración "en
combinación con" otro u otros agentes terapéuticos incluye la
administración simultánea (al mismo tiempo) y la administración
consecutiva en cualquier orden.
Una "célula huésped", según se usa en el
presente documento, se refiere a un microorganismo o a una célula o
línea celular de eucariota cultivada como una entidad unicelular que
puede usarse, o se ha usado, como receptor de un vector
recombinante u otros polinucleótidos de transferencia, e incluye a
la progenie de la célula original que se ha transfectado. Se
entiende que la progenie de una célula única puede no ser
necesariamente completamente idéntica en morfología o en
complemento de ADN genómico o total a la original, por las
mutaciones naturales, accidentales o deliberadas.
"Células efectoras humanas" son leucocitos
que expresan uno o más FcR y que realizan funciones efectoras. De
preferencia, las células expresan al menos Fc\gammaRIII y llevan a
cabo la función efectora de citotoxicidad mediada por células
dependiente de antígenos (ADCC). Los ejemplos de leucocitos humanos
que median la ADCC incluyen las células mononucleares de sangre
periférica (PBMC), células citolíticas naturales (NK), monocitos,
macrófagos, eosinófilos y neutrófilos, siendo las de preferencia las
PBMC y las células NK. Los anticuerpos que tienen actividad ADCC
son típicamente del isotipo IgG1 o IgG3. Nótese que además de aislar
anticuerpos IgG1 e IgG3, tales anticuerpos que median la ADCC
pueden generarse modificando una región variable de un anticuerpo
que no media la ADCC o un fragmento de región variable formando una
región constante del isotipo IgG1 o IgG3.
Los términos "receptor de Fc" o "FcR"
se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un
anticuerpo. El FcR de preferencia es un FcR humano de secuencia
nativa. Además, un FcR de preferencia es uno que se une a un
anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye a los receptores de las
subclases Fc\gammaRI, Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII, incluidas
las variantes alélicas y formas de corte y empalme alternativas de
estos receptores. Los receptores Fc\gammaRII incluyen
Fc\gammaRIIA (un "receptor activador") y Fc\gammaRIIB (un
"receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos
similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos.
El receptor activador Fc\gammaRIIA contiene un motivo de
activación inmuno receptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio
citoplásmico. El receptor inhibidor Fc\gammaRIIB contiene un
motivo de inhibición inmuno receptor basado en tirosina (ITIM) en
su dominio citoplásmico (véase Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:
203-234). Los FcR se recopilan en Ravetch and Kinet
(1991) Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Capel
y col. (1994) Immunomethods 4: 25-34; y de Haas y
col. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126: 330-341. Otros
FcRs, incluidos los que se identificarán en el futuro, están
abarcados por el término "FcR" en el presente documento. El
término incluye también el receptor neonatal, FcRn, que es
responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer
y col. (1976) J. Immunol. 117: 587 y Kim y col. (1994) J. Immunol.
24: 249 (1994)).
Hay varias maneras de producir anticuerpos
humanos. Por ejemplo, pueden inmortalizarse células secretoras por
medio de la infección con el virus de Epstein-Barr
(EBV). Sin embargo, las células infectadas con EBV son difíciles de
clonar y usualmente producen sólo rendimientos relativamente bajos
de inmunoglobulina (James and Bell (1987) J. Immunol Methods 100:
5-40). En el futuro, posiblemente podría lograrse la
inmortalización de células B humanas mediante la introducción de
una combinación definida de genes transformadores. Esa posibilidad
se destaca por medio de una reciente demostración de que la
expresión de la subunidad catalítica de telomerasa junto con la
oncoproteína grande de SV40 y un alelo oncogénico de
H-ras dio como resultado la conversión tumorigénica
de células fibroblásticas y epiteliales humanas normales (Hahn y
col. (1999) Nature 400: 464-468). Ahora es posible
producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son
capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio de
anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de
inmunoglobulinas (Jakobovits y col. (1993) Nature 362:
255-258; Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev.
Immunol. 13: 65-93; Fishwild y col. (1996) Nat.
Biotechnol. 14: 845-851; Mendez y col. (1997) Nat.
Genet. 15: 146-156; Green (1999) J. Immunol. Methods
231: 11-23; Tomizuka y col. (2000) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 97: 722-727; recopilado en Little y
col. (2000) Immunol. Today 21: 364-370). Por
ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota de la región de
unión de cadenas pesadas (JH) del anticuerpo en ratones quiméricos
y mutantes de línea germinal da como resultado la inhibición
completa de producción de anticuerpos endógenos (Jakobovits y col.
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-2555).
La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulinas humanas
de línea germinal en tales ratones mutantes de línea germinal da
como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el desafío
con antígenos (Jakobovits y col. (1993) Nature 362:
255-258). Mendez y col. (1997) (Nature Genetics 15:
146-156) han generado una línea de ratones
transgénicos que, cuando se desafían con un antígeno, generan
anticuerpos totalmente humanos de alta afinidad. Esto se logró por
la integración en la línea germinal de loci megabase de cadenas
pesadas y cadenas ligeras humanas en los ratones con deleción en el
segmento endógeno JH como se describió anteriormente. Estos ratones
(tecnología XenoMouse® II (Abgenix; Fremont, California)) albergan
1.020 kb del locus de cadena pesada humana que contiene
aproximadamente 66 genes de VH, regiones DH y JH completas, y tres
regiones constantes diferentes, y también albergan 800 kb del locus
\kappa humano que contiene 32 genes de V\kappa, segmentos
J\kappa y genes de C\kappa. Los anticuerpos producidos en estos
ratones se asemejan mucho a los que se observan en seres humanos en
todos los aspectos, incluidos la reorganización genética, la
estructura y el repertorio. Los anticuerpos humanos se expresan de
preferencia sobre anticuerpos endógenos por deleción en el segmento
endógeno que evita la reorganización genética en el locus murino.
Tales ratones pueden inmunizarse con un antígeno de interés
particular.
Los sueros de tales animales inmunizados pueden
seleccionarse para reactividad de anticuerpo frente al antígeno
inicial. Los linfocitos pueden aislarse de ganglios linfáticos o de
células del bazo y además pueden seleccionarse para células B
seleccionando las células CD138 negativas y CD19 positivas. En un
aspecto, tales cultivos de células B (BCC) pueden fusionarse a
células de mieloma para generar hibridomas como se detalló
anteriormente.
En otro aspecto, tales cultivos de células B
pueden seleccionarse además para reactividad frente al antígeno
inicial, de preferencia. Tal selección incluye ELISA con la proteína
diana/antígeno, un ensayo de competición con anticuerpos conocidos
que se unen al antígeno de interés, y unión in vitro a
células CHO u otras células transfectadas de manera transitoria que
expresan el antígeno diana.
La presente divulgación se refiere a
procedimientos para el tratamiento de sujetos humanos con tumores
sólidos que comprende células del carcinoma que que expresan CD40
incluyendo, pero sin limitarse a estos, cáncer de ovarios, pulmón
(por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas del carcinoma
de células escamosas, adenocarcinoma, y tipos de carcinoma de
células grandes, y cáncer de células pequeñas del pulmón), mama,
colon, riñón (incluyendo, por ejemplo, carcinomas de células
renales), vejiga, hígado (incluyendo, por ejemplo, carcinomas
hepatocelulares) gástrico, de cuello uterino, próstata,
nasofaringeal, tiroides (por ejemplo, carcinoma papilar de
tiroides), y cánceres de piel tales como melanoma, y sarcomas
(incluyendo, por ejemplo, osteosarcomas y sarcomas de Ewing). Los
procedimientos implican el tratamiento con un anticuerpo anti CD40
descrito en este documento, o uno de sus fragmentos de unión al
antígeno, en el que la administración del anticuerpo o su fragmento
de unión al antígeno promueve una respuesta terapéutica positiva en
el sujeto que se somete a este procedimiento de terapia. Los
anticuerpos anti CD40 adecuados para uso en los procedimientos de la
invención se unen específicamente al antígeno CD40 humano expresado
en la superficie de una célula de carcinoma humana y están exentos
de actividad agonista significativa, pero exhiben actividad
antagonista cuando se unen al antígeno CD40 en una célula humana
que expresa CD40, como se demuestra para células B humanas normales
y neoplásticas que expresan CD40. Estos anticuerpos anti CD40 y sus
fragmentos de unión al antígeno se denominan en el presente
documento anticuerpos anti CD40 antagonistas. Tales anticuerpos
incluyen, pero no se limitan a estos, los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 totalmente
humanos que se describen a continuación y los anticuerpos
monoclonales que tienen las características de unión de los
anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y
CHIR-12.12. Estos anticuerpos monoclonales que se
pueden producir de forma recombinante se describen a
continuación.
Los anticuerpos que tienen las características
de unión de los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 incluyen anticuerpos que interfieren de
manera competitiva con la unión de CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 a CD40 y/o se unen a los mismos epítopos
que CHIR-5.9 y CHIR-12.12. Un
experto podría determinar si un anticuerpo interfiere de manera
competitiva con CHIR-5.9 o
CHIR-12.12 usando procedimientos convencionales,
conocidos en la técnica.
Cuando estos anticuerpos se unen a CD40 expuesto
en la superficie de las células que expresan CD40 de un tumor
sólido (también denominado en esta invención como células del
carcinoma que expresan CD40), los anticuerpos están exentos de
actividad agonista importante; en algunas realizaciones, su unión a
CD40 expuesto en la superficie de las células de carcinoma que
expresan CD40 da lugar a muerte dependiente de ADCC de estas células
de carcinoma, y de ahí una reducción en el volumen del tumor. Por
consiguiente, los anticuerpos anti CD40 antagonistas adecuados para
uso en los procedimientos de la invención incluyen los anticuerpos
monoclonales que pueden exhibir actividad antagonista hacia las
células humanas que expresan el antígeno de superficie celular CD40,
como se demuestra para células B humanas normales y neoplásticas que
expresan CD40.
Los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 representan
anticuerpos anti CD40 antagonistas adecuados para uso en los
procedimientos de la presente invención. Los anticuerpos
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son
anticuerpos monoclonales anti CD40 totalmente humanos del isotipo
IgG1 producidos a partir de las líneas celulares de hibridoma
131.2F8.5.9 (a la que se hace referencia en el presente documento
como la línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12 (a la que se hace
referencia en el presente documento como la línea celular 12.12).
Estas líneas celulares se crearon usando esplenocitos de ratones
xenotípicos inmunizados que contienen el locus de cadena pesada de
IgG1 humana y el locus de cadena \kappa humana (tecnología
XenoMouse®; Abgenix; Fremont, California). Las células del bazo se
fusionaron con las células de mieloma SP2/0 de ratón (Sierra
BioSource). Las hibridomas resultantes se subclonaron varias veces
para crear las líneas celulares monoclonales estables 5.9 y 12.12.
Otros anticuerpos de la invención pueden prepararse de manera
similar usando ratones transgénicos para loci de inmunoglobulina
humana o por otros procedimientos conocidos en la técnica y/o
descritos en el presente documento.
Las secuencias de aminoácidos para las regiones
líder, variable y constante para la cadena ligera y cadena pesada
para el mAb CHIR-12.12 se presentan en las Figuras
1A y 1B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº 2 (secuencia
completa para la cadena ligera del mAb CHIR-12.12),
SEC ID Nº 4 (secuencia completa para la cadena pesada para el mAb
CHIR-12.12) y SEC ID Nº 5 (secuencia completa para
una variante de la cadena pesada para el mAb
CHIR-12.12 presentada en SEC ID Nº 4, donde la
variante comprende una sustitución del residuo alanina por serina
en la posición de 153 de SEC ID Nº 4). Las secuencias de nucleótidos
que codifican la cadena ligera y la cadena pesada para el mAb
CHIR-12.12 se presentan en las Figuras 2A y 2B,
respectivamente. Véase también SEC ID Nº 1 (secuencia codificadora
para la cadena ligera para el mAb CHIR-12.12) y SEC
ID Nº 3 (secuencia codificadora para la cadena pesada para el mAb
CHIR-12.12). Las secuencias de aminoácidos para las
regiones líder, variable y constante para la cadena ligera y cadena
pesada del mAb CHIR-5.9 se presentan en las Figuras
3A y 3B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº 6 (secuencia
completa para la cadena ligera del mAb CHR-5.9),
SEC ID Nº 7 (secuencia completa para la cadena pesada del mAb
CHIR-5.9) y SEC ID Nº 8 (secuencia completa para
una variante de la cadena pesada del mAb CHIR-5.9
presentada en SEC ID Nº 7, donde la variante comprende una
sustitución del residuo alanina por serina en la posición de 158 de
SEC ID Nº 7). Además, los hibridomas que expresan los anticuerpos
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se han
depositado en la ATCC con una denominación de depósito de patente de
PTA-5542 y PTA-5543,
respectivamente.
Además de la actividad antagonista, resulta de
preferencia que los anticuerpos anti CD40 adecuados para uso en los
procedimientos de esta invención tengan otro mecanismo de acción
contra una célula tumoral. Por ejemplo, los anticuerpos
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 nativos tienen
actividad ADCC. Como alternativa, las regiones variables de los
anticuerpos CHIR-5.9 y CHIR-12.12
pueden expresarse en otro isotipo de anticuerpos que tenga actividad
ADCC. También es posible conjugar formas nativas, formas
recombinantes o fragmentos de CHR-5.9 o
CHIR-12.12 que se unen al antígeno a una
citotoxina.
Los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen a CD40
soluble en ensayos de tipo ELISA, evitan la unión del ligando de
CD40 al CD40 de la superficie celular, y desplazan el ligando de
CD40 previamente unido, según se determina por ensayos de
citometría de flujo. Los anticuerpos CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 compiten uno con el otro por la unión a
CD40 pero no con 15B8, el anticuerpo monoclonal anti CD40 descrito
en la solicitud internacional PCT nº PCT/US01/30857, publicada como
documento WO 02/28904, también titulada "Human
Anti-CD40 Antibodies", presentada el 2 de
Octubre de 2001 (expediente del agente nº PP 16092.003).
Cuando se prueban in vitro los efectos en
la proliferación de células B de sujetos humanos normales,
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 actúan como
anticuerpos anti CD40 antagonistas. Además, CHIR-5.9
y CHIR-12.12 no inducen fuerte proliferación de
linfocitos humanos de sujetos normales. Estos anticuerpos son
capaces de matar las células diana que expresan CD40 (líneas de
linfoma y líneas celulares tumorales sólidas) por citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpo (ADCC). La afinidad de unión de
CHIR-5.9 por el CD40 humano es de 1,2 x 10^{-8} M
y la afinidad de unión de CHIR-12.12 es de 5 x
10^{-10} M, según se determina por medio del ensayo
Biacore^{TM}.
Los anticuerpos anti CD40 antagonistas adecuados
para uso en los procedimientos de la presente invención exhiben una
fuerte afinidad de unión de sitio único por el antígeno CD40 de
superficie celular. Los anticuerpos monoclonales de la invención
exhiben una constante de equilibrio de disociación (K_{D}) para
CD40 de al menos 10^{-5} M, al menos 3 X 10^{-5} M, de
preferencia al menos 10^{-6} M hasta 10^{-7} M, de más
preferencia al menos 10^{-8} M hasta aproximadamente 10^{-12}
M, medida usando un ensayo convencional tal como Biacore^{TM}. El
análisis Biacore se conoce en la técnica y se proporcionan detalles
en el "BIAapplications handbook". Los procedimientos descritos
en el documento WO 01/27160 pueden usarse para modular la afinidad
de unión.
Se entiende por "antígeno CD40",
"antígeno CD40 de superficie celular", "receptor de CD40"
o "CD40" una glicoproteína transmembranaria que pertenece a la
familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) (véase,
por ejemplo las Patentes de EEUU Nº 5.674.492 y 4.708.871;
Stamenkovic y col. (1989) EMBO 8: 1403; Clark (1990) Tissue
Antigens 36: 33; Barclay y col. (1997) The Leucocyte Antigen Facts
Book (2ª ed.; Academic Press, San Diego)). Se han identificado dos
isoformas de CD40 humano, codificadas por variantes de transcripción
con cortes y empalmes alternativos de este gen. La primera isoforma
(también conocida como la "isoforma larga" o "isoforma
1") se expresa como un polipéptido precursor de 277 aminoácidos
(SEC ID Nº 12 (informada primero en GenBank con Nº de acceso
CAA43045, e identificada como isoforma 1 en GenBank con Nº de acceso
NP 001241), codificado por SEC ID Nº 11 (véase Nº de acceso de
GenBank X60592 y NM 001250)), que tiene una secuencia señal
representada por los primeros 19 residuos. La segunda isoforma
(también conocida como la "isoforma corta" o "isoforma
2") se expresa como un polipéptido precursor de 203 aminoácidos
(SEC ID Nº 10 (Nº de acceso de GenBank NP 690593), codificado por
SEC ID Nº 9 (Nº de acceso de GenBank NM 152854)), que también tiene
una secuencia señal representada por los primeros 19 residuos. Los
polipéptidos precursores de estas dos isoformas de CD40 humano
comparten en común sus primeros 165 residuos (es decir, los residuos
1-165 de SEC ID Nº 10 y SEC ID Nº 12). El
polipéptido precursor de la isoforma corta (mostrado en SEC ID Nº
10) está codificado por una variante de transcripción (SEC ID Nº 9)
que carece de un segmento codificador, que da lugar a un cambio del
marco de traducción; la isoforma de CD40 resultante contiene un
extremo C terminal más corto y diferente (residuos
166-203 de SEC ID Nº 10) del que está contenido en
la isoforma larga de CD40 (extremo C terminal mostrado en los
residuos 166-277 de SEC ID Nº 12). Para los fines de
la presente invención, el término "antígeno CD40", "antígeno
CD40 de superficie celular", "receptor de CD40" o
"CD40" abarca tanto la isoforma corta como la larga de CD40.
Los anticuerpos anti CD40 de la presente invención se unen a un
epítopo de CD40 humano que se encuentra en la misma situación
dentro de la isoforma corta o la isoforma larga de este antígeno de
superficie celular como se señala a continuación en el presente
documento.
El antígeno CD40 está expuesto en la superficie
de una diversidad de tipos celulares, según se describe en otras
partes en el presente documento. Por "expuesto en la
superficie" y "expresado en la superficie" se entiende que
todo o una parte del antígeno CD40 está expuesto al exterior de la
célula. El antígeno CD40 expuesto o expresado puede estar total o
parcialmente glicosilado.
Por "actividad agonista" se entiende que la
sustancia funciona como un agonista. Un agonista se combina con un
receptor en una célula e inicia una reacción o actividad que es
similar a la misma que se inicia por el ligando natural del
receptor. Por ejemplo, un agonista de CD40 induce, pero no se limita
a, cualquiera o todas las siguientes respuestas: proliferación y
diferenciación de células B, producción de anticuerpos, adhesión
intercelular, generación de memoria de células B, cambio de isotipo,
regulación ascendente de la expresión en la superficie celular de
MHC clase II y CD80/86, y secreción de citocinas proinflamatorias
tales como IL-8, IL-12 y TNF. Por
"actividad antagonista" se entiende que la sustancia funciona
como un antagonista. Un antagonista de CD40 evita o reduce la
inducción de cualquiera de las respuestas inducidas por la unión del
receptor de CD40 a un ligando agonista, en particular CD40L. El
antagonista puede reducir la inducción de una o más de las
respuestas a la unión de agonistas en un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%,
30%, 35%, de preferencia 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, de más
preferencia 70%, 80%, 85% y de mayor preferencia 90%, 95%, 99% ó
100%. Los procedimientos para medir la especificidad de unión y la
actividad de antagonista de anticuerpos anti CD40 y ligandos de
CD40 son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero
no se limitan a, ensayos de unión competitiva convencionales,
ensayos para controlar la secreción de inmunoglobulinas por las
células B, ensayos de proliferación de células B, ensayos de
proliferación de células B análogos a Banchereau, ensayos de células
T ayudantes para la producción de anticuerpos, ensayos de
proliferación de células B con coestimulación y ensayos para
regulación ascendente de marcadores de activación de células B.
Véase, por ejemplo, los ensayos dados a conocer en el documento WO
00/75348 y en la Patente de EEUU Nº 6.087.329.
Por actividad antagonista "significativa"
se entiende una actividad agonista de al menos 30%, 35%, 40%, 45%,
50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 100% superior a la
actividad agonista inducida por una sustancia neutra o un control
negativo según se mide en el ensayo de una respuesta de células B.
De preferencia, la actividad agonista "significativa" es una
actividad agonista que es al menos 2 veces mayor o al menos 3 veces
mayor que la actividad agonista inducida por una sustancia neutra o
un control negativo según se mide en el ensayo de una respuesta de
células B. Por consiguiente, por ejemplo, cuando la respuesta de
células B de interés es la proliferación de células B, la actividad
agonista "significativa" sería la inducción de un nivel de
proliferación de células B que es al menos 2 veces mayor o al menos
3 veces mayor que el nivel de proliferación de células B inducido
por una sustancia neutra o un control negativo. En una realización,
una inmunoglobulina no específica, por ejemplo IgG1, que no se une
a CD40 sirve como el control negativo. Una sustancia "exenta de
actividad agonista significativa" exhibirá una actividad agonista
de no más que aproximadamente 25% mayor que la actividad agonista
inducida por una sustancia neutra o un control negativo, de
preferencia no más que aproximadamente 20% mayor, 15% mayor, 10%
mayor, 5% mayor, 1% mayor, 0.5% mayor, o incluso no más que
aproximadamente 0,1% mayor que la actividad agonista inducida por
una sustancia neutra o un control negativo según se mide en un
ensayo de una respuesta de células B. Los anticuerpos anti CD40
antagonistas útiles en los procedimientos de la presente invención
están exentos de actividad agonista significativa como se señaló
anteriormente cuando se unen a un antígeno CD40 en una célula
humana. En una forma de realización de la invención, el anticuerpo
anti CD40 antagonista está exento de actividad agonista
significativa en una respuesta de células B. En otra forma de
realización de la invención, el anticuerpo anti CD40 antagonista
está exento de actividad agonista significativa en ensayos de más
de una respuesta de células B (por ejemplo, proliferación y
diferenciación, o proliferación, diferenciación y producción de
anticuerpos).
Según se utiliza en el presente documento
"anticuerpo anti CD40" abarca cualquier anticuerpo que reconoce
específicamente el antígeno CD40 de superficie celular, incluidos
anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de
cadena única, y sus fragmentos tales como Fab, F(ab')_{2},
F_{v}, y otros fragmentos que retienen la función de unión al
antígeno del anticuerpo anti CD40 original. Son de particular
interés para los procedimientos de la presente invención los
anticuerpos anti CD40 antagonistas dados a conocer en el presente
documento que comparten las características de unión de los
anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 descritos anteriormente. Tales
anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: (1) los
anticuerpos monoclonales producidos por las líneas celulares de
hibridoma denominadas 131.2F8.5.9 (a la que se hace referencia en
el presente documento como línea celular 5.9) y 153.8E2.D10.D6.12.12
(a la que se hace referencia en el presente documento como línea
celular 12.12), depositadas en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5542 y Depósito de Patente Nº
PTA-5543, respectivamente; (2) un anticuerpo
monoclonal que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo constituido por la secuencia mostrada en SEC ID Nº 2, la
secuencia mostrada en SEC ID Nº 4, la secuencia mostrada en SEC ID
Nº 5, las secuencias mostradas en SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 4, y por
las secuencias mostradas en SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 5; (3) un
anticuerpo monoclonal que comprende la secuencia de aminoácidos
seleccionada del grupo constituido por la secuencia mostrada en SEC
ID Nº 6, la secuencia mostrada en SEC ID Nº 7, la secuencia
mostrada en SEC ID Nº 8, las secuencias mostradas en SEQ ID NO:6 y
SEC ID Nº 7, y por las secuencias mostradas en SEC ID Nº 6 y SEC ID
Nº 8; (4) un anticuerpo monoclonal que tiene la secuencia de
aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo
constituido por la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº 1,
la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº 3, y las
secuencias de nucleótidos mostradas en SEC ID Nº y SEC ID Nº 3; (5)
un anticuerpo monoclonal que se une a un epítopo capaz de unirse al
anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma
5.9 o la línea celular de hibridoma 12.12; (6) un anticuerpo
monoclonal que se une a un epítopo que comprende los residuos
82-87 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC
ID Nº 10 o SEC ID Nº 12; (7) un anticuerpo monoclonal que compite
con el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o
CHIR-12.12 en un ensayo de unión competitiva; y (8)
un anticuerpo monoclonal que es un fragmento del anticuerpo
monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9
que se une al antígeno o los anticuerpos monoclonales anteriores en
los puntos anteriores (1)-(7), en los que el fragmento retiene la
capacidad de unirse específicamente al antígeno CD40 humano. Los
expertos reconocerán que los anticuerpos antagonistas y los
fragmentos de unión al antígeno de estos anticuerpos adecuados para
uso en los procedimientos descritos en este documento incluyen
anticuerpos anti-CD40 antagonistas y sus fragmentos
de unión al antígeno, que se producen de forma recombinante usando
procedimientos bien conocidos en la técnica y descritos en este
documento a continuación, e incluyen, por ejemplo, anticuerpos
monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12
que se han producido de forma recombinante.
Los anticuerpos anti CD40 antagonistas para uso
en los procedimientos de la presente invención pueden producirse
mediante cualquier procedimiento de producción de anticuerpos
conocido por los expertos en la técnica. Por consiguiente, pueden
prepararse sueros policlonales por medio de procedimientos
convencionales. En general, primero se utiliza una disolución que
contiene el antígeno CD40 para inmunizar a un animal adecuado, de
preferencia un ratón, rata, conejo o cabra. Los conejos o cabras
son de preferencia para la preparación de sueros policlonales por el
volumen de suero que puede obtenerse y la disponibilidad de
anticuerpos anti conejo y anti cabra marcados.
Pueden prepararse sueros policlonales en un
animal transgénico, de preferencia un ratón que lleva loci de
inmunoglobulina humana. En una realización de preferencia, se usan
células Sf9 que expresan CD40 como el inmunógeno. La inmunización
también puede llevarse a cabo mezclando o emulsionando la disolución
que contiene el antígeno en disolución salina, de preferencia en un
adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund, e inyectando
por vía intravenosa la mezcla o emulsión por vía parenteral
(generalmente por vía subcutánea o intramuscular). Típicamente es
suficiente una dosis de 50-200 \mug/inyección. La
inmunización se estimula por lo general 2-6 semanas
más tarde con una o más inyecciones de la proteína en disolución
salina, de preferencia usando adyuvante incompleto de Freund. Como
alternativa, pueden también generarse anticuerpos mediante
inmunización in vitro usando procedimientos conocidos en la
técnica, que para los fines de esta invención se considera
equivalente a la inmunización in vivo. Los antisueros
policlonales se obtienen por extracción de sangre de los animales
inmunizados en un recipiente de vidrio o de plástico, incubando la
sangre a 25ºC durante una hora, seguido por la incubación a 4ºC
durante 2-18 horas. El suero se recupera por
centrifugación (por ejemplo, 1.000 g x durante 10 minutos). Pueden
obtenerse aproximadamente 20-50 ml por extracción de
sangre de conejos.
La producción de células Sf9 (Spodoptera
frugiperda) se da a conocer en la Patente de EEUU Nº 6.004.552
incorporada a esta invención como referencia. En resumen, se
combinaron secuencias que codifican CD40 humano en un baculovirus
usando vectores de transferencia. Los plásmidos se cotransfectaron
con ADN de baculovirus de tipo silvestre en células Sf9. Las
células Sf9 infectadas con baculovirus recombinante se identificaron
y se purificaron como clones.
De preferencia el anticuerpo es monoclonal en la
naturaleza. Por "anticuerpo monoclonal" se entiende un
anticuerpo obtenido de una población sustancialmente homogénea de
anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende
la población son idénticos excepto por posible mutaciones que se
presentan naturalmente que pueden estar presentes en cantidades
menores. El término no está limitado con respecto a la especie o la
fuente del anticuerpo. El término abarca inmunoglobulinas
completas, así como fragmentos tales como Fab, F(ab')2, Fv y
otros que retienen la función de unión al antígeno del anticuerpo.
Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, estando dirigidos
contra un único sitio antigénico, es decir, el antígeno CD40 de
superficie celular en la presente invención. Además, a diferencia
de las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales
que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra
diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal
está dirigido contra un único determinante en el antígeno. El
modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo ya
que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de
anticuerpos, y no debe interpretarse como que es necesaria la
producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por
ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizan según la
presente invención pueden obtenerse por el procedimiento de
hibridomas descrito por primera vez por Kohler y col. (1975) Nature
256: 495, o pueden producirse por los procedimientos de ADN
recombinante (véase, por ejemplo, Patente de EEUU Nº 4.816.567).
Los "anticuerpos monoclonales" pueden aislarse también de
bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas
en, por ejemplo, Clackson y col. (1991) Nature 352:
624-628; Marks y col. (1991) J Mol. Biol. 222:
581-597; y en la Patente de EEUU Nº 5.514.548.
Por "epítopo" se entiende la parte de la
molécula antigénica para la que se produce un anticuerpo y a la que
se unirá el anticuerpo. Los epítopos pueden comprender residuos
lineales de aminoácidos (es decir, los residuos en el epítopo están
organizados consecutivamente uno después de otro en forma lineal),
residuos no lineales (a los que se hace referencia en el presente
documento como "epítopos no lineales"; estos epítopos no están
organizados de forma consecutiva), o residuos de aminoácidos tanto
lineales como no lineales.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse
usando el procedimiento de Kohler y col. (1975) Nature 256:
495-496, o una de sus modificaciones. Típicamente,
se inmuniza un ratón con una disolución que contiene el antígeno.
La inmunización puede llevarse a cabo mezclando o emulsionando la
disolución que contiene el antígeno en disolución salina, de
preferencia en un adyuvante tal como el adyuvante completo de
Freund, e inyectando la mezcla o emulsión por vía parenteral. Puede
usarse cualquier procedimiento de inmunización conocido en la
técnica para obtener anticuerpos monoclonales de la invención. Tras
la inmunización del animal, se extirpa el bazo (y de manera
opcional, varios ganglios linfáticos grandes) y se separan las
células individuales. Las células del bazo pueden seleccionarse
aplicando una suspensión de células a una placa o pocillo recubierto
con el antígeno de interés. Las células B que expresan la
inmunoglobulina unida a membrana específica para el antígeno se
unen a la placa y no se eliminan por aclarado. A continuación se
induce la fusión de las células B resultantes, o de todas las
células separadas del bazo, con células de mieloma para formar
hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo. Las células
resultantes se plaquean por dilución en serie y se realiza el
ensayo de producción de anticuerpos que se unen específicamente al
antígeno de interés (y que no se unen a antígenos no relacionados).
A continuación se cultivan los hibridomas que secretan el anticuerpo
monoclonal (mAb) seleccionado in vitro (por ejemplo, en
frascos de cultivo tisular o reactores de fibras huecas), o in
vivo (como ascitis en ratones).
Cuando los anticuerpos anti CD40 antagonistas de
la invención deben prepararse utilizando procedimientos de ADN
recombinante, el ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se
aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales
(por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son
capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas
ligeras y pesadas de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma
descritas en el presente documento sirven como una fuente de
preferencia de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en
vectores de expresión, que a continuación se transfectan en las
células huésped tales como células de E. coli, células COS de
simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de
mieloma que no producen de otra manera proteína inmunoglobulina,
para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células
huésped recombinantes. Los artículos de recopilación sobre expresión
recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo
incluyen Skerra y col. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5: 256 y
Phickthun (1992) Immunol. Revs. 130: 151. Como alternativa, puede
producirse anticuerpo en una línea celular tal como una línea
celular CHO, como se da a conocer en las Patentes de EEUU Nº
5.545.403; 5.545.405; y 5.998.144. En resumen, la línea celular se
transfecta con vectores capaces de expresar una cadena ligera y una
cadena pesada, respectivamente. Transfectando las dos proteínas en
vectores separados, pueden producirse anticuerpos quiméricos. Otra
ventaja es la glicosilación correcta del anticuerpo.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti
CD40 antagonista, por ejemplo el anticuerpo
CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su
fragmento de unión al antígeno se produce en células CHO usando el
sistema de expresión de genes GS (Lonza Biologics, Portsmouth, New
Hampshire), que usa glutamina sintetasa como un marcador. Véase
también las Patentes de EEUU Nº 5.122.464; 5.591.639; 5.658.759;
5.770.359; 5.827.739; 5.879.936; 5.891.693; y 5.981.216.
Los anticuerpos monoclonales contra CD40 son
conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las secciones dedicadas
a antígenos de células B en McMichael, ed. (1987; 1989). Leukocyte
Typing III and IV (Oxford University Press, Nueva York); Patentes
de EEUU Nº 5.674.492; 5.874.082; 5.677.165; 6.056.959; documento WO
00/63395; documentos de Publicación Internacional Nº WO 02/28905 y
WO 02/28904; Gordon y col. (1988) J. Immunol. 140: 1425; Valle y
col. (1989) Eur. J. Immunol. 19: 1463; Clark y col. (1986) PNAS 83:
4494; Paulie y col. (1989) J. Immunol. 142: 590; Gordon y col.
(1987) Eur. J. Immunol. 17: 1535; Jabara y col. (1990) J. Exp. Med.
172: 1861; Zhang y col. (1991) J. Immunol. 146: 1836; Gascan y col.
(1991) J. Immunol. 147: 8; Banchereau y col. (1991) Clin. Immunol.
Spectrum 3: 8; y Banchereau y col. (1991) Science 251: 70. Son de
particular interés para la presente invención los anticuerpos anti
CD40 antagonistas dados a conocer en el presente documento que
comparten las características de unión de los anticuerpos
monoclonales CHIR-5.9 y CHIR-12.12
descritos anteriormente.
La expresión "epítopo del antígeno CD40"
según se utiliza en el presente documento se refiere a una molécula
que es capaz de tener inmunorreactividad con los anticuerpos
monoclonales anti CD40 de la presente invención, excluyendo el
propio antígeno CD40. Los epítopos del antígeno CD40 pueden
comprender proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos, hidratos
de carbono, lípidos y otras moléculas, pero para los fines de la
presente invención son más comúnmente proteínas, oligopéptidos
cortos, miméticos de oligopéptidos (es decir, compuestos orgánicos
que imitan las propiedades de unión al anticuerpo del antígeno
CD40), o sus combinaciones. Los miméticos de oligopéptidos
adecuados se describen, entre otros, en la solicitud de PCT US
91/04282.
Además, la expresión "anticuerpo anti CD40"
según se utiliza en el presente documento abarca anticuerpos
quiméricos anti CD40; tales anticuerpos anti CD40 quiméricos para
uso en los procedimientos de la invención tienen las
características de unión de los anticuerpos monoclonales
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 descritos en
el presente documento. Por anticuerpos "quiméricos" se
entiende que de más preferencia se obtienen usando técnicas de ácido
desoxirribonucleico recombinante y que comprenden tanto componentes
humanos (incluidas especies inmunológicamente "relacionadas",
por ejemplo, chimpancé) como no humanos. Por consiguiente, la región
constante del anticuerpo quimérico es de más preferencia
sustancialmente idéntica a la región constante de un anticuerpo
natural humano; la región variable del anticuerpo quimérico de más
preferencia se obtiene de una fuente no humana y tiene la
especificidad antigénica deseada para el antígeno CD40 de
superficie celular. La fuente no humana puede ser cualquier fuente
de vertebrado que pueda usarse para generar anticuerpos contra un
antígeno CD40 humano de superficie celular o material que comprenda
un antígeno CD40 humano de superficie celular. Tales fuentes no
humanas incluyen, pero no se limitan a, roedores (por ejemplo,
conejo, rata, ratón, etc.; véase, por ejemplo, la Patente de EEUU
Nº 4.816.567, incorporada en la presente divulgación por referencia)
y primates no humanos (por ejemplo, mono del viejo mundo, simio,
etc.; véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.750.105 y
5.756.096; incorporadas en la presente divulgación por referencia).
Según se usa en el presente documento, la frase "inmunológicamente
activo" cuando se usa en referencia a anticuerpos anti CD40
quiméricos significa un anticuerpo quimérico que se une a CD40
humano.
Los anticuerpos anti CD40 quiméricos y
humanizados también están abarcados por el término anticuerpo anti
CD40 según se utiliza en el presente documento. Los anticuerpos
quiméricos comprenden segmentos de anticuerpos obtenidos de
diferentes especies. Rituxan® (IDEC Pharmaceuticals Corp., San
Diego, California) es un ejemplo de un anticuerpo quimérico con una
región variable murina y una región constante humana.
Por "humanizado" se entienden formas de
anticuerpos anti CD40 que contienen una secuencia mínima derivada
de secuencias de inmunoglobulinas no humanas. En su mayoría, los
anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo
receptor) en las que están reemplazados residuos de una región
hipervariable (también conocida como región determinante de
complementariedad o CDR) del receptor por residuos de una región
hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal
como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la
especificidad, afinidad y capacidad deseadas. La expresión "región
determinante de complementariedad" se refiere a las secuencias
de aminoácidos que juntas definen la afinidad y especificidad de
unión de la región Fv natural de un sitio de unión de
inmunoglobulina nativa. Véase, por ejemplo, Chothia y col. (1987) J.
Mol. Biol. 196: 901-917; Kabat y col. (1991) U.S.
Dept of Health and Human Services, Publicación NIH Nº
91-3242). La expresión "región constante" se
refiere a la parte de la molécula de anticuerpo que confiere
funciones de efector. En trabajos anteriores dirigidos a la
producción de anticuerpos no inmunogénicos para uso en terapia de
enfermedades humanas, se sustituyeron regiones constantes de ratón
por regiones constantes humanas. Las regiones constantes de los
anticuerpos humanizados del sujeto se obtuvieron de inmunoglobulinas
humanas. Sin embargo, estos anticuerpos humanizados aún provocaron
una respuesta inmune no deseada y potencialmente peligrosa en seres
humanos y hubo pérdida de afinidad. Los anticuerpos anti CD40
humanizados para uso en los procedimientos de la presente invención
tienen características de unión similares a las exhibidas por los
anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y
CHIR-12.12 descritos en el presente documento.
La humanización puede realizarse esencialmente
siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y col.
(1986) Nature 321: 522-525; Riechmann y col. (1988)
Nature 332: 323-327; Verhoeyen y col. (1988) Science
239: 1534-1536), sustituyendo secuencias de un
anticuerpo humano por las correspondientes CDR o secuencias CDR de
roedores o roedores mutantes. Véase también las Patentes de EEUU Nº
5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. En algunos
casos, los residuos dentro de las regiones marco de una o más
regiones variables de la inmunoglobulina humana se reemplazan por
los correspondientes residuos no humanos (véase, por ejemplo, las
Patentes de EEUU Nº 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; y 6.180.370).
Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que
no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo
donador. Estas modificaciones se realizan para refinar más el
rendimiento del anticuerpo (por ejemplo, para obtener la afinidad
deseada). En general, en anticuerpo humanizado comprenderá
sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios
variables, en el que todas o sustancialmente todas las regiones
hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana
y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una
secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado
también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región
constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una
inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones y col.
(1986) Nature 331: 522-525; Riechmann y col. (1988)
Nature 332: 323-329; y Presta (1992) Curr. Op.
Struct. Biol. 2:593-596. Por consiguiente, tales
anticuerpos "humanizados" pueden incluir anticuerpos en los
que sustancialmente menos de un dominio variable intacto humano se
ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no
humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente
anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y
posiblemente algunos residuos del marco están sustituidos por
residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Véase, por
ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 5.225.539; 5.585.089; 5.693.761;
5.693.762; 5.859.205. Véase también la Patente de EEUU Nº 6.180.370,
y la Publicación Internacional WO 01/27160, en los que se dan a
conocer anticuerpos humanizados y técnicas para producir anticuerpos
humanizados que tienen mejor afinidad para un antígeno
predeterminado.
También están incluidos en el término
anticuerpos anti CD40 los anticuerpos anti CD40 xenogénicos o
modificados producidos en un huésped mamífero no humano, más
particularmente un ratón transgénico, caracterizados por loci de
inmunoglobulina (Ig) endógena inactivados. En tales animales
transgénicos, los genes endógenos competentes para la expresión de
las subunidades ligera y pesada de las inmunoglobulinas del huésped
se convierten en no funcionales y se sustituyen con los loci
análogos de inmunoglobulina humana. Estos animales transgénicos
producen anticuerpos humanos en ausencia sustancial de subunidades
ligera o pesada de inmunoglobulina del huésped. Véase, por ejemplo,
las Patentes de EEUU Nº 5.877.397 y 5.939.598.
De preferencia, los anticuerpos totalmente
humanos contra CD40 se obtienen inmunizando ratones transgénicos.
Uno de tales ratones se obtiene usando tecnología XenoMouse®
(Abgenix; Fremont, California), y se da a conocer en las Patentes
de EEUU Nº 6.075.181, 6.091.001 y 6.114.598. Para producir los
anticuerpos que se dan a conocer en el presente documento, se
inmunizaron ratones transgénicos para el locus de cadena pesada de
IgG_{1} humana y el locus de cadena ligera \kappa humana con
células Sf9 que expresan CD40 humano. Los ratones también pueden
ser transgénicos para otros isotipos. Los anticuerpos totalmente
humanos útiles en los procedimientos de la presente invención se
caracterizan por tener propiedades de unión similares a las
exhibidas por los anticuerpos monoclonales CHIR-5.9
y CHIR-12.12 descritos en el presente documento.
Los fragmentos de los anticuerpos anti CD40 son
adecuados para uso en los procedimientos de la invención siempre
que retengan la afinidad deseada del anticuerpo de longitud total.
Por consiguiente, un fragmento de un anticuerpo anti CD40 retendrá
la capacidad para unirse al antígeno CD40 de superficie de las
células B. Tales fragmentos se caracterizan por tener propiedades
similares al anticuerpo anti CD40 antagonista de longitud total
correspondiente, es decir, los fragmentos se unirán específicamente
a un antígeno CD40 humano expresado en la superficie de una célula
humana, y están exentos de actividad agonista significativa pero
exhiben actividad antagonista cuando se unen a un antígeno CD40 en
una célula humana que expresa CD40. En el presente documento se hace
referencia a estos fragmentos como fragmentos "que se unen al
antígeno". Los fragmentos de un anticuerpo que se unen al
antígeno adecuados comprenden una parte de un anticuerpo de longitud
total, por lo general la región de unión al antígeno o una de sus
regiones variables. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos
incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, F(ab')_{2}
y Fv y moléculas de anticuerpos de cadena simple. Por "Fab" se
entiende un fragmento monovalente de una inmunoglobulina que se une
al antígeno que está compuesto por la cadena ligera y parte de la
cadena pesada. Por F(ab')_{2} se entiende un fragmento
bivalente de una inmunoglobulina que se une al antígeno que
contiene ambas cadenas ligeras y parte de ambas cadenas pesadas. Por
"Fv de cadena simple" o fragmentos "sFv" del anticuerpo
se entiende fragmentos que comprenden los dominios V_{H} y V_{L}
de un anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una
cadena polipeptídica simple. Véase, por ejemplo, las Patentes de
EEUU Nº 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030 y 5.856.456. Por lo general,
el polipéptido Fv comprende además un conector de polipéptido entre
los dominios V_{H} y V_{L} que permite al sFv formar la
estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión de
sFv véase Pluckthun (1994) en The Pharmacology of Monoclonal
Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg and Moore
(Springer-Verlag, Nueva York), páginas
269-315. Los fragmentos de los anticuerpos anti
CD40 antagonistas que se unen al antígeno dados a conocer en el
presente documento también pueden conjugarse a una citotoxina para
producir la lisis de las células cancerosas diana, como se describe
a continuación en el presente documento.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos generadas
usando las técnicas descritas en, por ejemplo, McCafferty y col.
(1990) Nature 348: 552-554 (1990) y en la Patente
de EEUU Nº 5.514.548. Clackson y col. (1991) Nature 352:
624-628 y Marks y col. (1991) J. Mol. Biol. 222:
581-597 describen el aislamiento de anticuerpos
murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos.
Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos
humanos de alta afinidad (del orden de nM) por mezcla aleatoria de
cadenas (Marks y col. (1992) Biol/Technology
10:779-783), así como por infección combinatoria y
recombinación in vivo como una estrategia para construir
bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse y col. (1993) Nucleic,
Acids Res. 21: 2265-2266). Por consiguiente, estas
técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de
hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de
anticuerpos monoclonales.
Se han desarrollado diversas técnicas para la
producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos
fragmentos se obtuvieron por digestión proteolítica de anticuerpos
intactos (véase, por ejemplo, Morimoto y col. (1992) Journal of
Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117
(1992) y Brennan y col. (1985) Science 229: 81). Sin embargo, estos
fragmentos pueden producirse ahora directamente por medio de células
huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos
pueden aislarse de la biblioteca de anticuerpos de fagos analizada
anteriormente. Como alternativa, los fragmentos
Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E.
coli y pueden acoplarse químicamente para formar fragmentos
F(ab')_{2} (Carter y col. (1992) Bio/Technology 10:
163-167). Según otro enfoque, los fragmentos
F(ab')_{2} pueden aislarse directamente del cultivo de
células huésped recombinantes. Otra técnica para la producción de
fragmentos de anticuerpos resultará evidente para el experto en la
técnica.
Los anticuerpos anti CD40 antagonistas útiles en
los procedimientos de la presente invención incluyen los
anticuerpos monoclonales CHIR-5.9 y CHIR 12.12 dados
a conocer en el presente documento así como los anticuerpos que
difieren de estos anticuerpos pero que retienen las CDR; y los
anticuerpos con una o más adicion(es),
delecion(es)
o sustitución(es), en los que la actividad antagonista se mide por inhibición de la proliferación y/o diferenciación de las células B. La invención también abarca los anticuerpos anti CD40 antagonistas desinmunizados, que pueden producirse como se describe en, por ejemplo, los documentos de Publicación Internacional Nº WO 98/52976 y WO 0034317. De esta manera, los residuos dentro de los anticuerpos anti CD40 antagonistas de la invención se modifican para convertir a los anticuerpos en no inmunogénicos o menos inmunogénicos para los seres humanos manteniendo al mismo tiempo su actividad antagonista hacia las células humanas que expresan CD40, en los que tal actividad se mide por medio de los ensayos señalados en otra parte en el presente documento. También se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones las proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo anti CD40 antagonista de la invención, o uno de sus fragmentos, cuyas proteínas de fusión pueden sintetizarse o expresarse a partir de vectores de polinucleótidos correspondientes, como se conoce en la técnica. Tales proteínas de fusión se describen con referencia a la conjugación de anticuerpos como se señala a continuación.
o sustitución(es), en los que la actividad antagonista se mide por inhibición de la proliferación y/o diferenciación de las células B. La invención también abarca los anticuerpos anti CD40 antagonistas desinmunizados, que pueden producirse como se describe en, por ejemplo, los documentos de Publicación Internacional Nº WO 98/52976 y WO 0034317. De esta manera, los residuos dentro de los anticuerpos anti CD40 antagonistas de la invención se modifican para convertir a los anticuerpos en no inmunogénicos o menos inmunogénicos para los seres humanos manteniendo al mismo tiempo su actividad antagonista hacia las células humanas que expresan CD40, en los que tal actividad se mide por medio de los ensayos señalados en otra parte en el presente documento. También se incluyen dentro del alcance de las reivindicaciones las proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo anti CD40 antagonista de la invención, o uno de sus fragmentos, cuyas proteínas de fusión pueden sintetizarse o expresarse a partir de vectores de polinucleótidos correspondientes, como se conoce en la técnica. Tales proteínas de fusión se describen con referencia a la conjugación de anticuerpos como se señala a continuación.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
tener variaciones de secuencia producidas usando los procedimientos
descritos en, por ejemplo, los documentos de Publicación de Patente
Nº EP 0 983 303 A1, WO 00/34317 y WO 98/52976. Por ejemplo, se ha
mostrado que las secuencias dentro de la CDR pueden provocar que un
anticuerpo se una a MAC Clase II y desencadenar una respuesta de
células T ayudantes no deseada. Una sustitución conservadora puede
permitir que el anticuerpo retenga la actividad de unión y aún
pierda su capacidad para desencadenar una respuesta de células T no
deseada. Cualquiera de tales sustituciones conservadoras o no
conservadoras puede realizarse usando procedimientos reconocidos en
la técnica, tales como los señalados en otra parte en el presente
documento, y los anticuerpos resultantes se encontrarán dentro del
alcance de la invención. Los anticuerpos variantes pueden probarse
de manera rutinaria para verificar su actividad antagonista,
afinidad y especificidad usando los procedimientos descritos en el
presente documento.
Un anticuerpo producido por cualquiera de los
procedimientos descritos anteriormente, o cualquier otro
procedimiento no dado a conocer en el presente documento, se
encontrará dentro del alcance de esta descripción si posee al menos
una de las siguientes actividades biológicas: inhibición de la
secreción de inmunoglobulinas por las células B periféricas humanas
normales estimuladas por células T; inhibición de la supervivencia
y/o proliferación de células B periféricas humanas normales
estimuladas por células T Jurkat; inhibición de la supervivencia
y/o proliferación de células B periféricas humanas normales
estimuladas por células que expresan CD40L o ligando de CD40
soluble (sCD40L); inhibición de señales intracelulares intra
apoptóticas de "supervivencia" en cualquier célula estimulada
por sCD40L o CD40L de fase sólida; inhibición de transducción de
señal de CD40 en cualquier célula tras la unión con sCD40L o CD40L
de fase sólida; e inhibición de la proliferación de células B
neoplásicas humanas como se señala a continuación. Estos ensayos
pueden realizarse como se describe en Schultze y col. (1998) Proc.
Natl. Acad Sci. USA 92: 8200-8204; Denton y col.
(1998) Pediatr. transplant. 2: 6-15; Evans y col.
(2000) J. Immunol. 164: 688-697; Noelle (1998)
Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Lederman y col.
(1996) Curr. Opin. Hematol. 3: 77-86; Coligan y
col. (1991) Current Protocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom y
col. (1993) Immunology 79: 439-444; y Patentes de
EEUU Nº 5.674.492 y 5.847.082.
Un ensayo representativo para detectar
anticuerpos anti CD40 antagonistas específicos para los epítopos del
antígeno CD40 identificado en el presente documento es un "ensayo
de unión competitiva". Los ensayos de unión competitiva son
ensayos serológicos en los que el desconocido se detecta y
cuantifica por su capacidad para inhibir la unión de un ligando
conocido marcado a su anticuerpo específico. Esto también se conoce
como un ensayo de inhibición competitiva. En un ensayo de unión
competitiva representativo, se precipita el polipéptido CD40
marcado por medio de anticuerpos candidato en una muestra, por
ejemplo, en combinación con anticuerpos monoclonales surgidos
contra uno o más epítopos de los anticuerpos monoclonales de la
invención. Los anticuerpos anti CD40 que reaccionan específicamente
con un epítopo de interés pueden identificarse seleccionando una
serie de anticuerpos preparados contra una proteína CD40 o fragmento
de la proteína que comprende el epítopo particular de la proteína
CD40 de interés. Por ejemplo, para CD40 humano, los epítopos de
interés incluyen epítopos que comprenden residuos de aminoácido
lineales o no lineales de la isoforma corta del CD40 humano (véase
GenBank Nº de acceso NP 690593) presentada en la Figura 4B (SEC ID
Nº 10), codificada por la secuencia presentada en la Figura 4A (SEC
ID Nº 9; véase también GenBank Nº de acceso M 152854), o de la
isoforma larga de CD40 humano (véase GenBank Nº de acceso CAA43045
y NP 001241) presentada en la Figura 4D (SEC ID Nº 12), codificada
por la secuencia presentada en la Figura 4C (SEC ID Nº 11; véase
GenBank Nº de acceso X60592 y MN 001250). Como alternativa, podrían
usarse ensayos de unión competitiva con anticuerpos anti CD40
antagonistas adecuados identificados anteriormente para seleccionar
los anticuerpos monoclonales comparables a los anticuerpos
identificados anteriormente.
Los anticuerpos utilizados en tales
inmunoensayos pueden estar marcados o no marcados. Los anticuerpos
no marcados pueden utilizarse en aglutinación; los anticuerpos
marcados pueden utilizarse en una amplia diversidad de ensayos,
usando una amplia diversidad de marcadores. La detección de la
formación de un complejo antígeno-anticuerpo entre
un anticuerpo anti CD40 y un epítopo de interés puede facilitarse
fijando una sustancia detectable al anticuerpo. Los medios de
detección adecuados incluyen el uso de marcadores como
radionúclidos, enzimas, coenzimas, fluorescentes,
quimioluminiscentes, cromógenos, complejos enzima sustrato o
cofactores, inhibidores de enzimas, complejos de grupos
prostéticos, radicales libres, partículas, colorantes y similares.
Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa del rábano
picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o
acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos
prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y
avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes
apropiados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro
de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material fluorescente
es el luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen
luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de material
radiactivos adecuado incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o
^{3}H. Tales reactivos marcados pueden utilizarse en una
diversidad de ensayos conocidos, tales como radioinmunoensayos,
inmunoensayos enzimáticos, por ejemplo, ELISA inmunoensayos
fluorescentes y similares. Véase, por ejemplo, Patentes de EEUU Nº
3.766.162; 3.791.932; 3.817.837; y 4.233.402.
Cualquiera de los anticuerpos anti CD40
antagonistas o sus fragmentos de anticuerpos descritos previamente
pueden conjugarse antes del uso en los procedimientos de la presente
invención. Los procedimientos para producir anticuerpos conjugados
son conocidos en la técnica. Por consiguiente, el anticuerpo anti
CD40 puede marcarse usando una marcación indirecta o un enfoque de
marcación indirecta. Por "marcación indirecta" o "enfoque de
marcación indirecta" se entiende que un agente quelante se une
covalentemente a un anticuerpo y se inserta al menos un
radionúclido en el agente quelante. Véase, por ejemplo, los agentes
quelantes y radionúclidos descritos en Srivagtava and Mease (1991)
Nucl. Med. Bio. 18: 589-603, incorporado a esta
invención como referencia. Los marcadores adecuados incluyen
fluoróforos, cromóforos, átomos radiactivos (especialmente ^{32}P
y ^{125}I), reactivos densos a electrones, enzimas y ligandos que
tienen parejas de unión específicas. Las enzimas se detectan
normalmente por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa del rábano
picante se detecta usualmente mediante su capacidad para convertir
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) en un pigmento
azul, cuantificable con un espectrofotómetro. "Pareja de unión
específica" se refiere a una proteína capaz de unirse a una
molécula de ligando con alta especificidad, como por ejemplo en el
caso de un antígeno y un anticuerpo monoclonal específico para
éste. Otras parejas de unión específica incluyen biotina y avidina o
estreptavidina, IgG y proteína A, y las numerosas parejas de
receptor-ligando conocidas en la técnica. Debería
entenderse que la descripción anterior no pretende categorizar los
diversos marcadores en diferentes clases, ya que el mismo marcador
puede servir en varios modos diferentes. Por ejemplo, ^{125}I
puede servir como un marcador radioactivo o como un reactivo denso
en electrones. HRP puede servir como enzima o como antígeno para un
mAb. Además, pueden combinarse diversos marcadores para el efecto
deseado. Por ejemplo, los mAb y la avidina también requieren
marcadores en la práctica de esta invención: por consiguiente, puede
marcarse un mAb con biotina, y detectarse su presencia con avidina
marcada con ^{125}I, o con un mAb anti-biotina
marcado con HRP. Otras permutaciones y posibilidades serán
fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, y se
consideran como equivalentes dentro del alcance de la presente
invención.
Como alternativa, el anticuerpo anti CD40 puede
marcarse usando "marcación directa" o un "enfoque de
marcación directa", en el que un radionúclido se fija
covalentemente a un anticuerpo (típicamente a través de un residuo
de aminoácido). Los radionúclidos de preferencia se proporcionan en
Srivagtava and Mease (1991) supra. El enfoque de marcación
indirecta es particularmente de preferencia. Véase también, por
ejemplo, los documentos de Publicación Internacional Nº WO 00/52031
y WO 00/52473, en los que se usa un conector para fijar el marcador
radiactivo a los anticuerpos; y las formas marcadas de anticuerpos
anti CD40 descritas en la Patente de EEUU Nº 6.015.542.
Además, un anticuerpo (o su fragmento) puede
conjugarse a un resto terapéutico como una citotoxina, un agente
terapéutico, iones metálicos radiactivos o radioisótopos. Una
citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es
perjudicial para las células. Algunos ejemplos incluyen taxol,
citochalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina,
mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina,
colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin
diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D,
1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína,
tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y sus análogos y
homólogos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a,
antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato,
6-mercaptopurina, 6-tioguanina,
citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes
alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo,
melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida,
busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y
cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino),
antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente
daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo,
dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina
y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo,
vincristina y vinblastina) Los radioisótopos incluyen, pero no se
limitan a, I-131, I-123,
I-125, Y-90, Re-188,
Re-186, At-211,
Cu-67, Bi-212,
Bi-213, Pd-109,
Tc-99, In-111 y similares. Los
conjugados de la invención pueden utilizarse para modificar una
respuesta biológica determinada; no debe entenderse que el resto del
fármaco esté limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos.
Por ejemplo, el resto del fármaco puede ser una proteína o un
polipéptido que tenga una actividad biológica deseada. Tales
proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina,
ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina de difteria; una
proteína tal como el factor de necrosis tumoral, interferón alfa,
interferón beta, factor de crecimiento de los nervios, factor de
crecimiento derivado de las plaquetas, activador tisular del
plasminógeno, o, modificadores de respuesta biológica tales como,
por ejemplo, linfocinas, interleucina 1
("IL-1"), interleucina 2
("IL-2"), interleucina-6
("IL-6"), factor estimulador de colonias de
granulocitos y macrófagos ("GM-CSF"), factor
estimulador de colonias de granulocitos
("G-CSF") u otros factores de crecimiento.
Las técnicas para conjugar tales restos
terapéuticos a anticuerpos son bien conocidas. Véase, por ejemplo,
Amon y col. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of
Drugs in Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, ed. Reisfeld y col. (Alan R. Liss, Inc.), páginas
243-256; ed. Hellstrom y col. (1987) "Antibodies
for Drug Delivery," en Controlled Drug Delivery, ed. Robinson y
col. (2ª ed; Marcel Dekker, Inc.), páginas 623-653;
Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer
Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological and
Clinical Applications, ed. Pinchera y col. páginas
475-506 (Editrice Kurtis, Milán, Italia, 1985);
"Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use
of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", en Monoclonal
Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin y col.
(Academic Press, Nueva York, 1985), páginas
303-316; y Thorpe y col. (1982) Immunol. Rev. 62:
119-158.
Como alternativa, un anticuerpo puede conjugarse
a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de
anticuerpos como se describe en la Patente de EEUU Nº 4.676.980.
Además, pueden utilizarse conectores entre los marcadores y los
anticuerpos de la invención (véase Patente de EEUU Nº 4.831.175).
Los anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno pueden
marcarse directamente con yodo, indio, itrio radiactivos o con otras
partículas radiactivas conocidas en la técnica (Patente de EEUU Nº
5.595.721). El tratamiento puede estar constituido por una
combinación de tratamiento con anticuerpos conjugados y no
conjugados administrados en forma simultánea o consecutiva
(documentos WO 00/52031 y WO 00/52473).
En los procedimientos de la presente invención
pueden utilizarse variantes de los anticuerpos anti CD40
antagonistas biológicamente activas adecuadas. Tales variantes
retendrán las propiedades de unión deseadas del anticuerpo anti
CD40 antagonista original. Por lo general, en la técnica están
disponibles procedimientos para producir variantes de
anticuerpos.
Por ejemplo, pueden prepararse variantes de
secuencias de aminoácidos de un anticuerpo anti CD40 antagonista,
por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o
CHIR-12.12 descritos en el presente documento, por
medio de mutaciones en la secuencia de ADN clonada que codifica el
anticuerpo de interés. Los procedimientos para mutagénesis y
alteraciones de secuencias de nucleótidos son bien conocidos en la
técnica. Véase, por ejemplo, Walker and Gaastra, eds. (1983)
Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva
York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad Sci. USA 82:
488-492; Kunkel y col. (1987) Methods Enzymol. 154:
367-382; Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York); Patente de
EEUU Nº 4.873.192; y las referencias citadas en la misma. En el
modelo de Dayhoff y col. (1978) en Atlas of Protein Sequence and
Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) puede
encontrarse orientación para sustituciones adecuadas de aminoácidos
que no afectan la actividad biológica del polipéptido de interés.
Las sustituciones conservadoras, tales como los intercambios de un
aminoácido con otro que tiene propiedades similares, pueden ser de
preferencia. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen,
pero no se limitan a, Gly\LeftrightarrowAla,
Val\LeftrightarrowIle\LeftrightarrowLeu,
Asp\LeftrightarrowGlu, Lys\LeftrightarrowArg,
Asn\LeftrightarrowGln y
Phe\LeftrightarrowTrpo\LeftrightarrowTyr.
En la construcción de variantes del polipéptido
de interés del anticuerpo anti CD40 antagonista, las modificaciones
se realizan de manera tal que las variantes sigan teniendo la
actividad deseada, es decir, afinidad de unión similar y sean
capaces de unirse específicamente a un antígeno CD40 humano
expresado en la superficie de una célula humana y estén exentas de
actividad agonista significativa pero que exhiban actividad
antagonista cuando se unen a un antígeno CD40 en una célula humana
que expresa CD40. Obviamente, cualquier mutación realizada en el
ADN que codifica la variante polipéptido no deben colocar a la
secuencia fuera del marco de lectura y de preferencia no creará
regiones complemen-
tarias que podrían producir estructura de ARNm secundaria. Véase Publicación de Solicitud de Patente EP Nº 75.444.
tarias que podrían producir estructura de ARNm secundaria. Véase Publicación de Solicitud de Patente EP Nº 75.444.
Además, la región constante de un anticuerpo
anti CD40 antagonista puede mutarse para alterar la función efectora
en una serie de formas. Por ejemplo, véase la Patente de EEUU Nº
6.737.056B1 y la Publicación de Solicitud de Patente Nº
2004/0132101A1, que dan a conocer mutaciones de Fc que optimizan la
unión del anticuerpo a los receptores de Fc.
De preferencia, las variantes de un anticuerpo
anti CD40 antagonista de referencia tienen secuencias de aminoácidos
que tienen al menos 70% o 75% de homología de secuencia, de
preferencia al menos 80% u 85% de homología de secuencia, de más
preferencia al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ó 95% de homología de
secuencia con la secuencia de aminoácidos para la molécula del
anticuerpo anti CD40 antagonista de referencia, por ejemplo, el
anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 o
CHIR-12.12 descritos en el presente documento, o con
una parte más corta de una molécula de anticuerpo de referencia. De
más preferencia, las moléculas comparten al menos 96%, 97%, 98% ó
99% de homología de secuencia. Para los fines de la presente
invención, el porcentaje de homología de secuencia se determina
usando el algoritmo de búsqueda de homología de
Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines
con parámetros de penalización de hueco abierto de 12 y
penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El
algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman
se enseña en Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:
482-489. Una variante puede, por ejemplo, diferir
del anticuerpo anti CD40 antagonista de referencia en tan pocos
como 1 a 15 residuos de aminoácidos, tan pocos como 1 a 10 residuos
de aminoácidos, tal como 6-10, tan pocos como 5, tan
pocos como 4, 3, 2, o incluso 1 residuo de aminoácido.
Con respecto a la alineación óptima de dos
secuencias de aminoácidos, el segmento contiguo de la secuencia de
aminoácidos variante puede tener residuos de aminoácidos adicionales
o residuos de aminoácidos delecionados con respecto a la secuencia
de aminoácidos de referencia. El segmento contiguo utilizado para la
comparación con la secuencia de aminoácidos de referencia incluirá
al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos y puede tener 30, 40,
50 o más residuos de aminoácidos. Pueden hacerse correcciones para
homología de secuencia asociadas con huecos o sustituciones
conservadoras de residuos (véase el algoritmo de búsqueda de
Smith-Waterman).
La estructura química exacta de un polipéptido
capaz de unirse específicamente a CD40 y que retiene la actividad
antagonista, en particular cuando se une al antígeno CD40 en células
B malignas o células que expresan CD40 de un tumor sólido, depende
de una serie de factores. Como en la molécula están presentes grupos
amino y carboxilo ionizables, puede obtenerse un polipéptido
particular como una sal ácida o básica, o en forma neutra. Todas
las preparaciones que retienen su actividad biológica cuando se
colocan en condiciones ambientales adecuadas están incluidas en la
definición de anticuerpos anti CD40 antagonistas en el presente
documento. Además, puede aumentarse la secuencia de aminoácidos
principal del polipéptido por derivatización con restos de azúcar
(glicosilación) o por otras moléculas complementarias tales como
lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. También puede
aumentarse por conjugación con sacáridos. Ciertos aspectos de tal
aumento se realizan a través de sistemas de procesamiento
postraduccionales del huésped productor; otras de tales
modificaciones pueden introducirse in vitro. En cualquier
caso, tales modificaciones están incluidas en la definición de un
anticuerpo anti CD40 usada en el presente documento siempre que no
se destruyan las propiedades de antagonista del anticuerpo anti
CD40. Se espera que tales modificaciones puedan afectar
cuantitativamente o cualitativamente la actividad, ya sea
aumentando o disminuyendo la actividad del polipéptido, en los
diversos ensayos. Además, pueden modificarse residuos de
aminoácidos individuales en la cadena por oxidación, reducción u
otra derivatización, y el polipéptido puede escindirse para obtener
fragmentos que retengan la actividad. Tales alteraciones que no
destruyen la actividad antagonista no retiran a la secuencia del
polipéptido de la definición de anticuerpos anti CD40 de interés
según se utiliza en el presente documento.
La técnica proporciona orientación sustancial
con respecto a la preparación y al uso de las variantes de
polipéptidos. En la preparación de las variantes de anticuerpos
anti CD40, un experto en la técnica puede determinar fácilmente qué
modificaciones a la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de la
proteína nativa darán como resultado una variante que sea adecuada
para uso como un componente terapéuticamente activo de una
composición farmacéutica utilizada en los procedimientos dados de la
presente invención.
Los procedimientos de la divulgación están
dirigidos al uso de anticuerpos anti CD40 antagonistas para tratar
sujetos (es decir, pacientes) que tienen tumores sólidos que
comprenden células que expresan el antígeno de superficie celular
CD40. Por "células del carcinoma que expresan CD40" se entiende
células malignas (por ejemplo, neoplásticas) o
pre-malignas (por ejemplo, neoplásticas) de un tumor
sólido que expresa el antígeno de superficie celular CD40. Los
procedimientos para detectar la expresión de CD40 en células son muy
conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, técnicas
de PCR, inmunohistoquímica, citometría de flujo, transferencia
Western, ELISA y similares. Tumores sólidos que se pueden tratar
usando los procedimientos de las presente descripción incluyen,
pero sin limitarse a estos, cáncer de ovarios, pulmón (por ejemplo,
cáncer de pulmón de células no pequeñas del carcinoma de células
escamosas, adenocarcinoma, y tipos de carcinoma de células grandes,
y cáncer de células pequeñas del pulmón), mama, colon, riñón
(incluyendo, por ejemplo, carcinomas de células renales), vejiga,
hígado (incluyendo, por ejemplo, carcinomas hepatocelulares)
gástrico, de cuello uterino, próstata, nasofaringeal, tiroides (por
ejemplo, carcinoma papilar de tiroides), y cánceres de piel tales
como melanoma, y sarcomas (incluyendo, por ejemplo, osteosarcomas y
sarcomas de Ewing).
En el presente documento se define
"tratamiento" como la aplicación o administración de un
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno a un paciente, o la aplicación o administración de un
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento a un tejido aislado
o línea celular de un sujeto, en el que el sujeto tiene un tumor
sólido, un síntoma asociado con un tumor sólido, o una
predisposición hacia el desarrollo de un tumor sólido, siendo el
objetivo curar, sanar, calmar, aliviar, alterar, remediar, mejorar o
afectar el tumor sólido, cualquier síntoma asociado al tumor sólido
o la predisposición al desarrollo del tumor sólido. Por
"tratamiento" también se entiende la aplicación o
administración de una composición farmacéutica que comprende el
anticuerpo anti CD40 antagonista o sus fragmentos a un sujeto, o la
aplicación o administración de una composición farmacéutica que
comprende los anticuerpos anti CD40 o sus fragmentos a un tejido
aislado o una línea celular de un sujeto, que tiene un tumor
sólido, un síntoma asociado con un tumor sólido o una predisposición
al desarrollo del tumor sólido, siendo el objetivo curar, sanar,
calmar, aliviar, alterar, remediar, mejorar o afectar el tumor
sólido, los síntomas del tumor sólido o la predisposición al
desarrollo del tumor sólido.
Se entiende por "actividad antitumoral" una
reducción en la tasa de proliferación o acumulación de células
malignas que expresan CD40, y por consiguiente un descenso en la
tasa de crecimiento de un tumor existente o en un tumor que surge
durante la terapia, y/o la destrucción de células neoplásicas
(tumor) existentes o células neoplásicas formadas nuevas, y por
consiguiente un descenso en el tamaño global de un tumor durante la
terapia. La terapia con al menos un anticuerpo anti CD40 (o su
fragmento de unión al antígeno) provoca una respuesta fisiológica
que es ventajosa con respecto al tratamiento de tumores sólidos en
un humano, donde los tumores sólidos comprenden células de
carcinoma que expresan CD40. Se reconoce que los procedimientos de
la descripción pueden ser útiles en la prevención de otras
consecuencias tumorales que surjan durante la terapia.
De conformidad con los procedimientos de la
presente divulgación, al menos un anticuerpo anti CD40 antagonista
(o su fragmento de unión al antígeno) tal como se define en otras
partes en el presente documento se utiliza para promover una
respuesta terapéutica positiva con respecto a un tumor sólido. Por
"respuesta terapéutica positiva" con respecto al tratamiento
del cáncer se entiende una mejora en la enfermedad asociada con la
actividad antitumoral de estos anticuerpos o sus fragmentos, y/o
una mejora en los síntomas asociados con la enfermedad. Es decir,
puede observarse un efecto antiproliferativo, prevención de otras
consecuencias del tumor, una reducción del tamaño del tumor, una
reducción en la cantidad de células cancerosas y/o una disminución
en uno o más síntomas mediados por la estimulación de las células
que expresan CD40. Por consiguiente, por ejemplo, una mejora de la
enfermedad puede ser caracterizada como una respuesta completa. Por
"respuesta completa" se entiende la ausencia de enfermedad
clínicamente detectable con normalización de cualquier estudio
radiográfico, de médula ósea y de líquido cefalorraquídeo (LCR),
previamente anormal. Tal respuesta debe persistir durante al menos
un mes después del tratamiento según los procedimientos de la
descripción. Como alternativa, una mejora en la enfermedad puede
clasificarse como una respuesta parcial. Por "respuesta
parcial" se entiende una disminución de al menos el 50% en todas
las cargas tumorales que pueden medirse (es decir, la cantidad de
células tumorales presentes en el sujeto) en ausencia de nuevas
lesiones y que persiste durante al menos un mes. Tal respuesta es
aplicable sólo a los tumores que pueden medirse.
La respuesta del tumor puede evaluarse para
cambios en la morfología del tumor (es decir, carga general del
tumor, tamaño del tumor y similares) utilizando técnicas de
detección tales como la exploración de imágenes de resonancia
magnética (RM), imágenes de rayos x, exploración por tomografía
computerizada (TC), imágenes bioluminiscentes, por ejemplo,
imágenes con luciferasa, imágenes de gammagrafía ósea y recogida de
muestras de biopsias de tumor incluyendo la aspiración de médula
ósea (AMO). Además de estas respuestas terapéuticas positivas, el
sujeto que se somete a terapia con el anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede experimentar
el efecto ventajoso de una mejora en los síntomas asociados con la
enfermedad.
Por "dosis o cantidad terapéuticamente
eficaz" o "cantidad eficaz" se entiende una cantidad de
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
anticuerpo que, cuando se administra da lugar a una respuesta
terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un paciente con
una enfermedad que comprende la estimulación de las células que
expresan CD40. En algunas realizaciones de la invención, una dosis
terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti CD40 o su fragmento
está en el intervalo desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta
aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta
aproximadamente 15 mg/kg, o desde aproximadamente 7 mg/kg hasta
aproximadamente 12 mg/kg. Se reconoce que el procedimiento de
tratamiento puede comprender una única administración de una dosis
terapéuticamente eficaz o múltiples administraciones de una dosis
terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno.
Otra realización de la divulgación es el uso de
anticuerpos anti CD40 antagonistas para el control de diagnóstico
de los niveles proteicos en el tejido como parte de un procedimiento
de pruebas clínicas, por ejemplo, para determinar la eficacia de un
régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse por el
acoplamiento del anticuerpo a una sustancia detectable. Los
ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas,
grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales
luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales
radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la
peroxidasa del rábano picante, la fosfatasa alcalina, la
\beta-galactosidasa o la acetilcolinesterasa; los
ejemplos de complejos de grupos prostético adecuados incluyen
estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales
fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína,
isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina
fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un
material fluorescente incluye el luminol; los ejemplos de materiales
bioluminiscentes incluyen la luciferasa, luciferina y aequorina; y
los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen ^{125}I,
^{131}I ^{35}S o ^{3}H.
En algunas realizaciones preferidas, los
anticuerpos anti CD40 antagonistas de la invención, o sus fragmentos
de unión al antígeno, se administran en combinación con al menos
otra terapia contra cáncer, incluyendo pero sin limitarse a estas,
cirugía, terapia de radiación, quimioterapia, terapia con citocina,
u otro anticuerpo monoclonal que se pretenda para uso en el
tratamiento del tumor sólido de interés, en las que la terapia
anticancerosa adicional se administra antes de, durante, o
posteriormente a la terapia con el anticuerpo anti CD40. Por
consiguiente, cuando las terapias combinadas comprenden la
administración de un anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno en combinación con la administración
de otro agente terapéutico, como con quimioterapia, terapia con
citocina, u otro anticupero monoclonal, los procedimientos de la
divulgación abarcan la coadministración, usando formulaciones
separadas de una formulación farmacéutica única, y la administración
consecutiva en cualquier orden, en el que preferiblemente hay un
periodo de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes activos
ejercen simultáneamente sus actividades terapéuticas. Cuando los
procedimientos de la presente descripción comprenden regímenes
terapéuticos combinados, estas terapias pueden darse de manera
simultánea, es decir, el anticuerpo anti CD40 o su fragmento de
unión al antígeno se administra simultáneamente o dentro del mismo
período de tiempo que la otra terapia contra el cáncer (es decir,
las terapias tienen lugar simultáneamente, pero el anticuerpo anti
CD40 o su fragmento de unión al antígeno no se administra
precisamente en el mismo momento que la otra terapia contra el
cáncer). Como alternativa, el anticuerpo anti CD40 de la presente
invención o su fragmento de unión al antígeno puede también
administrarse antes de, o posteriormente a la otra terapia contra
el cáncer. La administración secuencial de las diferentes terapias
contra el cáncer puede realizarse independientemente de que el
sujeto tratado responda al primer curso de terapia para disminuir la
posibilidad de remisión o recaída.
En algunas realizaciones de la invención, los
anticuerpos anti CD40 descritos en este documento, o sus fragmentos
de unión al antígeno, se administran en combinación con
quimioterapia o terapia con citocina, pudiéndose administrar el
anticuerpo y el(los) agente(s)
quimioterapéutico(s) o citocina(s) secuencialmente, en
cualquier orden, o simultáneamente (es decir, de manera simultánea
o dentro del mismo periodo de tiempo). Ejemplos de agentes
quimioterapéuticos adecuados incluyen, pero sin limitarse a estos,
CPT-11 (irinotecano), que se puede usar, por
ejemplo, en el tratamiento de cáncer colorrectal y cáncer de células
no pequeñas del pulmón; gemcitabina, que se puede usar, por
ejemplo, en el tratamiento de cáncer de pulmón, cáncer de mama, y
cáncer epitelial de ovarios; y otros agentes quimioterapéuticos
adecuados para el tratamiento de tumores sólidos. Citocinas de
interés incluyen, pero sin limitarse a estas,
alfa-interferona, gamma-interferona,
interleuquina-2 (IL-2),
IL-12, IL-15 e
IL-21, factor de estimulación de colonia de
macrófago granulocito (GM-CSF), factor de
estimulación de colonia de granulocito (G-CSF) o
variantes biológicamente activas de estas citocinas.
En otras realizaciones de la invención, los
anticuerpos anti CD40 descritos en este documento, o sus fragmentos
de unión al antígeno, se administran en combinación con otros
anticuerpos monoclonales dirigidos al tratamiento del tumor sólido.
Por consiguiente, por ejemplo, cuando el sujeto está sometido a
tratamiento de un cáncer de mama que comprende células del
carcinoma que expresan CD40, la terapia podría incluir
administración de cantidades efectivas de un anticuerpo
anti-CD40 antagonista descrito en este documento, o
su fragmento de unión al antígeno, en combinación con
administración de cantidades efectivas de Herceptin® (Genentech,
Inc., San Francisco, California), que se dirige a la proteína
receptora Her2 en células de cáncer de mama Her2+. De forma
similar, cuando el sujeto está sometido a tratamiento de cáncer
colorrectal que comprende células del carcinoma que expresan CD40,
la terapia podría incluir administración de cantidades efectivas de
un anticuerpo anti-CD40 antagonista descrito en
este documento, o su fragmento de unión al antígeno, en combinación
con administración de cantidades efectivas de anticuerpo monoclonal
humanizado Avastin^{TM} (también conocido como bevacizumab;
Genentech, Inc., San Francisco, California), que se une e inhibe el
factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), una proteína que
juega un papel crítico en la angionénesis del tumor. Otros ejemplos
de anticuerpos monoclonales dirigidos al tratamiento de tumores
sólidos que se pueden usar en combinación con los anticuerpos
anti-CD40 de la presente invención incluyen, pero
sin limitarse a estos, anticuerpo anti-EGFR que se
dirigen al receptor del factor del crecimiento epidérmico (por
ejemplo, IMC-C225 (ImClone Systems, Nueva York,
Nueva York) (véase, por ejemplo, Mendelsohn and Baselga (2000)
Oncogene 19: 6550-6565 and Solbach y col. (2002)
Int. J. Cancer 101: 390-394); anticuerpo del
receptor anti-IGF-1, que se dirige a
la proteína del receptor IGF-1 (véase, por ejemplo,
Maloney y col. (2003) Cancer Res. 63: 5073-5083 and
Hailey y col. (2002) Mol. Cancer. Plier. 1:
1349-1353; anticuerpo anti-MUCl, que
se dirige la antígeno MUC1 asociado al tumor;
anti-\alpha5\beta1,
anti-\alphav\beta5, y
anti-\alphav\beta3, que se dirige a aquellas
integrinas respectivas, que regulan la adhesión celular y procesos
de señalización implicados en la proliferación y supervivencia
celular (véase, por ejemplo, Laidler y col. (2000) Acta Biochimica
Polonica 47 (4): 1159-1170 and
Cruet-Hennequart y col. (2003) Oncogene 22 (11):
1688-1702); anticuerpo
anti-P-cadherina, que se dirige a
este miembro de la familia de la cadherina (véase, por ejemplo, la
solicitud de patente de EEUU en tramitación junto con la presente
20030194406); y anticuerpo
anti-VE-cadherina, que se dirige a
la función relacionada angiogénica de esta molécula de adhesión
específica de la célula del endotelio (véase, por ejemplo, Liao y
col. (2002) Cancer Res. 62: 2567-2575).
Los anticuerpos anti-CD40 de la
invención y el otro anticuerpo monoclonal se pueden administrar
secuencialmente, en cualquier orden, o simultáneamente (es decir,
de forma simultánea o dentro del mismo periodo de tiempo). Cuando
se administra más de un tipo de anticuerpo monoclonal, los
procedimientos de la presente invención pueden comprender
adicionalmente la exposición a radiación y/o quimioterapia como se
especifique para el tratamiento contra el cáncer y como se
recomiende por el facultativo médico responsible.
Los anticuerpos anti CD40 para uso en los
procedimientos de la presente invención se administran en una
concentración que es terapéuticamente eficaz para prevenir o tratar
tumores sólidos que comprenden células del carcinoma que expresan
CD40, incluyendo cáncer de ovarios, pulmón (por ejemplo, cáncer de
pulmón de células no pequeñas del carcinoma de células escamosas,
adenocarcinoma, y tipos de carcinoma de células grandes, y cáncer de
células pequeñas del pulmón), mama, colon, riñón (incluyendo, por
ejemplo, carcinomas de células renales), vejiga, hígado
(incluyendo, por ejemplo, carcinomas hepatocelulares) gástrico, de
cuello uterino, próstata, nasofaringeal, tiroides (por ejemplo,
carcinoma papilar de tiroides), y cánceres de piel tales como
melanoma, y sarcomas (incluyendo, por ejemplo, osteosarcomas y
sarcomas de Ewing). Para lograr este objetivo, los anticuerpos
pueden formularse usando una diversidad de excipientes aceptables
conocidos en la técnica. Típicamente, los anticuerpos se
administran por medio de inyección, ya sea por vía intravenosa o por
vía intraperitoneal. Los procedimientos para llevar a cabo esta
administración son conocidos por los expertos en la técnica. También
es posible obtener composiciones que pueden administrarse por vía
tópica o por vía oral, o que pueden ser capaces de transmitirse a
través de membranas mucosas.
La administración intravenosa se realiza de
preferencia por medio de infusión durante un período de
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 horas, de más
preferencia durante aproximadamente 1 hasta aproximadamente 8 horas,
de más preferencia aún durante aproximadamente 2 hasta
aproximadamente 7 horas, todavía de más preferencia durante
aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 horas, dependiendo del
anticuerpo anti CD40 que se administra. La infusión inicial con la
composición farmacéutica puede administrarse durante un período de
aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 horas con infusiones
posteriores administradas de manera más rápida. Las infusiones
posteriores pueden administrarse durante un período de
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6 horas, incluyendo, por
ejemplo, aproximadamente 1 hasta aproximadamente 4 horas,
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 horas, o aproximadamente 1
hasta aproximadamente 2 horas.
Una composición farmacéutica de la invención
está formulada para que sea compatible con su vía de administración
prevista. Los ejemplos de posibles vías de administración incluyen
la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa (IV),
intramuscular (IM), intradérmica, subcutánea (SC), intraperitoneal,
intratumoral o la infusión), oral y pulmonar (por ejemplo,
inhalación), nasal, transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las
disoluciones o suspensiones usadas para aplicaciones parenterales,
intradérmicas o subcutáneas pueden incluir los siguientes
componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección,
disolución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles,
glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes
antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos;
antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio;
agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético;
tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para
ajustar la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH
puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o
hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede incluirse en
ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples
fabricados de vidrio o de plástico.
Los anticuerpos anti CD40 se proporcionan
típicamente por medio de técnicas convencionales en un tampón
farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, disolución salina estéril,
agua tamponada estéril, propilenglicol, combinaciones de los
anteriores, etc. En Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed.;
Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990) se describen
procedimientos para preparar agentes que pueden administrarse por
vía parenteral.
Véase también, por ejemplo, el documento WO
98/56418, que describe formulaciones farmacéuticas de anticuerpos
estabilizadas adecuadas para usar en los procedimientos descritos en
el presente documento.
Un experto en la técnica puede determinar
fácilmente sin excesiva experimentación la cantidad de al menos un
anticuerpo anti CD40 o su fragmento a administrar dada la
descripción del presente documento. Los factores que influyen en el
modo de administración y la respectiva cantidad de al menos un
anticuerpo anti CD40 antagonista (o su fragmento) incluyen, pero se
limitan a, la gravedad de la enfermedad, la historia de la
enfermedad, y la edad, altura, peso, salud y condición física del
individuo que se somete al tratamiento. De manera similar, la
cantidad de anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento a
administrar dependerá del modo de administración y de si el sujeto
se someterá a una monodosis o a dosis múltiples de este agente
antitumoral. Por lo general, al aumentar el peso del sujeto sometido
al tratamiento, resulta de preferencia una dosis más alta del
anticuerpo anti CD40 o su fragmento. La dosis del anticuerpo anti
CD40 o su fragmento a administrar está en el intervalo desde
aproximadamente 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, de
preferencia en el intervalo de 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 40
mg/kg. Por consiguiente, por ejemplo, la dosis puede ser de 0,01
mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5
mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15
mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg,
35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg o 50 mg/kg.
35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg o 50 mg/kg.
En otra realización de la descripción, el
procedimiento comprende la administración de dosis múltiples de
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento. El procedimiento
puede comprender la administración de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o más dosis terapéuticamente eficaces de
una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento. La frecuencia y duración de
administración de las dosis múltiples de las composiciones
farmacéuticas que comprenden anticuerpo anti CD40 o su fragmento
pueden ser determinadas fácilmente por un experto en la técnica sin
excesiva experimentación dada la descripción del presente
documento. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad
terapéuticamente eficaz de un anticuerpo puede incluir un
tratamiento único o, de preferencia, puede incluir una serie de
tratamientos. En un ejemplo de preferencia, se trata al sujeto con
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de
peso corporal, una vez por semana durante aproximadamente entre 1 y
10 semanas, de preferencia aproximadamente entre 2 y 8 semanas, de
más preferencia aproximadamente entre 3 y 7 semanas, y aún de más
preferencia durante aproximadamente 4, 5, ó 6 semanas. El
tratamiento puede llevarse a cabo anualmente para prevenir la
recaída o tras la indicación de la recaída. También se apreciará
que la dosis eficaz de anticuerpo o su fragmento de unión al
antígeno usado para el tratamiento puede aumentar o disminuir en el
transcurso de un tratamiento particular. Los cambios en la dosis
pueden ser el resultado y pueden resultar evidentes a partir de los
resultados de los ensayos de diagnóstico como se describe en el
presente documento. Por consiguiente, en una forma de realización,
el régimen de dosificación incluye una primera administración de
una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti
CD40 o su fragmento en los días 1, 7, 14 y 21 de un período de
tratamiento. En otra forma de realización, el régimen de
dosificación incluye una primera administración de una dosis
terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti CD40 o su
fragmento en los días 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 de una semana en un
período de tratamiento. Otras formas de realización incluyen un
régimen de dosificación que tiene una primera administración de una
dosis terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti CD40 o
su fragmento en los días 1, 3, 5 y 7 de una semana en un período de
tratamiento; un régimen de dosificación incluye una primera
administración de una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un
anticuerpo anti CD40 o su fragmento en los días 1 y 3 de una semana
en un período de tratamiento; y un régimen de dosificación de
preferencia que incluye una primera administración de una dosis
terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti CD40 o su
fragmento en el día 1 de una semana en un período de tratamiento.
El período de tratamiento puede comprender 1 semana, 2 semanas, 3
semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o un año. Los períodos de
tratamiento pueden ser consecutivos o pueden estar separados uno de
otro por un día, una semana, 2 semanas, un mes, 3 meses, 6 meses o
un año.
En algunas realizaciones, la dosis
terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno varía desde aproximadamente 0,003
mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg, desde aproximadamente 0,01
mg/kg hasta aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0,01
mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,1
mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0,5
mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg
hasta aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 25 mg/kg, desde aproximadamente 3 mg/kg hasta
aproximadamente 20 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta
aproximadamente 15 mg/kg, o desde aproximadamente 7 mg/kg hasta
aproximadamente 12 mg/kg. Por consiguiente, por ejemplo, la dosis de
cualquier anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión
al antígeno, por ejemplo el anticuerpo monoclonal
anti-CD40 CHIR-12.12 o
CHIR-5.9 o su fragmento de unión al antígeno, puede
ser de 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg,
0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg,
7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35
mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, u otra dosis semejante que
esté dentro el intervalo desde aproximadamente 0,003 mg/kg hasta
aproximadamente 50 mg/kg. La misma dosis terapéuticamente eficaz de
un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno puede administrarse a lo largo de cada semana de
dosificación del anticuerpo. Como alternativa, pueden usarse
diferentes dosis terapéuticamente eficaces de un anticuerpo anti
CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno durante el
transcurso de un período de tratamiento.
En otras realizaciones, la dosis
terapéuticamente eficaz inicial de un anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno según se define en
otra parte en el presente documento puede estar en el intervalo de
dosificación inferior (es decir, desde aproximadamente 0,003 mg/kg
hasta aproximadamente 20 mg/kg) con dosis posteriores dentro del
intervalo de dosificación superior (es decir, desde aproximadamente
20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg).
En realizaciones alternativas, la dosis
terapéuticamente eficaz inicial de un anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno según se define en
otra parte en el presente documento puede estar en el intervalo de
dosificación superior (es decir, desde aproximadamente 20 mg/kg
hasta aproximadamente 50 mg/kg) con dosis posteriores dentro del
intervalo de dosificación inferior (es decir, desde 0,003 mg/kg
hasta aproximadamente 20 mg/kg). Por consiguiente, en una forma de
realización, la dosis terapéuticamente eficaz inicial del anticuerpo
anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno es de
aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 35 mg/kg, incluyendo
aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente
30 mg/kg y aproximadamente 35 mg/kg, y las posteriores dosis
terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno son de aproximadamente 5 mg/kg hasta
aproximadamente 15 mg/kg, incluyendo aproximadamente 5 mg/kg, 8
mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg y aproximadamente 15 mg/kg.
En algunas realizaciones de la divulgación, la
terapia con anticuerpo anti CD40 antagonista se inicia administrando
una "dosis de carga" del anticuerpo o su fragmento de unión al
antígeno al sujeto que necesita terapia con anticuerpos anti CD40
antagonistas. Por "dosis de carga" se entiende una dosis
inicial del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno que se administra al sujeto, en la que la dosis
del anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno administrado
está dentro del intervalo de dosificación superior (es decir, desde
aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg). La
"dosis de carga" puede administrarse como una única
administración, por ejemplo, una infusión única en la que el
anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se administra por
vía IV, o como administraciones múltiples, por ejemplo, infusiones
múltiples en las que el anticuerpo o su fragmento de unión al
antígeno se administra por vía IV, siempre que la "dosis de
carga" completa se administre en un período de aproximadamente 24
horas. Tras la administración de la "dosis de carga", se
administra a continuación una o más dosis terapéuticamente eficaces
del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno al sujeto. Pueden administrarse dosis terapéuticamente
eficaces posteriores, por ejemplo, según un programa de
dosificación semanal, o una vez cada dos semanas, una vez cada tres
semanas, o una vez cada cuatro semanas. En tales formas de
realización, las dosis terapéuticamente eficaces posteriores
generalmente están en el intervalo de dosificación inferior (es
decir, desde 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg).
Como alternativa, en algunas formas de
realización, tras la "dosis de carga", las posteriores dosis
terapéuticamente eficaces del anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno se administran según un "programa
de mantenimiento", en el que la dosis terapéuticamente eficaz del
anticuerpo o su fragmento de unión al antígeno se administra una
vez al mes, una vez cada 6 semanas, una vez cada dos meses, una vez
cada 10 semanas, una vez cada tres meses, una vez cada 14 semanas,
una vez cada cuatro meses, una vez cada 18 semanas, una vez cada
cinco meses, una vez cada 22 semanas, una vez cada seis meses, una
vez cada 7 meses, una vez cada 8 meses, una vez cada 9 meses, una
vez cada 10 meses, una vez cada 11 meses, o una vez cada 12 meses.
En tales formas de realización, la dosis terapéuticamente eficaz del
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno está en el intervalo de dosificación inferior (es decir,
desde 0,003 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg), en particular
cuando las dosis posteriores se administran en intervalos más
frecuentes, por ejemplo, una vez cada dos semanas hasta una vez al
mes, o dentro del intervalo de dosificación superior (es decir,
desde aproximadamente 20 mg/kg hasta aproximadamente
50 mg/kg), en particular cuando las dosis posteriores se administran en intervalos menos frecuentes, por ejemplo, cuando las dosis posteriores se administran separadas por aproximadamente un mes hasta aproximadamente 12 meses.
50 mg/kg), en particular cuando las dosis posteriores se administran en intervalos menos frecuentes, por ejemplo, cuando las dosis posteriores se administran separadas por aproximadamente un mes hasta aproximadamente 12 meses.
Los anticuerpos anti CD40 antagonistas presentes
en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente
documento para usar en los procedimientos dados a conocer en el
presente documento pueden ser nativos o pueden obtenerse por medio
de técnicas recombinantes y pueden ser de cualquier fuente,
incluidas las fuentes de mamíferos tales como, por ejemplo, ratón,
rata, conejo, primate, cerdo y ser humano. De preferencia tales
polipéptidos se obtienen de una fuente humana, y de más preferencia
son proteínas humanas, recombinantes de líneas celulares de
hibridoma.
Las composiciones farmacéuticas útiles en los
procedimientos dados a conocer en el presente documento pueden
comprender variantes biológicamente activas de los anticuerpos anti
CD40 antagonistas de la invención. Tales variantes deben retener la
actividad biológica deseada del polipéptido nativo tal que la
composición farmacéutica que comprende el polipéptido variante
tenga el mismo efecto terapéutico que la composición farmacéutica
que comprende el polipéptido nativo cuando se administra a un
sujeto. Es decir, el anticuerpo anti CD40 variante servirá como
componente terapéuticamente activo en la composición farmacéutica de
manera similar a la observada para el anticuerpo antagonista
nativo, por ejemplo CHIR-5.9 o
CHIR-12.12 como se expresa por la línea celular de
hibridoma 5.9 ó 12.12, respectivamente. En la técnica están
disponibles procedimientos para determinar si un anticuerpo anti
CD40 variante retiene la actividad biológica deseada, y sirve por
consiguiente como un componente terapéuticamente activo en la
composición farmacéutica. La actividad biológica de las variantes
del anticuerpo puede medirse usando ensayos específicamente
diseñados para medir la actividad del anticuerpo antagonista nativo,
incluidos los ensayos descritos en la presente invención.
Cualquier composición farmacéutica que comprenda
un anticuerpo anti CD40 antagonista que tenga las propiedades de
unión descritas en el presente documento como el componente
terapéuticamente activo puede usarse en los procedimientos dados a
conocer en el presente documento. Por consiguiente, las
composiciones líquidas, liofilizadas o secadas por pulverización
que comprenden uno o más de los anticuerpos anti CD40 antagonistas
de la invención pueden prepararse como una disolución o suspensión
acuosa o no acuosa para la posterior administración a un sujeto de
acuerdo con los procedimientos dados a conocer en el presente
documento. Cada una de estas composiciones comprenderá al menos uno
de los anticuerpos anti CD40 antagonistas de la presente invención
como un componente terapéuticamente o profilácticamente activo. Por
"componente terapéuticamente o profilácticamente activo" se
entiende que el anticuerpo anti CD40 está específicamente
incorporado en la composición para provocar una respuesta
terapéutica o profiláctica con respecto al tratamiento, la
prevención o el diagnóstico de un tumor sólido en un sujeto cuando
se administra la composición farmacéutica a ese sujeto. De
preferencia la composición farmacéutica comprende agentes
estabilizantes, agentes de carga adecuados, o ambos para reducir al
mínimo los problemas asociados con la pérdida de estabilidad y
actividad biológica de las proteínas durante la preparación y el
almacenamiento.
Pueden añadirse compuestos de formulación a las
composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti CD40
antagonista de la invención. Estos compuestos de formulación pueden
incluir, pero no se limitan a, aceites, polímeros, vitaminas,
hidratos de carbono, aminoácidos, sales, tampones, albúmina,
tensioactivos o agentes de carga. Los hidratos de carbono de
preferencia incluyen azúcares o alcoholes de azúcar tales como
mono-, di- o polisacáridos, o glucanos solubles en agua. Los
sacáridos o glucanos pueden incluir fructosa, glucosa, manosa,
sorbosa, xilosa, maltosa, sucrosa, dextrano, pullulano, dextrina,
ciclodextrina \alpha y \beta, almidón soluble, hidroxietil
almidón y carboximetilcelulosa, o sus mezclas. Se define "alcohol
de azúcar" como un hidrocarburo C_{4} a C_{8} que tiene un
grupo hidroxilo e incluye galactitol, inositol, manitol, xilitol,
sorbitol, glicerol y arabitol. Estos azúcares o alcoholes de azúcar
pueden usarse de manera individual o en combinación. La
concentración del azúcar o de alcohol de azúcar está entre 1,0% y 7%
p/v., de más preferencia entre 2,0% y 6,0% p/v. Los aminoácidos de
preferencia incluyen formas levógiras (L) de carnitina, arginina, y
betaína; sin embargo, pueden añadirse otros aminoácidos. De
preferencia los polímeros incluyen polivinilpirrolidona (PVP) con
un peso molecular promedio entre 2.000 y 3.000, o polietilenglicol
(PEG) con un peso molecular promedio entre 3.000 y 5.000. Los
tensioactivos que pueden añadirse a la formulación se muestran en
los documentos EP Nº 270.799 y 268.110.
Además, los anticuerpos pueden modificarse
químicamente por conjugación covalente a un polímero para, por
ejemplo, aumentar su semivida de circulación. Los polímeros de
preferencia y los procedimientos para ligarlos a péptidos, se
muestran en las Patentes de EEUU Nº 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285;
y 4.609.546. Los polímeros de preferencia son polioles
polioxietilados y polietilenglicol (PEG). El PEG es soluble en agua
a temperatura ambiente y tiene la fórmula general:
R(O-CH_{2}-CH_{2})_{n}
O-R donde R puede ser hidrógeno, o un grupo
protector tal como un grupo alquilo o alcanol. De preferencia, el
grupo protector tiene entre 1 y 8 carbonos, de más preferencia es
metilo. El símbolo n es un número entero positivo, de preferencia
entre 1 y 1.000, de más preferencia entre 2 y 500. El PEG tiene de
preferencia un peso molecular promedio entre 1.000 y 40.000, de más
preferencia entre 2.000 y 20.000, de mayor preferencia entre 3.000 y
12.000. De preferencia, el PEG tiene al menos un grupo hidroxilo,
de más preferencia es un grupo hidroxi terminal. Este es el grupo
hidroxi que se activa de preferencia para reaccionar con un grupo
amino libre en el inhibidor. Sin embargo, se entenderá que el tipo
y la cantidad de los grupos reactivos pueden variarse para obtener
un PEG/anticuerpo de la presente invención conjugado de manera
covalente.
Los polioles polioxietilados solubles en agua
también son útiles en la presente invención. Estos incluyen
sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol
polioxietilado (POG), y otros. Resulta de preferencia el POG. Una
razón es porque la estructura central glicerol del glicerol
polioxietilado es la misma estructura central que se presenta en la
naturaleza en, por ejemplo, animales y seres humanos en los mono-,
di-, triglicéridos. Por consiguiente, esta ramificación no será
considerada necesariamente como un agente extraño en el cuerpo. El
POG tiene un peso molecular de preferencia en el mismo intervalo que
PEG. La estructura para el POG se muestra en Knauf y col. (1988) J.
Bio. Chem. 263:15064-15070, y puede encontrarse un
análisis de conjugados POG/IL-2 en la Patente de
EEUU Nº. 4.766.106.
Otro sistema de administración de fármacos para
aumentar la semivida circulatoria es el liposoma. Los procedimientos
para preparar los sistemas de administración de liposomas se
analizan en Gabizon y col. (1982) Cancer Research 42:4734; Cafiso
(1981) Biochem Biophys Acta 649:129; y Szoka (1980) Ann. Rev.
Bioplsys. Eng. 9:467. En la técnica se conocen otros sistemas de
administración de fármacos y están descritos, por ejemplo, en
Poznansky y col. (1980) Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed.,
Oxford, N.Y.) páginas 253-315; Poznansky (1984)
Pharm Revs 36:277.
Los compuestos de formulación a incorporar en
una composición farmacéutica deberían proporcionar estabilidad del
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno. Es decir, el anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno deberá retener su estabilidad física
y/o química y deberá tener la actividad biológica deseada, es
decir, una o más de las actividades definidas anteriormente en el
presente documento, incluidas, pero no limitadas a, inhibición de la
secreción de inmunoglobulinas por células B periféricas humanas
normales estimuladas por células T; inhibición de la supervivencia
y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales
estimuladas por células T de Jurkat; inhibición de la supervivencia
y/o proliferación de las células B periféricas humanas normales
estimuladas por células que expresan CD40L o ligando de CD40
soluble (sCD40L); inhibición de señales intracelulares
antiapoptóticas de "supervivencia" en cualquier célula
estimulada por sCD40L o CD40L de fase sólida; inhibición de la
transducción de señal de CD40 en cualquier célula tras la unión con
sCD40L o CD40L de fase sólida; e inhibición de la proliferación de
células B humanas malignas como se señaló en otra parte en el
presente documento.
Los procedimientos para controlar la estabilidad
de las proteínas son bien conocidos en la técnica. Véase, por
ejemplo, Jones (1993) Adv Drug Delivery Rev.
10:29-90; Lee, ed. (1991) Peptide y Protein Drug
Delivery (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York); y los
ensayos de estabilidad que se dan a conocer en el presente
documento a continuación. En general, la estabilidad de las
proteínas se mide a una temperatura elegida durante un período de
tiempo especificado. En realizaciones de preferencia, una
formulación farmacéutica de anticuerpo estable proporciona
estabilidad del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno cuando se almacena a temperatura ambiente
(aproximadamente 25ºC) durante al menos 1 mes, al menos 3 meses, o
al menos 6 meses, y/o es estable aproximadamente a
2-8ºC durante al menos 6 meses, al menos 9 meses, al
menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses.
\newpage
Una proteína tal como un anticuerpo, cuando se
formula en una composición farmacéutica, se considera que mantiene
su estabilidad física en un momento dado si no muestra signos
visuales (es decir, decoloración o pérdida de transparencia) o
signos que pueden medirse (por ejemplo, usando cromatografía de
exclusión por tamaño (SEC) o dispersión de luz UV) de
precipitación, agregación, y/o desnaturalización en esa composición
farmacéutica. Con respecto a la estabilidad química, una proteína
tal como un anticuerpo, cuando se formula en una composición
farmacéutica, se considera que mantiene su estabilidad química en un
momento dado si las medidas de estabilidad química son indicativas
de que la proteína (es decir, el anticuerpo) mantiene su actividad
biológica de interés en esa composición farmacéutica. Los
procedimientos para controlar los cambios en la estabilidad química
son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a,
procedimientos para detectar formas químicamente alteradas de la
proteína tales como el resultado la degradación, usando, por
ejemplo, SDS-PAGE, SEC, y/o espectrometría de masas
por tiempo de vuelo de desorción/ionización de láser asistida por
matriz; y degradación asociada con cambios en la carga molecular
(por ejemplo, asociada con desamidación), usando, por ejemplo,
cromatografía de intercambio iónico. Véase, por ejemplo, los
procedimientos que se dan a conocer en el presente documento a
continuación.
Se considera que un anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno, cuando se formula
en una composición farmacéutica, mantiene una actividad biológica
deseada en un momento dado si la actividad biológica deseada en ese
momento está aproximadamente dentro del 30%, de preferencia
aproximadamente dentro del 20% de la actividad biológica deseada
exhibida en el momento en que se preparó la composición farmacéutica
según se determina en un ensayo adecuado para la actividad
biológica deseada. Los ensayos para medir la actividad biológica
deseada de los anticuerpos anti CD40 antagonistas dados a conocer en
el presente documento, y sus fragmentos que se unen al antígeno,
pueden llevarse a cabo como se describe en los Ejemplos en el
presente documento. Véase también los ensayos descritos en Schultze
y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:8200-8204; Denton y col. (1998) Pediatr.
Transplant. 2:6-15; Evans y col. (2000) J. Immunol.
164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl.
49:17-22; Lederman y col. (1996) Curr. Opin.
Hematol. 3:77-86; Coligan y col. (1991) Current
Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom y col. (1993) Immunology
79:439-444; y las Patentes de EEUU Nº 5.674.492 y
5.847.082.
En algunas formas de realización de la
invención, el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el
anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno se
formula en una formulación farmacéutica líquida. El anticuerpo anti
CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno puede
prepararse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica,
incluidos los procedimientos dados a conocer anteriormente en el
presente documento. En una forma de realización, el anticuerpo anti
CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su
fragmento de unión al antígeno se produce de manera recombinante en
una línea celular CHO.
Tras su preparación y purificación, el
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno
puede formularse como una formulación farmacéutica líquida de la
manera expuesta en el presente documento. Cuando el anticuerpo anti
CD40 antagonista o su fragmento de unión al antígeno debe
almacenarse antes de su formulación, pueden congelarse, por
ejemplo, a \leq -20ºC, y a continuación descongelarse a
temperatura ambiente para otra formulación. La formulación
farmacéutica líquida comprende una cantidad terapéuticamente eficaz
del anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno. La cantidad de anticuerpo o su fragmento de unión al
antígeno presente en la formulación tiene en consideración la vía de
administración y el volumen de dosis deseado.
De esta manera, la composición farmacéutica
líquida comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo,
el anticuerpo CHIR-12.12 o CHIR-5.9,
o su fragmento de unión al antígeno en una concentración de
aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml,
aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 40,0 mg/ml,
aproximadamente 1,0 mg/ml hasta aproximadamente 30,0 mg/ml,
aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml,
aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 20,0 mg/ml, o
aproximadamente 15,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml. En
algunas formas de realización, la composición farmacéutica líquida
comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno en una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml
hasta aproximadamente 5,0 mg/ml, aproximadamente 5,0 mg/ml hasta
aproximadamente 10,0 mg/ml, aproximadamente 10,0 mg/ml hasta
aproximadamente 15,0 mg/ml, aproximadamente 15,0 mg/ml hasta
aproximadamente 20,0 mg/ml, aproximadamente 20,0 mg/ml hasta
aproximadamente 25,0 mg/ml, aproximadamente 25,0 mg/ml hasta
aproximadamente 30,0 mg/ml, aproximadamente 30,0 mg/ml hasta
aproximadamente 35,0 mg/ml, aproximadamente 35,0 mg/ml hasta
aproximadamente 40,0 mg/ml, aproximadamente 40,0 mg/ml hasta
aproximadamente 45,0 mg/ml, o aproximadamente 45,0 mg/ml hasta
aproximadamente 50,0 mg/ml. En otras formas de realización, la
composición farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno en una
concentración de aproximadamente 15,0 mg/ml, aproximadamente 16,0
mg/ml, aproximadamente 17,0 mg/ml, aproximadamente 18,0 mg/ml,
aproximadamente 19,0 mg/ml, aproximadamente 20,0 mg/ml,
aproximadamente 21,0 mg/ml, aproximadamente 22,0 mg/ml,
aproximadamente 23,0 mg/ml, aproximadamente 24,0 mg/ml, o
aproximadamente 25,0 mg/ml. La composición farmacéutica líquida
comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el
anticuerpo CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o
su fragmento de unión al antígeno y un tampón que mantiene el pH de
la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta
aproximadamente pH 7,0, incluyendo aproximadamente pH 5,0, 5,1,
5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4,
6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, y otros valores semejantes dentro del
intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0.
En algunas formas de realización, el tampón mantiene el pH de la
formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta
aproximadamente pH 6,5, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente
pH 6,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 5,5,
aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente 7,0, aproximadamente
pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5, o aproximadamente pH 5,5 hasta
aproximadamente pH 6,0.
En la formulación puede usarse cualquier tampón
adecuado que mantenga el pH de la formulación líquida del
anticuerpo anti CD40 en el intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta
aproximadamente pH 7,0, siempre que la estabilidad fisicoquímica y
la actividad biológica deseada del anticuerpo se mantengan como se
señaló anteriormente en el presente documento. Los tampones
incluyen pero no se limitan a, ácidos convencionales y sus sales,
donde el contraión puede ser, por ejemplo, sodio, potasio, amonio,
calcio o magnesio. Los ejemplos de ácidos convencionales y su sales
que pueden usarse para tamponar la formulación farmacéutica líquida
incluyen, pero no se limitan a, tampones de ácido succínico o
succinato, ácido cítrico o citrato, ácido acético o acetato, ácido
tartárico o tartrato, ácido fosfórico o fosfato, ácido glucónico o
gluconato, ácido glutámico o glutamato, ácido aspártico o
aspartato, ácido maleico o maleato y ácido málico o malato. La
concentración del tampón en la formulación puede ser desde
aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM, incluyendo
aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM,
30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores semejantes dentro
del intervalo de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM.
En algunas formas de realización, la concentración del tampón en la
formulación es desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15
mM, incluyendo aproximadamente 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM,
11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, u otros valores semejantes dentro
del intervalo de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15
mM.
En algunas realizaciones de la invención, la
formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR 12,12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno y
tampón succinato o tampón citrato a una concentración que mantiene
el pH de la formulación en el intervalo de aproximadamente pH 5,0
hasta aproximadamente pH 7,0, de preferencia aproximadamente pH 5,0
hasta aproximadamente pH 6,5. Por "tampón succinato" o
"tampón citrato" se entiende un tampón que comprende una sal
de ácido succínico o una sal de ácido cítrico, respectivamente. En
una realización de preferencia, el contraión de succinato o citrato
es el catión sodio, por consiguiente el tampón es succinato de
sodio o citrato de sodio, respectivamente. Sin embargo, se espera
que sea eficaz cualquier catión. Otros posibles cationes de
succinato o de citrato incluyen, pero no se limitan a, potasio,
amonio, calcio y magnesio. Como se señaló anteriormente, la
concentración del tampón succinato o citrato en la formulación puede
ser desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM,
incluyendo aproximadamente 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20
mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, u otros valores
semejantes dentro del intervalo desde aproximadamente 1 mM hasta
aproximadamente 50 mM. En algunas formas de realización, la
concentración de tampón en la formulación va desde aproximadamente
5 mM hasta aproximadamente 15 mM, incluyendo aproximadamente 5 mM,
6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, o
aproximadamente 15 mM. En otras realizaciones, la formulación
farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista,
por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno en una
concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente
50,0 mg/ml, o aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0
mg/ml, y tampón succinato o citrato, por ejemplo, tampón succinato
de sodio o citrato de sodio, a una concentración de aproximadamente
1 mM hasta aproximadamente 20 mM, aproximadamente 5 mM hasta
aproximadamente 15 mM, de preferencia aproximadamente 10 mM.
Cuando sea deseable que la formulación
farmacéutica líquida sea prácticamente isotónica, la formulación
farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el
anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un
tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo
de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0 puede
comprender además una cantidad de un agente de isotonicidad
suficiente para hacer que la formulación sea prácticamente
isotónica. Por "prácticamente isotónica" se entiende que la
formulación acuosa tiene una osmolaridad de aproximadamente 240
mmol/kg hasta aproximadamente 360 mmol/kg, de preferencia
aproximadamente 240 hasta aproximadamente 340 mmol/kg, de más
preferencia aproximadamente 250 hasta aproximadamente 330 mmol/kg,
aún de más preferencia aproximadamente 260 hasta aproximadamente
320 mmol/kg, de mayor preferencia aún aproximadamente 270 hasta
aproximadamente 310 mmol/kg. Los procedimientos para determinar la
isotonicidad de una disolución son conocidos por los expertos en la
técnica. Véase, por ejemplo, Setnikar y col. (1959) J. Am. Pharm.
Assoc. 48:628.
Los expertos en la técnica están familiarizados
con una diversidad de solutos farmacéuticamente aceptable útiles
para proporcionar isotonicidad en las composiciones farmacéuticas.
El agente de isotonicidad puede ser cualquier reactivo capaz de
ajustar la presión osmótica de la formulación farmacéutica líquida
de la presente invención hasta un valor prácticamente igual al de
un líquido corporal. Es deseable utilizar un agente de isotonicidad
fisiológicamente aceptable. Por consiguiente, la formulación
farmacéutica líquida que comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el
anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un
tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo
de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, puede
comprender además componentes que pueden usarse para proporcionar
isotonicidad, por ejemplo, cloruro de sodio; aminoácidos tales como
alanina, valina y glicina; azúcares y alcoholes de azúcares
(polioles), incluidos, pero no limitados a, glucosa, dextrosa,
fructosa, sacarosa, maltosa, manitol, trehalosa, glicerol, sorbitol,
y xilitol; ácido acético, otros ácidos orgánicos y sus sales, y
cantidades relativamente menores de citratos o fosfatos. El experto
en la técnica conocerá otros agentes que son adecuados para
proporcionar la tonicidad óptima de la formulación líquida.
En algunas realizaciones de preferencia, la
formulación farmacéutica líquida que comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti CD40 antagonista, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y un
tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo
de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0 comprende
además cloruro de sodio como el agente de isotonicidad. La
concentración de cloruro de sodio en la formulación dependerá de la
contribución de otros componentes a la tonicidad. En algunas
realizaciones, la concentración de cloruro de sodio es
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, aproximadamente
50 mM hasta aproximadamente 250 mM, aproximadamente 50 mM hasta
aproximadamente 200 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente
175 mM, aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 150 mM,
aproximadamente 75 mM hasta aproximadamente 175 mM, aproximadamente
75 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente 100 mM hasta
aproximadamente 175 mM, aproximadamente 100 mM hasta
aproximadamente 200 mM, aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente
150 mM, aproximadamente 125 mM hasta aproximadamente 175 mM,
aproximadamente 125 mM hasta aproximadamente 150 mM, aproximadamente
130 mM hasta aproximadamente 170 mM, aproximadamente 130 mM hasta
aproximadamente 160 mM, aproximadamente 135 mM hasta
aproximadamente 155 mM, aproximadamente 140 mM hasta aproximadamente
155 mM, o aproximadamente 145 mM hasta aproximadamente 155 mM. En
una de tales formas de realización, la concentración de cloruro de
sodio es aproximadamente 150 mM. En otra de tales realizaciones, la
concentración de cloruro de sodio es aproximadamente 150 mM, el
tampón es tampón succinato de sodio o citrato de sodio en una
concentración de aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 15 mM,
la formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, y la
formulación tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 hasta
aproximadamente pH 7,0, aproximadamente pH 5,0 hasta
aproximadamente pH 6,0, o aproximadamente pH 5,5 hasta
aproximadamente pH 6,5. En otras realizaciones, la formulación
farmacéutica líquida comprenden el anticuerpo anti CD40 antagonista,
por ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, en
una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml hasta
aproximadamente 50,0 mg/ml o aproximadamente 5,0 mg/ml hasta
aproximadamente 25,0 mg/ml, aproximadamente cloruro de sodio 150
mM, y aproximadamente succinato de sodio o citrato de sodio 10 mM, a
un pH de aproximadamente pH 5,5.
La degradación proteica por congelación
descongelación o cizallamiento mecánico durante el procesamiento de
una formulación farmacéutica líquida de la presente invención puede
inhibirse incorporando tensioactivos en la formulación para
disminuir la tensión superficial en la interfase
disolución-aire. Por consiguiente, en algunas
formas de realización, la formulación farmacéutica líquida comprende
una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40
antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o CHIR 5,9, o su fragmento de unión al
antígeno, un tampón para mantener el pH de la formulación dentro del
intervalo de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, y
comprende además un tensioactivo. En otras realizaciones, la
formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, un
tampón para mantener el pH de la formulación dentro del intervalo de
aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0, un agente de
isotonicidad tal como cloruro de sodio en una concentración de
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, y comprende
además un tensioactivo.
Los tensioactivos típicos utilizados son
tensioactivos noiónicos, incluidos los ésteres de
polioxietilensorbitol tales como polisorbato 80 (Tween 80) y
polisorbato 20 (Tween 20); ésteres de
polioxipropileno-polioxietileno tales como Pluronic
F68; alcoholes de polioxietileno tales como Brij 35; simeticona;
polietilenglicol tal como PEG400; lisofosfatidilcolina; y
polioxietilen-p-t-octilfenol
tal como Triton X-100. La estabilización clásica de
compuestos farmacéuticos por medio de tensioactivos o emulsivos se
describe, por ejemplo, en Levine y col. (1991) J. Parenteral Sci.
Technol. 45(3): 160-165. Un tensioactivo de
preferencia utilizada en la práctica de la presente invención es
polisorbato 80. Cuando se incluye un tensioactivo, éste se añade
típicamente en una cantidad desde aproximadamente 0,001% hasta
aproximadamente 1,0% (p/v), aproximadamente 0,001% hasta
aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente
0,4%, aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 0,3%,
aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente 0,2%, aproximadamente
0,005% hasta aproximadamente 0,5%, aproximadamente 0,005% hasta
aproximadamente 0,2%, aproximadamente 0,01% hasta aproximadamente
0,5%, aproximadamente 0,01% hasta aproximadamente 0,2%,
aproximadamente 0,03% hasta aproximadamente 0,5%, aproximadamente
0,03% hasta aproximadamente 0,3%, aproximadamente 0,05% hasta
aproximadamente 0,5%, o aproximadamente 0,05% hasta aproximadamente
0,2%.
Por consiguiente, en algunas realizaciones, la
formulación farmacéutica líquida comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti CD40 antagonista, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, el
tampón es tampón succinato de sodio o citrato de sodio en una
concentración de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM,
aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 25 mM, o aproximadamente
5 mM hasta aproximadamente 15 mM; la formulación tiene un pH de
aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 7,0,
aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0, o
aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5; y la
formulación comprende además un tensioactivo, por ejemplo,
polisorbato 80, en una cantidad desde aproximadamente 0,001% hasta
aproximadamente 1,0% o aproximadamente 0,001% hasta aproximadamente
0,5%. Tales formulaciones pueden comprender opcionalmente un agente
de isotonicidad, tal como cloruro de sodio en una concentración de
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 300 mM, aproximadamente
50 mM hasta aproximadamente 200 mM, o aproximadamente 50 mM hasta
aproximadamente 150 mM. En otras formas de realización, la
formulación farmacéutica líquida comprende el anticuerpo anti CD40
antagonista, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o su
fragmento de unión al antígeno, en una concentración de
aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 50,0 mg/ml o
aproximadamente 5,0 mg/ml hasta aproximadamente 25,0 mg/ml,
incluyendo aproximadamente 20,0 mg/ml; cloruro de sodio
aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, incluyendo
cloruro de sodio aproximadamente 150 mM; succinato de sodio o
citrato de sodio a una concentración de aproximadamente 5 mM hasta
aproximadamente 20 mM; incluyendo succinato de sodio o citrato de
sodio aproximadamente 10 mM; cloruro de sodio a una concentración
de aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 200 mM, incluyendo
aproximadamente 150 mM; y opcionalmente un tensioactivo, por
ejemplo, polisorbato 80, en una cantidad desde aproximadamente
0,001% hasta aproximadamente 1,0%, incluyendo aproximadamente 0,001%
hasta aproximadamente 0,5%; donde la formulación farmacéutica
líquida tiene un pH de aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente
pH 7,0, aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 6,0,
aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente pH 5,5, aproximadamente
pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5, o aproximadamente pH 5,5 hasta
aproximadamente pH 6,0.
La formulación farmacéutica líquida puede estar
esencialmente libre de conservantes y otros vehículos, excipientes,
o estabilizadores señalados anteriormente en el presente documento.
Como alternativa, la formulación puede incluir uno o más
conservantes, por ejemplo, agentes antibacterianos, vehículos,
excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables
descritos en el presente documento anteriormente con la condición de
que no afecten de manera adversa la estabilidad fisicoquímica del
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno. Los ejemplos de vehículos, excipientes o estabilizadores
aceptables incluyen, pero no se limitan a, otros agentes
tamponadores, codisolventes, tensioactivos, antioxidantes incluidos
ácido ascórbico y metionina, agentes quelantes tales como EDTA,
complejos de metales (por ejemplo, complejos
Zn-proteína), y polímeros biodegradables tales como
poliésteres. Puede encontrarse una discusión detallada de
formulación y selección de vehículos, excipientes e isomolitos
farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences
(18th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990).
Una vez que la formulación farmacéutica líquida
u otra composición farmacéutica descrita en el presente documento
está preparada, puede liofilizarse para evitar la degradación. Los
procedimientos para liofilizar composiciones líquidas son conocidos
por los expertos en la técnica. Justo antes de usar, la composición
puede reconstituirse con un diluyente estéril (disolución de
Ringer, agua destilada o disolución salina, por ejemplo) que puede
incluir otros componentes. Tras la reconstitución, la composición se
administra de preferencia a los sujetos usando los procedimientos
conocidos por los expertos en la técnica.
La presente invención también proporciona el uso
de un anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de
un sujeto con un tumor sólido que comprende células de carcinoma
que expresan antígeno CD40, en el que el medicamento está coordinado
con el tratamiento con al menos otra terapia contra el cáncer.
Ejemplos de estos tumores incluyen, pero no se limitan a estos,
cáncer de ovarios, pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células
no pequeñas del carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, y
tipos de carcinoma de células grandes, y cáncer de células pequeñas
del pulmón), mama, colon, riñón (incluyendo, por ejemplo, carcinomas
de células renales), vejiga, hígado (incluyendo, por ejemplo,
carcinomas hepatocelulares) gástrico, de cuello uterino, próstata,
nasofaringeal, tiroides (por ejemplo, carcinoma papilar de
tiroides), y cánceres de piel tales como melanoma, y sarcomas
(incluyendo, por ejemplo, osteosarcomas y sarcomas de Ewing).
Por "coordinado" se entiende que el
medicamento que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su
fragmento de unión al antígeno se usará antes, durante, o después
del tratamiento del sujeto con al menos otra terapia contra el
cáncer. Los ejemplos de otras terapias contra el cáncer incluyen,
pero no se limitan a, cirugía; terapia con radiación;
quimioterapia; cuando sea apropiado agentes quimioterapéuticos
incluyen, pero no se limitan a estos, fludarabina o fosfato de
fludarabina, clorambucilo, vincristina, pentostatina,
2-clorodesoxiadenosina (cladribina),
ciclofosfamida, doxorubicina, prednisona, y sus combinaciones, por
ejemplo, regímenes que contienen antraciclina tales como CAP
(ciclofosfamida, doxorubicina más prednisona), CHOP (ciclofosfamida,
vincristina, prednisona más doxorubicina), VAD (vincritsina,
doxorubicina, más dexametasona), MP (melfalán más prednisona), y
otros agentes citotóxicos y/o terapéuticos usados en quimioterapia
tales como mitoxantrona, daunorubicina, idarubicina, asparaginasa,
y antimetabolitos, incluidos, pero no limitados a, citarabina,
metotrexato, 5-fluorouracilo decarbazina,
6-tioguanina, 6-mercaptopurina y
nelarabina; terapia con citosina incluyendo, pero sin limitarse a
estas, terapia con interferona-alfa, terapia con
interferona-gamma, terapia con
interleuquina-2 (IL-2),
IL-12, IL-15 e
IL-21, factor de estimulación de colonia de
macrófago granulocito (GM-CSF), factor de
estimulación de colonia de granulocito (G-CSF) o
variantes biológicamente activas de estas citocinas; u otros
anticuerpos monoclonales dirigidos al uso en el tratamiento de
tumores sólidos de interés, por ejemplo, Herceptin® (Genentech,
Inc., San Francisco, California), que se dirige a la proteína
receptora Her2 en células de cáncer de mama Her2+; el anticuerpo
monoclonal humanizado Avastin^{TM} (también conocido como
bevacizumab; Genentech, Inc., San Francisco, California), que se
une e inhibe el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y
es de uso en el tratamiento de cáncer de colon; anticuerpo
anti-EGFR que se dirige al receptor del factor del
crecimiento epidérmico (por ejemplo, IMC-C225
(ImClone Systems, Nueva York, Nueva York); anticuerpo del receptor
anti-IGF-1, que se dirige a la
proteína del receptor IGF-1; anticuerpo
anti-MUCl, que se dirige al antígeno MUC1 asociado
al tumor; anti-\alpha5\beta1,
anti-\alphav\beta5, y
anti-\alphav\beta3, que se dirige a aquellas
integrinas respectivas, que regulan la adhesión celular y los
procesos de señalización implicados en la proliferación y
supervivencia celular; anticuerpo
anti-P-cadherina, que se dirige a
este miembro de la familia de la cadherina (véase, por ejemplo, la
solicitud de patente de EEUU Nº 20030194406); y anticuerpo
anti-VE-cadherina, que se dirige a
la función relacionada angiogénica de esta molécula de adhesión
específica de la célula del endotelio; donde el tratamiento con la
terapia contra el cáncer adicional, o terapias contra el cáncer
adicionales, tienen lugar antes, durante o a continuación del
tratamiento del sujeto con el medicamento que comprende el
anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno, como se indicó en este documento
anteriormente.
Por consiguiente, por ejemplo, en algunas
realizaciones, la invención proporciona el uso del anticuerpo
monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9, o
su fragmento de unión al antígeno, en la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de un sujeto con un tumor sólido
que comprende células de carcinoma que expresan antígeno CD40, en el
que el medicamento está coordinado con tratamiento por
quimioterapia, seleccionándose el agente quimioterapéutico del
grupo constituido por CPT-11 (irinotecano), que se
puede usar, por ejemplo, en el tratamiento de cáncer colorrectal y
cáncer de células no pequeñas del pulmón; gemcitabina, que se puede
usar, por ejemplo, en el tratamiento de cáncer de pulmón, cáncer de
mama, y cáncer epitelial de ovarios; y otros agentes
quimioterapéuticos adecuados para el tratamiento de tumores
sólidos; donde el tratamiento con la terapia contra el cáncer
adicional, o terapias contra el cáncer adicionales, tienen lugar
antes, durante o a continuación del tratamiento del sujeto con el
medicamento que comprende el anticuerpo anti-CD40
antagonista o su fragmento de unión al antígeno, como se indicó en
este documento anteriormente.
En otras realizaciones la invención proporciona
el uso del anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9, o su fragmento de unión al antígeno, en
la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto
con un tumor sólido que comprende células de carcinoma que expresan
antígeno CD40, en el que el medicamento está coordinado con
tratamiento con al menos otro anticuerpo anti-cáncer
seleccionado del grupo constituido por Herceptin® (Genentech, Inc.,
San Francisco, California), que se dirige a la proteína receptora
Her2 en células de cáncer de mama Her2+; el anticuerpo monoclonal
humanizado Avastin^{TM} (también conocido como bevacizumab;
Genentech, Inc., San Francisco, California), que se une e inhibe el
factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y es de uso en el
tratamiento de cáncer de colon; anticuerpo anti-EGFR
que se dirige al receptor del factor del crecimiento epidérmico
(por ejemplo, IMC-C225 (ImClone Systems, Nueva York,
Nueva York); anticuerpo del receptor
anti-IGF-1, que se dirige a la
proteína del receptor IGF-1; anticuerpo
anti-MUCl, que se dirige al antígeno MUC1 asociado
al tumor; anti-\alpha5\beta1,
anti-\alphav\beta5, y
anti-\alphav\beta3, que se dirige a aquellas
integrinas respectivas, que regulan la adhesión celular y los
procesos de señalización implicados en la proliferación y
supervivencia celular; anticuerpo
anti-P-cadherina, que se dirige a
este miembro de la familia de la cadherina (véase, por ejemplo, la
publicación de la solicitud de patente de EEUU 20030194406); y
anticuerpo anti-VE-cadherina, que se
dirige a la función relacionada angiogénica de esta molécula de
adhesión específica de la célula del endotelio; donde el tratamiento
con la terapia contra el cáncer adicional, o terapias contra el
cáncer adicionales, tienen lugar antes, durante o a continuación del
tratamiento del sujeto con el medicamento que comprende el
anticuerpo anti-CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno, como se indicó en este documento
anteriormente.
La invención también proporciona el uso de un
anticuerpo anti CD40 antagonista, por ejemplo, el anticuerpo
monoclonal CHIR-12.12 o CHIR-5.9
descrito en el presente documento, o su fragmento de unión al
antígeno en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de
un sujeto con un tumor sólido que comprende células que expresan el
antígeno CD40, en el que el medicamento se usa en un sujeto que ha
recibido tratamiento previo con al menos otra terapia contra el
cáncer. Por "pretratado" o "tratamiento previo" se
entiende que el sujeto ha recibido otra u otras terapias contra el
cáncer (es decir, ha sido tratado con al menos otra terapia contra
el cáncer) antes de recibir el medicamento que comprende el
anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de unión al
antígeno. "Pretratado" o "tratamiento previo" incluye
sujetos que han sido tratados con al menos otra terapia contra el
cáncer en el plazo de 2 años, en el plazo de 18 meses, en el plazo
de 1 año, en el plazo de 6 meses, en el plazo de 2 meses, en el
plazo de 6 semanas, en el plazo de 1 mes, en el plazo de 4 semanas,
en el plazo de 3 semanas, en el plazo de 2 semanas, en el plazo de 1
semana, en el plazo de 6 días, en el plazo de 5 días, en el plazo
de 4 días, en el plazo de 3 días, en el plazo de 2 días, o incluso
en el plazo de 1 día antes del inicio del tratamiento con el
medicamento que comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista, por
ejemplo, el anticuerpo monoclonal CHIR-12.12 o
CHIR-5.9 que se describe en el presente documento, o
su fragmento de unión al antígeno. No es necesario que el sujeto
haya sido un paciente que responde al tratamiento previo con la
anterior terapia contra el cáncer, o anteriores terapias contra el
cáncer. Por consiguiente, el sujeto que recibe el medicamento que
comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno podría haber respondido, o podría no haber
respondido (es decir el cáncer era refractario), al tratamiento
previo con la anterior terapia contra el cáncer, o a una o más
terapias anteriores contra el cáncer donde el tratamiento previo
comprendía múltiples terapias contra el cáncer. Los ejemplos de
otras terapias contra el cáncer para las que un sujeto puede haber
recibido tratamiento previo antes de recibir el medicamento que
comprende el anticuerpo anti CD40 antagonista o su fragmento de
unión al antígeno incluyen, pero no se limitan a, cirugía; terapia
con radiación; quimioterapia; cuando sea apropiado agentes
quimioterapéuticos incluyen, pero sin limitarse a estas, las
enumeradas anteriormente en este documento; otras terapias con
anticupero monoclonal anti-cáncer, incluyendo, pero
sin limitarse a estas, los anticuerpos anticáncer enumerados en este
documento anteriormente, terapia con citocina, incluyendo las
terapias con citocina enumeradas en este documento anteriormente; o
cualquiera de sus combinaciones.
"Tratamiento" en el contexto de uso
coordinado de un medicamento descrito en el presente documento con
otra u otras terapias contra el cáncer se define en el presente
documento como la aplicación o administración del medicamento o de
la otra terapia contra el cáncer a un sujeto, o la aplicación o
administración del medicamento u otra terapia contra el cáncer a un
tejido aislado o línea celular de un sujeto, en el que el sujeto
tiene un tumor sólido que comprende células de carcinoma que
expresan antígeno CD40, un síntoma asociado con tal cáncer, o una
predisposición a desarrollar tal cáncer, siendo la finalidad curar,
sanar, calmar, aliviar, alterar, remediar, mejorar o afectar el
cáncer, cualquier síntoma asociado del cáncer, o la predisposición a
desarrollar el cáncer.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de
ilustración y no como limitación.
Los anticuerpos anti CD40 antagonistas usados en
los ejemplos a continuación son CHIR-5.9 y
CHIR-12.12. Los anticuerpos anti CD40
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 son
anticuerpos monoclonales (mAb) anti CD40 humano del subtipo IgG1
humana generados por inmunización de ratones transgénicos que llevan
el locus de cadena pesada de IgG1 humana y el locus de cadena ligera
\kappa humana (tecnología XenoMouse®; Abgenix; Fremont,
California). Se usaron como inmunógeno células de insecto SF9 que
expresan el dominio extracelular CD40.
De forma resumida, se fusionaron esplenocitos de
ratones inmunizados con células de mieloma murino SP 2/0 o P 3 x
63Ag8.653 en una relación de 10:1 usando polietilenglicol al 50%
como está descrito previamente por de Boer y col. (1988) J.
Immunol. Meth. 113:143. Las células fusionadas se resuspendieron en
medio IMDM completo suplementado con hipoxantina (0,1 mM),
aminopterina (0,01 mM), timidina (0,016 mM), y hIL-6
0,5 ng/ml (Genzyme, Cambridge, Massachusetts). A continuación se
distribuyeron las células fusionadas entre los pocillos de placas de
cultivo tisular de 96 pocillos, de manera que cada una contenía 1
hibridoma en crecimiento en promedio.
Tras 10-14 días se analizaron
los sobrenadantes de las poblaciones de hibridomas para detectar la
producción de anticuerpos específicos. Para la detección de
anticuerpos específicos por los clones de hibridoma, se combinaron
los sobrenadantes de cada pocillo y se probaron para especificidad
de actividad anti-CD 40 por ELISA en primer lugar. A
continuación se usaron los positivos para tinción fluorescente de
células de las células B transformadas con VEB como se describió
para el ensayo FACS anteriormente. Las células de hibridomas
positivos se clonaron dos veces por dilución limitante en IMDM/FBS
que contenía hIL-6 0,5 ng/ml.
Se fusionó un total de 31 bazos de ratones con
las células SP2/0 de mieloma de ratón para generar 895 anticuerpos
que reconocen el CD40 recombinante en ELISA. En promedio
aproximadamente el 10% de los hibridomas producidos usando
tecnología Abgenix XenoMouse® pueden contener la cadena ligera
lambda de ratón en lugar de la cadena kappa humana. Se seleccionar
los anticuerpos que contenían cadena ligera lambda de ratón y se
descartaron. Se seleccionó una subserie de 260 anticuerpos que
también mostraban unión al CD40 de superficie celular para otro
análisis. Los hibridomas estables seleccionados durante una serie de
procedimientos de subclonación se usaron para más caracterización en
ensayos de unión y funcionales.
Se identificaron clones de otros 7 hibridomas
que tenían actividad antagonista. Basado en su potencia antagonista
relativa y actividades de ADCC, se seleccionaron dos clones de
hibridoma para posterior evaluación. Se denominan 131.2F8.5.9 (5.9)
y 153.8E2.D10, D6.12.12 (12.12).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La línea del hibridoma 131.2F5.8.5.9
(CMCC#12047) y la línea de hibridoma 153.8E2.D10.D6.12.12 de ratón
se han depositado en la American Type Culture Collection [ATCC;
10801 University Blvd., Manassas, Virginia
20110-2209 (EEUU)] con el Número de Depósito de
Patente Nº PTA-5542 y Nº PTA-5543,
respectivamente.
Los ADNc que codifican las regiones variables de
los anticuerpos candidato se amplificaron por PCR, se clonaron y se
secuenciaron. Las secuencias de aminoácido para la cadena ligera y
cadena pesada del anticuerpo CHIR-12.12 se presentan
en las Figuras 1A y 1B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº 2
(cadena ligera para mAb CHIR-12.12) y SEC ID Nº 4
(cadena pesada para mAb CHIR-12.12). En la Figura 1B
se muestra una variante de la cadena pesada para mAb
CHIR-12.12 (véase también SEC ID Nº 5), que difiere
de la SEC ID Nº 4 porque tiene un residuo alanina sustituido por un
residuo serina en la posición 153 de SEC ID Nº 4. Las secuencias de
nucleótidos que codifica la cadena ligera y cadena pesada del
anticuerpo CHIR-12.12 se presentan en las Figuras 2A
y 2B, respectivamente. Véase también SEC ID Nº 1 (secuencia
codificadora para cadena ligera para mAb CHIR-12.12)
y SEC ID Nº 3 (secuencia codificadora para cadena pesada para mAb
CHIR-12.12). Las secuencias de aminoácido para la
cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo
CHIR-5.9 se presentan en las Figuras 3A y 3B,
respectivamente. Véase también SEC ID Nº 6 (cadena ligera para mAb
CHIR-5.9) y SEC ID Nº 7 (cadena pesada para mAb
CHIR-5.9). En la Figura 3B se muestra una variante
de la cadena pesada para mAb CHIR-5.9 (véase también
SEC ID Nº 8), que difiere de la SEC ID Nº 7 porque tiene un residuo
alanina sustituido por un residuo serina en la posición 158
de
SEC ID Nº 7.
SEC ID Nº 7.
Como se espera para los anticuerpos derivados de
hibridomas independientes, hay una variación sustancial en las
secuencias de nucleótidos en las regiones determinantes de
complementariedad (CDR). Se cree que la diversidad en la región de
CDR3 de V_{H} determina de manera significativa la especificidad
del anticuerpo.
Como se muestra por medio del análisis FACS,
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 se unen
específicamente al CD40 humano y pueden prevenir la unión del
ligando de CD40. Ambos mAb pueden competir con la unión previa del
ligando de CD40 al CD40 de la superficie celular. La afinidad de
unión de CHIR-5.9 al CD40 humano es de 1,2 x
10^{-8} M y la afinidad de unión de CHIR-12.12 al
CD40 humano es de 5 x 10^{-10} M.
Los anticuerpos monoclonales
CHIR-12.12 y CHIR-5.9 son fuertes
antagonistas e inhiben la proliferación mediada por ligando de CD40
in vitro de células B normales, así mismo inhiben la
proliferación mediada por ligando de CD40 in vitro de células
de cáncer en pacientes NHL y CLL. In vitro, ambos anticuerpos
matan células de cáncer primarias de pacientes NHL por ADCC. Se
observó actividad anti-tumor dependiente de la dosis
en un modelo de linfoma de humano de xenoinjerto.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha encontrado una variedad de líneas
celulares cultivadas derivadas de tumor sólido y biopsias de
paciente para expresar CD40. Se encontró que un alto % de muestras
de biopsia de pacientes con cáncer de mama, pulmón, ovario, y piel
expresan CD40.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron muestras de tejido de carcinoma de
individuos (n=10) con cáncer de ovarios, pulmón, mama, o colon y se
congelaron para análisis subsiguiente de unión del anticuerpo usando
inmunohistoquímica. Se determinó el porcentaje de células
neoplásticas en los diversos carcinomas humanos capaces de unirse a
CHIR-12.12 mAb. Como se puede observar en la tabla
2, el 60% de las muestras de carcinoma de ovario y pulmón se
encontraban dentro de la categoría superior de unión en porcentaje
(es decir, de 50 a 100% de las células en estas muestras eran
capaces de unirse a CHIR-12.12 mAb). El treinta por
ciento de las muestras de carcinoma de mama y el 10% de las muestras
de carcinoma de colon se encontraban en la categoría superior de la
unión en porcentaje.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los anticuerpos candidatos pueden causar
citolisis de células diana (líneas de linfoma y líneas de células de
tumor sólido) mediante el mecanismo de ADCC. Tanto
CHIR-5.9 como CHIR-12.12 son
anticuerpos de isotipo IgG1 totalmente humanos y se esperan que
tengan la capacidad para inducir la citolisis de células diana
mediante el mecanismo de ADCC. Se probó su capacidad para causar
citolisis de líneas celulares cancerosas en ensayos in vitro.
Se seleccionaron inicialmente dos líneas celulares de linfoma
humanas (Ramos y Daudi) y una línea celular de cáncer de colon
humano (HCT116) como células diana para estos ensayos. Se usaron
PBMC o células NK enriquecidas de 8 donadoras voluntarios normales
como células efectoras en estos ensayos. Se observó mayor ADCC
frente a líneas celulares de linfoma que con la línea celular de
cáncer de colon. Se observó una respuesta de ADCC más potente con
CHIR-12.12 comparado con CHIR-5.9
frente a las células diana de ambas líneas celulares cancerosas de
linfoma. Las líneas celulares de linfoma también expresan CD20, el
antígeno diana para rituximab (Rituxan®, IDEC Pharmaceuticals Corp.,
San Diego, California), que hizo posible la comparación de la
actividad ADCC de estos dos mAb candidatos con la actividad de ADCC
de rituximab. Para la diana de línea celular de linfoma, se observó
una lisis específica promedio de 35%, 59% y 47% para
CHIR-5.9, CHIR-12.12, y rituximab,
respectivamente, cuando se usaron en una concentración de 1
\mug/ml. Para diana de línea celular de cáncer de colon se
observaron respectivamente una lisis específica media de 20% y 39%
para CHIR-5.9 y CHIR12.12. Véase la tabla 3
siguiente. Los dos anticuerpos no mostraron mucha actividad en los
ensayos de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
Se llevó a cabo ensayo adicional de la actividad
ADCC de estos dos anticuerpos anti-CD40 monoclonales
en la línea celular de cáncer de colon HCT116 y otras siete líneas
celulares de carcinoma, incluyendo las líneas celulares de cáncer de
ovarios SKOV3 y HEY, la línea celular de cáncer escamoso de piel
A431, las líneas celulares de cáncer de mama
MDA-MB231 y MDA-MB435, y las líneas
celulares de cáncer de pulmón NCI-H460 y
SK-MES-1 usando los procedimientos
descritos anteriormente. Como se observa en las figuras
5A-D y 6A-D, el anticuerpo
monoclonal CHIR-12.12 mostraba por lo general más
actividad ADCC que el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9
a cualquier concentración dada y para cualquier línea celular dada
ensayada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se espera que los mAb candidatos produzcan los
efectos farmacológicos deseados para reducir la carga tumoral por
cualquiera de dos mecanismos antitumorales, bloqueo de la señal de
proliferación/supervivencia e inducción de ADCC. Los modelos de
xenoinjerto de linfoma humano disponibles en la actualidad usan
líneas celulares de linfoma de largo plazo que, a diferencia de las
células cancerosas primarias, no son dependientes de la estimulación
de CD40 para su crecimiento y supervivencia. Por consiguiente, se
espera que el componente de esta actividad antitumoral de estos mAb
basado en el bloqueo de la señal de proliferación/supervivencia
tumoral no contribuya a la eficacia antitumoral en estos modelos. La
eficacia en estos modelos es dependiente de la ADCC, el segundo
mecanismo antitumoral asociado con los mAb CHIR-5.9
y CHIR-12.12.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron las actividades antitumorales de
los mAb candidatos con dos modelos de xenoinjerto de linfoma humano
en líneas celulares Namalwa y Daudi. Para demostrar más su actividad
terapéutica, se evaluaron estos mAb en un modelo de xenoinjerto no
estatificado (ie. profiláctico) y xenoinjerto estadificado (ie.
terapéutico) de linfoma humano basados en la línea celular
Daudi.
En resumen, se irradió el cuerpo entero de
ratones desnudos deficientes en células T a 3 Gy para suprimir
además el sistema inmune un día antes de la inoculación del tumor.
Las células tumorales se inocularon por vía subcutánea en el costado
derecho a razón de 5 x 10^{6} células por ratón. El tratamiento se
inició un día después de la implantación del tumor (modelos de
xenoinjerto de linfoma de células B humano subcutáneo no
estadificado, Namalwa y Daudi) o cuando el volumen del tumor alcanzó
200-400 mm^{3} (modelo de estadificado Daudi,
usualmente 15 días después de la inoculación del tumor). Se
inyectaron los ratones que llevaban el tumor con los mAb anti CD40
por vía intraperitoneal (i.p.) una vez a la semana en las dosis
indicadas. Las dosis para el modelo de Namalwa no estadificado
fueron como sigue: 0,01 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,1 mg/kg, 1 mg/kg y 10
mg/kg (mAb CHIR-12.12); 1 mg/kg (mAb
CHIR-5.9); y
10 mg/kg (rituximab). Las dosis para el modelo de Daudi no estadificado fueron como sigue: 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg y 1 mg/kg (mAb CHIR-12.12) y (mAb CHIR-5.9); y 10 mg/kg; 1 mg/kg (rituximab). Las dosis para el modelo de Daudi estadificado fueron como sigue: 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg, 1 mg/kg y 10 mg/kg (mAb CHIR-12.12); 1 mg/kg (mAb CHIR-5.9); y 1 mg/kg (rituximab). Se registraron los volúmenes tumorales dos veces por semana. Cuando el volumen del tumor en cualquier grupo alcanzó 2500 mm^{3}, el estudio se dio por terminado. Nótese que en el modelo estadificado de Daudi, los datos de volumen tumoral se analizaron hasta el día 36 por la muerte de algunos ratones después de ese día. La regresión completa (CR) se contó hasta el final del estudio. Los datos se analizaron usando ANOVA o prueba de Kruskal-Wallis y la correspondiente prueba posterior para la comparación de grupos múltiples.
10 mg/kg (rituximab). Las dosis para el modelo de Daudi no estadificado fueron como sigue: 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg y 1 mg/kg (mAb CHIR-12.12) y (mAb CHIR-5.9); y 10 mg/kg; 1 mg/kg (rituximab). Las dosis para el modelo de Daudi estadificado fueron como sigue: 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg, 1 mg/kg y 10 mg/kg (mAb CHIR-12.12); 1 mg/kg (mAb CHIR-5.9); y 1 mg/kg (rituximab). Se registraron los volúmenes tumorales dos veces por semana. Cuando el volumen del tumor en cualquier grupo alcanzó 2500 mm^{3}, el estudio se dio por terminado. Nótese que en el modelo estadificado de Daudi, los datos de volumen tumoral se analizaron hasta el día 36 por la muerte de algunos ratones después de ese día. La regresión completa (CR) se contó hasta el final del estudio. Los datos se analizaron usando ANOVA o prueba de Kruskal-Wallis y la correspondiente prueba posterior para la comparación de grupos múltiples.
En el modelo no estadificado de Namalwa, el mAb
anti CD40 CHIR-12.12, pero no Rituxan® (rituximab),
aumentó significativamente (p= <0,01) el crecimiento de los
tumores de Namalwa (reducción del volumen tumoral del 60% frente al
25% para rituximab, n = 10 ratones/grupo) (datos no mostrados). Por
consiguiente, en este modelo, el mAb anti CD40
CHIR-12.12 fue más potente que rituximab. Cabe
destacar que el segundo mAb candidato, CHIR-5.9, fue
al menos tan eficaz como rituximab en una dosis de 1/10 de la de
rituximab. Ambos mAb anti CD40, CHIR-12.12 y rituxan
previnieron significativamente el desarrollo tumoral en el modelo de
tumor no estadificado de Daudi (14/15 resistencia al desafío
tumoral) (datos no mostrados).
Cuando estos anticuerpos monoclonales anti CD40
se compararon además en un modelo de xenoinjerto estadificado de
Daudi, en el que el tratamiento comentó cuando el tumor subcutáneo
era palpable, el mAb anti CD40 CHIR12.12 en una dosis de 1 mg/kg
causó reducción significativa del tumor (p=0,003) con regresión
completa del 60% (6/10), mientras que rituximab en la misma dosis no
inhibió significativamente el crecimiento tumoral ni causó regresión
completa (0/10) (datos no mostrados).
En resumen, el mAb anti CD40
CHIR-12.12 inhibió significativamente el crecimiento
tumoral en modelos experimentales de linfoma. En la misma dosis y el
mismo régimen, el mAb CHIR-12.12 mostró mejor
actividad anticancerosa que Rituxan® (rituximab). Además, no se
observaron signos de toxicidad en esta dosis y en este régimen.
Estos datos sugieren que el mAb anti CD40 CHIR-12.12
tiene potente actividad anti linfoma humano in vitro y en
modelos de xenoinjerto y podría ser clínicamente eficaz para el
tratamiento del linfoma.
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Se evaluaron adicionalmente estos mAb candidatos
en relación a su actividad antitumoral terapéutica en un modelo de
tumor sólido. De forma similar a muchos tumores sólidos humanos, la
línea celular del carcinoma de colon humano HCT116 expresa CD40 y se
seleccionó para un modelo de xenoinjerto de cáncer de colon. Se
inocularon células tumorales por vía subcutánea en el costado
derecho de ratones desnudos deficientes en células T (este tumor
puede crecer en tatones desnudos sin irradiación previa ) a razón de
5 x 10^{6} células por ratón. Un día tras la inoculación del tumor
los ratones recibieron inyección por vía intraperitoneal (i.p.) de
anti-CD40 mAbs una vez a la semana con un total de 5
dosis.
El tratamiento con anti-CD40
mAbs mostró una tendencia reproducible hacia la inhibición del
crecimiento tumoral en dos estudios repetidos. Los datos de uno de
estos dos estudios se muestran en la figura 7. De forma interesante,
se observó una inversión de la actividad antitumoral con la dosis
mayor (10 mg/kg) en este modelo, lo que sugiere que puede ser
necesaria una dosis/régimen óptima para conseguir la mejor
inhibición del crecimiento tumoral. El anticuerpo
CHIR-12.12 monoclonal, que mostró mayor actividad de
ADCC in vitro y mayor eficacia anti-tumor en
un modelo de linfoma, se ensayó sólo con una dosis única de 1 mg/kg
en el modelo de carcinoma de colon. Se llevó a cabo una valoración
de dosis de CHIR-12.12 para determinar el potencial
total de su eficacia anti-tumor en este modelo de
xenoinjerto de cáncer de colon humano.
\vskip1.000000\baselineskip
El CHIR-12.12 mAb se evaluó
también en relación a su actividad antitumoral terapéutica en un
modelo murino ortotópico no estadificado (profiláctico) de cáncer de
ovarios usando la línea celular de cáncer de ovarios SKOV3i/p.1. Se
inocularon células tumorales por vía intraperitoneal (i.p.) en
ratones desnudos deficientes en células T a 2 X 10^{6} células por
ratón. Comenzando el primer día después de la inoculación del tumor
los ratones recibieron inyecciones i.p. de diversas dosis de
CHIR-12.12 mAbs o Herceptint® (Genentech, Inc., San
Francisco, California), que se encuentra bajo investigación clínica
para el tratamiento de cáncer de ovarios. Se dosificó el anticuerpo
una vez a la semana con un total de 6 dosis. Se calculó el
porcentaje de supervivencia en el tiempo.
El tratamiento con el CHIR-12.12
mAb prolongó el tiempo de supervivencia de forma dependiente de la
dosis (figura 8). Cincuenta y cuatro días después de la inoculación
del tumor, el porcentaje de supervivencia era significativamente
mayor para el grupo que recibe 30 mg/kg del
CHIR-12.12 mAb que para el grupo de control no
tratado. A pesar de que una dosis similar de Herceptin® mostraba una
tendencia hacia la prolongación de la supervivencia, el porcentaje
de supervivencia a los 54 días tras la inoculación no era
significativamente mayor que la observada para el grupo de control
no tratado.
La figura 9 muestra una comparación de los
efectos del CHIR-12.12 mAb en el porcentaje de
supervivencia en este modelo murino ortotópico no estadificado de
cáncer de ovarios cuando se administra el anticuerpo
intraperitonealmente (i. p.) frente a vía intravenosa (i.v.). El
protocolo de tratamiento era como se describió anteriormente. Como
se puede apreciar en esta figura, la inyección por vía i.p. de
CHIR-12.12 mAb dio porcentaje de supervivencia mejor
respecto al observado con la administración por vía i.v. de este
anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluaron adicionalmente los
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 mAbs en
relación a su actividad anti-tumoral terapéutica en
un modelo murino estadificado (terapéutico) de cáncer de ovarios
usando la línea celular de cáncer de ovarios SKOV3i.p.1. Para este
estudio se inocularon células tumorales por vía subcutánea en el
costado derecho de ratones desnudos deficientes en células T a razón
de 5 x 10^{6} células por ratón con matrigel al 10%. Comenzando 6
días después de la inoculación del tumor (cuando el volumen de tumor
alcanzó 100-200 mm^{3}), los ratones recibieron
inyecciones de estos mAbs por vía intraperitoneal una vez a la
semana con un total de 4 dosis. Se midió el volumen del tumor dos
veces a la semana tras el primer día de dosificación del
anticuerpo.
Los dos mAbs candidatos inhibieron
significativamente el crecimiento del tumor respecto al observado
para el grupo de control no tratado (figura 10) a las mayores
concentraciones de anticuerpo ensayadas (1 mg/kg para el
CHIR-5.9 mAb, y 10 mg/kg para el
CHIR-12.12 mAb). Para el CHIR-12.12
mAb (el único anticuerpo para el que se variaba la dosis), la
inhibición del crecimiento del tumor tuvo lugar de forma dependiente
de la dosis, con la mayor reducción de tumor sucediendo a la dosis
mayor (es decir, 10 mg/kg). Con la dosis mayor el
CHIR-12.12 mAb fue justamente tan eficaz como una
dosis equivalente de Herceptin®.
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Los anticuerpos monoclonales candidatos
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 compiten uno
con el otro por la unión al CD40 pero no con 15B8, un mAb IgG2 anti
CD40 (véase la Publicación Internacional Nº WO 02/28904). Se
diseñaron estudios de unión competitiva de anticuerpos usando
Biacore con chips biosensores CM5 con proteína A inmovilizada por
medio de acoplamiento de aminas, que se usó para capturar anti CD40,
CHIR-12.12, o 15B8. Se observaron las curvas de
unión de asociación/disociación normales con concentraciones
variables de CD40-his (datos no mostrados). Para los
estudios de competición, se capturaron CHIR-12.12 o
15B8 en la superficie de la proteína A. Posteriormente se hizo fluir
un complejo CD40-his/Fab de CHIR-5.9
(CD40 100 nM: Fab de CHIR-5.9 1 \muM), en
concentraciones variables, a través de la superficie modificada. En
el caso de CHIR-12.12, no se observó asociación del
complejo, que indica que CHIR-5.9 bloquea la unión
de CHIR-12.12 a CD40-his. Para 15B8,
se observó asociación del complejo Fab CHIR-5.9 que
indica que CHIR-5.9 no bloquea la unión de 15B8 al
sitio de unión de CD40. Sin embargo, la tasa de disociación del
complejo aumentó drásticamente (datos no mostrados).
También se determinó que 15B8 y
CHIR-12.12 no compiten por la unión de
CD40-his. Este experimento se llevó a cabo
capturando CHIR-12.12 en el chip biosensor de
proteína A, bloqueando los sitios residuales de proteína A con hIgG1
control, uniendo CD40-his y a continuación haciendo
fluir 15B8 sobre la superficie modificada. 15B8 se unió bajo estas
condiciones indicando que CHIR-12.12 no bloquea la
unión de 15B8 al CD40.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmovilizó proteína A en chips biosensores
CM5 a través de acoplamiento de aminas. Se capturaron anticuerpos
monoclonales anti-CD40 humanos, en una concentración
de 1,5 \mug/ml, sobre la superficie modificada del biosensor
durante 1,5 minutos a 10 \mul/min. Se hizo fluir
CD40-his recombinante soluble sobre la superficie
del biosensor en concentraciones variables. El anticuerpo y el
antígeno se diluyeron en HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3
mM, Tensioactivo P al 20 0,005% (HBS-EP). Se
determinaron las constantes cinéticas y de afinidad usando el
programa informático Biaevaluation con un ajuste de interacción
modelo/global de 1:1.
Como se muestra en la Tabla 4 a continuación,
hay una diferencia de 121 veces en la tasa de disociación de
CHIR-5.9 y CHIR-12.12 que da como
resultado una afinidad 24 veces mayor para
CHIR-12.12.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la localización del epítopo en
CD40 reconocido por los anticuerpos monoclonales
CHIR-12.12 y CHIR-5.9, se realizaron
análisis SDS-PAGE y transferencia Western. Se separó
CD40 purificado (0,5 \mug) en un gel NUPAGE al
4-12% bajo condiciones reductoras y no reductoras,
se transfirió a membranas PVDF, y se realizó el sondeo con
anticuerpos monoclonales en una concentración de 10 \mug/ml. Las
transferencias se sondearon con IgG anti humano conjugada con
fosfatasa alcalina y se desarrolló usando el sustrato estabilizado
Azul Western® para fosfatasa alcalina (Promega).
Los resultados indican que el anticuerpo
monoclonal anti CD40 CHIR12.12 reconoce epítopos tanto en la forma
no reducida como en la forma reducida de CD40, exhibiendo la forma
no reducida de CD40 mayor intensidad que la forma reducida de CD40
(Tabla 15; transferencias no mostradas). El hecho de que el
reconocimiento fuera positivo para ambas formas de CD40 indica que
este anticuerpo interactúa con un epítopo conformacional, parte del
cual es una secuencia lineal. El anticuerpo monoclonal
CHIR-5.9 reconoce principalmente la forma no
reducida de CD40 sugiriendo que este anticuerpo interactúa
principalmente con un epítopo conformacional (Tabla 5;
transferencias no mostradas).
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Para realizar un mapa de la región antigénica en
CD40, se clonaron los cuatro dominios extracelulares de CD40 y se
expresaron en células de insecto como proteínas de fusión GST. La
secreción de los cuatro dominios se aseguró con una señal de
secreción GP67. El sobrenadante de las células de insecto se analizó
por análisis SDS-PAGE y transferencia Western para
identificar el dominio que contenía el epítopo.
El anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 reconoce un epítopo en el Dominio 2 tanto
bajo condiciones reductoras como no reductoras (Tabla 6;
transferencias no mostradas). Por el contrario, el anticuerpo
monoclonal CHIR-5.9 exhibe reconocimiento muy débil
para el Dominio 2 (Tabla 6; transferencias no mostradas). Ninguno de
estos anticuerpos reconoce los Dominios 1, 3 ó 4 en este
análisis.
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\vskip1.000000\baselineskip
Para definir con más precisión el epítopo
reconocido por el mAb CHIR-12.12, se sintetizaron
péptidos del Dominio 2 extracelular de CD40, que corresponde a la
secuencia PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGT
SETDTICT (residuos 61-104 de la secuencia mostrada en SEC ID Nº 10 o SEC ID Nº 12). Se generaron membranas de síntesis SPOTs (Sigma) conteniendo treinta y cinco péptidos 10-meros con un desplazamiento de 1 aminoácido. Se realizó el análisis de transferencia Western con mAb CHIR-12.12 y anti IgG humana marcado con beta galactosidasa como anticuerpo secundario. Se desmontó la transferencia y se volvió a sondear con mAb CHIR-5.9 para determinar la región reconocida por este anticuerpo.
SETDTICT (residuos 61-104 de la secuencia mostrada en SEC ID Nº 10 o SEC ID Nº 12). Se generaron membranas de síntesis SPOTs (Sigma) conteniendo treinta y cinco péptidos 10-meros con un desplazamiento de 1 aminoácido. Se realizó el análisis de transferencia Western con mAb CHIR-12.12 y anti IgG humana marcado con beta galactosidasa como anticuerpo secundario. Se desmontó la transferencia y se volvió a sondear con mAb CHIR-5.9 para determinar la región reconocida por este anticuerpo.
Los análisis SPOTs sondando con anticuerpo
monoclonal anti CD40 CHIR-12.12 en una concentración
de
10 \mug/ml dieron reacciones positivas con las transferencias 18 a 22. La región de la secuencia cubierta por estos péptidos se muestra en la Tabla 7.
10 \mug/ml dieron reacciones positivas con las transferencias 18 a 22. La región de la secuencia cubierta por estos péptidos se muestra en la Tabla 7.
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Estos resultados corresponden a un epítopo
lineal de: YCDPNL (residuos 82-87 de la secuencia
mostrada en SEC ID Nº:10 o SEC ID Nº 12). Este epítopo contiene Y82,
D84 y N86, que se ha predicho que están implicados en la interacción
CD40-ligando de CD40.
Los análisis SPOTs con mAb
CHIR-5.9 mostraron un débil reconocimiento de los
péptidos representados por las transferencias 20-22
mostradas en la Tabla 8, sugiriendo implicación de la región
YCDPNLGL (residuos 82-89 de la secuencia mostrada en
SEC ID Nº 10 o SEC ID Nº 12) en su unión a CD40. Debe señalarse que
los mAb CHIR-12.12 y CHR-5.9
compiten uno con el otro por la unión a CD40 en el análisis
BIACORE.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los epítopos lineales identificados por los
análisis SPOTs están dentro del módulo B1 de CD40. La secuencia del
módulo B1 de CD40 es:
HKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTIC (residuos
80-103 de SEC ID Nº 10 o 12).
Dentro del epítopo lineal identificado para
CHIR-12.12 está C83. Se sabe que este residuo de
cisteína forma un enlace disulfuro con C103. Es probable que el
epítopo conformacional del mAb CHIR-12.12 contenga
este enlace disulfuro (C83-C103) y/o aminoácidos
vecinos conformacionalmente próximos a C103.
\vskip1.000000\baselineskip
El ligando de CD40 soluble (CD40L) activa las
células B e induce diversos aspectos de respuestas funcionales,
incluidos el aumento de la supervivencia y la proliferación, y la
activación de las vías de señales de NF\kappaB, ERK/MAPK, PI3K/Akt
y p38. Además, la estimulación de CD40 mediada por CD40L proporciona
señales de supervivencia por reducción de PARP escindido e inducción
de proteínas antiapoptóticas, XIAP y Mcl-1, en
células B normales. La estimulación de CD40 mediada por CD40L
también recluta TRAF2 y TRAF3 para la unión al dominio
citoplasmático de CD40.
Los siguientes estudios demuestran que
CHIR-12.12 inhibió directamente todos estos efectos
de la estimulación en las células B humanas normales. Por ejemplo,
el tratamiento con CHIR-12.12 dio como resultado el
aumento de escisión de caspasa-9,
caspasa-3 y PARP así como la reducción de XIAP y
Mcl-1 de una manera dependiente del tiempo y de la
dosis, restaurando la apoptosis de las células B. El tratamiento con
CHIR-12.12 también inhibió la fosforilación de
I\kappaB cinasa (IKK) \alpha y \beta (vía de NF\kappaB),
ERK, Akt y p38 en respuesta a la estimulación de CD40 mediada por
CD40L. Además, se encontró que CHIR-12.12 no provocó
estos efectos apoptóticos sin la estimulación inicial de CD40
mediada por CD40L.
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se estimularon 0,6 x
10^{6} células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje
de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp.,
Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió
CHIR-12.12 (10 \mug/ml) e IgG de control. Las
células se recogieron a los 0 y 20 minutos, a las 2 horas, 6 horas,
18 horas y 26 horas. Se detectaron controles de caspasa 9 escindida,
caspasa 3 escindida, PARP escindida y \beta actina en los lisados
celulares por transferencia Western.
En resumen, se observó que la estimulación de
CD40 mediada por CD40L proporcionó señales de supervivencia ya que
no dio lugar a aumentos de caspasa 9 escindida, caspasa 3 escindida
o PARP escindida con el tiempo, indicando que las células no estaban
sufriendo apoptosis. Sin embargo, el tratamiento con
CHIR-12.12 dio como resultado un aumento de estos
productos de escisión, indicando que el tratamiento con
CHIR-12.12 anuló los efectos de la unión de CD40L en
las señales de supervivencia en las células B normales estimuladas
con cCD40L, restaurando la apoptosis de las células B (datos no
mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se estimularon 0,6 x
10^{6} células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje
de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp.,
Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió
CHIR-12.12 (10 \mug/ml) e IgG de control. Las
células se recogieron a los 0 y 20 minutos, a las 2 horas, 6 horas,
18 horas y 26 horas. Se detectaron controles de
Mcl-1, XIAP, CD40 y \beta actina en los lisados
celulares por transferencia Western. En resumen, la estimulación con
sCD40L dio como resultado la expresión sostenida de
Mcl-1 y XIAP con el tiempo. Sin embargo, el
tratamiento de las células estimuladas con sCD40L con
CHIR-12.12 dio como resultado una disminución en la
expresión de estas proteínas con el tiempo (datos no mostrados).
Como Mcl-1 y XIAP son señales de
"supervivencia" capaces de bloquear la vía apoptótica, estos
resultados demuestran que el tratamiento con
CHIR-12.12 elimina el bloqueo contra la apoptosis en
las células B normales estimuladas con sCD40L.
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se estimularon 1,0 x
10^{6} células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje
de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp.,
Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió
CHIR-12.12 (10 \mug/ml) e IgG de control. Las
células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se detectaron los
controles de IKK \alpha (Ser180) e IKK \beta (Ser 181) y de IKK
\beta total en los lisados celulares por transferencia
Western.
Western.
En resumen, la estimulación por medio de sCD40L
dio como resultado la fosforilación de IKK \alpha (Ser180) e IKK
\beta (Ser 181) con el tiempo; sin embargo, el tratamiento con
CHIR-12.12 anuló esta respuesta a la estimulación de
sCD40L en las células B normales (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se estimularon 0,6 x
10^{6} células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje
de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp.,
Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió
CHIR-12.12 (0,01, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 \mug/ml) e
IgG de control. Las células se recogieron a las 24 horas. Se
detectaron los controles de PARP escindida y \beta actina en los
lisados celulares por transferencia Western.
Brevemente, el tratamiento con
CHIR-12.12 dio como resultado el aumento de escisión
de PARP en células estimuladas con sCD40L de una manera dependiente
de la dosis y, por consiguiente, anuló la vía de señales de
supervivencia en las células B normales estimuladas con sCD40L
(datos no mostrados).
\newpage
En estos experimentos, se estimularon 0,6 x
10^{6} células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje
de pureza entre 85 y 95%) con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp.,
Bingham, Nottinghamshire, RU). A continuación se añadió
CHIR-12.12 (0,5, 2 y 10 \mug/ml) e IgG de control.
Las células se recogieron a las 22 horas. Se detectaron los
controles de Mcl-1, XIAP, PARP escindida y \beta
actina en los lisados celulares por transferencia Western.
Brevemente, el tratamiento con
CHIR-12.12 redujo la expresión de
Mcl-1 y XIAP y aumentó la expresión de PARP en
células estimuladas con sCD40L de una manera dependiente de la dosis
y, por consiguiente, anuló estos bloqueos a la vía apoptótica en las
células B normales estimuladas con sCD40L (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se estimularon 1,0 x
10^{6} células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje
de pureza entre 85 y 95%) con CHIR-12.12 (10
\mug/ml) e IgG de control sola (es decir, las células no se
estimularon previamente con sCD40L antes de añadir el anticuerpo).
Las células se recogieron a las 0, 4, 14 y 16 horas. Se detectaron
los controles de XIAP, PARP escindida y \beta actina en los
lisados celulares por transferencia
Western.
Western.
Brevemente, los resultados muestran que sin
estimulación de sCD40L, las células expresaron concentraciones
aumentadas de PARP escindida, mientras que la expresión de XIAP
permaneció constante, tanto en las células tratadas con IgG de
control como en las tratadas con CHIR-12.12 (datos
no mostrados). Estos datos indican que CHIR-12.12 no
provoca apoptosis en las células B humanas normales sin estimulación
de CD40L.
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se privaron de suero en
medio que contenía FBS al 1% 1,0 x 10^{6} células B humanas
normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95%) y
se estimularon con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp., Bingham,
Nottinghamshire, RU). Los cultivos se trataron con
CHIR-12.12 (1 y 10 \mug/ml) e IgG de control. Las
células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se detectaron
fosfo-IKK\alpha, fosfo-IKK\beta,
IKK\beta total, fosfoERK, ERK total, fosfo-Akt,
Akt total, fosfo-p38 y p38 total en los lisados
celulares por transferencia Western.
En resumen, la estimulación con sCD40L dio como
resultado aumentos en la fosforilación de IKK\alpha/\beta,
fosforilación de ERK, fosforilación de Akt y fosforilación de p38,
por consiguiente dando lugar a la supervivencia y/o proliferación de
las células. El tratamiento de las células con
CHIR-12.12 anuló los efectos de la estimulación de
sCD40L en estas vías de señales en las células B normales (datos no
mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se privaron de suero en
medio que contenía FBS al 1% 1,0 x 10^{6} células B humanas
normales de donadores sanos (porcentaje de pureza entre 85 y 95%) y
se estimularon con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis Corp., Bingham,
Nottinghamshire, RU). Los cultivos se trataron también con
CHIR-12.12 (1 y 10 \mug/ml), Wortmanin (un
inhibidor de PI3K/Akt, 1 y 10 \muM), LY 294002 (un inhibidor de
PI3K/Akt; 10 y 30 \muM) y PD 98095 (un inhibidor de MEK, 10 y 30
\mug/ml). Las células se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se
detectaron fosfoERK, fosfo-Akt, Akt total,
fosfo-IKK\alpha/\beta y total en los lisados
celulares por transferencia Western.
En resumen, los resultados muestran que
CHIR-12.12 anuló la fosforilación de todas estas
moléculas de transducción de señales, mientras que los inhibidores
de transducción de señales mostraron sólo anulación específica de
las señales, indicando que CHIR-12.12 probablemente
inhibe en una etapa anterior a estas moléculas de transducción de
señales mediadas por la estimulación por CD40L (datos no
mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
En estos experimentos, se privaron de suero
durante cuatro horas en medio que contenía FBS al 1% 4,0 x 10^{6}
células B humanas normales de donadores sanos (porcentaje de pureza
entre 85 y 95%) y se estimularon con sCD40L 1 \mug/ml (Alexis
Corp., Bingham, Nottinghamshire, RU) durante 20 minutos. Las células
se recogieron a los 0 y 20 minutos. Se inmunoprecipitó CD40 usando
anti CD40 policlonal (Santa Cruz Biotechnology, CA), y se sondeó en
una transferencia Western con mAb anti TRAF2 (Santa Cruz
Biotechnology, CA), mAb anti TRAF3 (Santa Cruz Biotechnology, CA), y
mAb anti CD40 (Santa Cruz Biotechnology, CA).
\newpage
En resumen, los resultados muestran que TRAF2 y
TRAF3 precipitaron conjuntamente con CD40 tras la estimulación de
sCD40L. Por el contrario, el tratamiento con
CHIR-12.12 anuló la formación del complejo de señal
CD40-TRAF2/3 en células B normales estimuladas con
sCD40L. No hubo cambios en la expresión de CD40 (datos no
mostrados).
Sin estar ligados por la teoría, los resultados
de estos experimentos, y los resultados en los ejemplos resumidos
anteriormente, indican que el anticuerpo CHIR-12.12
es un anticuerpo monoclonal anti CD40 antagonista de acción dual que
tiene una única combinación de atributos. Este anticuerpo monoclonal
totalmente humano bloquea las vías de señales de CD40 mediadas por
CD40L para la supervivencia y la proliferación de las células B;
este antagonismo da lugar finalmente a la muerte celular.
CHIR-12.12 también media el reconocimiento y la
unión por las células efectoras, iniciando la citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos (ADCC). Una vez que
CHIR-12.12 está unido a las células efectoras, se
liberan las enzimas citolíticas, dando lugar a la apoptosis y lisis
de las células B. CHIR-12.12 es un anticuerpo
antitumoral más potente que rituximab cuando se compara en modelos
de tumores
preclínicos.
preclínicos.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este estudio fue investigar los
efectos del pH de la disolución en la estabilidad del anticuerpo
anti CD40 antagonista CHIR-12.12 por medio de
procedimientos biofísicos y bioquímicos para seleccionar el entorno
de disolución óptimo para este anticuerpo. Los resultados de
calorimetría diferencial de barrido (DSC) mostraron que la
estabilidad de la conformación de CHIR-12.12 es
óptima en formulaciones que tienen pH 5,5-6,5.
Basado en una combinación de análisis SDS-PAGE, HPLC
de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) y HPLC de
intercambio catiónico (CEX-HPLC), la estabilidad
fisicoquímica de CHIR-12.12 es óptima a un pH de
aproximadamente 5,0-5,5. En vista de estos
resultados, una formulación farmacéutica líquida recomendada que
comprende este anticuerpo es una formulación que comprende
CHIR-12.12 en una concentración de aproximadamente
20 mg/ml formulada en succinato de sodio aproximadamente 10 mM,
cloruro de sodio aproximadamente 150 mM y que tiene un pH de
aproximadamente pH 5,5.
\vskip1.000000\baselineskip
El anticuerpo CHIR-12.12
utilizado en los estudios de formulación es un anticuerpo monoclonal
humano producido por un proceso de cultivo de células CHO. Este mAb
tiene un peso molecular de 150 kDa y está constituido por dos
cadenas ligeras y dos cadenas pesadas unidas juntas por enlaces
disulfuro. Está dirigido contra el receptor de CD40 de superficie
celular en las células que expresan CD40, incluidas las células B
normales y malignas, para el tratamiento de diversos tipos de cáncer
y enfermedades autoinmunes/inflamatorias.
La sustancia del fármaco anti CD40 utilizada
para este estudio fue un lote a granel de anti CD40
(CHIR-12.12) purificado obtenido de células CHO. La
composición de la sustancia del fármaco era de anticuerpo
CHIR-12.12 9,7 mg/ml en citrato de sodio 10 mM,
cloruro de sodio 150 mM, a pH 6,5. La muestra de control en el
estudio era la sustancia del fármaco recibida, seguida por
congelación a \leq -60ºC, descongelación a TA y probada junto con
muestras de estabilidad en los puntos temporales predeterminados.
Las muestras de estabilidad se prepararon por diálisis de la
sustancia del fármaco contra disoluciones de diferentes pH y la
concentración de CHIR-12.12 en cada una de las
muestras se determinó por UV 280 tal como se presenta en la Tabla
9.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La estabilidad fisicoquímica del anticuerpo
CHIR-12.12 en las diversas formulaciones se ensayó
usando los siguientes protocolos.
\vskip1.000000\baselineskip
La estabilidad conformacional de diferentes
muestras de formulaciones se controló usando un MicroCal
VP-DSC tras calentar de 15ºC hasta 90ºC a razón de
1ºC/min.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estimó la fragmentación y la agregación
usando gel Tris-glicina al 4-20%
bajo condiciones no reductoras y reductoras. Se detectaron las
proteínas por medio de tinción con azul Coomassie.
\vskip1.000000\baselineskip
La fragmentación y agregación de proteínas
también se midió por medio de un sistema de HPLC Water Alliance con
una columna Tosohaas TSK-GEL 3000SWXL, con fosfato
de sodio 100 mM, pH 7,0 como fase móvil a un caudal de 0,7
ml/min.
\vskip1.000000\baselineskip
La degradación relacionada con el cambio de
cargas se midió usando un sistema de HPLC Waters 600s con una
columna Dionex Propac WCX-10, con HEPES 50 mM, pH
7,3 como fase móvil A y HEPES 50 mM que contenía NaCl 500 mM, pH 7,3
como fase móvil B a un caudal de 0,5ºC/min.
\vskip1.000000\baselineskip
El desplegamiento térmico de
CHIR-12.12 reveló al menos dos transiciones
térmicas, que representan probablemente el desplegamiento y fusión
de los dominios Fab y Fc, respectivamente. A temperaturas más altas,
la proteína presumiblemente agregó, dando lugar a pérdida de la
señal de DSC. Con la finalidad de seleccionar la formulación, se
definió la temperatura de transición térmica más baja como la
temperatura de fusión, Tf, en este estudio. La Figura 11 muestra la
temperatura de fusión térmica como una función de los pH de las
formulaciones. Las formulaciones a pH 5,5-6,5
proporcionaron anti CD40 con estabilidad conformacional superior
como se demuestra por las temperaturas de fusión térmica más
elevadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de formulaciones de
CHIR-12.12 a pH 4,5-9,0 se incubaron
a 40ºC durante 2 meses y se sometieron al análisis
SDS-PAGE (datos no mostrados). Bajo condiciones no
reductoras, se observaron especies con peso molecular (PM) de 23 kDa
y 2,7 kDa en formulaciones con pH superior a 5,5, y se observaron
especies con PM de 51 kDa en todas las formulaciones, pero
aparecieron menos a pH 5,0-5,5. Pudo verse una
especie con PM de 100 kDa a pH 7,5 y pH 9,0.
Bajo condiciones reductoras,
CHIR-12.12 se redujo en cadenas pesadas y cadenas
ligeras libres con PM de 50 kDa y 24 kDa, respectivamente. Las
especies de 100 kDa parecieron no ser totalmente reducibles y
aumentaron con el aumento del pH de la disolución, sugiriendo que
podría existir asociación covalente diferente de disulfuro en las
moléculas. Como había otras especies con identidades desconocidas en
SDS-PAGE, la comparación de estabilidad para cada
formulación se basa en la pureza restante de
CHIR-12.12. Las formulaciones a pH
5,0-6,0 proporcionaron un entorno más estable para
CHIR-12.12. Se detectaron pocos agregados por medio
de SDS-PAGE (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis SEC-HPLC detectó el
CHIR-12.12 intacto como la especie del pico
principal, una especie de agregación como una especie de pico
anterior separada de la especie del pico principal, una especie de
fragmento grande como un pico meseta en la parte posterior de la
especie del pico principal, y se detectaron especies de fragmentos
pequeños posteriores a las especies del pico principal. Tras la
incubación a 5ºC y 25ºC durante 3 meses, se detectaron cantidades
insignificantes de fragmentos y agregados de proteínas (<1,0%) en
las formulaciones anteriores y las especies del pico principal de
CHIR-12.12 siguieron teniendo más del 99% de pureza
(datos no mostrados). Sin embargo, se desarrollaron gradualmente
fragmentos tras el almacenamiento a 40ºC y se formaron más
fragmentos a pH 4,5 y pH 6,5-9,0, como se muestra en
la Tabla 21. Tras incubar las formulaciones de
CHIR-12.12 a 40ºC durante 3 meses, se detectó
aproximadamente 2-3% de agregados en pH 7,5 y pH
9,0, mientras que se detectó menos del 1% de agregados en las
formulaciones a otros pH (datos no mostrados). Los resultados de
SEC-HPLC indican que CHIR-12.12 es
más estable a un pH de aproximadamente 5,0-6,0,
El análisis CEX-HPLC detectó el
CHIR-12.12 intacto como la especie del pico
principal, las variantes ácidas eluyeron más temprano que las
especies del pico principal y las variantes de adición de lisina en
el extremo C terminal eluyeron después de las especies de pico
principal. La Tabla 11 muestra la dependencia de los porcentajes de
las especies restantes de CHIR-12.12 del pico
principal y las variantes ácidas en el pH de la disolución. La
muestra de control ya contenía un alto grado de especies ácidas
(aproximadamente 33%), probablemente debido a los procesos de
fermentación de etapa temprana y purificación. La susceptibilidad de
CHIR-12.12 a las disoluciones de pH más alto se
evidencia por dos hechos. Primero, la muestra de la formulación
inicial a pH 9 (t = 0) ya generaba 12% más especies ácidas que el
control. Segundo, el porcentaje de especies ácidas aumentó
bruscamente con el aumento del pH. La degradación relacionada con el
cambio de cargas se debe probablemente a la desamidación. Los datos
anteriores indican que este tipo de degradación de
CHIR-12.12 se redujo al mínimo a pH de
aproximadamente 5,0-5,5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El pH tiene un efecto significativo en la
estabilidad conformacional y fisicoquímica de
CHIR-12.12. Se determinó que la degradación
relacionada con el cambio de cargas es la principal vía de
degradación para CHIR-12.12, que se redujo al mínimo
a pH 5,0-5,5. En base a los datos de estabilidad
general, una formulación farmacéutica líquida recomendada que
comprende este anticuerpo es una formulación que comprende
CHIR-12.12 a una concentración de aproximadamente 20
mg/ml formulada en succinato de sodio aproximadamente 10 mM, cloruro
de sodio aproximadamente 150 mM, y que tiene un pH de
aproximadamente 5,5.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo general es proporcionar una terapia
eficaz para tumores sólidos que comprenden células de carcinoma que
expresan CD40 convirtiéndolos en dianas con una IgG1 anti CD40.
Estos tumores incluyen de pulmón, mama, colon, ovarios, y carcinomas
de piel. La señal para estas enfermedades se determina en fase II
aunque puede obtenerse alguna medición de actividad en fase I.
Inicialmente, el agente se estudia como un agente único, pero se
combinará con otros agentes, quimioterapéuticos, y otros anticuerpos
a medida que proceda el desarrollo.
\newpage
Fase
I
\bullet Evaluar la seguridad y la
farmacocinética - aumento de dosis en sujetos con tumores sólidos
anteriormente citados.
\bullet Elegir la dosis en base a la
seguridad, tolerabilidad y cambio en los marcadores séricos de CD40.
En general se busca una dosis máxima tolerable (DMT) pero pueden
resultar adecuadas otras indicaciones de eficacia (depleción células
B CD40+, etc.) para buscar la dosis.
\bullet Considerar más de una dosis
especialmente para indicaciones diferentes, por ejemplo, la dosis
para cáncer de mama puede ser diferente que para cáncer de ovarios.
Por consiguiente, puede ser necesaria alguna búsqueda de dosis en
fase II.
\bullet Los pacientes se dosifican
semanalmente con toma de muestras para farmacocinética (Pk) en
tiempo real. Inicialmente la dosis máxima permitida es un ciclo de 4
semanas. La Pk puede ser muy variable según la enfermedad estudiada,
densidad de CD40, etc.
\bullet Este(os) ensayo(s)
está(n) abierto(s) a sujetos con tumores sólidos que expresan
CD40, incluyendo carcinomas de pulmón, mama, colon, ovarios, y
piel.
\bullet La decisión para interrumpir o
continuar los estudios se basa en la seguridad, dosis y pruebas
preliminares de actividad antitumoral.
\bullet La actividad del fármaco, determinada
por la tasa de respuesta, se determina en la Fase II.
\bullet Identificar dosi(s) para la
Fase II.
\vskip1.000000\baselineskip
Fase
II
Se iniciarán varios ensayos en los tipos de
tumores mencionados anteriormente con concentración en cáncer de
pulmón, ovario y mama. Puede probarse más de una dosis y más de un
programa en una configuración aleatorizada de fase II.
En cada enfermedad, dirigirse a una población
que ha fracasado con el tratamiento convencional actual:
\bullet pulmón: cirugía, terapia de radiación,
quimioterapia
\bullet ovarios: cirugía, terapia de
radiación, quimioterapia
\bullet mama: cirugía, terapia de radiación,
quimioterapia, terapia con hormonas
\ding{51} La decisión para interrumpir o
continuar con el estudio se basa en la prueba del concepto
terapéutico en Fase II
\ding{51} Determinar si puede usarse un
marcador sustituto como indicación temprana para la eficacia
clínica
\ding{51} Identificar las dosis para la Fase
III
\vskip1.000000\baselineskip
Fase
III
La fase III dependerá de cuándo se detecta la
señal en la fase II y de qué terapias competidoras se consideran el
patrón de referencia. Si la señal se detecta en una etapa de la
enfermedad en la que no hay patrón de referencia de terapia,
entonces podrá servir un estudio de un único brazo, bien controlado,
como un ensayo fundamental. Si hay agentes competidores que se
consideran patrones de referencia, entonces se realizan estudios
directos.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Long, Li
\hskip1cmLuqman, Mohammad
\hskip1cmYabannavar, Asha
\hskip1cmZaror, Isabel
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Uso de anticuerpos
anti-CD40 monoclonales antagonistas para el
tratamiento de mieloma múltiple
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PP22589.002 (282915)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/565.710
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-04-26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/565.710
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-04-27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/525.579
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-11-26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/517.337
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-11-04
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 720
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificadora para cadena
ligera del anticuerpo anti CD40 12.12 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(720)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera del anticuerpo anti
CD40 12.12 humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2016
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificadora para cadena
pesada del anticuerpo anti CD40 12.12 humano (con intrones)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 469
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada del anticuerpo anti
CD40 12.12 humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 469
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada de la variante del
anticuerpo anti CD40 12.12 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena ligera del anticuerpo anti
CD40 5.9 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 474
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada del anticuerpo anti
CD40 5.9 humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 474
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena pesada de la variante del
anticuerpo anti CD40 5.9 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 612
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(612)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificadora para la
isoforma corta del CD40 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 834
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(834)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (0)...(0)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificadora para la
isoforma larga del CD40 humano
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 277
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (16)
1. Un anticuerpo monoclonal
anti-CD40 humano que es capaz de unirse
específicamente al antígeno CD40, estando dicho anticuerpo
monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une
al antígeno CD40, seleccionándose dicho anticuerpo del grupo
constituido por:
a) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal
CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de
hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543;
b) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-87 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12;
c) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-89 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12; y
d) un anticuerpo monoclonal que compite con el
anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse
de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito
de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
para uso en el tratamiento de un sujeto humano
con un tumor sólido que comprende células del carcinoma que expresa
el antígeno CD40.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo
monoclonal anti CD40 humano que es capaz de unirse específicamente
al antígeno CD40 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de un sujeto humano con un tumor sólido que comprende
células de carcinoma que expresan el antígeno CD40, estando dicho
anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa
cuando se une al antígeno CD40, seleccionándose dicho anticuerpo del
grupo constituido por:
a) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal
CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de
hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543;
b) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-87 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12;
c) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-89 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12; y
d) un anticuerpo monoclonal que compite con el
anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse
de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito
de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un procedimiento in vitro para inhibir
el crecimiento de un tumor sólido que comprende células de carcinoma
que expresan el antígeno CD40, comprendiendo dicho procedimiento
poner en contacto dichas células con una cantidad eficaz de un
anticuerpo monoclonal anti CD40 humano que es capaz de unirse
específicamente a dicho antígeno CD40, estando dicho anticuerpo
monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une
al antígeno CD40, seleccionándose dicho anticuerpo del grupo
constituido por:
a) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal
CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de
hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543;
b) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-87 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12;
c) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-89 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12; y
\newpage
d) un anticuerpo monoclonal que compite con el
anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse
de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito
de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Un anticuerpo monoclonal
anti-CD40 humano que es capaz de unirse
específicamente al antígeno CD40, estando dicho anticuerpo
monoclonal exento de actividad agonista significativa cuando se une
al antígeno CD40, seleccionándose dicho anticuerpo del grupo
constituido por:
a) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal
CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de
hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543;
b) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-87 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12;
c) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-89 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12; y
d) un anticuerpo monoclonal que compite con el
anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse
de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito
de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
para uso en la inhibición del crecimiento de un
tumor sólido que comprende células de carcinoma que expresan
antígeno CD40.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo
monoclonal anti-CD40 humano que es capaz de unirse
específicamente al antígeno CD40 en la fabricación de un medicamento
para la inhibición del crecimiento de un tumor sólido que comprende
células de carcinoma que expresa el antígeno CD40, estando dicho
anticuerpo monoclonal exento de actividad agonista significativa
cuando se une al antígeno CD40, seleccionándose dicho anticuerpo del
grupo constituido por:
a) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo capaz de unirse al anticuerpo monoclonal
CHIR-5.9 que puede obtenerse de la línea celular de
hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5542 o al anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543;
b) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-87 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12;
c) un anticuerpo monoclonal que se une a un
epítopo que comprende los residuos 82-89 de la
secuencia de CD40 humano que se muestra en SEC ID Nº 10 ó SEC ID Nº
12; y
d) un anticuerpo monoclonal que compite con el
anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede obtenerse
de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito
de Patente Nº PTA-5542 o el anticuerpo monoclonal
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543 en un ensayo de unión competitiva.
\vskip1.000000\baselineskip
6. El anticuerpo, uso o procedimiento de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo
o su fragmento de unión al antígeno se selecciona del grupo
constituido por:
(i) un anticuerpo o su fragmento de unión al
antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que
contiene los residuos 44-54, 70-76 y
109-117 de SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 6;
(ii) un anticuerpo o su fragmento de unión al
antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada que
contiene los residuos 50-54, 69-84 y
114-121 de SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 7;
(iii) un anticuerpo o su fragmento de unión al
antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que
contiene los residuos 46-52, 70-72 y
111-116 de SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 6; y
(iv) un anticuerpo o su fragmento de unión al
antígeno que comprende un dominio variable de cadena pesada que
contiene los residuos 45-51, 72-74 y
115-120 de SEC ID Nº 4 o SEC ID Nº 7.
\vskip1.000000\baselineskip
7. El anticuerpo, uso o procedimiento de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
constituido por:
(i) los residuos 21-132 de SEC
ID Nº 2;
(ii) los residuos 21-239 de SEC
ID Nº 2;
(iii) SEC ID Nº 2;
(iv) los residuos 20-139 de SEC
ID Nº 4;
(v) los residuos 20-469 de SEC
ID Nº 4;
(vi) SEC ID Nº 4;
(vii) los residuos 20-469 de SEC
ID Nº 5;
(viii) SEC ID Nº 5;
(ix) los residuos 21-132 de SEC
ID Nº 2 y los residuos 20-139 de SEC ID Nº 4;
(x) los residuos 21-239 de SEC
ID Nº 2 y los residuos 20-469 de SEC ID Nº 4;
(xi) los residuos 21-239 de SEC
ID Nº 2 y los residuos 20-469 de SEC ID Nº 5;
(xii) SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 4; y
(xiii) SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 5.
\vskip1.000000\baselineskip
8. El anticuerpo, uso o procedimiento de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo
o su fragmento de unión al antígeno comprende una secuencia de
aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:
(i) los residuos 21-132 de SEC
ID Nº 6;
(ii) los residuos 21-239 de SEC
ID Nº 6;
(iii) SEC ID Nº 6;
(iv) los residuos 20-144 de SEC
ID Nº 7;
(v) los residuos 20-474 de SEC
ID Nº 7;
(vi) SEC ID Nº 7;
(vii) los residuos 20-474 de SEC
ID Nº 8;
(viii) SEC ID Nº 8;
(ix) los residuos 21-132 de SEC
ID Nº 6 y los residuos 20-144 de SEC ID Nº 7;
(x) los residuos 21-239 de SEC
ID Nº 6 y los residuos 20-474 de SEC ID Nº 7;
(xi) los residuos 21-239 de SEC
ID Nº 6 y los residuos 20-474 de SEC ID Nº 8
(xii) SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 7; y
(xiii) SEC ID Nº 6 y SEC ID Nº 8.
\vskip1.000000\baselineskip
9. El anticuerpo, uso o procedimiento de
cualquier reivindicación precedente, en el que dicho anticuerpo es
el anticuerpo monoclonal CHIR-5.9 que puede
obtenerse de la línea celular de hibridoma depositada en la ATCC
como Depósito de Patente Nº PTA-5542 o
CHIR-12.12 que puede obtenerse de la línea celular
de hibridoma depositada en la ATCC como Depósito de Patente Nº
PTA-5543.
10. El anticuerpo, uso o procedimiento de
cualquier reivindicación precedente, en el que dicho tumor sólido se
selecciona del grupo constituido por carcinoma de pulmón, carcinoma
de mama, carcinoma de ovarios, carcinoma de piel, carcinoma de
colon, carcinoma de la vejiga urinaria, carcinoma de hígado,
carcinoma gástrico, cáncer de próstata, carcinoma de células
renales, carcinoma nasofaringeal, carcinoma de células escamosas,
carcinoma papilar de tiroides carcinoma de cuello uterino y
sarcomas.
11. El anticuerpo, uso o procedimiento de la
reivindicación 10, en el que dicho medicamento se administra en un
procedimiento que comprende además la administración a dicho sujeto
de al menos otro protocolo de terapia contra cáncer seleccionado del
grupo constituido por cirugía, terapia con radiación; quimioterapia,
terapia con citocina, u otro anticuerpo monoclonal concebido para su
uso en el tratamiento de dicho tumor sólido.
12. El anticuerpo, uso o procedimiento de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo
monoclonal es un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo
monoclonal, en el que dicho fragmento retiene la capacidad de unirse
específicamente a dicho antígeno CD40 humano.
13. El anticuerpo, uso o procedimiento de la
reivindicación 12, en el que dicho fragmento de anticuerpo de unión
al antígeno se selecciona del grupo constituido por un fragmento
Fab, un fragmento F(ab')_{2}, un fragmento Fv y un
fragmento Fv de cadena única.
14. El anticuerpo, uso o procedimiento de
cualquier reivindicación precedente, en el que dicho anticuerpo
monoclonal o su fragmento de unión al antígeno se une al antígeno
CD40 humano con una afinidad (K_{D}) de al menos
10^{-6} M.
10^{-6} M.
15. El anticuerpo, uso o procedimiento de la
reivindicación 14, en el que dicho anticuerpo monoclonal o su
fragmento de unión al antígeno se une al antígeno CD40 humano con
una afinidad (K_{D}) de al menos 10^{-8} M.
16. El anticuerpo, uso o procedimiento de
cualquier reivindicación precedente, en el que dicho anticuerpo
monoclonal o su fragmento de unión al antígeno se produce en una
línea celular CHO.
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|---|---|---|---|
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