ES2348397T3

ES2348397T3 - Metodos para medir la actividad de adamts13 en la superficie de las plaquetas.

Info

Publication number: ES2348397T3
Application number: ES04778605T
Authority: ES
Inventors: Safi Ranzurmal; Robert S. Greenfield
Original assignee: American Diagnostica Inc
Current assignee: American Diagnostica Inc
Priority date: 2004-07-19
Filing date: 2004-07-19
Publication date: 2010-12-03
Anticipated expiration: 2024-07-19
Also published as: EP1779117A1; ATE468536T1; EP1779117B1; DE602004027314D1; EP1779117A4; WO2006019379A1

Abstract

Método para medir la actividad de ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas que comprende: a) incubar una muestra que comprende ADAMTS13 con un sustrato, en el que la muestra es plaquetas lavadas, en el que el sustrato comprende un resto peptídico y un resto cromogénico, en el que el resto peptídico comprende X-Val-Tyr, X-Leu-Tyr o X-De-Tyr, en los que X es cualquier aminoácido, en el que la longitud del péptido es de 3 a 20 aminoácidos de longitud, con la condición de que el resto cromogénico no sea para- nitronilina (pNA); y b) medir la densidad óptica de la muestra; midiendo de ese modo la actividad de ADAMTS 13 en la superficie de las plaquetas.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona ensayos para la medición de la actividad de ADAMTS13 y el diagnóstico de la púrpura trombocitopénica trombótica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) es una enfermedad microangiopática trombótica potencialmente mortal caracterizada por anemia hemolítica y trombocitopenia asociada con agregación plaquetaria. La causa de la PTT se ha relacionado recientemente con anomalías en una metaloproteinasa denominada ADAMTS 13 o proteasa de escisión del factor de von Willebrand. ADAMTS 13 es una enzima que está presente en niveles significativos en plasma, y puede expresarse en otros tejidos (Levy et al. 2001, Nature 413:488-494; Plaimauer et al. 2002, Blood 100:3626-3632). Suzuki et al. (2004, Biochem. Biophys. Res. Com. 313:212-216) informaron recientemente sobre ADAMTS 13 en plaquetas.

ADAMTS 13 funciona escindiendo multímeros del factor de von Willebrand (FVW) ultragrandes en proteínas de FVW más pequeñas. La disminución de la actividad proteasa de escisión de FVW conduce a la persistencia de multímeros inusualmente grandes de FVW que se unen a las plaquetas, provocando agregados plaquetarios, hemólisis microangiopática y trombocitopenia en pacientes con PTT. Las manifestaciones clínicas de PTT son difíciles de distinguir del síndrome urémico hemolítico (SUH), otro trastorno trombótico microangiopático. Estudios recientes indican que bajos niveles de actividad de ADAMTS13 se asocian con PTT, más no con SUH (Veyradier A, et al. 2002, Blood 98:1765-1772; Furlan et al. 1998, Blood 91:2839-2846). Por tanto, puede realizarse el diagnóstico diferencial de PTT midiendo la actividad de ADAMTS 13.

Existen dos formas de PTT, congénita (familiar) y adquirida (Furlan et al. 1996, Blood 87:4223-4234; Furlan et al. 1998, Blood 91:2839-2846). La PTT congénita está causada por mutaciones genéticas en el gen ADAMTS 13, que da como resultado una pérdida en la producción de ADAMTS 13 y/o la producción de una enzima ADAMTS 13 no funcional. La PTT adquirida es una enfermedad de tipo autoinmunitaria, que se ha relacionado con la ingestión de determinados agentes farmacéuticos. La PTT adquirida está causada por la generación de autoanticuerpos frente a la proteína ADAMTS 13. El comienzo de la PTT adquirida se ha relacionado con la ingestión de determinados agentes farmacéuticos.

En la técnica se conocen diversos métodos para medir la presencia y/o la actividad de ADAMTS 13. Estos métodos incluyen ensayos de unión a colágeno, ensayos con cofactor de ristocetina, análisis electroforético (por ejemplo, análisis de multímeros) y métodos inmunológicos. Los inmunoensayos electroforéticos, tales como análisis de inmunotransferencia de tipo Western, se han reemplazado en gran medida por ensayos inmunorradiométricos (IRMA) y ensayos de inmunosorción ligados a enzimas (ELISA) (Laffan et al. 2004, Haemophilia 10:199-217). Varios informes describen ensayos de ADAPTS13 en los que se usa el domino A2 de FVW como sustrato (Zhou et al. 2004, Thromb. Haemost. 91:806-811; Kokame et al. 2004, Hemost. Thromb. Vasc. Biol. Blood 103:607-612; Cruz et al. 2004, Thromb. Haemost. 90:1204-1209). La escisión del domino A2 se monitoriza mediante un método de ELISA. Los ensayos disponibles para ADAMTS 13 requieren un nivel de experiencia técnica relativamente alto, y por tanto no se realizan en la mayoría de laboratorios clínicos. Además, la obtención de resultados puede llevar varios días usando las pruebas disponibles, lo que es perjudicial para los pacientes que presentan PTT, quienes requieren un diagnóstico rápido.

El documento WO 2004/035778 se refiere a un método para medir ADAMTS13 plasmático.

El documento WO 02/10437 describe un método de detección de proteasa de escisión de FVW usando FVW monomérico.

Para resolver los problemas de los ensayos disponibles actualmente se necesita un ensayo sencillo, específico y rápido para ADAMTS 13; sin embargo, se ha desarrollado ninguno hasta la fecha. Los intentos de desarrollar un ensayo de este tipo usando ADAMTS 13 aislado de plasma no han sido satisfactorios. Furlan et al. sometieron a prueba 28 sustratos de peptidilo cromogénicos sintéticos con para-nitroanilina (pNA) como grupo saliente, y no observaron resultados sistemáticos, repetibles (2002 Seminars in Thrombosis and Hemostasis 28(2):167-172). Estos resultados demostraron la dificultad en la técnica para desarrollar un ensayo rápido, fiable para determinar la actividad de ADAMTS 13.

Se ha descubierto que ADAMTS13 en plaquetas tiene una capacidad potenciada, en relación con ADAMTS 13 en plasma, para escindir pequeños sustratos de peptidilo. La diferencia entre el ADAMTS13 plasmático y plaquetario probablemente se deba al hallazgo de que el ADAMTS13 plaquetario se escinde, mientras que el ADAMTS13 plasmático no se escinde y permanece como un solo polipéptido. La actividad de ADAPTS13 puede potenciarse en plaquetas tratando con el factor de coagulación XIa (FXIa). Esto indica que el FXI activado (FXIa) puede provocar la escisión de ADAMTS13. Se han desarrollado ensayos cromogénicos de diagnóstico para medir la actividad de ADAMTS13 en plaquetas y en plasma usando diferentes sustratos de peptidilo con grupos salientes distintos a pNA. También se ha desarrollado un método de ensayo para medir autoanticuerpos frente a ADAMTS13 y un ELISA para medir la proteína ADAMTS13 en plasma.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la invención proporciona un método para medir la actividad de ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas según la reivindicación 1.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para identificar un inhibidor de ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas según la reivindicación 7.

En otro aspecto la invención proporciona un uso del método para medir la actividad de ADAMTS13 de la invención para diagnosticar PTT en un sujeto según la reivindicación 15.

Aún en otro aspecto, la invención proporciona un uso del método para medir la actividad de ADAMTS13 de la invención para diagnosticar PTT adquirida en un sujeto según la reivindicación

23.

La invención proporciona adicionalmente un uso del método para medir la actividad de ADAMTS13 de la invención para monitorizar el tratamiento de un paciente con PTT según la reivindicación 29.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

A continuación se describirá la presente invención a modo de ejemplo, haciéndose referencia a las siguientes figuras, en las que:

La figura 1 muestra la estructura de la forma plasmática de ADAMTS13. S: péptido señal; P: propéptido; Dis: región similar a desintegrina; Cys: región rica en Cys. También se muestran la región catalítica (metaloproteasa) y los dos dominios CUB. Se muestran las repeticiones de trombospondina de tipo I (TSP1) como círculos numerados. La figura 2 muestra LVY-pNA como un sustrato para ADAMTS13. La figura 3 muestra una comparación de sustratos LVY-AMC y Suc-LLVY-AMC para medir la actividad de ADAMTS 13. La figura 4 muestra la medición de la escisión de un sustrato de ADAMTS 13 usando transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Se incubó el sustrato, NH2-Arg-Lys(DABCYL)-NLVYMVTGD(EDANS)-Arg-COOH, con plaquetas normales, y se midió el aumento en la fluorescencia con el tiempo. La figura 5 muestra la actividad de ADAMTS13 en líquido de cultivo tisular de células HEK 293 transfectadas de manera simulada y transfectadas con ADAMTS13. Se midió la actividad usando sustrato fluorescente Suc-LLVY-AMC.

La figura 6 muestra una comparación de la actividad de ADAMTS 13 en plasma de sujetos normales y de sujetos con PTT adquirida usando sustrato fluorescente Suc-LLVY-AMC. La figura 7 muestra la cuantificación de la actividad de ADAMTS 13 en PRP de sujetos normales () y sujetos con PTT adquirida (♦). La figura 8 muestra la medición de la actividad de ADAMTS13 en plasma rico en plaquetas (PRP) y plasma pobre en plaquetas (PPP) de seis muestras individuales tomadas de sujetos normales. Se midió la actividad de ADAMTS 13 usando sustrato fluorescente Suc-LLVYAMC. La figura 9 muestra una comparación de la actividad de ADAMTS 13 por mg de proteína en plaquetas de sujetos normales y sujetos con PTT adquirida. La figura 10 muestra la inmunotinción de inmunotransferencias de tipo Western de proteínas plaquetarias de diversos anticuerpos anti-ADAMTS 13. La figura 10A muestra proteínas plaquetarias sometidas a electroforesis usando condiciones reductoras (carriles A y B) y condiciones no reductoras (carriles C y D). Se tiñeron los carriles A y C con anticuerpo de cabra antiPAI-1 como control; se tiñeron los carriles B y D con anticuerpo de cabra anti-ADAMTS 13; el carril E contiene patrones de peso molecular. Las flechas a la izquierda indican bandas de proteínas inmunoteñidas específicamente con anticuerpos anti-ADAMTS 13. La figura 10B muestra inmunotinción de proteínas plaquetarias usando anticuerpos humanos. Carril A: condiciones reductoras e Ig de un sujeto con PTT adquirida; carril B: condiciones no reductoras e Ig de un sujeto con PTT adquirida; carril C: condiciones no reductoras e Ig de un sujeto normal (control); carril D: marcadores de peso molecular. La figura 11 muestra que la actividad de ADAMTS 13 en plaquetas normales y en plaquetas de un sujeto con PTT adquirida se potencia mediante el tratamiento con el factor XIa (FXIa) activado por peptidasa.

La figura 12 muestra un gráfico de la actividad de ADAMTS 13 de plaquetas activadas por FXIa en plasma normal, y su inhibición por plasma de un sujeto con PTT adquirida. La figura 13 muestra una curva patrón que representa el aumento dependiente de la concentración de la densidad óptica usando el ELISA de ADAMTS 13 y diferentes cantidades de plasma normal. La figura 14 muestra la determinación de los niveles de ADAMTS 13, en relación al plasma normal combinado (PNP), en veinticuatro muestras de plasma individuales de sujetos normales usando el método de ELISA. La figura 15 muestra la inhibición de la actividad de ADAMTS 13 recombinante por anticuerpo de cabra anti-ADAMTS

13. La figura 16 muestra la actividad de ADAMTS13 recombinante en presencia de cantidades variables de plasma normal o plasma de sujetos con PTT adquirida, que contiene un inhibidor de la enzima. La figura 17 muestra la inhibición de la actividad de ADAMTS 13 en plaquetas aisladas por anticuerpos anti- ADAMTS 13 de diferentes especies. La figura 18 muestra los resultados de un experimento que mide autoanticuerpos anti-ADAMTS 13 en plasma preincubando el plasma de muestra con plaquetas normales aisladas. La figura 19 muestra la inhibición dependiente de la concentración de la actividad de ADAMTS13 en plaquetas por anticuerpos ADAMTS 13 humanos en plasma de sujetos con PTT adquirida. La figura 20 muestra el efecto del uso de diferentes cantidades de plaquetas en el ensayo de fluorescencia de la invención. Se midió la actividad de ADAMTS 13 en PRP de sujetos normales y sujetos con PTT adquirida.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En esta descripción, “comprende”, “que comprende”, “que contiene”, “que tiene” y similares pueden tener el significado atribuido a los mismos en la ley estadounidense de patentes y

puede significar “incluye”, “que incluye”, y similares. “Que consiste esencialmente en” o “consiste esencialmente en” asimismo tienen el significado atribuido en la ley estadounidense de patentes y la expresión es abierta, permitiendo la presencia de más de lo que se cita siempre que las características básicas o novedosas de lo que se cita no se cambie por la presencia de más de lo que se cita, pero excluye las realizaciones de la técnica anterior.

ADAMTS13

ADAMTS 13, también conocido como la proteasa de escisión del factor de von Willebrand (FVW), es un miembro de la familia de las metaloproteasas denominado por la combinación característica de motivos de tipo 1 de trombospondina con uno similar a desintegrina y metaloproteasa (de tipo reprolisina). En la figura 1, se muestra la estructura de ADAMTS13 plasmático. Los detalles estructurales y la información de secuencia sobre ADAMTS13 pueden encontrarse en Zheng et al. (2001; J. Biol. Chem. 276(44):41059-41063). ADAMTS13 escinde FVW en el enlace Tyr1605-Met1606 y requiere tanto iones calcio como zinc para funcionar.

Hasta la presente invención, se estudió principalmente la actividad de ADAMTS 13 en plasma. Esta forma de ADAMTS 13 se denomina en el presente documento “ADAMTS13 plasmático”. Actualmente se ha descubierto una forma novedosa de ADAMTS 13 en plaquetas y se denomina en el presente documento “ADAMTS13 plaquetario”. También puede prepararse “ADAMTS13 recombinante” usando técnicas de biología molecular convencionales, tales como las que se encuentran en Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª Ed., John Wiley & Sons, Inc. (así como la versión completa de Current Protocols in Molecular Biology).

Por tanto, en el presente documento se describe una proteína ADAMTS13 y la actividad de ADAMTS13 en plaquetas. Esta proteína parece ser distinta de ADAMTS13 plasmático porque ADAMTS 13 plasmático es un polipéptido contiguo, mientras que la

proteína ADAMTS 13 plaquetaria se escinde en más de un polipéptido, que entonces se mantienen unidos mediante enlaces disulfuro. Se observan polipéptidos de aproximadamente 120 kD, aproximadamente 84 kD, aproximadamente 60 kD, aproximadamente 43 kD y aproximadamente 30 kD en un gel de SDS-PAGE de ADAMTS13 plaquetario. El ADAMTS13 plaquetario parece que se escinde con FXIa. Asimismo, esta forma de ADAMTS13 también parece ser distinta de la notificada por Suzuki et al. (2004, Biochem. Biophys, Res. Commun. 313:212-216). A diferencia del ADAMTS13 plaquetario escindido de la presente invención, el ADAMTS 13 de Suzuki et al. tiene un peso molecular de aproximadamente 220 kD en un gel de SDS-PAGE. Además, Suzuki et al. notificaron una forma más grande de ADAMTS13 en plaquetas, mientras que los experimentos realizados por los presentes inventores indican actividad de ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas. Sin querer limitarse por la teoría, es posible que el ADAMTS13 plaquetario de la invención haya experimentado una modificación postraduccional diferente que el de Suzuki et al., dando como resultado una proteína de superficie escindida, en vez de una proteína citoplasmática más grande.

Pueden usarse los ensayos de la invención para detectar ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas.

La fuente de ADAMTS13 para su uso en los ensayos y los métodos de la invención son plaquetas aisladas. En la sección de ejemplos pueden encontrarse métodos para preparar plasma rico en plaquetas (PRP), plasma pobre en plaquetas (PPP), plaquetas aisladas y sobrenadante de cultivo tisular. Puede prepararse ADAMTS13 purificado a partir de plasma, plaquetas o células recombinantes usando técnicas bioquímicas convencionales para el aislamiento y la purificación de proteínas que incluyen, pero sin limitarse a, cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía por exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico, inmunoprecipitación y precipitación con sulfato de amonio. El término “plasma” puede incluir PRP, PPP y plasma normal combinado (PNP).

Tal como se usa en el presente documento, “plaquetas normales”, “plasma normal”, “PRP normal”, etc. se derivan de

individuos que no tienen ni PTT congénita ni PTT adquirida. PNP es una mezcla de plasma tomada de múltiples individuos que no tienen PTT. Asimismo, “plaquetas de PTT”, “plasma de PTT”, “PRP de PTT”, etc. se derivan de individuos que tienen o bien PTT congénita o bien PTT adquirida. “Plaquetas de PTT adquirida” “plasma de PTT adquirida”, “PRP de PTT adquirida”, etc. se derivan de individuos que tienen la forma adquirida de PTT.

Las mediciones de la actividad de ADAMTS13 se realizan en relación con la “actividad normal”, es decir, la actividad de ADAMTS 13 en plaquetas normales, PRP normal, ADAMTS 13 recombinante o purificado, etc. Por tanto, expresiones tales como “actividad de ADAMTS 13 reducida” o “actividad de ADAMTS 13 inhibida” se refieren a la actividad de ADAMTS 13 en relación con la actividad medida en una muestra normal, es decir plaquetas normales, plasma normal, PRP normal, ADAMTS13 recombinante o purificado, etc.

Los métodos de la invención son aplicables a aplicaciones clínicas, veterinarias y/o de investigación.

Sustratos

La invención se refiere a ensayos para medir la actividad de ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas. En un ensayo de este tipo, se incuba una muestra que comprende ADAMTS 13 con un sustrato que comprende un resto peptídico y un resto cromogénico y se mede la densidad óptica o fluorescencia de la muestra, midiendo de ese modo la actividad de ADAMTS 13. En esta realización, el resto peptídico comprende X-Val-Tyr, X-Leu-Tyr o X-Ile-Tyr, en los que X es cualquier aminoácido. En una realización preferida, X es Leu. En otras realizaciones preferidas, el resto peptídico es Leu-Val-Tyr, Leu-Leu-Val-Tyr o Suc-Leu-Leu-Val-Tyr.

El experto puede realizar sustituciones de aminoácidos sustituciones en el resto peptídico sin experimentación excesiva. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos siempre que se retenga la actividad

de unión del sustrato. Por ejemplo, los aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que

5 tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.

Pueden realizarse sustituciones conservativas, por ejemplo, según la tabla a continuación. Pueden sustituirse entre sí 10 aminoácidos en el mismo bloque de la segunda columna y

preferiblemente en la misma línea de la tercera columna:

ALIFÁTICO: No polar G A P

I L V

Polar no cargado: C S T M

N Q

Polar cargado: D E

K R

AROMÁTICO: H F W Y

El resto peptídico está en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 residuos de aminoácido de longitud. 15 También pueden usarse aminoácidos no convencionales tales como los que se encuentran en la serie Spectrozyme de sustratos de peptidilo de American Diagnostica. Inc. (Stamford, CT) para sustituirlos por aminoácidos convencionales, siempre que el péptido retenga su capacidad para unirse y escindirse por ADAMTS

20 13. Los restos cromogénicos adecuados para su uso en la invención incluyen s-bencilo, ácido 5-amino-2-nitrobenzoico y 6amino-1-naftalenosulfonamidas. El resto cromogénico no es paranitroanalina (pNA), que se ha demostrado que es un resto

25 ineficaz para sustrato de ADAMTS13. Sin querer limitarse por la teoría, es posible que la estructura de pNA provoque un impedimento estérico que evita la actividad de ADAMTS 13. Otro ensayo descrito en el presente documento es un método para medir la actividad de ADAMTS13 mediante la incubación de

una muestra que comprende ADAMTS 13 con un sustrato que tiene restos donadores y aceptores que median la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Además de los restos donadores y aceptores, el sustrato comprende un resto

5 peptídico que comprende Val-Tyr-Met, Leu-Tyr-Met o Ile-Tyr-Met. Se determina la actividad de ADAMTS 13 midiendo la fluorescencia de la muestra.

FRET es una interacción dependiente de la distancia entre los estados electrónicos excitados de dos moléculas colorantes 10 en las que se transfiere la excitación desde un resto donador hasta un resto aceptor sin la emisión de un fotón. Esto se logra usando pares donador/aceptor en los que el espectro de emisión del donador se solapa con el espectro de absorción del aceptor. Cuando los dos están en proximidad espacial, la energía de 15 excitación del donador se transfiere al aceptor a través de interacciones dipolo-dipolo de largo alcance. Cuando se produce la transferencia de energía, el aceptor extingue la fluorescencia del donador, y por tanto, el resto aceptor también se denomina un extintor. Los restos donadores y aceptores deben

20 estar dentro de aproximadamente 100 ángstroms o 10 nm entre sí para una transferencia de energía eficaz. En la técnica se conocen bien pares donador/aceptor adecuados para su uso en FRET. En la tabla 1 pueden encontrarse ejemplos de pares donador/aceptor. Debe observarse que la tabla

25 1 no contiene una lista exhaustiva de pares donador/aceptor de FRET, y que el experto puede elegir un par donador/aceptor basándose en su conocimiento de la técnica.

Tabla 1. Restos donadores y aceptores de FRET

Donador: Aceptor

7-metoxicumarina: DABCYL

Amino-metil-cumarina: DABCYL, QSY-351

Proteína azul fluorescente: Proteína roja fluorescente Ds

BODIPY-FL2: DABCYL, QSY-7, QSY-9, BHQ-13

B-ficoeritrina: Cy5

Éster succimidílico de: Rojo de Texas

carboxifluoresceína

Azul cascade: DABCYL

Cumarina: DABCYL

Cy3: Cy5, QSY-7, QSY-9, BHQ-2

Cy5: Cy5.5, QSY-35, BHQ-2

Dansilo: FITC

Dansilo: Octadecil-rodamina

Dialquilaminocumarina: DABCYL, QSY-35

EDANS4: DABCYL

FITC: Tiosemicarbazida de eosina

Fluoresceína: Tetrametil-rodamina

Proteína verde fluorescente: Proteína amarilla fluorescente

IAEDANS5: DDPM6

Azul marino: DABCYL, QSY-35

Azul pacífico: DABCYL, QSY-35

Rodamina 6G: Verde malaquita

Triptófano: Dansilo

1 Los extintores QSY son análogos de fluoresceína 2 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno 3 Extintores Black Hole QuenchersTM de Biosearch Technologies, Inc., Novato, CA 4 Ácido 5-[(2-aminoetil)amino]naftalen-1-sulfónico 5 Ácido 5-[(2-yodoacetilaminoetil)aminonaftalen-1-sulfónico 6 N-(4-dimetilamino-3,5-dinitrofenil)maleimida

El par donador/aceptor preferido es EDANS/DABCYL. Preferiblemente, el resto peptídico es de al menos aproximadamente 3 residuos de aminoácido de longitud. Más

5 preferiblemente, el resto peptídico está en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 residuos de aminoácido de longitud. Ventajosamente, el resto peptídico es Asn-Leu-Val-Tyr-Met-Val-Thr-Gly-Asp. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos tal como se describieron anteriormente sin apartarse

10 del espíritu y el alcance de la invención.

El sustrato preferido para su uso en esta realización de la invención es NH2-Arg-Lys-(DABCYL)-Asn-Leu-Val-Tyr-Met-Val-Thr- Gly-Asp-(EDANS)-Arg-COOH.

También se dan a conocer métodos para preparar los sustratos de ADAMTS13. Dichos métodos comprenden la unión de manera covalente de un resto peptídico, tal como se describió anteriormente, a un resto cromogénico o fluorogénico, o a un resto donador y un resto aceptor que median FRET, usando técnicas de síntesis bien conocidas.

Inhibidores de ADAMTS13

En el presente documento se describe un método para inhibir ADAMTS13 usando un anticuerpo inhibidor contra ADAMTS13. Varios anticuerpos anti-ADAMTS13 están disponibles de diversas fuentes. Por ejemplo, los ejemplos 12 y 14 demuestran los efectos inhibidores de anticuerpos anti-ADAMTS 13 de cabra, conejo y de ser humano.

Pueden detectarse autoanticuerpos que inhiben la actividad de ADAMTS 13 en sujetos con PTT adquirida. (Véase Klaus et al. 2004, Blood 103(12):4514-4519). Estos anticuerpos pueden aislarse del plasma de pacientes con PTT adquirida y usarse in vitro como inhibidores de ADAMTS13. Además, un método de diagnóstico de PTT adquirida proporcionado por la presente invención es incubar una muestra de ADAMTS13 con plasma de un sujeto que va a someterse a prueba para detectar PTT adquirida y medir la actividad de ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas usando uno de los ensayos de la invención. La inhibición de la actividad de ADAMTS 13 por el plasma indica la presencia de anticuerpos anti-ADAMTS13 inhibidores en el plasma, y por tanto, confirma un diagnóstico de PTT adquirida.

Klaus et al. (ibíd.) realizaron experimentos de mapeo de epítopos con el fin de deducir la naturaleza de los anticuerpos contra ADAMTS 13 inhibidores en pacientes con PTT adquirida. Los resultados indican que en todos los casos se detectaron anticuerpos dirigidos contra el dominio espaciador/rico en cisteína de ADAMTS13. Además, se detectaron anticuerpos dirigidos contra la repetición TSP1-1 o un fragmento que

contiene la repetición TSP1-1, el dominio similar a desintegrina y el domino catalítico en el 72% de los pacientes. Además, se detectaron anticuerpos dirigidos contra los dominios CUB 1 y/o CUB 2 en el 64% de los pacientes. Para los fines de esta invención, el extremo C-terminal consiste en 2-8 repeticiones TSP1 de trombospondina de tipo 1 y los dominios CUB. La figura 1 muestra un diagrama esquemático de ADAMTS13.

La invención proporciona un método para identificar inhibidores de ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas. El inhibidor puede ser, entre otros, un polipéptido, un péptido, un oligonucleótido, un polinucleótido, un nucleósido o análogo de nucleósido, un sacárido, una molécula pequeña, o un producto químico natural o sintético. El método comprende incubar una muestra de ADAMTS13 con un inhibidor candidato y medir la actividad de ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas según uno o más de los ensayos proporcionados por la invención. El inhibidor se identifica mediante la actividad de ADAMTS13 reducida en la superficie de las plaquetas en la muestra de prueba, en comparación con la actividad de ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas en una muestra control no incubada con el inhibidor candidato. El inhibidor candidato puede generarse usando técnicas conocidas, y puede derivarse, por ejemplo, de una biblioteca de compuestos químicos, una biblioteca de presentación en fago, una biblioteca de productos químicos naturales o una biblioteca de química combinatoria.

ELISA

El ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA) es un inmunoensayo en fase sólida que se usa ampliamente tanto en la práctica clínica como en la práctica de investigación básica. En un tipo de ELISA, se une un antígeno a la fase sólida, que es comúnmente una membrana, una placa, un micropocillo o una perla. Entonces, se incuba la fase sólida con un anticuerpo frente al antígeno (un “anticuerpo primario”). Si se conjuga el anticuerpo primario con un marcador, puede detectarse. Este procedimiento se conoce como inmunomarcado directo. Alternativamente, el anticuerpo primario puede estar sin marcar, en cuyo caso se

incuba con la fase sólida un anticuerpo frente al anticuerpo primario (un “anticuerpo secundario”), producido en una especie diferente del anticuerpo primario y conjugado con un marcador. Este método de detección se denomina inmunomarcado indirecto. En la técnica se conocen bien métodos de inmunomarcado.

En un tipo diferente de ELISA, se une un anticuerpo a la fase sólida. Este anticuerpo puede usarse entonces para capturar un antígeno de interés. Pueden emplearse las técnicas de inmunomarcado directo o indirecto con el propósito de análisis. Puede medirse ADAMTS 13 en una muestra uniendo un anticuerpo anti-ADAMTS13 a una fase sólida y añadiendo la muestra a la fase sólida. El ADAMTS 13 presente en la muestra se une al anticuerpo, y se detecta el ADAMTS 13 unido usando inmunomarcado directo o indirecto. Puede medirse la cantidad de ADAMTS 13 en la muestra cuantificando el marcador.

La muestra es o comprende plaquetas o es plasma.

Otro ELISA dado a conocer en el presente documento se usa para detectar anticuerpos anti-ADAMTS13 en una muestra de prueba. En esta realización, se une un anticuerpo anti-ADAMTS 13 producido en una primera especie, por ejemplo una cabra, a una fase sólida. Se añade ADAMTS 13 y se une al anticuerpo producido en la primera especie. Se añade una muestra de prueba de una segunda especie, por ejemplo ser humano, y cualquier anticuerpo anti-ADAMTS13 presente en la muestra de prueba se une a ADAMTS13. Finalmente, se añade un anticuerpo marcado contra los anticuerpos de la segunda especie. El anticuerpo marcado se produce en una tercera especie, por ejemplo asno, y se une al anticuerpo de la segunda especie. Detectando el marcador, pueden detectarse los anticuerpos anti-ADAMTS13 en la muestra de prueba.

La muestra de prueba puede ser cualquier líquido biológico, tal como sangre, plasma, suero, líquido de cultivo, líquido cefalorraquídeo o esputo.

El marcador puede ser cualquier resto conocido en la técnica, incluyendo sistemas enzimáticos cromogénicos, tales como peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, -galactosidasa,

glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Se hacen reaccionar estos marcadores enzimáticos con un sustrato cromogénico que puede detectarse mediante técnicas convencionales. El marcador podría ser peroxidasa de rábano, y el sustrato es tetrametilbencidina. El marcador también podría ser un colorante fluorescente, incluyendo rodamina, fluoresceína, colorantes Cy, rojo de Texas, y derivados de los mismos.

Aplicaciones de diagnóstico

Además del método tratado anteriormente para diagnosticar PTT adquirida sometiendo a prueba las propiedades inhibidoras del plasma en ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas, la invención proporciona otros métodos para el diagnóstico tanto de PTT congénita como adquirida.

Por ejemplo, puede diagnosticarse PTT congénita o adquirida midiendo la actividad de ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas en una muestra de prueba de un sujeto usando uno de los ensayos de la invención y comparando posteriormente la actividad de ADAMTS 13 en la superficie de las plaquetas en la muestra de prueba con respecto a la actividad de ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas en una muestra control que tienen actividad de ADAMTS13 normal en la superficie de las plaquetas. La actividad de ADAMTS13 reducida en la superficie de las plaquetas en la muestra de prueba en comparación con la muestra control indica un diagnóstico positivo de PTT.

Puede diagnosticarse PTT adquirida en un sujeto incubando una muestra que comprende ADAMTS 13 con plasma del sujeto; y midiendo la actividad de ADAPTS13 en la superficie de las plaquetas en la muestra usando uno de los ensayos de la invención. La actividad de ADAMTS13 reducida en la superficie de las plaquetas en la muestra, en comparación con la actividad de ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas en una muestra control que tiene actividad de ADAMTS13 normal en la superficie de las plaquetas, indica PTT adquirida.

Aplicaciones de tratamiento

Las técnicas proporcionadas en la invención pueden usarse para monitorizar el tratamiento de un paciente para PTT. Por ejemplo, durante el tratamiento, puede medirse la actividad de ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas usando los ensayos de la invención. Esto permite al médico evaluar la eficacia del tratamiento y/o determinar la duración de una sesión de tratamiento que se requiere para restaurar la actividad de ADAMTS13.

Un tratamiento para la PTT es la plasmaféresis. En pacientes con PTT adquirida, se usa plasmaféresis para eliminar los anticuerpos anti-ADAMTS13 inhibidores del plasma del paciente. El reemplazo del ADAMTS13 deficiente se proporciona mediante plasma infundido. Los avances recientes en el entendimiento de los mecanismos patológicos de PTT proporcionan un fundamento para monitorizar la plasmaféresis a través de la medición de los niveles de actividad de ADAMTS13 en el paciente que se somete a plasmaféresis.

Dado que la forma plaquetaria de ADAMTS 13 reacciona con sustratos de bajo peso molecular de manera más eficaz que la forma plasmática, es probable que el ADAMTS13 plaquetario sea una diana mejor para los fármacos diseñados para tratar PTT. Por tanto, en el presente documento se da a conocer un método para tratar PTT en un paciente que necesita el mismo que comprende administrar al paciente un fármaco que selecciona como diana específicamente el ADAMTS13 plaquetario. El fármaco puede identificarse usando los métodos de selección proporcionados en la invención y descritos en el presente documento. El término “fármaco” se entiende que abarca un polipéptido, un péptido, un oligonucleótido, un polinucleótido o un vector que contiene un polinucleótido, un nucleósido o análogo de nucleósido, un sacárido, una molécula pequeña o un producto químico natural o sintético.

A continuación se describirá la invención a modo de los siguientes ejemplos no limitativos, facilitados a modo de ilustración.

EJEMPLOS

Materiales y métodos

Sustratos de peptidilo sintéticos

Se obtuvieron Leu-Val-Tyr-AMC (LVY-AMC) y Suc-Leu-Leu-Val- Tyr-AMC (Suc-LLVY-AMC) de Bachem Bioscience Inc. (King of Prussia, PA). LVY-AMC también lo preparó QPR (Montreal, Canadá). El sustrato de FRET, NH2-Arg-Lys(DABCYL)-NLVYMVTGD(EDANS)-Arg- COOH, lo preparó American Diagnostica Inc. en el Centro de Recursos para la Biología Molecular, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma (Oklahoma City, OK).

Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP), plasma pobre en plaquetas (PPP) y plaquetas aisladas

Se extrajo sangre mediante venopunción en tubos de extracción que contenían citrato de sodio 0,12 M, un anticoagulante. Se centrifugó la sangre con citrato a 700 rpm durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y se guardó como la fracción de plasma rico en plaquetas (PRP). Se centrifugó el PRP a 10.000 rpm durante 20 minutos. Se retiró el sobrenadante y se guardó como la fracción de plasma pobre en plaquetas (PPP). El sedimento contenía las plaquetas, que se lavaron resuspendiendo en tampón Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 y centrifugando a 10.000 rpm durante 10 minutos. Se resuspendieron las plaquetas aisladas en tampón y se usaron en los experimentos.

ADAMTS 13 recombinante

Se transfectaron células HEK 293 con un vector que codifica para ADAMTS13. El Dr. David Ginsburg (Universidad de Michigan, MI) proporcionó generosamente el sobrenadante de cultivo celular de las células HEK 293 transfectadas. También se proporcionó como control sobrenadante de células transfectadas de manera simulada sin ADAMTS13 recombinante.

Ejemplo 1. Medición de la actividad de ADAMTS13 en PRP usando los sustratos de peptidilo LVY-pNA y LVY-AMC

Tal como se trató anteriormente, Furlan et al. notificaron que algunos restos de peptidil-pNA, tales como XLY-pNA y XVYpNA, no eran sustratos para ADAMTS13. Se preparó LVY-pNA y se

sometió a prueba para determinar su capacidad para escindirse por ADAMTS13. Los resultados mostrados en la figura 2 confirman los hallazgos de Furlan et al., es decir, LVY-pNA no se escindía por ADAMST13.

Por tanto, la naturaleza del grupo saliente del sustrato de peptidilo parece ser importante en la determinación de la capacidad de ADAMTS 13 para escindir un cromóforo o fluoróforo del extremo de un sustrato de peptidilo.

Ejemplo 2. Medición de la actividad de ADAMTS13 en PRP usando sustratos de peptidilo de diferentes longitudes

Con el fin de determinar el efecto de la modificación de la longitud de la secuencia peptídica conjugada con el fluorocromo AMC, se incubó PRP normal (20 l) a 37°C con una concentración final de Suc-LLVY-AMC o LVY-AMC 0,8 mM en tampón Tris-HCl 10 mM,

pH 8,0 en un volumen total de 200 l. Se midió la fluorescencia usando un lector fluorofotométrico de placas de microtitulación (Ex 360 nm/Em 460 nm). Se escindieron ambos sustratos de peptidil-AMC por ADAMTS13 en PRP, proporcionando Suc-LLVY-AMC una señal mayor con el tiempo en comparación con el sustrato LVY-AMC (figura 3).

Este ejemplo demuestra que pueden prepararse diferentes sustratos de ADAMTS 13 alterando la secuencia peptídica que se conjuga con el fluoróforo de AMC.

Ejemplo 3. Medición de la actividad de ADAMTS13 usando un sustrato de FRET

Se midió la actividad de ADAMTS13 usando un sustrato fluorescente unido a un resto donador y un resto aceptor que funciona mediante transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). En este ejemplo, se usó el sustrato selectivo de ADAMTS 13, NH2-Arg-Lys(DABCYL)-NLVYMVTGD(EDANS)Arg-COOH. La secuencia peptídica NLVYMVTGD de este sustrato es homóloga al sitio de escisión de ADAMTS13 en FVW. El sustrato de peptidilo intacto tiene baja fluorescencia, debido a la extinción del DABCYL-fluorocromo por el extintor EDANS. La

escisión del sustrato entre la tirosina y la metionina de la secuencia peptídica da como resultado en un aumento en la fluorescencia.

Se incubaron plaquetas aisladas en tampón de ensayo Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 con una concentración final de 8 g/ml del sustrato de FRET a 37°C. Se midió la fluorescencia en un lector de placas espectrofluorométrico (Ex 360 nm/Em 440 nm). La figura 4 muestra que la incubación de plaquetas con NH2-Arg-Lys(DABCYL)-NLVYMVTGD(EDANS)-Arg-COOH da como resultado el aumento de la fluorescencia con el tiempo, indicando que la forma de ADAMTS13 que se encuentra en las plaquetas escinde este sustrato peptídico de FRET. El experto puede diseñar otros sustratos de FRET para medir la actividad de ADAMTS 13 usando su propio conocimiento y las enseñanzas en el presente documento.

Ejemplo 4. Medición de la actividad de ADAMTS13 recombinante en sobrenadantes de cultivo tisular usando sustrato fluorescente Suc-LLVY-AMC

Se compararon las señales de fluorescencia entre el sobrenadante de cultivo tisular de células HEK 293 transfectadas con un vector viral que codifica para ADAMTS 13 recombinante (“ADAMTS13rec”) y el sobrenadante de células HEK 293 transfectadas de manera simulada, como control. (Los sobrenadantes de cultivo los suministró el Dr. David Ginsburg, Universidad de Michigan). Se añadieron cantidades variables de los dos sobrenadantes de cultivo al sustrato fluorescente Suc- Leu-Leu-Val-Tyr-AMC 0,8 mM en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 en un

volumen total de 100 l. La figura 5 muestra que se produjo una mayor señal de fluorescencia con el sobrenadante de las células transfectadas frente a las células transfectadas de manera simulada. El aumento de la señal de fluorescencia se debe a la escisión del sustrato por ADAMTS13rec en el sobrenadante de células transfectadas con vector.

Ejemplo 5. Medición de la actividad de ADAMTS13 en plasma

Se midió la actividad de ADAMTS 13 en plasma usando el sustrato Suc-LLVY-AMC. Se añadió plasma normal (50 l) o plasma de PTT adquirida (50 l) al sustrato en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. La concentración final del sustrato era de 0,8 mM; se usó sustrato en tampón como control de fondo. Se incubó la mezcla de reacción a 37°C durante 4 horas y se registró la fluorescencia en un lector de placas espectrofluorométrico a Ex 360 nm/Em 440 nm (figura 6). Se observó una mayor actividad de ADAMTS13 en el plasma normal en comparación con el plasma de PTT adquirida.

Ejemplo 6. Comparición de la actividad de ADAMTS13 en PRP de sujetos normales y con PTT

Se compararon la actividad de ADAMTS 13 de plasma normal y de plasma de PTT adquirida en el ensayo de fluorescencia descrito anteriormente. Específicamente, se diluyeron en serie

20 l de PRP normal 1:2 con PPP normal en pocillos de microtitulación. Se añadieron al PRP ochenta l de LVY-AMC (concentración final 0,2 mM) en tampón Tris-HCl 10 mM, pH 8,0. Se colocó la placa de microtitulación en un lector espectrofluorométrico de placas de microtitulación a 37°C y se monitorizó la fluorescencia a Ex 360 nm/Em 440 nm durante 16 minutos.

Los resultados mostrados en la figura 7 demuestran que, a medida disminuía que la cantidad de PRP en el ensayo, había una disminución en la señal de fluorescencia. En el ensayo, se sometió a prueba el PRP de un paciente al que se le diagnosticó PTT adquirida, en las mismas condiciones que el PRP normal. En este experimento, en el ensayo se usó más plasma del paciente con PTT adquirida (20-60 l), en comparación con el PRP normal. No se generó ninguna señal de fluorescencia a la cantidad mayor de PRP del paciente con PTT adquirida. Esto muestra que la actividad de ADAMTS13 en PRP de un paciente con PTT adquirida tiene significativamente menos actividad que el PRP normal. Este método puede usarse para diagnosticar la deficiencia en la actividad de ADAMTS13.

Ejemplo 7. La actividad de ADAMTS13 se asocia con las plaquetas

Se prepararon PRP y PPP de seis voluntarios normales tal como se describió anteriormente. Se añadieron cincuenta l de cada muestra de plasma a 130 l de tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y 20 l de sustrato Suc-LLVY-AMC 8 mM. Se incubaron las mezclas de reacción a 37° C y se monitorizaron durante 1 hora en un lector de placas espectrofluorométrico a Ex 360 nm/Em 440 nm. Las seis muestras de PRP presentaron alta actividad de ADAMTS13, tal como se manifestó con la generación de una alta señal de fluorescencia (URF) con el tiempo (figura 8).

La tasa de generación de fluorescencia con el tiempo fue significativamente mayor en PRP que en plasma. Tras sedimentar las plaquetas, también se sometió a prueba el PPP de cada sujeto, y presentó muy poca actividad de ADAMTS 13. Estos resultados muestran que la mayoría de la actividad de ADAMTS13 en PRP está presente en las plaquetas y no en el plasma.

Ejemplo 8. La actividad reducida de ADAMTS13 se asocia con las plaquetas humanas de un paciente con PTT adquirida

Se prepararon plaquetas aisladas de un sujeto normal y de un paciente al que se le diagnosticó PTT adquirida tal como se

describió anteriormente. Se pusieron aproximadamente 600 g de proteína en 100 l de tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 de las plaquetas normales y las plaquetas aisladas adquiridas en los pocillos de una placa de microtitulación de fluorescencia. Se añadió sustrato LVY-AMC a cada tubo hasta una concentración final de 0,2 mM y se incubaron las mezclas de reacción a 37°C durante 1 hora. Se monitorizó la fluorescencia a Ex 360 nm/Em 440 nm. La cantidad de actividad de ADAMTS 13 por mg de proteína asociada con plaquetas normales fue significativamente mayor que la asociada con plaquetas de un paciente con PTT adquirida (figura 9). Este método puede usarse para cuantificar la actividad de ADAMTS13 en plaquetas. La baja actividad de ADAMTS 13 indicaría PTT. Tanto la PTT congénita, causada por la mutación o alteración de ADAMTS 13, como la PTT adquirida,

causada por la presencia de anticuerpos inhibidores de ADAMTS 13, pueden diagnosticarse usando este método.

Ejemplo 9. ADAMTS13 asociado con plaquetas está presente en una forma escindida

Se investigó la forma molecular de ADAMTS 13 en plaquetas mediante inmunotinción de inmunotransferencias de tipo Western de proteínas plaquetarias (figura 10). Se solubilizaron plaquetas lavadas en tampón de muestra–SDS con y sin mercaptoetanol. Se realizó electroforesis SDS-PAGE usando gel de acrilamida al 4-20%. Se sometieron a electrotransferencia las proteínas resueltas sobre papel de nailon y se inmunotiñeron con diferentes anticuerpos anti-ADAMTS13 biotinilados y estreptavidina-HRP/TMB. Un anticuerpo de cabra anti-ADAMTS 13 inmunotiñó específicamente bandas de proteína en condiciones reductoras a aproximadamente 120 kD, 43 kD y 30 kD. Usando condiciones no reductoras, se inmunotiñó específicamente una banda de alto peso molecular a aproximadamente 150 kD.

Estos hallazgos sugieren que el ADAMTS 13 en plaquetas se compone de más de una proteína que se mantienen unidas mediante enlaces disulfuro. Se ha notificado que ADAMTS 13 en plasma se compone de una sola proteína de 150-170 kD de peso molecular. El ADAMTS13 asociado con plaquetas es diferente al ADAMTS 13 plasmático, y parece escindirse. Se inmunotiñó el ADAMTS 13 de plaquetas usando plasma de un paciente con PTT adquirida. Se inmunotiñó específicamente una banda de alto peso molecular en condiciones no reductoras. La reducción de la proteína provocó que no se tiñera el ADAMTS13 con este plasma de PTT.

Ejemplo 10. Actividad potenciada de ADAMTS13 plaquetario mediante tratamiento con una enzima proteolítica

El ADAMTS 13 en plaquetas parece que se escinde proteolíticamente en al menos dos o más cadenas polipeptídicas que se mantienen unidas mediante enlaces disulfuro, mientras que el ADAMTS 13 plasmático es una única cadena peptídica. Se sometió a prueba si una peptidasa puede escindir ADAMTS13 y

aumentar la actividad hacia los sustratos peptídicos de ADAMTS

13.

La figura 11 muestra que la actividad de ADAMTS 13 en plaquetas se potencia mediante el tratamiento con FXIa activado por peptidasa. Se resuspendieron plaquetas normales lavadas de 200 l de PRP en 1 ml de tampón de ensayo. Se resuspendieron las plaquetas lavadas de 1 ml de PRP de un sujeto con PTT adquirida en 50 l de tampón de ensayo. Se añadieron plaquetas normales o de PTT (10 l) al tampón de ensayo Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 (80 l) o tampón de ensayo que contenía 0,3 ng/ml de FXIa (80 l). Se añadió sustrato LVY-AMC (10 l de 2 mM) y se monitorizó la fluorescencia (Ex 360 nm/Em 440 nm) durante 1500 segundos. Se usó FXIa a 0,3 ng/ml como control. La actividad de ADAMTS 13 aumentó significativamente (en aproximadamente 8 veces) hacia el sustrato LVY-AMC tras el tratamiento de las plaquetas con FXIa. Se potenció la actividad de las plaquetas aisladas de PRP de un paciente con PTT adquirida mediante el tratamiento con FXIa en un grado mucho menor que las aisladas de PRP de un individuo normal. Esto muestra que los anticuerpos inhibidores en plasma de PTT bloquean la activación de ADAMTS 13 plaquetario por FXIa.

La actividad de las plaquetas tratadas con FXIa hacia LVYAMC se redujo significativamente tras la adición en 1500

segundos de 50 l de plasma de PTT adquirida a la mezcla de reacción, mientras que, la adición de 50 l de plasma normal no tuvo ningún efecto significativo sobre la actividad (figura 12). Estos resultados muestran que la potenciación de la actividad de ADAMTS 13 por FXIa se bloquea mediante anticuerpos antiADAMTS13. Estos hallazgos también muestran que puede potenciarse la actividad de ADAMTS13 mediante el tratamiento con enzimas proteolíticas.

Estos hallazgos sugieren que el ADAMTS 13 presente en plaquetas está en una forma diferente que el que se encuentra en plasma. Los resultados anteriores muestran que el ADAMTS13 plaquetario parece tener una mayor actividad enzimática hacia los sustratos de peptidilo que el ADAMTS13 plasmático. El hallazgo del ADAMTS13 escindido proteolíticamente en plaquetas

puede explicar las diferencias en reactividad del ADAMTS13 unido a plasma y plaquetas hacia los sustratos de peptidilo.

Ejemplo 11. Medición del antígeno de ADAMTS13 en plasma usando ELISA

Se desarrolló un ELISA para medir la proteína ADAMTS13 en líquidos biológicos. Se recubrieron 4 placas de microtitulación de 96 pocillos Immulon (Dynex) con anticuerpo de cabra antiADAMTS13 (2 g/ml) en 100 l de tampón MOPS 50 mM, pH 6,0. Se lavaron las placas y se bloquearon con Superblock (Pierce, IN). Se diluyó en serie una muestra de PNP 1:2 con tampón y se añadieron 100 l a los pocillos de microtitulación. Tras la incubación durante 1 hora a 37°C, se lavó la placa y se añadió a los pocillos de microtitulación inmunoglobulina 0,5 g/ml purificada a partir de plasma obtenido de un paciente con PTT adquirida. Tras la incubación a 37°C durante 1 hora, se lavó la placa y se añadió a los pocillos anticuerpo de asno anti-humano marcado con Ig-HRP (Jackson Laboratories, ME) (1:1000). Tras la incubación durante 1 hora a 37°C, se lavó la placa y se añadió a cada pocillo 100 l de sustrato TMB (Moss Inc, MD). Se incubó la placa a temperatura ambiente durante 5 minutos y se detuvo la reacción añadiendo 50 l de ácido sulfúrico 0,45 M. Se midió la absorbancia a 450 nm. La figura 13 muestra que el aumento en absorbancia fue linealmente proporcional a la cantidad de plasma que contenía ADAMTS13 añadido.

En otro experimento, se determinó la cantidad de proteína ADAMTS 13 en 24 muestras de plasma normal usando el método de ELISA. Los resultados se muestran en la figura 14. Usando PNP como el 100%, se distribuyó el ADAMTS 13 en 24 muestras de plasma normal individuales aproximadamente al valor de PNP. Este método de ELISA puede usarse para determinar la cantidad de ADAMTS 13 en plasma y otros líquidos biológicos.

Ejemplo 12. Inhibición de la actividad de ADAMTS13 recombinante por el anticuerpo de cabra anti-ADAMTS13

Se añadió líquido de cultivo tisular (5 l) de células HEK 293 transfectadas con un vector que codifica para ADAMTS 13 recombinante o líquido de cultivo tisular (5 l) de células HEK 293 transfectadas de manera simulada a 5 g de anticuerpo de cabra anti-ADAMTS 13 (Santa Cruz Biochemicals, Santa Cruz, CA) y sustrato fluorescente Suc-LLVY-AMC 0,8 mM en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 (85 l). Se siguió la fluorescencia (Vmax) en un lector de placas espetrofluorométrico a Ex 360 nm/Em 440 nm (figura 15).

El líquido de cultivo de ADAMTS 13 tuvo más actividad de fluorescencia que el líquido de cultivo transfectado de manera simulada. El anticuerpo de cabra anti-ADAMTS13 inhibió la fluorescencia del líquido con ADAMTS 13 pero no del líquido del cultivo tisular de células transfectadas de manera simulada. Estos resultados muestran que la actividad de fluorescencia del líquido de células transfectadas de manera simulada no se debe a ADAMTS 13.

Ejemplo 13. Inhibición de la actividad de ADAMTS13 recombinante en plasma de PTT adquirida

El plasma de pacientes con PTT adquirida (“plasma de PTT adquirida”) contiene un anticuerpo inhibidor contra ADAMTS 13. La figura 16 muestra que la adición de plasma de PTT al sobrenadante de cultivo tisular que contenía ADAMTS13rec inhibió la generación de una señal de fluorescencia cuando se usó SucLLVY-AMC como sustrato. La cantidad de inhibición de la señal de fluorescencia dependía de la cantidad de plasma de PTT añadido. El plasma de sujetos sanos (“plasma normal”) no inhibió significativamente la actividad de ADAMTS13, en comparación con el plasma de PTT adquirida, demostrando que la actividad de ADAMTS13 se inhibía específicamente por el plasma de PTT adquirida. Estos estudios también muestran que los anticuerpos presentes en los plasmas de PTT adquirida bloquean la hidrólisis del sustrato Suc-LLVY-AMC fluorescente por el ADAMTS13 recombinante.

Ejemplo 14. Inhibición de la actividad de ADAMTS13 en plaquetas aisladas con anticuerpos anti-ADAMTS13

Se centrifugó un ml de PRP a 10.000 rpm y se lavaron las plaquetas en el sedimento con tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8,0. Se suspendieron las plaquetas en 200 l de tampón de ensayo. Se añadieron las plaquetas aisladas (20 l) a 70 l de diversos anticuerpos anti-ADAMTS13 y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se usaron los anticuerpos de cabra G1 y G2 (Santa Cruz Biochemicals, Santa Cruz, CA) a 200 g/ml; se usó el anticuerpo de conejo contra el fragmento C-terminal de ADAMTS 13 (del Dr. Ginsburg) a 5,5 mg/ml. Se usó inmunoglobulina (Ig) purificada procedente de plasma de PTT adquirida a una concentración de 4 mg/ml. Se añadieron noventa l de tampón

Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 y 10 l de LVY-AMC 8 mM y se midió la fluorescencia con el tiempo como anteriormente. Los cuatro anticuerpos específicos anti-ADAMTS 13 inhibieron la actividad de las plaquetas normales (figura 17). Estos hallazgos indicaron que la actividad en plaquetas se debió a que ADAMTS 13 escindía el sustrato LVY-AMC.

Ejemplo 15. Un método para medir anticuerpos anti-ADAMTS13 en plasma usando plaquetas aisladas

Se realizó la detección de autoanticuerpos anti-ADAMTS13 usando plaquetas aisladas como fuente de ADAMTS13. Se incubaron plaquetas aisladas (preparadas a partir de 200 l de PRP normal) con 200 l de plasma normal combinado (PNP) o plasma de PTT adquirida. Se incubaron las mezclas a 37°C durante 30 minutos. Se retiraron cincuenta l de cada mezcla de reacción y se añadieron a 130 l de tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y 20 l de sustrato LVY-AMC 8 mM. Se incubaron las mezclas de reacción durante 30 minutos a 37ºC durante una hora y se monitorizó la fluorescencia en un lector de placas espectrofluorométrico (Ex 360 nm/Em 440 nm). Las plaquetas incubadas con plasma normal tuvieron alta señal de fluorescencia (indicando alta actividad de ADAMTS 13), mientras que las plaquetas incubadas con plasma

de PTT adquirida tuvieron baja señal de fluorescencia (indicando baja actividad de ADAMTS 13) (figura 18). Estos resultados muestran que estaban presentes autoanticuerpos anti-ADAMTS13 en el plasma de PTT adquirida, pero no en el plasma normal, y que pueden detectarse autoanticuerpos en plasma de un paciente con PTT adquirida usando este método. LVY-AMC puede sustituirse por otros sustratos de ADAMTS13 fluorescentes. Este método puede usarse para distinguir en PTT congénita y PTT adquirida.

La figura 19 muestra que el nivel de inhibición de la actividad de ADAMTS 13 en plaquetas depende de la cantidad de autoanticuerpos anti-ADAMTS13 usados en el ensayo, y por tanto, la actividad anti-ADAMTS 13. Se diluyó el plasma de un paciente con PTT adquirida hasta diferentes cantidades (10%, 20% y 40%) con plasma normal y se incubó con plaquetas aisladas en un

volumen total de 90 l durante 15 minutos. Se añadieron diez l de sustrato LVY-AMC 8 mM y se determinó la fluorescencia tras la incubación a 37°C durante 1 hora. La inhibición de la actividad de ADAMTS 13 en plasma de PTT dependía de la cantidad de plasma de PPT usado en el ensayo.

La cantidad de fluorescencia generada con el tiempo en el ensayo depende de la cantidad de plaquetas usadas en el ensayo. Tal como se muestra en la figura 20, se generó una mayor señal fluorescente en el control (plasma normal sin anticuerpos anti- ADAMTS 13) usando más plaquetas. La adición de plasma de PTT adquirida, que contenía anticuerpos frente a ADAMTS 13, inhibió casi completamente la actividad de ADAMTS13, independientemente de la cantidad de plaquetas en el ensayo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para medir la actividad de ADAMTS13 en la

superficie de las plaquetas que comprende: a) incubar una muestra que comprende ADAMTS13 con un sustrato, en el que la muestra es plaquetas lavadas, en el que el sustrato comprende un resto peptídico y un resto cromogénico, en el que el resto peptídico comprende X-Val-Tyr, X-Leu-Tyr o X-De-Tyr, en los que X es cualquier aminoácido, en el que la longitud del péptido es de 3 a 20 aminoácidos de longitud, con la condición de que el resto cromogénico no sea paranitronilina (pNA); y b) medir la densidad óptica de la muestra;

midiendo de ese modo la actividad de ADAMTS 13 en la superficie de las plaquetas.
2.

Método según la reivindicación 1, en el que X es Leu.
3.

Método según la reivindicación 1, en el que el resto peptídico es Leu-Val-Tyr.
4.

Método según la reivindicación 1, en el que el resto peptídico es Leu-Leu-Val-Tyr.
5.

Método según la reivindicación 1, en el que el resto peptídico es Suc-Leu-Leu-Val-Tyr.
6.

Método según la reivindicación 1, en el que el resto cromogénico se selecciona del grupo que consiste en sbencilo, ácido 5-amino-2-nitrobenzoico y 6-amino-1naftalenosulfonamidas.
7.

Método para identificar un inhibidor de ADAMTS 13 en la

superficie de las plaquetas que comprende: a) incubar una muestra que comprende ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas con un inhibidor candidato de ADAPTS13, en el que la muestra es plaquetas lavadas; y b) medir la actividad de ADAMTS13 en la muestra de prueba según el método de la reivindicación 1;

en el que se identifica al inhibidor mediante la actividad de ADAMTS 13 reducida en la superficie de las plaquetas en la muestra en comparación con la actividad de ADAMTS13 en

la superficie de las plaquetas en una muestra control que comprende ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas, en el que la muestra control es plaquetas lavadas, y en el que la muestra control no se incubó con el inhibidor candidato.
8.

Método según la reivindicación 7, en el que X es Leu.
9.

Método según la reivindicación 7, en el que el resto peptídico es Leu-Val-Tyr.
10.

Método según la reivindicación 7, en el que el resto peptídico es Leu-Leu-Val-Tyr.
11.

Método según la reivindicación 7, en el que el resto peptídico es Suc-Leu-Leu-Val-Tyr.
12.

Método según la reivindicación 7, en el que el resto cromogénico se selecciona del grupo que consiste en sbencilo, ácido 5-amino-2-nitrobenzoico y 6-amino-1naftalenosulfonamidas.
13.

Método según la reivindicación 7, en el que el inhibidor candidato procede de una biblioteca de compuestos químicos, una biblioteca de presentación en fago, una biblioteca de químicos naturales o una biblioteca de química combinatoria.
14.

Método según la reivindicación 7, en el que el inhibidor es un anticuerpo.
15.

Uso del método según la reivindicación 1 para diagnosticar púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) en un sujeto, en el que se mide la actividad de ADAMTS 13 en la superficie de las plaquetas en una muestra de prueba del sujeto según el método de la reivindicación 1, en el que la muestra de prueba es plaquetas lavadas; y en el que el método comprende además

c) comparar la actividad de ADAMTS 13 en la superficie de las plaquetas en la muestra de prueba con respecto a la actividad de ADAMTS 13 en la superficie de las plaquetas en una muestra control que tiene actividad de ADAMTS13 normal en la superficie de las plaquetas, en el que la muestra control es plaquetas lavadas;

en el que se diagnóstica PTT mediante la actividad de ADAMTS 13 reducida en la superficie de las plaquetas en la muestra de prueba en comparación con la muestra control.
16.

Uso según la reivindicación 15, en el que X es Leu.
17.

Uso según la reivindicación 15, en el que el resto peptídico es Leu-Val-Tyr.
18.

Uso según la reivindicación 15, en el que el resto peptídico es Leu-Leu-Val-Tyr.
19.

Uso según la reivindicación 15, en el que el resto peptídico es Suc-Leu-Leu-Val-Tyr.
20.

Uso según la reivindicación 15, en el que el resto cromogénico se selecciona del grupo que consiste en sbencilo, ácido 5-amino-2-nitrobenzoico y 6-amino-1naftalenosulfonamidas.
21.

Uso según la reivindicación 15, en el que la PTT es congénita.
22.

Uso según la reivindicación 15, en el que la PTT es adquirida.
23.

Uso del método según la reivindicación 1 para diagnosticar PTT adquirida en un sujeto, en el que se incuba una muestra que comprende ADAMTS13 en la superficie de las plaquetas con plasma del sujeto, en el que la muestra es plaquetas lavadas; y en el que se mide la actividad de ADAPTS13 en la superficie de las plaquetas en la muestra según el método de la reivindicación 1; en el que se diagnóstica PTT adquirida mediante la actividad de ADAMTS 13 reducida en la superficie de las plaquetas en la muestra en comparación con la actividad de ADAMTS 13 en la superficie de las plaquetas en una muestra control que tiene actividad de ADAMTS13 normal en la superficie de las plaquetas.
24.

Uso según la reivindicación 23, en el que X es Leu.
25.

Uso según la reivindicación 23, en el que el resto peptídico es Leu-Val-Tyr.
26.

Uso según la reivindicación 23, en el que el resto peptídico es Leu-Leu-Val-Tyr.
27.

Uso según la reivindicación 23, en el que el resto peptídico es Suc-Leu-Leu-Val-Tyr.
28.

Uso según la reivindicación 23, en el que el resto cromogénico se selecciona del grupo que consiste en s

5 bencilo, ácido 5-amino-2-nitrobenzoico y 6-amino-1naftalenosulfonamidas.
29. Uso del método según la reivindicación 1 para monitorizar el tratamiento de un paciente con PTT, en el que se mide la actividad de ADAMTS 13 en la superficie de las plaquetas

10 según el método de la reivindicación 1 durante el tratamiento del paciente.
30.

Uso según la reivindicación 29, en el que el tratamiento es plasmaféresis.
31.

Uso según la reivindicación 30, en el que el paciente

15 tiene PTT adquirida y en el que la plasmaféresis elimina los inhibidores de ADAMTS13 del paciente.
32. Método según la reivindicación 1, que comprende además añadir factor de coagulación XIa a la muestra.