ES2348961T3 - Composiciones y su uso para aumentar el acceso vascular. - Google Patents

Abstract

Un material implantable que comprende células y una matriz biocompatible para usar en el tratamiento de una fístula arteriovenosa, de un injerto arteriovenoso o de un injerto periférico en derivación en un paciente, que comprende la etapa de ubicar el material implantable sobre una superficie exterior de la fístula o del injerto, en el que el material implantable es eficaz para promover una remodelación segura de la fístula o del injerto, efectuando de ese modo una dilatación vascular con una simultánea inhibición de la hiperplasia de la capa neoíntima venosa.

Description

Antecedentes del invento

El fallo al acceso vascular es la principal complicación en la provisión de asistencia a los pacientes en hemodiálisis para tratar la insuficiencia renal terminal (en adelante ESRD). La tasa de casos actuales de ESRD en los Estados Unidos ha aumentado cada año desde 1980. En 2001, la tasa de casos ya diagnosticados llegó a casi 1.400 pacientes por millón de habitantes, lo que representaba un aumento de un 2,4% con respecto al año anterior. Basándose en los cambios demográficos en edad, raza, etnicidad y estado diabético, se espera que la población de ERSD ya diagnosticados en los Estados Unidos crezca hasta 1,3 millones hacia el año 2030. En la actualidad, aproximadamente un 65% de la población con ERS ya diagnosticada se trata con hemodiálisis (aproximadamente 264.710 pacientes). Entre 1.997 y 2.001, la población con hemodiálisis ya diagnosticada creció un 4,5% al año. Usando datos del programa Medicare, se ha calculado que hacia 2.001 los costes totales de ERSD alcanzaron 15,.500 millones de dólares, lo que suponía un 6,4% de todo el presupuesto del programa Medicare de 242.000 millones (los costes totales alcanzaron los 22.800 millones de dólares de todas las partidas). De hecho, el coste anual de la morbilidad relacionada con el acceso vascular en los Estados Unidos actualmente sobrepasa los 1.000 millones de dólares anuales.

El fallo de acceso vascular es la causa individual más importante de morbilidad en la población de hemodiálisis. Una reciente comunicación que analizó los datos del sistema de datos renales de los Estados Unidos (en adelante USRDS) obtuvo una tasa de patencia primaria global de acceso no asistido de solamente un 53% en 1 año. Las tasas de patencia primaria de acceso no asistido en 1 año fueron el 49% para estructuras de acceso vascular tales como los injertos arteriovenosos que implican puentes protésicos de politetrafluoretileno expandido (en adelante ePTFE) y el 62% para fístulas arteriovenosas. (en adelante AV). Las tasas de patencia acumulada para accesos de primera vez en 1,3 y 5 años fueron el 54%, el 46% y el 36% para fístulas de antebrazo y el 54%, 28% y 0% para injertos de AV, respectivamente. En la actualidad, el uso de injertos que impliquen puentes protésicos de ePTFE asciende al 70% de todas las intervenciones de acceso de hemodiálisis en los Estados Unidos; en la actualidad, la Fundación Nacional del Riñón recomienda que la fístula AV sea el método preferido de acceso vascular. Se espera que en el futuro se produzca un aumento en la proporción de nuevas fístulas AV en los Estados Unidos.

Las autofístulas arteriovenosas se han considerado históricamente como la mejor opción para acceso vascular en los pacientes de hemodiálisis. Cuando una fístula de AV madura de forma satisfactoria tras una creación quirúrgica, podría funcionar durante años con un bajo riesgo de complicaciones y una pequeña incidencia de revisiones. No obstante, las tasas informadas de inmaduración de fístulas de AV varían ampliamente, pero continúan siendo de aproximadamente el 2050%. La inmaduración se define en general como la incapacidad de permitir la canulación repetitiva de la fístula para diálisis o de obtener suficiente flujo sanguíneo para diálisis dentro de las 12 semanas después de la creación quirúrgica. La ocurrencia de inmaduración de fístulas AV puede depender, en parte, de la calidad y tamaño de los vasos usados para formar la fístula AV. Se ha demostrado que la evaluación preoperatoria de las características de los vasos tiene efectos beneficiosos en la identificación de vasos adecuados para la creación de fístulas AV.

El fallo de las estructuras de acceso vascular es atribuible al efecto acumulado de distintos fenómenos agudos y crónicos, especialmente en el denominado “dedo del pie” y sus alrededores corriente adelante. Por ejemplo, los injertos AV podrían desarrollar estenosis en relación de asociación con el injerto y oclusiones en relación de asociación con el injerto en las anastomosis en el lado anastomósico venoso. En una comunicación publicada, el examen histológico de segmentos extraídos de pacientes con estenosis anastomósica en relación de asociación con un injerto reveló una hiperplasia de la capa íntima consistente en células de músculo liso y matriz extracelular. La trombosis del injerto podría contribuir también a la disfunción de acceso vascular en injertos de diálisis de ePTFE. Además, en general el aislamiento de venas y arterias seguido por la exposición del segmento de vena al flujo sanguíneo arterial y la presión puede causar una isquemia inevitable y una lesión por revascularización. La manipulación quirúrgica como la suturación puede resultar también en un trauma directo al endotelio y a las células de músculo liso de los fluidos tanto en las venas como en las arterias. La lesión al endotelio de arteria y vena durante la creación de una anastomosis nativa o de injerto puede influir en la patencia y en tasas de oclusión. Adicionalmente al trauma físico en relación de asociación con el corte y la suturación de venas y arterias durante la formación de una estructura de acceso vascular, un incremento en la tensión de la pared y de la fuerza cortante pueden causar también lesiones físicas y/o bioquímicas al endotelio. Se ha sugerido que la presión arterial podría alterar la producción normal de compuestos reguladores del crecimiento endotelial, así como producir cambios morfológicos y bioquímicos en el fluido de la vena.

La terapia actual para el fallo de acceso vascular es o bien la revisión quirúrgica o bien la angioplastia con o sin endoprótesis. El tratamiento quirúrgico podría ser arriesgado en estos pacientes típicamente multipatológicos y los resultados a largo plazo de la angioplastia y la endoprótesis son generalmente decepcionantes debido a las tasas de fallo propias. Por tanto, el objetivo de un acceso vascular perfeccionado para fines de hemodiálisis así como para la circulación periférica es mantener la integridad anatómica de la zona del injerto original para permitir caudales sanguíneos para el soporte del tratamiento de diálisis o una corriente sanguínea suficiente en zonas de derivación periférica.

Otros factores que contribuyan a la maduración satisfactoria de una estructura de acceso vascular recientemente creada o a la maduración prolongada de una estructura de acceso vascular ya existente siguen siendo difíciles de encontrar. Además, se han llevado a cabo relativamente pocos ensayos clínicos aleatorizados en el campo de la prevención de fallos de acceso vascular. Los estudios que han evaluado las causas del fallo de acceso vascular han llegado a conclusiones inconsecuentes. De hecho, en el momento actual, a pesar de la enormidad de este problema, los médicos no disponen de medidas quirúrgicas, terapéuticas o farmacológicas para la supervivencia prolongada de fístulas de acceso que funcionen. Evidentemente, existe una necesidad de dar un paso al frente en esta zona vital de la atención al paciente.

El documento US 6328762 describe injertos implantables que toman la forma de prótesis tubulares porosas en las que la superficie exterior está recubierta con células adherentes. Este documento no describe la colocación de un implante de matriz celular en una superficie exterior de un vaso a tratar, ni el uso del implante para efectuar una remodelación positiva de una fístula o injerto.

El documento US4820626 describe prótesis tubulares implantables en las que la superficie de contacto está sembrada o revestida con células endoteliales para uso como injertos vasculares. Los injertos no establecen contacto con una superficie exterior de un vaso sanguíneo, sino que en su lugar se injertan quirúrgicamente ( por tanto se integran) en la vasculatura enferma con el fin de mantener la continuidad luminal.

Sumario del invento

El presente invento explota el descubrimiento de que un material implantable que comprende células y una matriz biocompatible, cuando se provee localmente a una estructura de acceso vascular, puede promover la formación o aumentar la maduración de la estructura, así como prolongar la estructura en un estado funcional maduro. De acuerdo con el presente invento, se provee un material implantable tal como se define en las reivindicaciones. El presente invento puede promover eficazmente la integración o aumentar la maduración de una estructura de acceso vascular recientemente creada, promover y sostener la duración funcional de una estructura actual que funcione, y puede ayudar en la recuperación de una estructura malograda o que se malogra..

En el caso de una fístula natural arteriovenosa, el tratamiento de la fibra natural arteriovenosa aumenta la maduración clínica suficiente para permitir la hemodiálisis, reduce el retraso en la maduración de la fístula natural arteriovenosa y promueve la canulación repetitiva. En el caso de un injerto arteriovenoso, el tratamiento del injerto arteriovenoso promueve la estabilidad clínica suficiente para recuperar la circulación normal o casi normal. En varias de las realizaciones, el material implantable reduce la frecuencia de revisión en un paciente que tenga una estructura de acceso.

Una maduración aumentada se caracteriza por una capacidad para canular repetitivamente la fístula para diálisis o por una capacidad para obtener suficiente corriente sanguínea durante la diálisis. Preferiblemente, una corriente sanguínea suficiente comprende un caudal de aproximadamente 350 ml/minuto. La aplicación del material biocompatible a la fístula arteriovenosa podría estar precedida por –o ser coincidente con – un agente terapéutico, una dilatación física o una endoprótesis. La fístula arteriovenosa podría ser radiocefálica, braquiocefálica o braquiobasílica.

En otro aspecto, el invento es un material implantable que comprende células y una matriz biocompatible adecuada para tratar una estructura de acceso vascular. Las células son células endoteliales o células que tienen una fenotipia de aspecto endotelial. La matriz biocompatible es una forma plana flexible o una composición fluible. En una realización particularmente preferida, las células son células endoteliales vasculares. La forma plana flexible está configurada para implantación en, junto a, en las proximidades de una fístula nativa...De acuerdo con una realización, la matriz biocompatible es una composición que conserva la forma.

En otras realizaciones, la matriz biocompatible es una forma plana flexible o una composición fluible. En una realización, la forma plana flexible está configurada para implantación en, junto a, o en las proximidades de una fístula nativa. En ciertas realizaciones, esta forma se configura de tal manera que defina una ranura o una serie de ranuras. Con respecto a la composición fluible, podría ser una composición que conserve la forma.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos, los números análogos de referencia se refieren a las mismas piezas a lo largo de todas las diferentes vistas. Asimismo, los dibujos no están necesariamente a escala o en proporción, habiéndose puesto el énfasis en su lugar en la ilustración de los principios del invento.

La Figura 1 es una vista esquemática en perspectiva de una forma plana flexible de material implantable para su administración a una superficie exterior de una estructura anatómica tubular según una realización ilustrativa del invento.

La Figura 2A es una vista esquemática en perspectiva de una forma plana flexible contorneada de material implantable para su administración a una superficie exterior de una estructura anatómica tubular según una realización ilustrativa del invento.

Las Figura 2B, 2C, 2D, 2E, 2F y 2G son vistas esquemáticas en perspectiva de una forma plana flexible contorneada del material implantable que comprende una ranura según diversas realizaciones ilustrativas del invento.

Las Figuras 3A y 3B son curvas representativas de crecimiento de células según una realización ilustrativa del invento.

Las Figuras 4A, 4B y 4C ilustran una serie de etapas para administrar múltiples presentaciones planas flexibles de material implantable a una superficie exterior de una anastomosis vascular desde una vista en perspectiva desde arriba según una realización ilustrativa del invento.

La Figura 5 es una vista en perspectiva desde arriba de una forma contorneada de material implantable administrado a una superficie exterior de una anastomosis vascular según una realización ilustrativa del invento.

La Figura 6 es una vista en perspectiva desde arriba de una forma plana flexible de material implantable administrado a una estructura anatómica tubular según una realización ilustrativa del invento.

Descripción detallada del invento

Como se ha explicado en la presente memoria, el invento se basa en el descubrimiento de que se puede usar una terapia basada en células para tratar estructuras de acceso vascular. Las enseñanzas presentadas más adelante proveen suficiente guiado para construir y usar los materiales del presente invento, y además proporcionan suficiente guiado para identificar criterios y temas adecuados para ensayar, medir, y monitorizar las prestaciones de los materiales y métodos del presente invento.

De acuerdo con lo anterior, se ha desarrollado una terapia basada en células para gestionar clínicamente las complicaciones de acceso vascular y/o los fallos. Una realización ejemplar del presente invento comprende una matriz biocompatible y unas células adecuadas para uso con los paradigmas de tratamiento descritos en la presente memoria. Específicamente, en una realización preferida, el material implantable comprende una matriz biocompatible y unas células endoteliales o una células parecidas a las células endoteliales. En una realización, el material implantable está en una forma plana flexible y comprende células endoteliales o células parecidas a las endoteliales, preferiblemente células endoteliales aórticas humanas y la esponja de gelatina Gelfoam® de material biocompatible (fabricada por Pfizer, Nueva York, NY, de aquí en adelante “matriz Gelfoam”). De acuerdo con otra realización preferida, el material implantable está en una forma que puede fluir y comprende células endoteliales o células parecidas a las endoteliales, preferiblemente células endoteliales aórticas humanas y partículas o polvo de gelatina Gelfoam® (fabricado por Pfizer, NuevaYork) (en adelante “partículas Gelfoam”) como matriz biocompatible.

El material implantable del presente invento comprende células injertadas sobre, en o dentro de una matriz biocompatible. El término “injertadas” significa fijadas firmemente por medio de interacciones de célula a célula o de célula a matriz para que las células soporten los rigores de las manipulaciones preparatorias descritas en la presente memoria. Como se ha explicado en otra parte de la presente memoria, una realización operativa de material implantable comprende una población de células casi confluentes, confluentes o post-confluentes que tiene una fenotipia preferida. Se entiende que las realizaciones de material implantable probablemente desprenderán células durante las manipulaciones preparatorias y/o que ciertas células no están fijadas tan firmemente como lo están otras células. Todo lo que se requiere es que el material implantable comprenda células que satisfagan los criterios funcionales o fenotípicos especificados en la presente memoria.

El material implantable del presente invento se desarrolló basándose en los principios de la ingeniería de tejidos y representa una novedosa solución para satisfacer las necesidades clínicas anteriormente expuestas. El material implantable del presente invento es único en el sentido de que las células viables injertadas sobre, en o dentro de la matriz biocompatible son capaces de suministrar a la estructura de acceso vascular y a la vasculatura correspondiente múltiples productos basados en células en proporciones fisiológicas bajo control de realimentación fisiológica. Según se describe en otra parte de la presente memoria, las células adecuadas para uso con el material implantable son células endoteliales o parecidas a las endoteliales. La administración local de múltiples compuestos mediante estas células y una dosificación fisiológicamente dinámica proveen una reglamentación más eficaz de los procesos responsables para mantener una estructura funcional de acceso vascular y disminuir las complicaciones o el fallo del acceso vascular. Es un hecho importante que las células endoteliales, por ejemplo, del material implantable del presente invento están protegidas de la corriente sanguínea erosiva dentro de la luz del vaso, debido a su emplazamiento en una superficie no luminal del vaso, por ejemplo, en la túnica adventicia o estableciendo contacto con una superficie exterior de un vaso. El material implantable del presente invento, cuando se envuelve, deposita o establece contacto de otro modo con dicha zona objetivo exterior, es decir, la anastomosis o sus alrededores, sirve para restablecer la homeostasis. Es decir, el material implantable del presente invento puede proveer un entorno que imita la fisiología de soporte y conduce a la formación, maduración, integración o estabilización de estructuras de acceso vascular.

Para los fines del presente invento, el establecimiento de contacto significa interactuar directa o indirectamente con una superficie extraluminal o no luminal según se define en otra parte de la presente memoria. En el caso de ciertas realizaciones preferidas, para lograr efectividad no se requiere un contacto físico real. Todo lo que se requiere para llevar a la práctica el presente invento es el depósito extraluminal o no luminal de un material implantable en, junto a, o en las proximidades de una zona lesionada o enferma en una cantidad efectiva para tratar la zona lesionada o enferma. En el caso de ciertas enfermedades o lesiones, una zona enferma o lesionada puede manifestarse clínicamente sobre una superficie de luz interior. En el caso de otras enfermedades o lesiones, una zona lesionada o enferma se puede manifestar sobre una superficie extraaluminal o no luminal. En algunas enfermedades o lesiones, una zona enferma o lesionada se puede manifestar clínicamente tanto sobre una superficie de luz interior como sobre una superficie extraluminal o no luminal. El presente invento es eficaz para tratar cualquiera de las manifestaciones clínicas anteriores.

Por ejemplo, las células endoteliales pueden liberar una amplia variedad de agentes que, en combinación, pueden inhibir o mitigar eventos fisiológicos adversos en relación de asociación con complicaciones agudas que siguen a la creación de una estructura de acceso vascular. Tal como se ha ejemplificado en la presente memoria, una composición y un método de uso que recapitula la fisiología y dosificación normales son útiles para mejorar la formación, maduración, integración o estabilización de una estructura de acceso vascular, así como para promover la persistencia a largo plazo de tales estructuras de acceso vascular. Típicamente, el tratamiento incluye colocar el material implantable del presente invento en, junto a, o en las proximidades de la zona de la estructura de acceso vascular, por ejemplo, en el espacio perivascular externo a la luz de la arteria y vena implicadas en la intervención. Cuando se envuelvan, envuelvan alrededor, depositen, o establezcan contacto de otro modo con un vaso sanguíneo lesionado, traumatizado o enfermo, las células del material implantable pueden proveer compuestos reguladores del crecimiento a la vasculatura, por ejemplo a las células de músculo liso subyacentes dentro del vaso sanguíneo. Se contempla que, cuando estén situadas en una zona extraluminal, las células del material implantable proveen un suministro continuo de múltiples compuestos reguladores que pueden penetrar el tejido del vaso y llegar a la luz, y todavía las células están protegidas de los efectos mecánicos adversos de la corriente sanguínea en el vaso (o en los vasos). Tal como se describe en la presente memoria, una zona extraluminal preferida es una superficie exterior de un vaso sanguíneo.

El tratamiento con una realización preferida del presente invento puede estimular la cicatrización normal o casi normal y la fisiología normal. Por el contrario, en ausencia del tratamiento con una realización preferida del presente invento, se perjudica la cicatrización fisiológica normal, por ejemplo, las células endoteliales naturales y las células de músculo liso pueden crecer anormalmente a un ritmo exuberante o incontrolado después de la creación de una estructura de acceso vascular, lo que conduce a consecuencias clínicas adversas, incluyendo el fallo de la estructura de acceso vascular. De acuerdo con esto, tal como se contempla en la presente memoria, el tratamiento con el material implantable del presente invento mejorará la cicatrización del tejido natural en la zona (o zonas ) de la anastomosis para mantener la persistencia de la estructura de acceso vascular.

Para los fines del presente invento, las estructuras de acceso vascular se podrían conformar en una variedad de configuraciones. Las estructuras de acceso vascular pueden incluir fístulas arteriovenosas, injertos arteriovenosos, injertos de derivación periféricos, catéteres venosos permanentes, orificios vasculares permanentes, todos ellos que se produzcan naturalmente o creados quirúrgicamente, u otras estructuras anastomósicas vasculares creadas para mejorar el acceso vascular en un paciente. Adicionalmente, varias realizaciones de estructuras de acceso vascular se forman en una variedad de configuraciones que incluyen anastomosis laterolaterales, anastomosis terminolaterales, anastomosis terminoterminales, y anastomosis lateroterminales Las estructuras de acceso vascular se pueden colocar también en una variedad de ubicaciones anatómicas.

El material implantable del presente invento se puede situar en una variedad de configuraciones en la estructura de acceso vascular que se va a tratar. Según ciertas realizaciones, el material implantable del presente invento se puede colocar tanto en la unión anastomósica como también en el segmento de vena proximal, distal a la anastomosis. En otras realizaciones, el material implantable del presente invento se puede colocar en el segmento arterial, en el segmento de vena proximal, o puenteando la estructura de acceso vascular. En otra realización, el material implantable se puede colocar también en el material del injerto o en una parte del material del injerto en la unión anastomósica. Los vasos se pueden contactar total o parcialmente, por ejemplo, el material implantable del presente invento se puede aplicar a los vasos circunferencialmente o en una configuración de arco. Un vaso o una estructura de acceso vascular necesitan solamente estar en contacto con una cantidad de material implantable suficiente para mejorar la formación, maduración, integración o estabilización de la estructura de acceso vascular.

Fístula arteriovenosa

Según determinadas realizaciones, una fístula arteriovenosa (en adelante “fístula AV”) creada para acceso vascular se puede tratar con el material implantable del presente invento. Una fístula AV se puede colocar en una variedad de ubicaciones dentro de un paciente, que incluyen, por ejemplo, colocación en el cuello, en la muñeca, en el antebrazo y en el brazo. Las configuraciones clínicas de fístulas AV incluyen fístulas radiocefálicas (entre la arteria radial y la vena cefálica), fístulas Brescia-Cimino (una anastomosis laterolateral de la arteria radial y de la vena cefálica dentro de la muñeca), fístulas braquiocefálicas (entre la arteria braquial y la vena cefálica), fístulas braquial-antecubitales (entre la arteria braquial y la vena cefálica), fístulas braquiobasílicas, (una vena basílica traspuesta), fístulas cubitalcefálicas (entre la arteria cubital y la vena cefálica) y fístulas del asa safena (vena safena y lado derecho de la arteria femoral).

Como consecuencia de la cirugía de las fístulas AV se producen complicaciones típicamente durante tres fases. Estas fases son una fase aguda, que a menudo se caracteriza por una trombosis, una fase intermedia, cuyo distintivo clínico es un fallo de la fístula en su maduración, y por último un fallo más crónico de una fístula en funcionamiento, ya establecida, que, por ejemplo, puede deberse a una estenosis venosa progresiva.

Las características de la maduración de las fístulas AV incluyen, por ejemplo, la capacidad para canular repetitivamente la fístula para diálisis. Otra característica de la maduración de una fístula AV es la capacidad de obtener suficiente corriente sanguínea que sea útil para hemodiálisis. Una corriente sanguínea adecuada es como mínimo un caudal adecuado para soportar diálisis usando una máquina de diálisis de tal manera que no se produzca recirculación. Una corriente sanguínea de diálisis suficiente para los fines del presente invento es una corriente sanguínea de al menos aproximadamente 350 ml/minuto en un punto de tiempo no mayor de 24 semanas, preferiblemente más de 20 semanas, con más preferencia 16 semanas, y con la máxima preferencia doce semanas después de la creación de la fístula. Actualmente, se entiende que los mecanismos de fallo de las fístulas AV para madurar incluyen, por ejemplo, trombosis precoz de los vasos de la fístula, estenosis en o cerca de la zona anastomósica, la presencia de venas secundarias, incluyendo ramificaciones laterales

o colaterales de venas, tamaño inadecuado de la vena, incluyendo un diámetro interno de vena inadecuado, y fallo tardío de fístula debido a estenosis progresiva. Las venas secundarias pueden prevenir el desarrollo de la fístula mediante la desviación de la corriente sanguínea y no permitiendo que la vena en relación de asociación con la fístula llegue a tener un tamaño adecuado para hacer posible la canulación. En la actualidad se piensa que las venas secundarias se podrían desarrollar, por ejemplo, en respuesta a la presencia de estenosis en la fístula. Los mecanismos de la maduración de las fístulas AV son multimodales y en general requieren el establecimiento de múltiples indicios clínicos. La ausencia de estenosis es generalmente una indicación insuficiente de una fístula AV madura.

Además, una fístula AV que se considere adecuada para el objeto de la diálisis requiere tanto la maduración del tejido, esos cambios que se producen en el segmento de vena de la fístula que permiten que la fístula sea repetitivamente canulada, como una corriente sanguínea suficiente para soportar la diálisis. Una fístula AV puede permanecer persistente incluso cuando hay muy poca corriente sanguínea, pero una fístula AV persistente podría no ser clínicamente adecuada para diálisis. Para los fines del presente invento, una corriente sanguínea clínicamente adecuada para diálisis es de aproximadamente 150-500 ml/minuto, preferiblemente alrededor de 300-500 ml/minuto, y con máxima preferencia aproximadamente 350-400 ml/minuto; son presiones de sangre adecuadas aproximadamente de 50-180 mmHG, preferiblemente alrededor de 50-120 mmHg.

Para los fines del presente invento, se cree que el tratamiento con el material implantable del presente invento provee un entorno homeostático suficiente para que las complicaciones comunes en la maduración de fístulas AV, por ejemplo, trombosis, estenosis, coagulación o el crecimiento de venas secundarias se reduzcan cuando el material se coloque junto a – o en las proximidades de – la fístula, bien en el momento de la creación de la fístula, o bien en una fase posterior. Este tipo de entorno beneficioso permite que una fístula AV proceda a la maduración o permanezca en una fase madura. Por ejemplo, la maduración se establece funcionalmente cuando la vena de la fístula AV aumenta su espesor y es capaz de conducir un alto caudal sanguíneo a presión elevada. El tratamiento de una fístula AV con el material implantable provisto para el presente invento mejora la maduración de la fístula o impide que la fístula no pueda madurar. Se entiende que, para los fines del presente invento, esta mejora de la maduración de la fístula AV incluye cualquier perfeccionamiento en el funcionamiento de la fístula, incluyendo su formación, el tiempo requerido para alcanzar un estado funcional, así como el mantenimiento de la fístula en una forma madura.

Una trombosis post-operatoria inmediata puede prevenir la formación de una fístula AV persistente y dar lugar a un fallo prematuro de la fístula. Según se explica en la presente memoria, el tratamiento con el material implantable del presente invento en el momento de la intervención quirúrgica puede impedir el fallo inmediato de la fístula debido a una trombosis post-operatoria. Por ejemplo, el material implantable libera mediadores antitrombósicos que reducen la trombosis y pueden mantener una fístula persistente a través de las fases de formación y maduración de la fístula.

La colocación del material implantable en o en las proximidades de la zona de la fístula AV en el momento de la intervención quirúrgica puede también mejorar la maduración mediante la reducción de estenosis en o cerca de las anastomosis de la fístula, permitiendo que la fístula llegue a ser de un tamaño adecuado para proveer una corriente sanguínea suficiente para soportar la diálisis, facilitar la dilatación arterial y venosa, disminuir la formación de venas secundarias parasitarias, mantener las venas nativas secundarias para mejorar la maduración de la fístula, y mejorar el tamaño de la vena.

Adicionalmente, una fístula AV requiere un período de tiempo más largo para llegar a la maduración que un injerto AV. Durante el período de maduración de la fístula, se realiza en general una hemodiálisis usando un catéter percutáneo o permanente, lo que conduce a un mayor riesgo de infección y compromete la permeabilidad central de la vena. La colocación del material implantable en la zona de una fístula AV en el momento de la creación de la fístula puede reducir el tiempo requerido para la maduración de la fístula, disminuyendo de ese modo los riesgos correspondientes de infección y la persistencia central comprometida de la vena. La colocación del material implantable en la zona de un catéter permanente . puede reducir el riesgo de trombosis, la hiperplasia de la capa íntima y la reestenosis en relación de asociación con el catéter permanente, reduciendo de ese modo los riesgos de infección y la persistencia central comprometida de la vena-

Por último, el uso del material implantable descrito en la presente memoria puede disminuir el fallo tardío de una fístula AV madura. Una fístula madura podría experimentar una disminución de la corriente sanguínea y un aumento de la estenosis venosa debido a la estenosis progresiva tardía. La estenosis, u oclusión de una fístula hasta un grado suficiente para reducir la corriente sanguínea por debajo de un nivel necesario para la diálisis, podría requerir una angioplastia intervencionista o una endoprótesis de la fístula para restaurar los niveles adecuados de corriente sanguínea. Tales terapias intervencionistas aumentan el riesgo de estenosis venosa y de la oclusión, impidiendo además la formación de una fístula AV madura. Además, la endoprótesis puede resultar en trombosis oclusiva o en reestenosis del vaso tratado en la parte del vaso distal y proximal a la endoprótesis, a lo que frecuentemente se hace referencia como efectos de borde.

La aplicación del material implantable resulta en una remodelación segura (una combinación de dilatación vascular con una inhibición simultánea de hiperplasia de la capa neoíntima venosa), previniendo de ese modo la estenosis progresiva tardía, aumentando la corriente sanguínea de la fístula madura, reduciendo la necesidad de una angioplastia rehabilitadora o la endoprótesis de una fístula ocluida, previniendo los efectos de borde en relación de asociación con la endoprótesis, y prolongando la duración y la capacidad de utilización de la fístula madura.

El material implantable del presente invento se puede proveer a la fístula en cualquiera de una serie de etapas distintas. Por ejemplo, en el momento de la cirugía puede prevenir que la fístula AV falle en su maduración o puede mejorar la maduración de la fístula. El material implantable se puede proveer también después de la intervención quirúrgica inicial para acelerar la cicatrización en general, así como después que se haya formado una fístula AV madura para mantenerla en un estado clínicamente estable. Adicionalmente, el material implantable puede también rescatar una fístula AV madura que subsiguientemente falle o puede prolongar la duración de una fístula madura. Estos casos son ejemplos sin carácter limitativo de la mejora de la maduración de una fístula AV. De acuerdo con esto, se contempla que el material implantable se pueda usar no solamente en el momento de la cirugía inicial para crear la fístula AV, sino también en momentos subsiguientes (por ejemplo, para mantener una fístula madura o rescatar una fístula madura para que no falle). Las administraciones subsiguientes se pueden realizar quirúrgicamente o de forma no invasora.

Injerto arteriovenoso. De acuerdo con realizaciones adicionales, un injerto arteriovenoso (en adelante “injerto AV”), creado para acceso vascular se puede tratar con material implantable del presente invento. Un injerto AV puede estar en la forma de un injerto recto de antebrazo, un injerto de asa de antebrazo o un injerto braquial. Las zonas eferentes de arteria incluyen, sin carácter limitativo, la arteria carótida común, la arteria radial en la muñeca, la arteria braquial en la fosa antecubital, la arteria braquial en la parte inferior del brazo, la arteria braquial justo por debajo de la axila, la arteria axilar y la arteria femoral. Las zonas eferentes de venas incluyen, sin carácter limitativo, la vena antecubital mediana, la vena cefálica proximal, la vena cefálica distal, la vena basílica en el nivel del codo, la vena basílica en el nivel del brazo superior, la vena axilar, la vena yugular y la vena femoral. Entre las ubicaciones adicionales, arteriales y venosas, adecuadas para la formación de un injerto AV, se incluyen la pared torácica (arteria axilar hasta la vena subclavia), las extremidades inferiores (arteria/vena femoral, vena safena, o arteria tibial (anterior)), la aorta hasta la vena cava, la arteria axilar hasta la vena femoral o la arteria femoral hasta la vena axilar.

Para los fines del presente invento, un injerto AV funcional que implica un puente protésico adecuado para diálisis es capaz de conducir sangre de alto caudal y alta presión a través del puente protésico. En dichos injertos AV, el caudal de la sangre en la región eferente venosa del injerto es sustancialmente similar al caudal de la sangre corriente atrás de la región eferente del injerto. Los caudales de sangre adecuados para diálisis son aproximadamente 150-500 ml(minuto, preferiblemente alrededor de 300-500 ml/minuto, y con la máxima preferencia aproximadamente 350400 ml/minuto; las presiones de sangre adecuadas son aproximadamente de 50-180 mmHg, preferiblemente 50-120 mmHg.

Los injertos AV generalmente fallan debido a la hiperplasia de la íntima en relación de asociación con el injerto seguida de una trombosis en relación de asociación con el injerto en la anastomosis del injerto venoso o en el segmento venoso proximal. Los injertos AV son también vulnerables al fallo debido a una deficiente integración del tejido entre los vasos nativos y el material del puente protésico y a la eventual dehiscencia del material del puente desde los vasos.

Para los fines del presente invento, el tratamiento con el material implantable del presente invento provee un entorno homeostásico beneficioso de tal manera que las complicaciones en relación de asociación con la integración y maduración del injerto , por ejemplo, trombosis, estenosis, coagulación, y/o dehiscencia se reducen, ya sea en el momento de la creación del injerto, o en una fase posterior. Este tipo de entorno beneficioso permite que los vasos sanguíneos en relación de asociación con un injerto AV se integren plenamente con el material del puente protésico. Por ejemplo, la maduración se establece funcionalmente cuando el injerto AV se integra y es capaz de conducir sangre con alta presión y un caudal elevado. Como se muestra en la presente memoria, el tratamiento de un injerto AV con material implantable mejora la integración y la maduración del injerto. Para los fines de este invento, se entiende que la mejora de la integración y maduración de un injerto AV incluye cualquier perfeccionamiento en el funcionamiento del injerto, incluyendo la formación, el tiempo requerido para alcanzar un estado funcional, así como el mantenimiento del injerto en una forma funcional

La trombosis post-operatoria inmediata en relación de asociación con un injerto puede prevenir la integración del tejido y la eventual formación de un injerto AV persistente, y puede dar lugar a un fallo prematuro del injerto. Según se explica en la presente memoria, el tratamiento en el momento de la intervención quirúrgica puede prevenir el fallo inmediato del injerto AV debido a una trombosis postoperatoria. Por ejemplo, el material implantable libera mediadores anti-trombósicos que reducen la trombosis y mantienen un injerto no obstruido a través de las fases de integración y maduración del injerto.

La colocación del material implantable en, junto a, o en las proximidades de la anastomosis de injerto AV; en, junto a, o en las proximidades de la región aferente venosa del injerto; o en las proximidades del injerto en el momento de la intervención quirúrgica puede mejorar también la integración y la maduración mediante la reducción de la trombosis inmediata y la estenosis progresiva en o cerca de las anastomosis del injerto. Este efecto terapéutico permite al injerto un tiempo suficiente para llegar a estar adecuadamente integrado con el material del puente protésico, minimiza la trombosis y la oclusión del vaso sanguíneo, y mantiene un diámetro interno adecuado del vaso para soportar una corriente sanguínea suficiente para la diálisis.

La administración del material implantable puede también minimizar el fallo tardío de un injerto AV maduro. Un injerto maduro puede experimentar una disminución de corriente sanguínea y un aumento de estenosis venosa debidos a la estenosis progresiva tardía. La aplicación del material implantable puede resultar en una remodelación venosa segura (una combinación de dilatación vascular con una inhibición simultánea de la hiperplasia de la capa neoíntima venosa), impidiendo de ese modo la estenosis progresiva tardía, aumentando la corriente sanguínea del injerto maduro y prolongando la duración y capacidad de utilización del injerto maduro.

Según se ha demostrado en la presente memoria, el tratamiento de una anastomosis de injerto AV con el material implantable del presente invento promueve la formación de un injerto AV funcional adecuado para diálisis. Se entiende además que, para los fines del presente invento, la formación de un injerto AV funcional incluye cualquier perfeccionamiento en el funcionamiento clínico del injerto, o en el proceso de formación de las anastomosis de injerto o en la integración del puente protésico, o el mantenimiento de las anastomosis del injerto en una forma madura, incluyendo una reducción en la incidencia de dehiscencia.

Como reconocen perfectamente los facultativos clínicos, la eficacia de un injerto AV requiere que un injerto soporte y mantenga una corriente sanguínea adecuada. En el caso de injertos AV útiles para diálisis, una corriente sanguínea adecuada es al menos un caudal adecuado para soportar la diálisis usando una máquina de diálisis de tal manera que no se produzca recirculación. Un injerto AV que ha fallado clínicamente es un injerto que no puede soportar una corriente sanguínea adecuada para soportar una diálisis. Se espera que una realización preferida del presente invento retrasará el comienzo del -o disminuirá el -fallo de un injerto AV mediante la promoción de la formación de un injerto AV funcional que pueda soportar una corriente sanguínea adecuada para diálisis.

Injerto periférico en derivación. De acuerdo con realizaciones adicionales, un injerto periférico creado para poner en derivación un vaso sanguíneo periférico que falla se puede tratar con el material implantable del presente invento. Un injerto periférico en derivación se puede colocar en una variedad de ubicaciones anatómicas, incluyendo las extremidades tales como una región de la pierna por encima o por debajo de la rodilla. Se puede usar un injerto periférico en derivación para poner en derivación un vaso periférico bloqueado, incluyendo un bloqueo en una arteria o vena periféricas. Un injerto periférico en derivación se puede usar para restablecer y/o mantener la corriente sanguínea normal a las extremidades, por ejemplo, un caudal de corriente sanguínea suficiente para mantener una circulación periférica normal o casi normal. Según ciertas realizaciones, el injerto periférico en derivación se forma desde por encima de la región del bloqueo hasta por debajo de la región de bloqueo. En ciertas realizaciones, el presente invento se puede usar para perfeccionar la funcionalidad, integración, maduración y/o estabilización de una derivación periférica que comprenda materiales nativos; en ciertas otras, el injerto tiene un puente protésico.

En el caso de un injerto periférico en derivación, el material implantable se puede colocar en una superficie exterior del vaso sanguíneo en uno o en los dos extremos del injerto o sobre una superficie exterior del material del injerto. En ciertas realizaciones, el material implantable puede contactar con la unión del injerto periférico en derivación en uno o en ambos extremos. En ciertas otras realizaciones, el implante se puede colocar en una parte exterior del flujo sanguíneo corriente atrás del injerto periférico en derivación.

La colocación de una realización preferida del material implantable en o cerca de las regiones del flujo de entrada o del flujo de salida de un injerto periférico en derivación en el momento de la intervención quirúrgica puede mejorar también la formación de un injerto funcional, promover la integración o prevenir la dehiscencia. Para los fines del presente invento, un injerto periférico funcional en derivación es capaz de conducir una corriente sanguínea normal a presiones normales. Los caudales normales para un injerto en derivación por debajo de la rodilla son aproximadamente 50-150 ml/minuto, preferiblemente alrededor de 80-100 ml/minuto; por encima de la rodilla, aproximadamente 50-150 ml/minuto, preferiblemente alrededor de 80-100 ml/minuto,; para los injertos pedios, aproximadamente 25-30 ml/minuto. Las presiones sanguíneas adecuadas son aproximadamente de 50-180 mmHg, preferiblemente alrededor de 50-120 mmHg.

En el caso de injertos periféricos en derivación tratados según se describe en la presente memoria, el caudal de salida es sustancialmente similar al caudal de entrada. El presente invento recupera la corriente sanguínea adecuada a las extremidades inferiores y disminuye los síntomas en relación de asociación con una corriente sanguínea inadecuada a las extremidades inferiores. Una realización preferida del presente invento retrasa el comienzo del -o disminuye, el fallo de -un injerto periférico en derivación mediante la formación de un injerto periférico funcional en derivación con una corriente sanguínea suficiente para mantener la circulación periférica.

Para los fines del presente invento, cualquier material de puente protésico es adecuado para crear una estructura de acceso vascular, con tal que soporte los caudales y presiones sanguíneas requeridos para hemodiálisis, en el caso de los injertos AV, y que soporte los caudales y presiones sanguíneas requeridos para la circulación periférica, en el caso de los injertos periféricos en derivación. Típicamente, los puentes protésicos son preferiblemente flexibles y compatibles con la integración celular, y de las dimensiones apropiadas para soportar los caudales sanguíneos requeridos. Una realización preferida utiliza un puente de PTFE, o un puente de ePTFE; otra utiliza Dacron® (fabricado por E.I. duPont de Nemours and Co.). Los puentes protésicos se pueden construir también de materiales de PTFE modificado, poliuretano, PTFE revestido de carbono, e injertos de materiales compuestos. Los injertos de PTFE se pueden realizar en una variedad de configuraciones físicas que incluyen los estrechados progresivamente, estirados, acanalados, lisos, y con múltiples niveles de PTFE. Los injertos protésicos pueden incluir también modificaciones distales que incluyan parches venosos, collarines, de pico de pato, interpuestos entre la arteria y la fístula. Realizaciones adicionales pueden incluir materiales nativos tales como injertos para vena safena, injertos para vena umbilical, aloinjertos para vena femoral, y xenoinjertos biológicos, incluyendo los injertos para vena carótida bovina y vena mesentérica bovina.

Adicionalmente y de un modo importante, en el caso de un injerto AV o de un injerto periférico en derivación, un ritmo normal o casi normal de cicatrización estimula a las células endoteliales a poblar las superficies luminales del puente protésico, facilitando de ese modo la integración del injerto y de la vasculatura en relación de asociación con el mismo. Para estimular la integración, los factores terapéuticos provistos por las células del material implantable se difunden en las paredes de los vasos. En el caso de un material sintético para injerto, la porosidad del material sintético puede afectar también a la capacidad de los factores terapéuticos para llegar a las células que proliferan en la superficie luminal de un injerto sintético.

Injerto de PTFE. En ciertas realizaciones preferidas, se usa un tubo de 15-25 cm. de longitud y 6 mm de diámetro interior para formar el injerto (injerto de PTFE pared estándar Atrium Advanta VS, 0,6 mm, Atrium Medical Corp., Hudson, NH). El PTFE, un material de injerto particularmente preferido, es un polímero flexible que ha demostrado no ser trombógeno cuando se usa en intervenciones quirúrgicas. Se contempla que los materiales de polímeros alternativos, como el Dacron®, que tiene propiedades similares a las del PTFE, se podrían usar también como materiales de injerto.

El injerto se podría cortar a una longitud que se desee para facilitar su colocación precisa en un paciente determinado. El injerto podría ser un injerto de asa para antebrazo o un injerto recto. Los extremos del injerto se podrían cortar formando un ángulo, con pestañas, o en otra configuración, suficiente para aumentar el área de superficie de los extremos del injerto para suturar o para perfeccionar la acomodación del injerto por el paciente determinado. Los extremos del injerto se podrían también hacer rugosos o modificar de otro modo para facilitar la adherencia de las células. Adicionalmente, el material del injerto se podría recubrir con gelatina, albúmina, u otro agente terapéutico.

Por último, la provisión de material implantable a un injerto AV o a un injerto periférico en derivación que hayan fallado o que fallen puede resultar en la rehabilitación del injerto original recuperando de ese modo la funcionalidad del injerto. En una circunstancia relacionada con el caso, una fístula AV nativa que haya fallado se puede reemplazar con un injerto AV en combinación con el material implantable del presente invento como una terapia intervencionista.

Consideraciones generales..En ciertas realizaciones del invento, se administraron agentes terapéuticos adicionales antes de, coincidiendo con, o después de la administración del material implantable. Por ejemplo, se pueden administrar agentes que impidan o disminuyan la formación de coágulos de sangre, la agregación de trombocitos u otros bloqueos similares. Entre los agentes ejemplares se incluyen, por ejemplo, el sulfato de heparán y el factor de crecimiento transformante (en adelante TGF) �. Se pueden incorporar también al material implantable otras citocinas

o factores de crecimiento, dependiendo de la indicación clínica que necesite el implante, incluyendo el factor de crecimiento endotelialvascular (en adelante VEGF) para promover la re-endoteliacización y el factor de crecimiento de fibroblastos-b (en adelante FGF-b) para promover la integración del injerto. Otros tipos de agentes terapéuticos incluyen, sin carácter limitativo, agentes anti-inductores de la proliferación, y agentes antineoplásicos. Entre los ejemplos se incluyen la rapamicina, el paclitaxel y el agente E2F Decoy. Cualquiera de los agentes anteriores se puede administrar localmente o de forma generalizada; si se administra localmente, ciertos agentes pueden contenerse dentro del material implantable o contribuirse mediante las células.

Adicionalmente, se pueden administrar agentes con remodelación de tejido segura que actúe como mediadora en combinación con las realizaciones de material implantable descritas en la presente memoria. Por ejemplo, ciertos agentes pueden promover una regeneración de luz normal o similar a la normal o una remodelación del tejido luminal en una zona de lesión vascular, incluyendo zonas quirúrgicas. De nuevo en este caso, dichos agentes pueden estar contenidos dentro del material implantable

o contribuirse mediante las células, por el espesor de las paredes de los vasos, manteniendo el diámetro de luz, o una combinación de lo anterior, en donde el método comprende la etapa de ubicar el material implantable en, junto a o en las proximidades de la estructura de acceso vascular en una cantidad eficaz para cumplir con uno o más de los anteriores criterios de valoración.

El material implantable del presente invento se puede aplicar a cualquier estructura anatómica tubular que requiera terapia intervencionista para mantener la homeostasis. Las estructuras anatómicas tubulares incluyen estructuras del sistema vascular, sistema reproductivo, sistema genitourinario, sistema gastrointestinal, sistema pulmonar, sistema respiratorio y sistema ventricular del cerebro y de la médula espinal. Según se contempla en la presente memoria, las estructuras anatómicas tubulares son las que tienen una superficie luminal interior y una superficie extraluminal. Para los fines del presente invento, una superficie extraluminal puede ser, sin carácter limitativo, una superficie exterior de una estructura tubular. En ciertas estructuras, la superficie luminal interior es un estrato de células endoteliales; en otras determinadas estructuras, la superficie luminal interior es un estrato de células no endoteliales.

Fuente de células.

Como se describe en la presente memoria, el material implantable del presente invento comprende células de aloinjerto, de xenoinjerto o autógenas. En ciertas realizaciones, se puede obtener de células vivas de un donante adecuado. En otras realizaciones determinadas, se puede obtener una fuente de células de un cadáver o de un banco de células.

En una realización actualmente preferida, las células son células endoteliales. En una realización particularmente preferida, dichas células endoteliales se obtienen a partir de tejido vascular, preferiblemente (sin carácter limitativo) de tejido arterial. Según se ejemplifica más adelante, un tipo de célula endotelial vascular que es adecuada para usar es una célula endotelial aórtica. Otro tipo de célula endotelial vascular que es adecuada para usar son las células endoteliales de venas de cordón umbilical. Y, otro tipo de células endoteliales vasculares que son adecuada para usar son las células endoteliales de la arteria coronaria. Todavía otros tipos de células endoteliales vasculares que son adecuadas para usar con el presente invento incluyen las células endoteliales de arteria pulmonar y las células endoteliales de arteria iliaca.

En otra realización actualmente preferida, se pueden obtener células endoteliales adecuadas a partir de tejido no vascular. El tejido no vascular se puede obtener a partir de cualquier estructura anatómica tubular según se describe en otra parte de la presente memoria, o bien se pueden obtener a partir de cualquier tejido u órgano no vascular.

En todavía otra realización, las células endoteliales se pueden obtener a partir de células progenitoras o células madre; en todavía otra realización, las células endoteliales se pueden obtener a partir de células progenitoras o células madre en general. En otras realizaciones preferidas, las células pueden ser células no endoteliales que sean de aloinjerto, de xenoinjerto o autógenas obtenidas de un órgano o tejido vascular o no vascular. El presente invento contempla también cualquiera de las anteriormente indicadas que sean genéticamente alteradas, modificadas o manipuladas.

En una realización adicional, dos o más tipos de células se cultivan conjuntamente para preparar la actual composición. Por ejemplo, una primera célula se puede introducir en el material implantable biocompatible y cultivarse hasta que sea confluente. El primer tipo de célula puede incluir, por ejemplo, células de músculo liso, fibrocitos, células madre, células progenitoras endoteliales, una combinación de células de músculo liso y fibrocitos, y cualquier otro tipo de células que se desee o una combinación de tipos de células que se deseen que sean adecuados para crear un entorno que conduzca a un desarrollo de células endoteliales. Una vez que el primer tipo ha llegado a la confluencia, se siembra un segundo tipo de células sobre la parte superior del primer tipo de células confluentes en, sobre o dentro del material biocompatible y se cultivan hasta que ambos tipos primero y segundo de células hayan llegado a la confluencia. El segundo tipo de células podría incluir, por ejemplo, células endoteliales o cualquier tipo deseado de células o combinación de tipos de células que se desee. Se contemplan que los tipos primero y segundo de células se puedan introducir de forma escalonada, o bien como una sola mezcla. Se contempla también que se pueda modificar la densidad de células o alterar la relación entre células de músculo liso y células endoteliales.

Para prevenir la sobre-proliferación de células de músculo liso o de otros tipos de células propensas a una proliferación excesiva, se puede modificar el procedimiento de cultivo. Por ejemplo, siguiendo a la confluencia del primer tipo de células, el cultivo se puede recubrir con un factor de fijación adecuado para el segundo tipo de células antes de la introducción de este segundo tipo de célula. Entre los factores de fijación ejemplares se incluyen el recubrimiento del cultivo con gelatina para mejorar la fijación de las células endoteliales. De acuerdo con otra realización, se puede añadir heparina a los medios de cultivo durante el cultivo del segundo tipo de células para reducir la proliferación del segundo tipo de células y optimizar la relación prevista entre el primer tipo de células y el segundo tipo de células. Por ejemplo, después de un crecimiento inicial de células de músculo liso, se puede administrar heparina para controlar el desarrollo de células de músculo liso con el fin de conseguir una relación mejor entre las células endoteliales y las células de músculo liso.

En una realización preferida, se crea un co-cultivo sembrando en primer lugar un material implantable biocompatible con células de músculo liso para crear estructuras de vasos. Una vez que las células de músculo liso han llegado a la confluencia, se siembran células endoteliales sobre la parte superior de las células de músculo liso cultivadas en el material implantable para crear un vaso sanguíneo simulado. Esta realización se puede administrar, por ejemplo, a un injerto AV o a un injerto periférico en derivación de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria para promover la integración del material de injerto protésico.

Todo lo que se requiere de las células del presente invento es que presenten uno o más fenotipos o propiedades funcionales preferidos. Según se ha descrito antes en la presente memoria, el presente invento se basa en el descubrimiento de que una célula que tenga un fenotipo fácilmente identificable cuando esté en una relación de asociación con una matriz preferida (que se ha descrito en otra parte de la presente memoria) pueda facilitar, restablecer o modular de otro modo la fisiología de las células endoteliales vasculares o la homeostasis luminal en relación de asociación con el tratamiento de estructuras de acceso vascular tales como fístulas arteriovenosas o injertos arteriovenosas.

Para los fines del presente invento, uno de dichos fenotipos preferidos y fácilmente identificables de células del presente invento es una capacidad para inhibir

o interferir de otro modo con la proliferación de células de músculo liso vasculares tal como se haya medido en los ensayos in vitro descritos más adelante. A este fenotipo se hará referencia en la presente memoria como el “fenotipo inhibidor”.

Otro fenotipo fácilmente identificable que presentan las células de la presente composición es que son anti-trombósicas o que son capaces de inhibir la adherencia y agregación de trombocitos. La actividad anti-trombósica se puede determinar usando un ensayo in vitro con sulfato de heparán y un ensayo in vitro de agregación de

trombocitos que se describen más adelante.

En una realización operativa típica del presente invento, no es necesario que las células presenten más de uno de los anteriores fenotipos. En ciertas realizaciones, las células pueden presentar más de uno de los anteriores fenotipos.

Aunque cada uno de los fenotipos anteriormente indicados tipifica una célula endotelial funcional, tal como (sin carácter limitativo) una célula endotelial vascular, una célula que no sea endotelial pero que presente dicho fenotipo (o dichos fenotipos) se considera similar a una célula endotelial para los fines del presente invento, y por tanto adecuada para usar con el presente invento. A las células que sean similares a las endoteliales se hará referencia también en la presente memoria como equivalentes funcionales de células endoteliales; o imitaciones funcionales de células endoteliales.. Así, solamente a título de ejemplo, las células adecuadas para uso con los materiales y métodos descritos en la presente memoria incluyen también células madre o células progenitoras que dan lugar a células similares a las endoteliales; células que no son endoteliales en su origen y que todavía se comportan funcionalmente como una célula endotelial usando los parámetros especificados en la presente memoria, y células de cualquier origen que se hayan genomanipulado o modificado de otro modo para obtener una funcionalidad similar a la de las células endoteliales usando los parámetros especificados en la presente memoria.

Típicamente, las células del presente invento presentan uno o más de los fenotipos anteriormente mencionados cuando están presentes en poblaciones confluentes, casi confluentes o post-confluentes y en relación de asociación con una matriz biocompatible preferida como las descritas en otra parte en la presente memoria. Como apreciarán los expertos en la técnica, las poblaciones confluentes, , casi confluentes o post-confluentes de células son fácilmente identificables por una variedad de técnicas, de las que la más común y más ampliamente aceptada es el examen microscópico directo. Otras técnicas incluyen la evaluación del número de células por área de superficie usando técnicas estándar de recuento de células tales como (sin carácter limitativo) un hemocitómetro o un contador Coulter.

Adicionalmente, para los fines del presente invento, las células similares a las endoteliales incluyen (sin carácter limitativo) células que emulen o imiten células endoteliales funcional y fenotípicamente confluentes, casi confluentes o post-confluentes tal como se han medido mediante los parámetros especificados en la presente memoria.

De este modo, usando la descripción detallada y la orientación especificada más adelante, el facultativo normalmente experto en la técnica apreciará cómo hacer, usar, ensayar e identificar realizaciones operativas del material implantable descrito en la presente memoria. Es decir, las enseñanzas aportadas por la presente memoria describen todo lo que es necesario para construir y usar los materiales implantables del presente invento. Y además, las enseñanzas aportadas por el presente invento describen todo lo que es necesario para identificar, construir y usar composiciones que contengan células operativamente equivalentes. En el fondo, todo lo que se requiere es que las composiciones que contengan células equivalentes sean eficaces para tratar estructuras de acceso vascular que respondan a los métodos descritos en la presente memoria. Como apreciarán los facultativos expertos en la técnica, las realizaciones equivalentes de la presente composición se pueden identificar usando solamente experimentos rutinarios junto con las enseñanzas provistas en la presente memoria.

En ciertas realizaciones preferidas, las células endoteliales utilizadas en el material implantable del presente invento se aíslan a partir de la aorta de donantes de cadáveres humanos. Cada lote de células se obtiene de uno solo o de múltiples donantes, ensayado extensamente en cuanto a pureza de las células endoteliales, función biológica, presencia de bacterias, hongos, patógenos humanos conocidos y otros agentes accidentales. Las células se crioconservan y recogen en bancos usando técnicas bien conocidas para su expansión posterior en un cultivo para la subsiguiente formulación en materiales implantables biocompatibles.

Preparación de las células

Según se ha indicado anteriormente, las células adecuadas se pueden obtener a partir de una variedad de tipos de tejidos y tipos de células. En ciertas realizaciones preferidas, las células endoteliales de aorta humana utilizadas en el material implantable se aíslan de la aorta de cadáveres de donantes. En otras realizaciones, las células endoteliales de la aorta de ganado porcino (aplicaciones de células, San Diego, California, CA) se aíslan de la aorta normal del ganado porcino mediante un procedimiento similar al usado para aislar células endoteliales de aorta humana. Cada lote de células se obtiene de uno solo o de múltiples donantes, y se ensaya extensamente en cuanto a viabilidad de las células endoteliales, pureza, función biológica, presencia de micoplasma, bacterias, hongos, levadura, patógenos humanos conocidos y otros agentes accidentales. Las células además se expanden, se caarcterizan y crioconservan para formar un banco de células de trabajo en el tercero al sexto paso usando técnicas bien conocidas para su expansión posterior en un cultivo y para la subsiguiente formulación en material implantable biocompatible.

Las células endoteliales de aortas humanas o porcinas se preparan en matraces T-75 pre-tratados mediante la adición de aproximadamente 15 ml por matraz de medio de crecimiento de células endoteliales. Las células endoteliales de aorta humana se preparan en un medio de crecimiento de células endoteliales (en adelante EGM-2, Cambrex Biosciences, East Rutherford, N.J.). El EGM-2 consiste en un medio basal para células endoteliales (en adelante EBM-2, Cambrex Biosciendes) suplementado con partes alícuotas simples de EGM-2, que contienen un 2% de suero bovino fetal (en adelante FBS). Las células porcinas se preparan en EBM-2 suplementado con un 5% de FBS y 50 �g/ml de gentamicina. Los matraces se colocan en una incubadora mantenida aproximadamente a 37º C y con una mezcla de un 5% de CO2/95% de aire, y humedad del 90% durante un mínimo de 30 minutos. Uno o dos viales de las células se retiran del congelador a -160ºC –140º C y se descongelan aproximadamente a 37ºC. Cada vial de células descongeladas se siembra en dos matraces T-75 a una densidad de aproximadamente 3X103 células por cm3, preferiblemente, pero a no menos de 1,0 x103 y a no más de 7,0x103; y los matraces que contienen las células se devuelven a la incubadora. Transcurridas aproximadamente 6 a 24 horas, se retira el medio gastado y se reemplaza por un medio fresco. El medio se cambia cada dos o tres días, después de eso, hasta que las células llegan aproximadamente a un 85-100% de confluencia preferiblemente, pero a no menos del 60% y a no más del 100%. Cuando el material implantable está destinado a aplicación clínica, solamente se usa un medio exento de antibióticos en el cultivo post-congelación de células endoteliales de aorta humana y en la fabricación del material implantable del presente invento.

Luego se retira el medio de crecimiento de células endoteliales, y el monoestrato de células se aclara con 10 ml de hidroxietil-piperacina-etano-ácido sulfónico (en adelante HEPES) amortiguado salino. Se retira el HEPES, y se añaden 2 ml de tripsina para separar las células de la superficie del matraz T-75. Una vez que se ha producido la separación, se añaden 3 ml de solución neutralizante de tripsina (en adelante TNS) para detener la reacción enzimática. Se añaden 5 ml adicionales de HEPES, y se cuentan las células usando un hemocitómetro. La suspensión de células se centrífuga y ajusta a una densidad de, en el caso de células humanas, aproximadamente 75X106 células/ml usando EGM-2 sin antibióticos, o, en el caso de células porcinas, aproximadamente 1,50 X 106 células/ml usando EBM-2 suplementado con un 5% de FBS y 59 �g/ml de gentamicina..

Matriz biocompatible.

De acuerdo con el presente invento, el material implantable comprende una matriz biocompatible. La matriz es permisiva para el crecimiento de las células y su fijación a, sobre o dentro de la matriz La matriz es flexible y conformable. La matriz puede ser una composición porosa maciza, semi-maciza o fluible Para los fines del presente invento, el término “composición fluible” significa una composición susceptible a su administración usando un dispositivo de descarga de inyección o del tipo de inyección tal como, sin carácter limitativo, una aguja, una jeringuilla o un catéter. Se contemplan también en la presente memoria otros dispositivos de descarga que funcionan por extrusión, eyección o expulsión. Se prefieren las matrices porosas. Una composición fluible preferida es conservante de la forma. La matriz puede ser también de una forma plana flexible. También puede ser de la forma de un gel, una espuma, una suspensión, una partícula, un microportador, una microcápsula,

o una estructura fibrosa. Una matriz actualmente preferida está en forma de partículas.

La matriz, cuando se implanta sobre una superficie exterior de un vaso sanguíneo por ejemplo, puede residir en la zona de implantación durante al menos aproximadamente 56-84 días, preferiblemente alrededor de cómo mínimo 7 días, con más preferencia al menos alrededor de 14 días, y con la máxima preferencia al menos alrededor de 28 días antes de que bioerosione.

Una matriz preferida es Gelfoam®. (Pfizer, Nueva York, N.Y.), una esponja de gelatina absorbible (de aquí en adelante “matriz Gelfoam”). La matriz Gelfoam es una esponja quirúrgica porosa y flexible preparada a partir de una solución de gelatina cutánea de porcino purificada y especialmente tratada.

De acuerdo con otra realización, las modificaciones al material de matriz se pueden seleccionar para optimizar o controlar la función de las células, incluyendo el fenotipo de las células (por ejemplo, el fenotipo inhibidor) según se ha descrito anteriormente, cuando las células están en relación de asociación con la matriz. Según una realización, las modificaciones al material de la matriz incluyen recubrir la matriz con factores de fijación o péptidos de adherencia que aumentan la capacidad de las células para inhibir la proliferación de células de músculo liso, para disminuir la inflamación, para aumentar la producción de sulfato de heparán, para aumentar la producción de prostaciclina, o para aumentar la producción de TGF-�1.Entre los factores ejemplares de fijación se incluyen, por ejemplo, fibronectina, gel de fibrina, y ligandos de adherencia de células fijados de forma covalente (incluyendo, por ejemplo, arginina-glicina-aspartato (en adelante RGD) utilizando química de carbodiimida acuosa estándar. Entre los ligandos adicionales para adherencia de células se incluyen péptidos que tienen secuencias de reconocimiento de adherencia de células, incluyendo (sin carácter limitativo): RGDY, REDVY, GRGDF, GPDSRG, GRGDY y REDV.

De acuerdo con otra realización, la matriz es una matriz distinta de la Gelfoam. Entre los materiales ejemplares adicionales para matriz se incluyen, por ejemplo, gel de fibrina, alginato, microportadores de sulfonato sódico y poliestireno, microportadores de dextran recubiertos de colágeno, copolímeros de PLA/PGA y pHEMA/MMA (con relaciones de polímeros que abarcan desde 1 al 100% para cada polímero). De acuerdo con una realización preferida, estas matrices adicionales se modifican para incluir factores de fijación o péptidos para adherencia, según se ha indicado y descrito anteriormente. Entre los factores de fijación ejemplares se incluyen, por ejemplo, gelatina, colágeno, fibronectina, gel de fibrina, y ligandos para adherencia de células fijados de forma covalente (incluyendo RGD) utilizando química de carbodiimida acuosa. Entre los ligandos adicionales para adherencia de células se incluyen péptidos que tienen secuencias de reconocimiento de adherencia de células, incluyendo (sin carácter limitativo): RGDY, REDVY, GRGDF, GPDSRG, GRGDY y REDV.

De acuerdo con otra realización, el material de matriz biocompatible se modifica físicamente para mejorar la fijación de células a la matriz. Según una realización, la matriz está reticulada para aumentar sus propiedades mecánicas y mejorar sus propiedades de crecimiento y fijación de células. Según una realización preferida, una matriz de alginato se reticula primero usando sulfato cálcico seguida por una segunda etapa de reticulación usando cloruro cálcico y protocolos de rutina.

De acuerdo con todavía otra realización, se modifica el diámetro de los poros de la matriz biocompatible. Un diámetro preferido de poros de matriz es de aproximadamente 25 �m hasta alrededor de 100 �m; preferiblemente alrededor de 25 �m hasta 50 �m; con más preferencia aproximadamente 50 �m hasta 75 �m; aún con más preferencia aproximadamente 75 �m hasta 100 �m. Otros diámetros preferidos de poros incluyen diámetros por debajo de aproximadamente 25 �m y por encima de alrededor de 100 �m. De acuerdo con una realización, el diámetro de los poros se modifica usando una técnica de lixiviación con sal. Se mezcla cloruro sódico en una solución del material de matriz y un disolvente, se vierte la solución en un molde, y se deja evaporar al disolvente. Luego se sumerge en agua el bloque de matriz y sal y la sal se lixivia dejando una estructura porosa. El disolvente se elige de tal manera que la matriz esté en la solución, pero no la sal. Una solución ejemplar incluye polilactida (en adelante PLA) y cloruro de metileno.

Según una realización alternativa, se incorporan burbujas gaseosas de dióxido de carbono a una forma no maciza de la matriz y luego se estabiliza con un agente tensoactivo apropiado. Subsiguientemente se extraen las burbujas de gas usando vacío, dejando una estructura porosa.

De acuerdo con otra realización, se emplea una técnica de secado-congelación para controlar el diámetro de los poros de la matriz, usando la velocidad de congelación de las partículas de hielo para formar poros de diferentes diámetros. Por ejemplo, una solución de gelatina de aproximadamente 0,1-2% de gelatina porcina

o bovina se puede verter en un molde o plato y pre-congelarse a una variedad de temperaturas diferentes y luego liofilizarse durante un período de tiempo. El material luego se puede reticular mediante el uso, preferiblemente, de luz ultravioleta (254 nm)

o mediante la adición de gluteraldehido (formaldehído). Las variaciones en la temperatura de pre-congelación (por ejemplo – 20º C, -80º C ó – 180º C) en la temperatura de liofilización (congelación en seco a aproximadamente – 50º C), y concentración de gelatina (0,1% hasta 2,0%; el diámetro de los poros es en general inversamente proporcional a la concentración de gelatina en la solución) pueden afectar todos al diámetro de poros resultante del material de matriz y se pueden modificar para crear un material preferido. Los expertos en la técnica apreciarán que un diámetro de poro adecuado es el que promueve y sostiene unas poblaciones óptimas de células que tengan los fenotipos descritos en otra parte de la presente memoria.

Forma plana flexible. Según se ha indicado en la presente memoria, las formas planas de matrices biocompatibles se pueden configurar en una variedad de formas y tamaños, preferiblemente en una forma y un tamaño que se adapte para la implantación en, junto a o en las proximidades de una fístula, injerto, injerto periférico, u otra estructura de acceso vascular y sus alrededores y que puedan conformarse a las superficies contorneadas de las estructuras de acceso y a los vasos sanguíneos en relación de asociación con ellas. De acuerdo con una realización preferida, un solo trozo de matriz se dimensiona y configura para su aplicación a la estructura específica de acceso vascular que se va a tratar.

De acuerdo con una realización, la matriz biocompatible se configura en una forma plana flexible. En la Figura 1 se ha ilustrado una realización ejemplar configurada para su administración a una estructura tubular tal como (pero sin carácter limitativo) a un vaso sanguíneo o para su administración a una estructura de acceso vascular tal como (pero sin carácter limitativo) a una anastomosis vascular. En la Figura 1 no se han dibujado a escala ni de una manera proporcional las características de longitud, anchura, espesor y área de superficie; la Figura 1 es una realización ilustrativa no limitativa.

Con referencia a la Figura 1, una forma plana flexible 20 se ha conformado a partir de un trozo de matriz biocompatible adecuada. Todo lo que se requiere es que la forma plana flexible 20 sea flexible, conformable o adaptable a una superficie exterior contorneada de una estructura tubular tal como un vaso sanguíneo. La forma plana flexible 20 puede establecer contacto con una superficie exterior de un vaso sanguíneo, puede envolver una superficie exterior o puede envolverse alrededor de una superficie exterior.

De acuerdo con una realización ejemplar ilustrada en la Figura 2A, la forma plana flexible contorneada 20’ se puede configurar para contener regiones definibles tales como un cuerpo 30, conectado a un puente 50, conectado a una lengüeta 40. La lengüeta 40 es separable del cuerpo 30 por el puente 50, aunque las diversas regiones forman un todo contiguo. De acuerdo con otra realización ejemplar, los bordes interiores de estas varias regiones están destinados a definir una ranura interior 60 practicada en la forma plana flexible contorneada 20’. De acuerdo con una realización preferida, estas varias regiones que definen la ranura interior 60 definen además un primer punto de terminación 62 dentro del interior de la forma plana flexible contorneada 20’, un segundo punto de terminación 64 sobre un borde exterior de la forma plana flexible contorneada 20’, y una anchura 66. En esta realización ejemplar particular, el primer punto de terminación 62 está en un límite entre la lengüeta 40 y el puente 50; y el segundo punto de terminación 64 está en un límite entre la lengüeta 40 y el cuerpo 30.

En ciertas realizaciones, se contempla que la anchura 66 de la ranura 60 definida por la lengüeta 40, cuerpo 30 y puente 50 anteriormente indicados sea preferiblemente alrededor de 0,254 mm (0,01”) hasta alrededor de 1,016 mm (0,04”), con más preferencia desde alrededor de 1,27 mm (0,05”) hasta aproximadamente 2,032 mm (0,08”), y con máxima preferencia alrededor de 1,524 mm (0,06”). Preferiblemente, la anchura 66 de la ranura 60 de la forma plana flexible 20’ es de una dimensión suficiente para desalentar a las células injertadas de formar un estrato confluente ininterrumpido o un puente de células a través de la anchura 66 de la ranura 60. Sin embargo, se contempla que las realizaciones que definen una ranura 60 y una anchura 66 de ranura puedan usarse en la forma descrita anteriormente en la presente memoria incluso si las células abarcan la anchura 66 simplemente por corte

o interrumpen de otro modo dicho estrato de células o dicho puente de células.

El presente invento contempla además que la forma plana flexible 20’ de la Figura 1 se pueda destinar a definir una ranura 60 inmediatamente antes de su uso simplemente dando instrucciones a un facultativo con experiencia para usar un escalpelo u otro útil de corte para cortar la forma plana, parcialmente, definiendo una ranura.

En parte, el invento descrito en la presente memoria se basa en el descubrimiento de que una forma plana flexible contorneada o conformable permite que el material implantable se aplique de forma óptima a una estructura tubular sin comprometer la integridad del implante o de las células injertadas en la misma. Una realización preferida optimiza el contacto con – y se conforma a – la anatomía de un vaso tratado quirúrgicamente y controla la extensión de la solapa del material implantable. Una solapa excesiva de material implantable dentro del espacio de la túnica adventicia puede causar puntos de presión en el vaso tratado, restringir potencialmente la corriente sanguínea a través del vaso o crear otras interrupciones que podrían retrasar o inhibir la homeostasis y la cicatrización normal. Un facultativo experto en la técnica reconocerá una solapa excesiva en el momento de la implantación y se dará cuenta de la necesidad de reposicionar o alterar, por ejemplo cortando, el material implantable. Adicionalmente, en otras realizaciones, la solapa del material implantable puede resultar en una sobre-dosificación de los agentes terapéuticos dispersos dentro del material implantable. Según se describe en otra parte de la presente memoria, se pueden añadir opcionalmente a un implante productos químicos u otros agentes terapéuticos suministrados por vía exógena. En ciertas otras realizaciones, dichos agentes se pueden añadir a una matriz biocompatible en la ausencia de células; una matriz biocompatible utilizada de esta manera define opcionalmente una ranura.

En contraste con lo anterior, el material implantable que contacte adecuadamente la estructura tubular objetivo puede dar lugar a una exposición insuficiente a los beneficios clínicos aportados por las células injertadas o a una dosificación insuficiente del agente terapéutico añadido al material implantable. El facultativo experto en la técnica reconocerá que un contacto inferior al óptimo en el momento de la implantación necesita reposicionamiento o material implantable adicional.

Composición fluíble

En ciertas realizaciones contempladas en la presente memoria, el material implantable del presente invento es una composición fluíble que comprenda una matriz biocompatible de partículas. En la presente memoria se contempla cualquier composición fluible no maciza para uso con un dispositivo de descarga del tipo inyectable capaz de, o bien una administración intraluminal (endovascular) mediante la navegación de la longitud interior de un vaso sanguíneo, o bien una administración local percutánea. La composición fluible es preferiblemente una composición que conserva la forma. Por tanto, se puede formular un material implantable que comprenda células en, sobre o dentro de una matriz de partículas del tipo fluible tal como se contempla en la presente memoria para uso con cualquier dispositivo de descarga inyectable con un diámetro interior que abarque desde aproximadamente un calibre 22 hasta alrededor del calibre 26 y capaz de descargar aproximadamente 50 mg de composición fluible que comprenda material de partículas conteniendo preferiblemente alrededor de 1 millón de células en aproximadamente 1 ml hasta alrededor de 3 ml.

De acuerdo con una realización actualmente preferida, la composición fluible comprende una matriz de partículas biocompatible tales como las partículas de Gelfoam®., el polvo Gelfoam®, o el Gelfoam® pulverizado (Pfizer Inc., Nueva York, N.Y.) (de aquí en adelante “partículas de Gelfoam) un producto obtenido de gelatina cutánea porcina. De acuerdo con otra realización, la matriz en partículas es de microportadores Cytodex-3 (fabricados por Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), constituidos por colágeno desnaturalizado acoplado a una matriz de dextran reticulado.

Según realizaciones alternativas, la matriz de partículas implantable y biocompatible es una matriz biocompatible modificada. Las modificaciones incluyen las descritas anteriormente para un material de matriz implantable.

Siembra de células de matriz biocompatible.

Piezas precortadas de una matriz biocompatible adecuada o una parte alícuota de una matriz fluible biocompatible adecuada se rehidratan mediante la adición de EGM-2 sin antibióticos aproximadamente a 37º C y con un 5% de CO2 y un 95% de aire durante 12 a 24 horas. Luego se retira el material implantable de sus recipientes de rehidratación y se coloca en platos individuales de cultivo de tejido. La matriz biocompatble se siembra a una densidad preferida de aproximadamente 1,5-2,0 X 105 células (1,25-1,66 X 105 células / cm3 de matriz) y se coloca en una incubadora mantenida aproximadamente a 37º C y con un 5% de CO2 y un 95% de aire y una humedad del 90% durante 3-4 horas para facilitar la fijación de las células. La matriz sembrada se coloca luego en recipientes tubulares individuales (fabricados por American MasterTech, Lodi, GA), cada uno dotado de un tapón que contiene un filtro de 0,2 �m con EGM-2 y se incuba aproximadamente a 37ºC con un 5% de CO2 y un 95% de aire. El medio se cambia cada dos o tres días, después de lo anterior, hasta que las células hayan llegado a la confluencia. Las celdas en una realización preferida son preferiblemente de 6 pasos, pero se pueden usar células de menos o de más pasos.

Curva de crecimiento y confluencia de células. Se retira una muestra de material implantable en o alrededor de los días 3 ó 4, 6 ó 7, 9 ó 10, y 12 ó 13, se cuentan las células y se valoran en cuanto a viabilidad, y se construye y evalúa una curva de crecimiento con el fin de establecer las características de crecimiento y determinar si se ha conseguido confluencia, casi confluencia o post-confluencia. En las Figuras 3A y 3B se presentan curvas de crecimiento representativas de dos de dos preparaciones de material implantable que comprenden lotes implantados de células endoteliales de aorta porcina. En estos ejemplos, el material implantable está en una forma plana flexible. En general, una persona con experiencia normal apreciará los indicios de crecimiento de células aceptable en puntos de tiempo temprano, medio y tardío, tales como la observación de un aumento en el número de células en los puntos de tiempo temprano (refiriéndose a la Figura 3A, entre aproximadamente los días 2 a 6), seguida de una fase casi confluente (refiriéndose a la Figura 3A, entre aproximadamente los días 6 a 8), seguida por una meseta en números de células una vez que las células han llegado a la confluencia (refiriéndose a la Figura 3A, entre aproximadamente los días 8 a 10), y la conservación del número de células cuando las células son post-confluentes (refiriéndose a la Figura 3 A, entre aproximadamente los días 10 a 14). Para los fines del presente invento, se prefieren las poblaciones de células que están en una meseta durante al menos 72 horas.

Las cuentas de células se obtienen mediante una digestión completa de la parte alícuota de material implantable con una solución de 0,8 mg/ml de colagenasa en una solución de tripsina-ácido etilendiaminotetraacético (en adelante EDTA). .Después de medir el volumen del material implantable digerido, se diluye un volumen conocido de la suspensión de células con un 0,4% de trypan azul . y se establece la viabilidad por exclusión del trypan azul. Se enumeran las células viables, no viables y totales usando un hematocitómetro. Se construyen las curvas de crecimiento representando gráficamente el número de células viables en función del número de días transcurridos en el cultivo. Las células se envían e implantan después de llegar a la confluencia.

Para los fines del presente invento, la confluencia se define como la presencia de al menos aproximadamente 4 X 105 células/cm3 cuando el material implantable está en una forma plana flexible (1,0 X 4,0 X 0,3 cm), y preferiblemente alrededor de 7X 105 a 1X 106 células totales por parte alícuota (50-70 mg) cuando está en la composición flexible. En ambos casos, la viabilidad de las células es al menos aproximadamente un 90% con preferencia, pero no menor del 80%. Si las células no son confluentes hacia el día 12 ó 13, se cambia el medio, y se continúa la incubación un día más. Este proceso se continúa hasta que se consigue la confluencia o hasta 14 días después de la siembra. En el día 14, si las células no son confluentes, se descarta el lote. Si se determina que las celdas son confluentes después de realizar comprobaciones durante el proceso, se realiza un cambio final de medio. Este cambio final de medio se realiza usando EGM-2 sin fenol rojo y sin antibióticos. Inmediatamente después del cambio de medio, se ponen en los tubos unos tapones obturadores estériles de cierre hermético para el transporte.

Evaluación de funcionalidad. Para los fines del invento descrito en la presente memoria, el material implantable se ensaya adicionalmente para detectar indicios de su funcionalidad antes de su implantación. Por ejemplo, se recogen medios condicionados durante el período de cultivo, para asegurarse de los niveles de sulfato de heparán, factor de crecimiento de transformación �1 (en adelante TGF-�1), factor de crecimiento básico de fibrocitos (en adelante b-FGF), y óxido nítrico que son producidos por las células endoteliales cultivadas. En ciertas realizaciones preferidas, el material implantable se puede usar para los fines descritos en la presente memoria cuando el número total de células es al menos aproximadamente 2, con preferencia aproximadamente 4X 105 células /cm3 de forma plana flexible; el porcentaje de células viables es al menos aproximadamente un 80-90%, con preferencia � 90%, con la máxima preferencia al menos aproximadamente un 90%; el sulfato de heparán en medio condicionado es al menos aproximadamente 0,5-1,0 preferiblemente al menos alrededor de 1,0 mg/X 106 células/día. El TGF-�1 en medio condicionado es al menos aproximadamente 200-300, con preferencia aproximadamente al menos 300 picog/ml/día; el b.FGF en medio condicionado está por debajo de aproximadamente 200 picog/ml, con preferencia no más de aproximadamente 400 picog/ml.

Los niveles de sulfato de heparán se pueden cuantificar usando un ensayo espectrofotométrico rutinario de digestión con colorante de dimetimetilen azulcondroitinasa ABC Los niveles totales de glicosaminoglicanos (en adelante GAC) sulfatados se determinan usando un análisis de fijación a receptores con azul de dimetilmetileno (en adelante (DMB) en el que se comparan muestras desconocidas con una curva estándar usando cantidades conocidas de sulfato de condroitina purificado diluido en un medio de colección. Se mezclan muestras adicionales de medio condicionado con condroitina ABC para digerir la condroitina y los sulfatos de condroitina antes de la adición del reactivo de color DMB. Todas las absorbencias se determinaron a la absorbencia de máxima longitud de onda del colorante DMB mezclado con el GAG estándar, generalmente alrededor de 515-525 nm. La concentración de sulfato de heparán por 106 células por día se calcula restando la concentración de sulfato de condroitina y de dematán de la concentración total de glicosaminoglican sulfatado en muestras de medio condicionado. La actividad de la condroitinasa ABC se confirma mediante la digestión de una muestra de sulfato de condroitina purificado. Las muestras de medio condicionado se corrigen si se ha digerido menos del 100% del sulfato de condroitina purificado, Los niveles de sulfato de heparán se podrían cuantificar también usando un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (en adelante ensayo ELISA) empleando anticuerpos monoclonales

Los niveles de TGF-�1 y b-FGF se pueden cuantificar usando un ensayo ELISA que emplee anticuerpos monoclonales o policlonales, preferiblemente policlonales. Los medios de colección de control se pueden cuantificar también usando un ensayo ELISA, y las muestras se corrigen apropiadamente para los niveles de TGF-�1 y b-FGB presentes en los medios de control.

Los niveles de óxido nítrico (NO) se pueden cuantificar usando un ensayo estándar de reacción de Griess. La naturaleza transitoria y volátil del ácido nítrico le hace inadecuado para la mayor parte de los métodos de detección. Sin embargo, se pueden detectar dos productos de descomposición estables del óxido nítrico, el nitrato (NO3) y el nitrito (NO2) usando métodos fotométricos rutinarios. El ensayo de reacción de Griess convierte enzimáticamente nitrato a nitrito en la presencia de reductasa de nitrato. El nitrito se detecta por colorimetría como un producto colorante azoico, que absorbe luz visible en el intervalo de aproximadamente 540 nm. El nivel de óxido nítrico presente en el sistema se determina mediante la conversión de todo el nitrato en nitrito,. en las muestras desconocidas, y luego comparando la concentración resultante de nitrito con una curva estándar usando las cantidades conocidas de nitrato convertido en nitrito.

El fenotipo inhibidor preferido anteriormente indicado se establece usando los ensayos cuantitativos de sulfato de heparán, TGF-�1, NO y b-FGF anteriormente descritos, así como ensayos cuantitativos in vitro de crecimiento de células de músculo liso e inhibición de trombosis que se indican a continuación. Para los fines del presente invento, el material implantable está listo para su implantación cuando uno o más de estos ensayos alternativos in vitro confirman que el material implantable está presentando el fenotipo inhibidor preferido.

Para evaluar la inhibición del crecimiento de células de músculo liso in vitro, se determina la magnitud de la inhibición en relación de asociación con las células endoteliales cultivadas. Las células de músculo liso de aorta porcina o humana se siembran de forma dispersa en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos en un medio de crecimiento de células de músculo liso (SmGM-2, Cambrex BioScience). A las células se les deja fijarse durante 24 horas. Luego se reemplaza el medio por un medio basal para células de músculos lisos (SmBM) que contiene un 0,2% de FBS durante 48-72 horas hasta la detención del crecimiento de las células. Los medios condicionados se preparan a partir de cultivos de células endoteliales post-confluentes, diluidos en relación 1:1 con medios de crecimiento 2XSMC y se añaden a los cultivos. En cada ensayo se incluye un control positivo para la inhibición del crecimiento de células de músculo liso, Transcurridos tres ó cuatro días, se enumera el número de células de cada muestra usando un contador Coulter. El efecto de los medios condicionados sobre la proliferación de células de músculo liso se determina mediante la comparación del número de células de músculo liso por pocillo inmediatamente antes de la adición de medio condicionado con el de tres o cuatro días de exposición al medio condicionado, y a los medios de control (medios de crecimiento estándar con y sin la adición de factores de crecimiento). Se compara la magnitud de inhibición en relación de asociación con las muestras de medio condicionado con la magnitud de inhibición en relación de asociación con el control positivo. De acuerdo con una realización preferida, el material implantable se considera inhibidor si los medios condicionados inhiben aproximadamente un 20% de lo que el control de heparina es capaz de inhibir.

Para evaluar la inhibición de la trombosis in vitro, se determina el nivel de sulfato de heparán en relación de asociación con las células endoteliales cultivadas. El sulfato de heparán tiene tanto propiedades anti-proliferativas como antitrombósicas. Usando o bien el ensayo rutinario de dimetilmetil azul – condroitinasa ABC o bien un ensayo ELISA, (ambos ensayos se han descrito con detalle anteriormente), se calcula la concentración de sulfato de heparán por 106 células. El material implantable se puede usar para los fines descritos en la presente memoria cuando la concentración de sulfato de heparán contenido en el medio condicionado sea al menos aproximadamente 0,5-1,0, preferiblemente al menos aproximadamente 1,0 microgramos/106 células/día.

Otro método para evaluar la inhibición de trombosis implica determinar la magnitud de inhibición de agregación de trombocitos in vitro en relación de asociación con plasma rico en trombocitos. Se obtiene plasma porcino por la adición de citrato sódico a muestras de sangre porcina a la temperatura ambiente. El plasma citrado se centrífuga a una velocidad suave, para aspirar células rojas (eritrocitos) y blancas (leucocitos) en una pildorita, dejando a los trombocitos suspendidos en el plasma. El medio condicionado se prepara a partir de cultivos de células endoteliales post-confluentes y se añade a partes alícuotas del plasma rico en trombocitos. Se añade un agente de agregación de trombocitos (agonista) al plasma como control. Los agonistas de trombocitos comúnmente incluyen araquidonato, adenosin difosfato (en adelante ADP) colágeno, epinefrina, y ristocetina. (comercializada por Sigma-Aldrich Co., San Luis, MO). Una parte alícuota adicional de plasma incluye aspirina, heparina, abcisimab (reoPro®, Eli Lily, Indianápolis, IN), tirofiban (Aggrastat®, Merck &Co., Inc., Whitehouse Station, NJ), o eptifibatida (Integrilin®, Millennium Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, MA). Luego se mide la agregación de trombocitos resultante en todas las condiciones de los ensayos usando un agregómetro. El agregómetro mide la agregación de trombocitos mediante la monitorización de la densidad óptica. A medida que los trombocitos se agregan, más luz puede pasar a través de la muestra. El agregómetro comunica los resultados en “unidades de agregación de trombocitos”, una función del ritmo en que se agregan los trombocitos. La agregación se valora como máxima agregación en 6 minutos después de la adición del agonista. El efecto del medio condicionado sobre la agregación de trombocitos se determina mediante la comparación de la agregación inicial de trombocitos antes de la adición de medio condicionado con la de después de la exposición de plasma rico en trombocitos al medio condicionado, y al control positivo. Los resultados se expresan como un porcentaje de los valores iniciales. La magnitud de inhibición en relación de asociación con las muestras de medio condicionado se compara con la magnitud de inhibición en relación de asociación con el control positivo. De acuerdo con una realización preferida, el material implantable se considera inhibidor si el medio condicionado inhibe aproximadamente un 20% de lo que el control positivo es capaz de inhibir.

Cuando esté listo para implantarse, el material implantable que comprende una forma plana flexible se suministra en recipientes de producto final, cada uno preferiblemente conteniendo una pieza estéril de 1X4X0,3 cm (1,2 cm3) con preferiblemente alrededor de 5-8 X105 , al menos aproximadamente 4X105 células/cm3 y al menos aproximadamente un 905 de células viables, por ejemplo, células endoteliales de aorta humana obtenidas de una sola fuente de cadáver donante, por centímetro cúbico en aproximadamente 45-60 ml, preferiblemente alrededor de 50 ml, un medio de crecimiento endotelial (por ejemplo, un medio de crecimiento endotelial (EGM-2) que no contenga rojo de fenol ni antibióticos. Cuando se usen células endoteliales de aorta porcina, el medio de crecimiento es también EBM-2 que no contenga rojo de fenol, pero suplementado con un 5% de FBS y 50 �g/ml de gentamicina.

En otras realizaciones preferidas, el material implantable que comprende una forma en partículas fluibles se suministra en recipientes de producto final, incluyendo, por ejemplo, recipientes herméticamente cerrados de cultivo de tejido modificados con tapones con filtro o jeringuillas precargadas, cada uno preferiblemente conteniendo aproximadamente 50-60 mg de material en partículas injertado con aproximadamente 7X105 hasta aproximadamente 1X106 células endoteliales totales en alrededor de 4560 ml,. preferiblemente alrededor de 50 ml, de medio de crecimiento endotelial por parte alícuota.

Duración en almacenamiento del material implantable.

El material implantable que comprende una población confluente, casi confluente o post-confluente de células se puede mantener a la temperatura ambiente en una condición estable y viable durante al menos dos semanas. Preferiblemente, dicho material implantable se mantiene en un medio de transporte de aproximadamente 45-80 ml, con más preferencia 50 ml, con o sin FBS adicional. El medio de transporte comprende EGM-2 sin rojo de fenol. Se puede añadir FBS al volumen del medio de transporte hasta aproximadamente un 10% de FBS, o una concentración total de aproximadamente un 12% de FBS. Sin embargo, como el FBS debe extraerse del material implantable antes de la implantación, se prefiere limitar la cantidad de FBS utilizado en el medio de transporte para reducir la duración del aclarado antes de la implantación.

Crioconservación de material implantable.

El material implantable que comprende una población confluente de células se puede crioconservar para almacenamiento y/o transporte a la clínica sin disminuir su potencia o integridad clínicas tras una eventual descongelación. Preferiblemente, el material implantable se crioconserva en un criovial de 15 ml (fabricado por Naigene® Naige Nunc INS’1, Rochester, NY) en una solución de aproximadamente 5 ml de CryoStor CS-10 (fabricado por BioLife Solutions, Oswego, NY)que contenga aproximadamente un 10% de dimetil-sulfóxido (en adelante DMSO), alrededor del 2 al 8% de Dextran y aproximadamente un 50-75% de FBS. Los crioviales se colocan en un baño de agua fría en iso-propanol, se trasladan a un congelador a – 80ºC durante 4 horas, y subsiguientemente se trasladan a un recipiente con nitrógeno líquido (-150º C a –165ºC)

Las partes alícuotas crioconservadas del material implantable se descongelan luego a la temperatura ambiente durante alrededor de 15 minutos, seguido de unos aproximadamente 15 minutos adicionales en un baño de agua a temperatura ambiente. Luego se lava el material unas tres veces en un medio de lavado de unos 15 ml. El medio de lavado comprende EBM sin rojo de fenol y con 50 �g/ml de gentamicina. Los dos primeros procedimientos de aclarado se llevan a cabo durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente. El procedimiento de aclarado final se realiza durante alrededor de 30 minutos a 37ºC en un 5% de CO2.

Siguiendo a los procedimientos de descongelación y aclarado, se deja reposar el material crioconservado durante unas 48 horas en aproximadamente 10 ml de solución de recuperación. Para las células endoteliales porcinas, la solución de recuperación es EBM-2 suplementado con un 5% de FBS y 50 �g/ml de gentamicina 37º C en un 5% de CO2. Para células endoteliales humanas, la solución de recuperación es EGM-2 sin antibióticos. El acondicionamiento adicional post-descongelación se puede realizar durante al menos otras 24 horas antes del uso y/o embalaje para almacenamiento o transporte.

Inmediatamente antes de la implantación, el medio se decanta y el material implantable se aclara en una solución salina estéril de aproximadamente 50-500 ml (USP). El medio contenido en el producto final contiene una pequeña cantidad de FBS para mantener la viabilidad de las células durante el transporte a una zona clínica, si es necesario. El FBS se ha ensayado extensamente para detectar la presencia de bacterias, hongos y otros agentes virales de acuerdo con el Título 10 del Código de Regulaciones federales (en adelante CFR): animales y productos animales. Se emplea un procedimiento de aclarado justo antes de la implantación, que disminuye la cantidad de FBS transferido preferiblemente hasta entre 0-80 ng por implante.

La carga total de células por paciente humano será preferiblemente de alrededor de 1,6-2,6X104 células por kg. de peso del cuerpo, pero no menos de aproximadamente 2X103 y no más de aproximadamente 2X106 células por kg. de peso del cuerpo.

Tal como se contempla en la presente memoria, el material implantable del presente invento comprende células, preferiblemente células endoteliales vasculares que preferiblemente son alrededor de un 90% viables en una densidad de preferiblemente alrededor de 4X105 células/cm3 de forma plana flexible y cuando son confluentes, producen un medio condicionado que contiene sulfato de heparán en al menos aproximadamente 0,5-1,0 preferiblemente al menos alrededor de 1,0 microgramos /106 células /día, TGF-�1 en al menos aproximadamente 200-300, preferiblemente al menos alrededor de 200 picogramos /ml/día, y b-FGF por debajo de al menos aproximadamente 210 picogramos/ml, preferiblemente no más de alrededor de 400 picogramos/ml.

Descarga de material implantable en forma plana flexible.

Consideración general. El material implantable se puede administrar a una estructura de acceso vascular en una variedad de formas. De acuerdo con una realización preferida, el material implantable es una forma plana flexible cortada en una forma y tamaño que se adapte a una implantación junto a una fístula, un injerto, un injerto periférico, u otra estructura de acceso vascular y sus alrededores, y que puede conformarse a las superficies contorneadas de la estructura de acceso y a sus correspondientes vasos sanguíneos.

De acuerdo con una realización preferida, un trozo individual de material implantable se dimensiona para su aplicación a la estructura de acceso vascular a tratar. De acuerdo con otra realización, más de un trozo de material implantable en su forma plana flexible, por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más trozos de material de matriz, se pueden aplicar a una sola ubicación de acceso vascular. Adicionalmente, más de una ubicación a lo largo de la longitud de una estructura de acceso vascular se puede tratar con uno o más trozos del material implantable. Por ejemplo, en el caso de un injerto arteriovenoso, cada una de la anastomosis venosa proximal, anastomosis venosa distal y sección venosa distal se pueden tratar con uno

o más trozos del material de matriz implantable.

De acuerdo con una realización sin carácter limitativo, el material implantable se configura para conformarse a una superficie exterior de un vaso sanguíneo. En la Figura 1 se ha ilustrado un ejemplo de forma plana no limitativa. Con referencia a la Figura 1, la forma plana flexible ejemplar 20 tiene una longitud 12, una anchura 14 y una altura 16. Según una realización preferida, la longitud 12 de la forma plana flexible 20 es aproximadamente 2 cm hasta alrededor de 6 cm, la anchura 14 de la forma plana flexible 20 es desde aproximadamente 0,1 cm hasta alrededor de 0,5 cm.

De acuerdo con otra realización, la forma plana flexible 20 se puede configurar como una forma anatómicamente contorneada que se conforma a una superficie exterior de un vaso sanguíneo o a una estructura de acceso vascular. En la Figura 2A se ha dibujado una forma plana flexible 20’ anatómicamente contorneada configurada para su administración a una estructura de acceso vascular, que se describe más adelante con mayor detalle.

Según se ha explicado en otra parte de la presente memoria, la forma plana flexible contorneada 20’ de la Figura 2A se puede configurar en una variedad de formas geométricas. Por ejemplo, según una realización, la forma plana flexible contorneada 20’ contiene varias regiones que definen una ranura 60. De acuerdo con realizaciones adicionales, los bordes de la forma plana flexible contorneada y/o los bordes de la ranura interior forman un ángulo o son curvos. De acuerdo con otra realización, la altura 16’ de la forma plana flexible contorneada 20’ varía a través de la longitud 12’ o de la anchura 14’. Adicionalmente, pueden existir una o más de una lengüeta 40, puente 50 o ranura 60, dependiendo de la configuración y del fin previsto para la forma plana flexible contorneada 20’. Con respecto a la característica de una ranura, se puede definir una ranura en cualquier lugar en, sobre o dentro de la forma plana flexible contorneada 20’. Una ranura se puede definir para que sea uniforme en anchura o varíe en anchura. Una ranura se puede definir como lineal, no lineal, o curva.

Con referencia a las Figuras 2B, 2C, 2D y 2E, que representan múltiples realizaciones de la forma plana flexible contorneada 20’ del presente invento que contiene al menos una ranura 60, la forma plana flexible contorneada 20’ puede definir una o más de una ranura en ciertas realizaciones, y se puede usar de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria. La ranura 60 definida sobre o dentro de una forma plana flexible contorneada 20’ se puede alinear a lo largo de cualquier borde de la forma plana flexible contorneada 20’ o puede penetrar en el interior de la forma contorneada 20’. Refiriéndose ahora a la Figura 2E, la anchura 66 o la forma total de la ranura 60 en o dentro de la forma plana flexible contorneada 20’ se pueden definir para que sea de una anchura uniforme o de anchura variable, y puede definirse como lineal, no lineal o curva.

Con referencia a las Figuras 2F y 2G, la forma plana flexible contorneada 20’ puede definir una ranura 60 ó 60’ que tenga anchuras diferentes 66 y 66’, respectivamente.

Según se ha representado en la Figura, la ranura 60’ de la Figura 2G y la anchura 66’ son representativas de una realización en la que el facultativo, en el momento de la implantación, corta la forma plana flexible 20’ como se ha indicado en otra parte de la presente memoria, convirtiéndola de ese modo en la forma plana flexible 20’ dibujada en la Figura 2G.

De acuerdo con una realización, una unión terminolateral anastomósica vascular, como una fístula arteriovenosa, se puede tratar usando el material implantable del invento. Las etapas de un método ejemplar para descargar el material implantable de una forma plana flexible a una anastomosis vascular terminolateral se han ilustrado en las Figuras 4A, 4B y 4C.

Con referencia a la Figura 4A, se provee un primer trozo de material implantable 22 a la estructura de acceso vascular haciendo pasar un extremo 34, o un segundo extremo 36 del primer trozo de material implantable 22 por debajo del segmento anastomósico 110 hasta que el centro 32 del primer trozo de material implantable 22 está en una unión 112 donde se encuentran los vasos 100, 110. Luego, los extremos 34, 36 se envuelven alrededor de una línea de sutura 14 de la unión 112, manteniendo al material implantable centrado sobre la línea de sutura 114. De acuerdo con una realización, los extremos 34, 36 del primer trozo de material de matriz implantable 22 se pueden solapar entre sí sólo lo bastante para sujetar en posición al primer trozo de material implantable 22 De acuerdo con otra realización, los extremos 34, 36 del primer trozo de material de matriz implantable 22 no se solapan entre sí. Los extremos 34, 36 del primer trozo de material de matriz implantable 22 o cualquier otro trozo de material de matriz implantable no tienen que encontrarse entre sí, solaparse entre sí o envolverse alrededor de toda la circunferencia de cualquiera de los dos vasos 100, 110. De acuerdo con una realización, preferida, los extremos 34, 36 del primer trozo de material implantable 22 se envuelven todo lo que sea posible alrededor de la unión anastomósica 112 sin estiramientos ni desgarramientos. Todo lo que se requiere es que se consiga la cobertura adecuada del vaso (o de los vasos). Los expertos en la técnica apreciarán cuándo se ha logrado correctamente la administración del material implantable.

Con referencia a la Figura 4B, de acuerdo con otra realización, se aplica opcionalmente un segundo trozo de material implantable 24, con la parte central del segundo trozo de material implantable 24 centrada en, o adyacente a, o en las proximidades de la unión anastomósica 112.. Los extremos 44, 46 del segundo trozo de material implantable 24 se envuelven alrededor del vaso 100. Como se ha descrito con respecto al primer trozo de material implantable 22 en la Figura 4A, los extremos 44, 46 del segundo trozo de material de matriz implantable 24 pueden, pero no es necesario que lo hagan, tocarse, solaparse, o envolverse alrededor de toda la circunferencia de cualquiera de los dos vasos 100,110.

Con referencia a la Figura 4C, según todavía otra realización, un tercer trozo de material implantable 26 se coloca opcionalmente en el segmento de vaso proximal 116 del vaso tratado 100, distal a la unión anastomósica 112. El tercer trozo de material implantable 26, de acuerdo con una realización, se coloca longitudinalmente según la longitud del vaso 100 con un primer extremo 54 del tercer trozo de material implantable 26 en, adyacente a, o en las proximidades de la unión anastomósica 112 y un segundo extremo 56 del tercer trozo de material implantable 26 distal a la unión anastomósica 112. Según se ha descrito con respecto al primer trozo del material implantable 22 de la Figura 4A, los extremos 54, 56 del tercer trozo de material de matriz implantable 26 pueden, pero no se requiere que lo hagan, tocarse, solaparse o envolverse alrededor de toda la circunferencia del vaso 100.

De acuerdo con una realización alternativa, se provee un único trozo de forma plana flexible contorneada 20’ que define una ranura 60, por ejemplo la forma contorneada ejemplar ilustrada en la Figura 2A, a una estructura de acceso vascular, por ejemplo una anastomosis terminolateral. En la Figura 5 se ha ilustrado la implantación de la forma plana flexible contorneada 20’ del material implantable que define una ranura 60 en, adyacente a, o en las proximidades de una anastomosis terminolateral. Cuando el material implantable se usa en una modalidad envolvente, se contempla que un solo trozo de material de matriz implantable es adecuado para tratar tanto la anastomosis como la vasculatura adyacente. Cada forma plana flexible contorneada 20’ está dimensionada y conformada para su aplicación a una estructura de acceso vascular particular y, por tanto, está preconformada para proveer una cobertura y un nivel suficiente de factores de células endoteliales o de agente (o agentes) terapéutico (o terapéuticos) para crear un entorno homeostásico para esa estructura de acceso vascular en particular y su vasculatura adyacente.

Con referencia a la Figura 5, en una realización, se provee una única forma contorneada 20’ que define una ranura a una anastomosis mediante la separación del cuerpo 30 de la lengüeta 40. El cuerpo 30 se coloca a lo largo de una superficie del vaso principal 100. El puente 50 se coloca en una superficie del vaso principal 100 y por debajo de la ramificación del vaso auxiliar 110. Luego se lleva la lengüeta 40 alrededor del vaso ramificado 110 y se coloca la lengüeta 40 a lo largo de una superficie superior del vaso ramificado 110.

De acuerdo con la Figura 5, el trozo único de forma plana flexible contorneada 20’ contiene dos puntos de referencia 70, 80 (véase también la Figura 2 A). Cuando se administra a la zona de una anastomosis terminolateral, como se ha ilustrado en la Figura 5, los dos puntos de referencia 70, 80 están alineados. El primer punto de referencia 70 está situado sobre la lengüeta 70 y el segundo punto de referencia está situado en el puente 50 (véase también la Figura 2 A). En una realización de la forma plana flexible contorneada 20’ los puntos de referencia 70, 80 antes de la implantación está separados por una distancia de aproximadamente 12,7 mm (1/2”), preferiblemente menos de alrededor de 25,4 mm (1”), con más preferencia alrededor de 25,4 mm (1”), y con máxima preferencia no más de 38,1 mm (1,5”). Cuando la forma plana flexible contorneada 20’ se administra a la zona de una anastomosis, la rotación de la forma plana flexible contornedada20’ alrededor del vaso ramificado 110 permitida por la propiedad de la ranura causa que los puntos de referencia 70, 80 se alineen.

De acuerdo con una realización (y haciendo referencia de nuevo a las Figuras 4A, 4B y 4C), por ejemplo, cuando se trata un injerto arteriovenoso, el primer trozo de material implantable 22 y el segundo trozo de material implantable 24 se aplican a cada una de las anastomosis venosa proximal y venosa distal. Adicionalmente, el tercer trozo de material implantable 26 se puede colocar sobre la vena distal, corriente adelante de la anastomosis de vena distal.

Según todavía otra realización ejemplar alternativa ilustrada en la Figura 6, un solo trozo de material implantable de la forma plana flexible 20 se aplica a una estructura tubular tal como un vaso 100. Se contempla que el material implantable se pueda aplicar a una estructura tubular tal como un vaso que no contiene una estructura de acceso vascular..Por ejemplo, una parte venosa situada corriente adelante de una estructura de acceso vascular puede experimentar un aumento de inflamación, trombosis, restenosis u oclusión de la formación de la estructura de acceso vascular o de esquirlas de aguja en la estructura de acceso vascular, corriente atrás de la parte venosa tratada. En tal caso, el material implantable del presente invento es capaz de tratar, gestionar o mejorar estas condiciones que surgen a cierta distancia de la estructura de acceso vascular.

Descarga de material implantable en una composición fluible

El material implantable del presente invento, cuando constituye una composición fluible, comprende una matriz biocompatible de partículas y células, preferiblemente células endoteliales, con más preferencia células endoteliales vasculares, que son aproximadamente un 90% viables en una densidad preferida de aproximadamente 0,8 X 104 células/mg, con más preferencia alrededor de 1,5 X104 células/mg, con máxima preferencia alrededor de 2 X104 células/mg, y que pueden producir medios condicionados que contienen sulfato de heparán al menos aproximadamente 0,5-1,0, preferiblemente al menos alrdedor de 1,0 microgramos /106 células/día, TGF-�1 en al menos aproximadamente 200-300, preferiblemente al menos alrededor de 300 picogramos/ml/día, y b-FGF por debajo de aproximadamente 200 picogramos /ml y preferiblemente no más de alrededor de 400 picogramos /ml; y, presentar el fenotipo inhibidor anteriormente indicado.

Para los fines del presente invento, y con carácter general, la administración del material fluible de partículas se localiza a una zona situada en, adyacente a o en las proximidades de la estructura de acceso vascular. La zona del depósito del material implantable es exttraluminal. Tal como se contempla en la presente memoria, el depósito extraluminal localizado se puede realizar del modo que se indica a continuación.

En una realización particularmente preferida, la composición fluible se administra en primer lugar por vía percutánea, entrando en el espacio perivascular y luego depositándose en una zona extraluminal usando una aguja adecuada., un catéter u otro dispositivo adecuado de descarga del tipo de inyección percutánea. Alternativamente, la composición fluible se administra por vía percutánea usando una aguja, un catéter u otro dispositivo de descarga adecuado conjuntamente con una etapa de identificación para facilitar la descarga a una zona extraluminal prevista. La etapa de identificación puede producirse antes de o coincidiendo con la descarga percutánea. La etapa de identificación se puede llevar a cabo usando metodologías de ultrasonido intravascular, de otros ultrasonidos de rutina, de fluoroscopia, o metodologías de endoscopia, por citar unas pocas. La etapa de identificación se realiza opcionalmente y no requiere llevar a la práctica los métodos del presente invento.

La composición fluible se puede administrar también de forma intraluminal, es decir, endovascularmente. Por ejemplo, la composición se puede descargar mediante cualquier dispositivo capaz de insertarse dentro de un vaso sanguíneo. En este caso, dicho dispositivo de descarga intraluminal está dotado de un dispositivo que atraviesa o penetrante que penetra la pared luminal de un vaso sanguíneo para llegar a una superficie no luminal de un vaso sanguíneo. La composición fluible se deposita luego en una superficie no luminal de un vaso sanguíneo en, adyacente a, o en las proximidades de la zona de la estructura de acceso vascular.

Se contempla en la presente memoria que una superficie no luminal, también denominada extraluminal, puede incluir una superficie exterior o perivascular de un vaso, o puede estar dentro de la túnica adventicia, túnica media o túnica intima de un vaso sanguíneo. Para los fines de este invento, una superficie no luminal o extraluminal es cualquier superficie excepto una superficie interior de la luz.

Los dispositivos penetrantes contemplados en la presente memoria pueden permitir, por ejemplo, un solo punto de descarga o una pluralidad de puntos de descarga dispuestos en una configuración geométrica prevista para realizar la descarga de la composición fluible a una superficie no luminal de un vaso sanguíneo sin desbaratar una estructura de acceso vascular. Se pueden disponer una pluralidad de puntos de descarga, por ejemplo, en un círculo, en una disposición de ojo de buey,

o en una disposición de red lineal, por citar sólo unas pocas. El dispositivo penetrante puede estar también en la forma de un perforador de endoprótesis tal como, sin carácter limitativo, una endoprótesis con globo que incluya una pluralidad de puntos de descarga.

De acuerdo con una realización preferida del invento, el dispositivo penetrante se inserta a través de la superficie luminal interior del vaso sanguíneo, bien proximal o bien distal a la zona de la estructura de acceso vascular. En algunos casos clínicos, la inserción del dispositivo penetrante en la zona de la estructura de acceso vascular podría perturbar la estructura de acceso vascular o resultar en la dehiscencia de un injerto arteriovenoso o periférico. De acuerdo con esto, en dichos casos, debe tenerse cuidado para insertar el dispositivo penetrante en una ubicación a cierta distancia de la estructura de acceso vascular, preferiblemente a una distancia determinada por el facultativo y considerada teniendo en cuenta las circunstancias específicas que se tengan a mano.

Preferiblemente, la composición fluible se deposita en una superficie perivascular de un vaso sanguíneo, bien en la zona de una estructura de acceso vascular a tratar, o bien junto a o en las proximidades de la zona de una estructura de acceso vascular. La composición se puede depositar en una variedad de ubicaciones relativas a una estructura de acceso vascular, por ejemplo, corriente atrás de la anastomosis, sobre la superficie opuesta exterior del vaso de la anastomosis. De acuerdo con una realización preferida, una zona adyacente está dentro de aproximadamente 2 mm hasta 20 mm de la zona de la estructura de acceso vascular. En otra realización preferida, una zona está dentro de aproximadamente 21 mm hasta 40 mm; en todavía otra realización preferida, una zona está dentro de aproximadamente 41 mm hasta 60 mm. En otra realización preferida, una zona está dentro de aproximadamente 61 mm hasta 100 mm. Alternativamente, una zona adyacente es cualquier ubicación adyacente determinada por el facultativo donde la composición depositada es capaz de presentar un efecto previsto sobre un vaso sanguíneo en la proximidad de la estructura de acceso vascular.

En otra realización, la composición fluible se deposita directamente a una zona extraluminal expuesta quirúrgicamente y adyacente a, o en, o en las proximidades de la estructura de acceso vascular. En este caso, la descarga es guiada y dirigida por observación directa de la zona. También en este caso, la descarga se puede ayudar mediante el uso coincidente de una etapa de identificación anteriormente descrita. De nuevo en este caso, la etapa de identificación es opcional.

Administración extraluminal. Para los fines del presente invento, la administración de la composición fluible se localiza a una zona adyacente a, en las proximidades de, o en, una zona en necesidad de tratamiento. Tal como se contempla en la presente memoria, el depósito extraluminal localizado se puede llevar a cabo de la forma que se indica a continuación.

La composición fluible se descarga de forma percutánea usando una aguja, un catéter u otro dispositivo de descarga adecuado. Alternativamente, la composición fluible se descarga de forma percutánea coincidiendo con el uso de un método de guiado para facilitar la descarga a la zona en necesidad de tratamiento. Tras la entrada en el espacio perivascular, el facultativo deposita la composición fluible en una zona extraluminal, adyacente a, o en las proximidades de la zona en necesidad de tratamiento. La descarga percutánea se puede guiar y dirigir de forma óptima mediante metodologías de rutina por ultrasonido, fluoroscopia, y endoscopia, por citar sólo unas cuantas.

En otra realización, la composición fluible se descarga localmente, a una zona extraluminal quirúrgicamente expuesta y adyacente a, o en, o en las proximidades de una zona en necesidad de tratamiento. En este caso, la descarga se guía y dirige por observación directa de la zona en necesidad de tratamiento; también en este caso, la descarga se puede ayudar mediante el uso coincidente de otros métodos de guiado tal como se han descrito anteriormente.

Agente anastomósico de cierre hermético. En otras realizaciones determinadas, la composición fluible del presente invento puede servir adicionalmente como un agente anastomósico de cierre hermético, específicamente, o como un agente quirúrgico de cierre hermético en general. En dicha realización de doble uso, la composición es también eficaz para cerrar herméticamente la unión de dos o más estructuras tubulares o pata cerrar herméticamente un espacio vacío en una estructura tubular cuando se contacte con una superficie exterior de la estructura (o estructuras),

o aplicada en un arco sobre una superficie exterior, o aplicada circunferencialmente, Este tipo de agente de cierre hermético puede eliminar un requisito para las suturas que pueden dañar adicionalmente el tejido vascular, por ejemplo, y contribuir al trauma endotelial luminal. Dicho agente de cierre hermético puede proporcionar también una estabilidad adicional en las proximidades de una anastomosis, reforzando de ese modo cualquier reparación de sutura. Todo lo que se requiere es que las propiedades del tipo de agente de cierre hermético de esta composición de doble uso no interfieran con,,o perjudiquen, la expresión coincidente del fenotipo previsto de las células y la funcionalidad basada en células de la composición.

Para los fines de ciertas realizaciones con agente de cierre hermético, la composición fluible comprende una matriz biocompatible que de por sí comprende un componente que tiene propiedades de un agente de cierre hermético, tal como, sin carácter limitativo, una red de fibrina, mientras que al mismo tiempo tiene las propiedades requeridas para soportar poblaciones de células endoteliales o similares a las endoteliales. Asimismo, la matriz biocompatible per se puede tener propiedades de agente de cierre hermético así como las requeridas para soportar una población de células. En el caso de otras realizaciones, la funcionalidad del agente de cierre hermético puede ser contribuida, al menos en parte, por las células. Por ejemplo, se contempla que las células en relación de asociación con la composición producen una sustancia que puede modificar un sustrato, de tal manera que el sustrato adquiera propiedades de agente de cierre hermético,, al mismo tiempo que también presente o mantenga su funcionalidad celular requerida. Ciertas células pueden producir esta sustancia de forma natural, mientras que otras células se pueden manipular para conseguirlo.

Ejemplos

Ejemplo 1: estudio de fístulas AV humanas

Este ejemplo proporciona ejemplos experimentales para ensayar y usar una

realización preferida de material implantable que comprende células endoteliales vasculares para mejorar la maduración de una fístula y/o prevenir el fallo de una fístula

a su maduración. Utilizando intervenciones quirúrgicas estándar, se crea una .fístula

en la ubicación anatómica prevista. Luego, el material implantable, en una forma plana

flexible, se deposita en el espacio perivascular junto a la fístula creada

quirúrgicamente; los detalles de un procedimiento ejemplar se especifican a

continuación. Según se ha indicado antes, la colocación y la configuración del material

implantable se pueden variar para adaptarse a las circunstancias clínicas. En este

estudio, se ha representado al menos en las Figuras 1 ó 2A una forma plana flexible

ejemplar preferida

Los experimentos y protocolos especificados más adelante aportan suficiente

guiado:

1. Evaluar el fallo de una fístula arteriovenosa a la maduración en 3 meses. .

Para este estudio, el fallo a la maduración se define como la incapacidad para permitir la canulación repetitiva de la fístula para la diálisis, y de obtener suficiente corriente sanguínea para diálisis dentro del intervalo 35-500 ml/minuto, con una corriente sanguínea preferida de al menos 350 ml/minuto, dentro de aproximadamente 12 semanas después de la creación de la fístula. Se emplearán técnicas clínicas estándar.

2.

Evaluar caudal de acceso y la anatomía (% del área de estenosis) por ultrasonografía Doppler de flujo en color en el día 5, a las 2 semanas, a los 1, 3 y 6 meses y en puntos de tiempo subsiguientes.

Decremento en el flujo de acceso absoluto entre la medida inicial (día 5 después de la intervención quirúrgica) y 6 meses después de la intervención quirúrgica, medidos por ultrasonografía Doppler con flujo de color. Magnitud de estenosis determinada por ultrasonido Doppler a los 6 meses, cuando se compara el valor inicial (día 5 después de la intervención quirúrgica). , Se emplearán técnicas clínicas estándar

3.

Evaluar la respuesta de anticuerpos de antígenos leucocitos humanos (en adelante HLA) en relación de asociación con el uso de un producto de células alogénicas.

Determinación inmunológica cuantitativa de la presencia de anticuerpos de HLA de donante a los 5 días, 2 semanas, 1, 3 y 5 meses después de la cirugía, comparados con los niveles pre-quirúrgicos. Se emplearán técnicas clínicas estándar.

Específicamente, el estudio incluye 10 pacientes urémicos humanos que han sufrido una intervención quirúrgica para una fístula arteriovenosa. Estos pacientes que han sufrido una cirugía para fístula arteriovenosa recibirán (inmediatamente después de la intervención quirúrgica) la aplicación de dos (2) realizaciones de 1X4X0,3 cm (1,2 cm3) de una forma plana flexible; una (i) colocada en la unión anatómica y la otra se coloca longitudinalmente sobre el segmento de vena proximal, distal a la anastomosis. Se inscribirá a 5 pacientes más, pero no recibirán implantes. Estos 5 pacientes se utilizarán para comparación con el tratamiento de referencia.

Se realizarán seguimientos clínicos a los 5 días, a las 2 semanas y a los 1, 3 y 6 meses. Se realizarán medidas de flujo de acceso usando ultrasonografía Doppler con flujo de color en el día 5 para establecer un nivel de referencia, seguidos a las 2 semanas, 1 mes, 3 meses y 6 meses después de la intervención quirúrgica. A los pacientes que presenten una corriente sanguínea absoluta menor que aproximadamente 350 ml/minuto, o presenten una reducción mayor que el 25% en corriente sanguínea con respecto a la medida anterior, o presenten una estenosis mayor que el 50% (medida por ultrasonografía Doppler), se les tomará nota para angiografía. Se permitirá una intervención clínica reparadora tal como una angioplastia para las lesiones estenósicas mayores que el 50% según sea determinado por la angiografía. A los pacientes con fístulas que sean incapaces de madurar dentro de 12 semanas se les tomará nota para radiografía. Se permitirán intervenciones clínicas reparadoras estándar, incluyendo angioplastia y cirugía, para reparar ramificaciones laterales o para revisar la fístula, con el fin de asistir con la maduración funcional en la fístula que haya fallado en su maduración dentro del plazo de 12 semanas. La duración de la participación en el estudio para cada paciente será de 6 meses.

De acuerdo con esto, un total de 15 pacientes se inscribirán en este estudio clínico. 10 pacientes recibirán cada uno 2 implantes, y se usarán para comparación 5 pacientes que reciban tratamiento de referencia.. Se tendrá en cuenta también a los pacientes a los que se les haya colocado una fístula AV para acceso de hemodiálisis.

Los diez pacientes tratados con el material implantable de este invento tendrán cada uno una colocación de fístula AV estándar, medicaciones, tratamientos, e implantes, de acuerdo con el siguiente plan de estudio. Los cinco primeros de estos pacientes recibirán dos implantes en una forma plana flexible, uno en la zona anastomósica y uno colocado longitudinalmente en el segmento de vena proximal, distal a la anastomosis. A continuación del tratamiento del último paciente dentro de este primer grupo, tendrá lugar un período de observación antes del tratamiento del grupo siguiente. A continuación de una revisión satisfactoria de los datos de 1 mes de los cinco primeros pacientes, se tratará a los 5 pacientes finales.

Cinco pacientes se inscribirán en el estudio clínico y recibirán colocación de fístula AV estándar, medicaciones, tratamientos, pero no material implantable. Estos pacientes se utilizarán para comparación con un tratamiento de referencia y recibirán un seguimiento similar inmunológico y radiográfico como tales pacientes tratados con implantes.

Se realizarán intervenciones quirúrgicas de fístula AV convencionales de acuerdo con las técnicas operatorias estándar. Tras la terminación de la fístula, pero antes de la implantación, se hará una medida del diámetro de la vena eferente.

Se usarán unos fórceps sin dientes para elevar suavemente el material implantable en forma plana de los recipientes de aclarado. El material implantable se aplicará después que haya teminado la cirugía de acceso y se haya establecido la corriente sanguínea a través de la fístula, habiéndose realizado todas medidas de referencia. Se controlarán todas las hemorragias y la zona a tratar se secará todo lo que sea posible antes de colocar el material implantable. El área (o las áreas) no se irrigará después de la colocación del implante. Se usarán uno o dos implantes para tratar la zona de anastomosis. El otro implante se usará para tratar el segmento de vena proximal, distal a la anastomosis. En ciertas realizaciones, las uniones vasculares terminolaterales se tratarán haciendo pasar un extremo del implante por debajo del segmento anastomósico hasta que la parte central del implante esté en el punto donde se encuentran los vasos. Luego, se envolverán ambos extremos alrededor de la línea de sutura, manteniendo al implante centrado sobre la línea de sutura. El segmento de vena proximal (distal a la anastomosis venoso-arterial) se tratará colocando el material implantable longitudinalmente según la longitud de la vena empezando en la zona anastomósica. El material implantable no necesitará envolverse por completo alrededor de la circunferencia de la vena.

A los pacientes se les efectuará un seguimiento con procedimientos estándar de enfermería durante el transcurso de la recuperación en hospital a continuación de la cirugía de fístula AV. Se monitorizarán minuciosamente los signos vitales. Se llevará un registro de las medicaciones concomitantes. Los pacientes recibirán instrucciones sobre los requisitos para las visitas de seguimiento a los 5 días, a las 2 semanas, y a los 1, 3, y 6 meses.

Se registrará la corriente sanguínea de acceso en el día 5 (valor de referencia), a las 2 semanas y, a partir de entonces, a los 1, 3 y 6 meses después de la intervención quirúrgica. Se determinará también el grado de estenosis por ultrasonografía Doppler en el día 5 para establecer un nivel de referencia, y de nuevo a las 2 semanas, 1, 3 y 6 meses para comparación. Se tomará una muestra de sangre completa de 5 cc para disponer de suero para la determinación de los niveles de anticuerpos anti-HLA a los 5 días, 2 semanas, 1, 3 y 6 meses después de la intervención quirúrgica.

Se determinará la corriente sanguínea de acceso usando ultrasonografía Doppler con flujo de color en el día 5 (± 24 horas), para establecer una medida de referencia, y a las 2 semanas (±2 días), 1 mes (± 4 días), 3 y 6 meses (± 7 días) después de la intervención quirúrgica. A los pacientes que presenten una corriente sanguínea absoluta de menos de aproximadamente 350 ml/minuto, o presenten una reducción mayor del 25% en la corriente sanguínea con respecto a su medida anterior

o presenten un área de estenosis mayor del 50% (medida por ultrasonografía Doppler) se les tomará nota para angiografía. Se permitirá una intervención clínica reparadora tal como una angioplastia para las lesiones estenósicas de una estenosis mayor del 50% determinada por angiografía. A los pacientes con fístulas cuya maduración haya fallado transcurridas 12 semanas se les tomará nota para radiografías. Se permitirá una intervención clínica reparadora estándar incluyendo angioplastia y cirugía para reparar las ramificaciones laterales o para revisar la fístula, con el fin de ayudar en la maduración funcional en las fístulas cuya maduración haya fallado dentro de las 12 semanas. Dicha intervención podrá ir seguida por la implantación de material implantable para mejorar la maduración de la fístula revisada o de mantener la funcionalidad de la fístula revisada y rescatar una fístula que falle o que haya fallado

Resultados previstos del estudio de fístulas AV. Se espera que los pacientes tratados con el material implantable del presente invento anteriormente descrito presentarán uno o más indicios de una mejora de la maduración de la fístula y/o de la prevención del fallo de la fístula para madurar. Específicamente, los pacientes tratados individualmente presentarán, por ejemplo, una corriente sanguínea mejorada, hasta un caudal suficiente para diálisis (por ejemplo, una corriente sanguínea dentro del intervalo de 35-500 ml/minuto y preferiblemente al menos 350 ml/minuto) o una mejor capacidad para canular en repetidas ocasiones la fístula para diálisis. Otro de los indicios de la maduración de una fístula es el espesor de las paredes de las venas; una fístula madura o que esté madurando de forma satisfactoria presenta un engrosamiento de las paredes de las venas. Esto se medirá usando ultrasonografía intravascular (en adelante IVUS) de acuerdo con las técnicas clínicas estándar. Dicho brevemente, la IVUS se usará para medir el espesor de las paredes de las venas y discriminar entre espesor de la capa íntima o de la capa media. La fístula tratada o de control se canulará, y se colocará la sonda ultrasonido dentro de las venas y arterias objetivo. . Todavía otro indicio de una fístula que funciona es un diámetro de luz adecuado. Se espera que el material implantable del presente invento permita mantener un diámetro de luz adecuado, permitiendo de ese modo una corriente sanguínea sin impedimentos en caudales adecuados para una diálisis eficaz, es decir, una corriente sanguínea que sea marginalmente mayor que el caudal de la bomba de la máquina de diálisis, o bien, al menos un caudal de sangre adecuado para prevenir la recirculación durante la diálisis. El diámetro de la luz se monitorizará por series usando angiografía de la fístula que comience el día nº 5 después de su creación y después de esto al menos 3 meses después de la intervención quirúrgica. El estrechamiento de la luz después de la intervención quirúrgica se correlacionará con los caudales sanguíneos usando protocolos estándar de ultrasonografía Doppler. Se espera que el material implantable prevendrá o retrasará el estrechamiento que impide la circulación de la corriente sanguínea por debajo de un caudal adecuado para diálisis como se ha indicado en la presente memoria. Este estrechamiento de la luz que caracteriza a una fístula que haya fallado puede surgir debido a una estenosis y al aumento de espesor correspondiente de la capa íntima, o bien puede surgir por un encogimiento o contracción del vaso sin ningún aumento correspondiente de espesor. En el caso de un aumento real del espesor, en la actualidad una intervención de angioplastia constituye un medio clínico estándar; en el caso de un encogimiento y/o una contracción debidos, por ejemplo, a una remodelación negativa del tejido, la dilatación es actualmente una intervención clínica estándar. Se espera que una fístula tratada con implante no requiera angioplastia o dilatación.

Como grupo, se espera que los pacientes tratados muestren como mínimo diferencias incrementales en al menos uno de los indicios anteriormente mencionados de maduración comparados con los controles.

Ejemplo 2. Estudio de injertos AV en animales

Este ejemplo provee protocolos experimentales para ensayar y usar una realización preferida del presente invento con el fin de promover la formación de un injerto AV funcional en pacientes de ensayo animales. Usando intervenciones quirúrgicas estándar, se creó un injerto AV entre la arteria carótida y la vena yugular. Luego se dispuso material implantable en el espacio perivascular adyacente a cada anastomosis de injerto AV creada quirúrgicamente; los detalles de una intervención ejemplar se especifican más adelante. Como se ha descrito antes, se pueden variar la colocación y configuración del material implantable. .En este estudio, el material implantable estaba en una forma plana flexible, como se ha representado en la Figuras 4A, 4B y 4C.

Específicamente, el estudio incluyó 26 pacientes de ensayo de ganado porcino a los que se practicó una intervención quirúrgica para un injerto AV. Se realizaron intervenciones quirúrgicas convencionales para injertos AV de acuerdo con las técnicas operatorias estándar. El material implantable se aplicó a las anastomosis de injerto AV y alrededores, según se describe más adelante, después que se completó la cirugía del injerto y se estableció la circulación de la corriente sanguínea a través del injerto.

Para cada participante experimental que fue sometido a cirugía de injerto AV, se colocó un injerto d politetrafluoretileno (en adelante PTFE) de un diámetro interior de seis milímetros entre la arteria carótida izquierda común y la vena yugular externa derecha del participante experimental Se creó una anastomosis terminolateral oblicua en cada extremo del injerto usando una sutura continua de polipropileno 6-0. Todos los participantes experimentales recibieron heparina intraoperatoria . y se les administró diariamente aspirina a continuación de la intervención quirúrgica.

Diez de los participantes experimentales recibieron material implantable que comprendía células endoteliales aórticas en el día de la intervención quirúrgica. Se aplicaron cinco de dichos implantes a cada participante experimental. Dos de los implantes se envolvieron alrededor de cada una de las dos zonas anastomósicas. En esta circunstancia, un extremo del material implantable se pasó por debajo del segmento anastomósico hasta que la parte central del implante estaba en el punto donde se encuentran el vaso y el injerto. Luego se envolvieron ambos extremos alrededor de la línea de sutura, manteniendo el implante centrado sobre la línea de sutura. Los extremos se solaparon mínimamente para sujetar el material en posición. Se colocó un único implante adicional según la longitud del segmento venoso proximal comenzando en la anastomosis de cada participante experimental El implante no quedaba completamente envuelto alrededor de la circunferencia de la vena.

Las zonas anastomósicas se envolvieron con material implantable, por ejemplo, según se ha ilustrado en las Figuras 4A y 4B. Adicionalmente, el segmento venoso proximal (distal a la anastomosis venoso-arterial) se trató colocando el material implantable longitudinalmente según la longitud de la vena comenzando en la zona anastomósica, por ejemplo, como se ha ilustrado en la Figura 4C.

Diez participantes experimentales recibieron implantes de control sin células, envueltos alrededor de las zonas anastomósicas y colocados en el segmento venoso proximal del injerto en el día de la intervención quirúrgica; por ejemplo, como se ha dibujado en las Figuras 4A, 4B y 4C. 6 participantes experimentales adicionales no recibieron ningún tipo de implante. Estos 6 pacientes experimentales se usaron para comparación con el tratamiento de referencia. La carga total de células basándose en el peso del cuerpo fue aproximadamente 2,5 X105 células por kg. Se espera que esta carga de células sea aproximadamente al menos de 6 a 10 veces la carga de células estimada que se usará en un estudio clínico humano según se describe más adelante.

Intervención quirúrgica. Se realizó una incisión de línea central longitudinal de cuello de 15 cm y se aisló la arteria carótida izquierda común seguida por la vena yugular externa derecha. Un segmento de 8 cm de la vena se liberó de los tejidos circundantes y todos los tributarios a la altura de la vena se ligaron con suturas de seda 3-0. La arteria carótida izquierda se fijó y se realizó una arteriotomía circunferencial de 7 mm de diámetro. Se realizó una anastomosis terminolateral oblicua entre la arteria y un injerto de PTFE de 6 mm de diámetro interior usando una sutura continua 6-0 de polipropileno. Una vez realizada, se retiró la pinza arterial y se lavó a presión el injerto con solución salina y heparina. Se introdujo la corriente sanguínea a través de la arteria en el injerto. Luego se introdujo el injerto a través de un túnel por debajo de los músculos esternocleidomastoideos y se llevó a las proximidades de la vena yugular externa derecha.

Se realizó una venotomía circunferencial de 7 mm de diámetro directamente en la vena yugular externa. Luego se completó el injerto arteriovenoso con una anastomosis terminolateral oblicua entre el injerto de PTFE y la vena yugular externa derecha usando una sutura continua 6-0 de polipropileno (la longitud del injerto era de entre 15 y 25 cm y se registró en el momento de la colocación). Se retiraron todas las pinzas y se confirmó la corriente sanguínea a través del injerto. La artera carótida izquierda distal a la anastomosis de PTFE se ligó doblemente con suturas de seda 3

0.

A continuación de la terminación de las anastomosis, se posicionó el injerto arteriovenoso de PTFE para prevenir la formación de roscas. El injerto arteriovenoso de PTFE se canuló por vía percutánea con una aguja con aletas del calibre 22 justo distal a la anastomosis del injerto de la arteria carótida. Para confirmar la colocación, se aspiró sangre al interior del sistema con una jeringuilla de 10 cc. Luego se lavó a presión el sistema con 10 cc de solución salina. Luego se colocó un radioscopio de arco sobre el cuello del animal en estudio para que se pudiesen visualizar la anastomosis del injerto venoso y la vía venosa eferente. Bajo la radioscopia continua, se inyectaron de 10 a 15 cc de contraste yodado (Renograffin, plena intensidad). Se registró la angiografía de la radiocinematografía y se guardó para compararla con el angiograma previo al sacrificio del animal

Una vez terminada la angiografía, se envolvieron las zonas anastomósicas con una esponja de gasa húmeda de 10,16 cm X 10,16 cm (4” X 4”). Se mantuvo presión sobre las zonas anastomósicas durante un período de aproximadamente 5 minutos, antes de retirar las esponjas de gasa y de inspeccionar las zonas anastomósicas. Si aún no se había logrado la anastomosis, como evidenciaba la sangría lenta, se volvió a envolver la zona durante otros 5 minutos. Se colocaron suturas adicionales a la discreción del cirujano si la hemorragia de la zona era intensa. Una vez lograda la hemostasis se rellenó la herida del cuello con solución salina y se realizó un análisis de flujo sanguíneo con sonda en la vía eferente venosa distal usando una sonda de flujo Transonic de 6 mm. Se retiró la solución salina, de haber sido necesario, y las anastomosis se secaron todo cuanto fue posible y se trataron con material implantable que comprendía células endoteliales aórticas e implantes de control. Las zonas no se trataron con cualquiera de los dos tipos de implante hasta que se hubo controlado toda la hemorragia, confirmado el flujo que pasaba por el injerto, y secado el área todo lo posible. Una vez terminada la intervención, se cerró la herida en estratos y se dejó que el animal se recuperase de la anestesia.

Se administró heparina antes de la intervención quirúrgica en la forma de una inyección en embolada de 100 U/kg/hora más una infusión continua de 35 U/kg/hora y se mantuvo hasta el final de la intervención. Se administraron dosis en emboladas adicionales (100 U/kg) lo necesario para mantener los ACT � 200 segundos.

Persistencia de los injertos.

Se confirmó la persistencia de los injertos mediante medidas de flujo de acceso usando ultrasonografía Doppler de flujo de color y sonda de flujo Transonic (fabricada por Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY) inmediatamente después de la intervención quirúrgica, de 3 a 7 días después de la intervención quirúrgica, y una vez a la semana después de lo anterior. Se monitorizaron los injertos minuciosamente en cuanto al flujo sanguíneo.

Procedimientos patológicos.

Los animales experimentales se anestesiaron usando pentobarbital sódico (65 mg/kg, intravenosos). Se dejaron al descubierto los injertos de PTFE y se realizaron una fotografía digital del injerto de PTFE y una anastomosis venosa. Luego se canuló el injerto arteriovenoso de PTFE por vía percutánea con una aguja de aletas calibre 22 justo distal a la anastomosis del injerto de la arteria carótida. Para confirmar la colocación, se aspiró sangre al interior del sistema con una jeringuilla de 10 cc. Después se lavó a presión el sistema con 10 cc de solución salina. Luego se colocó un radioscopio de arco sobre el cuello del animal, para que pudieran visualizarse la anastomosis del injerto venoso y la vía eferente venosa. . Bajo radioscopia continua, se inyectaron de 10 a 15 cc de contraste yodado (Renograffin, plena intensidad). La angiografía de la radiocinematografía se registró en ángulos de 0º y 90º con respecto al injerto de PTFE. Se determinaron la persistencia del injerto y el grado de estenosis de la vía eferente venosa mediante una lectura con enmascaramiento de los angiogramas de necroscopia en comparación emparejada con los angiograamas posteriores a la colocación. Los angiogramas se clasificaron en una escala de 0 a 5 dependiendo del grado de estenosis observado en los mismos. El esquema de clasificación empleado fue el siguiente: 0 = 0% de estenosis, 1 = 20% de estenosis, 2 = 40% de estenosis, 3= 60% de estenosis, 4 = 80% de estenosis, y 5 = 100% de estenosis. Se anticipaba que los injertos tratados con el material implantable del presente invento presentarían un porcentaje de estenosis disminuido en comparación con el control tras el examen de los angiogramas.

Histología La mitad de los animales experimentales (5 con implante de células injertado, 5 con implante de control, 3 sin implantes) se sacrificaron 3 días después de la intervención quirúrgica. Los restantes animales experimentales (5 con implantes injertados, 5 con implantes de control, 3 sin implantes) se sacrificaron un mes después de la intervención quirúrgica.

Se realizó en todos los animales experimentales una necroscopia limitada, definida como el examen macroscópico de la zona de administración, incluyendo todas las zonas anastomósicas y zonas venosas proximales, y el tejido circundante incluyendo los nódulos linfáticos de drenaje. Se recogió el tejido de los órganos principales, incluyendo el cerebro, los pulmones, los riñones, el hígado, el corazón y el bazo, y se guardó para todos los animales experimentales sacrificados en un mes después de la intervención quirúrgica. Los órganos iban a analizarse solamente si surgían hallazgos inusuales del examen macrocópico de la superficie externa del cuerpo, o del examen microscópico de las zonas de administración y del tejido circundante. No surgieron hallazgos inusuales que exigiesen un examen adicional de los órganos principales en cualquiera de los animales integrantes del estudio.

Todas las zonas anastomósicas de injerto AV y los tejidos circundantes, incluyendo segmentos de 5 cm. de cada una de la vena y arteria anastomosizadas, se cortaron, se fijaron con formalina al 10% (o su equivalente) y se incluyeron en glicolmetilacrilato ( o su equivalente). Usando secciones de un espesor de aproximadamente 3 �m cortadas con un bisturí de acero inoxidable en arco (o su equivalente), se prepararon secciones de como mínimo tres regiones: la anastomosis de injerto de vena, la anastomosis de injerto de arteria, y la vía eferente venosa. Tres secciones se hicieron transversalmente a través de la anastomosis de injerto de vena. Cinco secciones se hicieron a través de la vía eferente venosa (por tanto cubriendo 1,5 cm. de vena eferente). Tres secciones se hicieron a través de la anastomosis de arteria de injerto en intervalos de 1 mm. Estas secciones se montaron en portaobjetos de vidrio (o su equivalente) recubiertos de gelatina y se tiñeron con hematoxilina y eosina o con tinte de elastina de Verhoeff.

Se determinará la inflamación perivascular y luminal tanto de carácter agudo (participantes de 3 días) como de carácter crónico (participantes de 1 mes). La inflamación aguda se marca mediante granulocitos, principalmente neutrófilos, mientras que la inflamación crónica se marca mediante macrófagos y linfocitos. Adicionalmente, las secciones se pueden teñir con los siguientes marcadores específicos: anti-CD45 para identificar leucocitos, anti-CD3 para identificar células T, CD79 para identificar células B y MAC387 para identificar monocitos o macrófagos.

Los portaobjetos teñidos se examinarán para detectar la presencia de células de músculo liso y células endoteliales y para detectar indicaciones de integración entre la anastomosis arterial o venosa y el material de injerto artificial. Todas las secciones del tejido aislado, incluyendo el material del injerto, la capa íntima o la seudoíntima, la parte interior de la capa media cerca de la luz, la parte exterior de la capa media cerca de la capa adventicia, y la capa adventicia para cada una de las anastomosis de injerto de vena., la anastomosis injerto de arteria, y la vía eferente venosa, se evaluarán y puntuarán. Se medirá en micras el tamaño de cada uno de los compartimentos de tejido, por ejemplo, la capa íntima, la capa media y la capa adventicia. Cada sección se evaluará para detectar la presencia o extensión de los criterios siguientes. Se evaluarán los indicios de inflamación, incluyendo, pero sin carácter limitativo, la presencia y extensión de neutrófilos, linfocitos, macrófagos, eosinófilos, células gigantes y células de plasma. Se evaluarán las secciones de injerto para detectar la presencia de fibroblastos, neovascularización, calcificación, hemorragia, congestión, fibrina, fibrosis de injerto e infiltración de injerto. Las secciones de tejido se evaluarán además para detectar los indicios de degeneración, incluyendo, pero sin carácter limitativo, la pérdida de elastina o la ausencia de la parte

5 de tejido, la vacuolación de miofibras de músculos lisos o la calcificación del tejido. Las secciones de tejido se evaluarán también para detectar la presencia de necrosis de tejido y de materias extrañas. Se asignarán puntuaciones para cada variable en una escala de 0 a 4 (0 = cambios no significativos; 1 = cambios mínimos; 2 = cambios suaves; 3 = cambios moderados; y 4 = cambios intensos).

10 Secciones adicionales de zonas anastomósicas de injertos arteriovenosos . solamente de los participantes animales del ensayo de 1 mes se montarán en portaobjetos de vidrio y se teñirán (con elastina de Verhoeff) para realizar análisis morfométricos. Se tomarán medidas del volumen la capa luminal, de la capa media, de la capa íntima, y del volumen total de vaso usando planimetría digital

15 computerizada con un vídeo microscopio y software personalizado para cada sección. Para cada sección se determinará la extensión de hiperplasia de la capa íntima. Un método de cuantificar la hiperplasia de la capa íntima es mediante la normalización del área de la capa íntima por el área total de la pared del vaso [ capa íntima, en mm2) / (capa íntima + capa media, en mm2)], o mediante la determinación de la luz residual [

20 (luz, en mm2) / (luz + capa íntima, en mm2)].

Resultados para los animales participantes con injertos AV. Los participantes tratados con el material implantable del presente invento según se ha expuesto anteriormente presentaron uno o más indicios de la formación de un injerto AV clínicamente funcional. Los injertos AV tratados de acuerdo con los materiales y métodos descritos en la presente memoria soportaron caudales sanguíneos suficientes para permitir diálisis. Una diálisis eficaz requiere una corriente sanguínea que sea marginalmente mayor que el caudal de bombeo de la máquina de diálisis, o al menos un caudal sanguíneo adecuado para prevenir la recirculación durante la diálisis. Asimismo, los participantes tratados individualmente presentaron una menor incidencia de dehiscencia definida como la separación de la vena o arteria anastomósicas del injerto de PTFE, y una integración mejor del puente protésico definida como una proliferación o migración de células de músculos lisos o de células endoteliales en o dentro de la luz del puente protésico. La corriente sanguínea fuera del injerto AV en la zona eferente venosa era comparable a la de la zona del injerto. Tal como se usa en la presente memoria, el término “comparable” significa sustancialmente similar para fines clínicos. Por ejemplo, el caudal sanguíneo previsto es aproximadamente 150-500 ml/minuto, preferiblemente alrededor de 300-500 ml/minuto, y con más preferencia aproximadamente 350-400 ml/minuto.

Adicionalmente, se medirá como un indicio de integración .la migración de células de músculos lisos o de células endoteliales hacia el interior o dentro del puente protésico. Se contempla que el material implantable del presente invento promoverá la proliferación de células de músculos lisos y la proliferación de células endoteliales, así como la migración de ambas al interior del puente. Se podrían obtener tres secciones de cinco micrómetros a través del injerto de PTFE y teñirse para actina de SMC y evaluarse para identificar SMC y Factor VIII (Factor de von Willebrands) o moléculas de adherencia de células endoteliales y plaquetas (en adelante PECAM)-1 para identificar células endoteliales. Las células endoteliales se cuantificarán usando microscopia /morfometría y software personalizado.

Todavía otro indicio de un injerto AV que funcione es un diámetro de luz adecuado. Los implantes del presente invento permiten el mantenimiento de un diámetro de luz adecuado mediante la reducción de la estenosis de los vasos y permitiendo de ese modo una corriente sanguínea sin obstrucciones en caudales adecuados para una diálisis eficaz, es decir, una diálisis eficaz requiere una corriente sanguínea que sea marginalmente mayor que el caudal de bombeo de la máquina de diálisis, o al menos un caudal sanguíneo adecuado para prevenir la recirculación durante la diálisis. Se monitorizaron el diámetro de la luz y el porcentaje de estenosis usando angiografía de las anastomosis de injertos arteriovenosos en el día de la creación del injerto arteriovenoso y justo antes del sacrificio a los 30 días. El estrechamiento de la luz después de la intervención quirúrgica se correlacionó con los caudales sanguíneos usando protocolos estándar de ultrasonografía Doppler.

El material implantable del presente invento redujo la presencia y el grado de estenosis de las anastomosis tratadas comparadas con los implantes de control. En la Tabla 1, a continuación, se presentan los porcentajes de estenosis, determinados por angiografía, para cada participante tratado en el estudio. Por término medio, el material implantable redujo la estenosis en un noventa y cinco por ciento, desde un 46% en los animales controlados hasta un 2,5% en los que recibieron implantes ( [462,5 ] /46 X 100 ). Los resultados se confirmarán histológicamente. Estos estudios enseñan que el presente invento previno o retrasó el estrechamiento que reduce la corriente sanguínea por debajo de un caudal adecuado para diálisis, promoviendo de ese modo la funcionalidad de una anastomosis de injerto AV.

Animal Nº

Grupo Porcentaje de estenosis (ángulo de 0º con el injerto) Porcentaje de estenosis (ángulo de 90º con el injerto) Porcentaje medio de estenosis

1956 1957 1664 1667 1624 1659 1666 1670

2 2 2 2 3 3 3 3 30% 80% 60% 0% ND 0% 0% 0% 20% 80% 80% 20% 0% 0% 205 0% 25% 80% 70% 10% 0% 0% 10% 0%

Grupo 2: implante de control recibido solamente de matriz biocompatible. Grupo 3: Material implantable recibido en una forma plana flexible que comprende células y matriz biocompatible.

Ejemplo 3: estudio clínico de injertos AV humanos Este ejemplo provee protocolos experimentales para ensayar y usar el invento

10 con el fin de promover la formación de un injerto AV funcional en participantes humanos en estudios clínicos. Usando intervenciones quirúrgicas estándar, se crea una anastomosis de injerto AV en la ubicación anatómica prevista y se coloca un puente protésico ePTFE entre las anastomosis arterial y venosa. Luego se deposita el material implantable en el espacio perivascular adyacente a cada anastomosis de

15 injerto creada quirúrgicamente; más adelante se especifican los detalles de un ejemplo de intervención quirúrgica. Según se ha expuesto anteriormente, los facultativos expertos en la técnica pueden variar la colocación o la configuración de material implantable de una manera rutinaria. Específicamente, el estudio incluye participantes humanos en los ensayos que

20 se someten a intervenciones quirúrgicas de injertos AV. Se realizarán intervenciones quirúrgicas convencionales de acuerdo con las técnicas operatorias estándar. Se aplicará el material implantable del presente invento a las anastomosis de injerto AV y a sus alrededores según se describe más adelante después que se haya completado la intervención quirúrgica y que se haya establecido el caudal sanguíneo a través del injerto.

Los participantes humanos en el estudio clínico recibirán una o más partes del material implantable el día de la intervención quirúrgica. Se aplicarán dos o tres de dichas partes a cada participante. Una parte de material implantable se envuelve alrededor de cada zona anastomósica. Luego se pasa un extremo por debajo del segmento anastomósico hasta que la mitad de la envoltura esté en el punto donde se encuentran el vaso y el injerto. Luego se envuelven ambos extremos alrededor de la línea de sutura manteniendo el implante centrado sobre la línea de sutura. Los extremos se pueden solapar para sujetar el material en posición. Se colocará una única parte adicional de material implantable en el segmento venoso proximal del injerto arteriovenoso, longitudinalmente según la longitud de la vena empezando en la anastomosis, de cada participante en el estudio. El material implantable no requiere envolverse completamente alrededor de la circunferencia de la vena. Las zonas anastomósicas se tratarán con implantes preferidos, por ejemplo, según se ha ilustrado en las Figuras 4A, 4B y 4C, o como se ha ilustrado en la Figura 5. Adicionalmente, en ciertos pacientes, el segmento venoso proximal (distal a la anastomosis arteriovenosa) se trata colocando un implante preferido longitudinalmente según la longitud de la vena comenzando en la zona anastomósica. Se espera que la carga total de células basada en el peso del cuerpo será aproximadamente de 2,0 X 104 células por kg hasta aproximadamente 6,0 X 104 células por kg.

Se realizarán seguimientos clínicos a los 5 días, a las 2 semanas y a los 1, 3 y 6 meses. Se requerirán medidas de la corriente sanguínea de acceso usando ultrasonografía Doppler con flujo de color en el día 5, para establecer un nivel de referencia, seguidas a loa 2 semanas, 1 mes, 3 meses y 6 meses después de la intervención quirúrgica. A los participantes en el estudio que presenten un caudal sanguíneo absoluto de menos de 350 ml/minuto, o mayor que una reducción del 25% en caudal desde la medida anterior, o mayor que el 50% de la estenosis de área (medida por la ultrasonografía Doppler) se les tomará referencia para angiografía. Se permitirá una intervención clínica reparadora tal como una angioplastia para lesiones estenósicas de más del 50% determinadas por angiografía.

Se realizará una angiografía de contraste del injerto, así como en las zonas anastomósicas arterial y venosa, en la línea de referencia y a los 3 meses. Se calculará el diámetro de luz para cada región y se medirá el valor máximo de la velocidad sistólica.

Resultados esperados del estudio clínico de injertos AV humanos

Se espera que los participantes tratados con el material implantable del presente invento según se ha descrito anteriormente presenten uno o más indicios de la formación de un injerto AV clínicamente funcional. Específicamente, los pacientes tratados individualmente presentarán, por ejemplo, un caudal sanguíneo mejorado, hasta como mínimo un caudal suficiente para diálisis (por ejemplo, un caudal sanguíneo dentro del intervalo de 35-500 ml/minuto y preferiblemente al menos 350 ml/minuto), una menor incidencia de extracciones serosas en el peri-injerto y seudoaneurisma, y una integración mejorada del puente protésico definida como la proliferación o migración de las células de músculos lisos o de las células endoteliales en o dentro de la luz del puente protésico. El caudal sanguíneo fuera del injerto AV en la zona eferente venosa será comparable al de la zona del injerto. El término “comparable” significa sustancialmente similar para fines clínicos. Por ejemplo, el caudal sanguíneo previsto es aproximadamente 150-500 ml/minuto, preferiblemente alrededor de 300-500 ml/minuto, y con más preferencia alrededor de 350-400 ml/minuto.

Adicionalmente, se medirá la migración de células de músculos lisos o de células endoteliales en o dentro del puente protésico por ultrasonografía intravascular como un indicio de integración. Se espera que el material implantable del presente invento, cuando se use según se ha descrito en la presente memoria, promoverá una proliferación de las células de músculos lisos o una proliferación de las células endoteliales, así como la migración de ambas al interior del puente.

Todavía otro indicio de un injerto AV que funcione es el diámetro de luz adecuado. Se espera que los implantes del presente invento permitan el mantenimiento de un diámetro de luz adecuado, permitiendo de ese modo una corriente sanguínea sin obstrucciones en caudales adecuados para una diálisis eficaz, es decir, una diálisis eficaz requiere una corriente sanguínea que sea marginalmente mayor que el caudal de bombeo de la máquina de diálisis, o como mínimo un caudal sanguíneo adecuado para prevenir la recirculación durante la diálisis. El diámetro de la luz se monitorizará usando angiografía de la anastomosis arteriovenosa en la línea de referencia (aproximadamente 5 días después de la creación del injerto arteriovenoso) y después de esto al menos 3 meses después de la intervención quirúrgica. El estrechamiento de la luz después de la intervención quirúrgica se correlacionará con los caudales sanguíneos usando protocolos estándar de ultrasonografía Doppler. Se espera que el presente invento, cuando se use según se ha describe en la presente memoria, impida o retrase el estrechamiento que obstruye la corriente sanguínea por debajo de un caudal adecuado para diálisis según se ha descrito en la presente memoria.

En el caso de los injertos AV, se espera que el material implantable del presente invento impida o reduzca la incidencia de dehiscencia.

Como grupo, se espera que los participantes tratados presenten al menos diferencias incrementales en como mínimo uno de estos indicios anteriormente mencionados de funcionalidad, comparándolos con los controles.

Ejemplo 4: estudio de injertos periféricos

Este ejemplo provee protocolos experimentales para ensayar y usar una realización preferida del presente invento con el fin de promover la formación de un injerto periférico funcional en los participantes en el estudio clínico. Usando intervenciones quirúrgicas estándar, se crea una anastomosis de injerto periférico en la ubicación anatómica prevista y se coloca un puente protésico de ePTFE entre las anastomosis. Luego se dispone el material implantable en el espacio perivascular adyacente a cada anastomosis de injerto periférico creada quirúrgicamente; los detalles de un ejemplo e intervención quirúrgica se especifican más adelante. Según se ha expuesto anteriormente, se pueden variar la colocación y la configuración de material implantable.

Específicamente, el estudio incluye participantes en el ensayo que se someten a una intervención quirúrgica de injerto periférico. Se realizarán intervenciones quirúrgicas convencionales de acuerdo con las técnicas operatorias estándar. Se aplicará el material implantable a las anastomosis de injerto periférico y alrededores según se describe más adelante después de completar la intervención quirúrgica y de haberse establecido la corriente sanguínea a través del injerto.

Los participantes en el estudio clínico recibirán uno o más materiales implantables en el día de la intervención quirúrgica. Dos o tres de dichos implantes se aplicarán a cada participante en el estudio clínico. Uno de tales implantes se envuelve alrededor de cada zona anastomósica. Un extremo del material implantable se pasa luego por debajo del segmento anastomósico, hasta que la parte central de la envoltura esté en el punto donde se encuentran el vaso y el injerto. Luego se envuelven los extremos alrededor de la línea de sutura, manteniendo al implante centrado sobre la línea de sutura. Los extremos se pueden solapar entre sí para sujetar el material en posición. Se colocará un único implante adicional en el segmento venoso proximal del injerto periférico, longitudinalmente según la longitud de la vena empezando en la anastomosis, de cada participante en el estudio clínico. El implante no necesita envolverse por completo alrededor de la circunferencia de la vena.

Las zonas anastomósicas se envolverán con material implantable, por ejemplo, como se ha ilustrado en las Figuras 4A, 4B y 4C, o como se ha ilustrado en la Figura

5. Adicionalmente, el segmento de vaso proximal (distal a la anastomosis) se trata mediante la colocación del material implantable longitudinalmente según la longitud del vaso comenzando en la zona anastomósica. La carga total de células basada en el peso del cuerpo será aproximadamente 2,0 X 104 células por kg, hasta aproximadamente 6,0 X 104 células por kg.

Se realizarán seguimientos clínicos a los 5 días, a las 2 semanas y a los 1, 3 y 6 meses. Se requerirán medidas de caudal sanguíneo usando ultrasonografía Doppler con flujo de color en el día Nº 5 para establecer una referencia, seguida a las 2 semanas, a 1 mes, 3 meses y 6 meses después de la intervención quirúrgica. A los participantes en el estudio clínico que presenten un caudal sanguíneo absoluto de menos de 350 ml/minuto, o mayor que una reducción del 25% en caudal desde la medida anterior, o mayor que el 50% de área de estenosis (medida por ultrasonografía Doppler) se les tomará referencia para angiografía. Se permitirá una intervención clínica reparadora tal como una angioplastia para lesiones estenósicas de más del 50% determinado por angiografía.

Se realizará una angiografía de contraste del injerto, así como de las zonas anastomósicas, Se calculará el diámetro de luz para cada región y se medirá el valor máximo de la velocidad sistólica.

Resultados esperados para participantes con injertos periféricos.

Se espera que los participantes tratados con el material implantable del presente invento según se ha descrito anteriormente presenten uno o más indicios de formación de un injerto periférico clínicamente funcional. Los injertos periféricos tratados de acuerdo con los materiales y métodos descritos en la presente memoria soportarán un caudal sanguíneo suficiente para restablecer o mantener una circulación de sangre clínicamente aceptable. Asimismo, los participantes tratados individualmente presentarán, por ejemplo, una menor incidencia de dehiscencia definida como la separación de la vena anastomósica del injerto de PTFE,.o una mejor integración del puente protésico definida como proliferación o migración de células de músculos lisos o de células endoteliales en o dentro de la luz del puente protésico. El caudal sanguíneo fuera del injerto periférico en la zona eferente será a comparable al de la zona del injerto. Tal como se usa en la presente memoria, el término “comparable” significa sustancialmente similar para fines clínicos. Por ejemplo, el caudal sanguíneo previsto es aproximadamente 150-500 ml/minuto preferiblemente alrededor de 300-500 ml/minuto, y con más preferencia aproximadamente 350-400 ml/minuto.

Adicionalmente, se medirá la migración de células de músculos lisos o de células endoteliales en o dentro del puente protésico como un indicio de integración. Se espera que el material implantable del presente invento promueva la proliferación de las células de los músculos lisos o la proliferación de las células endoteliales, así como la migración de ambas al interior del puente.

Todavía otro indicio de un injerto periférico que funciona es un diámetro de luz adecuado. Se espera que los implantes del presente invento permitan el mantenimiento de un diámetro de luz adecuado, permitiendo de ese modo una circulación de la sangre sin obstrucciones en caudales suficientes para mantener la circulación periférica. Se monitorizará el diámetro de la luz usando la angiografía del injerto periférico en la línea de referencia y al menos 3 meses después de la creación del injerto. El estrechamiento de la luz después de la intervención quirúrgica se correlacionará con los caudales sanguíneos usando protocolos de ultrasonido estándar con Doppler. Se espera que el material implantable del presente invento prevenga o retrase el estrechamiento que impida el flujo sanguíneo por debajo de un caudal adecuado para la circulación periférica según se ha descrito en la presente memoria.

En el caso de los injertos periféricos en derivación, se espera que el tratamiento con el material implantable del presente invento resulte en unos caudales sanguíneos que permitan una circulación clínicamente aceptable, o unos caudales aproximadamente normales. Serán comparables los caudales que entran y salen del injerto. El término “comparable” significa sustancialmente similar para fines clínicos. Por ejemplo, el caudal sanguíneo previsto es aproximadamente 150-500 ml/minuto, preferiblemente alrededor de 300-500 ml/minuto, y con más preferencia aproximadamente 350-400 ml/minuto. Adicionalmente, se espera que el tratamiento promueva la proliferación y la migración de células de músculos lisos y células endoteliales en el injerto protésico o nativo.

En el caso de injertos periféricos en derivación, se espera que el material implantable del presente invento impida o reduzca la incidencia de dehiscencia.

Como grupo, se espera que los pacientes tratados presenten como mínimo

diferencias incrementales en al menos uno de los indicios de funcionalidad

mencionados anteriormente comparados con los controles.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un material implantable que comprende células y una matriz biocompatible para usar en el tratamiento de una fístula arteriovenosa, de un injerto arteriovenoso o de un injerto periférico en derivación en un paciente, que comprende la etapa de ubicar el material implantable sobre una superficie exterior de la fístula o del injerto, en el que el material implantable es eficaz para promover una remodelación segura de la fístula o del injerto, efectuando de ese modo una dilatación vascular con una simultánea inhibición de la hiperplasia de la capa neoíntima venosa.

2. 2.

   El material implantable de la reivindicación 1, en el que las células son células endoteliales o células que tienen un fenotipo similar al endotelial

3. 3.

   El material implantable de la reivindicación 1, en el que la matriz biocompatible es un material plano flexible.

4. 4.

   El material implantable de la reivindicación 3, en el que la matriz biocompatible está configurada para su implantación en una anastomosis.

5. 5.

   El material implantable de la reivindicación 4, en el que la matriz biocompatible define una ranura o está configurada como en las Figuras 1 ó 2A.

6. 6.

   El material implantable de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la matriz biocompatible es una composición fluible.

7. 7.

   El material implantable de la reivindicación 6, en el que la matriz biocompatible es una composición fluible que conserva la forma.

8. 8.

   El material implantable de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la fístula arteriovenosa es una fístula arteriovenosa nativa.

9. 9.

   El material implantable de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la fístula arteriovenosa es radiocefálica, braquiocefálica o braquiobasílica.

10. 10.

    El material implantable de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la aplicación del material biocompatible a la fístula o injerto arteriovenosos va precedida por – o es coincidente con-la administración de un agente terapéutico.

11. 11.

    El material implantable de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la aplicación del material biocompatible a la fístula o injerto arteriovenosos va precedida por una dilatación física.

12. 12.

    El material implantable de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende la etapa de disponer dicho material implantable sobre

    una superficie exterior de dicha fístula o injerto en, adyacente a, o en las proximidades de la región eferente venosa del mismo.