ES2349030T3 - Tratamiento antibacteriano de la osteoartritis. - Google Patents
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Abstract
Uso de un agente antibacteriano en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la osteoartritis bacteriana primaria al tratar una infección bacte- riana que es responsable de la osteoartritis.
Description
El presente invento se refiere a la osteoartritis y a métodos para el tratamiento y el diagnóstico de la misma. La osteoartritis (OA) es también conocida como "enfermedad degenerativa de las articulaciones" y es el tipo más común de artritis, estimándose que sola
5 mente en los Estados Unidos de América afecta a 20,7 millones de adultos (datos de www.nih.gov/niams/healthinfo/artrheu.htm). La osteoartritis afecta principalmente al cartílago, el tejido que protege los extremos de los huesos en una articulación. Tiene lugar una osteoartritis cuando el cartílago comienza a deteriorarse, desgastarse y descomponerse. En casos extremos, el cartílago puede consumirse hasta dejar una
10 articulación de hueso sobre hueso. La osteoartritis puede causar dolor articular, movilidad articular reducida e incapacidad. Resulta muy a menudo una incapacidad cuando la enfermedad afecta a la columna vertebral y a las articulaciones que soportan peso (las rodillas y las caderas). Típicamente, los síntomas de la OA se desarrollan bastante lentamente.
15 Una articulación concreta puede doler o producir molestias después de un uso prolongado o después de un periodo de inactividad, tal como, por ejemplo, tras dormir. El dolor, la rigidez y la molestia empeorarán generalmente con el tiempo, y la amplitud de movimientos de la articulación puede llegar a reducirse. Un sonido chirriante al moverse indica que el cartílago de la articulación se ha desgastado y que los huesos están
20 rozando uno contra otro. La osteoartritis es conocida como "artritis degenerativa" y puede afectar a la rodilla, la cadera, la columna vertebral y otras estructuras; es el más común de todos los trastornos articulares humanos. La OA es clasificada como una artritis no inflamatoria y, por lo tanto, puede distinguirse de enfermedades reumáticas como la
25 artritis reumatoide, que es clasificada como una artritis inflamatoria. La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria del revestimiento de la articulación (sinovia), y se asocia con hinchazón e inflamación de ciertas articulaciones, dolor muscular y finalmente la pérdida de uso de la articulación en su conjunto. La inflamación tiende a ser simétrica, lo que facilita el diagnóstico de la artritis reumatoide. Otras enfermedades
30 del grupo de las enfermedades reumáticas incluyen la gota, que afecta muy comúnmente al dedo gordo del pie y se desarrolla rápidamente, la artritis infecciosa, que es una expresión general usada para describir las diversas formas de artritis causadas por agentes infecciosos tales como bacterias y virus, y la artritis reactiva, que se desarrolla después de una infección que afecta al tracto urinario, el intestino y otros órga
35 nos y se asocia a menudo con problemas oculares, erupciones cutáneas y úlceras bucales.
El término "artritis" se utiliza a veces para referirse a todas las enfermedades reumáticas; sin embargo, la palabra significa literalmente inflamación articular, es decir, hinchazón, enrojecimiento, ardor y dolor causados por una lesión o enferme
5 dad tisular en la articulación. Los diferentes tipos de artritis comprenden sólo una parte de las enfermedades reumáticas que también incluye enfermedades descritas como "enfermedades del tejido conjuntivo" y enfermedades autoinmunes tales como fibromialgia y lupus eritematoso sistémico. Como se discutió anteriormente, la OA ya no se ve como parte de este grupo puesto que es una artritis no inflamatoria.
10 No se conoce la causa de la OA, pero se cree que es el resultado de una combinación de factores. Se ha pensado que una edad avanzada, una historia familiar de la enfermedad, un uso excesivo o abuso de una articulación concreta, una lesión, la existencia de sobrepeso y otras enfermedades pueden contribuir al desarrollo de la OA. La causa o las causas de los tipos de artritis infecciosa (bacterias y virus)
15 y la gota (cristales de ácido úrico en la articulación) son mejor comprendidas por los científicos y los médicos. Se han investigado el papel de ciertas enzimas, endógenamente producidas, en la descomposición del cartílago articular en la OA y la posibilidad de utilizar fármacos que bloqueen la acción de estas enzimas. En particular, se libera espontá
20 neamente óxido nítrico, que es producido por una familia de enzimas llamadas óxido nítrico sintasas, del cartílago humano afectado por OA en cantidades suficientes para causar daño en el cartílago. Está la hipótesis de que el NO inhibe la producción de matriz al interferir en importantes factores autocrinos y paracrinos, y se ha mostrado que el NO inhibe la producción de TGF-�. Los condrocitos articulares activados produ
25 cen grandes cantidades de NO, y existe la creciente evidencia de que esto podría estar implicado en la etiopatogénesis de la osteoartritis. Es probable que los efectos biológicos del NO endógenamente producido, a causa de su corta semivida, se produzcan localmente dentro del cartílago (R. Studer, Osteoarthritis and Cartilage, Volumen 7, Número 4, Julio de 1999). Además, un componente importante del cartílago es el
30 colágeno de tipo II, que es degradado por la gelatinasa, una metaloproteinasa endógena. El diagnóstico de enfermedades reumáticas o la OA puede ser difícil porque ciertos síntomas son comunes a muchas enfermedades diferentes. El diagnóstico puede requerir la remisión a un reumatólogo ya que, incluso si se ha realizado el
35 diagnóstico de una de las enfermedades reumáticas, puede ser necesario que un especialista determine cuál.
Típicamente, el diagnóstico requerirá una revisión completa de la historia médica del paciente, incluyendo la historia familiar, un examen físico, pruebas de laboratorio, y rayos X u otras técnicas con formación de imágenes. El examen físico
5 incluirá típicamente la investigación de todas las articulaciones en cuanto a enrojecimiento, ardor, deformidad, facilidad de movimiento y sensibilidad. Puesto que ciertas formas de artritis, tal como el lupus, pueden afectar a otros órganos, puede resultar necesario un examen físico completo que incluya el corazón, los pulmones, el abdomen, el sistema nervioso, los ojos, los oídos y la garganta. Puede ser necesario llevar
10 a cabo en sangre, orina y/o líquido sinovial una de diversas pruebas de laboratorio que incluyen: para anticuerpos antinucleares, recuento sanguíneo completo, hematocrito, para factor reumatoide, y urinálisis.
Puede que el médico necesite ver al paciente más de una vez con objeto de hacer el diagnóstico, y la decisión final será generalmente un diagnóstico de tra15 bajo basado en un número de parámetros diferentes, que se basa en la competencia y la correspondiente experiencia del facultativo que realiza el examen. Una prueba menos subjetiva para la OA que fuera rápida y fácil de llevar a cabo mejoraría en gran medida el proceso diagnóstico. Puesto que la OA es común, sería útil para identificar positivamente la OA pero, igualmente, si se pudiera descartar la OA en una fase tem
20 prana, esto también sería considerablemente provechoso para el facultativo.
Hasta ahora, en cuanto a tratamientos actualmente disponibles para la OA, no hay un único tratamiento exitoso disponible para todos los pacientes. En un plan de tratamiento típico se combinan normalmente varios tipos de tratamiento dependiendo de la fase y la gravedad del estado y de las necesidades médicas y de esti25 lo de vida del paciente. Los tratamientos pueden incluir descanso y relajación, ejercicio, cambios en la dieta y medicación; en casos graves, puede ser necesaria la cirugía. Se admite generalmente (www.nih.gob/niams/healthinfo/artrheu.htm) que las medicaciones disponibles usadas para tratar la mayoría de las enfermedades reumáticas y la OA no proporcionan una cura sino que, más bien, limitan los síntomas
30 de la enfermedad. Aunque la artritis infecciosa (por ejemplo, la enfermedad de Lyme), si se diagnostica a tiempo, puede ser exitosamente tratada con antibióticos. Las medicaciones comúnmente utilizadas para tratar la OA proporcionan un alivio del dolor. Los analgésicos adecuados incluyen la aspirina y otros fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAIDs; del inglés, non-steroidal anti-inflammatory
35 drugs), tal como el ibuprofeno (que tienen la ventaja añadida de disminuir la inflama
ción asociada con el daño tisular). En los últimos años, los cambios tempranos en las articulaciones han sido quirúrgicamente tratados utilizando una combinación de células de cartílago cultivadas y cubierta perióstica del paciente, en un intento para reparar el cartílago dañado. Sólo un pequeño número de pacientes puede ser tratado mediante
5 este método caro e invasivo.
Se ha planteado la hipótesis [A. R. Amin et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, páginas 14.014-14.019] de que se podrían usar tetraciclinas en el tratamiento de la OA a causa de su capacidad para inhibir la expresión de la óxido nítrico sintasa (NOS; del inglés, nitric oxide synthase) endógena. La posibilidad de utilizar la
10 tetraciclina doxiciclina en el tratamiento de la OA a causa de su capacidad para inhibir la actividad colagenasa del paciente fue discutida por L. P. Yu et al. (1991) en J. Rheumatol. 18, páginas 1450-2. Aún no se ha lanzado al mercado un producto basado en estos compuestos. De la discusión anterior resulta evidente que los métodos existentes
15 para el diagnóstico y el tratamiento de la OA no son completamente satisfactorios. Dado el número de pacientes aquejados de OA, particularmente en las poblaciones occidentales envejecidas, existe la necesidad real de un diagnóstico rápido y fiable de la OA y de tratamientos mejorados para la misma. Siguiendo un nuevo y sorprendente descubrimiento, el presente invento proporciona una enseñanza que aborda estos dos
20 problemas. El presente inventor ha establecido, por vez primera, un vínculo entre bacterias y osteoartritis. Nunca se había sugerido antes que las bacterias pudieran ejercer un papel principal en la OA, y la identificación de este papel abre la posibilidad de una diversidad de nuevas técnicas terapéuticas y diagnósticas en el campo del cui
25 dado de los aquejados de OA. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto, el presente invento proporciona el uso de un agente antibacteriano en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la OA bacteriana primaria, mediante el tratamiento de una infección bacteriana que es responsable de la OA. Alternativamente expresado, el presente invento proporciona un agente antibacteriano para uso en el tratamiento de
30 una OA bacteriana primaria, mediante el tratamiento de una infección bacteriana que es responsable de la OA. Los síntomas y el diagnóstico de la OA se discutieron anteriormente y, aunque puede ser un proceso complejo, un facultativo adecuadamente experimentado normalmente puede diagnosticar exitosamente la OA. Una definición útil de la OA para
35 los fines del presente invento es la siguiente: dolor en una o más articulaciones, desgaste gradual del cartílago de esa articulación (típicamente durante varios años), más ausencia de síntomas de cambios artríticos como los que se hallan, por ejemplo, en la artritis reumatoide.
Los cambios típicos hallados en las radiografías de pacientes con OA
5 incluyen un espacio articular estrecho y esclerosis subcondral. La OA se caracteriza por dolor y pérdida de función de la articulación causadas por una pérdida generalmente progresiva de cartílago articular, lo que va seguido de un intento de reparación del cartílago articular y también de remodelación y esclerosis del hueso subcondral. También se pueden hallar osteofitos y quistes en el hueso subcondral y sinovitis se
10 cundaria dentro de la articulación. Por contraste con las enfermedades reumáticas, la inflamación no es un aspecto principal de la enfermedad. La OA se puede dividir en OAs primaria y secundaria. La OA primaria es la forma más común y aparece con incidencia creciente al aumentar la edad; actualmente no hay cura disponible. El American College of Rheumatology (ACR),
15 http://www.rheumatology.org/patients/factsheets.html, proporciona la siguiente definición de OA primaria: La OA es un grupo heterogéneo de estados que conducen a sin-tomas y signos articulares que están asociados con una integridad defectuosa del cartílago articular, además de cambios relacionados en el hueso subyacente y los bordes de la articulación. El diagnóstico implicará típicamente la evaluación de aspectos pato
20 lógicos, radiográficos y clínicos. La OA secundaria es menos común, y sus causas incluyen anormalidades metabólicas, genéticas y de desarrollo del cartílago articular. En la OA secundaria, se reconoce un claro estado, proceso o enfermedad causal. A menudo se presenta OA secundaria en las circunstancias siguientes: síndrome de Stickler (artro-oftalmopatía
25 hereditaria progresiva), hemocromatosis, enfermedad por depósitos de pirofosfato de calcio, lesión en la superficie articular, inestabilidad de las articulaciones, incongruencia de las articulaciones, denervación (articulación de Charcot), displasias epifisarias, tras artritis séptica (infección), osteonecrosis, osteocondritis disecante, y años después de daño en el menisco y/o extirpación del menisco.
30 En realidad, los datos aquí presentados en relación con el papel de una infección bacteriana en el desarrollo de la OA podrían conducir a su clasificación como un estado secundario que resulta de una infección bacteriana inicial.
Los inventores son los primeros en identificar un papel primario (es decir, causal) de las bacterias en la OA; es decir, una infección puede ser un proceso 35 primario o ser secundaria a un proceso de iniciación en la OA pero, no obstante, es
responsable de uno o más (típicamente la mayoría o todos) de los síntomas característicos de la OA y/o de exacerbar dichos síntomas. Por lo tanto, la expresión "responsable de" debería ser interpretada teniendo en cuenta esta relación.
Los datos clínicos aquí presentados en relación con el tratamiento de
5 pacientes osteoartríticos con un antibiótico confirman los datos moleculares y demuestran un papel de las bacterias en la osteoartritis. Se consideró que la mayoría de los pacientes examinados mostraban síntomas mejorados después de sólo 4 semanas de tratamiento con un antibiótico.
Aún sin pretender el respaldo de la teoría, parece probable que puede
10 haber cierto daño inicial en el cartílago y que la infección causativa de la OA se trasmite a través del líquido sinovial o a través de los vasos sanguíneos desarrollados alrededor del cartílago lesionado. Este papel activo de las bacterias en el desarrollo de la OA puede ser contrastado con las infecciones bacterianas secundarias que pueden tener lugar, por ejemplo, después de una cirugía y que no son en sí responsables de
15 los síntomas de la OA. Por ejemplo, se han descrito previamente antibióticos en un contexto profiláctico [B. Espehaug et al. (1997), J. Bone Joint Surg. Br., Julio; 79 (4), páginas 590-5]. En este estudio, se administraron antibióticos sistémicos y/o cemento que contenía antibióticos a pacientes osteoartríticos que acababan de recibir reemplazos de
20 cadera totales cementados primarios. Implantar un metal durante el tratamiento de fracturas o la OA significa aumentar el riesgo de infección ya que las bacterias pueden atravesar fácilmente la zona alrededor de un implante metálico. Sin embargo, el uso de antibióticos en este contexto no es para el tratamiento de una infección bacteriana que tiene un papel causal en la propia OA. Por contraste, de acuerdo con el presente
25 invento, el tratamiento es típicamente no profiláctico; es decir, se trata una infección establecida que es responsable de la OA observada. Además, las bacterias concretas que pueden causar problemas después de una operación son diferentes de las ahora identificadas por tener un papel causal en la OA y sus síntomas. El presente invento puede ser también distinguido de publicaciones ta
30 les como la de Amin et al. (supra), que sugieren un posible papel de las tetraciclinas en el tratamiento de la OA por medio de la capacidad de dichas moléculas para inhibir enzimas endógenas que incluyen NOS y colagenasa. Evidentemente, dichos documentos no tienen relación con, y no describen, el uso de tetraciclinas en el tratamiento de una infección bacteriana, siendo la actividad antibiótica secundaria a las actividades
35 de interés. En estos documentos no se sugiere un papel causal de bacterias en la OA.
Los inventores han sido capaces de establecer el vínculo entre bacterias y OA a través de una serie de experimentos. No se habían encontrado previamente bacterias en las articulaciones con osteoartritis primaria (excepto en casos con cirugía de intercambio después de aflojamiento). Como se discutió anteriormente, la artri
5 tis séptica (infecciosa) es un estado diferente, y en dichas articulaciones se encuentran normalmente bacterias tales como estreptococos y estafilococos y algunas especies Gram negativas. Sólo una combinación fortuita de técnicas, es decir, el modo de tomar biopsias, métodos de presentación diferencial modificados y finalmente el análisis de rRNA 16s alertó a los inventores de la posibilidad de una implicación bacteriana, lo que
10 luego se confirmó. Se presenta la hipótesis de que la presencia de bacterias puede haber estado "oculta" en el pasado porque es difícil desarrollar las bacterias pertinentes en ensayos de cultivo estándares.
Todos los pacientes incluidos en el grupo "osteoartrítico" pasaron por procedimientos de artroplastia en una rodilla. Se tomaron las biopsias durante la ciru15 gía, cuando la articulación estaba siendo reemplazada tanto en el lado femoral como en el tibial. El diagnóstico de la osteoartritis se basaba en dolor en la articulación, un típico desgaste gradual del cartílago durante años, falta de signos de cambios artríticos como los hallados en la artritis reumatoide, y los típicos cambios hallados en radiografías, tales como espacio articular estrecho y esclerosis subcondral. Los cambios
20 patológicos estaban muy avanzados; esto viene respaldado por la necesidad de los pacientes a someterse a una artroplastia de la articulación. Uno de los grupos testigo incluidos eran pacientes con cartílago normal, de los cuales se tomaron muestras durante el reemplazo del ligamento cruzado anterior. Ningún trauma reciente había alterado las rodillas sometidas a esta operación, y
25 el trozo de cartílago estudiado hubo de ser extirpado durante el procedimiento de reemplazo para permitir el espacio suficiente para que funcionara el ligamento reparado. Se halló que ninguno de estos pacientes testigo tenía la secuencia génica bacteriana a identificar. En el otro grupo testigo, los pacientes sólo tenían zonas dañadas locali
30 zadas, sin daño general en la articulación. Todos fueron operados en un intento para recuperar la arquitectura y las funciones de un cartílago normal. Esta operación incluía el uso de condrocitos cultivados in vitro, la extirpación del cartílago dañado y el cubrimiento de la zona a reparar con periostio y las células cultivadas in vitro. Se halló que ninguno de los pacientes con este daño limitado del cartílago tenía el gen bacteriano.
35 Estos resultados sugieren que en las primerísimas fases del desarrollo de la OA puede haber poca o ninguna implicación bacteriana pero que una infección bacteriana es responsable del desarrollo de la verdadera OA y de los síntomas avanzados y más graves de la misma. Es el progreso hasta la OA verdadera (fase avanzada) en una articulación dada el responsable del dolor y la falta de movilidad experimentados por la
5 mayoría de los pacientes con OA, y, por lo tanto, serían deseables tratamientos que evitaran o lentificaran este progreso.
Los síntomas característicos de la OA de primera fase incluyen dolor durante la actividad y un nivel reducido de actividad. En una fase avanzada de la OA, se puede observar dolor durante el descanso y por la noche, así como durante la acti
10 vidad. Se reduce mucho la actividad y es común el uso de muletas. También se asocian con la OA avanzada un movimiento reducido de la articulación y rigidez en la articulación.
Desde el punto de vista del médico, en las primeras fases de la OA se halla dolor en la línea articular y puede haber un líquido sinovial aumentado en la arti15 culación. Las radiografías indican generalmente un estrechamiento del espacio articular porque el cartílago está reducido. Sin embargo, los barridos con formación de imágenes por resonancia magnética son más útiles que las imágenes por rayos X en las primeras fases ya que permiten identificar cambios tempranos en el cartílago y el hueso subcondral. Una artroscopia puede revelar fibrilación, grietas y defectos en el cartí20 lago. En la OA avanzada, hay dolor aumentado en la línea articular, palpación de osteofitos y normalmente líquido sinovial aumentado. Las radiografías revelan un estrechamiento significativo del espacio articular hasta la articulación, donde aparece como hueso contra hueso sin espacio para cartílago. Los rayos X también revelan esclerosis y quistes en el hueso subcondral, posible deformación de la articulación y normalmen
25 te osteofitos alrededor de los bordes de la articulación. La artroscopia revela cartílago ausente y degradado. También se describe aquí el uso de un agente antibacteriano en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir el desarrollo de, o el progreso hasta, una osteoartritis de fase avanzada. Si se diagnostica la OA en una fase muy
30 temprana, puede ser apropiado entonces un tratamiento profiláctico con un antibiótico. Se utilizó una técnica modificada de presentación diferencial, que aquí se describe con detalle en la sección "Ejemplos". La presentación diferencial es un método que se utiliza para descubrir genes que se expresan diferencialmente en una situación con respecto a otra. Se realiza la transcripción inversa de mRNA y, de la po
35 blación de cDNA, se multiplica un número pequeño de genes utilizando cebadores
seleccionados y PCR. La separación de las muestras bajo investigación (multiplicadas con los mismos conjuntos de cebadores) una al lado de la otra en un gel de alta resolución produce un patrón de bandas, cada una de las cuales representa un gen expresado de las muestras originales. Se dice que un gen/banda que se encuentra en una
5 muestra pero no en otra se expresa diferencialmente.
En este caso, se tomaron biopsias de la rodilla, de la parte osteoartrítica del cartílago de pacientes con OA y de otro paciente durante la reparación del ligamento cruzado. En un paciente con OA, se compararon las biopsias de la zona osteoartrítica con las de una zona no alterada. Hubo un problema con mRNA insuficiente
10 en la muestra de cartílago. El tejido cartilaginoso está compuesto de células condrocíticas rodeadas por matriz extracelular. El número total de células por gramo de tejido es pequeño. La matriz extracelular consiste esencialmente en colágeno (tipos II, IX, XI), proteoglicanos (agrecano) y otros moléculas grandes, tal como hialuronano. La extracción de mRNA de pequeñas muestras de cartílago produce niveles casi indetec
15 tables de mRNA. Esto se debe tanto al pequeño número de células en un pequeño trozo de tejido con pocas células por unidad de peso, como al efecto de la matriz extracelular sobre la eficacia de las extracciones/aislamiento de mRNA. Los proteoglicanos se unen fácilmente al RNA y, por lo tanto, reducen el rendimiento. Por consiguiente, se multiplicó la población completa de cDNA como una operación preliminar des
20 pués de la transcripción inversa. Las bandas diferencialmente expresadas del gel pueden ser cortadas, remultiplicadas, clonadas y luego secuenciadas. Este trabajo permitió identificar a la NOS como la más expresada en el cartílago osteoartrítico, y el análisis secuencial indicó que el gen tenía mayor homología con una secuencia bacteriana que con una
25 secuencia humana. La presencia de bacterias fue luego confirmada al detectar rRNA 16S en tejidos osteoartríticos, lo que es indicativo de bacterias patógenas en el tejido cartilaginoso afectado.
Una secuenciación y unos estudios comparativos ulteriores del rRNA 16S ha permitido la identificación de la especie bacteriana implicada en la OA, y esto 30 permitirá la selección de los antibióticos más apropiados. La especie implicada es, o está muy estrechamente relacionada con, Janthinobacterium. Duganella es un ejemplo de una especie muy estrechamente relacionada con Janthinobacterium. Los datos secuenciales indican que la bacteria responsable está relacionada con subespecies de Pseudomonas. Dichas bacterias son diferentes de las bacterias que causan problemas 35 en los hospitales a causa de la infección de heridas y zonas quirúrgicas. Puede haber
una población bacteriana heterogénea que cause OA en la(s) articulación(es) de ciertos pacientes. Por "agente antibacteriano" se quiere significar cualquier compuesto o formulación que mata bacterias, previene o inhibe la proliferación de bacterias o, si no,
5 debilita o incapacita bacterias. Se pueden utilizar agentes tanto bactericidas como bacteriostáticos. El agente puede tener una actividad específica para una sola especie bacteriana o para un pequeño número de especies bacterianas, o puede ser activo frente a una gran variedad de bacterias, tal como los péptidos que afectan a las membranas bacterianas.
10 Los agentes antibacterianos adecuados pueden ser usados localmente
o ser administrados intravenosa u oralmente. El tratamiento podría incluir uno o más de los puntos siguientes: a -Una pequeña operación con artroscopia que incluirá limpiar la articulación e inyec
tar el antibiótico seleccionado, o una artrotomía con una aguja que inyecta el anti15 biótico seleccionado. b -De nuevo mediante artroscopia, poner en las articulaciones afectadas una matriz
que libera antibiótico. c -Administración oral de una combinación de antibióticos seleccionados. d -Administración intravenosa de una combinación de antibióticos seleccionados.
20 Además, la prótesis o las células podrían ser impregnadas o formuladas con antibióticos antes de la implantación.
Se conocen muchos agentes antibacterianos y se están desarrollando más en todo momento. Los agentes antibacterianos preferidos son aquellos que son eficaces en el tratamiento de infecciones por Pseudomonas. Se prefieren los antibióti
25 cos que son activos incluso contra especies bacterianas que tienen tendencia a formar biopelículas por percepción de quórum, ya que Pseudomonas, Janthinobacterium y Burkholderia tienen una elevada tendencia a formar dichas biopelículas. De esta manera, una clase preferida de antibióticos es la de aquellos que se dirigen a/contra los genes o productos génicos implicados en la percepción de quórum y la formación de
30 biopelículas.
En realidad, se ha mostrado recientemente que un componente principal de las biopelículas producidas por Pseudomonas es DNA (se cree que las bacterias responsables de la osteoartritis son similares a la Pseudomonas). Por lo tanto, en una realización preferida del presente invento, el tratamiento será una terapia combi
35 nada en que se administran conjuntamente un antibiótico y un agente que puede romper el DNA, preferiblemente una enzima, tal como, por ejemplo, una enzima de restricción o DNasa I. Se produce un efecto sinérgico ya que la enzima o el otro agente rompe el DNA y reduce la viscosidad de la biopelícula, lo que permite una penetración más eficaz del antibiótico. En la articulación afectada se inyectarán preferiblemente
5 agentes anti-DNA, tal como DNasa I.
Los compuestos siguientes son ejemplos específicos de agentes antibacterianos adecuados: combinación de claritromicina/levofloxacina, mercaptoetilguanidina (se ha hallado que inhibe la respuesta inflamatoria debida al ácido nítrico en una infección por Pseudomonas), lactato de ciprofloxacina (eficaz frente a Pseudomonas),
10 tobramicina (se ha usado contra Pseudomonas), ceftazidima pentahidratada (sola o en combinación con otros antibióticos), gentamicina (se usa localmente en cirugía ortopédica para el tratamiento de infecciones y podría utilizarse en el tratamiento local de la osteoartritis), ciproxina, rifampicina (en combinación con ceftazidima pentahidratada y/o gentamicina), doxiciclina (un antibiótico de amplio espectro) y trimetropri
15 ma/sulfametoxazol (combinación). En ciertos casos, por ejemplo cuando hay preocupación acerca de los efectos secundarios que siguen a un tratamiento sistémico, el agente antibacteriano será preferiblemente inyectado en (o cerca de) la articulación osteoartrítica afectada. Los agentes antibacterianos de esta categoría incluyen gentamicina y ciproxina. De
20 acuerdo con un régimen de tratamiento preferido, se administrarán conjuntamente 2 o más agentes antibacterianos, tales como, por ejemplo, gentamicina y doxiciclina. En este caso, se puede administrar oralmente un agente activo e inyectar el otro localmente.
Los agentes de realización particularmente preferidos son aquellos que 25 son eficaces contra Janthinobacterium y/o Pseudomonas o bacterias de tipo Pseudomonas.
Durante el trabajo que condujo al presente invento, los inventores mostraron que la óxido nítrico sintasa (que parecía ser de origen bacteriano) se expresaba diferencialmente en tejidos con OA. Se ha hallado que la óxido nítrico sintasa resulta
30 inhibida incluso a nivel transcripcional por compuestos de tetraciclina, y, por lo tanto, dichos compuestos son una clase preferida de antibióticos para uso en el invento. Los agentes antibacterianos para uso de acuerdo con el presente invento tienen tal efecto suficientemente inhibidor sobre las bacterias de la articulación que causan una mejoría mensurable y significativa de la osteoartritis y sus síntomas aso
35 ciados. No se espera que el tratamiento sea totalmente exitoso en todos los casos
pero el "tratamiento" de acuerdo con el presente invento debería incluir una mejoría en una o más de las áreas siguientes: dolor en, y alrededor de, la articulación en reposo o en movimiento, inflamación alrededor de la articulación, movimiento de la articulación y deterioro del cartílago de la articulación. El tratamiento se verá preferiblemente como 5 una mejoría en una o más de estas áreas, pero puede incluir la prevención o lentificación de la ulterior decadencia del cartílago, el movimiento de la articulación, etc. La naturaleza de la OA significa que si se detiene el desarrollo de la enfermedad podría haber un beneficio significativo para el paciente. Si se pretende introducir tejido creado
- o nuevas células en el sitio del daño en la articulación, el sitio es entonces preferible10 mente tratado en primer lugar con un agente antibacteriano de acuerdo con la enseñanza del invento.
Para el tratamiento de acuerdo con el presente invento, se pueden tener en cuenta todos los pacientes con OA bacteriana primaria, estén recién diagnosticados
- o estén en una fase más avanzada. Los síntomas en que se puede observar una me15 joría se discutieron anteriormente.
Se puede determinar una cantidad "farmacéuticamente eficaz" en relación con las diversas áreas aquí discutidas en que el tratamiento puede proporcionar mejorías mensurables, y se puede seleccionar con referencia a los Ejemplos.
También se describe un método para mejorar la movilidad articular y/o
20 reducir el dolor y/o la inflamación de una articulación en un mamífero, método que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un agente antibacteriano a dicho mamífero. La mejoría en la movilidad articular puede ser valorada por el propio paciente o por su asesor médico; lo mismo en cuanto al dolor y la inflamación.
25 También se describe una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de la OA bacteriana primaria, más particularmente de una infección bacteriana responsable de la OA, composición que comprende un agente antibacteriano junto con al menos un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. En dichas composiciones, el ingrediente activo puede comprender del 0,05% al 99% en
30 peso de la formulación, más preferiblemente del 0,1% al 5,0%. Por "farmacéuticamente aceptable" se quiere significar que los ingredientes deben ser compatibles con otros ingredientes de la composición, así como fisiológicamente aceptables para el receptor.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas de acuerdo 35 con cualquiera de los métodos convencionales conocidos en la técnica y ampliamente descritos en la bibliografía. De esta manera, el ingrediente activo puede ser incorporado, opcionalmente junto con otras sustancias activas, con uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes convencionales para producir preparaciones galénicas convencionales tales como tabletas, píldoras, polvos, pastillas, sobres, cápsulas, elixires,
5 suspensiones, emulsiones, disoluciones, jarabes, aerosoles (como un sólido o en un medio líquido), ungüentos, cápsulas de gelatinas blanda y dura, supositorios, disoluciones inyectables estériles, polvos envasados estériles, y similares. Anteriormente se discutieron otros métodos para formular los agentes antibacterianos, por ejemplo, mediante su incorporación a dispositivos para implantación.
10 Los agentes activos se formulan preferiblemente en tabletas, conteniendo cada tableta una cantidad predeterminada de ingrediente activo. Como aquí se discute, puede ser deseable inyectar ciertos antibióticos en la articulación afectada. Las dosis adecuadas variarán de paciente a paciente y pueden ser determinadas por el médico de acuerdo con el peso, la edad y el sexo del paciente y la
15 gravedad del estado, y también con el particular agente antibacteriano seleccionado. Una dosis diaria total típica de agente antibacteriano estará en la región de 50-1000 mg, preferiblemente de 100-300 mg. Esto se administrará preferiblemente como una sola dosis. Las mejorías en los pacientes tratados de acuerdo con el presente in
20 vento pueden verse a lo largo de una semana o dos y, normalmente, el tratamiento se debería continuar durante 1 a 2 meses o más para alcanzar los beneficios máximos. Como aquí se muestra, puede que 4 semanas sean suficientes para ver mejorías significativas. La identificación de un papel de las bacterias en el desarrollo de la OA
25 también proporciona nuevos métodos para el diagnóstico exacto de la OA. Se pueden examinar biopsias tomadas de pacientes de los que se sospecha que tienen OA, por ejemplo, muestras de líquido sinovial, en cuanto a la presencia de bacterias patógenas. De esta manera, en un aspecto más, el presente invento proporciona un método in vitro para diagnosticar osteoartritis en un paciente del que se sospecha que tiene
30 osteoartritis, método que comprende examinar una muestra de una articulación de dicho paciente en cuanto a la presencia de bacterias (patógenas) que confirmen que dicha articulación está afectada por osteoartritis bacteriana primaria.
Un método particularmente preferido implica el uso de cebadores o sondas de ácido nucleico diseñados para detectar la especie bacteriana de interés por 35 medio de homología con una región (secuencia) diana del ácido nucleico de las bacte
rias. Aquí se describen cebadores adecuados en los Ejemplos. Preferiblemente, el cebador o los cebadores se dirigen a una región del rRNA 16S (o el gen que lo codifica). Los cebadores aquí diseñados como F21-y R21-, particularmente F21-4 y R21-4, son específicos para secuencias de tipo Janthinobacterium y son especialmente prefe
5 ridos. También es particularmente adecuada la pareja de cebadores F21-2 y R21-4. Las sondas/cebadores tienen homología con secuencias diana; es decir, son capaces de unirse con secuencias diana bajo niveles de rigor estándares. En los Ejemplos presentes se proporcionan métodos para obtener muestras adecuadas de pacientes de los que se sospecha que tienen OA en una o
10 más articulaciones. El método diagnóstico aquí descrito proporciona una prueba útil y fiable para confirmar que una articulación está afectada por OA bacteriana primaria y se puede utilizar solo o junto con técnicas diagnósticas conocidas. La muestra examinada será preferiblemente líquido sinovial. Si sólo se obtiene un poco de líquido, se puede inyectar entonces disolución salina (posiblemen
15 te hasta aproximadamente 30 ml) antes de una aspiración ulterior. Estas muestras fluidas pueden ser luego centrifugadas para obtener una muestra de células; por ejemplo, centrifugando a 13.000 rpm (15.000g) durante 45 minutos. Las células del sedimento de centrifugación son preferiblemente lavadas 2-3 veces con una disolución salina estéril antes de ser congeladas a, por ejemplo, -70 °C.
20 El ensayo para el marcador génico bacteriano se puede basar en la identificación de RNA (por ejemplo, directamente para rRNA 16S) o DNA (por ejemplo, el gen que codifica rRNA 16S). Cuando se analiza RNA, antes de que se pueda llevar a cabo una PCR, se requiere una operación de transcripción inversa para generar cDNA. En los Ejemplos se describen métodos para analizar RNA, pero en su lu
25 gar/también se puede analizar el DNA de las bacterias del líquido sinovial. Se puede aislar primero el DNA de las células usando, por ejemplo, el kit tisular DNeasy de QIAGEN (número 69504 del catálogo). Alternativamente, el DNA puede ser multiplicado y analizado sin una operación de extracción independiente. B. Nordvag et al., en Method in Neurosciences, volumen 26 (1995), páginas 15-25, y en BioTechniques
30 (1992), volumen 12, nº 4, páginas 490-491, describen protocolos adecuados para la multiplicación de DNA de células sanguíneas, y los métodos se aplican igualmente a una muestra de células procedente de líquido sinovial.
Cuando se lleva una PCR a cabo, se usarán preferiblemente tres parejas de cebadores distintas: 35 A) un conjunto de cebadores específico para las bacterias que causan la en
fermedad, específico así para Janthinobacterium y especies relacionadas (preferiblemente diseñado para la multiplicación del gen de rRNA 16S); B) un conjunto de cebadores para la multiplicación de otro gen de las bacterias que causan la enfermedad, que no está tan sumamente conservado como los genes 5 de rRNA 16S; por ejemplo, para parte de uno de los genes de rRNA 23S; y
C) un gen estándar humano, tal como el de �-actina, que puede ser usado para la normalización de la cantidad de señal bacteriana para que sea una señal de genes humanos derivados de células sinoviales humanas. El ensayo puede ser llevado rápida y convenientemente a cabo utilizan
10 do sólo el anterior conjunto (A) de cebadores. Las células se lisarán preferiblemente en un ciclo previo al método de PCR para hacer el DNA accesible para la hibridación de cebadores. Después de la PCR, se usan técnicas estándares para visualización de geles. Visto alternativamente, el presente invento proporciona un componente
15 para detección bacteriana para uso en el diagnóstico de una osteoartritis bacteriana primaria en un paciente del que se sospecha que tiene osteoartritis. Como se discutió anteriormente, los componentes para detección bacteriana adecuados incluyen sondas y cebadores de ácido nucleico que pueden ser diseñados para detectar bacterias en general o un género o especie particular. En particular, los componentes permiten
20 detectar la especie relacionada con Janthinobacterium que los inventores presentes han hallado vinculada con la OA. Otros componentes para detección bacteriana incluyen anticuerpos. El "agente" puede ser simplemente una disolución, suspensión, etc., que contiene el componente para detección bacteriana y está, o es capaz de estar, en
25 una forma conveniente para que se lleve a cabo el método diagnóstico sobre una muestra. El agente se pondrá típicamente en contacto con la muestra con objeto de determinar si están presentes bacterias o no.
También se describe un kit para el diagnóstico de OA bacteriana primaria, que comprende un componente para detección bacteriana, preferiblemente un 30 agente como el anteriormente definido. El "componente para detección bacteriana" es típicamente una o más moléculas oligonucleotídicas, tal como, por ejemplo, una pareja de cebadores de ácido nucleico que permite detectar las bacterias diana responsables de los síntomas de la OA. El kit puede también incluir preferiblemente uno o más de los compuestos siguientes: una DNA polimerasa (que está exenta de DNA contami35 nante en la medida de lo posible), dNTPs, tampones y un reactivo para facilitar la so
lubilización de RNA/DNA.
En aún otro aspecto, el presente invento proporciona un producto que contiene (a) un agente antibacteriano como el aquí definido y (b) un antagonista de óxido nítrico, como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o su
5 cesivo en el tratamiento de la OA bacteriana primaria, mediante el tratamiento de una infección bacteriana que es responsable de la OA. Un "antagonista de óxido nítrico" es cualquier componente que sirve para reducir la concentración local de óxido nítrico en la zona que rodea la articulación, tal como, por ejemplo, un inhibidor de la óxido nítrico sintasa.
10 En un aspecto más, el presente invento proporciona un producto que contiene (a) un agente antibacteriano como el aquí definido y (b) un agente que puede romper DNA, que será preferiblemente una enzima tal como DNasa I, como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de la OA bacteriana primaria, mediante el tratamiento de una infección bacteriana que es
15 responsable de la OA. El invento será adicionalmente descrito con referencia a los siguientes Ejemplos no restrictivos y las Figuras, en que: La Figura 1 es un croquis que muestra una plastia de fosa durante la reconstrucción del ligamento cruzado anterior. Se extirpa cartílago de la pared lateral 20 de la fosa.
La Figura 2 es una fotografía basada en una visualización óptica que muestra cartílago focalmente dañado en el cóndilo femoral medial. La fotografía se tomó durante una artroscopia.
La Figura 3 es una fotografía basada en una visualización óptica que 25 muestra cambios osteoartríticos avanzados en una rodilla. De nuevo, la fotografía se tomó durante una artroscopia.
La Figura 4 es un organigrama de la tecnología SMART. La figura está adaptada del manual de usuario del kit SMART™ para síntesis de cDNA por PCR, de Clontech.
30 La Figura 5 es una fotografía de un gel que muestra los resultados de la remultiplicación de bandas diferencialmente expresadas. Se aíslan las bandas entre 200 y 600 pares de bases (bp; del inglés, base pairs) y se usan para clonación, secuenciación y posterior verificación. La Figura 6 es la primera secuencia aislada de pacientes mediante pre
35 sentación diferencial. Fue un análisis de esta secuencia mediante FASTA lo que condujo al inventor a sospechar por vez primera la presencia de bacterias.
La Figura 7 es una fotografía de un gel que muestra la detección de señales de RNA ribosómico 16S a partir de cultivos testigo de E. coli. Carril 1 = RNA bacteriano testigo, Carril 2 = 1/10 x RNA bacteriano, Carril 3 = agua. La transcripción
5 inversa se lleva a cabo con el cebador R1492, y la PCR con F27/R1492. Se aplicaron al gel 5 µl de cada mezcla de reacción PCR.
La Figura 8 es una fotografía de un gel que muestra la señal de 16S en biopsias de cartílago. Se cargaron los carriles del modo siguiente: Carril ID de la muestra 1 8A 2 8A 3 17A 4 17A 5 20A 6 20A 7 16N 8 16N 9 Mezcla magistral tratada + cebadores pero sin molde. La transcripción inversa se llevó a cabo con el cebador R1474, la PCR con los cebado
10 res F7/R1474, y se aplicaron 6 µl de cada mezcla de reacción PCR al gel.
La Figura 9 es una fotografía de un gel que muestra la señal de 16S en biopsias de cartílago. Se cargaron los carriles del modo siguiente: Carril ID de la muestra 1 8A 2 17A 3 16N 4 Testigo de agua La transcripción inversa y la PCR se llevaron a cabo usando los cebadores de la Figura 8.
15 La Figura 10 es una fotografía que muestra fragmentos de DNA 16S multiplicados y purificados antes de la secuenciación. En algunas muestras, especialmente en tejidos normales, se observó un fragmento más pequeño (350 bp) con respecto al de las señales de 16S (1400 bp). Parecía que estos fragmentos más pequeños, cuando eran secuenciados, eran similares al rRNA humano 18S. Se cargó el gel
20 de la manera siguiente:
Carril ID de la muestra
1 Fragmento pequeño de 17A*
2 Fragmento grande de 17A
3 Fragmento grande de 20A
4 Fragmento pequeño de 17A*
5 Fragmento grande de 17A
6 Mezcla magistral tratada + cebadores (F7 y R1474) pero sin molde.
Se aplicaron 4 µl de cada producto de aislamiento de DNA al gel.
La Figura 11 es una representación esquemática que muestra la situación de cebadores en el rRNA 16s de longitud completa. La pareja F7/R1474 multiplicará el cDNA del rRNA 16s de longitud completa pero, cuando se usan para secuen
5 ciar, cada uno de estos cebadores proporcionará una información secuencial sobre unos pocos cientos de pares de bases, lo que no cubrirá la secuencia completa. Para obtener la secuencia completa del cDNA multiplicado, se usan los cebadores F10A, F10B, F10C, R10A, R10B y R10C como cebadores de secuenciación adicionales. En la tabla 1 se enumeran las secuencias nucleotídicas. De este modo, se genera una
10 secuencia compuesta al usar información secuencial solapante obtenida por secuenciación con diversos cebadores directos. Se puede realizar el mismo proceso con los cebadores inversos para obtener una secuencia inversa compuesta y luego se pueden comparar las secuencias directa e inversa para crear una secuencia compuesta aún más precisa.
15 La Figura 12 es la secuencia del RNA 16s de longitud completa obtenida como una secuencia compuesta directa e inversa de la región A del paciente número 21, usando los cebadores descritos en la leyenda de la Figura 16. Esta secuencia se hallaba siempre en pacientes osteoartríticos y se halló que representaba a Janthinobacterium mediante una búsqueda en la base de datos del NCBI con Blastn.
20 La Figura 13 es una representación esquemática de cómo se pueden utilizar diferentes cebadores para diferenciar entre las secuencias de rRNA 16s de Janthinobacterium (J) y Burkholderia (B). Estas secuencias son generalmente bastante similares pero con regiones en que hay un elevado porcentaje de falta de apareamiento entre las dos especies. De este modo, los cebadores F25-/R25-multiplicarán mol
25 des con una secuencia de tipo B, y los cebadores F21-/R21-multiplicarán moldes con una secuencia de tipo J. Esta técnica ayudó a alcanzar la conclusión de que la especie bacteriana implicada en la OA era Janthinobacterium, o una especie muy estrechamente relacionada con ella, y a identificar los mejores cebadores para uso en el dia
gnóstico de la OA causada por infección bacteriana, F21-1 y R21-4.
La Figura 14 es una fotografía de un gel que muestra la detección de
genes de rRNA 16S de patógeno en líquido sinovial. Se aisló DNA del líquido sinovial
de una rodilla artrítica usando el kit TRIzol de Gibco BRL/Life Technologies. Se multi
plicó la secuencia del rRNA 16s usando los cebadores diseñados a partir de la se
cuencia de rRNA 16s hallada en la muestra 21A. Se cargó el gel del modo siguiente:
Carril ID de la muestra Cebadores
1 DNA F21-1/R21-4
2 DNA, dilución 1/10 F21-1/R21-4
3 Testigo de agua F21-1/R21-4
4 DNA F21-1/R21-5
5 DNA, dilución 1/10 F21-1/R21-5
6 Testigo de agua F21-1/R21-5
L Escala de DNA Plus de 1 kb, Gibco BRL/Life Technologies
La Figura 15 es una fotografía de un gel que muestra un fallo para de
tectar rRNA 16S bacteriano en muestras de región normal (N) del paciente 31 y en un
testigo de agua. Se cargaron los carriles del modo siguiente:
Carril Muestra Cebador directo Cebador inverso
L Escala de 1 kb+
1 DNA de 31N-SF, dilución 1/10 F25-1 R25-3
2 DNA de 31N-SF, dilución 1/10 F25-1 R25-4
3 DNA de 31N-SF, dilución 1/10 F25-1 R25-5
4 DNA de 31N-SF, dilución 1/10 F25-2 R25-3
5 DNA de 31N-SF, dilución 1/10 F25-2 R25-4
6 DNA de 31N-SF, dilución 1/10 F25-2 R25-5
7 DNA de 31N-SF, dilución 1/10 F25-3 R25-4
8 DNA de 31N-SF, dilución 1/10 F25-3 R25-5
9 Testigo de agua F25-1 R25-3
10 Testigo de agua F25-1 R25-4
11 Testigo de agua F25-1 R25-5
12 Testigo de agua F25-2 R25-3
13 Testigo de agua F25-2 R25-4
14 Testigo de agua F25-2 R25-5
15 Testigo de agua F25-3 R25-4
16 Testigo de agua F25-3 R25-5
Si hubieran estado presentes bacterias en cualquiera de las muestras (incluso especies distintas de Burkholderia), se debería haber generado entonces una señal al usar estos cebadores directos e inversos.
La Figura 16 es un gráfico que muestra las calificaciones KOOS para 5 "síntomas" antes y después del tratamiento con un antibiótico. p = 0,100. La Figura 17 es un gráfico que muestra las calificaciones KOOS para "actividad diaria" antes y después del tratamiento con un antibiótico. p = 0,429. La Figura 18 es un gráfico que muestra las calificaciones KOOS para "deporte y diversión" antes y después del tratamiento con un antibiótico. p = 0,008. 10 La Figura 19 es un gráfico que muestra las calificaciones KOOS para "calidad de vida" antes y después del tratamiento con un antibiótico. p = 0,182. La Figura 20 es un gráfico que muestra las calificaciones KOOS para "dolor" antes y después del tratamiento con un antibiótico. p = 0,386. La Figura 21 es un gráfico que muestra las calificaciones individuales de 15 Lysholm antes y después del tratamiento con un antibiótico. p = 0,003.
Ejemplos
Ejemplo 1 – Identificación de bacterias asociadas con el daño osteoartrítico
Biopsias clínicas de cartílago
20 El Comité Ético del Hospital de la Universidad de Tromsø aprobó la extirpación y el examen de cartílago para este estudio. Los pacientes que fueron sometidos al procedimiento de biopsia fueron informados oralmente y por escrito acerca del proyecto y firmaron un documento en que decían aceptar el uso del material para este proyecto de investigación.
25 Se tomaron de los pacientes las tres diferentes calidades de tejidos cartilaginosos, normal, focalmente dañado y osteoartrítico, del modo siguiente:
1. Se tomó el cartílago normal (N) de rodillas que fueron sometidas a reconstrucción del ligamento cruzado anterior. Para reparar el ligamento, se usó un injerto que incluía un trozo de hueso de rótula, una parte del ligamento rotuliano y una canti
30 dad de hueso de la tibia proximal. Cuando se pone el injerto en la rodilla, el procedimiento incluye la extirpación de algún cartílago del cóndilo femoral lateral de la rodilla (Figura 1). Esto se hace para dejar espacio suficiente para el nuevo ligamento en la flexión y extensión de la rodilla. Ninguna de las rodillas que se usaron para recoger cartílago normal tenía historia alguna de trauma durante los dos
35 últimos meses, y no había signos de inflamación real en esas rodillas. El cartílago extirpado se usó como muestra de tejido normal. Durante la operación, se sacó bajo condiciones estériles y se congeló inmediatamente por inmersión en nitrógeno líquido. Las muestras fueron almacenadas más tarde a -75 °C.
2. El cartílago focalmente dañado (D) procedía de zonas de rodillas, extirpado du
5 rante una reparación con trasplante de condrocitos (Figura 2), una técnica descrita por Mats Brittberg y colaboradores en 1994 [M. Brittberg, A. Landahl, A. Nilsson, C. Ohlsson, O. Isaksson y L. Peterson, N. Engl. J. Med., 6 de Octubre de 1994, 331 (14): 889-95]. Esta técnica incluye tomar una biopsia de la rodilla que se va a reparar, de una zona de la rodilla que no soporta peso, y de esta biopsia
10 se aíslan las células y se dejan multiplicar in vitro durante aproximadamente tres semanas. Cuando se alcanza un número suficiente de células, se trasplantan las células a la rodilla después de la extirpación de la zona cartilaginosa dañada. El cartílago extirpado y dañado fue utilizado como una muestra de cartílago dañado. Esta biopsia también se extrajo bajo condiciones estériles.
15 3. El cartílago osteroartrítico (A) (Figura 3) se extirpó durante la operación de pacientes con osteoartritis avanzada hasta un grado que excluía la técnica de trasplante de células. Estas rodillas fueron sometidas a cirugía de reemplazo articular utilizando una prótesis. Durante el procedimiento operativo, el cartílago hubo de ser extirpado, y se tomaron zonas de cartílago con los cambios más avanzados y se
20 recogieron bajo condiciones estériles.
Detalles de otros materiales utilizados en los experimentos
Se utilizaron los cebadores siguientes. Para la transcripción inversa, se
25 usaron los cebadores inversos (R; del inglés, reverse) R-1492 y R-1474. Para la PCR, se usaron generalmente las parejas F-27/R1492 y F-7/R-1474 [F = directo (del inglés, forward)]. Más adelante, en la Tabla 1, se indican las secuencias de los cebadores.
Los cebadores se compraron a Sigma-Genosys. Para la síntesis de cDNA, los cebadores se diluyeron hasta 2,5 picomoles/�l en agua. Para la PCR, los 30 cebadores se diluyeron hasta 50 picomoles/�l en agua.
Se prefieren generalmente F-7/R-1474 para la identificación del rRNA 16S bacteriano (o el gen que lo codifica) ya que se hibridan con una secuencia conservada entre varias especies bacterianas estudiadas. F21-2/R21-4 son adecuados para la identificación de la bacteria causal esencial Janthinobacterium (o especies es
35 trechamente relacionadas).
Tabla 1
Se utilizó la transcriptasa inversa RNasa H-Superscript II de Gibco
BRL/Life Technologies (nº 18064-014 del catálogo) con su tampón y DTT. Los dNTPs
se compraron a Promega (nº U1240 del catálogo).
Se usó agarosa Seakem LE de MedProbe (nº 50004 del catálogo) para la electroforesis en gel. Se usó el kit de extracción de gel QIAEX II de QIAGEN (nº 20021 del 5 catálogo) para el aislamiento del DNA a partir de la agarosa.
Para las reacciones de secuenciación, se usó el kit Thermo Sequenase con terminadores colorantes Cy-5, de Amersham Pharmacia Biotech (nº 27-2682-01
10 del catálogo). Para la purificación del producto de PCR de la secuenciación se usó Sephadex G-50 de Sigma (nº 9048-71-9 del catálogo). También se podría haber usado el kit ABI PRISM para secuenciación cíclica con terminadores BigDye.
15 Para la multiplicación del RNA ribosómico 16S por PCR se usó DNA polimerasa HotStarTaq de Qiagen (nº 203205 del catálogo). Las mezclas magistrales para PCR se trataron con DNasa I RQ1 exenta de RNasa, de Promega (nº M610A del catálogo).
20 Agua Cuando se preparó RNA, se sintetizó cDNA y durante la PCR, se usó agua filtrada a través de filtros de 0,2 �m, tratada en autoclave, tratada con DEPC, exenta de DNasa y exenta de RNasa, de Ambion (nº 9915G del catálogo).
25 Método de presentación diferencial En la técnica siguiente se combina la multiplicación de cDNA de longitud completa con la presentación diferencial. La PCR de cDNA SMART (Clontech Laboratories Inc., PR304-1) es una técnica originalmente desarrollada para multiplicar poblaciones/bancos de cDNA completo. Se sintetiza la primera cadena de cDNA utilizando
30 un cebador de oligo-dT (cebador de CDS). La transcriptasa inversa (MMLV, RNasa H-) añade un pequeño número de restos de citidina tras la compleción de la primera cadena. Se hibrida un segundo cebador (cebador SMART II) con la dC-"cola", y la transcriptasa inversa cambia el molde. Los cebadores son diseñados para obtener la misma secuencia en ambos extremos del cDNA y, por lo tanto, al utilizar un cebador que se
35 unirá a ambos extremos (cebador de PCR), podemos multiplicar exponencialmente la población de mRNA (como cDNA) total.
Hemos usado la PCR de cDNA SMART para multiplicar cDNA construido a partir de muestras de mRNA muy pequeñas. Hemos usado luego el cDNA multiplicado como molde en reacciones de presentación diferencial.
5
El material de muestra se obtuvo de un paciente que estaba siendo operado de artrosis unicompartimental en la rodilla; véase el Ejemplo 1. Se tomaron biopsias de la parte osteoartrítica del cartílago. Se tomó cartílago normal de la zona no
10 alterada de la misma rodilla. Las muestras de cartílago fueron congeladas en nitrógeno líquido durante 5 minutos y fueron luego guardadas a -75 °C hasta que se llevó a cabo la extracción de RNA.
15 El cartílago fue homogeneizado hasta un polvo fino con un mortero y su mano en nitrógeno líquido. Se aisló el RNA total usando el reactivo TRIZOL de Gibco (nº 15596). Se determinaron la concentración y la calidad del RNA midiendo las absorbancias a 260/280 y desarrollando una muestra en un gel de agarosa.
20 Síntesis de cDNA Se realizaron las transcripciones inversas usando el kit SMART de Clontech (nº K1052-1) para síntesis de cDNA por PCR. Se siguieron las condiciones recomendadas por el fabricante. Se usaron 3 �l de disolución de RNA. Se usó la transcriptasa inversa de MMLV (200 U/�l; Gibco 18064-014).
25
Se multiplicó el cDNA total usando el kit SMART de Clontech (nº K10521) para síntesis de cDNA por PCR. Se utilizaron las condiciones recomendadas por el fabricante. Se multiplicaron 2 �l de cDNA de primera cadena en un volumen total de 50
30 �l con la polimerasa Advantage 2 KlenTaq de Clontech (nº 8430-1). Después de 25 ciclos, se examinó el producto de PCR en un gel de agarosa y se determinó la concentración de DNA midiendo las absorbancias a 260/280.
Presentación diferencial usando dos cebadores
35 Para las reacciones de presentación diferencial, se usó el kit Delta de Clontech (nº K1810-1) para presentación diferencial. Se utilizaron las condiciones recomendadas por el fabricante. El cDNA multiplicado fue diluido hasta 0,02 �g/�l. Se usaron varias combinaciones de cebadores (los cebadores T y P incluidos en el kit) para explorar genes diferencialmente expresados.
5 En cada reacción se usó 1 �l de las diluciones de cDNA como molde. Las muestras fueron marcadas con [�]-33P-dATP (Amersham) y fueron multiplicadas con la polimerasa Advantage 2 KlenTaq de Clontech (nº 8417-1). Después de tres ciclos de bajo rigor, se desarrollaron 25 ciclos de alto rigor. Los productos de PCR fueron separados en un gel para secuenciación [urea 7 M, acrilamida al 4% (37,5:1), TBE
10 0,5x] con espaciadores de 0,2 mm, a 500 V, hasta que el colorante azul de bromofenol hubo salido del gel. Los geles fueron visualizados por exposición de una película Bio-Max MR durante ½-1 día.
Las bandas diferencialmente expresadas fueron cortadas de los geles secados superponiendo la película para señalar las bandas antes de aislar el material 15 del gel usando un escalpelo. Se añadieron 100 �l de agua a cada corte de gel en un tubo Eppendorf. Los cortes fueron luego incubados a 37 °C durante la noche. Los tubos fueron centrifugados a 14.000g y 4 °C durante 15 minutos. Los productos de elución fueron luego guardados a -20 °C. Se utilizaron 5 �l de cada producto de elución, como molde, en una reacción de multiplicación usando las mismas condiciones que en 20 la PCR de presentación diferencial (sin marcación). Se examinaron los productos de PCR en un gel de agarosa. Cierta mancha resultaba evidente, y se separó un volumen más grande en un gel más grande. Se cortaron las bandas de interés del gel de agarosa y se aisló el DNA usando el kit QIAEX II de Qiagen (nº 20021). Se siguió el procedimiento del fabricante. Se eluyó el DNA en 20 �l de agua. Se volvió a multiplicar de
25 nuevo el DNA usando la polimerasa pfu Turbo (nº 600252-51). Cada 50 �l de mezcla de reacción contenían 1 �l de molde, cebadores T y P 40 pM, dNTP 100 �M, tampón 10x y 1,25 U de enzima. Se desarrolló la PCR con las condiciones siguientes: inicio a 94 °C durante 9 minutos, 43 ciclos de 94 °C durante 30 segundos y 60 °C durante 1 minuto, y un alargamiento final a 60 °C durante 10 minutos.
30 Después de examinar un ensayo desarrollado en un gel de agarosa, se desarrollaron reacciones paralelas en 2 tubos y se reunieron los productos. Se aisló el DNA de la mezcla de reacción PCR usando el sistema QIAEX II de Qiagen para purificación de DNA. Se siguieron las recomendaciones del fabricante. Se eluyó el DNA en 15 �l de agua. Se desarrolló una muestra en un gel de agarosa. Tras la visualización,
35 no hubo bandas ni manchas adicionales visibles.
El cDNA remultiplicado fue clonado en el vector de clonación pGEM-T Easy (nº A1360, Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.). La ligación se llevó a cabo con una concentración de vector de 50 ng/�l. Se ensayó por PCR la presencia de un
5 inserto plasmídico del tamaño esperado, usando los mismos cebadores que en la presentación diferencial y cortando el vector con la enzima de restricción EcoRI.
Los fragmentos de PCR clonados fueron secuenciados usando el cebador T7. Las secuencias halladas mostraban una acusada homología con conocidas secuencias génicas humanas. Además eran 3-4 veces más largas que la EST media.
10
Se utilizaron cebadores aleatorios de 10 monómeros (Operon Technologies, Alameda, California, EE.UU.) para multiplicar el cDNA sin radiactividad. Cada mezcla de reacción de 50 µl contenía 1 µl de cDNA, 80 pM de un cebador, 200 �M de
15 cada dNTP, tampón 10x y 2,5 U de polimerasa HotStarTaq (Qiagen). Se desarrolló la PCR con las condiciones siguientes: inicio a 95 °C durante 15 minutos, 40 ciclos de 94 °C durante 2 minutos, 38 °C durante 2 minutos y 68 °C durante 1 minuto y 25 segundos, y un alargamiento final a 72 °C durante 10 minutos. Los productos de multiplicación por PCR fueron separados en un gel de agarosa al 1,5% (agarosa 1000, Gibco)
20 en tampón de TAE con guanosina 1 mM y fueron visualizados con bromuro de etidio. La agarosa 1000 es capaz de resolver bandas separadas por 10 bp. Las bandas diferencialmente expresadas fueron cortadas, aisladas y clonadas en el vector pGEM-T Easy sin una multiplicación adicional.
25 Resultados Un aspecto importante de nuestra estrategia es multiplicar la población de cDNA total antes de usarla como molde en reacciones PCR con presentación diferencial utilizando el kit de PCR Smart™ de Clontech (Figura 4).
La comparación de los productos de PCR con presentación diferencial 30 procedentes de muestras de cartílago (sanas y osteoartríticas) mostró genes expresados en una muestra pero no en la otra.
Después de la presentación diferencial, el cDNA puede ser eluido del material de gel. El cDNA puede ser luego remultiplicado utilizando los mismos cebado-res (RT-PCR) que en el procedimiento de presentación diferencial (Figura 5).
35
Después de la secuenciación, se diseñaron dos cebadores internos con un solapamiento de 100%. Se utilizaron estos cebadores internos para multiplicar el gen completo usando el banco de cDNA en el vector pTriplEx2 (Clontech) como mol
5 de. El cDNA fue empaquetado en � TriplEx2, que es convertido en pTriplEx2 por transducción en E. coli BM25.8. Al Utilizar el banco de cDNA de pTriplEx2 con los cebadores internos determinados, sólo se multiplica el plásmido con el gen de interés. Los cebadores son diseñados a partir de la secuencia de un gen diferencialmente expresado. Después de la transformación de JM109 con él, el gen diferencialmente ex
10 presado es secuenciado.
Identificación de RNA ribosómico 16S bacteriano en muestras de cartílago
Los tejidos cartilaginosos recién congelados fueron homogeneizados
15 hasta un polvo fino con un mortero y su mano sobre nitrógeno líquido. Se aisló el RNA total usando el reactivo TRIZOL de Gibco (nº 15596). Se determinó la calidad del RNA sometiendo una muestra a electroforesis en un gel de agarosa.
20 Se mezclaron los componentes siguientes en un tubo Eppendorf: 2 �l de cebador de RT (R1474, 5 picomoles) 2 �l de muestra de RNA 8 �l de H2O (tratada con DEPC, exenta de RNasa)
Se calentó el tubo a 90 °C durante 5 minutos y luego se enfrió lenta25 mente hasta la temperatura ambiental.
Se preparó la mezcla magistral para RT-PCR:
/Una reacción
4 µl de tampón para primera cadena
2 µl de DTT 0,1 M
30 1 �l de dNTPs 10 mM Se añadieron 7 µl de mezcla magistral para RT a cada mezcla de reacción y luego se incubó el tubo a 42 °C durante 2 minutos.
Se añadió 1 �l de transcriptasa inversa Superscript II a cada mezcla de reacción. Luego se incubaron los tubos a 42 °C durante 50 minutos. Se detuvieron las 35 reacciones mediante calentamiento a 100 °C durante 10 minutos. Luego se pusieron
rápidamente los tubos sobre hielo. Luego se añadieron 80 µl de agua tratada con DEPC a cada tubo.
5 Preparación, y tratamiento con DNasa, de la mezcla magistral para PCR
1 reacción
5 �l de tampón 10x
2 �l de Mg2+ 25 mM
1 �l de dNTPs 10 mM
37,5 �l de H2O
2,5 �l de DNasa I
La mezcla magistral para PCR fue incubada a 37 °C durante 1 hora, y luego hervida durante 5 minutos y puesta sobre hielo. Se añadieron los reactivos siguientes. 1 reacción 1 �l de mezcla de cebadores (50 picomoles/�l de cebador directo + 50 picomo
les/�l de cebador inverso) 0,25 �l de DNA polimerasa HotStarTaq Para cada reacción PCR, se mezcló 1 �l de cDNA de primera cadena
10 con 49 µl de mezcla magistral para PCR en un tubo para PCR de 0,2 ml de capacidad. Se llevó a cabo la siguiente PCR en un termociclador Peltier PTC-200 de MJ Research. 95 °C 8 minutos
12X
95 °C 40 segundos
70 °C 40 segundos
-1 °C/ciclo
72 °C 2 minutos
15X
95 °C 40 segundos
58 °C 40 segundos
72 °C 2 minutos
20X
95 °C 40 segundos
56 °C 40 segundos
72 °C 2 minutos
4 °C mantenimiento Los productos de la PCR fueron luego almacenados a -20 °C.
Se desarrollaron los productos de la PCR, uno al lado del otro, en un gel
5 de agarosa al 0,8%. Se desarrollaron minigeles (6x10 cm) durante 50 minutos a 90 V en tampón de TAE 1x. Para los minigeles, una muestra típica era 6 µl de producto de PCR. Paralelamente a las muestras, se desarrolló una escala de DNA Plus de 1 kb de Gibco para la determinación del tamaño de los fragmentos de DNA.
Los geles fueron teñidos en disolución de EtBr (0,5 µg/ml de agua) du10 rante 20 minutos. Luego fueron desteñidos mediante diversos lavados en agua durante aproximadamente 40 minutos. Los geles fueron visualizados en un sistema de BioRad para documentación de geles.
15 Aislamiento de DNA a partir del gel de agarosa Para el aislamiento preparativo de DNA para su secuenciación, se llevaron a cabo cuatro reacciones PCR idénticas en paralelo. Los productos combinados fueron luego desarrollados en un gel con pocillos grandes. Se utilizaron las mismas condiciones que en la visualización previa. Después de la tinción, se pusieron los ge
20 les en un transiluminador UV de baja intensidad y se cortaron rápidamente las bandas de interés con escalpelos estériles. Hemos hallado que el empapamiento del gel en una disolución 1 mM de guanosina (Grundemann y Schoming) antes de la visualización UV de las bandas eliminaba las complicaciones en la secuencia de DNA debidas al daño del DNA por la radiación UV. Un trozo de gel típico pesaba aproximadamente
25 150-200 mg. Se aisló el DNA de los fragmentos del gel utilizando el kit QIAEX II de QIAGEN (nº 20021 del catálogo) para extracción de gel. Se siguieron las condiciones del fabricante. Los fragmentos de DNA se eluyeron en 25 µl de Tris-HCl 10 mM, pH de 8,5.
La calidad del DNA aislado fue comprobada desarrollando una pequeña cantidad (2 µl) en un minigel del modo anteriormente descrito. En la Figura 10 se muestra un ejemplo de fragmentos de DNA purificados, aislados antes de la secuenciación del DNA.
5
Mezclas de Cy-5-dNTP
Se prepararon cuatro mezclas de Cy-5-dNTP (A, C, G, T) para cuatro reacciones de secuenciación. 4 reacciones (mezclas MA, MC, MG, MT) 2 �l de dNTPs 1,1 mM 1 �l de Cy-5-dNTP (A, C, G o T) 7 �l de H2O 1 �l de EDTA 0,55 mM
10 Los tubos que contienen Cy-5-dNTPs deben ser mantenidos sobre hielo en la oscuridad en todo momento.
Se preparó una mezcla magistral para secuenciación.
1 reacción
8 �l de molde de DNA
2 �l de cebador (directo o inverso)
3,5 �l de tampón de reacción
0,9 �l de Thermo Sequenase
12,6 �l de H2O
Se añadió lo siguiente a cuatro tubos para PCR.
A: 2 �l de MA 15 C: 2 �l de MC
G: 2 �l de MG
T: 2 �l de MT Se añadieron 6 �l de mezcla magistral para secuenciación a cada uno de los cuatro tubos.
20 Se llevó a cabo la PCR siguiente: 30X 95 °C 30 segundos 57 °C 30 segundos 72 °C 80 segundos
Los productos de la reacción de secuenciación fueron purificados en columnas de Sephadex G-50 para centrifugación (conjunto de 96 pocillos). Los productos fueron secados después en la oscuridad a 37 °C y fueron luego resuspendidos en disolución para detención de secuenciación (8 µl). Las muestras (4 µl) fueron luego
5 tratadas en un secuenciador ALF de Amersham-Pharmacia bajo condiciones estándares.
10 Resultados de la PCR Después de habérnoslas arreglado para probar el protocolo mediante la detección de RNA 16S usando cultivos bacterianos diluidos de Escherichia coli (Figura 7), probamos este método sobre muestras clínicas de cartílago. La designación de los carriles/tejidos es (N) para regiones normales o
15 no afectadas, (D) para regiones dañadas y (A) para regiones osteoartríticas. Una articulación de un paciente puede tener regiones de OA obviamente avanzada, regiones que parecen bastante normales y zonas que no están en las fases avanzadas de la OA pero en que el cartílago es blando y en cierto grado está fibrilado; esta última zona es definida como dañada.
20 Los resultados se muestran más adelante en las Figuras y la Tabla 2. Los resultados muestran que la presencia de señales de 16S pueden ser siempre asociadas con pacientes osteoartríticos. Aunque, de vez en cuando, el tejido aislado de pacientes osteoartríticos no revelaba señales de RNA 16S al utilizar las condiciones de PCR estándares, nunca se detectó una señal de RNA 16S en teji
25 dos de pacientes normales. La Tabla 2 posterior proporciona un resumen de la detección de secuencias de rRNA 16S en muestras clínicas. A = osteoartrítica y N = normal. Se utilizaron dos tipos de testigo: testigo de H2O (blanco) y RNA total de E. coli como testigo positivo. La transcripción inversa se realizó con el cebador R1474. La multiplicación
30 por PCR se llevó a cabo utilizando los cebadores F7 y R1474. Los números de la columna "muestra" son los números de los pacientes. Algunas muestras aparecen más de una vez en la tabla porque la muestra fue analizada más de un día.
Muestra Positiva Negativa
8A *
17A *
20A *
16N *
Testigo de E. coli *
H2O *
8A *
17A *
H2O *
8A *
17A *
16N *
H2O *
8A *
17A *
H2O *
21A *
H2O *
21A *
H2O *
25A *
H2O *
25A *
H2O *
25A * H2O *
25A * H2O *
25A * H2O *
25A * 21A * H2O *
21A * H2O *
8A * 17A * 20A * 16N * H2O *
17A * 20A * H2O *
8A * 17A * 20A * 15A * H2O *
8A * 15A * 17A *
20A *
16N *
H2O *
8A *
15A *
16N *
H2O *
8A *
17A *
20A *
16N *
H2O *
8A *
15A *
17A *
20A *
16N *
18N *
H2O *
La primera secuencia de presentación diferencial aislada de pacientes (Figura 6) nos llevó a sospechar de la presencia de bacterias.
A continuación se muestra el resumen de un análisis FASTA de esta secuencia, que indica una similitud muy elevada con secuencias de origen procariótico.
Secuencias que producen alineaciones significativas: (bits) Valor
Secuencias compuestas de diversas muestras de pacientes generadas al usar los cebadores aquí descritos han sido sometidas a análisis FASTA. Los resul
5 tados de estos indican la presencia de Janthinobacterium o una especie bacteriana muy estrechamente relacionada con ella en tejido con OA. Más adelante se presentan dos de dichos análisis a modo de ejemplo.
Mediante una búsqueda en la base de datos del NCBI con Blastn, se halló que la secuencia compuesta directa e inversa del tejido afectado del paciente 21 10 (Figura 12) representaba a Janthinobacterium. Esta secuencia se halló siempre en
pacientes con OA. Las 3 mejores alineaciones de esta secuencia al seguir una investigación con Blastn el 13 de Noviembre de 2000 fueron:
Las alineaciones concretas fueron las siguientes:
Se analizó similarmente una secuencia compuesta (705 nucleótidos) del tejido afectado del paciente 17 usando el cebador directo F7, y las cuatro mejores ali
neaciones a partir de una base de datos que contenía 671.573 secuencias fueron:
A continuación se muestra la alineación concreta para la primera secuencia de la lista:
Las muestras previamente discutidas procedían de biopsias pero, en un
5 avance significativo, se ha mostrado también ahora que se puede hacer un diagnóstico a partir de una muestra del líquido sinovial que se puede obtener sin cirugía mediante un procedimiento mucho menos invasivo y traumático. A continuación se describe un protocolo adecuado. Después de la recogida de LS del paciente, el LS fue guardado a 4 °C y,
10 después de no más de 20 minutos, fue centrifugado a 13.000 rpm (aproximadamente
12.500 g) durante 30 minutos a 4 °C. Se separó el sobrenadante y se guardó el sedimento de centrifugación a -72 °C hasta el aislamiento del RNA/DNA. Se añadió 1 ml de disolución de TRIzol al sedimento de centrifugación. El sedimento de centrifugación fue disuelto por remoción y fue luego incubado a temperatura ambiental durante 10
15 minutos. Se añadieron 0,2 ml de cloroformo a la disolución y ésta fue mezclada después por remoción y fue luego incubada a temperatura ambiental durante 15 minutos. Luego se centrifugó la disolución a 13.000 rpm a 4 °C durante 15 minutos. Se separó la fase superior acuosa y se aisló el RNA del modo anteriormente descrito. Se añadieron 0,3 ml de etanol a la fase de fenol-cloroformo y luego se mezcló la
20 disolución por remoción. Luego se incubó la disolución a temperatura ambiental durante 15 minutos. Después se centrifugó a 2000 rpm (aproximadamente 4500 g) a 4 °C durante 5 minutos. Se separó el sobrenadante y se lavó tres veces el sedimento de centrifugación en 0,5 ml de citrato sódico 0,1 M con etanol al 10%. Después de cada lavado,
25 se realizó una centrifugación a 2000 rpm (aproximadamente 4500 g) a 4 °C durante cinco minutos y se desechó el sobrenadante. Después del último lavado, el sedimento de centrifugación fue dejado secar al aire durante 30 minutos a temperatura ambiental. El sedimento de centrifugación fue resuspendido en 80 µl de NaOH 8 mM.
30 Ejemplo 2 – Tratamiento de pacientes osteoartríticos con antibióticos – Aspectos clínicos En este estudio, se utilizó un antibiótico eficaz contra una gran variedad de bacterias Gram negativas y Gram positivas.
Se diagnosticó la enfermedad de 30 pacientes y se trataron estos durante un mes con el antibiótico internacionalmente conocido de forma genérica como doxiciclina; este fue adquirido a Pfizer como Vibramicina. Se tomaron muestras del
5 líquido sinovial antes y después del tratamiento.
Se identificaron 30 pacientes que presentaban signos clínicos y radiológicos de osteoartritis. Se informó a estos pacientes, quienes firmaron un papel de 10 acuerdo con las instrucciones del Comité Etico (Northern Norway Health Region 5).
Se utilizaron las calificaciones KOOS (Knee Injury and Osteoarthritis Outcome Score) [Roos et al.: "Development of a self-administered outcome measure", Journal of Orthopaedic and Sports Physical Therapy 78 (2): 88-96, 1998] y de Lysholm [véase Tegner y Lysholm: "Rating Systems in the Evaluation of Knee Ligament Inju
15 ries", Clinical Orthopaedics and Related Research, nº 198, Setiembre de 1985, 43-49]. Durante la primera visita, se tomó una muestra del líquido sinovial (técnica estándar en el portal lateral superior), utilizando una jeringa de 10 ml de capacidad. Si había demasiado poco líquido y no se aspiraba líquido sinovial en seguida, se inyectaban 5-10 ml de disolución salina fisiológica-agua y se aspiraba de nuevo. Se
20 pusieron inmediatamente las muestras en una nevera y se llevaron al laboratorio. Se administraron diariamente 100 mg de Vibramicina a todos los pacientes durante 4 semanas. De los pacientes en que se encontraron las bacterias, se tomaron nuevas muestras del líquido sinovial utilizando la misma técnica.
Se observó una mejoría.
Es importante advertir que, en este sistema de calificación, valores mayores significan que los pacientes están mejor. Los valores pequeños indican más síntomas, por ejemplo, dolor. Todos los valores mejoraron en este estudio. Se considera
30 una mejoría particularmente significativa cuando los valores de p son � 0,05. KOOS Se analizaron estos parámetros: Síntomas Actividad de la vida diaria
35 Deporte
Calidad de la vida diaria
Dolor
Lysholm
0-100: 100 es la mejor calificación posible y 0 es la peor.
Los resultados de estos ensayos se presentan en forma gráfica en las Figuras 16 a 21.
En la Tabla 3 siguiente se muestra un resumen de la respuesta al tratamiento con el antibiótico tetraciclina durante cuatro semanas, según se determina mediante preguntas directas a los pacientes sobre cómo se sentían.
- Muestra/paciente
- Estatus después de 4 semanas de tratamiento
- 2
- mejorado
- 3
- inalterado
- 4
- inalterado
- 5
- inalterado
- 6
- mejorado
- 7
- mejorado
- 8
- inalterado
- 9
- mejorado
- 10
- mejorado
- 11
- inalterado
- 12
- inalterado
- 13
- mejorado
- 14
- mejorado
- 15
- inalterado
- 16
- mejorado
- 17
- inalterado
- 18
- inalterado
- 19
- inalterado
- 20
- inalterado
- 21
- inalterado
- 22
- inalterado
- 23
- inalterado
- 24
- inalterado
- 25
- inalterado
- 26
- mejorado
- 34
- mejorado
Conclusión
Estos resultados respaldan nuestra hipótesis de que se puede tratar la
osteoartritis con antibióticos. La Vibramicina mejoró todas las calificaciones clínicas del
paciente.
Claims (17)
- REIVINDICACIONES1. Uso de un agente antibacteriano en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la osteoartritis bacteriana primaria al tratar una infección bacteriana que es responsable de la osteoartritis.5 2. Un uso como el reivindicado en la Reivindicación 1, en que dicho agente antibacteriano es eficaz contra Janthinobacterium.
- 3. Un uso como el reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en que dicho agente antibacteriano es seleccionado del grupo que comprende: claritromicina, levofloxacina, mercaptoetilguanidina, lactato de ciprofloxacina, tobramicina,10 ceftazidima pentahidratada, gentamicina, ciproxina, rifampicina, doxiciclina, trimetroprima y sulfametoxazol.
- 4. Un uso como el reivindicado en cualquier reivindicación precedente, en que dicho medicamento comprende dos o más agentes antibacterianos.
- 5. Un uso como el reivindicado en cualquier reivindicación precedente,15 en que el tratamiento comprende además la administración de un segundo medicamento que contiene otro agente antibacteriano o un agente que puede romper DNA.
- 6. Un uso como el reivindicado en la Reivindicación 5, en que dicho segundo medicamento contiene gentamicina, ciproxina o DNasa I.
- 7. Un uso como el reivindicado en la Reivindicación 6, en que dicho se20 gundo medicamento está en una forma adecuada para inyección.
- 8. Un agente antibacteriano para uso en el tratamiento de la osteoartritis bacteriana primaria al tratar una infección bacteriana que es responsable de la osteoartritis.
- 9. Un producto que contiene (a) un agente antibacteriano y (b) un anta25 gonista de óxido nítrico como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o sucesivo en el tratamiento de la osteoartritis bacteriana primaria al tratar una infección bacteriana que es responsable de la osteoartritis.
- 10. Un producto que contiene (a) un agente antibacteriano y (b) un agente que puede romper DNA como una preparación combinada para uso simultá30 neo, separado o sucesivo en el tratamiento de la osteoartritis bacteriana primaria al tratar una infección bacteriana que es responsable de la osteoartritis.
- 11. Un método in vitro para diagnosticar una osteoartritis en un paciente del que se sospecha que tiene osteoartritis, método que comprende examinar una muestra de una articulación de dicho paciente en cuanto a la presencia de bacterias y,35 cuando dichas bacterias están presentes, confirmar que dicha articulación está afectada por una osteoartritis bacteriana primaria.
- 12. Un método como el reivindicado en la Reivindicación 11, en que las bacterias se detectan por medio de la unión de uno o más oligonucleótidos al ácido nucleico de dichas bacterias.5 13. Un método como el reivindicado en la Reivindicación 11 ó 12, en que dicha muestra se pone en contacto con una pareja de cebadores capaz de unirse a secuencias diana del ácido nucleico de dichas bacterias.
- 14. Un método como el reivindicado en la Reivindicación 13, en quedichos cebadores son capaces de unirse a regiones del rRNA 16S de las bacterias o 10 del gen que lo codifica.
-
- 15.
- Un método como el reivindicado en la Reivindicación 11, en que se detectan las bacterias utilizando anticuerpos.
-
- 16.
- Un método como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 11 a 15, en que dicha muestra es una muestra del líquido sinovial.
15 17. Un componente para detección bacteriana para uso en el diagnóstico de una osteoartritis bacteriana primaria en un paciente del que se sospecha que tiene osteoartritis. - 18. Un componente para detección bacteriana de acuerdo con la Reivindicación 17, en que dicho componente para detección es un oligonucleótido.20 19. Un componente para detección bacteriana de acuerdo con la Reivindicación 18, en que dicho oligonucleótido es un cebador capaz de unirse a secuencias diana del ácido nucleico de dichas bacterias.
- 20. Un componente para detección bacteriana de acuerdo con la Reivindicación 19, en que dicho cebador es capaz de unirse a regiones del rRNA 16S de 25 las bacterias o del gen que lo codifica.
- 21. Un componente para detección bacteriana de acuerdo con la Reivindicación 17, en que dicho componente para detección es un anticuerpo.
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