DE69433201T2 - Oligonukleotide und Verfahren zum Nachweis von Bakterien - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Bereich der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft synthetische Oligonucleotide zum Nachweis von enterohämorrhagischem Escherichia coli oder verocytotoxin-produzierendem Escherichia coli, ein Verfahren und einen Kit zum Nachweis dieser bakteriellen Stämme.
  • Stand der Technik
  • Der Nachweis von pathogenem enterohämorrhagischem Escherichia coli (im Folgenden einfach als EHEC bezeichnet) oder verocytotoxin-produzierendem Escherichia coli (im Folgenden einfach als VTEC bezeichnet) ist eine wichtige Aufgabe in dem Bereich der Medizin und öffentlichen Hygiene; dazu werden verschiedene Verfahren verwendet.
  • Konventionell beinhaltet der Nachweis eines pathogenen bakteriellen Stammes die Isolierung mehrerer pathogener bakterieller Kolonien und Identifizierung der Bakterienarten durch serologische oder biochemische Verfahren.
  • Im Fall von Shigella-Arten geschah dies durch Kultivierung und Isolierung des Zielbakteriums aus Proben von Ausscheidungen von Patienten, Nahrungsmitteln oder Ähnlichem unter Verwendung eines Mediums, wie DHL-Agar oder MacConkey's-Agar, und anschließendes Kultivieren des Bakteriums unter Verwendung eines Mediums, wie TSI-Agar oder LIM-Agar zum Zweck der Identifizierung.
  • Im Fall von Salmonella-Arten wird eine Kultivierung durchgeführt zur Isolierung des Bakteriums aus Proben von Ausscheidungen oder Erbrochenem von Patienten, Nahrungsmitteln oder Wischproben usw., gefolgt von Animpfen von TSI-Agar, SIM-Medium, VP-MR-Medium und Lysin-Decarboxylierungstestmedium und anschließender Über-Nacht-Kultur bei 37°C zur Bestätigung der Salmonella-Arten; der Serotyp wird unter Verwendung eines kom merziell erhältlichen Sets von Antiseren gegen O- und H-Antigene bestimmt.
  • EHEC oder VTEC verursachen bekanntermaßen das hämolytische urämische Syndrom bei Kindern; außerdem wird bei Nahrungsmittelvergiftungs-Symptomen, typischer hämorrhagischer Colitis und Stress ein Nachweis dieses Bakteriums in klinischen Tests durchgeführt. Im Fall des Nachweises von EHEC oder VTEC handelt es sich bei den Proben um Patientenausscheidungen, Nahrungsmittel- oder Wasserproben (Trinkwasser, Flusswasser usw.), die aus der Umwelt des Patienten gesammelt werden. Beim Nachweis von EHEC (VTEC) in diesen Proben ist es notwendig, eine Reihe von Verfahren durchzuführen, von der direkten Isolierung der Kultur, einem primären Bestätigungskultivierungstest und einem sekundären Bestätigungskultivierungstest bis zu einem Agglutinationstest mit einem Antiserum.
  • Im Fall von Staphylococcus aureus handelt es sich bei den Proben um Erbrochenes oder Ausscheidungen des Patienten, vom Patienten gegessene Nahrungsmittel, Wischproben aus der Umgebung des Patienten oder Ähnliches. Vor dem Nachweis und der Identifizierung von Staphylococcus aureus in diesen Proben ist es notwendig, eine bakterielle Kultivierung, eine Isolierungskultur und anschließend eine reine Kultur und Bestätigungskultur durchzuführen.
  • Im Fall von Vibrio cholerae handelt es sich bei den Proben um Ausscheidungen oder Nahrungsmittel des Patienten oder Wasserproben (Trinkwasser, Flusswasser, Meerwasser usw.) oder Benthosproben aus der Umgebung des Patienten. Beim Nachweis und der Identifizierung von Vibrio cholerae in diesen Proben ist es notwendig, eine Reihe von Verfahren durchzuführen, von der primären Anreichungskultur, sekundären Anreicherungskultur und Isolierungskultur bis zu einem Agglutinations-Reaktionstest mit Anti-V. cholerae-01-Serum und einer Bestätigungskultur.
  • Im Fall von Clostridium perfringens werden die Proben vorwiegend von Ausscheidungen des Patienten und Nahrungsmitteln erhalten. Zum Nachweis und zur Identifizierung werden die Proben einer Anreicherungskultur und einer Isolierungskultur unter anaeroben Bedingungen unterworfen. Die Tests auf biochemische Eigenschaften werden mit mehreren Kolonien der Bakterien durchgeführt.
  • Jedes der oben erwähnten Identifizierungsverfahren dauert gewöhnlich mehrere Tage und verhindert eine schnelle Diagnose der Infektionskrankheiten.
  • Insbesondere im Fall von Shigella-Arten dauert jede Kultivierungsstufe 18–24 Stunden, insgesamt also 3–4 Tage; ein schneller Nachweis ist schwierig. Zu anderen verfügbaren Verfahren zählen die umgekehrte passive Latex-Agglutination unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen das Shiga-Toxin, das EIA-Verfahren unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen das 140 MDal-Plasmidprodukt, welches mit der Pathogenität von Shigella-Arten und enteroinvasivem Escherichia coli in Verbindung steht [Kenichiro Ito et al., Jananese Journal of Bacteriology 41, 414 (1986)], und das DNA-Sondenverfahren zum Nachweis des ipaB-Gens, des ipaC-Gens oder des ipsD-Gens (US-Patentanmeldung Nr. 888194). Diese Testverfahren erfordern jedoch komplizierte beschwerliche Verfahren bei der Herstellung von Reagenzien und Proben und viel Zeit.
  • Im Fall von Salmonella-Arten werden 2–3 Tage für die bakterielle Isolierung und Identifizierung des Bakteriums aus den Proben benötigt. Zudem sind Salmonella-Tests schwierig in gewöhnlichen Laboratorien durchzuführen, da 100 Antiseren und viel Erfahrung notwendig sind, um eine vollständige Serum-Typisierung der Salmonella-Arten zu erreichen, was eine große Anzahl von Serumtypen erfordert. Ebenso dauert jede Kultivierungsstufe und jeder Serotypisierungstest 3–4 Tage; die Geschwindigkeit ist gering. Zudem sind die Bestätigungskultur und die Serotypisierung kostenaufwendig und erfordern beschwerliche Arbeitsschritte.
  • Im Fall von EHEC (VTEC) dauert jede Kultivierungsstufe 18– 24 Stunden, insgesamt also 3–4 Tage. Der derzeit vorliegende Serotyp von EHEC (CTEC) ist 0157:H7; es ist jedoch kein diagnostisches Antiserum kommerziell erhältlich zur Identifizierung dieses Serotyps, so dass das diagnostische Antiserum durch den Forschenden hergestellt werden muss. Außerdem ist es oftmals schwierig, das ursächliche Bakterium allein auf der Grundlage der Serumtypisierung in EHEC (VTEC) zu identifizieren, da der Serumtyp und die Pathogenität nicht immer übereinstimmen. Deshalb fehlt es dem konventionellen Testverfahren für EHEC (VTEC) an Schnelligkeit und Einfachheit, und es ist nicht für die praktische Anwendung geeignet.
  • Im Fall von Staphylococcus aureus dauert jede Kultivierugnsstufe 18–24 Stunden, insgesamt sind das 4 Tage, wenn sie mit der für die nachfolgenden Tests erforderlichen Zeit zusammengenommen werden. Außerdem sollten bei dem biochemischen Kultivierungstest zur Identifizierung verschiedene Eigenschaften, wie aerobes Wachstum, VP-Reaktivität, Nitratreduktion, Tween-80-Hydrolisierbarkeit, Hyaluronidase-Aktivität und Zuckerzersetzung, untersucht werden; dieses Verfahren ist jedoch beschwerlich, ermüdend und teuer. Das zuverlässigste Verfahren zur Identifizierung des ursächlichen Bakteriums bei Nahrungsmittelvergiftung und Diarrhöe ist, den isolierten Stamm auf Exotoxin (toxisches-Schock-Syndrom-Toxin-1, im Folgenden einfach als TSST-1 bezeichnet)-Produktion zu testen. Jedoch werden, auch wenn ein kommerziell erhältlicher bequemer Reagenzkit verwendet wird, 18–20 Stunden benötigt, um die Ergebnisse zu erhalten; die Geschwindigkeit ist gering.
  • Im Fall von Vibrio cholerae dauert jede Kultivierungsstufe 18–24 Stunden, insgesamt sind das etwa 4 Tage. Bei dem biochemischen Test betreffend die Bestätigungskultur sollten ver schiedene Eigenschaften, wie Oxidasetest-Positivität, Indoltest-Positivität, Motilität und Lysindecarboxylierungstest-Positivität, untersucht werden. Diese Tests sind aufwendig, ermüdend und kostenaufwendig und die erhaltenen Ergebnisse sind in einigen Fällen schwer zu bewerten. Zudem ist es im Fall von Vibrio cholerae wesentlich, den isolierten Stamm auf Enterotoxin (Choleratoxin; CT)-Produktion zu testen, um ein administratives Maß zur Pestkontrolle zu erhalten. Jedoch werden, auch wenn ein kommerziell erhältlicher bequemer Reagenzkit verwendet wird, 18–20 Stunden benötigt, um die Ergebnisse zu erhalten; die Geschwindigkeit und die praktische Anwendbarkeit sind gering.
  • Im Fall des Welchs's-Bazillus (Clostridium perfringens) erfordert der Nachweis eine beträchtlich lange Zeit: jede Kultivierungsstufe dauert 18–48 Stunden, insgesamt 5–6 Tage. Außerdem ist es, da Clostridium perfringens-Stämme in der Natur weit verbreitet sind, nicht ausreichend, lediglich den bakteriellen Stamm in der Probe nachzuweisen, um den Stamm als ursächliches Agens für die Nahrungsmittelsvergiftung zu bestimmen. Es sind weitere Tests erforderlich, einschließlich des Nachweises von Enterotoxin im Stuhl des Patienten, eine Untersuchung der isolierten Stämme auf Enterotoxin-Produktion, Sertotyp-Bestimmung und Bestimmung der Bakterienzahl bei dem verdächtigen Nahrungsmittel. Diese Verfahren benötigen viel Zeit und Arbeit; es fehlen ihnen Schnelligkeit und Einfachheit.
  • In den vergangenen Jahren wurden der DNA-Nachweis durch Sonden oder die DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Oligonucleotiden versucht. Jedoch ist, wenn die Hybridisierung auf einer Membran oder einem anderen Träger unter Verwendung einer markierten Oligonucleotid-Sonde und anschließende Detektion der Sonde durchgeführt wird, die Sensitivität der Assays abhängig von der Anzahl von für den Nachweis verfügbaren Orga nismen. Aus diesem Grund ist es schwierig, eine hohe Nachweisempfindlichkeit und Selektivität in diesem Test zu erreichen, ohne die oben beschriebene Vorbehandlung der Trennungskultur.
  • "Journal of Clinical Microbiology", Vol. 28, Nr. 1, Jan. 1990, Seiten 540–545, beschreibt den schnellen und spezifischen Nachweis von Verotoxin-Genen in E. coli durch die Polymerase-Kettenrekation unter Verwendung bestimmter verotoxinspezifischer Oligonucleotid-Primer (siehe Seite 540, Tabelle 2 und "Ergebnisse").
  • EP 0 409 159 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von enteropathogenen Bakterien unter Verwendung des PCR-Verfahrens zur Amplifikation einzelner Zielbereiche, die für ein bestimmtes Bakterium spezifisch sind; solche Verfahren werden für den Nachweis von Escherichia coli, Salmonella sp., Staphylocossus aureos und Clostridium perfringens unter anderen Stämmen beschrieben.
  • "Journal of Clinical Microbiology", Vol. 29, Nr. 9, Sept. 1991, Seiten 1910–1914, zeigt die Identifizierung/Detektion von Shiga-Toxin und shiga-artigem Toxin Typ-1 produzierendem Shigella dysenteriae Typ 1 und E. coli unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (siehe Zusammenfassung, Material-und Methodenteil der Veröffentlichung).
  • Aus dem Abstract von JP 4297489 , Database WPI/Derwent ist der Nachweis von verotoxin-produzierendem E. coli durch Polymerase-Kettenreaktionstechnik bekannt, wobei Primer verwendet werden, die spezifisch nur eines der VT1-, VT2-, VT2vp- und VT2vh-Gene zum Nachweis des Verotoxin-Gens detektieren; durch dieses Verfahren kann der Typ des verotoxin-produzierenden E. coli bestimmt werden.
  • Der Abstract von JP 4297488 , Database WPI/Derwent beschreibt den Nachweis von verotoxin-produzierendem E. coli durch Polymerase-Kettenreaktionstechniken unter Verwendung von Primern, welche eine hohe Homologie mit VT1-, VT2-, VT2vp-, VT2vha- und VT2vhb-Genen aufweisen, zum Nachweis des Verotoxin-Gens. Durch dieses Verfahren kann der verotoxinproduzierende E. coli schnell nachwiesen werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, synthetische Oligonucleotide zur Verfügung zu stellen, die als Primer für PCR verwendet werden, um bestimmte Bereiche der Gene, die spezifisch für die obigen verschiedenen pathogenen Mikroorganismen sind, zu amplifizieren.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein einfaches, schnelles und hoch sensitives Verfahren zum Nachweis von EHEC oder VTEC zur Quarantänekontrolle, klinischen Laboruntersuchung und Nahrungsmittelkontrolle zur Verfügung zu stellen, wobei ein Bereich eines Gens, welches spezifisch für einen nachzuweisenden bakteriellen Stamm ist, durch die PCR-Technik unter Verwendung synthetischer Oligonucleotid-Primer amplifiziert wird.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Kit zum Nachweis der obigen verschiedenen bakteriellen Stämme zur Verfügung zu stellen, welcher wenigstens ein Primerpaar, eine thermostabile DNA-Polymerase und dNTP-Lösungen enthält.
  • Das wesentliche der vorliegenden Erfindung betrifft:
    • 1) ein synthetisches Oligonucleotid von 10 bis 30 Basen gemäß den Ansprüchen 1 und 2;
    • 2) ein Verfahren zum Nachweis eines bakteriellen Stammes gemäß den Ansprüchen 3 und 5;
    • 3) einen Kit zum Nachweis eines bakteriellen Stammes gemäß Anspruch 4, bestehend aus den Oligonucleotiden von 1) und 2), einer thermostabilen DNA-Polymerase und dNTP-Lösungen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein hoch selektives und hoch sensitives Verfahren zum schnellen Nachweis von EHEC, welche das ipaH-Gen und das invE-Gen aufweisen, EHEC, welche das VT1-Gen und das VT2-Gen aufweisen, zur Verfügung.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden detaillierten Beschreibung und der angefügten Zeichnungen, welche lediglich der Veranschaulichung dienen und die vorliegende Erfindung nicht einschränken, verständlicher.
  • 1 ist das Elektrophorese-Muster der amplifizierten DNA-Fragmente auf einem Agarosegel zur Bewertung der Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens der vorliegenden Erfindung für das TSST-1-Gen von Staphylococcus aureus, wobei die Zahlen 1 bis 9 die Anzahl der in der Polymerase-Kettenreaktion (im Folgenden einfach als PCR bezeichnet) verwendeten Kopien bezeichnet: 1 bezeichnet 107 Kopien, 2 bezeichnet 106 Kopien, 3 bezeichnet 105 Kopien, 4 bezeichnet 104 Kopien, 5 bezeichnet 103 Kopien, 6 bezeichnet 102 Kopien, 7 bezeichnet 10 Kopien, 8 bezeichnet 1 Kopie und 9 bezeichnet keine DNA.
  • 2 ist das Muster der Agarosegel-Elektrophorese von Nucleotidfragmenten, die durch PCR amplifiziert wurden, um die Spezifität des Nachweisverfahrens der vorliegenden Erfindung für das ctx-Gen von Vibrio cholerae zu bestimmen, wobei M den Molekulargewichtsmarker angibt, und die Spuren 1–13 die Template-DNA-Lösungen bezeichnen, welche den Hitzeextrakt folgender Stämme enthalten:
    Spuren 1 bis 3: Vibrio cholerae (El Tor – Ogawa-Typ, der ctx-Gen positive Stamm)
    Spuren 4 bis 6: Vibrio cholerae (El Tor – Inaba-Typ, der ctx-Gen positive Stamm )
    Spur 7: Vibrio cholerae (klassischer Ogawa-Typ, der ctx-Gen positive Stamm
    Spur 8: Vibrio cholerae (klassischer Inaba-Typ, der ctx-Gen positive Stamm
    Spur 9 bis 10: Vibrio cholerae (non-O1, der ctx-Gen positive Stamm
    Spur 11: Vibrio cholerae (El Tor – Ogama Typ, der ctx-Gen negative Stamm
    Spur 12: Vibrio cholerae (El Tor – Inaba-Typ, der ctx-Gen negative Stamm
    Spur 13: Enterotoxigenes Escherichia coli (thermolabiler Enterotoxingen positiver Stamm).
  • 3 ist das elektrophoretische Muster der Agarosegel-Elektrophorese für die durch PCR amplifizierten Nucleotidfragmente, zum Nachweis des Enterotoxingens von Clostridium perfringens, wobei der obere Bereich die Ergebnisse zeigt, die mit Oligonucleotid SEQ ID NO: 28 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 33 erhalten wurden, der untere Bereich die Ergebnisse zeigt, die mit Oligonucleotid SEQ ID NO: 29 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 33 erhalten wurden, wobei M den Molekulargewichtsmarker bezeichnet und die Spuren 1–13 die Template-DNAs bezeichnen, die aus den Hitzeextrakten folgender Stämme erhalten wurden: Spur 1, ATCC 12925; Spur 2, ATCC 12924; Spur 3, ATCC 12922; Spur 4, ATCC 12920, Spur 5, ATCC 12916, Spur 6, ATCC 12915; Spur 7, ATCC 12918; Spur 8, ATCC 12919; Spur 9, ATCC 12921; Spur 10 , JCM 1296; Spur 11, JCM 1416; Spur 12, JCM 1382; Spur 13, negative Kontrolle.
  • 4 zeigt die Ergebnisse eines Southern-Blot-Hybridisierungstests zur Bestätigung, dass die Nucleotidsequenz der mit den Primern der vorliegenden Erfindung amplifizierten DNA ein Teil der Enterotoxingensequenz von Clostridium perfringens ist, wobei der obere Bereich die Ergebnisse zeigt, die mit Oligonucleotid SEQ ID NO: 28 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 33 erhalten wurden, und der untere Bereich die Ergebnisse zeigt, die mit Oligonucleotid SEQ ID NO: 29 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 33 erhalten wurden, wobei M den Molekulargewichtsmarker angibt und die Spuren 1–13 die Template-DNA-Lösungen angeben, die aus den Hitzeextrakten folgender Stämme erhalten wurden: Spur 1, ATCC 12925; Spur 2, ATCC 12924; Spur 3, ATCC 12922; Spur 4, ATCC 12920; Spur 5, ATCC 12916; Spur 6, ATCC 12915; Spur 7, ATCC 12918; Spur 8, ATCC 12919; Spur 9, ATCC 12921; Spur 10, JCM 1296; Spur 11, JCM 1416; Spur 12, JCM 1382; Spur 13, negative Kontrolle.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Oligonucleotide
  • Ein Oligonucleotid der vorliegenden Erfindung ist ein synthetisches Oligonucleotid, welches komplementär und selektiv an ein Gen hybridisiert, welches spezifisch für einen pathogenen Bakterienstamm, wie Shigella-Spezies, EIEC, Salmonella-Spezies, EHEC oder VTEC, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae und Clostridium perfringens, ist. Bei dem bakteriellen Nachweis der vorliegenden Erfindung werden die Oligonucleotide als Primer bei der PCR verwendet, um eine DNA-Sequenz eines Zielgens, welches spezifisch für das nachzuweisende pathogene Bakterium ist, zu amplifizieren. Zu diesem Zweck können jegliche Kombinationen zweier Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung wahlweise verwendet werden, ohne besondere Einschränkung, solange eine DNA-Sequenz von 50 bis 2000 Basen, bevorzugt 100 bis 1000 Basen, amplifiziert werden kann. Die bevorzugte Kombination der Oligonucleotide ist detailliert in den folgenden bevorzugten Ausführungsformen beschrieben.
  • In den unten erwähnten Oligonucleotiden kann T durch U ersetzt werden, ohne die vorteilhafte Wirkung der Oligonucleotide zu beeinträchtigen.
  • Bevorzugte Ausführungform 1:
  • Für den Nachweis von Shigella-Arten (Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii und Skigelle sonnei) und EIEC werden das Shiga-Toxingen, welches spezifisch für Shigella-Spezies ist, das ipaH-Gen, welches spezifisch für Shigella-Spezies und EIEC ist, oder das invE-Gen, welches spezifisch für Shigella-Spezies und EIEC ist, als Zielgene ausgewählt.
  • Wenn auf das Shiga-Toxingen gezielt wird, werden zwei Oligonucleotide, von denen eines wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des folgenden Oligonucleotids SEQ ID NO: 1 enthält, und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des folgenden Oligonucleotids SEQ ID NO: 2 enthält, in der vorliegenden Erfindung ausgewählt:
  • Figure 00110001
  • Wenn auf das ipaH-Gen gezielt wird, werden zwei Oligonucleotide, von denen eines wenigestens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 3 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 4 enthält, in der vorliegenden Erfindung ausgewählt:
  • Figure 00110002
  • Wenn auf das invE-Gen gezielt wird, werden zwei Oligonucleotide, von denen eines wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 5 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 6 enthält, in der vorliegenden Erfindung ausgewählt:
  • Figure 00110003
  • Bevorzugte Ausführungsform 2:
  • Für den Nachweis von Salmonella-Spezies wird auf das araC-Gen gezielt.
  • Zu diesem Zweck wird eine der folgenden Oligonucleotid-Kombinationen bevorzugt in der vorliegenden Erfindung ausgewählt.
  • Eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigestens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 7 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 8 enthält; eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 9 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 10 enthält; und eine Kombination, in der das Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 11 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 8 enthält:
  • Figure 00120001
  • Bevorzugte Ausführungsform 3:
  • Für den Nachweis von EHEC- oder VTEC-Stämmen wird auf das Verocytotoxin-1(VT1)-Gen oder das Verocytotoxin-2(VT2)-Gen gezielt.
  • Um Bakterien nachzuweisen, welche lediglich das VT1-Gen besitzen, werden zwei Oligonucleotide, von denen eines wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 12 und das andere wenigstens 10 aufeinanderfolgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 13 enthält, bevorzugt in der vorliegenden Erfindung aufgewählt:
  • Figure 00120002
  • Um Bakterien nachzuweisen, welche lediglich das VT2-Gen oder eine Variante davon (VT2vha, VT2vhb und VT2vp1) besitzen, werden zwei Oligonucleotide, von denen eines wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 14 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 15 enthält, bevorzugt in der vorliegenden Erfindung ausgewählt:
  • Figure 00130001
  • Um Bakterien nachzuweisen, welche sowohl das VT1-Gen als auch das VT2-Gen (einschließlich der VT2vha-, VT2vhb- und VT2vp1-Gene) besitzen, wird eine der folgenden Oligonucleotid-Kombinationen bevorzugt in der vorliegenden Erfindung ausgewählt.
  • Eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 16 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 18 enthält; eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 17 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 18 enthält.
  • Figure 00130002
  • Bevorzugte Ausfühungsform 4:
  • Zum Nachweis von Staphylococcus aureus wird auf das TSST-1-Gen gezielt.
  • Zu diesem Zweck wird eine der folgenden Oligonucleotid-Kombinationen bevorzugt in der vorliegenden Erfindung ausgewählt.
  • Eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 20 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 21 enthält; eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 19 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 22 ent hält; und eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 20 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgenden Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 22 enthält:
  • Figure 00140001
  • Bevorzugte Ausführungsform 5:
  • Zum Nachweis von Vibrio cholerae wird auf das ctx-Gen gezielt.
  • Zu diesem Zweck wird eine der folgenden Oligonucleotid-Kombinationen bevorzugt in der vorliegenden Erfindung ausgewählt.
  • Eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 23 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 25 enthält; und eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 24 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 26 enthält:
  • Figure 00140002
  • Bevorzugte Ausführungform 6:
  • Für den Nachweis von Clostridium perfringens wird auf das Enterotoxin-Gen gezielt.
  • Zu diesem Zweck wird eine der folgenden Oligonucleotid-Kombinationen bevorzugt in der vorliegenden Erfindung ausgewählt.
  • Eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 27 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO:32 enthält; eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 28 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO:33 enthält, eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 29 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 33 enthält; eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 30 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 34 enthält; und eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 31 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen von Oligonucleotid SEQ ID NO: 35 enthält:
  • Figure 00150001
  • Amplifikation der Gensequenz durch PCR
  • Zur Amplifikation eines Bereichs eines Zielgens in der vorliegenden Erfindung wird die von Saiki et al. entwickelte PCR verwendet [Science 230, 1350 (1985)].
  • Insbesondere werden zwei Oligonucleotid-Primer, die einen bestimmten Bereich eines Zielgens flankieren (in der vorlie genden Erfindung das Shiga-Toxingen von Shigella-Spezies, die ipaH- und invE-Gene von Shigella-Spezies und EIEC, das araC-Gen von Salmonella-Spezies, die VT1- und VT2-Gene von EHEC oder VTEC, das TSST-1-Gen von Staphylococcus aureus, das ctx-Gen von Vibrio cholerae und das Enterotoxingen von Clostridium perfringens) synthetisiert.
  • Bei der PCR hybridisiert einer der Oligonucleotid-Primer selektiv an den (+)-Strang der Zielgen-DANN, und das andere hybridisiert an den (–)-Strang der DNA. Dann dienen beide Oligonucleotide jeweils als Primer der matrizen-abhängigen DNA-Polymerisation. In der vorliegenden Erfindung werden Einzelstrang-DNAs, die durch Hitzedenaturierung von doppelsträngigen DNAs in Proben gebildet wurden, als Matrizen (Templates) verwendet. Die Doppelstränge, die aus der DNA-Polymerisationsreaktion resultieren, werden dann denaturiert, um die Primer-Verlängerungsprodukte von den Matrizen zu trennen. Dann dienen die Primer-Verlängerungsprodukte ihrerseits als Matrizen für die nächste DNA-Polymerisationsreaktion. Der Zyklus von Denaturierung, Primer-Hybridisierung (Annaeling), bei dem ein Primer mit einer Matrizen-DNA hybridisiert, und einer Primer-Verlängerungsreaktion wird wiederholt, bis der Bereich des Zielgens ausreichend amplifiziert wurde, um nachgeweisen zu werden.
  • Proben, die für die PCR in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind klinische Proben, wie Stuhl, Urin, Blut, Gewebehomogenat, und Nahrungsmittelproben. Eine Probe für die PCR sollte vorbehandelt werden, um die Nukleinsäurekomponenten von den darin vorliegenden bakteriellen Zellen zu trennen. Da PCR mit lediglich einigen bis zu mehreren zehn Nukleinsäuremolekülen durchgeführt werden kann, kann eine Testlösung, welche eine angemessene Menge an Nukleinsäure enthält, einfach durch kurzes Behandeln einer Probe mit einem bakterio lytischen Enzym, einem grenzflächenaktiven Stoff oder einem Alkali hergestellt werden.
  • Die als Primer in der vorliegenden Erfindung verwendeten Oligonucleotide können entweder synthetisch oder natürlich sein, im Hinblick auf die Selektivität, Nachweisempfindlichkeit und Reproduzierbarkeit sind sie nicht weniger als 10 Basen lang, bevorzugt nicht weniger als 15 Basen. Es ist nicht notwendig, die Primer zum Nachweis zu markieren.
  • Der in dem Zielgen zu amplifizierende Bereich (d. h., das Shiga-Toxingen von Shigella-Spezies, das ipaH-Gen und das invE-Gen von EIEC, das VT1-Gen und das VT2-Gen von EHEC oder VTEC, das araC-Gen von Salmonella-Spezies, das TSST-1-Gen von Staphylococcus aureus und das ctx-Gen von Vibrio cholerae, und das Enterotoxin-Gen von Clostridium perfringens) besitzt eine Länge von 50 bis 2000 Basen, bevorzugt 100 bis 1000 Basen.
  • Bei der PCR wird eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet. Die Quelle, aus der das Enzym erhalten wird, ist nicht besonders beschränkt, solange das Enzym seine Aktivität bei einer Temperatur von 90 bis 95°C beibehält. Die Denaturierung wird bei einer Temperatur von 90 bis 95°C durchgeführt, die Primer-Hybridisierung bei 37 bis 65°C und die Polymerisationsreaktion bei 50 bis 75°C. Der Zyklus von Denaturierung, Primer-Hybridisierung und Polymerisation wird 20 bis 42 mal wiederholt.
  • Die Anwesenheit oder Abwesenheit und die Länge des amplifizierten Nucleotidfragments kann bestimmt werden, indem die Reaktionslösung nach Beendigung der PCR einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen wird. Es können andere Typen von Elektrophorese und Chromatographie ebenso zum Nachweis verwendet werden. Einer der Oligonucleotid-Primer kann als Sonde zum Nachweis der amplifizierten Nucleotidsequenz verwendet werden.
  • Der Nachweis einer Nucleotidsequenz eines Zielgens in einer Probe bedeutet, dass der bakterielle Stamm, welcher das Gen aufweist, in der Probe vorliegt.
  • Die Erfindung wird im Folgenden detaillierter durch die folgenden Beispiele beschrieben; die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Nachweis von Shigella-Arten, welche das Shiga-Toxingen aufweisen
  • [Experiment 1]
  • Herstellung der Proben
  • Die in Tabelle 1 aufgeführten 42 Stämme von Shigella dysenteriae werden von Patienten oder anderen Quellen erhalten. Mit jedem Stamm wird LB-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1 Natriumchlorid) angeimpft und die Kultur über Nacht bei 37 °C unter aeroben Bedingungen geschüttelt. Jede Kulturbrühe wird 10-fach mit 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 (im Folgenden als TE-Puffer bezeichnet) verdünnt und bei 95°C 10 Minuten erhitzt und anschließend zentrifugiert; die Überstände werden als Probenlösungen verwendet.
  • Synthese der Primer
  • Als Primer zur Amplifikation des Shiga-Toxingens von Shigella dysenteriae werden die oben beschriebenen Oligonucleotide SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 auf der Grundlage der bekannten Basensequenz des Shiga-Toxingens ausgewählt [Takao, T. et al., Microb. Pathog., 5: 357–369 (1988)] und chemisch durch das β-Cyanoethylphosphoamidit-Verfahren unter Verwendung einer Cyclon-Plus-DNA-Synthesevorrichtung (hergestellt von Milli-Gen/Bioresearch) synthetisiert. Die synthetisierten Oligonucleotide werden durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie unter Verwendung einer C18-Umkehrphasen-Säule gereinigt.
  • Das Shiga-Toxingen wird als identisch mit dem VT1-Gen von EHEC oder VTEC betrachtet, ein Unterschied besteht lediglich in einigen Basen [Takao, T. et al., Microb. Pathog., 5: 357– 369 (1988)].
  • PCR
  • Zu 3 μl der oben beschriebenen Probenlösung werden 17,05 μl steriles destilliertes Wasser, 3 μl 10 × Reaktionspuffer, 4,8 μl dNTP-Lösung, 1,0 μl Primer (1), 1,0 μl Primer (2) und 0,15 μl einer thermostabilden DNA-Polymerase gegeben, wodurch 30 μl einer Reaktionsmischung hergestellt werden. Diese Reaktionsmischung wird mit 50 μl Mineralöl (hergestellt von SIGMA) beschichtet. Die verwendeten Lösungen und Primer (1) und (2) sind folgendermaßen zusammengesetzt:
    10 × Reaktionspuffer: 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl2, 0,1% (w/v)-Gelatine.
  • dNTP-Lösung: Eine Mischung von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, jeweils mit einer Endkonzentration von 1,25 mM.
  • Primer (1) und (2): Wässrige Lösung der oben beschriebenen chemisch synthetisierten gereinigten Produkte (Konzentration, 3,75 OD/ml).
  • Primer: Die oben beschriebenen chemisch synthetisierten und gereinigten Produkte werden folgendermaßen in Kombination verwendet:
    Primer (1) + Primer (2) = Oligonucleotid SEQ ID NO: 1 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 2
    Thermostabile DNA-Polymerase: Taq-DNA-Polymerase (5 Units/ml; hergestellt von Perkin Elmer Cetus).
  • Die Reaktionsbedingungen sind die folgenden:
    Hitzedenaturierung: 94°C für 1 Minute.
    Hybridisierung (Annealing): 55°C für 1 Minute.
    Polymerisation: 72°C für 1 Minute.
  • Der Zyklus aus Hitzedenaturierung, Primer-Hybridisierung und Polymerisation (5,7 Minuten) wird 35 mal wiederholt (Gesamtdauer etwa 3 Stunden). Dieses Verfahren wird unter Verwendung einer DNA-Thermal-Cycler-Vorrichtung (hergestellt von Perkin Elmer Cetus), in der die obigen Reaktionsbedingungen programmiert sind, durchgeführt.
  • Nachweis
  • Agarosegel-Elektrophorese
  • Zum Nachweis des amplifizierten Nucleotidfragments in der Reaktionsmischung wird Agarosegel-Elektrophorese wie im Folgenden beschrieben durchgeführt.
  • Das verwendete Agarosegel besitzt eine Gelkonzentration von 3% (w/v) und enthält Ethidiumbromid (0,5 μl/ml). Die Elektrophorese wird bei einer konstanten Spannung von 100 V für 30 Minuten durchgeführt. Es werden die bei Maniatis et al. [Molecular Cloning, 2nd Edition (1989)] beschriebenen Verfahren und Bedingungen verwendet. Zusätzlich zu der Reaktionsmischung werden Molekurlargewichtsmarker gleichzeitig elektrophoretisch behandelt. Die Länge des Nucleotidfragments wird durch Vergleich der relativen Mobilitäten berechnet.
  • Umgekehrter passiver Latex-Agglutinationstest (RPLA)
  • Es wird ein kommerziell erhältlicher RPLA-Kit zum Nachweis von Escherichia coli-Verocytotoxin (hergestellt von DENKA SEIKEN) erworben. Die Proben werden vorbereitet und gemäß der beigefügten Gebrauchsanweisung getestet.
  • Ergebnisse
  • Die Basensequenz des Shiga-Toxingens von Shigella dysenteriae wurde bereits bestimmt. Deshalb kann die Länge des durch PCR amplifizierten Nucelotids unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung als Primer leicht abgeschätzt werden. Insbesondere wird, wenn die Oligonucleotide SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 der vorliegenden Erfindung zu sammen verwendet werden, eine Nucleotidsequenz von 349 Basen (oder eine Nucleotid-Duplex von 349 Basenpaaren) amplifiziert. Wenn diese Schätzung mit der Länge des amplifizierten Nucleotidfragments übereinstimmt, wird daraus geschlossen, dass durch die PCR unter Verwendung der Primer-Kombination die Zielregion des Shiga-Toxingens korrekt amplifiziert wird, und dass der bakterielle Stamm in der Probe das Shiga-Toxingen aufweist. Die aus der Agarosegel-Elektrophorese mit den 34 Teststämmen erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Durch die PCR unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung wird lediglich die DNA von Stämmen amplifiziert, die positive Ergebnisse in der RPLA ergeben, wobei keine Amplifikation von DNA von Shiga-Toxin negativen Stämmen auftritt. Dies deutet darauf hin, dass durch die PCR unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung das Shiga-Toxingen korrekt amplfiziert werden kann, und dass Shigella dysenteriae, welcher das Shiga-Toxingen aufweist, mit hoher Genauigkeit unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden kann.
  • Tabelle 1
    Figure 00220001
  • [Experiment 2]
  • Um zu bestimmen, ob die in Experiment 1 erhaltenen Ergebnisse spezifisch für das Shiga-Toxingen sind, werden die DNA's klinisch bedeutender pathogener Bakterien, bei denen es sich nicht um Shigella dysenteriae handelt, mit den Primern der vorliegenden Erfindung untersucht. Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 verwendet, ausgenommen das Verfahren zur Herstellung der Proben.
  • Herstellung der Proben
  • Mit jedem der in Tabelle 2 aufgeführten Stämme wird ein geeignetes Anreicherungsmedium angeimpft, welches über Nacht bei 37°C unter aeroben oder anaeroben Bedingungen kultiviert wird (Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Bacteroides flagilis, Bacteroides vulgatus, Lactobacillus acidophilus und Bifidobacterium adolescentis werden unter anaeroben Bedingungen kultiviert, während Neisseria gonorrhoeae und Neisseria menigitidis in Gegenwart von 3 bis 10 CO2 kultiviert werden. Die bakteriellen Zellen werden durch Zentrifugation von 0,5 ml jeder Kulturbrühe gewonnen und einmal mit TE-Puffer gewaschen. Zu diesen bakteriellen Zellen werden eine N-Acetylmuraminidase-Lösung in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, und eine Achromopeptidase-Lösung in dem gleichen Puffer zu Endkonzentrationen von 50 μg/ml bzw. 1 mg/ml gegeben und anschließend bei 37°C 10 Minuten inkubiert, um die Zellen zu lysieren. Eine 1 : 1-Phenol-/Cloroform-Mischung, gesättigt mit TE-Puffer, wird dem Lysat zugegeben und anschließend kräftig gerührt. Nach Zentrifugation wird der Überstand gewonnen und mit Ethanol behandelt, um die Nukleinsäuren auszufällen. Der resultierende Niederschlag wird in 1 ml TE-Puffer gelöst; diese Lösung wird als Probe verwendet. Ebenso wird humane Plazenta-DNA mit einer Konzentration von 1 μg/ml auf die gleiche Weise wie oben PCR unterworfen.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse des Tests unter Verwendung der Kombination der Primer der vorliegenden Erfindung. Mit dieser Primer-Kombination werden keine anderen DNA's als die von Shiga-Toxin produzierendem Shigella dysenteriae und verocytotoxin-1-produziertendem Escherichia coli amplifiziert.
  • Daraus kann geschlossen werden, dass die Oligonucleotid-Primer der vorliegenden Erfindung selektiv mit DNA von Bakterien reagieren, die das Shiga-Toxingen aufweisen.
  • Durch die in den obigen Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendete Agarosegel-Elektrophorese können Nucleotidfragmente mit einem Längenunterschied von 5–10 Basen (Basenpaaren) bei Nucleotidfragmenten von nicht mehr als 100 Basen (Basenpaaren) und von 10 bis 20 Basen (Basenpaaren) bei Nucleotidfragmenten von 100 bis 500 Basen (Basenpaaren) unterschieden werden. Außerdem ermöglicht die Verwendung anderer Gelmaterialien, wie Acrylamid, die Verbesserung der Genauigkeit bei der Bestimmung der Länge der Nucleotidfragmente. Somit kann die Zuverlässigkeit des seletiven Nachweises des Zielgens in der vorliegenden Erfindung weiter erhöht werden.
  • Tabelle 2
    Figure 00250001
  • Beispiel 2: Nachweis von Shigella-Arten und EIEC, welche beide das ipaH-Gen aufweisen
  • [Experiment 1]
  • Herstellung der Proben
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet, mit dem Unterschied, dass die in den Tabellen 3-1 bis 3-7 aufgeführten Stämme von Shigella-Arten und EIEC verwendet werden.
  • Synthese der Primer
  • Als Primer zur Amplifikation des ipaH-Gens von Shigella-Arten und EIEC-Stämmen werden die oben beschriebenen Oligonucleotide SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 auf der Grundlage der bekannten Basensequenz des ipaH-Gens ausgewählt [Hartmann, A. B., et al., J. Bacteriol., 172, 1905–1915 (1990); Venkatesan, M. M., et al., Mol. Microbiol., 5, 2435–2446 (1991)]. Diese Oligonucleotide werden durch das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 von Beispiel 1 chemisch synthetisiert.
  • PCR
  • Die PCR wird unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit dem Unterschied, dass die folgende Oligonucleotid-Kombination verwendet wird:
    Primer (1) + Primer (2) = Oligonucleotid SEQ ID NO: 3 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 4
  • Nachweis
  • Agarosegel-Elektrophorese
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet.
  • Koloniehybridisierungstest
  • Es wird ein Koloniehybridisierungstest unter Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde, die spezifisch für das ipaH-Gen ist, gemäss dem von Grunstein beschriebenen Verfahren durchgeführt [Grunstein, M. und Hogness, D., Proc. Natl. Acad. Sci., 72, 3961 (1975)].
  • Ergebnisse
  • Die Basensequenz des ipaH-Gens von Shigella-Arten und EIEC wurde bereits bestimmt. Aus diesem Grund kann die Länge der Nucleotidfragmente, die durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung als Primer amplifiziert wurden, leicht geschätzt werden. Insbesondere sollte, wenn die Oligonucleotide SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 der vorliegenden Erfindung in Kombination verwendet werden, ein Nucleotidfragment von 242 Basen (oder eine Nucleotidduplex von 242 Basenpaaren) amplifiziert werden. Wenn diese Schätzung mit der Länge des amplifizierten Nucleotidfragments übereinstimmt, wird angenommen, dass durch die PCR unter Verwendung der Primerkombination die Zielregion in dem ipaH-gen korrekt amplifiziert wurde, und dass der bakterielle Stamm in der Probe das ipaH-Gen aufweist. Die aus der Agarosegel-Elektrophose mit 341 Teststämmen erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 3-1 bis 3-7 wiedergegeben. Durch die PCR unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung wird lediglich die DNA von Stämmen amplifiziert, welche ipaH-positive Ergebnisse beim Koloniehybridisierungstest ergeben, während bei den ipaH-negativen Stämmen keine Amplifikation der DNAs auftritt. Dies zeigt, dass durch die PCR unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung das ipaH-Gen korrekt amplifiziert werden kann, und dass Shigella-Arten und EIEC, welche beide das ipaH-Gen aufweisen, mit hoher Genauigkeit unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können.
  • Tabelle 3-1
    Figure 00280001
  • Tabelle 3-2
    Figure 00290001
  • Tabelle 3-3
    Figure 00300001
  • Tabelle 3-4
    Figure 00310001
  • Tabelle 3-5
    Figure 00320001
  • Tabelle 3-6
    Figure 00330001
  • Tabelle 3-7
    Figure 00340001
  • [Experiment 2]
  • Um zu bestimmen, ob die in Experiment 1 erhaltenen Ergebnisse spezifisch für das ipaH-Gen sind, werden die DNAs klinisch bedeutender pathogener Bakterien, bei denen es sich nicht um Shigella-Arten und EIEC handelt, mit den Primern der vorliegenden Erfindung untersucht. Es wird das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 angewendet, ausgenommen das Verfahren zur Herstellung der Proben.
  • Herstellung der Proben
  • Jeder der in Tabelle 4 aufgeführten Stämme wird auf die gleiche Weise wie in Experiment 2 von Beispiel 1 behandelt.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse des Tests, bei dem die Kombination der Primer der vorliegenden Erfindung verwendet wurde. Mit dieser Primer-Kombination werden keine anderen DNAs als die von Shigella-Arten und EIEC amplifiziert. Daraus kann geschlossen werden, dass die Oligonucleotid-Primer der vorliegenden Erfindung selektiv mit DNAs von Bakterien reagieren, welche das ipaH-Gen aufweisen.
  • Tabelle 4
    Figure 00360001
  • Beispiel 3: Nachweis von Shigella-Arten und EIEC, welche das invE-Gen aufweisen
  • [Experiment 1]
  • Herstellung der Proben
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet, mit dem Unterschied, dass die in den Tabelle 3-1 bis 3-7 aufgeführten 341 Stämme von Shigella-Arten und EIEC verwendet werden.
  • Synthese der Primer
  • Als Primer zur Amplifikation des invE-Gens von Shigella-Arten und EIEC werden die oben beschriebenen Oligonucleotide SEQ ID NO : 5 und SEQ ID NO : 6 auf der Grundlage der bekannten Basensequenzen des invE-Gens ausgewählt [Watanabe, H., et al., J. Bacteriol., 172, 619–629 (1990)]. Diese Oligonucleotide werden durch das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 von Beispiel 1 chemisch synthetisiert.
  • PCR
  • Die PCR wird unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit dem Unterschied, dass die folgende Oligonucleotid-Kombination verwendet wird:
    Primer (1) + Primer (2) = Oligonucleotid SEQ ID NO: 5 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 6
  • Nachweis
  • Agarosegel-Elektrophorese
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet.
  • Koloniehybridisierungstest
  • Es wird ein Koloniehybridisierungstest unter Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde, die spezifisch für das invE-Gen ist, gemäss dem von Grunstein beschriebenen Verfahren durchgeführt [Grunstein, M. und Hogness, D., Proc. Natl. Acad. Sci., 72, 3961 (1975)].
  • Ergebnisse
  • Die Basensequenz des invE-Gens von Shigella-Arten und EIEC wurde bereits bestimmt. Aus diesem Grund kann die Länge der Nucleotidfragmente, die unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung als Primer durch PCR amplifiziert werden, leicht geschätzt werden. Insbesondere sollte, wenn die Oligonucleotide SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 der vorliegenden Erfindung in Kombination verwendet werden, ein Nucleotidfragment von 293 Basen (oder eine Nucleotidduplex von 293 Basenpaaren) amplifiziert werden. Wenn diese Einschätzung mit der Länge der amplifizierten Nucleotidsequenz übereinstimmt, wird angenommen, dass mit dieser Primer-Kombination die Zielregion in dem invE-Gen korrekt amplifiziert wird, und dass der bakterielle Stamm in der Probe das invE-Gen aufweist. Die Ergebnisse, die aus der Agarosegel-Elektrophorese mit 341 Teststämmen erhalten wurden, sind in den Tabellen 5-1 bis 5-7 wiedergegeben. Unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung wird durch die PCR lediglich die DNA von Stämmen amplifiziert, die invE-positive Ergebnisse bei dem Koloniehybridisierungstest ergeben, während bei invE-negativen Stämmen keine Amplifikation von DNAs auftritt. Dies weist darauf hin, dass durch die PCR unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung das invE-Gen korrekt amplifiziert werden kann, und dass Shigella-Arten und EILE, welche beide das invE-Gen aufweisen, mit hoher Genauigkeit unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können.
  • Tabelle 5-1
    Figure 00390001
  • Tabelle 5-2
    Figure 00400001
  • Tabelle 5-3
    Figure 00410001
  • Tabelle 5-4
    Figure 00420001
  • Tabelle 5-5
    Figure 00430001
  • Tabelle 5-6
    Figure 00440001
  • Tabelle 5-7
    Figure 00450001
  • [Experiment 2]
  • Um zu bestimmen, ob die in Experiment 1 erhaltenen Ergebnisse spezifisch für das invE-Gen sind, werden die DNAs klinisch bedeutender pathogener Bakterien, bei denen es sich nicht um Shigella-Arten und EIEC handelt, mit den Primern der vorliegenden Erfindung untersucht. Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet, ausgenommen des Verfahrens zur Herstellung der Proben.
  • Herstellung der Proben
  • Jeder der in Tabelle 6 aufgeführten Stämme wird auf die gleiche Weise wie in Experiment 2 von Beispiel 1 behandelt.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 6 zeigt die Ergebnisse des Tests, bei dem die Kombination der Primer der vorliegenden Erfindung verwendet wurde. Mit dieser Primer-Kombination werden keine DNAs von pathogenen Bakterien, bei denen es sich nicht um Shigella-Arten und EIEC handelt, amplifiziert. Daraus kann geschlossen werden, dass die Oligonucleotid-Primer der vorliegenden Erfindung selektiv mit DNAs von Bakterien reagieren, die das invE-Gen aufweisen.
  • Tabelle 6
    Figure 00470001
  • Beispiel 4: Nachweis von Salmonella-Arten, welche das araC-Gen aufweisen
  • [Experiment 1]
  • Herstellung der Proben
  • Wie in den Tabellen 7-1 bis 7-6 aufgeführt, werden 133 verschiedene Salmonella-Arten, die aus Patienten- und Nahrungsmittelproben isoliert wurden, verwendet. Die Stämme sind die folgenden: 67 Stämme von Salmonella typhimurin, 1 von Salmonella havana, 2 von Salmonella Oranienburg, 3 von Salmonella london, 3 von Salmonella senftenberg, 4 von Salmonella blockley, 3 von Salmonella agona, 4 von Salmonella infantis, 14 von Salmonella lichtfield, 6 von Salmonella enteritidis, 13 von Salmonella thompson, 6 von Salmonella paratyphi B, 2 von Salmonella montevideo, 1 von Salmonella gallinarum, 1 von Salmonella choleraesuis, 1 von Salmonella derby, 1 von Salmonella give und 1 von Salmonella heidelberg. Mit jedem Stamm wird ein geeignetes Medium angeimpft und über Nacht bei 37°C unter aeroben Bedingungen kultiviert. Jede Kulturbrühe wird mit TE-Puffer verdünnt und bei 95°C 10 Minuten erhitzt und anschließend zentrifugiert. Die Überstände werden als Proben verwendet.
  • Synthese der Primer
  • Als Primer zur Amplifikation des araC-Gens von Salmonella typhimurium werden die oben beschriebenen Oligonucleotide SEQ ID NO: 7 bis SEQ ID NO: 11 jeweils auf der Grundlage der bekannten Basensequenz des araC-Gens ausgewählt [Horwitz, A. H., et al., Gene 14, 309–319 (1981); Clarke, P., et al., Gene 18, 157–163 (1982); Lee, J.-H., et al., Gene 46, 113–121 (1986)] und durch das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 von Beispiel 1 chemisch synthetisiert.
  • PCR
  • Die PCR wird unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit dem Unterschied, dass eine der folgenden Oligonucleotid-Kombinationen verwendet wird:
    Primer (1) + Primer (2) = Oligonucleotid SEQ ID NO: 7 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 8;
    Oligonucleotid SEQ ID NO: 9 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 10; und
    Oligonucleotid SEQ ID NO: 11 + Oligonucleotid SEQ ID NO: B.
  • Nachweis
  • Agarosegel-Elektrophorese
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet.
  • Ergebnisse
  • Die Basensequenz des araC-Gens von Salmonella typhimurium wurde bereits bestimmt. Diese Basensequenz ist vermutlich bei allen Salmonella-Arten gleich. Die Länge der Nucleotidfragmente, die durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung amplifiziert wurden, kann leicht bestimmt werden. Insbesondere wird, wenn die Oligonucleotide SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 der vorliegenden Erfindung in Kombination verwendet werden, ein Nucleotidfragment von 361 Basen (oder eine Nucleotidduplex von 361 Basenpaaren) amplifiziert. Bei der Kombination von SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 und von SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 8 werden Nucleotidfragmente von 493 Basen bzw. 334 Basen amplifiziert. Wenn diese Einschätzungen mit der Länge der amplifizierten Nucleotidfragmente übereinstimmen, wird daraus geschlossen, dass durch PCR unter Verwendung der Kombination der Primer die Zielregion in dem araC-Gen korrekt amplifiziert wird, und dass der bakterielle Stamm in der Probe das araC-Gen aufweist. Die Tabellen 7-1 bis 7-6 zeigen die Ergebnisse des Nachweises des araC-Gens in Salmonella-Arten. Wie aus den Tabellen 7-1 bis 7-6 ersichtlich, wird das araC-Gen von Salmonella-Arten mit hoher Genauigkeit unter Verwendung der Oligonucleotid-Primer der vorliegenden Erfindung nachgewiesen.
  • Tabelle 7-1
    Figure 00510001
  • Tabelle 7-2
    Figure 00520001
  • Tabelle 7-3
    Figure 00530001
  • Tabelle 7-4
    Figure 00540001
  • Tabelle 7-5
    Figure 00550001
  • Tabelle 7-6
    Figure 00560001
  • [Experiment 2]
  • Um zu bestimmen, ob die in Experiment 1 erhaltenen Ergebnisse spezifisch für das araC-Gen von Salmonella-Arten sind, werden die DNAs klinisch bedeutender Diarrhöe-Bakterien, bei denen es sich nicht um Salmonella-Arten handelt, und anderer pathogener Bakterien mit den Primern der vorliegenden Erfindung untersucht. Insbesondere wird die Differenzierung zwischen Salmonella-Arten und Citrobacter-Arten, welche mit konventionellen Verfahren schwierig durchzuführen ist, sorgfältig untersucht.
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 angewendet, ausgenommen das Verfahren zur Herstellung der Proben.
  • Herstellung der Proben
  • Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Bacteroides fragiles, Bacteroides vulgatus, Lactobacillus acidophilus und Bifidobacterium adolescentis werden bei 37°C unter anaeroben Bedingungen kultiviert, während Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis in Gegenwart von 3– 10% CO2 kultiviert werden.
  • Humane Plazenta-DNA wird auf die gleiche Weise wie oben mit einer Konzentration von 1 μg/ml PCR unterzogen.
  • Ergebnisse
  • Die Tabellen 8-1 bis 8-3 zeigen die Ergebnisse des Tests unter Verwendung der Kombinationen von Primern der vorliegenden Erfindung. Mit diesen Primer-Kombinationen werden keine DNAs von bakteriellen Stämmen, bei denen es sich nicht um Salmonella-Arten handelt, oder humane Plazenta-DNA amplifiziert. Es ist von besonderer Bedeutung, dass die Primer-Kombinationen der vorliegenden Erfindung keine DNA von Citrobacter-Arten, welche mit Salmonella-Arten verwandt sind und schwer von diesen unterschieden werden können, amplifizieren. Daraus kann geschlossen werden, dass die Oligonucleotid-Primer der vorliegenden Erfindung selektiv mit DNAs von Salmonella-Arten mit hoher Zuverlässigkeit reagieren.
  • Tabelle 8-1
    Figure 00580001
  • Tabelle 8-2
    Figure 00590001
  • Tabelle 8-3
    Figure 00600001
  • Beispiel 5: Nachweis von EHEC (VTEC), welche das VT1-Gen aufweisen
  • [Experiment 1]
  • Herstellung der Proben
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet, mit dem Unterschied, dass 320 Stämme von EHEC- (VTEC)-Stämmen verwendet werden.
  • Synthese der Primer
  • Als Primer für die Amplifikation des VT1-Gens von EHEC (VTEC) werden die oben beschriebenen Oligonucleotide SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 auf der Grundlage der bekannten Basensequenz des VT1-Gens ausgewählt [Takao T., et al., Microb. Pathog., 5, 357–369 (1988)]. Diese Oligonucleotide werden durch das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 von Beispiel 1 chemisch synthetisiert.
  • PCR
  • Die PCR wird unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit dem Unterschied, dass die folgende Oligonucleotid-Kombination verwendet wird:
    Primer (1) + Primer (2) = Oligonucleotid SEQ ID NO: 12 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 13
  • Nachweis
  • Agarosegel-Elektrophorese
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet.
  • Koloniehybridisierungstest
  • Es wird ein Koloniehybridisierungstest unter Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde, die spezifisch für das VT1-Gen und für das VT2-Gen ist, gemäss des von Grunstein beschriebenen Verfahrens durchgeführt [Grunstein, M. und Hogness, D., Proc. Natl. Acad. Sci., 72, 3961 (1975)].
  • Ergebnisse
  • Die Basensequenz des VT1-Gens von EHEC (VTEC) wurde bereits bestimmt. Aus diesem Grund kann die Länge der Nucleotidfragmente, die durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung als Primer amplifiziert werden, leicht geschätzt werden. Insbesondere sollte, wenn die Oligonucleotide SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13 der vorliegenden Erfindung in Kombination verwendet werden, ein Nucleotidfragment von 349 Basen (oder eine Nucleotidduplex von 349 Basenpaaren) amplifiziert werden. Wenn diese Schätzung mit der Länge des amplifi zierten Nucleotidfragments übereinstimmt, wird daraus geschlossen, dass durch die PCR unter Verwendung der Primer-Kombination korrekt die Zielregion in dem VT1-Gen amplifiziert wird, und dass der bakterielle Stamm in der Probe das VT1-Gen aufweist. Die aus der Agarosegel-Elektrophorese und dem Koloniehybridisierungstest für 320 Teststämme erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 9 wiedergegeben. Tabelle 9 zeigt, dass durch die PCR unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung lediglich DNAs von Stämmen amplifiziert werden, welche ein positives Ergebnis für das VT1-Gen in dem Koloniehybridisierungstest ergeben, und dass keine DNA von VT1-negativen Stämmen amplifiziert wird. Dies zeigt, dass es durch PCR unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung möglich ist, das VT1-Gen korrekt zu amplifizieren, und dass EHEC (VTEC), welche das VT1-Gen aufweisen, mit hoher Genauigkeit unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können.
  • Tabelle 9 Genauigkeit der Primer
    Figure 00620001
  • [Experiment 2]
  • Um zu bestimmen, ob die in Experiment 1 erhaltenen Ergebnisse spezifisch für EHEC (VTEC), welche das VT1-Gen aufweisen, sind, werden die DNAs klinisch bedeutender pathogener Bakterien, bei denen es sich nicht um EHEC (VTEC) handelt, mit den Primern der vorliegenden Erfindung untersucht. Es wird das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 angewendet, ausgenommen das Verfahren zur Herstellung der Proben.
  • Herstellung der Proben
  • Jeder der in Tabelle 10 aufgeführten Stämme wird auf die gleiche Weise wie in Experiment 2 von Beispiel 1 behandelt. Unter den in Tabelle 10 aufgeführten Stämmen werden die folgenden Stämme unter anaeroben Bedingungen kultiviert: Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Bacteroides fragilis, Bacteroides vulgatus und Lactobacillus acidophilus.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 10 zeigt die Ergebnisse aus dem Test, bei dem die Kombinationen der Primer der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Mit den Primer-Kombinationen werden keine anderen DNAs anderer Stämme als EHEC (VTEC), ausgenommen eines bestimmten Typs von Shigella-Spezies (Shigella dysenteriae Typ I), amplifiziert.
  • Es ist bekannt, dass die Differenzierung zwischen EHEC (VTEC) und Shigella dysenteriae unmöglich ist, da Shigella dysenteriae das VT1-Gen besitzt. Daraus kann geschlossen werden, dass die Oligonucleotid-Primer der vorliegenden Erfindung selektiv mit DNAs von Bakterien reagieren, die das VT1-Gen aufweisen.
  • Tabelle 10 Reaktivität mit Nicht-Zielgenen
    Figure 00640001
  • Beispiel 6: Nachweis von EHEC (VTEC), welche das VT2-Gen aufweisen
  • [Experiment 1]
  • Herstellung der Proben
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 von Beispiel 5 angewendet.
  • Synthese der Primer
  • Als Primer zur Amplifikation des VT2-Gens von EHEC- (VTEC)-Stämmen werden die oben beschriebenen Oligonucleotide SEQ ID NO: 14 und SEQ ID NO: 15 auf der Grundlage der bekannten Basensequenz des VT2-Gens ausgewählt [Jackson, M. P., et al., FEMS Microbio. Lett., 44, 109–114 (1987)]. Diese Oligonucleotide werden durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 chemisch synthetisiert.
  • PCR
  • Die PCR wird unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit dem Unterschied, dass die folgende Oligonucleotid-Kombination verwendet wird:
    Primer (1) + Primer (2) = Oligonucleotid SEQ ID NO: 14 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 15
  • Nachweis
  • Agarosegel-Elektrophorese
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet.
  • Koloniehybridisierungstest
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 von Beispiel 5 angewendet.
  • Ergebnisse
  • Die Basensequenz des VT2-Gens von EHEC (VTEC) wurde bereits bestimmt. Aus diesem Grund kann die Länge der Nucleotidfragmente, die durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung als Primer amplifiziert werden, leicht bestimmt werden. Insbesondere sollte, wenn die Oligonucleotide SEQ ID NO : 14 und SEQ ID NO : 15 der vorliegenden Erfindung in Kombination verwendet werden, ein Nucleotidfragment von 404 Basen (oder eine Nucleotidduplex von 404 Basenpaaren) amplifiziert werden. Wenn diese Einschätzung mit der Länge des amplifizierten Nucleotidfragments übereinstimmt, wird daraus geschlossen, dass durch die PCR unter Verwendung der Primer-Kombination die Zielregion des VT2-Gens korrekt amplifiziert wird, und dass der bakterielle Stamm in der Probe das VT2-Gen aufweist. Die Ergebnisse aus der Agarosegel-Elektrophorese mit 320 Teststämmen und aus dem Koloniehybridisierungstest sind in Tabelle 11 wiedergegeben. Durch die PCR unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung werden lediglich DNA's der Stämme amplifiziert, die ein positives Ergebnis für das VT2-Gen in dem Koloniehybridisierungstest ergeben; sie zeigen keine Amplifikation von DNA VT2-negativer Stämme. Dies weist darauf hin, dass durch die PCR unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung das VT2-Gen korrekt amplifiziert werden kann, und dass EHEC (VTEC), welche das VT2-Gen aufweisen, mit hoher Genauigkeit unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können.
  • Tabelle 11 Genauigkeit der Primer
    Figure 00660001
  • [Experiment 2]
  • Um zu bestimmen, ob die in Experiment 1 erhaltenen Ergebnisse spezifisch für EHEC (VTEC) sind, die das VT2-Gen aufweisen, werden die DNA's klinisch bedeutenden pathogener Bakterien, bei denen es sich nicht um EHEC (VTEC) handelt, mit den Primern der vorliegenden Erfindung untersucht. Es wird das gleiche Verfahren wie in Experiment 2 von Beispiel 5 angewendet.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 10 zeigt die Ergebnisse des Tests, bei dem Kombinationen der Primer der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Mit keiner der Primer-Kombinationen in Tabelle 10 werden DNAs anderer pathogener Bakterien als EHEC (VTEC) amplifiziert. Daraus kann geschlossen werden, dass die Oligonucleotid-Primer der vorliegenden Erfindung selektiv mit den DNAs der Bakterien reagieren, die das VT2-Gen aufweisen.
  • Beispiel 7: Nachweis von EHEC (VTEC), welche das VT1-Gen, das VT2-Gen oder eine Variante des VT2-Gens aufweisen
  • [Experiment 1]
  • Herstellung der Proben
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 von Beispiel 1 angewendet.
  • Synthese der Primer
  • Als Primer zur Amplifikation des VT1-Gens, des VT2-Gens oder einer Varinate des VT2-Gens (VT2vha, VT2vhb oder VT2vp1) werden die oben beschriebenen Oligonucleotide SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 18 ausgewählt. Diese Oligonucleotide werden durch das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 von Beispiel 1 chemisch synthetisiert.
  • PCR
  • Die PCR wird unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit dem Unterschied, dass eine der folgenden Oligonucleotid-Kombinationen verwendet wird:
    Primer (1) + Primer (2) = Oligonucleotid SEQ ID NO: 16 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 18 und
    Oligonucleotid SEQ ID NO: 17 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 18.
  • Nachweis
  • Agarosegel-Elektrophorese
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 von Beispiel 1 angewendet.
  • Koloniehybridisierungstest
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 von Beispiel 1 angewendet.
  • Ergebnisse
  • Die Basensequenz des VT1-Gens, des VT2-Gens, des VT2vha-Gens, des VT2vhb-Gens und des VT2vp1-Gens von EHEC (VTEC) wurde bereits bestimmt. Aus diesem Grund kann die Länge der Nucleotidfragmente, welche durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung als Primer amplifiziert werden, leicht bestimmt werden. Insbesondere sollte, wenn die Oligonucleotide SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 18 der vorliegenden Erfindung in Kombination verwendet werden, ein Nucleotidfragment von 495 Basen (oder eine Nucleotidduplex von 495 Basenpaaren) amplifiziert werden. Wenn diese Einschätzung mit der Länge des amplifizierten Nucleotidfragments übereinstimmt, wird daraus geschlossen, dass durch die PCR unter Verwendung der Primer-Kombination die Zielregion in dem VT1-Gen, dem VT2-Gen, dem VT2vha-Gen, dem VT2vhb-Gen oder dem VT2vp1-Gen korrekt amplifiziert wird, und das einige bakterielle Stämme in der Probe eines dieser Gene aufweisen. Die aus der Agarosegel-Elektrophorese und aus dem Koloniehybridisierungstest erhaltenen Ergebnisse mit 320 Teststämmen sind in Tabelle 12 wiedergegeben. Bei der PCR unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung wird lediglich DNA der Stämme amplifiziert, welche ein positives Ergebnis für das VT1-Gen oder VT2- Gen ergeben; die DNA von Stämmen, die für diese Gene negativ sind, wird nicht amplifziert. Dies weist darauf hin, dass durch die PCR unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung das VT1-Gen oder VT2-Gen (einschließlich seiner Gen-Varianten) korrekt amplifiziert werden kann, und dass EHEC (VTEC), welche das VT1-Gen oder das VT2-Gen oder beide Gene aufweisen, mit hoher Genauigkeit unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können.
  • Tabelle 12 Genauigkeit der Primer
    Figure 00690001
  • [Experiment 2]
  • Um zu bestimmen, ob die in Experiment 1 erhaltenen Ergebnisse spezifisch für EHEC (VTEC) sind, die das VT1-Gen oder das VT2-Gen aufweisen, werden die DNA's klinisch bedeutender pathogener Bakterien, bei denen es sich nicht um EHEC (VTEC) handelt, mit den Primern der vorliegenden Erfindung untersucht. Es wird das gleiche Verfahren wie in Experiment 2 von Beispiel 5 angewendet.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 10 zeigt die Ergebnisse aus dem Test, bei dem Kombinationen der Primer der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Durch die PCR werden bei Verwendung der Primer-Kombinationen keine DNAs anderer Stämme als EHEC (VTEC) amplifiziert, ausgenommen die DNA eines bestimmten Typs von Shigel-1a-Spezies (Shigella dysenteriae Typ I).
  • Es ist bekannt, dass eine Differenzierung zwischen EHEC (VTEC) und Shigella dysenteriae nur durch Nachweis des VT1-Gens unmöglich ist, da nicht nur EHEC (VTEC), sondern ebenso Shigella dysenteriae das VT1-Gen aufweist. Daraus kann geschlossen werden, dass die Oligonucleotid-Primer der vorliegenden Erfindung selektiv mit den DNA's von Bakterien reagieren, welche das VT1-Gen oder das VT2-Gen aufweisen.
  • Beispiel 8: Nachweis von Staphylococcus aureus, welcher das TSST-1-Gen aufweist
  • [Experiment 1]
  • Herstellung der Proben
  • Insgesamt werden 343 Stränge von Staphylococcus aureus verwendet. Diese Stämme stammen aus Fällen von Nahrungsmittelvergiftung und aus der Umwelt und werden aus Quellen, wie Diarrhöe-Stuhl, Erbrochenem und Nahrungsmitteln, isoliert. Mit jedem Stamm wird ein Gehirn-Herz-Infusionsmedium (hergestellt von BBL Co., Ltd.) angeimpft und über Nacht unter Schütteln bei 37°C unter anaeroben Bedingungen kultiviert. Jede Kulturbrühe wird 10-fach mit TE-Puffer verdünnt und bei 95°C 5 Minuten erhitzt und anschließend bei 5000 rpm 1 Minute zentrifugiert; die Überstände werden als Proben verwendet.
  • Synthese der Primer
  • Als Primer zur Amplifikation des TSST-1-Gens von Staphylococcus aureus werden die oben beschriebenen Oligonucleotide SEQ ID NO: 19 bis SEQ ID NO: 22 auf der Grundlage der bekannten Basensequenz des TSST-1-Gens von Staphylococcus aureus ausgewählt [Blomster-Hautamaa et al., J. Biol. chem., 26, 15783–15786 (1986)] und durch das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 von Beispiel 1 chemisch synthetisiert.
  • PCR
  • Zu 3 μl der oben beschriebenen Probenlösung werden 16,05 μl steriles destilliertes Wasser, 3 μl 10 × Reaktionspuffer, 4,8 μl dNTP-Lösung, 1,0 μl Primer (1), 1,0 μl Primer (2) und 0,15 μl einer thermostabilden DNA-Polymerase gegeben, wodurch 30 μl einer Reaktionsmischung hergestellt werden. Diese Reaktionsmischung wird mit 50 μl Mineralöl (hergestellt von SIGMA) überlagert. Die Lösungszusammensetzungen und verwendeten Primer (1) und (2) sind die folgenden:
    10 × Reaktionspuffer: 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl2, 0,1% (w/v) Gelatine.
  • dNTP-Lösung: Eine Mischung von dATP, dCTP, dGTP und dTTP, jeweils mit einer Endkonzentration von 1,25 mM.
  • Primer: Wässrige Lösung der oben beschriebenen chemisch synthetisierten gereinigten Oligonucleotide (Konzentration, 3,75 OD/ml). Es wird eine der folgenden Oligonucleotid-Kombinationen verwendet:
    Primer (1) + Primer (2) = Oligonucleotid SEQ ID NO: 20 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 21
    Oligonucleotid SEQ ID NO: 19 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 22 und
    Oligonucleotid SEQ ID NO: 20 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 22
  • Thermostabile DNA-Polymerase: Taq-DNA-Polymerase (5 Units/ml; hergestellt von Perkin Elmer Cetus).
  • Die Reaktionsbedingungen sind die folgenden:
    Hitzedenaturierung: 94°C für 1 Minute.
    Hybridisierung (Annealing): 55°C für 1 Minute.
    Polymerisation: 72°C für 1 Minute.
  • Der Zyklus aus Hitzedenaturierung, Primer-Annaeling und Polymerisation (5,7 Minuten) wird 35 mal wiederholt (Gesamtdauer etwa 3 Stunden). Dieses Verfahren wird unter Verwendung eines DNA-Thermal-Cyclers (hergestellt von Perkin Elmer Cetus), in den die obigen Reaktionsbedingungen programmiert sind, durchgeführt.
  • Nachweis
  • Agarosegel-Elektrophorese
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet.
  • Umgekehrter passiver Latex-Agglutinations(RPLA)-Test
  • Es wird ein kommerziell erhältlicher RPLA-Kit zum Nachweis von TSST-1 von Staphylococcus aureus (TST-RPLA "SEIKEN", hergestellt von DENKA SEIKEN) erworben. Es werden Proben hergestellt und gemäss der angefügten Gebrauchsanleitung getestet, wobei die Herstellung der Proben teilweise modifiziert wird, damit die Teststämme ausreichende Mengen ihres Enterotoxins herstellen können. Das heisst, anstelle der Gehirn-Herz-Infusion wird eine von BBL Co., Ltd. hergestellte verwendet.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 13 zeigt den Vergleich der Ergebnisse des PCR-Verfahrens der vorliegenden Erfindung mit den Ergebnissen der konventionell verwendeten TST-RPLA. Die Daten zeigen, dass durch das Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung das TSST-1-Gen von Staphylococcus aureus mit einer Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann, die vergleichbar oder höher ist, als bei dem konventionellen TST-RPLA-Verfahren. Die Daten in Tabelle 13 zeigen, dass 17 der 18 PCR-positiven Stämme ebenso bei RPLA positiv sind, und dass 325 Stämme sowohl bei PCR als auch bei RPLA negativ sind. Das heißt, dass mit Ausnahme eines Stammes, welcher positiv bei PCR und negativ bei RPLA ist, die gleichen Ergebnisse bei PCR und RPLA erhalten werden. Der Stamm, bei dem die Ergebnisse von PCR und RPLA nicht übereinstimmen, wird durch Southern-Blot-Hybridisierung getestet und als positiv für das TSST-1-Gen bestätigt.
  • Tabelle 13 Vergleich von PCR und TST-RPLA
    Figure 00730001
  • 1 zeigt die Ergebnisse des Empfindlichkeitstests der PCR-Primer der vorliegenden Erfindung durch Elektrophorese. In 1 bezeichnen die Zahlen 1 bis 9 die Anzahl der in der PCR-Reaktion verwendeten DNA-Kopien: 1 bedeutet 107 Kopien; 2 bedeutet 106 Kopien; 3 bedeutet 105 Kopien; 4 bedeutet 104 Kopien; 5 bedeutet 103 Kopien; 6 bedeutet 102 Kopien, 7 bedeutet 10 Kopien; 8 bedeutet 1 Kopie und 9 die Abwesenheit von DNA. Aus dieser Figur ist ersichtlich, dass durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung schon 10 DNA-Kopien nachgewiesen werden können.
  • [Experiment 2]
  • Um zu bestimmen, ob die in Experiment 1 erhaltenen Ergebnisse spezifisch für Staphylococcus aureus sind, welcher das TSST-1-Gen aufweist, werden die DNA's anderer klinisch bedeutender pathogener Bakterien mit den Primern der vorliegenden Erfindung untersucht. Es wird das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 angewendet, ausgenommen das Verfahren zur Herstellung der Proben.
  • Herstellung der Proben
  • Jeder der in Tabelle 14 aufgeführten Stämme wird auf die gleiche Weise wie in Experiment 2 von Beispiel 5 behandelt.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 14 zeigt die Ergebnisse des Tests, bei dem die Primer der vorliegenden Erfindung verwendet wurden. Durch die PCR wird bei Verwendung der Primer keine DNA anderer Stämme, einschließlich solcher, die für Nahrungsmittelvergiftung verantwortlich sind, amplifiziert. Daraus kann geschlossen werden, dass die Oligonucleotid-Primer der vorliegenden Erfindung selektiv mit der DNA von Staphylococcus aureus, welcher das TSST-1-Gen aufweist, reagieren. Die gleichen Ergebnisse werden mit anderen Primer-Kombinationen der vorliegenden Erfindung erhalten, welche nicht in Tabelle 14 wiedergegeben sind.
  • Tabelle 14
    Figure 00750001
  • Beispiel 9: Nachweis von Vibrio Cholerae, welcher das ctx-Gen aufweist
  • [Experiment 1]
  • Herstellung der Proben
  • Es wird das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 angewendet, mit dem Unterschied, dass 622 Stämme von Vibrio cholerae verwendet werden. Diese Stämme werden aus Patienten mit Cholera, Meeresprodukten (Shrimp, Schnappschildkröte), Wasserproben aus FLüssen, Häfen usw. isoliert. Setotyp, Biotyp und die Anzahl der Stämme sind in Tabelle 15 wiedergegeben.
  • Tabelle 15 Typ und Quellen von Vibrio cholerae
    Figure 00760001
  • Synthese der Primer
  • Als Primer zur Amplifikation des ctx-Gens von Vibrio Cholerae werden die oben beschriebenen Oligonucleotide SEQ ID NO: 23 bis SEQ ID NO: 26 auf der Grundlage der bekannten Basensequenzen des ctx-Gens von Vibrio cholerae ausgewählt [Lockman, H. und J. B. Kaper: J. Biol. Chem., 258, 13722–13726 (1983)] und durch das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 von Beispiel 1 chemisch synthetisiert.
  • PCR
  • Die PCR wird unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit dem Unterschied, dass einer der folgenden Oligonucleotid-Kombinationen verwendet wird:
    Primer (1) + Primer (2) = Oligonucleotid SEQ ID NO: 23 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 25, und
    Oligonucleotid SEQ ID NO: 24 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 26.
  • Nachweis
  • Agarosegel-Elektrophorese
  • Um die amplifizierten Nucleotidfragmente in der Reaktionslösung nachzuweisen, wird Agarosegel-Elektrophorese durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt.
  • Koloniehybridisierungstest
  • Es wird ein Koloniehybridisierungstest unter Verwendung einer Polynucleotid-Sonde, die spezifisch für das ctx-Gen ist, [Kaper, J. B., J. G. Morris, Jr., und N. Nashibuchi (1988), DNA Probes für Pathogenic Vibrio Species, 65–77. In F. C. Tenover (ed.), DNA Probes für Infectious Diseases. CRC Press, Inc., Boca Raton Fla.] gemäß dem von Grundstein beschriebenen Verfahren [Grunstein, M. und Hogness, D., Proc. Natl. Acad. Sci., 72, 3961 (1975)] durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Die Basensequenz des ctx-Gens von Vibrio cholerae wurde bereits bestimmt. Aus diesem Grund kann die Länge der Nucleotidfragmente, die durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung als Primer amplifiziert werden, leicht bestimmt werden. Insbesondere sollte, wenn die Oligonucleotide SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 25 der vorliegenden Erfindung in Kombination verwendet werden, ein Nucleotidfragment von 169 Basen (oder eine Nucleotidduplex von 169 Basenpaaren) amplifiziert werden. Durch die Kombination von SEQ ID NO: 24 und SEQ ID NO: 26 sollte ein Nucleotidfragment von 307 Basen (oder eine Nucleotidduplex von 307 Basenpaaren) amplifi ziert werden. Wenn die geschätzte Länge des Nucleotids mit der Länge des amplifizierten Nucleotidfragments übereinstimmt, wird daraus geschlossen, dass durch die PCR unter Verwendung der Primer-Kombination die Zielregion in dem ctx-Gen korrekt amplifiziert wird, und dass der bakterielle Stamm in der Probe das ctx-Gens aufweist. Die aus der Agarosegel-Elektrophorese und dem Koloniehybridisierungstest erhaltenen Ergebnisse mit 662 Teststämmen sind in Tabelle 16 wiedergegeben. Bei der PCR werden unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung lediglich DNAs von Stämmen amplifiziert, die ein positives Ergebnis für das ctx-Gen bei dem Koloniehybridisierungstest ergeben, wobei keine Amplifikation von DNA bei den ctx-Gen-negativen Stämmen auftritt. Dies zeigt, dass durch PCR unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung das ctx-Gen korrekt amplifiziert werden kann, und dass Vibrio cholerae, welcher das ctx-Gens aufweist, mit hoher Genauigkeit unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden kann. Tabelle 16 zeigt das mit den Oligonucleotiden SEQ ID NO: 24 und SEQ ID NO: 26 erhaltene Ergebnis. Die Kombination von SEQ ID NO: 23 und SEQ ID NO: 25 ergibt ein ähnliches Ergebnis.
  • Tabelle 16 Genauigkeit der Primerkombination von SEQ ID NO: 24 und SEQ ID NO: 26
    Figure 00780001
  • 2 zeigt, dass durch die PCR unter Verwendung der Kombinationen der Primer der vorliegenden Erfindung das ctx-Gen korrekt nachgewiesen werden kann, unabhängig von der Quelle, dem serologischen Typ und dem biologischen Typ der Stämme. Es werden Hitzeextrakte der folgenden Stämme als Template-DNA-Lösungen verwendet:
    Spuren 1 bis 3: Vibrio cholerae (El Tor – Ogawa-Typ, der ctx-Gen-positive Stamm)
    Spuren 4 bis 6: Vibrio cholerae (El Tor – Inaba-Typ, der ctx-Gen-positive Stamm)
    Spur 7: Vibrio cholerae (klassicher Ogawa-Typ, der ctx-Gen-positive Stamm)
    Spur 8: Vibrio cholerae (klassischer Inaba-Typ, der ctx-Gen-positive Stamm)
    Spuren 9 bis 10: Vibrio cholerae (nicht-O1, der ctx-Gen-positive Stamm)
    Spur 11: Vibrio cholerae (El Tor – Ogawa-Typ, der ctx-Gen-negative Stamm)
    Spur 12: Vibrio cholerae (Al Tor – Inaba-Typ, der ctx-Gen-negative Stamm)
    Spur 13: Enterotoxigenes Echerichia coli (thermolabiler Enterotoxingen-positiver Stamm)
  • [Experiment 2]
  • Um zu bestimmen, ob die in Experiment 1 erhaltenen Ergebnisse spezifisch für Vibrio cholerae sind, welcher das ctx-Gen aufweist, werden die Gene anderer klinisch bedeutender pathogener Bakterien mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung untersucht. Es wird das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 angewendet, ausgenommen das Verfahren zur Herstellung der Proben.
  • Herstellung der Proben
  • Jeder der in Tabelle 17 aufgeführten Stämme wird auf die gleiche Weise wie in Experiment 2 von Beispiel 5 behandelt.
  • Ergebnisse
  • Tabelle 17 zeigt die Ergebnisse des Tests, bei dem eine Kombination der Primer der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Durch die PCR werden unter Verwendung der Primer keine DNAs anderer pathogener getesteter Stämme amplifiziert. Daraus kann geschlossen werden, dass die Oligonucleotid-Primer der vorliegenden Erfindung selektiv mit den DNAs von Vibrio cholerae, welche das ctx-Gen aufweisen, reagieren. Ähnliche Ergebnisse werden ebenso für andere Primer-Kombinationen der vorliegenden Erfindung, welche nicht in Tabelle 17 wiedergegeben sind, erhalten.
  • Tabelle 17 Reaktivität mit DNA von Bakterien, bei denen es sich nicht um Vibrio cholerae handelt
    Figure 00810001
  • Beispiel 10: Nachweis von Clostridium perfringens, welcher das Enterotoxin-Gen aufweist
  • [Experiment 1]
  • Herstellung der Proben
  • Bei den verwendeten Stämmen von Clostridium perfringens handelt es sich um 11 Stämme, die aus Patienten isoliert und von Instituten zur Verfügung gestellt wurden, in denen die Stämme gelagert werden. Mit jedem Stamm wird GAM-Brühe (hergestellt von Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) angeimpft und über Nacht bei 37°C unter anaeroben Bedingungen und Schütteln kultiviert. Jede Kulturbrühe wird 10-fach mit 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, verdünnt und bei 95°C 10 Minuten erhitzt und anschließend zentrifugiert, wobei der Überstand als Probe verwendet wird.
  • Synthese der Primer
  • Als Primer zur Amplifikation des Enterotoxin-Gens von Clostridium perfringens werden die oben beschriebenen Oligonucleotide SEQ ID NO: 27 bis SEQ ID NO: 35 auf der Grundlage der bekannten Basensequenz des Enterotoxin-Gens von Clostridium perfringens ausgewählt [Maruke van Damme-Jongsten, Antonie van Leeuwenhoek, 56, 181–190 (1989)] und durch das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 von Beispiel 1 chemisch synthetisiert.
  • PCR
  • Die PCR wird unter den gleichen Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit dem Unterschied, dass eine der folgenden Oligonucleotid-Kombinationen verwendet wird:
    Primer (1) + Primer (2) = Oligonucleotid SEQ ID NO: 27 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 32;
    Oligonucleotid SEQ ID NO: 28 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 33;
    Oligonucleotid SEQ ID NO: 29 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 33;
    Oligonucleotid SEQ ID NO: 30 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 34; und
    Oligonucleotid SEQ ID NO: 31 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 35.
  • Nachweis
  • Agarosegel-Elektrophorese
  • Um die amplifizierten Nucleotidfragmente in der Reaktionslösung nachzuweisen, wird Agarosegel-Elektrophorese nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 durchgeführt.
  • 3 zeigt einen Teil der elektrophoretischen Ergebnisse. Der obere Bereich der Figur zeigt die Ergebnisse mit Oligonucleotid SEQ ID NO: 28 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 33; der untere Bereich zeigt die Ergebnisse mit Oligonucleotid SEQ ID NO: 29 + Oligonucleotid SEQ ID NO: 33. In der Figur bezeichnet M den Molekulargewichtsmarker; die Spuren 1 bis 13 bezeichnen jeweils ATCC 12925 (Spur 1), ATCC 12924 (Spur 2), ATCC 12922 (Spur 3), ATCC 12920 (Spur 4), ATCC 12916 (Spur 5), ATCC 12915 (Spur 6), ATCC 12918 (Spur 7), ATCC 12919 (Spur 8), ATCC 12921 (Spur 9), JCM 1296 (Spur 10), JCM 1416 (Spur 11), JCM 1382 (Spur 12) bzw. TE (negative Kontrolle, Spur 13).
  • Southern-Blot-Hybridisierungstest
  • Ein Southern-Blot-Hybridisierungstest wird unter Verwendung einer Oligonucleotid-Sonde, die spezifisch für das Enterotoxin-Gen von Clostridium perfringens ist, gemäß dem von Tada et al. beschriebenen Verfahren [Tada, J. et al. Mol. Cell. Probe., 6, 477 (1992)] durchgeführt.
  • Umgekehrter passiver Latex-Agglutinations(RPLA)-Test
  • Es wird ein kommerziell erhältlicher RPLA-Kit zum Nachweis von Clostridium perfringens Enterotoxin (Pet-RPLA "SEIKEN", hergestellt von DENKA SEIKEN) erworben. Die Proben werden vorbereitet und gemäß der angefügten Gebrauchsanweisung getestet.
  • Ergebnisse
  • Die Basensequenz des Enterotoxin-Gens von Clostridium perfringens wurde bereits bestimmt. Aus diesem Grund kann die Länge der Nucleotidfragmente, die durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung als Primer amplifiziert werden, leicht bestimmt werden. Insbesondere sollte, wenn die Oligonucleotide SEQ ID NO: 27 und SEQ ID NO: 32 der vorliegenden Erfindung in Kombination verwendet werden, ein Nucleotidfragment von 473 Basen (oder eine Nucleotidduplex von 473 Basenpaaren) amplifiziert werden. Wenn die geschätzte Länge mit der Länge des amplifizierten Nucleotidfragments übereinstimmt, wird daraus geschlossen, dass durch die PCR unter Verwendung der Primer-Kombination die Zielregion in dem Enterotoxin-Gen korrekt amplifiziert wird, und dass der bakterielle Stamm in der Probe das Enterotoxin-Gen aufweist. Die aus der Agarosegel-Elektrophorese und dem RPLA-Test mit den 11 Teststämmen erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 18 wiedergegeben.
  • Figure 00850001
  • In dem Southern-Blot-Hybridisierungstest wird bestätigt, dass es sich bei den Nucleotidfragmenten, die mit einer Kombination von Primern der vorliegenden Erfindung amplifiziert werden, um Teile der Enterotoxin-Gensequenzen handelt. Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt. 4 entspricht 3. In 4 bezeichnet M den Molekulargewichtsmarker; die Spuren 1 bis 13 bezeichnen jeweils ATCC 12925 (Spur 1), ATCC 12924 (Spur 2), ATCC 12922 (Spur 3), ATCC 12920 (Spur 4), ATCC 12916 (Spur 5), ATCC 12915 (Spur 6), ATCC 12918 (Spur 7), ATCC 12919 (Spur 8), ATCC 12921 (Spur 9), JCM 1296 (Spur 10), JCM 1416 (Spur 11), JCM 1382 (Spur 12) bzw. TE (negative Kontrolle, Spur 13).
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass durch PCR unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung eine genaue Amplifikation des Enterotoxin-Gens in der PCR möglich ist, und dass Clostridium perfringens, welcher das Enterotoxin-Gen besitzt, mit hoher Genauigkeit unter Verwendung der Oligonucleotide der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden kann.
  • [Experiment 2]
  • Um zu bestimmen, ob die in Experiment 1 erhaltenen Ergebnisse spezifisch für Clostridium perfringens sind, welcher das Enterotoxin-Gen besitzt, wird die Reaktivität der Primer der vorliegenden Erfindung mit DNA anderer Clostridium-Arten und anderer klinisch bedeutender pathogener Bakterien untersucht. Es wird das gleiche Verfahren wie in Experiment 1 angewendet, ausgenommen das Verfahren zur Herstellung der Proben.
  • Herstellung der Proben
  • Jeder der in den Tabellen 19 und 20 aufgeführten Stämme wird auf die gleiche Weise wie in Experiment 2 von Beispiel 5 behandelt.
  • Ergebnisse
  • Die Tabellen 19 und 20 zeigen die Ergebnisse des Tests, bei dem einige der Primer-Kombinationen der vorliegenden Erfindung verwendet wurden: Bei keiner der in den Tabellen aufgeführten Primer-Kombinationen trat eine Amplifikation von DNA anderer Stämme, einschließlich pathogener Stämme, in der PCR auf. Daraus kann geschlossen werden, dass die Oligonucleotid-Primer der vorliegenden Erfindung selektiv mit dem Enterotoxin-Gen von Clostridium perfringens reagieren.
  • Figure 00880001
  • Tabelle 20
    Figure 00890001
  • Durch die in den obigen Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendete Agarosegel-Elektrophorese können Nucleotidfragmente voneinander unterschieden werden, die einen Längenunterschied von 5–10 Basen (Basenpaaren) bei Nucleotidfragmenten von nicht mehr als 100 Basen (Basenpaaren) und von 10– 20 Basen (Basenpaaren) bei Nucleotidfragmenten von 100–500 Basen (Basenpaaren) aufweisen. Die Verwendung eines anderen Gelmaterials, wie Acrylamid, ermöglicht die Verbesserung der Genauigkeit bei der Bestimmung der Nucleotidfragmentlänge. Dadurch kann die Zuverlässigkeit des selektiven Nachweises des Zielgens in der vorliegenden Erfindung weiter erhöht werden.
  • Obwohl die Erfindung detailliert und mit Bezug auf spezifische Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es für einen Fachmann offensichtlich, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen.
  • Sequenzliste
    Figure 00910001
  • Figure 00920001
  • Figure 00930001
  • Figure 00940001
  • Figure 00950001
  • Figure 00960001
  • Figure 00970001
  • Figure 00980001
  • Figure 00990001
  • Figure 01000001
  • Figure 01010001
  • Figure 01020001
  • Figure 01030001
  • Figure 01040001
  • Figure 01050001
  • Figure 01060001

Claims (5)

  1. Synthetisches Oligonucleotid von 10 bis 30 Basen, welches komplementär ist zu einer Nucleotidsequenz eines der Gene Verocytotoxin-1-Gen von enterohämorrhagischem Escherichia coli oder verocytotoxin-produzierendem Escherichia coli, Verocytotoxin-2-Gen von enterohämorrhagischem Escherichia coli oder verocytotoxin-produzierendem Escherichia coli, wobei es sich bei der synthetischen Oligonucleotidsequenz um (i) das synthetische Oligonucleotid, enthaltend wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 12 oder des Oligonucleotids SEQ ID NO: 13, (ii) das synthetische Oligonucleotid, enthaltend wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 14 oder des Oligonucleotids SEQ ID NO: 15, oder (iii) das synthetische Oligonucleotid, enthaltend wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 16, des Oligonucleotids SEQ ID NO: 17 und/oder des Oligonucleotids SEQ ID NO: 18, handelt.
  2. Synthetisches Oligonucleotid, enthaltend eine Nucleotidsequenz, die komplimentär zu dem synthetischen Oligonucleotid gemäß Anspruch 1 ist.
  3. Verfahren zum Nachweis eines der bakteriellen Stämme enterohämorrhagischer Escherichia coli und/oder verocytotoxinproduzierender Escherichia coli mit den Stufen (1) Hybridisieren eines Primers an eine einzelsträngige Ziel-DNA als Template-DNA, welche in einer Probe vorliegt, und Durchführen einer Primer-Verlängerungsreaktion zum Erhalt eines Primer-Verlängerungsprodukts, (2) Denaturieren des entstandenen DNA-Doppelstrangs zur Trennung des Primer-Verlängerungsprodukts von der Template-DNA, wobei das Primer-Verlängerungsprodukt als weitere Template-DNA für den anderen Primer fungiert, (3) Wiederholen eines Zyklus gleichzeitiger Primer-Verlängerungsreaktion mit den zwei Primern, Trennen der Primer-Verlängerungsprodukte von den Templates und Hybridisieren der Primer zur Amplifizierung eines Bereichs der Ziel-DNA, wobei in den Stufen (1) bis (3) die Primer aus den Nucleotiden gemäß Anspruch 1 und 2 ausgewählt werden, und (4) Detektieren der amplifizierten Nucleotidsequenz, um zu bestimmen, ob ein vermuteter bakterieller Stamm in der Probe vorliegt.
  4. Kit zum Nachweis eines bakteriellen Stammes, enthaltend wenigstens ein Primerpaar der Oligonucleotide von Anspruch 1 und/oder 2, eine thermostabile DNA-Polymerase und dNTP-Lösungen.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die zwei Primer aus den folgenden Oligonucleotidkombinationen ausgewählt werden: eine Kombination, in der ein Nucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 12 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 13 enthält, eine Kombination, in der ein Nucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 14 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 15 enthält, eine Kombination, in der ein Nucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 16 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 18 enthält und eine Kombination, in der ein Oligonucleotid wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 17 und das andere wenigstens 10 aufeinander folgende Basen des Oligonucleotids SEQ ID NO: 18 enthält.
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