ES2349059T3 - Electrodo para biosensor. - Google Patents

Abstract

Una tira de electrodos desechable de un solo uso para la unión al circuito de lectura de señales de un sistema sensor para detectar una corriente representativa de un analito en una muestra acuosa, comprendiendo la tira: a) un soporte alargado (1) que tiene una superficie plana, lisa, adaptada para la unión liberable a dicho circuito de lectura; b) un primer conductor (4) que se extiende a lo largo de dicha superficie y que comprende un elemento conductor para la conexión con dicho circuito de lectura; c) un electrodo activo (5) sobre dicha superficie en contacto con dicho primer conductor, comprendiendo dicho electrodo activo un compuesto mediador que tiene una de las dos siguientes fórmulas: en las que X e Y pueden ser independientemente oxígeno, azufre, CR 3 R 4 , NR 3 o NR 3 R 4+ o el grupo funcional CZ 1 Z 2 , en el que Z 1 y Z 2 son grupos atractores de electrones; R1 y R2 pueden ser independientemente un grupo aromático o heteroaromático sustituido o no sustituido; y R 3 y R 4 pueden ser independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo alquilo, arilo, heteroarilo, amino, alcoxilo o ariloxilo sustituido o no sustituido; d) un segundo conductor (3) que se extiende a lo largo de dicha superficie, que comprende un elemento conductor para la conexión con dicho circuito de lectura; e) un electrodo de referencia/auxiliar (6) en contacto con dicho segundo conductor; f) un tercer conductor (2) que se extiende a lo largo de dicha superficie, que comprende un elemento conductor para la conexión con dicho circuito de lectura y un electrodo indicador de relleno (7) en contacto con dicho tercer conductor; g) estando dichos conductores espaciados de modo que no están en contacto eléctrico, y estando configurados de modo que no se ponen en contacto eléctrico cuando dicha muestra acuosa se pone sobre dicha tira; h) estando configurados dicho electrodo activo y dicho electrodo de referencia/auxiliar de modo que pueden cubrirse simultáneamente por una pequeña gota de dicha muestra acuosa para proporcionar un camino de conducción eléctrica entre dichos electrodos.

Description

Antecedentes de la invención

La invención está en el campo general de los electrodos para biosensores amperométricos. Más específicamente, la invención está en el campo de compuestos para usar como mediadores para el reciclaje de cofactores usados en estos electrodos.

Las enzimas dependientes de NAD y NADP tienen un gran interés en cuanto que muchas tienen sustratos de valor clínico, tales como la glucosa, D-3hidroxibutirato, lactato, etanol y colesterol. Se pueden diseñar electrodos amperométricos para detectar estos sustratos y otros analitos incorporando esta clase de enzimas y estableciendo comunicación eléctrica con el electrodo a través de la oxidación mediada de los cofactores reducidos NADH y NADPH.

Las enzimas dependientes de NAD y NADP en general son oxidorreductasas intracelulares (EC 1.x.x.x). Las oxidorreductasas se clasifican además de acuerdo con la identidad del grupo donador de un sustrato sobre el que actúan. Por ejemplo, las oxidorreductasas que actúan en un grupo CH-OH en un sustrato se clasifican como EC 1.1.x.x, mientras que aquellas que actúan en un grupo aldehído o ceto de un sustrato se clasifican como EC 1.2.x.x. Algunos analitos importantes (p. ej., glucosa, D-3-hidroxibutirato, lactato, etanol y colesterol) son sustratos de las enzimas EC

1.1.x.x.

La categoría de las oxidorreductasas también se divide de acuerdo con el tipo de aceptor usado por la enzima. Las enzimas de relevancia de la presente invención tienen al NAD+ y NADP+ como aceptores y se clasifican como EC.1.x.1.x. Estas enzimas en general tienen grupos sulfidrilo en sus sitios activos y por lo tanto pueden ser inhibidas de forma irreversible por reaccionantes reactivos con tiol, tales como el yodoacetato. Un inhibidor irreversible forma un compuesto estable, a menudo por la formación de un enlace covalente con un resto de aminoácido particular (p. ej., cisteína o Cys) que es esencial para la actividad enzimática. Por ejemplo, la gliceraldehído-3-P deshidrogenasa (EC 1.2.1.9) es alquilada estequiométricamente por el yodoacetato en la Cys1.19 con pérdida simultánea de la actividad catalítica. Además, se sabe que las enzimas glucosa deshidrogenasa, D-3-hidroxibutirato deshidrogenasa (HBDH) y lactato deshidrogenasa son inhibidas de forma irreversible por los reaccionantes de tipo tiol.

Las tiras de electrodos para usar en un sensor electroquímico se describen en el documento US 5628890. Dichas tiras de electrodos se caracterizan por un soporte de electrodos, un electrodo de referencia o auxiliar dispuesto en el soporte, un

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electrodo de trabajo separado del electrodo de referencia o auxiliar en el soporte, una capa de recubrimiento, y una pluralidad de capas de malla interpuestas en el espacio encerrado entre la capa de recubrimiento y el soporte. El electrodo de trabajo incluye una enzima capaz de catalizar una reacción que implica un sustrato para la enzima o un sustrato para dicha enzima y un mediador capaz de transferir electrodos.

Por lo tanto, en la búsqueda del desarrollo de biosensores estables que contengan deshidrogenasas dependientes de NAD o NADP, es muy importante evitar compuestos que sean reactivos frente a tioles, ya que pueden actúar como inhibidores de enzimas.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de compuestos mediadores de NAD+ y NADP+ que no se unen de forma irreversible a grupos tiol de los sitios activos de las enzimas deshidrogenasa intracelulares. Dichos compuestos mediadores impiden un modo común de inhibición enzimática. Por lo tanto, los mediadores pueden aumentar la estabilidad y fiabilidad de la respuesta eléctrica en electrodos amperométricos construidos a partir de enzimas dependientes de NAD o NADP.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una tira de electrodos desechable de un solo uso como se especifica en la reivindicación 1.

Cualquier grupo alquilo, salvo que se especifique lo contrario, puede ser lineal

o ramificado y puede contener hasta 12, preferiblemente hasta 6 y en especial hasta 4 átomos de carbono. Los grupo alquilo preferidos son metilo, etilo, propilo y butilo. Cuando un resto alquilo forma parte de otro grupo, por ejemplo el resto alquilo de un grupo alcoxilo, se prefiere que contenga hasta 6, en especial hasta 4 átomos de carbono. Los restos alquilo preferidos son metilo y etilo.

Un grupo arilo aromático puede ser cualquier hidrocarburo aromático y puede contener de 6 a 24, preferiblemente de 6 a 18, más preferiblemente de 6 a 16 y en especial de 6 a 14 átomos de carbono. Los grupos arilo preferidos incluyen fenilo, naftilo, antrilo, fenantrilo y pirilo, en especial un grupo fenilo o naftilo, y en particular un grupo fenilo. Cuando un resto arilo forma parte de otro grupo, por ejemplo, el resto arilo de un grupo ariloxilo, se prefiere que sea un resto fenilo, naftilo, antrilo, fenantrilo

o pirilo, en especial fenilo o naftilo, y en particular un resto fenilo.

Un grupo heteroaromático o heteroarilo puede ser cualquier sistema anular monocíclico o policíclico aromático, que contiene al menos un heteroátomo. Preferiblemente, un grupo heteroarilo es un sistema anular aromático de 5 a 18

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miembros, en particular de 5 a 14 miembros, y en especial de 5 a 10 miembros, que contiene al menos un heteroátomo seleccionado de átomos de oxígeno, azufre y nitrógeno. Se prefieren en particular los grupos heteroarilo de 5 y 6 miembros, en especial los grupos de 6 miembros. Se prefieren en especial los grupos heteroarilo que contienen al menos un átomo de nitrógeno. Los grupos heteroarilo preferidos incluyen grupos piridilo, pirilio, tiopirilio, pirrolilo, furilo, tienilo, indolinilo, isoindolinilo, indolizinilo, imidazolilo, piridonilo, pironilo, pirimidinilo, pirazinilo, oxazolilo, tiazolilo, purinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinoxalinilo, piridazinilo, benzofuranilo, benzoxazolilo y acridinilo.

Cuando cualquiera de los sustituyentes anteriores se especifica como sustituido, los grupos sustituyentes que pueden estar presentes pueden ser uno cualquiera o más de los usados habitualmente en el desarrollo de compuestos para usar en reacciones electroquímicas y/o en la modificación de dichos compuestos para influir en su estructura/actividad, solubilidad, estabilidad, capacidad mediadora, potencial normal (Eº) u otra propiedad. Los ejemplos específicos de dichos sustituyentes incluyen, por ejemplo, átomos de halógeno, grupos oxo, nitro, ciano, hidroxilo, cicloalquilo, alquilo, halogenoalquilo, alcoxi, halogenoalcoxi, amino, alquilamino, dialquilamino, formilo, alcoxicarbonilo, carboxilo, alcanoilo, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, arilsulfinilo, arilsulfonilo, carbamoilo, alquilamido, arilo o ariloxi. Cuando cualquiera de los sustituyentes anteriores representa o contiene un grupo sustituyente alquilo, este puede ser lineal o ramificado y puede contener hasta 12, preferiblemente hasta 6 y en especial hasta 4 átomos de carbono. Un grupo cicloalquilo puede contener de 3 a 8, preferiblemente de 3 a 6 átomos de carbono. Un grupo o resto arilo puede contener de 6 a 10 átomos de carbono, prefiriéndose en especial grupos fenilo. Un átomo de halógeno puede ser un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo y cualquier grupo que contenga un resto halógeno, tal como un grupo halogenoalquilo, puede así contener uno cualquiera o más de estos átomos de halógeno.

Un grupo atractor de electrones puede ser cualquier grupo que forme un grupo metileno estable CZ1Z2. Dichos grupos atractores de electrones pueden incluir átomos de halógeno, grupos nitro, ciano, formilo, alcanoilo, carboxilo y ácido sulfónico.

Preferiblemente, X e Y son ambos átomos de oxígeno.

También se prefiere que R1 y R2 se seleccionen independientemente de grupos fenilo, naftilo, piridilo y pirrolilo, prefiriéndose en especial grupos piridilo. La expresión “grupo piridilo” también incluye el N-óxido del mismo así como grupos piridinio y

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piridinio N-sustituidos.

Preferiblemente, R1 y R2 no están sustituidos o están sustituidos solo con uno o más, preferiblemente 1 ó 2 grupos alquilo, en especial grupos metilo. Se prefiere en especial que R1 y R2 no estén sustituidos.

R3 y R4, si están presentes, se seleccionan preferiblemente de átomos de hidrógeno y grupos alquilo.

Los complejos y quelatos de metales incluyen complejos y quelatos con metales de transición, en especial elementos de transición de la primera, segunda y tercera fila tales como rutenio, cromo, cobalto, hierro, níquel y renio, prefiriéndose en particular el rutenio. También se pueden incluir otros grupos, tales como los grupos 4vinil-4’-metil-2,2’-bipiridilo (v-bpy) y bipiridilo (bpy) en dichos complejos y quelatos como partes de un ion metálico complejo. Normalmente, dichos complejos y quelatos se formarán como resultado de que los heteroátomos en R1 y R2 se coordinan con un ion metálico o complejo de ion metálico.

Los reactivos de ensayo se pueden depositar sobre el electrodo en una o más capas basadas en tinta. Los reactivos de ensayo se pueden serigrafiar sobre el electrodo de trabajo en una sola capa.

El elemento puede ser un sensor amperométrico de tira seca que incluye un soporte aislante eléctrico, alargado, que tiene un par de pistas conductoras eléctricas, longitudinales y sustancialmente paralelas sobre el mismo, y un par de electrodos. Los electrodos pueden estar cada uno eléctricamente conectados a una pista distinta; uno de los electrodos puede ser un electrodo de referencia/auxiliar, mientras que el otro electrodo puede ser un electrodo de trabajo. El elemento también puede incluir un electrodo nulo. Además, el elemento puede incluir una membrana colocada para filtrar las muestras antes de su introducción sobre los electrodos.

El sensor puede incluir adicionalmente una tira de soporte de material de soporte aislante eléctrico (p. ej., un polímero sintético tal como poli(cloruro de vinilo), o una mezcla de polímeros sintéticos).

El compuesto mediador puede ser una quinona. Los ejemplos de quinonas adecuadas incluyen 1,10-fenantrolinquinona, 1,7-fenantrolinquinona y 4,7fenantrolinquinona.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para medir la concentración en una muestra acuosa de un analito como se especifica en la reivindicación 10.

Por ejemplo, el compuesto mediador puede ser la 1,10-fenantrolinquinona, 1,7

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fenantrolinquinona y 4,7-fenantrolinquinona.

Salvo que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en esta memoria tienen el mismo significado que entiende normalmente el experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos. En caso de conflicto, controlará la presente solicitud, incluyendo las definiciones.

Una ventaja de los nuevos mediadores es su no reactividad con respecto a los grupos tiol del sitio activo en las enzimas. Esto mejora la estabilidad y la vida en anaquel de los electrodos biosensores hasta un grado inesperado. También como resultado de esta estabilidad, la enzima y el mediador se pueden incorporar juntos en una tinta para imprimir o disolución de dosificación para facilitar la construcción de los biosensorse. El uso de un mediador que no es un inhibidor irreversible de la enzima dará como resultado la retención de una gran proporción de la actividad de la enzima durante la fabricación del biosensor. Las enzimas deshidrogenasa dependientes de NAD y NADP en general son caras e inestables, y por lo tanto la mejora de su estabilidad es muy conveniente.

Ventajosamente, los compuestos descritos en esta memoria también se pueden usar como mediadores de los cofactores NADH y NADPH acoplados con una amplia variedad de enzimas dependientes de NAD o NADP; como marcadores para antígenos o anticuerpos en procedimientos inmunoquímicos; y en otras aplicaciones en el campo de la electroquímica y bioelectroquímica. Los mediadores requieren potenciales de oxidación bajos para la reoxidación después de la reacción con el NADH o NADPH. Esto es particularmente ventajoso cuando se ensaya en sangre entera, en la que el potencial para la interferencia de especies electroactivas exógenas

(p. ej., ácido ascórbico, ácido úrico) es particularmente alto. El potencial bajo pude ser ventajoso porque puede obviar la necesidad de un electrodo nulo para eliminar las especies electroactivas en la muestra. Además, la forma nativa oxidada del mediador puede reducir la corriente de fondo que estaría presente con un mediador reducido.

Otras características y ventajas de la invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una vista detallada de una tira de electrodos de acuerdo con una realización de la invención.

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La figura 2 es una representación de una tira de electrodos montada.

La figura 3 es una representación gráfica de la corriente en µA frente a la concentración de NADH en mM para electrodos impresos que contienen 1,10fenantrolinquinona.

La figura 4 es una representación gráfica de la corriente en µA frente a la concentración de NADH en mM para electrodos impresos que contienen azul de Meldola.

La figura 5 es una gráfica de barras que presenta la actividad enzimática residual (es decir, como un porcentaje de la actividad inicial) después de incubación de HBDH con diferentes mediadores.

La figura 6 es una representación gráfica de la corriente en µA frente a la concentración de D-3-hidroxibutirato en mM para electrodos impresos que contienen 1,10-fenantrolinquinona, D-3-hidroxibutirato deshidrogenasa y NAD+ ensayados después de 4, 14 y 26 semanas.

La figura 7 es una representación gráfica de la corriente en µA frente a la concentración de D-3-hidroxibutirato en mM para electrodos impresos que contienen azul de Meldola, D-3-hidroxibutirato deshidrogenasa y NAD+ ensayados después de 2 y 14 semanas, respectivamente.

La figura 8 es una representación gráfica de la respuesta calibrada a la glucosa en sangre entera para electrodos impresos que contienen 1,10-fenantrolinquinona, glucosa deshidrogenasa y NAD+.

Descripción detallada de la invención

Se describe una clase de compuestos seleccionados por su capacidad para combinar de forma irreversible con tioles, para usar como mediadores de NADH o NADPH. Las características estructurales, electrónicas y estéricas de estos mediadores los hace prácticamente incapaces de reaccionar con tioles. Debido a que estos mediadores tienen prácticamente impedida la unión irreversible a los grupos sulfidrilo del sitio activo de las deshidrogenasas dependientes de NAD y NADP, se evita la inactivación de la enzima y la consiguiente pérdida de estabilidad del biosensor.

Los mediadores de NADH y NADPH se pueden usar en la fabricación de sensores enzimáticos amperométricos para un analito, en el que el analito es un sustrato de una enzima dependiente de NAD o NADP presente en el sensor, tales como los del tipo descritos en el documento EP 125867-A. Por consiguiente, se pueden hacer sensores enzimáticos amperométricos para usar en el análisis de la

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presencia de un analito en una muestra, en especial una muestra acuosa. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra biológica compleja tal como un fluido biológico (p. ej., sangre entera, plasma o suero) y el analito puede ser un metabolito que se encuentra de forma natural (p. ej., glucosa, D-3-hidroxibutirato, etanol, lactato o

5 colesterol) o una sustancia introducida como un fármaco.

De utilidad particular para la fabricación de sensores enzimáticos amperométricos, la presente invención describe además una tinta que incluye los mediadores de NADH y NADPH descritos en esta memoria.

Además, se puede usar en el sensor cualquier precursor, aducto o forma

10 reducida (leuco) de los mediadores anteriores que se puede convertir in situ por oxidación o descomposición en los correspondientes mediadores activos. Dichos precursores o aductos pueden incluir hemiacetales, hemitioacetales, acetales cíclicos, complejos de o-quinona y metal, formas protonadas, aductos de acetona, etc. En la tabla 1 se proporciona una lista no limitante de enzimas que se pueden

15 usar junto con los nuevos mediadores. TABLA 1

1.1.1.1

Alcohol deshidrogenasa

1.1.1.27

Lactato deshidrogenasa

1.1.1.31

3-Hidroxibutirato deshidrogenasa

1.1.1.49

Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

1.1.1.47

Glucosa deshidrogenasa

1.2.1.46

Formaldehído deshidrogenasa

1.1.1.37

Malato deshidrogenasa

1.1.1.209

3-Hidroxiesteroide deshidrogenasa

Los sensores enzimáticos amperométricos que adoptan los mediadores de la presente invención, en general usan un elemento de ensayo, por ejemplo, una tira de 20 un solo uso. Un elemento de ensayo desechable puede llevar un electrodo de trabajo, por ejemplo, con los reactivos de ensayo que incluyen la enzima, el cofactor nicotinamida (es decir, NAD+ o NADP+), los mediadores como se describen en la presente invención para generar una corriente indicativa del nivel de analito, y un electrodo de referencia/auxiliar. Los reactivos de ensayo pueden estar en una o más 25 capas basadas en tinta asociadas con el electrodo de trabajo en el elemento de ensayo. Por consiguiente, los electrodos sensores pueden incluir, por ejemplo, un área de electrodo formada por impresión, pulverización u otra técnica de deposición

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adecuada.

En relación con las figuras 1 y 2, un soporte de electrodo 1, normalmente hecho de PVC, policarbonato o poliéster o una mezcla de polímeros (p. ej., Valox, una mezcla de policarbonato y poliéster) soporta 3 pistas impresas de tinta de carbón conductora eléctrica 2, 3 y 4. Las pistas impresas definen la posición del electrodo de trabajo 5 sobre el que se deposita la tinta del electrodo de trabajo 16, el electrodo de referencia/auxiliar 6, el electrodo indicador de relleno 7, y los contactos 8, 9 y 10.

Las partes alargadas de las pistas conductoras se cubren respectivamente con pistas de partículas de plata/cloruro de plata 11, 12 y 13 (con el área expuesta ampliada 14 de la pista 12 cubriendo el electrodo de referencia 6), y se cubren después con una capa de material aislante eléctrico hidrófobo 15 que deja expuestas solo posiciones del electrodo de referencia/auxiliar 14, el electrodo de trabajo 5, el electrodo indicador de relleno 7 y las zonas de contacto 8, 9 y 10. Este material aislante hidrófobo sirve para prevenir cortocircuitos. Debido a que este material aislante es hidrófobo, puede servir para confinar la muestra a los electrodos expuestos. Un material aislante adecuado es Sericard, disponible en el comercio en Sericol, Ltd. (Broadstairs, Kent, Reino Unido). Opcionalmente, pueden cubrir el material aislante hidrófobofo una primera capa de malla 17, una segunda capa aislante 18, una segunda capa de malla 19, una tercera capa aislante 20 y una cinta 21.

Las respectivas mezclas de tinta se pueden aplicar sobre una pista conductora en un soporte, por ejemplo, cercana a un electrodo de referencia 14 conectado a una segunda pista. De esta forma, se puede producir un sensor que es capaz de funcionar con una muestra pequeña de sangre o de otro líquido que cubre el área de electrodo 5 eficaz. Las mezclas se aplican preferiblemente, pero no exclusivamente, en el soporte por serigrafía.

En general, las deshidrogenasas dependientes de NAD(P) catalizan reacciones de acuerdo con la ecuación:

RH2 + NAD(P)+� R + NAD(P)H + H+

en la que RH2 representa el sustrato (analito) y R el producto. En el proceso de la reacción anterior, el NAD(P)+ (es decir, NAD+ o NADP+) se reduce a NAD(P)H. Los biosensores amperométricos adecuados proporcionan un mediador electroquímico que puede reoxidar el NAD(P)H, regenerando de esta forma el NAD(P)+. La reoxidación se produce en un electrodo para generar una corriente que es indicativa de la concentración de sustrato.

En una realización, se proporciona un sensor seco. El sensor incluye un

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soporte aislante eléctrico alargado como se especifica en la reivindicación 1, que tiene un par de pistas conductoras eléctricas, longitudinales y sustancialmente paralelas sobre el mismo, estando provista cada pista en el mismo extremo con medios para la conexión eléctrica a un lector y provista de un electrodo, siendo uno de los electrodos el electrodo de referencia/auxiliar y siendo el otro el electrodo de trabajo, junto con los reactivos de ensayo. El sensor se puede configurar en forma de una tira de soporte de material soporte aislante eléctrico, tal como un polímero sintético (p. ej., PVC, policarbonato o poliéster, o una mezcla de polímeros tales como Valox), que lleva los dos electrodos soportados en las pistas conductoras eléctricas entre sus extremos. Por ejemplo, los electrodos pueden tener forma de dos áreas rectangulares una al lado de otra en la tira soporte, como se muestra en la figura 2 (es decir, electrodos 14 y 16). Dichas áreas se pueden diseñar como un área objetivo para cubrir mediante una sola gota de muestra, tal como sangre entera, para analizar el analito. Si se desea, se pueden usar áreas no rectangulares (p. ej., áreas en forma de diamante, semicircular, circular o triangular) para proporciona un área objetivo para el contacto optimizado por una muestra de líquido.

También se pueden incluir otros electrodos, tales como un electrodo nulo. Estos otros electrodos pueden tener una formulación similar al electrodo de trabajo (es decir, con los reactivos de ensayo asociados), pero carecen de uno o más de los componentes activos del electrodo de trabajo. Un electrodo nulo, por ejemplo, puede proporcionar resultados más fiables, en cuanto que si la carga pasa al electrodo nulo se resta de la carga que pasa al electrodo de trabajo, y se puede concluir que la carga resultante se debe a la reacción de interés.

Se puede proporciona una membrana en o encima del objetivo para realizar una función de filtración. Por ejemplo, una membrana puede filtrar las células de sangre de una muestra antes de que la muestra entre en la tira de ensayo. Los ejemplos de membranas disponibles en el comercio que se pueden usar incluyen Hemasep V, Cytosep, y Hemadyne (Pall Biosupport, Fort Washington, NY 11050). Como una alternativa, se puede moldear in situ una membrana de filtración o separación celular. Esto se puede lograr mediante el moldeo de polímeros hidrófobos tales como acetato de celulosa, polivinil-butiral y poliestireno y/o polímeros hidrófobos tales como hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, poli(alcohol vinílico) y poli(acetato de vinilo).

En otra realización, se proporciona una tira de electrodos desechable de un solo uso para unir a un circuito de lectura de señales de un sistema sensor. La tira

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puede detectar una corriente representativa de un analito en una mezcla líquida. La tira incluye un soporte alargado adaptado para la unión liberable al circuito de lectura; un primer conductor que se extiende a lo largo del soporte y que incluye un elemento conductor para la conexión al circuito de lectura; un electrodo de trabajo en la tira en contacto con el primer conducto y colocado para ponerse en contacto con la mezcla; un segundo conductor que se extiende a lo largo del soporte, que comprende un elemento conductor para la conexión al circuito de lectura; y un electrodo de referencia/auxiliar en contacto con el segundo elemento conductor y colocado para poner en contacto la mezcla y el segundo conductor, y que además se especifica con más detalle como se describe en la reivindicación 1 y se representa en la figura 1.

El electrodo de trabajo puede incluir una capa impresa sobre el soporte, y la propia capa impresa puede incluir una enzima deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP capaz de catalizar una reacción que implica un sustrato para la enzima. Esta capa también puede incluir el correspondiente cofactor nicotinamida y un mediador de la presente invención capaz de transferir electrones entre la reacción catalizada por la enzima y el primer conductor a través del NADH o NADPH, para crear una corriente representativa de la actividad tanto de la enzima como del analito.

El primer elemento conductor y el electrodo activo pueden estar separados del segundo elemento conductor y el electrodo de referencia/auxiliar, y los electrodos tener un tamaño y estar en una posición para presentar un área eficaz combinada suficientemente pequeña para ser cubierta completamente por una gota de sangre u otra muestra de ensayo; normalmente el área de reacción es 5 mm2 pero puede ser tan grande como de 25 mm2. La muestra de ensayo completa un circuito eléctrico a través del electrodo activo y el electrodo de referencia/auxiliar para la detección amperométrica de la actividad de la enzima.

En una realización preferida de la presente invención, se produce un electrodo de trabajo usando una formulación que incluye no solo la enzima, el cofactor nicotinamida y el mediador, sino también ingredientes de carga y aglutinantes que hacen que el electrodo de trabajo de una respuesta monotónica creciente a concentraciones de interés para el analito, detectándose cuando se mide en un modo cinético en el que la oxidación y reducción del mediador se producen ambas durante la medición. El concepto es proporcionar una capa de reacción estable sobre la superficie del electrodo de trabajo cuando se aplica la muestra. Esto permite el uso de mediadores que son poco solubles en la muestra. Puesto que el mediador se reduce por reacción con la enzima, cofactor y analito, es retenido cerca de la superficie del

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electrodo de modo que se puede reoxidar fácilmente sin pérdida significativa para la precipitación. El mantenimiento de esta capa de reacción fina también permite que la reacción analítica general se produzca en un volumen pequeño de la muestra general, de modo que lo que se mide de hecho es el flujo de analito desde la muestra en volumen a esta capa de reacción.

Es necesario que esta capa de reacción permanezca estable durante el menos el tiempo para llevar a cabo una medición cinética reproducible. Los tiempos típicos para dicha medición, están en el intervalo entre aproximadamente 5 y 60 segundos, aunque se prefiere la estabilidad para tiempos mayores. Normalmente, las tiras de electrodos desechables de interés se producen en masa y por lo tanto es conveniente tener un margen de seguridad con respecto a cualquier propiedad requerida para dar cuenta de la variabilidad inherente en cualquier procedimiento de fabricación en masa.

La estabilidad de la capa de reacción se puede mejorar por una combinación adecuada de cargas y aglutinantes. La capa preferiblemente es suficientemente estable para dar una respuesta reproducible aproximadamente lineal en una medición cinética a lo largo del intervalo de concentraciones de interés para un analito dado. Por ejemplo, para cuerpos cetónicos (medidos como hidroxibutirato) esto sería entre aproximadamente 1 y 8 mM, mientras que para la glucosa sería entre aproximadamente 2 y 40 mM.

La medición cinética implica la circulación del mediador entre un estado oxidado y un estado reducido. La proporción de esta circulación, que se refleja en la corriente observada durante el transcurso del ensayo, depende de la concentración del analito en la muestra. Cuando mayor es la concentración del analito más cofactor enzimático es reducido en el transcurso de la oxidación del analito por la enzima. A su vez, el analito queda reducido al reoxidar el cofactor y después se reoxida en la superficie del electrodo. Sin embargo, debido a su solubilidad muy baja solo una cantidad pequeña del mediador está disponible inmediatamente para reaccionar con el cofactor reducido. Por consiguiente, el mediador que reacciona con el cofactor reducido y se reoxida en el electrodo, después reaccionará con el cofactor reducido y esto continua a lo largo del transcurso de una medición cinética. Por lo tanto, cuanto mayor es la concentración del cofactor reducido (reflejo de una concentración mayor de analito en la muestra) mayor es la fuerza conductora para la circulación del mediador y por lo tanto mayor la proporción de circulación.

En algunos casos el cofactor también puede involucrarse en la circulación entre un estado oxidado y un estado reducido durante la medición cinética. Esto depende de

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si hay una cantidad suficiente de cofactor presente inicialmente para convertir todo el analito presente en la capa de reacción. Si la cantidad de cofactor presente inicialmente es insuficiente, cuando el cofactor oxidado se regenera promueve la oxidación de cualquier analito que quede en la capa de reacción quedando otra vez reducido.

Sin embargo, lo que es crítico es que una concentración dada de analito reproducible, da como resultado la producción de la misma señal en el ensayo cinético para un diseño de tira de electrodos particular y que la señal aumenta de forma monotónica, preferiblemente lineal, con la concentración del analito (en otras palabras, la señal es una función verdadera de la concentración de analito) frente al intervalo de concentraciones de interés. Esto permite que el fabricante de las tiras de electrodos establezca una calibración universal para un lote dado de tiras de electrodo, de modo que cualquier señal dada obtenida de una tira dada en condiciones de ensayo estándar se correlaciona únicamente con una concentración particular de analito. Por lo tanto, es importante que dentro del intervalo de concentraciones de interés, no haya una variable no contralada más que la concentración de analito que producirá sustancialmente la señal.

La señal puede ser la corriente observada en un tiempo fijado después de iniciar el ensayo o puede ser la corriente integrada a lo largo de algún periodo que se produce un tiempo fijado después de iniciar el ensayo (básicamente la carga transferida a lo largo de dicho periodo). El ensayo se lleva a cabo cubriendo el electrodo de trabajo y un electrodo de referencia/auxiliar con la muestra y después aplicando un potencial entre ellos. La corriente que fluye entonces se observa a lo largo de algún periodo de tiempo. El potencial puede imponerse tan pronto como la muestra cubre los electrodos o puede imponerse después de un retraso corto, normalmente aproximadamente 3 segundos, para asegurar el humedecimiento bueno de los electrodos por la muestra. El tiempo fijado hasta que la corriente o la integración de la corriente se considera como la señal, debe ser suficientemente largo para asegurar que la variable principal que afecta a la corriente observada es la concentración de analito.

El electrodo de referencia/auxiliar puede ser un electrodo de plata/cloruro de plata clásico, pero también puede ser idéntico al electrodo de trabajo en la construcción. En una realización, las dos pistas conductoras separadas pueden recubrirse ambas con una formulación adecuada de enzima, cofactor y mediador en un vehículo acuoso que contiene un aglutinante y carga, para dar un revestimiento. En

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aquellos casos en los que el revestimiento no es conductor, p. ej., cuando la carga no es un conductor, un revestimiento común puede cubrir ambos electrodos. Cuando se aplica un potencial, uno de los electrodos funcionará como un electrodo de referencia/auxiliar absorbiendo los electrones liberados en el otro electrodo, el de trabajo. El mediador en el electrodo de referencia/auxiliar simplemente quedará reducido como resultado de la interacción con el flujo de electrones en su electrodo.

La capa de reacción que produce el comportamiento deseado se obtiene formulando el electrodo de trabajo con los ingredientes aglutinante y carga. El objetivo es permitir que la muestra interaccione con la enzima, el cofactor y el mediador, pero también asegurar que estos ingredientes químicamente activos permanecen en la cercanía inmediata de la superficie del electrodo. El ingrediente aglutinante debe incluir materiales que aumentan fácilmente la viscosidad del medio acuoso y promueven la formación de películas o capas. Típicos de estos materiales son los polisacáridos tales como goma de guar, alginato, goma de algarrobilla, carragenano y xantano. También son útiles los materiales conocidos habitualmente como formadores de película tales como poli(alcohol vinílico) (PVA), polivinilpirrol, acetato de celulosa, carboximetilcelulosa y poli(viniloxazolidona). El ingrediente carga debe ser un material en partículas que sea químicamente inerte respecto a las reacciones de oxidación y reducción implicadas en la medición e insoluble en medio acuoso. Puede ser conductor o no conductor eléctrico. Los materiales típicos incluyen carbón, normalmente en forma de grafito, dióxido de titanio, sílice y alúmina.

El electrodo activo se puede producir de forma conveniente formulando la enzima, cofactor, mediador e ingredientes de carga y aglutinante en un vehículo acuoso y aplicándolos en el soporte alargado aislante eléctrico que tiene pistas conductoras. La formulación se puede aplicar por impresión como serigrafía u otras técnicas adecuadas. La formulación también puede incluir otros ingredientes tales como un tampón para proteger la enzima durante el procesamiento, un estabilizante de proteína para proteger la enzima frente a la desnaturalización y un agente antiespumante. Estos ingredientes adicionales también pueden tener un efecto en las propiedades de la capa de reacción.

El electrodo de trabajo tiene normalmente un grosor en seco entre aproximadamente 2 y 50 micrómetros, preferiblemente entre aproximadamente 10 y 25 micrómetros. El grosor en seco real en cierta medida dependerá de la técnica de aplicación usada para aplicar los ingredientes que componen el electrodo de trabajo. Por ejemplo, por serigrafía son típicos los grosores entre aproximadamente 10 y 25

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micrómetros.

Sin embargo, el grosor de la capa de reacción no es solo una función del grosor en seco del electrodo de trabajo, sino que también depende del efecto de la muestra en el electrodo de trabajo. En el caso de muestras acuosas, la formulación de

5 los ingredientes del electrodo de trabajo afectará al grado de absorción de agua que presenta esta capa.

La carga normalmente compone entre aproximadamente 20 y 30 por ciento en peso del vehículo acuoso. Las cantidades de otros ingredientes son normalmente menos de aproximadamente 1 por ciento en peso del vehículo acuoso y se ajustan de

10 forma empírica para lograr las propiedades finales deseadas. Por ejemplo, la cantidad de tampón y estabilizante de proteína se ajustan para lograr el grado deseado de actividad enzimática residual. En relación con esto, se puede usar más enzima y menos estabilizante o menos enzima y más estabilizante para lograr el mismo nivel final de actividad enzimática. La cantidad de aglutinante y agente antiespumante debe

15 ajustarse para dar viscosidades adecuadas para el método de aplicación, siendo adecuadas mayores viscosidades para la serigrafía y siendo adecuadas menores viscosidades para la impresión por rotograbado.

Una formulación de tinta acuosa adecuada se puede formular de acuerdo con la Tabla 2, siendo el resto antiespumante, tampón, potenciadores de la actividad 20 enzimática y agua para completar 1 gramo de tinta formulada. TABLA 2

Enzima (tal como glucosa deshidrogenasa o 3hidroxibutirato deshidrogenasa)

200 a 4000 unidades

Cofactor nicotinamida (tal como NAD)

5 a 30 por ciento en peso

Mediador (tal como 1,10-fenantrolinquinona)

0,1 a 1,5 por ciento en peso

Carga (tal como carbón o dióxido de titanio ultrafino)

10 a 30 por ciento en peso

Aglutinante (tal como alginato o goma de guar)

0,01 a 0,5 por ciento en peso

Estabilizante de proteína (tal como trealosa o albúmina de suero bovino)

0,01 a 2 por ciento en peso

La estabilidad de la capa de reacción se puede evaluar fácilmente usando voltametría cíclica con diferentes tiempos de retardo. La formulación del electrodo de 25 trabajo se evalúa exponiéndola a una muestra que contiene una concentración relativamente alta de analito y sometiéndola a un potencial uniformemente creciente hasta un valor máximo y después a un potencial uniformemente decreciente hasta no

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aplicar potencial. La corriente resultante aumenta hasta un valor máximo y después disminuye cuando continua el barrido de voltaje. Dichas evaluaciones de voltametría cíclica se llevan a cabo después de diferentes periodos de retraso después de que el electrodo de trabajo se exponga a la muestra. El cambio de corriente máxima con periodos de retraso cada vez más largos es una medida de la estabilidad de la capa de reacción. Cuanto más estable es la capa de reacción menor es la disminución de la corriente máxima.

Se llevó a cabo una evaluación para comparar la estabilidad de un electrodo de trabajo formulado de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención con la de un “electrodo de trabajo” formulado de acuerdo con las enseñanzas de Geng et al. en las páginas 1267 a 1275 de Biosensors and Bioelectronics, Volumen II, número 12 (1996). El electrodo de trabajo representativo de la presente invención se formuló con aproximadamente 25 por ciento en peso de carga (carbón ultrafino), aglutinante, estabilizante de proteína y antiespumante como se enseña en lo que antecede, y el electrodo de trabajo representativo de Gen se formuló con un poli(óxido de etileno) de alto peso molecular como se describe en la página 1267 del artículo de Geng. En cada caso, se aplicó un potencial con una velocidad de barrido de 50 milivoltios por segundo hasta 400 mV frente a un electrodo de referencia de plata/cloruro de plata, después de exponer el electrodo de trabajo a una disolución acuosa de glucosa 20 mM durante 3 segundos y 60 segundos. La formulación de acuerdo con la presente invención da una capa de reacción estable en la que la corriente máxima después de 60 segundos es 60% de la observada después de 3 segundos, mientras que la formulación de acuerdo con el artículo de Geng da una capa de reacción inestable en la que no se puede observar corriente máxima después de 60 segundos de exposición.

Esto se atribuye a una disolución del electrodo con una pérdida de los reactivos a la disolución madre. Los voltamogramas respectivos son los siguientes:

imagen1

Formulación con aglutinante y carga (presente invención)

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imagen1

Formulación con PEO (artículo de Geng)

Las tiras de ensayo de esta invención pueden detectar analitos que son sustratos de enzimas deshidrogenasas dependientes de NAD o NADP usando un mediador seleccionado de los compuestos descritos en el presente documento, tal como la 1,10-PQ.

Las tiras de ensayo de acuerdo con esta invención se dirigen a su uso con aparatos electrónicos y sistemas de medición. Estas controlan el avance de la reacción electroquímica (p. ej., manteniendo un potencial particular en los electrodos), siguen la reacción y calculan y presentan el resultado. Una característica particular que es deseable en un sistema de medición para usar con tiras de ensayo de este tipo es la capacidad de detectar el humedecimiento de la zona de reacción por el fluido de muestra, permitiendo así el inicio oportuno de la medición y reduciendo el potencial debido a inexactitudes causadas por error del usuario. Este objetivo puede lograrse aplicando un potencial a los electrodos de la tira de ensayo tan pronto como la tira se inserta en el sistema de medición; este potencial se puede suprimir durante un periodo corto para permitir que el humedecimiento sea completo antes de iniciar la medición.

El sistema de medición también puede presentar un medio para identificar automáticamente tiras de ensayo para medir diferentes analitos. Esto se puede lograr, por ejemplo, cuando se imprimen uno o más bucles de circuito en la tira de ensayo; cada bucle puede proporcionar una resistencia característica del tipo de tira, como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.126.034 en la columna 4, líneas 3 a 17. Como alternativa adicional, se pueden cortar muescas u otro tipo de formas en el extremo proximal de la tira de ensayo; interruptores o detectores ópticos en el sistema de medición pueden detectar la presencia o ausencia de cada muestra. Otras técnicas de reconocimiento del tipo de tira incluyen variar el color de las tiras y proporcionar el sistema de medición con un fotodetector capaz de distinguir la variedad de colores; y proporcionar las tiras con códigos de barras, tiras magnéticas u otras marcas, y

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proporcionar el sistema de medición con una disposición de lectura adecuada.

En un ejemplo de una tira de ensayo para la producción a gran escala, los electrodos de la tira tienen una configuración de dos electrodos que comprende un electrodo de referencia/auxiliar y un electrodo de trabajo. El soporte puede estar hecho de cualquier material que tenga una superficie aislante eléctrica, incluyendo poli(cloruro de vinilo), policarbonato, poliéster, papel, cartón, material cerámico, metal recubierto de material cerámico, mezclas de estos materiales (p. ej., una mezcla de policarbonato y poliéster) u otra sustancia aislante.

Se aplica una tinta conductora al soporte mediante un método de deposición como la serigrafía. Esta capa forma las áreas de contacto, que permiten que el sistema de medición interconecte con la tira de ensayo, y proporciona un circuito eléctrico entre los contactos y la química activa que tiene lugar en la tira. La tinta puede ser una mezcla de carbón basado en compuestos orgánicos, secada al aire, por ejemplo. Las formulaciones alternativas incluyen tintas de carbón basadas en agua y tintas de metal tales como de plata, oro, platino y paladio. Otros métodos de secado o curado de las tintas incluyen el uso de radiación infrarroja, ultravioleta y radiofrecuencia.

Se imprime una capa que forma el electrodo de referencia/auxiliar con una tinta basada en disolvente orgánico que contiene una mezcla de plata/cloruro de plata. Las parejas de referencia alternativas incluyen Ag/AgBr, Ag/AgI y Ag/Ag2O. La impresión se extiende para cubrir parcialmente la pista central de la impresión de carbón, donde se extiende a la zona de reacción. Es útil si partes separadas de esta impresión se extienden para cubrir partes de otras pistas de carbón fuera de la zona de reacción, de modo que se reduce la resistencia eléctrica total de cada pista.

Opcionalmente se puede imprimir una capa de tinta dieléctrica para cubrir la mayoría de las capas de carbono y plata/cloruro de plata impresas. En este caso, se dejan dos áreas sin cubrir, en concreto las áreas de contacto eléctrico y las áreas de detección que estarán debajo de la zona reactiva como se representa en las figuras 1 y 2. Esta impresión sirve para definir el área de la zona reactiva y proteger las pistas expuestas de cortocircuitos.

Para el electrodo de trabajo, se depositan una o más tintas con un grosor preciso en un área definida en la parte superior de las pistas conductoras en la zona de reacción, para depositar la enzima, el cofactor y un mediador como se describe en la presente invención. Es conveniente hacer esto mediante serigrafía. Otras formas de depositar esta tinta incluyen la impresión por chorro de tinta, dosificación volumétrica,

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rotograbado, impresión flexográfica, e impresión tipográfica. Opcionalmente, se puede depositar una segunda tinta parcialmente activa sobre una segunda pista conductora para formar un electrodo nulo.

Se pueden incluir polisacáridos en la formulación de la tinta. Los polisacáridos adecuados incluyen goma de guar, alginato, goma de algarrobilla, carragenano y xantano. La tinta también puede incluir un formador de película; los polímeros formadores de película adecuados incluyen poli(alcohol vinílico) (PVA), polivinilpirrol, acetato de celulosa, CMC y poliviniloxazolidina. Las cargas para tintas pueden incluir dióxido de titanio, sílice, alúmina o carbón.

Los siguientes son ejemplos ilustrativos no limitantes de la práctica de la invención:

EJEMPLO 1

Mediadores:

El azul de Meldola (MB) (compuesto 3) se obtuvo como la hemisal de ZnCl2 de Polysciences, Inc. El 2,6-dicloroindofenol (DCIP) (compuesto 6) y el tampón de Tris se adquirieron en Sigma. La disolución salina tamponada con fosfato (PBS) (fórmula de Dulbecco) se preparó a partir de comprimidos suministrados por ICN Biomedicals, Ltd.

La D-3-hidroxibutirato deshidrogenasa (HBDH; EC 1.1.1.30) de Pseudomonas sp. se adquirió en Toyobo Co., Ltd. El dinucleótido de p-nicotinamida y adenina (NAD+) y el ácido D,L-3-hidroxibutírico fueron suministrados por Boehringer Mannheim.

La 1,10-fenantrolinquinona (1,10-PQ) (compuesto 7) se preparó de acuerdo con el método de Gillard et al. (J. Chem. Soc. A, 1447-1451,1970). La 1,7fenantrolinquinona (1,7-PQ) (compuesto 8) se sintetizó usando el procedimiento descrito por Eckert et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:2533-2536, 1982). La 2,9dimetil-1,10-fenantrolinquinona (2,9-Me2-1,10-PQ) (compuesto 10) se sintetizó como un subproducto de nitración de la neocuproina como describen Mullins et al. (J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, 75-81, 1996). El metosulfato de 1-metoxifenazina (1-MeO-PMS) (compuesto 5) se preparó por metilación de la 1-metoxifenazina adaptada del método descrito por Surrey (Org. Synth. Coll Vol. 3, Bd. E. C. Horning, Wiley, New York, 753756). La 1-metoxifenazina se sintetizó por una reacción de Wohl-Aue modificada como describe Yoshioka (Yakugaku Zasshi, 21:23-25, 1953). La 4-metil-1,2-benzoquinona (4-Me-BQ) (compuesto 4) se preparó por oxidación del 4-metilcatecol con o-cloranilo de acuerdo con un procedimiento general de Carlson et al. (J. Am. Chem, Soc., 107:479-485,1985). El complejo de 1,10-PQ [Ru(bpy)2(1,10-PQ)](PF6)2 (compuesto 12) se obtuvo a partir de [Ru(bpy)2Cl2] (Strem Chemicals, inc.) como describen Goss et al.

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(Inorg. Chem., 24:4263-4267, 1985).

Preparación de trifluorometanosulfonato de 1-Me-1,10fenantrolinioquinona (1-Me-1,10-PQ+) (compuesto 11):

Se añadió trifluorometanosulfonato de metilo (Aldrich) (1,0 ml) a una disolución de 1,10-PQ (0,50 g, 2,38 mmol) en cloruro de metileno anhidro (25 ml) en atmósfera de nitrógeno. Se produjo la precipitación inmediata y la mezcla resultante se agitó durante 24 h. La filtración seguida de lavado con cloruro de metileno dio la 1-Me-1,10PQ+ (0,65 g, 73%) en forma de un polvo fino amarillo.

Evaluación de azul de Meldola y 1,10-PQ como mediadores de NADH en tiras secas:

Se produjeron electrodos serigrafiados que incorporaban 1,10-PQ y MB a partir de una tinta de carbón orgánico que contenía estos mediadores de NAD(P)H en un nivel de 3,5 mg/g de tinta. Los mediadores sólidos se mezclaron en una tinta de carbón conductora comercial (Gwent Electronic Materials).

La curva de dosis-respuesta para los electrodos que contenían 1,10-PQ ensayados con disoluciones de NADH acuoso (0-16,7 mM) en PBS a un potencial de equilibrio de +400 mV frente a un electrodo de referencia impreso de Ag/AgCl se muestra en la Fig. 3. Se registró una pendiente de 0,58 µA.mM-1 NADH. La curva de dosis-respuesta para los electrodos que contenían MB ensayados con disoluciones acuosas de NADH (0-12,4 mM) a un potencial de equilibrio de +100 mV frente a un electrodo de referencia impreso de Ag/AgCl se muestra en la Fig. 4. Se observó una pendiente aumentada de 8,48 µA.mM-1 NADH.

Evaluación de la inhibición por el mediador de la D-3-hidroxibutirato deshidrogenasa:

Se preparó una serie de 18 disoluciones (2,5 ml cada una), que contenía cada una 50 U/ml de HBDH y 1,29 ó 2,58 mg de los siguientes mediadores de NAD(P)H: MB(3), 4-Me-BQ(4), 1-MeO-PMS(5), DCIP(6), 1,10-PQ(7), 1,7-PQ(B), 2,9-Me2-1,10PQ(10), 1-Me-1,10-PQ+(11), y [Ru(bpy)2(1,10-PQ)](PF5)3 (12) en tampón de Tris (50 mM, pH 8,2). También se preparó una disolución de control que contenía enzima pero no mediador. Las disoluciones se incubaron durante 0,5 horas a 37,5ºC, después se ensayó (por triplicado) el NADH a 340 nm, usando un kit de D-3-hidroxibutirato de Sigma Diagnostics. La extensión de la interferencia del mediador añadido con la velocidad de ensayo comparado con el control, dio una medición cuantitativa de la eficacia del mediador como un oxidante del NADH.

Después, la enzima se volvió a aislar de las disoluciones de mediadores por

-20

filtración a través de una membrana de polisulfona (corte de exclusión de peso molecular nominal: 30.000) en un filtro de microcentrífuga (Millipore). La enzima que quedaba en el filtro se disolvió en tampón de Tris (0,2 ml) y la disolución resultante se ensayó (por triplicado) con el kit de Sigma. Comparando los resultados de los ensayos antes y después de la filtración, se pudo determinar el efecto de cualquier mediador unido de forma covalente y/o irreversible en la actividad enzimática.

Los resultados de los dos ensayos en cada disolución antes y después de la filtración se recogen en la Tabla 3. Tabla 3

Mediador (compuesto nº)

Velocidad de ensayo (unidades de absorbancia/mln)

control (sin mediador)

antes de filtración después de filtración

1,10-PQ

0,167 0,149 0,160 (96%)

1,7-PQ

0,155 0,115 0,150 (97%)

MB

0,167 0,008 0,026 (16%)

4-Me-BQ

0,170 0,005 0,007 (4%)

1-MeO-PMS

0,150 0,009 0,071 (47%)

DCIP

0,150 0,104 0,085 (57%)

2,9-Me2 -1,10-PQ

0,197 0,189 n/e

1-Me-1,10-PQ+

0,197 0,150 0,185 (94%)

[Ru(bpy)2 (1,10-PQ)](PF6 )2

0,197 0,114 0,193 (98%)

10 Aunque estos resultados demuestran que los mediadores fenantrolinquinona eran mediadores de NADH relativamente ineficaces comparados con el azul de Meldola y el 1-MeO-PMS (es decir, la velocidad de ensayo “antes de filtración” solo disminuyó en un pequeño grado), alrededor de 90% de la actividad enzimática original

15 para las disoluciones que contenían 1,10-PQ, 1,7-PQ, 1-MeO-1,10-PQ, o [Ru(bpy)2(1,10-PQ)](PF6)2 se restableció “después de filtración”. Este no fue el caso para MB, 1-MeO-PMS, DCIP o 4-Me-BQ. Realmente, el mediador de quinona 4-Me-BQ demostró ser el inhibidor más potente, quedando solo 4% de la actividad original “después de filtración”. Por lo tanto, los últimos cuatro mediadores inactivaron

20 parcialmente la HBDH, mientras que los mediadores nuevos descritos ventajosamente no tienen o tienen poco efecto en la actividad enzimática. El porcentaje de actividades enzimáticas residuales para cada mediador se

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presenta como un diagrama de barras en la figura 5, que pone de manifiesto que los mediadores de la presente invención, representados por barras negras, no son inhibidores fuertes de la HBDH. En cambio, MB, 4-Me-BQ, 1-MeO-PMS, y DCIP inhibían todos de modo irreversible la NBDH, con pérdida simultánea de actividad en el intervalo de 43 a 96%; estos resultados se representan por barras grises en la figura

5.

EJEMPLO 2

Evaluación del azul de Meldola y 1,10-PQ en las tiras secas que contienen HBDH:

Los electrodos serigrafiados se produjeron a partir de una tinta de carbón acuosa que incorporaba 1,10-PQ o MB en un nivel de 2,4 ó 4,3 mg/g de tinta, respectivamente, junto con la enzima HBDH (120 unidades/g de tinta) y NAD+ (110 mg/g de tinta). La tinta también contenía un aglutinante polisacárido.

Las curvas de dosis-respuesta para los electrodos que contenían 1,10-PQ se dan en la figura 6. Los electrodos se ensayaron después de 4, 14 y 26 semanas de almacenamiento (30ºC, desecado) con disoluciones de D-3-hidroxibutirato (0-25 mM) en PBS a un potencial de equilibrio de +400 mV frente a un electrodo de referencia impreso de Ag/AgCl. Las tres dosis-respuesta eran no lineales y se nivelaron con una corriente de 8,5 µA registrada con D-3-hidroxibutiraton 24 mM. Esto de mostraba que la respuesta de los electrodos secos era estable durante al menos 26 semanas.

Las curvas de dosis-respuesta para los electrodos que contenían MB se proporcionan en la figura 7. Los electrodos se ensayaron después de 2 y 14 semanas de almacenamiento (30ºC, desecado) con disoluciones acuosas de D-3-hidroxibutirato (0-28 mM) en PBS a un potencial de equilibrio de +100 mV frente a un electrodo de referencia impreso de Ag/AgCl. Las curvas de dosis-respuesta eran similares a las de la figura 4. Se registró una corriente de 8,6 µA con D-3-hidroxibutiraton 24 mM para estos electrodos después de 2 semanas de almacenamiento. Esto es casi idéntico a las respuestas obtenidas a partir de las tiras secas que contenían 1,10-PQ.

Este resultado demostraba que la capacidad de un compuesto como MB para mediar muy eficazmente con NADH comparado con la 1,10-PQ es superada por el hecho de que inhibe la HBDH. Además, la estabilidad de la respuesta del electrodo al D-3-hidroxibutirato está comprometida por la inactivación de la HBDH por MB. La figura 7 muestra que la respuesta de estos electrodos disminuye a un margen inaceptable de aproximadamente 7% después de 14 semanas de almacenamiento.

En resumen, los electrodos biosensores que contienen un mediador de la

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presente invención presentaban respuestas que eran estables después de al menos 26 semanas de almacenamiento. A diferencia de esto, aquellos electrodos que incorporaban un mediador tradicional tal como MB que es un inhibidor enzimático irreversible, presentaban respuestas que disminuían después de solo 14 semanas de almacenamiento.

EJEMPLO 3

Evaluación de 1,10-PQ en tiras secas que contienen glucosa deshidrogenasa (GDH):

Se produjeron electrodos serigrafiados a partir de una tinta de carbón acuosa que incorporaba 1,10-PQ o MB en un nivel de 2,4 ó 4,3 mg/g de tinta, respectivamente, junto con la enzima glucosa deshidrogenasa (120 unidades/g de tinta) y NAD+ (110 mg/g de tinta). La tinta también contenía un aglutinante polisacárido.

La curva de dosis-respuesta calibrada para los electrodos se da en la figura 8. Los electrodos se ensayaron con sangre entera que contenía concentraciones fisiológicamente relevantes de glucosa en el intervalo de 3,3 a 26 mM. Se mantuvo un potencial de equilibrio de +50 mV frente a un electrodo impreso de Ag/AgCl. Los electrodos produjeron una respuesta lineal a lo largo del intervalo de glucosa. Por lo tanto, se demostró que se podía usar un mediador de la presente invención para construir un sensor de glucosa clínicamente útil que opera a un potencial aplicado particularmente bajo.

EJEMPLO 4

Se prepararon tiras de electrodos usando la construcción ilustrada en las figuras 1 y 2 con un electrodo de referencia/auxiliar de plata/cloruro de plata y un electrodo de trabajo preparado por serigrafía de una formulación de acuerdo con la tabla 2. En un caso, la carga era 25 por ciento en peso de carbón ultrafino y en el otro caso la carga era 25 por ciento en peso de dióxido de titanio. En ambos casos la enzima era la glucosa deshidrogenasa (GDH), el cofactor era el NAD, el mediador era la 1,10-PQ, el aglutinante era goma de guar, el estabilizante de proteína era albúmina de suero bovino (BSA) y el tampón era Tris (0,325 por ciento en peso).

Estas tiras de electrodo se evaluaron aplicando un potencial de 200 mV entre el electrodo de referencia/auxiliar y el electrodo de trabajo mientras una disolución acuosa de glucosa cubría ambos electrodos. La corriente observada de 15 a 20 segundos después de aplicar el potencial se integró y se representó gráficamente frente al contenido de glucosa de las disoluciones de ensayo. La formulación cargada con carbón dio una pendiente de 2,6 microculombios por mM de glucosa y un corte

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con el eje X de -1 microculombios, mientras que la formulación cargada con dióxido de titanio dio una pendiente de 1,5 microculombios por mM de glucosa y un corte con el eje X de 0,6 microculombios. Las representaciones gráficas eran las siguientes:

imagen1

-24

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una tira de electrodos desechable de un solo uso para la unión al circuito de lectura de señales de un sistema sensor para detectar una corriente representativa de 5 un analito en una muestra acuosa, comprendiendo la tira: a) un soporte alargado (1) que tiene una superficie plana, lisa, adaptada para la unión liberable a dicho circuito de lectura; b) un primer conductor (4) que se extiende a lo largo de dicha superficie y que comprende un elemento conductor para la conexión con dicho circuito de lectura;

   10 c) un electrodo activo (5) sobre dicha superficie en contacto con dicho primer conductor, comprendiendo dicho electrodo activo un compuesto mediador que tiene una de las dos siguientes fórmulas:

   imagen1

   en las que X e Y pueden ser independientemente oxígeno, azufre, CR3R4, NR3 o

   15 NR3R4+ o el grupo funcional CZ1Z2, en el que Z1 y Z2 son grupos atractores de electrones; R1 y R2 pueden ser independientemente un grupo aromático o heteroaromático sustituido o no sustituido; y R3 y R4 pueden ser independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo alquilo, arilo, heteroarilo, amino, alcoxilo o ariloxilo sustituido o no sustituido;

   20 d) un segundo conductor (3) que se extiende a lo largo de dicha superficie, que comprende un elemento conductor para la conexión con dicho circuito de lectura; e) un electrodo de referencia/auxiliar (6) en contacto con dicho segundo conductor; f) un tercer conductor (2) que se extiende a lo largo de dicha superficie, que 25 comprende un elemento conductor para la conexión con dicho circuito de lectura y un electrodo indicador de relleno (7) en contacto con dicho tercer conductor;

   g) estando dichos conductores espaciados de modo que no están en contacto eléctrico, y estando configurados de modo que no se ponen en contacto eléctrico cuando dicha muestra acuosa se pone sobre dicha tira;

   30 h) estando configurados dicho electrodo activo y dicho electrodo de

   -25

   referencia/auxiliar de modo que pueden cubrirse simultáneamente por una pequeña gota de dicha muestra acuosa para proporcionar un camino de conducción eléctrica entre dichos electrodos.

2. 2.

   Una tira de electrodos según la reivindicación 1, en la que dicho electrodo activo además comprende una enzima dependiente del cofactor nicotinamida, y un cofactor nicotinamida.

3. 3.

   Una tira de electrodos según la reivindicación 1, en la que el compuesto mediador es la 1,10-fenantrolinquinona.

4. 4.

   Una tira de electrodos según la reivindicación 2, en la que la enzima dependiente de cofactor es la glucosa deshidrogenasa.

5. 5.

   Una tira de electrodos según la reivindicación 2, en la que la enzima dependiente de cofactor es la 3-hidroxibutirato deshidrogenasa.

6. 6.

   Una tira de electrodos según la reivindicación 1, que además incluye uno o más bucles de circuitos impresos sobre la tira de ensayo, proporcionando cada bucle una resistencia característica del tipo de tira para identificar las tiras de ensayo para medir diferentes analitos.

7. 7.

   Una tira de electrodos según la reivindicación 1, que además incluye muescas u otras formas cortadas en el extremo proximal de la tira de ensayo para identificar las tiras de ensayo para medir diferentes analitos.

8. 8.

   Un procedimiento de medición de la concentración en una muestra acuosa de un analito sometido a oxidación por una enzima dependiente de NAD(P)+ que comprende

   a) oxidar el analito con la enzima dependiente de NAD(P)+ en presencia de NAD(P)+, en el que el NAD(P)+ está presente en un electrodo de trabajo de una tira de electrodos y en el que la tira de electrodos además comprende un electrodo de referencia/auxiliar y un electrodo indicador de relleno; oxidar el NAD(P)H generado por reacción con el analito y la enzima dependiente de NAD(P)+ con un compuesto mediador que tiene una de las siguientes dos fórmulas:

   -26

   imagen1

   en las que X e Y pueden ser independientemente oxígeno, azufre, CR3R4, NR3 o NR3R4+ o el grupo funcional CZ1Z2, en el que Z1 y Z2 son grupos atractores de electrones; R1 y R2 pueden ser independientemente un grupo aromático o heteroaromático sustituido o no sustituido; y R3 y R4 pueden ser independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo o un grupo alquilo, arilo, heteroarilo, amino, alcoxilo o ariloxilo sustituido o no sustituido;

   b) aplicar un potencial eléctrico en el electrodo de trabajo para reoxidar el compuesto mediador reducido al oxidar el NAD(P)H y observar la corriente resultante,

   en el que parte del compuesto mediador es reducido por reacción con el NAD(P)H mientras que parte del compuesto mediador es oxidado por la transferencia de electrones a dicho electrodo de trabajo durante un periodo de medición y la tasa de oxidación del compuesto mediador a lo largo de dicho periodo de medición y por consiguiente la corriente resultante observada está relacionada de forma monotónica con la concentración de analito en la muestra.

9. 9.

   Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que la enzima dependiente de NAD(P)+, el NAD(P) y el compuesto mediador se han aplicado en la superficie de dicho electrodo en combinación con un aglutinante y una carga, incluyendo dicho ingrediente aglutinante materiales que aumentan fácilmente la viscosidad del medio acuoso y promueven la formación de películas o capas, y siendo dicho ingrediente de carga un material en partículas que es químicamente inerte a las reacciones de oxidación y reducción implicadas en la medición e insoluble en el medio acuoso.

10. 10.

    Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que la corriente observada durante el periodo de medición está relacionada de forma lineal con la concentración de analito en la muestra.

11. 11.

    Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que el compuesto mediador es la 1,10-fenantrolinquinona.

    -27

12. 12.

    Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que la enzima dependiente de cofactor es la glucosa deshidrogenasa.

    5 13. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que la enzima dependiente de cofactor es la 3-hidroxibutirato deshidrogenasa.
13. 14. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que el potencial aplicado es 200 mV o menos.