ES2349312T3 - Uso de anticuerpos antagonistas del receptor de il-10 para inhibir la inducción por il-tif/il-21 de proteínas de fase aguda. - Google Patents

Abstract

El uso de un anticuerpo antagonista del IL-10Rß en la preparación de un medicamento para la inhibición de la inducción por IL-TIF/IL-21 de una respuesta de (a) un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre la SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 41 y SEC ID Nº: 43; o (b) un polipéptido que tiene una identidad en aminoácidos de al menos el 60% respecto de un polipéptido de (a).

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La presente invención se refiere al uso de un anticuerpo antagonista de IL10Rβ en la inhibición de la inducción de una respuesta de fase aguda mediante ILTIF/IL-21. [0002] También se describen moléculas de ácidos nucleicos recién aisladas y sus usos. Se ha demostrado que las moléculas de ácidos nucleicos están reguladas en exceso por la citocina interleucina-9 ("IL-9"). Además se describen las proteínas codificadas por las anteriores. Estas moléculas se han descrito como "factores inducibles derivados de células T" o "TIF"; no obstante, desde ahora, se conocen como "interleucina 21" o "IL-21", así como "IL-TIF". Por esta razón, en el presente documento los términos se usarán de manera intercambiable. Estas moléculas de ácidos nucleicos codifican proteínas que inducen la activación de STAT en las células. Se pueden usar, por ejemplo, en la estimulación de la regeneración de tejidos diana. Además, se pueden usar sus inhibidores o antagonistas para retrasar, evitar o inhibir la diferenciación de otros tejidos.

ANTECEDENTES Y TÉCNICA ANTERIOR [0003] La última década ha visto como se ha expandido tremendamente el conocimiento del sistema inmunitario y su regulación. Un área de interés particular ha sido la investigación de las proteínas y glicoproteínas que regulan el sistema inmunitario. Una de las familias de estas moléculas mejor conocidas son las citocinas. Se trata de moléculas que están involucradas en la "comunicación" de las células entre sí. Se ha encontrado que miembros individuales de la familia de las citocinas están involucrados en una amplia variedad de dolencias patológicas, tales como el cáncer y las alergias. Aunque algunas veces las citocinas están involucradas en la patología de la dolencia, también se sabe que son terapéuticamente útiles. [0004] Las interleucinas son un tipo de citocina. La bibliografía sobre interleucinas es vasta. Un listado a modo de ejemplo, pero de ningún modo exhaustivo, de las patentes en este área incluyen la patente de EE.UU. Nº 4.778.879 de Mertelsmann y col.; patente de EE.UU. Nº 4.490.289 de Stern; patente de EE.UU. Nº

4.518.584 de Mark y col.; y patente de EE.UU. Nº 4.851.512 de Miyaji y col., todas ellas que se refieren a la interleucina-2 o "IL-2". Se han expedido patentes adicionales que se refieren a la interleucina-1 ("IL-1"), tales como la patente de EE.UU. Nº

4.808.611

de Cosman. La descripción de todas estas patentes se incorpora al presente documento por referencia. Patentes más recientes sobre interleucinas diferentes

incluyen las patentes de EE.UU. Nº 5.694.234 (IL-13); 5.650.492 (IL-12); 5.700.664,

5.371.193

y 5.215.895 (IL-11); 5.728.377, 5.710.251, 5.328.989 (IL-10); 5.580.753, 5.587.302, 5.157.112, 5.208.218 (IL-9); 5.194.375, 4.965.195 (IL-7); 5.723.120,

5.178.856 (IL-6), y 5.017.691 (IL-4). Incluso una revisión somera de esta bibliografía de patentes muestra la diversidad de las propiedades de los miembros de la familia de la interleucina. Se puede asumir que la gran familia de citocinas muestra una diversidad incluso superior. Véase, por ejemplo, Aggarwal y col., ed., Human Cytokines: Handbook For Basic And Clinical Research (Blackwell Scientific Publications, 1992), Paul, ed., Fundamental Immunology (Raven Press, 1993), pg 763836, "T-Cell Derived Cytokines And Their Receptors", y "Proinflammatory Cytokines and Immunity". [0005] Las relaciones entre las diversas citocinas son complejas. Como se puede observar de las referencias citadas en el presente documento, a medida que se incrementa o se reduce el nivel de una citocina particular, esto puede afectar a los niveles de otras moléculas producidas por un sujeto, ya sea directa o indirectamente. Entre las moléculas afectadas están otras citocinas. [0006] La linfoquina IL-9, denominada previamente "P40", es una molécula derivada de células T que se identificó originalmente como un factor que sostiene un crecimiento permanente independiente de antígenos de líneas celulares de T4. Véase, por ejemplo, Uyttenhove y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6934 (1988), y Van Snick y col., J. Exp. Med. 169: 363 (1989) y Simpson y col., Eur. J. Biochem. 183: 715 (1989). [0007] La actividad de IL-9 se observó por primera vez sobre líneas celulares de T4 restringidas, que no muestran actividad sobre CTL o células T recién aisladas. Véanse, por ejemplo, Uyttenhove y col., anteriormente, y Schmitt y col., Eur. J. Immunol. 19: 2167 (1989). Este intervalo de actividad se expandió cuando los experimentos demostraron que la IL-9 y la molécula denominada factor III de crecimiento de células T ("TCGF III") eran idénticas a la MEA (actividad que aumenta el crecimiento de mastocitos), un factor que potencia la respuesta proliferativa de mastocitos derivados de médula ósea a IL-3, como describe en Hültner y col., Eur. J. Immunol. y en la patente de EE.UU. Nº 5.164.317. También se encontró que la forma humana de la IL-9 estimula la proliferación de la leucemia megacarioblástica. Véase Yang y col., Blood 74: 1880 (1989). El trabajo sobre la IL-9 ha demostrado que también ayuda en la formación de colonias eritroides (Donahue y col., Blood 75(12): 2271-2275 (6-15-90)); promueve la proliferación de la formación de eritroides y mieloides (Williams y col., Blood 76: 306-311 (9-1-90); y ayuda en la maduración de clones de BFU-E de origen adulto y fetal (Holbrook y col., Blood 77(10): 2129-2134 (5-15-91)). La expresión de IL-9 se ha relacionado con la enfermedad de Hodgkins y con el linfoma anaplásico de células grandes (Merz y col., Blood 78(8): 1311-1317 (91-90)). Los análisis genéticos de ratones que eran susceptibles o resistentes al desarrollo de hiperrespuesta bronquial han desentrañado en este modelo una relación con el gen IL-9, así como una correlación entre la producción de IL-9 y la susceptibilidad (Nicolaides y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 13175-13180, 1997). Los estudios genéticos en seres humanos también apuntan a los genes IL-9 y IL-9R como candidatos para el asma (Doull y col., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 153, 1280-1284, 1996; Holroyd y col., Genomics 52, 233-235, 1998). Además, los ratones transgénicos en IL-9 permitieron la demostración de que un aumento en la expresión de IL-9 daba como resultado mastocitosis pulmonar, hipereosinofilia, hiperrespuesta bronquial y niveles elevados de IgE (Temann y col., J. Exp. Med. 188, 1307-1320, 1998; Godfraind y col., J. Immunol. 160, 3989-3996, 1998; McLane y col., Am. J. Resp. Cell. Mol. 19:713-720 (1999)). Tomadas en conjunto, estas observaciones sugieren poderosamente que la IL-9 desempeña un papel importante en esta enfermedad. Trabajos adicionales han implicado la IL-9 y muteínas de esta citocina en el asma y alergias. Véase, por ejemplo, los documentos WO 97/08321 (Levitt, y col.), y WO 98/24904 (Levitt, y col.). [0008] Se sabe que la IL-9 afecta a los niveles de otras moléculas en sujetos. Véanse, Louahed y col., J. Immunol. 154: 5061-5070 (1995); Demoulin y col., Mol. Cell. Biol. 16: 4710-4716 (1996). Se reconocerá que las moléculas afectadas tienen sus propias funciones en sistemas biológicos. Por ejemplo, Demoulin y col. demuestran que muchas de las actividades conocidas de la IL-9 están mediadas por la activación de factores de transcripción STAT. Como tal, hay un interés continuo en intentar identificar moléculas cuya presencia y/o niveles se vean afectado por otras moléculas, tales como las citocinas. [0009] La siguiente descripción describe esas moléculas. Se encontró que moléculas de ácidos nucleicos que codifican las proteínas de la invención se expresaban en presencia de IL-9, pero no en su ausencia. Por tanto, esas moléculas son, entre otros, "marcadores" de la expresión o el efecto de la IL-9 en un sujeto. Estas moléculas denominadas anteriormente factores inducibles derivados de células T o "TIF" ahora se denominan interleucina-21, o "IL-21". Éstas y otras características de la invención se apreciarán con la siguiente descripción. El documento WO 00/24578 describe el aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos descritas como factores inducibles derivados de células T (TIF) que están reguladas en exceso por la IL-9 y que inducen la activación de STAT en células. Dumoutier y col., J. Immunology (2000) 164:1814-1819 describen la clonación y caracterización de IL-TIF y demuestran que esto está inducido por la IL-9 en linfomas tímicos, células T y mastocitos y por lectinas en esplenocitos recién aislados. La proteína muestra una identidad en aminoácidos del 22% con la IL-10. El documento US 5.843.697 describe la preparación de células recombinantes que expresan el receptor de IL-10 y una proteína de transducción de señales de IL-10 recién identificada, CRFB4, que junto con IL-10R forma un complejo receptor de IL10 funcional. También se describe el uso de agonistas o antagonistas de IL-10. Kotenko y col., EMBO J. (1997) 16(19):5894-5903 describen la identificación y caracterización funcional de la cadena CRFB4 del receptor de IL-10. Gabay y col., New England J. Med. (1999) 340(6):448-454 revisan el estado de la técnica en lo que se refiere a la respuesta de fase aguda y describe que esto se manifiesta, en parte, por una producción incrementada de las proteínas de fase aguda. Lacki y col., Archivum Immunologiae et Therapiac Experimentalis (1995) 43:11-14 describen una investigación del efecto de la IL-10 sobre la respuesta de fase aguda y propone que la IL-10 puede reducir la producción de IL-6 y con ello se puede afectar indirectamente la respuesta de fase aguda en pacientes RA. DiSanto y col., Neuroimmunomodulation (1995) 2:149-154 describen la inhibición por IL-10 de la producción de TNF inducida por LPS in vivo e in vitro.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

Ejemplo 1 [0010] La línea celular de linfoma murino BW5147 es una línea celular muy conocida que puede crecer in vitro, sin necesidad de añadir ninguna citocina a su medio de cultivo. Para identificar genes inducidos por la IL-9, se cultivaron muestras de BW5147 con 200 U/ml, o sin IL-9, durante 24 horas. A continuación, se aisló el ARN total, usando lisis con isotiocianato de guanidina, y centrifugación en gradiente de CsCl. Estas técnicas son muy conocidas en la materia. Después de esto, el ARN poliadenilado se purificó a partir del ARN total, usando una columna de oligo(dT) celulosa. El ARN poliA aislado, se usó a continuación para generar un ADNc bicatenario. Se usó un cebador oligo(dT) disponible comercialmente. Se calentaron entre 3-5 μg de ARN poliA a 70°C durante 10 minutos con 1 μg de oligo(dT), y a continuación se incubaron con tampón de primera cadena 5x (HCl 250 mM (pH 8,3), KCl 375 mM, MgCl2 15 mM), ditiotreitol 10 mM, 500 μM de desoxinucleótidos trifosfatos, y 800 U de transcriptasa inversa. El volumen total de la mezcla de reacción fue de 20 μl, y la reacción se dejó proseguir a 37°C durante una hora. Esto dio como resultado la síntesis de la primera cadena de ADNc. La síntesis de la segunda cadena se consiguió con la adición de 30 μl de tampón de la segunda cadena 5x (Tris-HCl 100 mM (pH 6,9)), KCl 450 mM, MgCl2 23 mM, β-NAD+ 0,75 mM, (NH4)2SO4 50 mM, junto con 60 U de ADN polimerasa I derivada de E. coli, 2U de RNasa H de E. coli, 10 U de ADN ligasa de E. coli, y 250 μM de desoxinucleótidos trifosfatos, y se llevó hasta un volumen final de 150 μl. La mezcla se incubó durante dos horas, a 16°C. [0011] El producto se extrajo usando fenol-cloroformo, y se precipitó con etanol. El producto de ADNc final a continuación se resuspendió en 200 μl de TE. [0012] Estas etapas se llevaron a cabo tanto en las células BW5147 estimuladas (en adelante "probadora"), y para células BW5147 en paralelo sin estimular (en adelante "conductora"). Ejemplo 2 [0013] El ADNc preparado en el Ejemplo 1 a continuación se sometió a clonación por sustracción de acuerdo con procedimientos muy conocidos. Para hacer esto, se prepararon seis oligonucleótidos: 5'-AGCACTCTCC AGCCTCTCAC CGCA-3 (SEC ID Nº: 1); 5'-GATCTGCGGT GA-3' (SEC ID Nº: 2); 5'-ACCGACGTCG ACTATCCATG AACA-3' (SEC ID Nº: 3); 5'-GATCTGTTCA TG-3' (SEC ID Nº: 4); 5'-AGGCAACTGT GCTATCCGAG GGAA-3' (SEC ID Nº: 5); y 5'-GATCTTCCCT CG-3' (SEC ID Nº: 6). [0014] Estos se usaron como se explica en el presente documento. ADNc (2 μg) bicatenario, se digirió con la endonucleasa de restricción DpnII, se extrajo con fenolcloroformo, se precipitó con etanol, y se resuspendió en 20 μl de TE (Tris-HCl 10 mM (pH 7,5); EDTA 1 mM). Doce μl (1,2 μg), de ADNc cortado se ligó a las SEC ID NOS: 1 y 2 bicatenario, en una mezcla que incluía 4 μl de la SEC ID Nº: 1 (2 mg/ml) desalada, 4 μl de la SEC ID Nº: 2 (1 mg/ml) desalada, 10 μl de tampón adaptador 5X (Tris-HCl 330 mM, pH 7,6, MgCl2 50 mM, ATP 5 mM), 7 μl de DTT (100 mM), y 28 μl de H2O). Los oligonucleótidos se hibridaron entre sí y a la muestra de ADN calentando la mezcla a 50°C y a continuación enfriándola a 10°C durante una hora, seguido de la adición de 5 μl de la ADN ligasa de T4, y la incubación durante 12-14 horas, a 12-16°C. Las mezclas se diluyeron añadiendo 140 μl de TE. La PCR se llevó a cabo sobre muestras de 200 μl, como se describe a continuación.

Ejemplo 3 [0015] Para llevar a cabo la PCR, muestras de 200 μl que contienen 2 μl del producto de ligadura en un tampón de Tris-HCl 66 mM, pH 8,8, MgCl2 4 mM, (NH4)2SO4 16 mM, 33 μg/ml de BSA, 0,3 mM de cada dNTP (concentración: 500 μM), y 2 μg de la SEC ID Nº: 1 primero se calentaron a 72°C durante tres minutos para retirar cualquier resto de la SEC ID Nº: 2 que se hubiese hibridado al producto del Ejemplo 2. A continuación los extremos 3' se rellenaron usando 5 U de Taq polimerasa (5 minutos, 72°C). Se llevaron a cabo 20 ciclos de amplificación (1 ciclo: 1 minuto a 95°C, y tres minutos a 72°C), tras los cuales los productos se combinaron, se extrajeron con fenol, se precipitaron con etanol, y se resuspendieron en tampón TE, a una concentración de 0,5 μg/μl. En adelante, esto se denomina la representación. Ejemplo 4 [0016] A continuación se preparó la representación por hibridación sustractiva eliminando la SEC ID Nº: 1 de ella por digestión con DpnII. El resultado de la digestión se extrajo con fenol y se precipitó con etanol. En el caso de la muestra no estimulada, esto dio como resultado la conductora, mientras que la muestra estimulada dio como resultado la probadora. Las porciones de probadora (20 μg) se purificaron con gel sobre un gel de agarosa al 1,2% y se aislaron. Las muestras (2 μg) se ligaron a las SEC ID NOS: 3 y 4, de la misma forma en que se ligaron las SEC ID NOS: 1 y 2, como se ha descrito más arriba. [0017] En un primer ciclo de hibridación sustractiva, 0,4 μg de las muestras probadoras con las SEC ID NOS: 3 y 4 ligadas a ella se mezclaron con 40 μg del ADNc conductor. La mezcla se extrajo con fenol, se precipitó con etanol, se disolvió en 2 μl de tampón 3XEE (EPPS 30 mM pH 8,0), EDTA 3 mM; pH 8,0, EDTA 3 mM. Esto se recubrió con 30 μl de aceite mineral, y se desnaturalizó durante cinco minutos a 98°C. Se añadió una disolución de NaCl 5 M (0,5 μl), y el ADN se hibridó durante 20 horas, a 67°C. La mezcla de reacción se diluyó hasta 200 μl con TE, y ARNt portador. Las muestras se incubaron durante tres minutos a 72°C para separar la SEC ID Nº: 4, y a continuación se prepararon cuatro reacciones de PCR (200 μl). Éstas incluían 20 μl de mezcla de hibridación diluida sin cebador, para rellenar los extremos del probador rehibridado, seguido de 10 ciclos de amplificación después de añadir muestras de la SEC ID Nº: 3 (1 ciclo: 1 minuto a 95°C, tres minutos a 70°C) tras los cuales los productos se combinaron, se extrajo con fenol, se precipitó con etanol, y se resuspendió en 40 ml de tampón 0,2XTE. El ADN monocatenario se degradó mediante un tratamiento de 30 minutos de 20 μl de este material con 20 U de nucleasa de judía mungo, a un volumen total de 40 μl. Las muestras se diluyeron (1:5), en Tris-HCl 50 mM, a pH 8,9, seguido de calentamiento durante cinco minutos a 98°C para inactivar la enzima. Se llevó a cabo una segunda PCR, usando 20 μl del producto descrito anteriormente, 2 μl de la SEC ID Nº: 3 (1 mg/ml), y 1 μl (5 U) de ADN Taq polimerasa. Se llevaron a cabo un total de 18 ciclos (1 ciclo: 1 minuto a 95°C, tres minutos a 70°C). Los productos se combinaron, se extrajo con fenol, se precipitó con etanol, y se resuspendió a 0,5-1 μg/μl. El producto se denomina en adelante "DP1", o el primer producto diferenciado. Ejemplo 5 [0018] A continuación el DP1 se digirió con la endonucleasa DpnII, como se ha descrito anteriormente, y se ligó a las SEC ID NOS: 5 y 6, siguiendo los mismos procedimientos descritos para las SEC ID NOS: 1, 2, 3 y 4. Se repitieron la hibridación sustractiva y la amplificación selectiva, como se describe en el Ejemplo 4, y se generó un segundo producto diferenciado, o "DP2". En estos experimentos, el probador eran 50 ng de DP1. El conductor (40 μg) era como se ha descrito anteriormente. El proceso se repitió para generar un tercer producto diferenciado, usando las SEC ID NOS: 3 y 4 como adaptadores. Para generar el tercer producto, se mezclaron 100 pg de probador con 40 μg de conductor. Todas las etapas de los protocolos anteriores se repitieron, excepto la amplificación final que se llevó a cabo durante 22 ciclos, donde un ciclo corresponde a un minuto a 95°C, y tres minutos a 70°C. Esto dio el producto diferenciado final. Ejemplo 6 [0019] Los productos diferenciados finales se digirieron con DpnII, y a continuación se clonaron en el sitio BamHI de un vector disponible comercialmente, es decir, pTZ19R. Se prepararon plásmidos de ADN bicatenario, y a continuación se secuenciaron, usando procedimientos habituales. La secuencia se compararon con secuencias conocidas del GenBank y las bases de datos del EMBL, usando el programa de búsquedas BLAST. [0020] Al final de este procedimiento de sustracción, se identificó un fragmento de ADNc corto, es decir, un fragmento de una longitud de 200 pares de bases aproximadamente. Este fragmento se usó para seleccionar una librería de ADNc procedente de células BW 5147. Se secuenció el clon más largo. Esto se describe más adelante. No se corresponde con ninguna secuencia conocida. [0021] La secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 7), tiene una longitud de 1119 bases, incluyendo un marco de lectura abierto de 537 pares de bases, que codifica una proteína con una longitud de 179 aminoácidos. El peso molecular predicho de la proteína es de 20.093. Existen dos codones ATG adicionales que, si actuasen como codones de iniciación, producirían proteínas con una longitud de 172 y 167 aminoácidos, con pesos moleculares de 19.335 y 18.770 daltons, respectivamente. Cada forma de la proteína está caracterizada por una secuencia de aminoácidos hidrófobos que se escindirían de la molécula a través del retículo endoplasmático para dar una proteína madura. [0022] El análisis de la secuencia muestra tres motivos ricos en AT (TTATTTAT). Estos motivos se encuentran a menudo en regiones 5' sin traducir de citocinas y oncogenes. Kruys, y col., Science 245: 852 (1989), han demostrado que estas repeticiones modulan la estabilidad del ARNm. Ejemplo 7 [0023] El ADNc aislado y analizado en el Ejemplo 6, anteriormente, a continuación se usó como sonda para identificar ADN genómico para TIFα. [0024] Se seleccionó una librería genómica preparada a partir de la cepa de ratón 129 con la SEC ID Nº: 7, siguiendo procedimientos habituales. Un fragmento de EcoRI procedente de un clon positivo se subclonó en el plásmido pZERO y se secuenció parcialmente. La secuencia parcial se presenta como SEC ID Nº: 8. Ejemplo 8 [0025] También se subclonó un segundo fragmento EcoRI a partir del clon positivo descrito en el Ejemplo 7, anteriormente. Había un alto grado de homología, pero las secuencias no eran idénticas. Para ser específicos, el intrón 1 de esta secuencia era idéntico en un 98% a la SEC ID Nº: 8, el intrón 2 era un 100% idéntico y el intrón 3 era un 92% idéntico. [0026] Lo que es llamativo sobre las secuencias es que los promotores no son homólogos en absoluto, sugiriendo una regulación independiente. Las regiones 5' sin traducir son idénticas en un 92%. El primer exón para TIFα se separa en el exón 1α y el exón 1β. El primer exón codificante (que es el exón 1b para TIFα y el exón 1 para TIFβ) son idénticos en un 99,5%, mientras que los segundos exones son idénticos en un 100%, los terceros exones son idénticos en un 97%, los cuartos exones son idénticos en un 98,5%, y en un 96% para el quinto exón. En la región 3' sin traducir, la homología es del 96%. Ejemplo 9 [0027] Usando la información descrita en el Ejemplo 8, anteriormente, se dedujo una secuencia de ADNc para el segundo clon, denominado TIFβ, y se expresó como SEC ID Nº: 9. También se valoró la secuencia de ADN genómico, de la misma manera que se ha descrito anteriormente, y se expresa como SEC ID Nº: 42. La secuencia de aminoácidos es la SEC ID Nº: 41. [0028] Comparado con la región codificante para TIFα, la de TIFβ tiene seis cambios silenciosos. Hay dos cambios que dan como resultado un cambio de aminoácidos sin consecuencias (en ambas posiciones 36 y 103, la Val en TIFα se convierte en Ile en TIFβ). También hay un cambio más significativo, en la posición 112, en la que la Gln se convierte en Arg. Ejemplo 10 [0029] Se llevaron a cabo experimentos para estudiar la expresión de los TIF. Las células BW 5147 se estimularon con IL-9 murina recombinante (200 U/ml), durante periodos variables de tiempo (0,2, 0,5, 1, 2 y 24 horas). A continuación se aisló el ARN total, usando procedimientos y reactivos habituales. A continuación se llevó a cabo la transcripción inversa, usando 5 μg del ARN total y un cebador de oligo(dT). Las muestras de ADNc que corresponden a 20 ng de ARN total a continuación se amplificaron durante 25 ciclos usando diferentes cebadores. (Un ciclo corresponde a 4 minutos a 94°C, 1 minuto a 57°C, y 2 minutos a 72°C). Los cebadores TIF fueron: 5'-CTGCCTGCTT CTCATTGCCC T-3' (SEC ID Nº: 10) y 5-CAAGTCTACC TCTGGTCTCA T-3' (SEC ID Nº: 11) (sentido directo y contrario, respectivamente). [0030] Esto corresponde a los nucleótidos 107-127, y 766-786 de la SEC ID Nº: 7, respectivamente. Como control, también se amplificó β-actina, durante 18 ciclos (primer ciclo: 4 minutos a 94°C, 1 minuto a 60°C, 2 minutos a 72°C. Los siguientes ciclos fueron 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 60°C, 2 minutos a 72°C). [0031] Después de la amplificación, los productos obtenidos de la PCR se analizaron sobre un gel de agarosa al 1%, y se confirmó la amplificación específica, seguido de transferencia, usando sondas radiactivas internas. La sonda para el TIF fue: 5'-GACGCAAGCA TTTCTCAGAG-3' (SEC ID Nº: 12) las condiciones y las sondas expuestas no eran específicas para una u otra forma del TIF; no obstante, el producto de amplificación del TIFα contiene un sitio de restricción KpnI, mientras que el sitio de restricción para el TIFβ no lo contiene. La digestión de los productos de amplificación con KpnI indicaba que la mayoría, sino todo, el ARNm del TIF inducido por IL-9 era TIFα, lo que sugiere que la expresión de TIFα se indujo rápidamente a través de la IL-9. El ARNm para el TIFα fue detectable después de 30 minutos de estimulación, y alcanzó una meseta durante un período de tiempo de 1-24 horas. Ejemplo 11 [0032] A continuación se llevaron a cabo experimentos que muestran que la inducción de ARNm del TIF por IL-9, descrita más arriba, no requiere la síntesis de proteínas. En estos experimentos, se extrajo el ARN total de células estimuladas durante 24 horas, como se describe en el Ejemplo 10, pero con o sin 10 μg/ml de un inhibidor de la síntesis de proteínas, la cicloheximida, durante 4,5 horas. En un grupo de experimentos en paralelo, las células no se estimularon. Se extrajo el ARN total, y la amplificación por RT-PCR se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 10. Los productos obtenidos de la PCR se analizaron sobre un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. Lo que se observó fue que la inducción por IL-9 aún se producía cuando la síntesis de proteínas estaba bloqueada. Por tanto, el efecto de la IL-9 es un efecto directo, que no requiera la síntesis de un mediador proteico.

Ejemplo 12 [0033] En estos experimentos se estudió el papel de las proteínas STAT en la inducción del ARNm del TIF sobre derivados de la línea celular BW5147. La primera línea, BWh9R, expresa receptores de IL-9 humana de tipo silvestre. La línea BWPhe116 es un transfectante con una mutación sencilla (en la posición 116), que hace que el receptor sea incapaz de activar los factores de transcripción STAT. Otra línea celular más, la BW-mut6, tiene una mutación que hace que el receptor sea incapaz de activar la STAT5, mientras retiene la capacidad para activar la STAT1 y la STAT3. Finalmente, la línea celular BW-mut7 tiene una mutación sencilla que hace que el receptor de la IL-9 sea incapaz de activar la STAT1 y la STAT3, pero que retiene la capacidad de activar la STAT5. [0034] La estimulación celular, el aislamiento del ARN total, la transcripción inversa y la amplificación del ADNc se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 10 (las células se estimularon durante 24 horas. Se usó IL-9 recombinante tanto humana como murina). Los productos de la PCR se analizaron sobre un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio, como se ha descrito anteriormente. [0035] El análisis reveló que la IL-9 humana no inducía la expresión en BWPhe116, lo que sugiere que están implicados factores de transcripción STAT. Se encontró que la IL-9 inducía la expresión del TIF en el mutante BW-mut6, pero no en la variante mut7, lo que sugiere que están involucradas las STAT1 o STAT3, pero no la STAT5.

Ejemplo 13 [0036] A continuación se estudió la expresión del ARNm del TIF en células normales de bazo de ratón. [0037] Se cultivaron células de bazo procedentes de ratones Balb/c de 10-12 semanas de edad durante 24 horas en medio de control o en medio de control suplementado con 20 μg/ml de LPS (que activa los linfocitos B y los macrófagos), o ConA (que activa las células T), o ConA más el 1% de un antisuero de bloqueo contra IL-9 murina, usando β-actina como control. La purificación del ARN y el análisis por RT-PCR se llevaron a cabo como se ha descrito anteriormente. [0038] Los datos indican que el TIF se expresa, en el mejor de los casos, muy débilmente en células de bazo en reposo, no inducidas por el LPS, pero son fuertemente inducidas por ConA. El antisuero anti-IL-9 no afectó a la inducción por ConA, lo que sugiere que su efecto no está mediado por IL-9, o está mediado por otras citocinas. [0039] Cuando las células de bazo activadas por ConA se analizaron usando secuencias de los productos de la RT-PCR, se encontró que estas células estaban expresando predominante, o exclusivamente TIFα. Ejemplo 14 [0040] Experimentos adicionales demostraron que el ARNm del TIF se expresaba incluso en ausencia de inducción por IL-9. [0041] Células de bazo procedentes de ratones FVB de 5 semanas de edad se enriquecieron en células T, usando una columna de lana de nailon. A continuación, las células se estimularon durante 24 horas en medio suplementado con ConA (un activador de células T), o PMA (que activa el PKC en la mayoría de las células), ya sea con o sin IL-9. [0042] El ARN total se aisló usando técnicas habituales, y a continuación muestras de 10 μg se fraccionaron mediante electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,3% que contiene formaldehído 2,2 M. A continuación las fracciones se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, se marcaron, y se sometieron a un ensayo de hibridación siguiendo a Van Snick, y col., J. Exp. Med. 169: 363 (1989), incorporado por referencia. [0043] Los resultados indican que la inducción del TIF mediante ConA no se modificó, y que la IL-9 no indujo el ARNm del TIF en células de bazo activadas con PMA. Ejemplo 15 [0044] Se probó la expresión del ARNm del TIF en diversas líneas celulares. En estos experimentos, líneas celulares murinas se estimularon durante al menos un día, con una citocina particular. Específicamente, la 9T7 es un linfoma de células T, que responde a la IL-2, IL-4 o IL-9. Las líneas celulares TS3 y TS6 proceden de clones de células T ayudantes, y proliferan en presencia de IL-2 o IL-9. La MC9 y LI38 son líneas de mastocitos, que proliferan en presencia de IL-3 o IL-9. [0045] Después de la estimulación, se preparó ARN total usando lisados con isotiocianato de guanidina habitual, y centrifugación en gradiente de CsCl. [0046] A continuación se analizó la línea 9T7 por transferencia Northern, como se describe en el Ejemplo 14, mientras que las otras líneas se sometieron a ensayo usando análisis RT-PCR, como se ha descrito anteriormente. [0047] Se encontró que la IL-9 regula en exceso la expresión del TIF en células T ayudantes y mastocitos, mientras que la IL-2 y la IL-3 no. No obstante, la línea celular 9T7 mostró prácticamente el mismo nivel de expresión, independientemente de la citocina, lo que indica que la IL-9 no es imprescindible para la expresión del TIF. Ejemplo 16 [0048] A continuación se estudió la expresión del ARNm del TIF en líneas de células B. Las líneas celulares A20, 70Z/3, y BCL-1 son líneas celulares de leucemia de células B que crecen, in vitro, sin citocinas. Estas células se estimularon durante 24 horas con IL-4 e IL-9 y el ARN total se aisló usando procedimientos habituales. La expresión se analizó mediante RT-PCR que se llevó a cabo durante 35 ciclos, seguido por transferencia e hibridación, como se ha descrito anteriormente. [0049] Los resultados indican que la expresión del TIF es detectable en células B, pero en el mejor de los casos se regula débilmente hacia arriba en presencia de IL-9 e IL-4. Ejemplo 17 [0050] A continuación se llevaron a cabo experimentos para estudiar la expresión de las moléculas de la invención en líneas de células T ayudantes. Las TS2 y TS1 son líneas de células T ayudantes conocidas, procedentes de clones de células T ayudantes, que proliferan en presencia de IL-9 o IL-2 (TS2), y cualquiera de IL-9 o IL-4 (TS1). Específicamente, las células TS1 o TS2 se crecieron en presencia de las citocinas listadas durante al menos 10 días, tras los cuales el ARN se extrajo usando procedimientos conocidos. La expresión de las moléculas se estudió mediante la RTPCR (35 ciclos), usando los protocolos descritos anteriormente. En las células TS1 tanto la IL-4 como la IL-9 inducen la expresión del TIF, pero la IL-2 no lo hace en células TS2. Ejemplo 18 [0051] Se estudió la expresión del ARNm del TIF en diversos órganos de ratón. El ARN total se preparó a partir de hígado, riñón, corazón, cerebro, intestino, bazo, timo, pulmón, músculo y médula ósea, usando las metodologías habituales con isotiocianato de guanidina y centrifugación en gradiente de CsCl. Se llevaron a cabo 40 ciclos de RT-PCR, usando los protocolos descritos anteriormente. La expresión más fuerte se encontró en el tejido del timo, mientras que se encontraron señales menos intensas en tejido de cerebro, y la expresión más débil en los tejidos restantes. Ejemplo 19 [0052] Los siguientes experimentos describen la producción del TIFα en células 293-EBNA. [0053] El ADN complementario para el TIFα se ha descrito anteriormente. Se subclonó en un vector de expresión pCEP-4 disponible comercialmente, en una unión operable con el promotor del CMV. Los plásmidos resultantes se transfectaron en células 293-EBNA, usando procedimientos de lipofectamina habituales. Después de la transfección, las células se incubaron en medio exento de metionina, suplementado con metionina marcada con 35S, durante 24 horas. Se recogió el sobrenadante, y se corrió sobre un gel de acrilamida, seguido de electroforesis. A continuación el gel se secó y se expuso a autorradiografía durante un día. A continuación se corrió un control transfectando células con el mismo plásmido, en el que el ADNc se clonó en la dirección sentido contrario. [0054] Se encontró una banda heterogénea de 25-30 kilodaltons aproximadamente procedente de las células transfectadas con TIF en la dirección sentido. Cualquier discrepancia entre el peso molecular predicho, el peso molecular real en el sistema, y la heterogenicidad, se puede atribuir a la glicosilación. En una serie de experimentos paralelos, se expresó ADNc que codifica TIF humano de la misma forma que se expresó el ADNc murino. Con la excepción del cambio del ADNc, todos los parámetros experimentales eran idénticos. Ejemplo 20 [0055] Se llevaron a cabo experimentos adicionales para estudiar la producción de TIFα en células COS. Específicamente, se subclonó ADNc de TIFα en el plásmido pEF-BOS.puro descrito por Demoulin y col., anteriormente, en unión operable con el promotor EF-1α. El ADNc plasmídico se transfectó en células COS, usando el mismo procedimiento de lipofectamina descrito anteriormente. Las células se incubaron en medio exento de metionina, se suplementaron con metionina 35S durante 24 horas, tras las cuales el sobrenadante se trató como se ha descrito en el Ejemplo 19, anteriormente. De nuevo, se observó una banda heterogénea de 25-30 kilodaltons, así como una banda de 18 kilodaltons, que probablemente representa una forma no glicosilada de la molécula. Ejemplo 21 [0056] En estos experimentos, se descubrió que el TIF induce la activación de STAT en células mesangiales, de melanoma neuronal y de hepatoma. Es sabido que cuando las citocinas activan los factores STAT, los factores dimerizan, se trasladan del citoplasma al núcleo, y se unen a secuencias diana en los promotores. Los detalles de los experimentos son los siguientes. [0057] Se usaron células 293-EBNA transfectadas como se ha descrito anteriormente después de la incubación en medio normal durante 48 horas, al igual que el sobrenadante procedente de los controles, también descrito anteriormente. Se usaron las muestras de una línea celular mesangial de riñón de ratón ("MES13" en adelante), una línea celular de feocromocitoma de rata ("PC12" en adelante), cuatro melanomas humanos diferentes (SK23, AUMA, NA-8mel y MULL), hepatoma humano (HepG3) y hepatoma de rata (H-4-II-K). Las muestras celulares (0,5 x 106) se estimularon durante 5-10 minutos en presencia del 1% de sobrenadante. A continuación se prepararon extractos nucleares, de acuerdo con Demoulin y col., Mol. Cell. Biol. 16: 4710 (1996), incorporado por referencia. Resumiendo, las células se lavaron con PBS y a continuación se resuspendieron en 1 ml de tampón hipotónico enfriado en hielo durante 15 minutos. (El tampón era tampón HEPES 10 mM, pH 7,5, con KCl 10 mM, MgCl2 1 mM, 5% de glicerol, EDTA 0,5 mM, EGTA 0,1 mM, ditiotreitol 0,5 mM, y Pefabloc 1 mM, Na3V4 1 mM, y NaF 5 mM). A continuación las células se lisaron añadiendo 65 μl de NP-40, seguido del paso por el vortex. Los núcleos se sedimentaron, pasándolos por el vortex durante 30 segundos a 14.000 rpm, seguido de la extracción en tampón suplementado con HEPES (20 mM), glicerol (20%), y NaCl (420 mM). Los restos nucleares se eliminaron por centrifugación durante 2 minutos. La actividad de unión del ADN se determinó de acuerdo con Demoulin y col., anteriormente, usando un oligonucleótido bicatenario marcado con 32P denominado "GRR", que contiene el sitio de unión STAT del promotor del gen PcγRI, es decir: 5'ATGTATTTCC CAGAAA-3' (SEC ID Nº: 13) y 5'-CCTTTTCTGG GAAATAC-3' (SEC ID Nº: 14) correspondientes a las hebras superior e inferior de los sitios de unión en la sonda GRR. En resumen, un volumen de 5 μl de extractos nucleares se incubó en tampón de unión (HEPES 12 mM, pH 7,6, KCl 10 mM, EDTA 0,5 mM, 2,5% de glicerol, 0,1 mg de poli(dI-dC) por ml) durante 5 minutos. Se añadió la sonda GRR radiomarcada (105 cpm; 0,5 ng aproximadamente), y se prosiguió con la incubación durante 25 minutos antes de cargarla sobre un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. [0058] También se notó que los complejos observados en células MES13, descritos anteriormente, fueron parcialmente sobrevalorados por ambos anticuerpos anti-STAT5 y anti-STAT3, demostrando que (i) las células en observación eran dianas para el TIF, y (ii) que STAT3 y STAT5 son componentes principales del complejo activado por el TIF. La diferencia en el perfil STAT, comparado con el perfil del Ejemplo 12, anteriormente, es atribuible a la diferencia en la fuente de células (ser humano frente a ratón). También se observó que el TIF humano funciona sobre células murinas, y viceversa. Ejemplo 22 [0059] Este ejemplo detalla el aislamiento y la clonación de una molécula de ácidos nucleicos que codifica el TIF humano. En primer lugar, se prepararon células mononucleares de sangre periférica humana mediante la centrifugación en gradiente de densidad habitual. Después de esta preparación, las muestras se cultivaron durante 24 horas, a 3 x 106 células/ml, con o sin anticuerpo monoclonal dirigido contra CD3 (el anticuerpo era el anticuerpo disponible comercialmente mAb OKT3, usado en forma de ascitos fluidos a una dilución de 1/500). Se usó este anticuerpo debido a que las citocinas derivadas de células T generalmente sólo se expresan tras la activación mediante, por ejemplo, anticuerpos específicos CD3. [0060] Se aisló el ARN total a partir de estas células, usando técnicas de ultra centrifugación habituales con isotiocianato de guanidina/CsCl. Después del aislamiento, muestras de 10 μg del ARN se sometieron a la trascripción inversa usando un cebador oligo(dT)15. [0061] Después de la preparación de ADNc, como se ha resumido anteriormente, se amplificaron muestras que correspondían a 100 ng de ARN total, a través de la PCR, usando los siguientes cebadores: 5' -AGGTGCTGAA CTTCACCCTG GA -3' (SEC ID Nº: 15) 5' -CCACTCTCTC CAAGCTTTTT CA -3' (SEC ID Nº: 16) que se basan en una secuencia de ADNc murino, (es decir, SEC ID Nº: 7). Las condiciones de la PCR suponían 30 ciclos de amplificación, con un ciclo definido como 1 minuto a 94°C, seguido de 1 minuto a 42°C, y a continuación 2 minutos a 72°C. El producto de amplificación se separó en un gel de agarosa, usando procedimientos habituales, y a continuación se secuenció. El resultado indicaba que se habían amplificado fragmentos del ADNc. Por tanto, se llevó a cabo una segunda reacción, usando los mismos materiales, excepto que la SEC ID Nº: 16 se sustituyó por SEC ID Nº: 17, es decir: 5' -CAAGTCTACC TCTGGTCTCA T-3' [0062] Esta reacción de PCR se llevó a cabo durante 25 ciclos, con un ciclo que se define como 1 minuto a 94°C, seguido de 1 minuto a 45°C, y a continuación 2 minutos a 72°C. El producto de amplificación se sometió a las mismas etapas que el primero. Se amplificó un fragmento de 418 nucleótidos, que se encontró en células estimuladas con anticuerpo dirigido contra CD3, pero no en PBMCs en reposo. Este fragmento de secuencias de nucleótidos se expresa como SEC. ID Nº: 18. Ejemplo 23 [0063] Después de la preparación del producto de amplificación, se aisló el extremo 5' del ADNc usando técnicas 5'-RACE habituales. Resumiendo, la primera hebra del ADNc se preparó usando la SEC ID Nº: 19 como cebador, es decir: 5' -TGGCCAGGAA GGGCACCACC T -3' [0064] Este cebador se basa en la información de secuencia obtenida de acuerdo con el ejemplo 22. Resumiendo, el procedimiento del 5'-RACE se llevó a cabo combinando 1 μg de ARN total, preparado como se describe anteriormente, 2,5 pmoles de la SEC ID Nº: 19, transcriptasa inversa, tampón de la transcriptasa inversa, 2,5 μl de mezcla de dNTP (10 mM), 2,5 μl de MgCl2 (25 mM), y 2,5 μl de ditiotreitol (0,1 M). La reacción se llevó a cabo y, después de completarse, el ARN original se eliminó mediante la adición de Rnasa H, y Rnasa TI. Todos los dNTPs no incorporados, así como los cebadores y proteínas, se eliminaron. El ADNc se extendió en sus extremos usando la transferasa terminal o "TdT". Esta enzima crea un sitio de unión en 3' para el cebador de anclaje acortado, como se describe a continuación. La extensión de los extremos se llevó a cabo combinando la primera hebra de ADNc purificada, TdT, tampón (Tris-HCl 10 mM, KCl 25 mM, MgCl2 1,5 mM), y 200 μM de dCTP. [0065] Después de la reacción de extensión de los extremos, se llevó a cabo una PCR usando: 5' -CCTATCAGAT TGAGGGAACA G -3' (SEC ID Nº: 20) y el cebador de anclaje acortado 5'-RACE: 5' -GGCCACGCGT CGACTAGTAC GGGIIGGGIIGGGIIG -3' (SEC ID Nº: 21).

[0066] La amplificación supuso 35 ciclos (1 ciclo se define como 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 56°C, y 2 minutos a 72°C). Después de esto, se realizó una amplificación anidada sobre 5 μl de una dilución 1/100 del producto de amplificación, usando la SEC ID Nº: 20 y el cebador de amplificación universal acortado: 5' -GGCCACGCGT CGACTAGTAC -3' (SEC ID Nº: 22). [0067] La amplificación supuso 30 ciclos (1 ciclo que se define como 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 56°C, y 2 minutos a 72°C). El producto resultante de la PCR se clonó, siguiendo procedimientos habituales, y se secuenció. [0068] Estos tres protocolos, es decir, los dos experimentos descritos anteriormente que generan fragmentos, y la PCR 5'-RACE, también descrita anteriormente, permitieron el alineamiento del producto de amplificación secuenciado, para generar la secuencia completa. [0069] Después del alineamiento, se generaron oligonucleótidos que flanqueaban el marco de lectura abierto deducido, es decir: 5' -CCTTCCCCAG TCACCAGTTG -3' (SEC ID Nº: 23) y 5' -TAATTGTTAT TCTTAGCAGG -3' (SEC ID Nº: 24). Estos cebadores se usaron para amplificar el marco de lectura abierto completo, usando ARNm procedente de células estimuladas con mAb específico de CD3, como se ha descrito anteriormente. Para la amplificación, 25 ciclos (1 ciclo que se define como 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 56°C, y 2 minutos a 72°C). [0070] La secuencia completa del ADNc humano se expresa en la SEC ID Nº: 25. Contiene un ORF de 537 pares de bases que codifica una proteína de 179 aminoácidos. Esta es la misma longitud que la proteína murina. La proteína humana tiene una homología de aminoácidos del 79% con la proteína murina, y una homología del 25% con la IL-10. Las proteínas humana y murina se expresan como las SEC ID NOS: 43 y 40, respectivamente. Ejemplo 24 [0071] Estos experimentos detallan el trabajo sobre el aislamiento del ADN genómico humano correspondiente al ADNc descrito anteriormente. [0072] Basándose en las secuencias de ADNc, se desarrollaron cebadores que corresponden a los nucleótidos 51-70 y el complemento de los nucleótidos 631-650 de la SEC ID Nº: 25. Se llevó a cabo la PCR, usando la metodología habitual. Específicamente, como molde se usaron 100 ng de ADN genómico obtenido de células CESS (una línea celular linfoblastoide transformada con el EBV), y se llevaron a cabo 33 ciclos de amplificación (un ciclo de amplificación que se define como 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 30 segundos, y 72°C durante 5 minutos). Una vez se hubo aislado una secuencia, se secuenció, y ésta se expresa como SEC ID Nº: 26. La secuencia tiene una longitud de 4,8 kilobases aproximadamente, y se cree que contiene la secuencia genómica completa que codifica la molécula del TIF, que carece solamente de la región flanqueante 5', el promotor, y el extremo 3'. Los análisis indican que contiene 6 exones y 5 intrones, al igual que la secuencia genómica murina. [0073] Se llevó a cabo una hibridación de transferencia Southern, usando procedimientos habituales. Mostró que el genoma solamente contiene una única copia del gen TIF. Ejemplo 25 [0074] Era interesante identificar dónde estaba localizado el ADN genómico descrito anteriormente dentro del genoma humano. Para conseguir esto, se adoptaron dos aproximaciones diferentes. En la primera, la secuencia descrita anteriormente, es decir, la SEC ID Nº: 26, se marcó con un marcador fluorescente, y a continuación se usó para sondear el genoma humano a través de hibridación fluorescente in situ ("FISH") usando procedimientos habituales. [0075] En una segunda aproximación, se seleccionó un plantel de clones híbridos radiactivos usando la sonda constituida por los nucleótidos 51-70 de la SEC ID Nº: 25, y 5'-ATCAGATGGA TTACTGAATG-3' (SEC ID Nº: 27). Se llevó a cabo la PCR usando 25 ng de ADN genómico como molde, durante 35 ciclos, donde un ciclo se define como 94°C durante 1 minuto, 55° C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos. [0076] Ambas metodologías indicaban que el gen está localizado en el cromosoma 12q15. Algún trabajo relaciona enfermedades asociadas al asma con este sitio. Véase, por ejemplo, Nat. Genet. 15:389-392 (1997); Ober, y col., Hum. Mol Genet. 7(9):1393-1398(1998); Nickel, y col., Genomic 46(1):159-162(1997); Takahashi, y col., Genomics 44(1):150-2(1997); Barnes, y col., Genomics 37(1):41-50(1996), todos ellos incorporados por referencia. [0077] Se consultaron bases de datos públicas para determinar si alguna parte de las secuencias estaba presente en éstas. El último exón del TIF se encontró en un clon BAC, procedente del cromosoma 12q15. (Número de acceso: AC007458; 191.111 pares de bases, BAC RDCI11-444B24). La identificación del último exón en este clon sugiere que el gen TIF está localizado a 90 kilobases aproximadamente del gen IFN, y a menos de 30 kilobases de un gen denominado AK155, que es una citocina relacionada con la IL-10 (Knappe, y col., J. Virol 74:3881-3887 (2000)). Ejemplo 26 [0078] Estos experimentos describen la preparación de anticuerpos que se unen a la proteína TIF. Para prepararlos, se acopló un péptido constituido por los aminoácidos 40-61 codificados por la SEC ID Nº: 7 a la proteína portadora KLH, usando procedimientos habituales y una relación de 1 mg de péptido por 1 mg de proteína portadora. Los animales objeto (conejos), fueron inmunizados 3 veces, en intervalos de dos semanas, con 150 μg del complejo. El inmunógeno se emulsionó en adyuvante completo de Freund para la primera inyección, y a continuación con adyuvante incompleto de Freund para las dos siguientes. [0079] Se llevó a cabo una primera sangría un mes después de la última inyección, y se preparó suero, siguiendo procedimientos conocidos. [0080] A continuación el suero se probó en una transferencia de Western estándar. Resumiendo, 10 μl de sobrenadante procedente de células transfectadas con la SEC ID Nº: 7 o la SEC ID Nº: 25 se separaron mediante electroforesis SDS-PAGE, y a continuación se transfirieron sobre membranas de PVDF. El antisuero se diluyó a 1:500, y se usó en un protocolo de transferencia Western estándar, junto con anticuerpo anti-conejo como anticuerpo secundario, y un kit de detección disponible comercialmente. [0081] Se encontró que, de hecho, el suero reconocía la proteína TIF. Ejemplo 27 [0082] Este ejemplo describe experimentos llevados a cabo para identificar líneas celulares que responden al TIF humano. Células de riñón embrionario humano HEK293-EBNA, descritas anteriormente, se sembraron en placas de 6 pocillos, a 3 x 105 células/pocillo un día antes de la transfección. Se transfectaron con 2 μg de plásmido pCEP-4 que contenía ADNc para TIF humano, bajo el promotor del CMV. Las células se incubaron después de la transfección, en 1,5 ml de medio normal, durante 3 días, para maximizar la producción de TIF humano recombinante. [0083] Se propuso la hipótesis de que el TIF humano induciría la activación de los factores de transcripción STAT de la misma forma que lo hacía el factor murino. Se siguió el protocolo del ejemplo 21, más arriba. Se llevaron a cabo sobrevaloraciones añadiendo anticuerpos dirigidos contra STAT (0,75 μg de anti-STAT 1, 1 μg de anti-STAT 3, o 1 μg de anti-STAT 5b), a mezclas de extractos nucleares y sondas de ADN marcadas, y se incubó. [0084] Se observó un desplazamiento de las bandas inducido por el TIF cuando se usó la línea celular de hepatoma HepG2. Los anticuerpos descritos anteriormente se usaron para caracterizar la respuesta en profundidad. Los anticuerpos dirigidos contra STAT-3 desplazaron la mayoría de los complejos de retardo, aunque el resto de complejos débiles fueron sobrevalorados por anticuerpos dirigidos contra STAT-1. Los anticuerpos dirigidos contra STAT-5 no tuvieron ningún efecto. Esto indica que el STAT-3 y, en un menor grado, el STAT-1 son los factores de transcripción principales activados por el TIF. Estos resultados también se obtuvieron usando la línea celular de hepatoma humano HepG3, y también la línea celular de hepatoma H4IIE. Ejemplo 28 [0085] Este ejemplo describe experimentos diseñados para medir la activación de STAT por medio de un gen informador. El informador era "GRR5". Éste contiene 5 copias de la secuencia presentada en el Ejemplo 21, aguas arriba de un gel de la luciferasa bajo el control del promotor TK. El control era el vector pRL-TK, que contiene el gen de la luciferasa de remilla, bajo el control del promotor TK. [0086] El ensayo se llevó a cabo combinando 106 células de HepG2 con 15 μg de GRR5, y 1 μg de Prl-TK (250V, 74Ω, 1200 μF). El conjunto de transfectantes se dividió en placas de 24 pocillos (42.000 células/pocillo). [0087] Después de 1 hora, las células se estimularon con TIF humano (sobrenadante de las células HEK293 al 1%) con 300 U/ml de IL-6 humana, sobrenadante al 1% procedente de células HEK293 transfectadas con un vector vacío,

o medio solo. [0088] Después de dos horas, las células sedimentaron, y se lisaron. La actividad luciferasa se controló usando metodologías habituales. Los resultados indican que la estimulación con la molécula de la invención incrementa la actividad transcripcional de un promotor que incluye los sitios de unión a STAT. Ejemplo 29 [0089] Se sabe que la activación de STAT-3 por citocinas de tipo IL-6 da como resultado la inducción de proteínas de fase aguda en células de hepatoma. Para determinar si el TIF ejercía la misma actividad, 5 x 106 células de HepG2 se estimularon durante 2, 13, o 24 horas, con sobrenadante al 1% procedente de células HEK293-EBNA infectadas transitoriamente. En algunos experimentos se usó el inhibidor de la síntesis de proteínas cicloheximida a una concentración de 10 μg/ml, y se combinó con las células y el sobrenadante. Después de la estimulación, el ARN total se aisló usando procedimientos habituales, y se llevó a cabo la transcripción inversa sobre muestras de 10 μg de ARN total, usando un cebador oligo(dT). A continuación, se amplificó ADNc correspondiente a 20 ng de ARN, durante 18 ciclos, con cebadores específicos para el amiloide A sérico humano ("SAA"), es decir: agctcagcta cagcacagat (sentido directo, SEC ID Nº: 28) cctgccccat ttattggcag (sentido contrario, SEC ID Nº: 29) antiquimotripsina α1 humana: tgtcctctgc caccctaaca (sentido, SEC ID Nº: 30) taattcacca ggaccatcat (sentido contrario, SEC ID Nº: 31) para la haptoglobina humana: gtggactcag gcaatgatgt (sentido, SEC ID Nº: 32) acatagagtgt taaagtggg (sentido contrario, SEC ID Nº: 33) y para la β-actina humana: gctggaaggt ggacagcgag (sentido, SEC ID Nº: 34) tggcatcgtg atggactccg (sentido contrario, SEC ID Nº: 35). Para el SAA, la Tm era de 54°C, mientras que para la antiquimotripsina α1 y la haptoglobina humanas era de 52°C, y de 56°C para la β-actina. Los productos de la PCR se analizaron en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio, usando procedimientos habituales. [0090] Los resultados indicaban que el TIF inducía fuertemente el SAA y la quimotripsina α1 y, en un menor grado, la haptoglobina. Para determinar si el TIF regula directamente hacia arriba el SAA, o si es necesaria la síntesis de proteínas, se estimularon células HEPG2, como se ha descrito, en presencia de cicloheximida. La expresión de SAA no se vio afectada, lo que indica que la síntesis de proteínas no era necesaria para la actividad TIF. Ejemplo 30 [0091] Los resultados, más arriba, muestran que el TIF y la IL-6 parecen tener actividades similares sobre reactivos de fase aguda. Puesto que la actividad IL-6 está mediada a través de gp 130, se llevaron a cabo experimentos para determinar si la actividad TIF está mediada también a través de gp 130. [0092] Para determinar si éste era el caso, células HepG2 se transfectaron con un informador luciferasa, como se ha descrito anteriormente, y a continuación se estimularon con TIF o IL-6, en presencia de anticuerpos policlonales anti-gp 130 de los que se había determinado previamente que bloquean la actividad de citocinas que interaccionan con gp 130. [0093] Los resultados indicaban que los anticuerpos policlonales sólo bloqueaban la actividad IL-6. [0094] Se llevaron a cabo experimentos paralelos para determinar si estaba implicada la cadena β del IL-10R. En presencia de anticuerpos anti-IL-10R β, la actividad TIF se bloqueó completamente mientras que la actividad IL-6 permaneció inalterada. Se observó el mismo efecto con el ensayo para la expresión de SAA. Ejemplo 31 [0095] Estos experimentos se diseñaron para determinar la capacidad de TIF para regular las proteínas de fase aguda in vivo. [0096] Se inyectaron cantidades variables de TIF murino recombinante (50, 12,5, 3,2, 0,8 o 0,2 μg), intraperitonealmente, en ratones hembra C3H/HeJ resistentes a endotoxina (10-12 semanas de edad). Seis horas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados, con la excepción de los ratones que habían recibido 50 μg de TIF, que se sacrificaron después de 1, 3, 6, 12, o 24 horas. Se extrajeron los hígados y se congelaron directamente en nitrógeno líquido. A continuación se extrajo el ARN total, usando procedimientos habituales, tras los cuales se fraccionaron 10 μg de muestras de ARN total sobre un gel de agarosa al 1,3% que contenía 2,2 ml/litro de formaldehído. A continuación las muestras se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. [0097] Se prepararon sondas de SAA murino, usando un kit de marcaje comercial. El ensayo de hibridación se llevó a cabo de acuerdo con Van Snick, y col., J. Exp. Med 169:363-368 (1989), incorporado por referencia. La propia sonda se obtuvo mediante PCR, como se ha descrito anteriormente, usando ADNc procedente de hígado murino, aislado como se ha descrito anteriormente. Los cebadores usados para la preparación de la sonda fueron: tctgctccct gctcctggga (sentido, SEC ID Nº: 36) y tccaggaggt ctgtagtaat (sentido contrario, SEC ID Nº: 37) Los resultados indicaban que la dosis más elevada del TIF murino (50 μg), inducía la expresión de SAA tan solo una hora después de la inyección i.p. El efecto máximo se alcanzó después de 6 horas. El nivel de expresión para el SAA se redujo 24 horas después de la inyección. [0098] Los datos generados a partir de los experimentos usando dosis variables de TIF indicaban que la inducción máxima del SAA aún se producía cuando se usaban dosificaciones de 3,2 μg. El mensaje del SAA aún era detectable cuando se usaba tan solo 0,8 μg. Ejemplo 32 [0099] Inicialmente, el TIF se identificó como una citocina derivada de células T. La mayoría de citocinas que regulan las fases agudas del hígado se producen principalmente durante la inflamación. Para determinar si el TIF se podría producir a través de la estimulación inflamatoria, se inyectaron intraperitonealmente in vivo 2 μg del antígeno lipopolisacárido de E. coli a ratones BALB/c hembra de 12 semanas de edad. Los ratones se sacrificaron dos horas más tarde, y los órganos se congelaron en nitrógeno líquido. El ARN total se aisló siguiendo protocolos habituales, y la transcripción inversa se llevó a cabo sobre 10 μg de ARN total, usando cebadores oligo(dT). Después de la transcripción inversa, el ADN correspondiente a 20 ng de ARN total se amplificó durante 25 ciclos, usando cebadores específicos para TIF, es decir: ctgcctgctt ctcattgccc t (sentido, SEC ID Nº: 38) y caagtctacc tctggtctca t (sentido contrario, SEC ID Nº: 39), que tenían una Tm de 55°C. Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa. [0100] Los resultados indicaban que el LPS inducía la expresión del TIF en todos los órganos examinados, lo que indica que el TIF está involucrado en procesos inflamatorios. [0101] Los ejemplos anteriores describen la invención que es, en una forma de realización, un anticuerpo antagonista del IL-10Rβ para su uso en la inhibición de la inducción por IL-TIF/IL-21 de una respuesta de fase aguda, en el que dicha IL-TIF/IL21 se selecciona entre:

(a)

un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre la SEC ID Nº: 40, SEC

ID Nº: 41 y SEC ID Nº: 43;o

(b)

un polipéptido que tiene una identidad en aminoácidos de al menos el 60% a un polipéptido de (a). [0102] En una forma de realización adicional, la invención proporciona un procedimiento para la inhibición de la inducción por IL-TIF/IL-21 de una proteína de fase aguda in vitro que comprende la puesta en contacto de una célula susceptible a la inducción por IL-TIF/IL-21 de una proteína de fase aguda con un anticuerpo antagonista que se une específicamente a una molécula IL-10Rβ en una cantidad suficiente para inhibir la inducción por IL-TIF/IL-21 de una proteína de fase aguda, en la que dicha IL-TIF/IL-21 se selecciona entre:

(a)

un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre la SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 41 y SECT IDNº: 43; o

(b)

un polipéptido que tiene una identidad en aminoácidos de al menos el 60% a un polipéptido de (a); y en la que dicha proteína de fase aguda es amiloide A sérico humano, antiquimotripsina α1 o haptoglobina. [0103] Se describen moléculas de ácidos nucleicos aisladas, que codifican proteínas TIF tales como aquellas con la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7, 25 ó 26. Alguien experto en la materia apreciará que la degeneración del código genético facilita la preparación de moléculas de ácidos nucleicos que pueden no ser idénticas a la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nº: 7, 25 ó 26, pero que codifican la misma proteína. Naturalmente, las SEC ID NOS: 7, 25 y 26 son REALIZACIONES preferidas de esta invención, pero otras REALIZACIONES también son una parte de la invención. En ella se deben incluir el ADN genómico, ADN complementario, y ARN, tal como ARN mensajero. Las moléculas de ácidos nucleicos aisladas procedentes de otras especies animales, incluyendo otros mamíferos, también son una parte de la invención. Además se describen moléculas de ácidos nucleicos aisladas cuyos complementos se hibridan con las SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, o SEC ID Nº: 25 o SEC ID Nº: 26 en condiciones rigurosas. "Condiciones rigurosas", como se usa en el presente documento se refiere, por ejemplo, a la hibridación a 65°C en tampón (3,5xSSC), 0,02% de Ficoll, 0,02% de polivinilpirrolidona, 0,02% de seroalbúmina bovina, NaH2PO4 25 mM (pH 7), 0,1% de SDS, EDTA 2 mM, seguido de un lavado final en 2xSSC, a temperatura ambiente y a continuación en 0,1xSSC/0,2xSDS a temperaturas tan elevadas como, por ejemplo, 65°C. También se

pueden usar condiciones más rigurosas, tales como 0,1xSSC. Estas moléculas de ácidos nucleicos codifican proteínas de 17-22 kDa aproximadamente determinado por SDS-PAGE, que activa las proteínas STAT, tales como STAT1, STAT3 y/o STAT5. En la forma glicosilada, estas proteínas pueden abarcar entre 17 aproximadamente y 30 kilodaltons aproximadamente, determinado por SDS-PAGE. También se describen moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican proteínas que tienen una identidad en aminoácidos de al menos el 30%, preferentemente de al menos el 45%, más preferentemente de al menos el 60%, y lo más preferentemente del 90% con una secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por las SEC ID Nº: 7, 25 ó 26, por ejemplo, la SEC ID Nº: 42. [0104] También se describen vectores de expresión que incluyen moléculas de ácidos nucleicos, unidas de manera operable a un promotor, para así facilitar la expresión del ADN. Está dentro de las competencias del facultativo preparar esos vectores. [0105] Los vectores, así como las moléculas de ácidos nucleicos per se, se pueden usar para preparar células recombinantes, ya sean eucariotas o procariotas, en las que se incorpora un vector de expresión o la propia molécula de ácidos nucleicos. Las células de E. coli, células COS, células CHO, etc., son todos ejemplos de tipos de células que se pueden usar. [0106] Las proteínas codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos mencionadas anteriormente, preferentemente en forma aislada, son otra característica descrita. Por "proteína" se quiere decir tanto el producto de expresión inmediato de las moléculas de ácidos nucleicos, como sus formas glicosiladas, así como las formas multiméricas, tales como dímeros, trímeros, etc., que pueden contener al menos una molécula proteica de la invención, y al menos una molécula proteica diferente. Preferentemente, esta molécula proteica diferente es una citocina, tal como IL-10. También se incluyen construcciones, tales como proteínas de fusión, donde todas o parte de las proteínas descritas anteriormente están unidas de alguna forma, tal como en una proteína de fusión, al menos una proteína o péptido adicional, o una secuencia de aminoácidos. El "compañero de fusión" puede ser, por ejemplo, una molécula que proporciona una señal reconocible, ya sea directa o indirectamente, tal como un péptido FLAG, β-galactosidasa, luciferasa, etc. Estos compañeros de fusión preferentemente están unidos a la molécula que se ha descrito anteriormente por los Ny/o C-términos de la proteína; no obstante, se debe entender que hay muchas técnicas conocidas para la unión de moléculas a aminoácidos, y todas y cada una de estas metodologías pueden producir construcciones. [0107] Las moléculas de proteínas individuales, como se ha indicado anteriormente, preferentemente tendrán un peso molecular de entre 17 aproximadamente y 30 kilodalton aproximadamente, determinado por SDS-PAGE. En las formas multiméricas, naturalmente el peso molecular del complejo variará, pero las moléculas TIF contenidas en él tendrá cada una un peso molecular de 17 a 30 kilodalton aproximadamente, determinado por SDS-PAGE. [0108] Las proteínas preferentemente constarán de al menos 120 aproximadamente y no más de 200 aminoácidos aproximadamente. Preferentemente, las secuencias de aminoácidos constan de o comprenden todas o parte de las secuencias de aminoácidos codificadas por las SEC ID NOS: 7, 8, 9, 25 ó 26. Más preferentemente, la secuencia de aminoácidos contiene todos, excepto aproximadamente los primeros 40 aminoácidos codificados por dichas SEC ID. Incluso más preferentemente contiene todos excepto aproximadamente los primeros 20 aminoácidos codificados por estas secuencias. Más preferentemente, la proteína comprende los aminoácidos expresados en las SEC ID Nº: 40 ó 41, así como proteínas definidas por las identidades de aminoácidos expuestas anteriormente. [0109] El facultativo experto apreciará que las proteínas codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos mencionadas anteriormente son una característica de la invención, y se pueden usar para producir anticuerpos, de acuerdo con protocolos habituales. Esos anticuerpos, en forma monoclonal o policlonal, constituyen una característica adicional de la invención, al igual que los fragmentos de dichos anticuerpos, las formas quiméricas, las formas humanizadas, las formas recombinantes, etc. Además, una característica de la invención son los inmunógenos, que comprenden todas o parte de la secuencia de aminoácidos de las moléculas proteicas de la invención, preferentemente combinadas con un adyuvante, tal como el adyuvante completo o incompleto de Freund. Se pueden unir porciones de las secuencias de proteínas a otras moléculas, tales como la hemocianina de lapa de California, para hacerlas más inmunógenas. Estos anticuerpos se pueden usar, por ejemplo, para determinar si están presentes las proteínas descritas. [0110] Los datos expuestos anteriormente, en particular, la inducción de la expresión de la molécula de la invención por el LPS, y la regulación de la respuesta de fase aguda por esta molécula, indican que las moléculas de la invención están involucradas de forma activa en la respuesta inflamatoria. Será evidente para el facultativo experto que la IL-TIF/IL-21 puede regular la respuesta inflamatoria. Véase, por ejemplo, Janeway, y col., Immunobiology (4th edition). Janeway explica que diversas citocinas tales como la IL-1, IL-6 y el TNF-α activan los hepatocitos para sintetizar proteínas de fase aguda, tales como la proteína C reactiva, y lecitina de unión a manano, así como aquellas descritas en los ejemplos, anteriormente. [0111] El papel de la IL-TIF/IL-21 en la activación de proteínas de fase aguda también da lugar a un procedimiento para la identificación de agonistas y antagonistas de la IL-TIF/IL-21, determinando si la producción de proteínas de fase aguda varía en presencia del agonista o antagonista putativo, y la IL-TIF/IL-21. Un incremento en la producción se debe tomar como indicación de que la molécula de prueba es un antagonista, y viceversa. [0112] La invención incluye procedimientos para regular la actividad de la ILTIF/IL-21 en vista de sus relaciones con los receptores de la interleucina-10. Como se ha mostrado anteriormente, el uso de antagonistas del IL-10Rβ, tales como anticuerpos, inhiben la actividad IL-TIF/IL-21. [0113] Se describe el uso de agonistas y antagonistas de receptores de IL-10, tales como agonistas, y antagonistas del IL-10Rβ para regular la producción de IL-TIF/IL

21. [0114] Otras características de la invención serán evidentes para el facultativo y no requieren mayor explicación. [0115] Los términos y expresiones que se han empleado se utilizan como términos descriptivos, y no limitantes. [0116] Los siguientes párrafos describen características de esta descripción.

1.

Un procedimiento para modular la actividad de una molécula IL-TIF/IL-21, que comprende la puesta en contacto de una célula susceptible a la actividad IL-TIF/IL-21 con un modulador IL-TIF/IL-21, en una cantidad suficiente para modular la actividad IL-TIF/IL-21.

2.

El procedimiento del párrafo 1, en el que dicho modulador es una sustancia que se une a moléculas IL-10Rβ.

3.

El procedimiento del párrafo 2, en el que dicho modulador es un anticuerpo que se une específicamente a una molécula IL-10Rβ.

4.

El procedimiento del párrafo 3, en el que dicho modulador es un antagonista de una molécula IL-10R.

<110> Dumoutier, Laure Renauld, Jean-Christophe

<120> Isolated Nucleic Acid Molecules which Encode T Cell Inducible Factors, or Interleukin-21, The Proteins Encoded, and Uses Thereof

<130> LUD 5664

<140>

<141>

<150> US09/419.568

<151> 18-10-1999

<150> US09/354.243

<151> 16-7-1999

<150> US09/178.973

<151> 26-10-1998

<160> 43

<210> 1

<211> 24

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<400> 1 agcactctcc agcctctcac cgca 24

<210> 2

<211> 12

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<400> 2 gatctgcggt ga 12

<210> 3

<211> 24

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<400> 3 accgacgtcg actatccatg aaca 24

<210> 4

<211> 12

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<400> 4 5 gatctgttca tg 12

<210> 5

<211> 24

<212> ADN

<213> Mus musculus <220>

10 <400> 5 aggcaactgt gotatccgag ggaa 24

<210> 6

<211> 12

<212> ADN 15 <213> Mus musculus

<220>

<400> 6 gatcttccct cg 12

<210>

7 20 <211> 1119

<212> ADN

<213> Mus musculus <220>

<400> 7

<210> 8

<211> 7445

<212>

ADN 5 <213> Mus musculus <220>

<400> 8

<210> 9

<211> 1111

<212>

ADN 5 <213> Mus musculus

<220>

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212>

ADN 5 <213> Mus musculus

<220>

<400> 10 ctgcctgctt ctcattgccc t 21

<210>

11 10 <211> 21

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<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<400> 11 15 caagtctacc tctggtctca t 21

<210> 12

<211> 20

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<400> 12 gacgcaagca tttctcagag 20

<210> 13

<211> 16

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 13 atgtatttcc,cagaaa 16

<210> 14

<211> 17

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 14 ccttttctgg gaaatac 17

<210> 15

<211> 22

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<400> 15 aggtgctcaa cttcaccctg ga 22

<210> 16

<211> 22

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<400> 16 ccactctctc caagcttttt ca 22

<210> 17

<211> 21

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<400> 17 5 caagtctacc tctggtctca t 21

<210> 18

<211> 418

<212> ADN

<213> Homo sapiens 10 <220>

<400> 18

imagen1

<210> 19

<211> 21 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 19

tggccaggaa gggcaccacc t 21 20 <210> 20

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

25 <400> 20 cctatcagat tgagggaaca g 21

<210> 21

<211> 36

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<221> cebador

<222> 24,25,29,30,34,35

<223> n es inosina en todos los casos

<400> 21 ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng 36

<210> 22

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<400> 22 ggccacgcgt cgactagtac 20

<210> 23

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 23 ccttccccag tcaccagttg 20

<210> 24

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 24 taattgttat tcttagcagg 20

<210> 25

<211> 690

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 25

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<210> 26 5 <211> 4797

<212> ADN

<213> Homo sapiens <220>

<400> 26

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<210> 27

<211> 20

<212> ADN 5 <213> Homo sapiens <220>

<400> 27 atcagatgga ttactgaatg 20

<210> 28

<211> 20 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens <220> <400> 28 agctcagcta cagcacagat 20

<210> 29

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 29 cctgccccat ttattggcag 20

<210> 30

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 30 tgtcctctgc caccctaaca 20

<210> 31

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 31 taattcacca ggaccatcat 20

<210> 32

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 32 gtggactcag gcaatgatgt 20

<210> 33

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> <400> 33 acatagagtg ttaaagtggg 20

<210> 34

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 34 gctggaaggt ggacagcgag 20

<210> 35

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<400> 35 tggcatcgtg atggactccg 20

<210> 36

<211> 20

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<400> 36 tctgctccct gctcctggga 20

<210> 37

<211> 20

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<400> 37 tccaggaggt ctgtagtaat 20

<210> 38

<211> 21

<212> ADN

<213> Mus musculus

<220> <400> 38 ctgcctgctt ctcattgccc t 21

<210> 39

<211> 21 5 <212> ADN

<213> Mus musculus

<220>

<400> 39

caagtctacc tctggtctca t 21 10 <210> 40

<211> 179

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220> 15 <400> 40

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<210> 41

<211> 179

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

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<210> 42

<211> 5935

<212> ADN 10 <213> Mus musculus

<220>

<400> 42

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<210> 43

<211> 179

<212> PRT 5 <213> Homo sapiens

<220>

<400> 43

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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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US 4778879 A, Mertelsmann [0004]

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US 4490289 A, Stern [0004]

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US 4518584 A, Mark [0004]

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US 5215895 A [0004]

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US 5328989 A [0004]

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US 5580753 A [0004]

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US 5587302 A [0004]

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US 5194375 A [0004]

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US 4965195 A [0004]

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US 5017691 A [0004]

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US 5164317 A [0007]

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WO 9708321 A, Levitt [0007]

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WO 9824904 A, Levitt [0007]

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WO 0024578 A [0009]

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US 5843697 A [0009]

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US 09419568 B [0118]

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US 09354243 B [0118]

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US 09178973 B [0118

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

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Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. El uso de un anticuerpo antagonista del IL-10Rβ en la preparación de un medicamento para la inhibición de la inducción por IL-TIF/IL-21 de una respuesta de fase aguda, en la que dicha IL-TIF/IL-21 se selecciona entre:

   (a)

   un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre la SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 41 y SEC ID Nº: 43; o

   (b)

   un polipéptido que tiene una identidad en aminoácidos de al menos el 60% respecto de un polipéptido de (a).

2. 2. Un anticuerpo antagonista del IL-10Rβ para su uso en la inhibición de la inducción por IL-TIF/IL-21 de una respuesta de fase aguda, en la que dicha IL-TIF/IL-21 se selecciona entre:

   (a)

   un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre la SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 41 y SEC ID Nº: 43; o

   (b)

   un polipéptido que tiene una identidad en aminoácidos de al menos el 60% respecto de un polipéptido de (a).

3. 3.

   El uso de la reivindicación 1, en el que la inhibición de la inducción por IL-TIF/IL-21 de una respuesta de fase aguda da como resultado la inhibición de la inducción de una proteína de fase aguda seleccionada entre amiloide A sérico humano, anti-quimotripsina α1 y haptoglobina.

4. 4.

   El anticuerpo antagonista del IL-10Rβ para el uso de la reivindicación 2, en el que la inhibición de la inducción por IL-TIF/IL-21 de una respuesta de fase aguda da como resultado la inhibición de la inducción de una proteína de fase aguda seleccionada entre amiloide A sérico humano, anti-quimotripsina α1 y haptoglobina.

5. 5.

   Un procedimiento para la inhibición de la inducción por IL-TIF/IL-21 de una proteína de fase aguda in vitro que comprende la puesta en contacto de una célula susceptible a la inducción por IL-TIF/IL-21 de una proteína de fase aguda con un anticuerpo antagonista que se une específicamente a una molécula IL-10Rβ en una cantidad suficiente para inhibir la inducción por IL-TIF/IL-21 de una proteína de fase aguda, en la que dicha IL-TIF/IL-21 se selecciona entre:

   (a)

   un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada entre la SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 41 y SEC ID Nº: 43; o

   (b)

   un polipéptido que tiene una identidad en aminoácidos de al menos el 60% respecto de un polipéptido de (a); y en la que dicha proteína de fase aguda es amiloide A sérico humano, antiquimotripsina α1 y haptoglobina.