ES2346831T3 - Moleculas de acido nucleico que codifican factores inducibles de celulas t, proteinas codificadas y usos de las mismas. - Google Patents
Moleculas de acido nucleico que codifican factores inducibles de celulas t, proteinas codificadas y usos de las mismas. Download PDFInfo
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Abstract
Molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína que induce la activación de una proteína STAT, la secuencia complementaria de la que hibrida, bajo condiciones rigurosas, a al menos una de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, en donde las condiciones rigurosas comprenden la hibridación a 65ºC en 3.5xSSC, seguido de lavados a temperatura ambiente en 2xSSC y a 65ºC en 0.1xSSC; con la condición de que dicha molécula de ácido nucleico sea diferente de: un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 **(Ver fórmula)** (b) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 del nucleótido 65 al nucléotido 601; (c) la secuencia de nucleótidos de una secuencia del clon hGIL-191AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231 que codifica una proteína de longitud completa; (d) la secuencia de nucleótidos de una secuencia del clon HGIL-191AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231 que codifica una proteína madura; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 **(Ver fórmula)** (f) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende aproximadamente del aminoácido 34 a 179 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; y (g) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, comprendiendo el fragmento una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 50-60, 63-81 y 168-1 77 de SEQ ID NO:2.
Description
Moléculas de ácido nucleico aisladas que
codifican Factores Inducibles de Células T, proteínas codificadas y
usos de las mismas.
La invención se refiere a nuevas moléculas de
ácido nucleico aisladas y a sus usos. Se ha comprobado que las
moléculas de ácido nucleico se encuentran
sobre-reguladas por la citoquina interleuquina 9
("IL-9"). También se describen proteínas
codificadas por las mismas. Estas se describen como Factores
Inducibles Derivados de Células T ("TIFs"). Estas moléculas de
ácido nucleico codifican proteínas que inducen la activación de
STAT en las células. Se pueden usar, por ejemplo, en la estimulación
de la regeneración de tejidos diana. Además, sus inhibidores o
antagonistas se pueden usar para retardar, prevenir o inhibir la
diferenciación de otros tejidos.
En la última década se ha visto incrementado de
una manera importante el conocimiento del sistema inmune y su
regulación. La búsqueda de proteínas y glicoproteínas que regulan el
sistema inmune ha sido un área de particular interés. Una de las
familias de estas moléculas que mejor se conoce es la de las
citoquinas. Estas son moléculas que están implicadas en la
"comunicación" de unas células con otras. Se ha encontrado que
miembros individuales de la familia de citoquinas están implicados
en una gran variedad de afecciones patológicas, tales como el
cáncer y las alergias. Si bien algunas veces las citoquinas están
implicadas en la patología de la afección, también se conocen por
ser terapéuticamente útiles.
Las interleuquinas son un tipo de citoquina. La
literatura sobre interleuquinas es inmensa. A modo de ejemplo, pero
sin que signifique un listado exhaustivo de patentes en esta área,
se incluyen la patente US Nº 4.778.879 de Mertelsmann et
al.; la patente US Nº 4.490.289 de Stern; la patente US Nº
4.518.584 de Mark et al.; y la patente US Nº 4.851.512 de
Miyaji et al., estando implicada, en todas ellas, la
interlequina 2 o "IL-2." Se han publicado
patentes adicionales que se refieren a la interleuquina 1
("IL-1"), tal como la patente US Nº 4.808.611
de Cosman. Patentes más recientes que incluyen otras interleuquinas
diferentes incluyen las patentes US Nº 5.694.234
(IL-13); 5.650.492 (IL-12);
5.700.664, 5.371.193 y 5.215.895 (IL-11);
5.728.377, 5.710.251, 5.328.989 (IL-10); 5.580.753,
5.587.302, 5.157.112, 5.208.218 (IL-9); 5.194.375,
4.965.195 (IL-7); 5.723.120, 5.178.856
(IL-6), y 5.017.691 (IL-4). Incluso
una revisión rápida de esta literatura de patentes muestra la
diversidad en las propiedades de los miembros de la familia de
interleuquina. Uno puedo asumir que la mayor parte de la familia de
citoquinas muestra incluso una mayor diversidad. Véase, por ejemplo,
Aggarwal et al., ed., Human Cytokines: Handbook For Basic
And Clinical Research (Blackwell Scientific Publications, 1992),
Paul, ed., Fundamental Immunology (Raven Press, 1993), p.
763-836, "T-Cell Derived Cytokines
And Their Receptors", y "Proinflammatory Cytokines and
Immunity."
Las relaciones entre las diversas citoquinas
son complejas. Como se verá a partir de las referencias citadas en
el presente documento, cuando el nivel de una citoquina concreta
aumenta o disminuye, esto puede afectar, ya sea de manera directa o
indirecta, a los niveles de otras moléculas producidas por un
sujeto. Entre las moléculas afectadas hay otras citoquinas.
La linfoquina IL-9, previamente
referida como "P40," es una molécula derivada de célula T que
originalmente se identificó como un factor que mantenía el
crecimiento independiente de antígeno permanente de líneas celulares
T4. Véase, por ejemplo, Uyttenhove et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 85: 6934 (1988), y Van Snick et al., J. Exp. Med. 169:
363 (1989), y Simpson et al., Eur. J. Biochem. 183: 715
(1989).
La actividad de IL-9 se observó
primero en líneas de células T4 restringidas, que dejaban de mostrar
actividad en células T aisladas frescas o CTL. Véase, por ejemplo,
Uyttenhove et al., más arriba, y Schmitt et
al., Eur. J. Immunol. 19: 2167 (1989). Este rango de actividad
se amplió cuando los experimentos mostraron que IL-9
y la molécula referida como Factor de crecimiento III de células T
("TCGF III") son idénticas a MEA (Actividad protenciadora del
crecimiento de mastocitos), un factor que potencia la respuesta
proliferativa de los mastocitos derivados de médula a
IL-3, según ha sido descrito por Hültner et
al., Eur. J. Immunol, y en la patente US número 5.164.317.
También se encontró que la forma humana de IL-9
estimula la proliferación de leucemia megacarioblástica. Véase Yang
et al., Blood 74: 1880 (1989). Un trabajo reciente sobre
IL-9 ha demostrado que esta también ayuda en la
formación de la colonia eritroide (Donahue et al., Blood
75(12): 2271-2275
(6-15-90)); promueve la
proliferación de la formación de brotes mieloides eritroides
(Williams et al., Blood 76: 306-311
(9-1-90); y ayuda en la maduración
clónica de BFU-E's de origen fetal y adulto
(Holbrook et al., Blood 77(10):
2129-2134
(5-15-91)). La expresión de
IL-9 también se ha implicado en la enfermedad de
Hodgkins disease y en el linfoma anaplásico de células grandes
(Merz et al., Blood 78(8): 1311-1317
(9-1-90). Los análisis genéticos de
ratones que eran susceptibles o resistentes al desarrollo de
hiper-respuestas bronquiales han desenmarañado un
enlace con el gen de IL-9 así como una correlación
entre la producción de IL-9 y la susceptibilidad en
este modelo (Nicolaides et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
94, 13175-13180, 1997). Los estudios genéticos
humanos también apuntan a los genes de IL-9 y
IL-9R como candidatos a asma (Doull et al.,
Am. J. Respir. Crit. Care Med., 153, 1280-1284,
1996; Holroyd et al., Genomics 52, 233-235,
1998). En segundo lugar, los ratones transgénicos con
IL-9 permitieron demostrar que una expresión
aumentada de IL-9 resultaba en mastocitosis
pulmonar, hipereosinofilia, hiper-respuesta
bronquial y elevados niveles de IgE (Temann et al., J. Exp.
Med. 188, 1307-1320, 1998; Godfraind et al.,
J. Immunol. 160, 3989-3996, 1998; McLane et
al., Am. J. Resp. Cell. Mol. 19:713-720 (1999).
Consideradas juntas todas estas observaciones, sugieren que
IL-9 juega un papel principal en esta enfermedad. Un
trabajo adicional ha implicado IL-9 y las muteínas
de esta citoquina en asma y alergias. Véase, por ejemplo, la
solicitud PCT US96/12757 (Levitt, et al), y PCT US97/21992
(Levitt, et al).
IL-9 es conocida por afectar los
niveles de otras moléculas en los sujetos. Véase Louahed et
al., J. Immunol. 154: 5061-5070 (1995; Demoulin
et al., Mol. Cell. Biol. 16: 4710-4716
(1996). Se reconocerá que las moléculas afectadas tienen sus propias
funciones en los sistemas biológicos. Por ejemplo, Demoulin et
al. muestran que muchas de las actividades conocidas de
IL-9 están mediadas por la activación de los
factores de transcripción STAT. Como tal, existe un interés
continuo en intentar identificar moléculas cuya presencia y/o nivel
se vea afectado por otras moléculas tales como citoquinas.
WO 00/65027 reivindica prioridad de
28-4-99 y se publicó el 2.11.00.
Esta solicitud describe una proteína similar a
IL-10 que tiene una secuencia de nucleótidos de la
secuencia codificante de la proteína de longitud completa del clon
hGIL-19/AE289 depositado con el número de acceso
ATCC 20723. La solicitud describe una secuencia de ácido nucleico y
aminoacídica humanas (SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente) de una
proteína referida como proteína hTIF/AE289.
La descripción que sigue describe estas
moléculas. Se encontró que las moléculas de ácido nucleico que
codificaban las proteínas de la invención se expresaban en
presencia de IL-9, pero no en su ausencia. Por lo
tanto, estas moléculas son, entre otros, "marcadores" de
expresión o efecto de IL-9 en un sujeto. Las
moléculas se refieren de aquí en adelante como Factores Inducibles
derivados de Células T o "TIFs". Estas y otras características
se verán en la descripción que sigue.
La presente invención describe una molécula de
ácido nucleico aislada que codifica una proteína que induce la
activación de una proteína STAT, la secuencia complementaria con la
que hibrida, bajo condiciones rigurosas, a al menos una de SEQ ID
NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 24 o
SEQ ID NO: 25, en donde las condiciones rigurosas comprenden la
hibridación a 65ºC en 3.5xSSC, seguido de lavados a temperatura
ambiente en 2xSSC y a 65ºC en 0.1xSSC; con la condición de que dicha
molécula de ácido nucleico sea diferente de:
- un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
-
1
\vskip1.000000\baselineskip
- (b)
- la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 del nucleótido 65 al nucléotido 601;
- (c)
- la secuencia de nucleótidos de una secuencia del clon hGIL-19IAE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231 que codifica una proteína de longitud completa;
- (d)
- la secuencia de nucleótidos de una secuencia del clon HGIL-19IAE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231 que codifica una proteína madura;
- (e)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2
-
2
\vskip1.000000\baselineskip
- (f)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende aproximadamente del aminoácido 34 a 179 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; y
- (g)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, comprendiendo el fragmento una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 50-60, 63-81 y 168-1 77 de SEQ ID NO:2.
Las secuencias de nucleótidos definidas en el
disclaimer anterior son las derivadas de WO 00/65027.
La presente solicitud se refiere a un factor
inducible de células T, TIF. A lo largo de la presente solicitud,
este TIF es una proteína que induce la activación de una proteína
STAT, y es según se define más arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 compara las secuencias de
aminoácidos deducidas de TIF humana y de murino (SEQ ID NO: 27 y
28, respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
La línea de células de linfoma murino BW5147 es
bien conocida por ser una línea celular que puede crecer in
vitro sin la necesidad de añadir citoquinas a su medio de
cultivo. Con el fin de identificar los genes inducidos por
IL-9, se cultivaron muestras de BW5147 con (200
U/ml) o sin IL-9, durante 24 horas. A continuación,
se aisló el RNA total usando lisis con isotiocianato de guanidinio y
centrifugación con gradiente de CsCl. Estas técnicas son bien
conocidas en el estado de la técnica. A continuación, se purificó el
RNA poliadenilado del RNA total usando una columna de celulosa con
oligo(dT). El RNA poliA aislado se usó, a continuación, para
generar un cDNA de doble cadena. Se usó un cebador oligo(dT)
disponible comercialmente. En alguna parte se calentaron de
3-5 ug de RNA poliA a 70ºC durante 10 minutos con 1
\mug de oligo dT, y a continuación se incubaron con un tampón de
primera cadena 5x (HCl 250 mM (pH 8.3), KCl 375 mM, MgCl_{2} 15
mM), ditiotreitol 10 mM, 500 uM de desoxinucleótido trifosfatos, y
800 U de transcriptasa inversa. El volumen total de la mezcla de
reacción fue de 20 ul, y la reacción se dejó proceder a 37ºC durante
1 hora. Esto resultó en la síntesis de la primera cadena de DNA. La
síntesis de la segunda cadena se llevó a cabo añadiendo 30 ul de
tampón de segunda cadena 5 (Tris-HCl 100 mM (pH
6.9)), KCl 450 mM, MgCl_{2} 23 mM,
\beta-NAD^{+} 0.75 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 50 mM, junto con 60U de DNA
polimerasa I derivada de E. coli, 2U de RNasa H de E.
coli, 10 U de DNA ligasa de E. coli, y 250 uM de
desoxinucleótido trifosfatos, y se llevó a un volumen final de 150
ul. La mezcla se incubó durante dos horas a 16ºC.
El producto se extrajo usando
fenol-cloroformo, y se precipitó con etanol. El
producto cDNA final se volvió a suspender en 200 \mul de TE.
Estas etapas se llevaron a cabo tanto para
células BW5147 estimuladas (de aquí en adelante "probadoras"),
como para células BW5147 no estimuladas paralelas (de aquí en
adelante "conductoras").
\newpage
El cDNA preparado en el Ejemplo 1 se sometió, a
continuación, a clonación sustractiva de acuerdo con métodos bien
conocidos. Para hacer esto, se prepararon 6 oligonucleótidos:
- 5'-AGCACTCTCC AGCCTCTCAC CGCA-3
- (SEQ ID NO: 1);
- 5'-GATCTGCGGT GA-3'
- (SEQ ID NO: 2);
- 5'-ACCGACGTCG ACTATCCATG AACA-3'
- (SEQ ID NO: 3);
- 5'-GATCTGTTCA TG-3'
- (SEQ ID NO: 4);
- 5'-AGGCAACTGT GCTATCCGAG GGAA-3'
- (SEQ ID NO: 5); y
- 5'-GATCTTCCCT CG-3'
- (SEQ ID NO: 6).
Estos se usaron como se explica en el presente
documento. El cDNA de doble cadena (2 ug), se digirió con la
endonucleasa de restricción DpnII, se extrajo con
fenol-cloroformo, se precipitató con etanol, y se
volvió a suspender en 20 ul de TE (10 mM Tris-HCl
(pH 7.5); 1 mM EDTA). Se ligaron doce ul (1.2 ug) de cDNA cortado a
SEQ ID NOS: 1 y 2 de doble cadena, en una mezcla que incluía 4 ul de
SEQ ID NO: 1 (2 mg/ml) desalada, 4 ul de SEQ ID NO: 2 (1 mg/ml)
desalada, 10 \mul de tampón adaptador 5X (Tris-HCl
330 mM, pH 7.6, MgCl_{2} 50 mM, ATP 5 mM), 7 \mul de DTT (100
mM), y 28\mul de H_{2}O). Los oligonucleótidos se hibridaron
unos a otros y a la mezcla de DNA, calentando la mezcla a 50ºC y, a
continuación, enfriándola a 10ºC por encima de una hora, seguido de
la adición de 5 ul de T4 DNA ligasa, e incubación durante
12-14 horas, a 12-16ºC. Las mezclas
se diluyeron añadiendo 140 ul de TE. La PCR se llevó a cabo, a
continuación, en muestras de 200 ul, según se describe más
abajo.
Para llevar a cabo la PCR, se calentaron primero
muestras de 200 ul que contenían 2 ul del producto de ligación en
un tampón de Tris-HCl 66 mM, pH 8.8, MgCl_{2} 4
mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 16 mM, 33 ug/ml BSA, 0.3 mM de
cada dNTP (concentración: 500 \muM), y 2 ug de SEQ ID NO: 2 a 72ºC
durante tres minutos para eliminar cualquier SEQ ID NO: 1 que se
hubiera hibridado con el producto del Ejemplo 2. Los extremos 3' se
rellenaron, a continuación, usando 5U de Taq polymerasa (5 minutos,
72ºC). Se llevaron a cabo veinte ciclos de amplificación (1 ciclo:
1 minuto a 95ºC, y tres minutos a 72ºC), después de lo cual se
combinaron los productos, se extrajeron con fenol, se precipitaron
con etanol, y se volvieron a suspender en tampón TE, a una
concentración de 0.5 ug/ul. De aquí en adelante, éste se refiere
como la representación.
La representación se preparó a continuación para
la hibridación sustractiva, eliminado SEQ ID NO: 1 de la misma
mediante digestión con Dpn II. El digerido resultante se extrajo con
fenol y se precipitó con etanol. En el cado de la muestra sin
estimular, esta resultó en la "conductora", mientras que la
muestra estimulada resultó en la probadora. Se purificaron en gel
porciones de la probadora (20 ug) en un gel de agarosa al 1.2% y se
aislaron. Se ligaron las muestras (2 ug) a SEQ ID NO: 3 y 4, de la
misma manera que las SEQ ID NO: 1 y 2 se ligaron, según se describe
más arriba.
En un primer ciclo de hibridación sustractiva,
0.4 ug de muestras de la probadoras con SEQ ID NO: 3 y 4 ligadas a
éstas se mezclaron con 40 ug de cDNA conductor. La mezcla se
extrajo con fenol, se precipitó con etanol, se disolvió en 2 ul de
tampón 3XEE (30 mM EPPS pH 8.0), 3 mM EDTA; pH 8.0, EDTA 3 mM. Esto
se colocó sobre 30 ul aceite mineral, y se desnaturalizó durante
cinco minutos a 98ºC. Se añadió una solución 5M de NaCl (0.5 ul), y
se hibridó el DNA durante 20 horas a 67ºC. La mezcla de reacción se
diluyó a 200 ul con TE, y tRNA portador. Las mezclas se incubaron
durante tres minutos a 72ºC hasta desaparecer la SEQ ID NO: 4, y a
continuación se prepararon cuatro reacciones de PCR (200 ul). Estas
incluían 20 ul de mezcla de hibridación diluida sin cebador para
rellenar los extremos de la probadora re-hibridada,
seguido de 10 ciclos de amplificación después de añadir muestras de
SEQ ID NO: 3 (1 ciclo:1minuto a 95ºC, tres minutss a 70ºC) después
de lo cual se combinaron los productos, se extrajeron con fenol, se
precipitaron con etanol, y se volvieron a suspender en 40 \mul de
tampón 0.2XTE. El DNA de cadena sencilla se degradó mediante un
tratamiento de 30 minutos de 20 \mul de este material con 20 U de
nucleasa mung bean, a un volumen total de 40 ul. Las muestras se
diluyeron (1:5), en 50 mM de Tris-HCl, a pH 8.9,
seguido de cinco minutos de calentamiento a 98ºC para inactivar la
enzima. Se llevó a cabo una segunda PCR, usando 20 ul del producto
descrito más arriba, 2 ul de SEQ ID NO: 3 (1 mg/ml), y 1 ul (5 U) de
DNA Taq polimerasa. Se llevarona a cabo un total de 18 ciclos (1
ciclo: minuto a 95ºC, tres minutos a 70ºC). Se combinaron los
productos, se extrajeron con fenol, se precipitaron con etanol y se
volvieron a suspender a 0.5-1 ug/\mul. El producto
se refiere de aquí en adelante como "DP1", o el primer
producto de diferencia.
DP1 se digirió a continuación con endonucleasa
DpnII, según se describe más arriba, y se ligó con SEQ ID NO: 5 y
6, siguiendo los mismos procedimientos descritos para SEQ ID NO: 1,
2, 3 y 4. Se repitieron la hibridación sustractiva y la
amplificación selectiva, según se ha descrito en el Ejemplo 4, y se
generó un segundo producto de diferencia, o "DP2". En estos
experimentos, 50 ng de DP1 fueron probador. El conductor (40 ug),
fue según se ha descrito más arriba. El procedimiento se repitió
para generar un tercer producto diferente usando SEQ ID NO: 3 y 4
como adaptadores. Para generar el tercer producto, se mezclaron 100
pg de probador con 40 \mug de conductor. Todas las etapas de los
protocolos de más arriba se repitieron, excepto la amplificación
final que se llevó a cabo durante 22 ciclos, donde un ciclo era de
un minuto a 95ºC, y tres minutos a 70ºC. Esto permitió obtener el
producto final de diferencia.
Los productos finales de diferencia se
digirieron con DpnII, y a continuación se clonaron en el sitio
BamHI de un vector disponible comercialmente, i.e., ptZ19R. Se
prepararon los plásmidos de DNA de doble cadena y, a continuación,
se secuenciaron usando métodos estándar. Las secuencias se
compararon con secuencias conocidas de las bases de datos de
GenBank y EMBL, usando un programa de búsqueda BLAST.
Al final de este proceso de sustracción, se
identificó un fragmento de cDNA corto, es decir, una fragmento de
aproximadamente unos 200 pares de bases de longitud. Este fragmento
se usó para cribar una biblioteca de cDNA procedente de células BW
5147. Se secuenció el clon más grande. Se discute más abajo. No
corresponde a ninguna secuencia conocida.
La secuencia nucleotídica (SEQ ID NO: 7), tiene
1121 bases de longitud, incluyendo un marco de lectura abierto de
537 pares de bases, que codifica una proteína de 179 aminoácidos de
longitud. El peso molecular predicho de la proteína es de 20.093.
Hay dos codones ATG adicionales que, si actuaran como codones de
inicio, producirían proteínas de 172 y 167 aminoácidos de longitud,
con pesos moleculares de 19.335 y 18.770 daltons, respectivamente.
Cada forma de la proteína se caracteriza por una secuencia de
aminoácidos hidrofóbicos que serían escindidos de la molécula por
el retículo endoplásmatico, para proporcionar la proteína
madura.
El análisis de la secuencia muestra tres motivos
ricos en AT (TTATTTAT). Estos motivos se encuentran a menudo en
regiones 5' no traducidas de citoquinas y oncogenes. Kruys, et
al., Science 245: 852 (1989), han demostrado que estas
repeticiones modulan la estabilidad del mRNA para TIF.
El cDNA aislado y analizado en el ejemplo 6, más
arriba, se usó, a continuación, como sonda para identificar DNA
genómico para TIF\alpha.
Siguiendo métodos estándar, se cribó con SEQ ID
NO: 7 una biblioteca genómica generada a partir de la cepa 129 de
ratón. Se suclonó un fragmento de EcoRI procedente de un clon
positivo en el plásmido pZERO y se secuenció parcialmente. La
secuencia parcial se presentó como SEQ ID NO: 8.
Se subclonó también un segundo fragmento de
EcoRI procedente del clon positivo descrito en el ejemplo 7 de más
arriba. Hubo una elevada homología, si bien las secuencias no eran
idénticas. Para ser concreto, el intrón 1 de esta secuencia era un
98% idéntica a SEQ ID NO: 8, el intrón 2 era un 100% idéntico y el
intrón 3 era un 92% idéntico.
Lo que sorprende de las secuencias es que no
todos los promotores son homólogos, lo que sugiere una regulación
independiente. Las regiones en 5' sin traducir eran idénticas en un
92%. El primer exón de TIF\alpha se divide en el exón 1\alpha y
en el exón 1\beta. El primer exón codificante (que es el exón 1b
para TIF\alpha y el exón 1 para TIF\beta) son un 99.5%
idénticos, mientras que los segundos exones son 100% idénticos, los
terceros exones son un 97% idénticos, los cuartos exones son un
98.5% idénticos, y el quinto exón es un 96% idéntico. En la región
3' no traducida la homología es del 96%.
Utilizando la información descrita en el ejemplo
8 de más arriba, se dedujo una secuencia de cDNA para el segundo
clon, designado TIF\beta, y se muestra como SEQ ID NO: 9. También
se averiguó la secuencia de DNA genómico, de la misma manera que se
ha descrito más arriba, y se muestra como SEQ ID NO: 29.
Al comparar con la región codificante de
TIF\alpha, TIF\beta tiene seis cambios silenciosos. Hay dos
cambios que resultan en un cambio de aminoácidos de poca
importancia (en las posiciones 36 y 113, una Val en TIF\alpha
pasa a ser una Ile en TIF\beta). Hay también un cambio más
significativo en la posición 112, donde una Gln pasa a ser una
Arg.
Se llevaron a cabo experimentos para estudiar la
expresión de los TIFs. Se estimularon células BW 5147 con
IL-9 murino recombinante (200 U/ml), durante
periodos de tiempo variables (0.2, 0.5, 1, 2 y 24 horas). A
continuación, se aisló el RNA total usando métodos y reactivos
estándar. Se llevó a cabo, a continuación, la transcripción inversa
usando 5 \mug de RNA total y un cebador oligo (dT). Se
amplificaron, a continuación, muestras de cDNA correspondientes a
20 ng de RNA total durante 25 ciclos usando diferentes cebadores.
(Un ciclo era de 4 minutos a 94ºC, 1 minuto a 57ºC, y 2 minutos a
72ºC). Los cebadores de TIF fueron:
- 5'-CTGCCTGCTT CTCATTGCCC T-3'
- (SEQ ID NO: 10); y
- 5-CAAGTCTACC TCTGGTCTCA T-3'
- (SEQ ID NO: 11)
(sentido y antisentido, respectivamente).
Estas corresponden a los nucleótidos
106-126, y 764-784 de SEQ ID NO: 7,
respectivamente. Como control se amplificó también la
\beta-actina durante 18 ciclos (primer ciclo: 4
minutos a 94ºC, 1 minuto a 60ºC, 2 minutos a 72ºC. Los ciclos
siguientes fueron de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC, 2 minutos a
72ºC).
Después de la amplificación, los productos
post-PCR fueron analizados en un gel de agarosa y se
confirmó la amplificación específica, siguiendo técnicas de
transferencia (en inglés "blotting"), usando sondas
radiactivas internas. La sonda para TIF fue:
- 5'-GACGCAAGCA TTTCTCAGAG-3'
- (SEQ ID NO: 12)
Las condiciones y sondas indicadas no fueron
específicas de una o más formas de TIF; sin embargo, el producto de
amplificación de TIF\alpha contiene un sitio de restricción KpnI,
mientras que no contiene el sitio de restricción para TIF\beta.
La digestión de los productos de amplificación con KpnI indicó que
prácticamente todos, sino todos, los mRNA de TIF nducidos por
IL-9 eran TIF\alpha, sugiriendo que la expresión
de TIF\alpha era inducida rápidamente por la
IL-9. El mRNA para TIF\alpha era detectable
después de 30 minutos de estimulación y se estancó pasado un
periodo de tiempo de 1-24 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, se llevaron a cabo experimentos
que demostraban que la inducción de mRNA de TIF por
IL-9, descrita más arriba, no requiere la síntesis
de proteína. En estos experimentos se extrajo el RNA total de
células estimuladas durante 24 horas, según se ha descrito en el
ejemplo 10, pero con o sin 10 \mug/ml de un inhibidor de síntesis
de proteína, cicloheximida, durante 4.5 horas. En una serie de
experimentos en paralelo, no se estimularon las células. Se extrajo
el RNA total, y se llevó a cabo la amplificación por
RT-PCR según se ha descrito en el ejemplo 10. Los
productos post-PCR se analizaron en un gel de
agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. Lo que se observó fue
que la inducción por IL-9 sucedía aún cuando la
síntesis proteica estaba bloqueada. Así, el efecto de
IL-9 es un efecto directo que no requiere de la
síntesis de un mediador proteico.
\vskip1.000000\baselineskip
En estos ensayos se estudió el papel de las
proteínas STAT en la inducción de mRNA de TIF en derivados de la
línea celular BW5147. La primera línea, BWh9R, expresa receptores de
IL-9 humanos de tipo salvaje. La línea
BW-Phe116 es un transfectante con un sola mutación
(en la posición 116), que hace que el receptor sea incapaz de
activar los factores de transcripción STAT. Todavía otra línea
celular, BW-mut6, tiene una mutación que hace que
el receptor sea incapaz de activar STAT5 si bien retiene la
capacidad de activar STAT1 y STAT3. Finalmente, la línea celular
BW-mut7 tiene una única mutación que hace que el
receptor de IL-9 sea incapaz de activar STAT1 y
STAT3, pero retiene la capacidad de activar STAT5.
La estimulación celular, el aislamiento de RNA
total, la transcripción inversa y la amplificación del cDNA se
llevaron a cabo según se describe en el ejemplo 10 (Se estimularon
las células durante 24 horas. Se usaron tanto IL-9
humana como recombinante murino). Se analizaron los productos de
PCR en gel de agarosa al 1% teñida con bromuro de etidio, según se
ha descrito más arriba.
El análisis reveló que la IL-9
humana no inducía expresión en BW-Phe116, lo que
sugería que los factores de transcripción STAT están implicados. Se
encontró que IL-9 inducía expresión de TIF en el
mutante BW-mut6, pero no en la variante mut7,
sugiriendo que STAT1 o STAT3 están implicados, no así STAT5.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió la expresión del mRNA de TIF en
células de bazo de ratón normal.
Se cultivaron las células de bazo de ratones
Balb/c de 10-12 semanas de edad durante 24 horas en
un medio control o medio control complementado con 20 \mug/ml de
LPS (que activa linfocitos B y macrófagos), o ConA (que activa las
células T), o ConA junto con un 1% de un antisuero bloqueante de
IL-9 de murino, usándose la
\beta-actina como control. La purificación del
RNA y el análisis de RT-PCR se llevaron a cabo según
se ha descrito más arriba.
Los datos indicaron que TIF está, en el mejor de
los casos, muy débilmente expresado en las células de bazo en
reposo, que no estaba inducido por LPS, pero sí fuertemente inducido
por ConA. El antisuero anti-IL-9 no
afectó a la inducción por ConA, lo que sugiere que su efecto no está
mediado por IL-9, o está mediado por otras
citoquinas.
Cuando se analizaron las células de bazo
activadas con ConA usando las secuencias de los productos de
RT-PCR, se encontró que estas células estaban
expresando TIF\alpha de manera predominante o exclusiva.
Experimentos adicionales demostraron que el mRNA
de TIF se expresaba incluso en ausencia de inducción de
IL-9.
Se enriquecieron células de bazo de ratones FVB
de 5 semanas de edad con células T usando una columna de nylon y
lana. A continuación, se estimularon las células durante 24 horas en
un medio complementado con ConA (un activador de células T) o PMA
(que activa PKC en la mayoría de las células), ya sea con o sin
IL-9.
Se aisló el RNA total usando técnicas estándar
y, a continuación, se fraccionaron muestras de diez microgramos
mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1.3% que contenía
formaldehído 2.2M. Las fracciones se transfirieron, a continuación,
a una membrana de nitrocelulosa, se marcó y se ensayó en un ensayo
de hibridación siguiendo Van Snick, et al, J. Exp. Med. 169:
363 (1989).
Los resultados indicaron que la inducción de
TIF no era modificada por ConA y que IL-9 no inducía
el RNA de TIF en células de bazo activadas con PMA.
Se estudió la expresión del mRNA de TIF en
diversas líneas celulares. En estos experimentos se estimularon
líneas celulares murino durante al menos un día con una citoquina
particular. Específicamente, 9T7 es un linfoma de células T que
responde a IL-2, IL-4 o
IL-9. Las líneas celulares TS3 y TS6 se derivan de
clones de células T auxiliares y proliferan en presencia de
IL-2 o IL-9. MC9 y LI38 son líneas
de mastocitos que proliferan en presencia de IL-3 o
IL-9.
Después de la estimulación, se preparó el RNA
total usando lisis con isotiocianato de guanidinio y centrifugación
con gradiente de CsCl.
La línea 9T7 se analizó, a continuación,
mediante transferencia Northern, según se ha descrito en el ejemplo
14, mientras que se ensayaron otras líneas usando el análisis por
RT-PCR, según se ha descrito más arriba.
Se encontró que IL-9
sobre-regulaba la expresión de TIF en células T
auxiliares y mastocitos, mientras que IL-2 y
IL-3 no. La línea de células 9T7, sin embargo,
mostró aproximadamente el mismo nivel de expresión, a pesar de la
citoquina, lo cual indica que IL-9 no es
obligatoria para la expresión de TIF.
Se estudió, a continuación, la expresión del
mRNA de TIF en líneas de células B. Las líneas celulares A20, 70Z/3
y BCL-1 son líneas celulares de leucemia de células
B que crecen, in vitro, sin citoquinas. Estas células se
estimularon durante 24 horas con IL-4 y
IL-9 y se aisló el RNA total usando métodos
estándar. Se analizó la expresión mediante RT-PCR,
la cual se llevó a cabo durante 35 ciclos, seguida de la técnica de
transferencia e hibridación, según se ha descrito más arriba.
Los resultados indicaron que la expresión de
TIF es detectable en células B, pero está débilmente
sobre-regulada en el mejor de los casos en presencia
de IL-9 y IL-4.
Se llevaron a cabo experimentos para estudiar la
expresión de las moléculas inventivas en líneas de células T
auxiliares. TS2 y TS1 son líneas de células T auxiliares derivadas
de clones de células T auxiliares que proliferan en presencia de
IL-9 o IL-2 (TS2), y
IL-9 o IL-4 (TS1).
Específicamente, las células TS1 o TS2 se
hicieron crecer en presencia de las citoquinas listadas durante al
menos 10 días, después de lo cual se extrajo el RNA usando métodos
conocidos. La expresión de las moléculas se estudió mediante
RT-PCR (35 ciclos) usando los protocolos descritos
más arriba. En células TS1 tanto IL-4 como
IL-9 inducen expresión de TIF, pero no lo hace así
la IL-2 en células TS2.
Se estudió la expresión del mRNA de TIF en
varios órganos de ratón. Se preparó el RNA total de hígado, riñón,
corazón, cerebro, intestino, bazo, timo, pulmón, músculo y médula
usando metodologías estándar de isotiocianato de guanidinio y
centrifugación con gradiente de CsCl. Se llevaron a cabo cuarenta
ciclos de RT-PCR usando los protocolos descritos
más arriba. La expresión más potente se encontró en el tejido de
timo mientras que las señales menos intensas se encontraron en el
tejido cerebral y se dio expresión más débil en los demás
tejidos.
Los siguientes experimentos describen la
producción de TIF\alpha en células 293-EBNA.
El DNA complementario de TIF\alpha se
describió más arriba. Se subclonó en un vector de expresión
disponible comercialmente pCEP-4, en unión
operativa con un promotor CMV. Los plásmidos resultantes se
transfectaron en células 293-EBNA, usando métodos
de lipofectamina estándar. A continuación de la transfección, se
incubaron las células en un medio libre de metionina complementado
con metionina marcada con ^{35}S, durante 24 horas. Se recogió el
sobrenadante y se hizo correr en un gel de acrilamida seguido de
electroforesis. El gel se secó, a continuación, y se expuso a
autorradiografía durante 1 día. Se hizo correr, a continuación, un
control mediante transfección de células con el mismo plásmido, en
el cual se subclonó el cDNA en dirección antisentido.
Se encontró una banda heterogénea de
aproximadamente 25-30 kilodaltons procedente de las
células transfectadas con TIF en la dirección sentido. Cualquier
discrepancia entre el peso molecular predicho, el peso molecular
actual en el sistema y la heterogenicidad, se pueden atribuir a la
glicosilación. En una serie de ensayos en paralelo, se expresó el
cDNA codificante de la TIF humana de la misma manera que se expresó
el cDNA murino. Con la excepción del cambio del cDNA, todos los
parámetros fueron los mismos.
Se llevaron a cabo experimentos adicionales para
estudiar la producción de TIF\alpha en células COS.
Específicamente, se subclonó el cDNA de TIF\alpha en el plásmido
pEF-BOS.puro descrito por Demoulin et al.,
más arriba, unido operativamente al promotor
EF-1\alpha. El plásmido con el cDNA se transfectó
en células COS, usando el mismo método de lipofectamina descrito
más arriba. Las células se incubaron en medio libre de metionina,
complementado con metionina marcada con ^{35}S durante 24 horas,
después de lo cual se trató el sobrenadante como se describe en el
ejemplo 20, supra. Otra vez se observó una banda heterogénea
de 25-30 kilodaltons así como una banda de 18
kilodaltons que probablemente represente una forma no glicosilada de
la molécula.
En estos experimentos se descubrió que TIF
induce la activación de STAT en células de hepatoma, melanoma
neuronal y mesangiales. Se conoce que cuando las citoquinas activan
los factores STAT, los factores dimerizan, se desplazan del
citoplasma al núcleo y se unen a las secuencias diana de los
promotores. A continuación se detallan los experimentos
seguidos
Se usaron células 293-EBNA
transfectadas según se ha descrito más arriba después de la
incubación en medio normal durante 48 horas, como lo fueron el
sobrenadante de los controles, también descrito más arriba. Se
usaron muestras de una línea de células mesangiales de riñón de
ratón (de aquí en adelante "MES13"), una línea celular
feocromocitoma de rata (de aquí en adelante "PC12"), cuatro
melanomas humanos diferentes (SK23, AUMA, NA-8mel y
MULL), hepatoma humano (HepG3) y hepatoma de rata
(H-4-II-K). Se
estimularon las muestras celulares (0.5x10^{6}) durante
5-10 minutos en presencia de un 1% de sobrenadante.
Los extractos nucleares se prepararon, a continuación, de acuerdo
con Demoulin et al., Mol. Cell. Biol, 16: 4710 (1996).
Resumiendo, se lavaron las células con PBS y se volvieron a
suspender, a continuación, en 1 ml de tampón hipotónico enfriado con
hielo durante 15 minutos. (El tampón fue tampón HEPES 10 mM, pH 7.5,
con KCl 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, glicerol al 5%, EDTA 0.5 mM, EGTA
0.1 mM, ditiotreitol 0.5 mM, y Pefabloc 1 mM, Na_{3}V_{4} 1 mM
y NaF 5 mM). A continuación se lisaron las células mediante la
adición de 65 \mul de NP-40, seguido de agitación
con vórtex. Los núcleos se peletelizaron mediante agitación con
vórtex durante 30 segundos a 14,000 rpm, seguido de la extracción
en un tampón complementado con HEPES (20 mM), glicerol (20%) y NaCl
(420 mM). Se eliminó la debris nuclear centrifugando durante 2
minutos. La actividad de unión a DNA se determinó de acuerdo con
Demoulin et al., supra, usando un oligonucleótido de
doble cadena marcado con ^{32}P denominado "GRR," el cual
contiene el sitio de unión a STAT del promotor del gen Fc\gammaRI,
es decir:
- 5'ATGTATTTCC CAGAAA-3'
- (SEQ ID NO: 13)
y
- 5'-CCTTTTCTGG GAAATAC-3'
- (SEQ ID NO: 14)
que corresponden a las cadenas superior e
inferior de los sitios de unión en la sonda de GRR. Brevemente, se
incubó un volumen de 5 \mul de extracto nuclear en tampón de
unión (HEPES 12 mM, pH 7.6, KCl 10 mM, EDTA 0.5 mM, glicerol al
2.5%, 0.1 mg de poli(dI-dC) por ml) durante 5
minutos. La sonda GRR radiomarcada (10^{5}cpm; aproximadamente
0.5ng) se añadió y se continuó la incubación durante 25 minutos
antes de cargar sobre un gel de poliacrilamida no
desnaturalizante.
También se vio que los complejos observados en
células MES13, descritas más arriba, estaban parcialmente
desplazadas (en inglés "overshifted") tanto por
anticuerpos anti-STAT5 como por anticuerpos
anti-STAT3, que demostraba que (i) las células en
examen eran dianas para TIF, y (ii) que STAT3 y STAT5 son los
componentes principales del complejo activado por TIF. La
diferencia en el perfil STAT, cuando se compara con el perfil del
Ejemplo 12 de más arriba, es atribuible a la diferencia en la fuente
de células (humanas versus ratón). También se observó que la TIF
humana funciona en células murino y viceversa.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo detalla el aislamiento y clonación
de una molécula de ácido nucleico que codifica la TIF humana.
Primero, las células mononucleares de sangre periférica humana se
prepararon mediante centrifugación por gradiente de densidad
estándar. A continuación de esta preparación, se cultivaron las
muestras durante 24 horas a 3 x 10^{6} células/ml, ya sea con o
sin anticuerpo monoclonal anti-CD3 (El anticuerpo
fue OKT3 mAb disponible comercialmente y se usó en la forma de
fluido de ascitos a una dilución 1/500). Se usó este anticuerpo
porque las citoquinas derivadas de células T se expresaban
generalmente únicamente tras la activación mediante, por ejemplo,
anticuerpos específicos CD3.
Se aisló el RNA total de estas células usando
las técnicas estándar isotiocianato de
guanidinio/ultracentrifugación con CsCl. Después del aislamiento, se
transcribieron de manera inversa 10 \mug de muestras usando un
cebador de oligo (dT)15.
Después de la preparación del cDNA, según se ha
subrayado más arriba, se amplificaron muestras que correspondían a
100 ng de RNA total, mediante PCR, usando los siguientes
cebadores:
- 5' - AGCTGCTCAA CTTCACCCTG GA - 3'
- (SEQ ID NO: 15)
- 5' - CCACTCTCTC CAAGCTTTTT CA - 3'
- (SEQ ID NO: 16)
que se basan en la secuencia de cDNA murino
(i.e., SEQ ID NO: 7). Las condiciones de PCR implicaron 30 ciclos
de amplificación, con un ciclo definido como 1 minuto a 94ºC,
seguido de 1 minuto a 42ºC, y a continuación 2 minutos a 72ºC. El
producto de amplificación se separó en un gel de agarosa, usando
métodos estándar y seguidamente se secuenció. El resultado indicó
que se habían amplificado los fragmentos de cDNA. Por lo tanto, se
llevó a cabo una segunda reacción usando los mismos materiales
excepto la SEQ ID NO: 16 que se reemplazó por la SEQ ID NO: 17,
i.e.:
5' - CAAGTCTACC TCTGGTCTCA T - 3'
Esta segunda reacción de PCR se llevó a cabo
durante 25 ciclos, un ciclo siendo de 1 minuto a 94ºC, seguido de 1
minuto a 45ºC, y a continuación 2 minutos a 72ºC. El producto de
amplificación se sometió a las mismas etapas que la primera. Se
amplificaron otra vez los fragmentos de cDNA.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de preparar el producto de
amplificación, se aisló el extremo 5' del cDNA usando técnicas
estándar 5'-RACE. Brevemente, se preparó una
primera cadena de cDNA usando SEQ ID NO: 18 como cebador, i.e:
5' - TGGCCAGGAA GGGCACCACC T - 3'
Este cebador se basó en la información de
secuencia obtenida de acuerdo con el ejemplo 22. En resumen, el
método 5' - RACE se llevó a cabo combinando 1 \mug de RNA total,
preparado según se ha descrito más arriba, 2.5 pmoles de SEQ ID NO:
18, transcriptasa inversa, tampón para transcriptasa inversa, 2.5
\mul de mezcla de dNTP (10 mM), 2.5 \mul de MgCl_{2} (25 mM),
y 2.5 \mul de ditiotreitol (0.1 M). Se llevó a cabo la reacción
y, después de su completación, se eliminó el RNA original mediante
adición de RnasaH y Rnasa TI. Se eliminó cualquier dNTP no
incorporado así como cebadores y proteínas. Se disminuyó el cDNA
usando la transferasa terminal o "TdT." Esta enzima crea un
sitio de unión en 3' para el cebador de ancla abreviado según se
describe más abajo. La disminución se llevó a cabo combinando la
primera cadena de cDNA purificada, TdT, tampón
(Tris-HCl 10 mM, KCl 25 mM, MgCl_{2} 1.5 mM, y
200 \muM de dCTP.
A continuación de la reacción de disminución, se
llevó a cabo la PCR usando:
- 5' - TGGCCAGGAA GGGCACCACC T - 3'
- (SEQ ID NO: 19),
y el cebador ancla abreviado 5' - RACE:
- 5' - GGCCACGCGT CGACTAGTAC GGGIIGGGIIGGGIIG - 3'
- (SEQ ID NO: 20).
La amplificación implicó 35 ciclos (1 ciclo
definido como 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 56ºC, y 2 minutos a
72ºC). Después de esto, se llevó a cabo la amplificación anidada de
5 \mul de una dilución 1/100 del producto de la amplificación
usando SEQ ID NO: 19 y el cebador de amplificación universal
abreviado:
- 5' - GGCCACGCGT CGACTAGTAC - 3'
- (SEQ ID NO: 21).
La amplificación implicó 30 ciclos (1 ciclo
estando definido como 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 56ºC, y 2 minutos
a 72ºC). El producto resultante de la PCR se clonó, siguiendo
procedimientos estándar, y se secuenció.
Estos tres protocolos, i.e., los dos
experimentos descritos más arriba que generaron los fragmentos, y la
PCR 5' - RACE, también descrita más arriba, permitieron la
alineación del producto de amplificación secuenciado para generar
la secuencia completa.
Después de la alineación, se generaron los
oligonucleótidos que flanqueaban el marco de lectura abierto
deducido, i.e.:
- 5' - CCTTCCCCAG TCACCAGTTG - 3'
- (SEQ ID NO: 22)
y
- 5' - TAATTGTTAT TCTTAGCAGG - 3'
- (SEQ ID NO: 23).
Estos cebadores se usaron para amplificar el
marco de lectura abierto completo usando el mRNA de células
estimuladas con mAb específicos de CD3, según se ha descrito más
arriba. Para la amplificación, 25 ciclos (1 ciclo estando definido
como 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 56ºC, y 2 minutos a 72ºC).
La secuencia completa del cDNA humano se indica
en SEQ ID NO: 24.
Como con la secuencia de murino, existen codones
potenciales de inicio en las posiciones de SEQ ID NO: 24 que
corresponden a los aminoácidos 1 y 13, así como codones
correspondientes a metionina en las posiciones aminoacídicas 58,
85, y 92. Los posibles codones iniciadores corresponden a proteínas
con pesos moleculares calculados de 19.998 daltons y 18.735 daltons
respectivamente (para los aminoácidos 176 ó 167, respectivamente).
Como sucedía con la forma murino de la proteína, se observan las
secuencias líder hidrofóbicas, lo que indica una secuencia señal
N-terminal de aproximadamente 20 a aproximadamente
40 aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos experimentos detallan el trabajo sobre el
aislamiento del DNA genómico humano correspondiente al cDNA
discutido más arriba.
En base a las secuencias de cDNA, se
desarrollaron cebadores que corresponden a los nucleótidos
51-70 y el complementario de los nucleótidos
631-650 de SEQ ID NO: 24. Se llevó a cabo la PCR
usando metodologías estándar. Específicamente, se usaron 100 ng de
DNA genómico como plantilla y se llevaron a cabo 33 ciclos de
amplificación (un ciclo de amplificación estando definido como 94ºC
durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 5
minutos). Una vez se aisló una secuencia, esta se secuenció y se
indica en SEQ ID NO: 25. La secuencia es de unas 4.8 kilobases de
longitud, y se cree que contiene la secuencia genómica completa que
codifica la molécula TIF, que carece, únicamente, de la región
flanqueante en 5', el promotor y el extremo en 3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Era de interés identificar dónde se localizaba
el DNA genómico discutido más arriba dentro del genoma humano. Con
el fin de hacer esto, se llevaron a cabo dos aproximaciones
diferentes. En la primera, la secuencia discutida más arriba, i.e.,
SEQ ID NO: 25, se marcó con una etiqueta fluorescente y, a
continuación, se usó para sondear el genoma humano mediante
hibridación in situ de fluorescencia ("FISH") usando
métodos estándar.
En una segunda aproximación, se cribó un panel
de clones híbridos radiactivos usando la sonda que consistía en los
nucleótidos 51-70 de SEQ ID NO: 24 y
5'-ATCAGATGGA TTACTGAATG-3' (SEQ ID
NO:26). Se llevó a cabo la PCR usando 25 ng de DNA genómico como
plantilla, durante 35 ciclos, donde un ciclo se define como 94ºC
durante un minuto, 55ºC durante un minuto y 72ºC durante 2
minutos.
Ambas metodologías indicaron que el gen se
localiza en el cromosoma 12q15. Algunos trabajos relacionan
enfermedades asociadas con el asma en este sitio. Véase, por
ejemplo, Nat. Genet. 15:389-392 (1997); Ober, et
al, Hum. Mol Genet.
7(9):1393-1398(1998); Nickel, et
al, Genomic 46(1):159-162(1997);
Takahashi, et al, Genomics
44(1):150-2(1997); Barnes, et
al, Genomics
37(1):41-50(1996).
Estos experimentos describen la fabricación de
anticuerpos que se unen a la proteína TIF. Para prepararlos, se
acopló un péptido que consistía en los aminoácidos
40-61 codificados por SEQ ID NO: 7 a una proteína
portadora KLH, usando métodos estándar y una proporción de 1 mg de
péptido para 1 mg de proteína portadora. Los animales sujeto
(conejos), se inmunizaron 3 veces, a intervalos de 2 semanas, con
150 \mug del complejo. El inmunógeno se emulsificó en adjuvante
completo de Freund para la primera inyección y, a continuación,
adyuvante incompleto de Freund para las dos siguientes.
Se realizó una primera extracción de sangre un
mes después de la última inyección y se preparó el suero siguiendo
métodos conocidos.
Se ensayó el suero, a continuación, en una
transferencia Western estándar. Brevemente, 10 \mul de
sobrenadante procedente de células infectadas con SEQ ID NO: 7 o
SEQ ID NO:24 se separaron mediante electroforesis
SDS-PAGE y, a continuación, se transfirieron a
membranas de PVDF. Se diluyó el antisuero a 1:500 y se usó en un
protocolo de transferencia Western estándar junto con anticuerpo
anti-conejo como anticuerpo secundario, y un kit de
detección disponible comercialmente.
Se encontró que el suero, de hecho, reconocía,
la proteína TIF.
En la Figura 1 se indican las secuencias de
aminoácidos deducidas para la TIF humana y murino. El alto grado de
homología se observa en las regiones incluidas en cajas.
Los ejemplos precedentes describen la invención,
un aspecto de la cual son las moléculas de ácido nucleico aisladas
que codifican proteínas TIF tales como las que tienen la secuencia
de aminoácidos de la proteína codificada por la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 7, 24 ó 25. Será apreciado por el experto
en la materia que la degeneración del código genético facilita la
preparación de moléculas de ácido nucleico que no sean idénticas a
la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, 24 ó 25, pero que
codifican la misma proteína. Por supuesto, las secuencias SEQ ID
NOS: 7, 24 y 25 son realizaciones preferidas de esta invención. El
DNA genómico, DNA complementario y RNA, tal como el RNA mensajero,
se incluyen aquí. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de otras
especies animales, incluyendo otros mamíferos, también forman parte
de la invención. Un aspecto preferido de la invención son las
moléculas de ácido nucleico cuyas complementarias hibridan con SEQ
ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ó SEQ ID NO: 24 bajo
condiciones rigurosas. "Condiciones rigurosas" tal y como se
usa en el presente documento, se refieren, por ejemplo, a
hibridación a 65ºC en tampón (3.5xSSC), Ficoll al 0.02%,
polivinilpirrolidona al 0.02%, albúmina de suero bovino al 0.02%,
NaH_{2}PO_{4} 25 mM (pH 7), SDS al 0.1%, EDTA 2 mM, seguido de
un lavado final a 2xSSC, temperatura ambiente y, a continuación,
0.1xSSC/0.2xSDS a temperaturas tan altas como, por ejemplo,
aproximadamente 65ºC. Condiciones más restrictivas, tal como
0.1xSSC, también se pueden usar. Estas moléculas de ácido nucleico
codifican proteínas de unos 17-22 kD según se
determina por SDS - PAGE, la cual activa proteínas STAT, tal como
STAT 1, STAT3 y/o STAT5. En forma glicosilada, estas proteínas se
pueden encontrar en el rango de aproximadamente 17 a
aproximadamente 30 kilodaltons, según se determina por SDS -
PAGE.
También forman parte de la invención los
vectores de expresión que incluyen las moléculas de ácido nucleico
de la invención unidas operativamente a un promotor de manera que
se facilite la expresión del DNA. Forma parte del conocimiento del
experto la preparación de dichos vectores.
Los vectores, así como las moléculas de ácido
nucleico per se, se pueden usar para preparar células
recombinantes, que son eucariotas o procariotas, en donde el vector
de expresión o la molécula de ácido nucleico por sí misma se
incorpora en los mismos. Células de E. coli, células COS,
células CHO, etc., son todas ejemplos de tipos de células que se
pueden usar de acuerdo con el aspecto de la invención.
Las proteínas codificadas por las moléculas de
ácido nucleico más arriba indicadas, preferiblemente en forma
aislada, son otra característica de esta invención. Por
"proteína" se entiende tanto el producto inmediato de la
expresión de las moléculas de ácido nucleico, formas glicosiladas de
la misma, así como formas multiméricas, tales como dímeros,
trímeros, y demás. También son una parte de la invención los
multímeros, tales como dímeros, que contienen al menos una molécula
proteica de la invención y al menos una molécula proteica
diferente. Preferiblemente, esta molécula proteica diferente es una
citoquina, tal como IL-10. También se incluye como
una característica de la invención las construcciones, tales como
proteínas de fusión, en las que toda o parte de la proteínas
descritas más arriba se unen de alguna manera, tal como en una
proteína de fusión, a al menos una proteína o péptido o secuencia
aminoacídica. La "pareja de fusión" puede ser, por ejemplo,
una molécula que proporcione una señal reconocible, ya sea de manera
directa o indirecta, tal como un péptido FLAG,
\beta-galactosidasa, luciferasa, y demás. Estas
parejas de fusión se unen preferiblemente a la molécula que se ha
descrito más arriba por el extremo N-y/o C- terminal
de la proteína; sin embargo, se debe entender que existen muchas
técnicas conocidas para unir moléculas a aminoácidos, y que
cualquiera y cada una de estas metodologías pueden producir
construcciones que forman parte de la invención.
Las moléculas proteicas moleculares de la
invención, como se ha indicado más arriba, tendrán preferiblemente
un peso molecular de aproximadamente 17 a aproximadamente 30
kilodaltons, según se determina por SDS-PAGE. En
formas multiméricas, el peso molecular del complejo variará, por
supuesto, pero las moléculas TIF contenidas tendrán un peso
molecular de aproximadamente 17 a 30 kilodaltons, según se
determina por SDS-PAGE.
Las proteínas consisten, preferiblemente, en al
menos aproximadamente 120 y no más de 200 aminoácidos.
Preferiblemente, las secuencias aminoacídicas consisten en o
comprenden toda o parte de las secuencias aminoacídicas codificadas
por SEQ ID NOS: 7,8, 9, 24 ó 25. Más preferiblemente, la secuencia
de aminoácidos contiene todos excepto los aproximadamente 40
primeros aminoácidos codificados por dichas SEQ ID's. Incluso más
preferiblemente, contiene aproximadamente todos excepto los
primeros 20 aminoácidos codificados por estas secuencias. Más
preferiblemente, la proteína comprende los aminoácidos indicados en
SEQ ID NO: 27 ó 28.
Será apreciado por el experto en la materia que
las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico
indicadas más arriba son una característica de la invención y que
se pueden usar para producir anticuerpos, de acuerdo con protocolos
estándar. Dichos anticuerpos, en forma monoclonal y policlonal,
constituyen un aspecto más de la invención así como los fragmentos
de dichos anticuerpos, formas quiméricas, formas humanizadas,
formas recombinantes y demás. También son un aspecto de la
invención los inmunógenos, que comprenden toda o parte de las
secuencias de aminoácidos de las moléculas proteicas,
preferiblemente combinadas con un adyuvante, tal como adyuvante
completo o incompleto de Freund. Las porciones de secuencias
proteicas se pueden unir a otras moléculas, tal como la hemocianina
de lapa "ojo de cerradura" (en inglés "keyhole limpet
hemocyanin") para hacerlas más inmunogénicas. Estos
anticuerpos se pueden usar, p.e., para determinar si están
presentes las proteínas de la invención. Este es otro aspecto de la
invención, tal y como ahora se explica. Se ha encontrado, en los
ejemplos, que las moléculas de ácido nucleico de la invención se
expresaban en presencia de la IL-9. Así, un aspecto
más de la invención es un procedimiento para determinar si está o
ha estado presente IL-9, en donde se detecta si las
proteínas de la invención, usando por ejemplo anticuerpos o mRNA
usando las moléculas de ácido nucleico de la invención como sondas.
El mRNA se puede determinar directamente o en la forma de cDNA.
Dichas sondas pueden estar o no marcadas, como aspecto a
seleccionar por el usuario. Así, uno puede determinar, por ejemplo,
si tras la administración de IL-9, la citoquina
todavía es eficaz, determinando si la molécula de ácido nucleico de
la invención está presente. Este tipo de ensayo se puede adaptar a
estudios cuantitativos donde uno determina, por ejemplo, si una
célula es sensible a IL-9, y si es así, cómo de
sensible es. Uno puede usar también las proteínas de la invención
para fosforilar proteínas STAT tales como STAT 1, STAT3 y/o STAT 5.
Esto a su vez resulta en la dimerización de la proteína STAT,
seguido de la migración al núcleo para provocar el efecto que estas
proteínas STAT tienen sobre las células.
Uno podría también usar estas moléculas para
probar la eficacia de agonistas o antagonistas de
IL-9 cuando se administran a un sujeto, tal como un
sujeto que sufre un linfoma, una afección del sistema inmune tal
como una alergia, el síndrome de inmunodeficiencia adquirido,
diabetes autoinmune, tiroiditis o cualquiera de las afecciones
descritas, por ejemplo, en las patentes US No. 5,830,454; 5,824,551
y 5,935,929. Las moléculas también se pueden usar para mediar en el
papel de IL-9 en estas y otras afecciones. Para
explicar detalladamente, puesto que IL-9 induce a
las TIF, las TIF son útiles como mediadores de la actividad
IL-9. Así, un aspecto más de la invención es un
procedimiento para determinar la actividad de la
IL-9 endógena, tal como en situaciones en las que
está implicado un exceso de actividad de IL-9, tal
como asmas, alergias y linfomas. Uno puede también bloquear o
inhibir la actividad de IL-9, bloqueando o
inhibiendo TIF o la actividad de TIF, usando, por ejemplo,
moléculas antisentido, anticuerpos que se unen a TIF u otros
antagonistas de estas moléculas. Por ejemplo las m uteínas de TIF,
que se unen al receptor pero no lo activan, inhibiendo de esta
manera la actividad inducida por IL-9, son una
característica de la invención. Ejemplos de afecciones que se
pueden tratar usando dichas muteínas de TIF son las alergias, asma y
demás. Las muteínas, de acuerdo con la invención se pueden preparar
de acuerdo con, por ejemplo, Weigel, et al, Eur. J. Biochem
180(2):295-300(1989) y Epps, et
al, Cytokine 9(3):149-156(1997).
Dichas muteínas se pueden usar en el tratamiento del asma, las
alergias o ambos. Además, será evidente para el experto en la
materia que los modelos indicados más arriba se pueden usar para
cribar las muteínas adecuadas. La capacidad de regular la actividad
IL-9 es importante en afecciones tales como las
indicadas en la lista de más arriba, así como en afecciones tales
como la apoptosis, incluyendo la apoptosis inducida por cortisol,
afecciones que implican la expresión nuclear de
BCL-3, puesto que IL-9 es conocida
por inducir dicha expresión, y demás. "Anticuerpos," tal y como
se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier porción
de anticuerpo que se une a TIF, incluyendo anticuerpos quiméricos y
humanizados.
Otra característica de la invención se refiere a
la capacidad de las moléculas de tipo TIF de la invención a
promocionar la regeneración o inhibir la diferenciación de los tipos
de tejido en los que las moléculas son activas. Como se demostraba
más arriba, las moléculas TIF dirigen varias líneas celulares
normales y cancerígenas (i.e., células mesangiales y neuronales así
como células de melanoma y hepatoma). Así, uno puede estimular la
regeneración del tejido mediante, por ejemplo, la adición de una
cantidad de una molécula del tipo TIF a una muestra que necesita
que tenga lugar la regeneración mediante la molécula TIF. Esta
aproximación se puede usar tanto in vitro como in
vivo. De manera similar, los antagonistas de TIF se pueden
añadir cuando la situación es una en la que el objetivo es inhibir
la diferenciación de un tipo concreto de tejido, tal como un
melanoma o hepatoma.
Los genes que codifican TIF, tal y como se
indica en el Ejemplo 25 de más arriba, se localizan en el cromosoma
12. Este cromosoma se asocia con asma, tal y como es conocido en el
estado de la técnica. Así, una realización adicional de la invención
es un método para determinar la susceptibilidad a afecciones tales
como, o relacionadas con el asma, determinando si las aberraciones
tales como polimorfismos, deleciones, adiciones, etc. están
presentes en el sitio del gen TIF. Dichas aberraciones pueden ser
un indicio de susceptibilidad a, o presencia de, asma, una afección
alérgica o una o más afecciones relacionadas. La capacidad para
detectar aberraciones en una secuencia de DNA es bien conocida en el
estado de la técnica y dichos métodos no necesitan ser detallados
aquí. Preferiblemente, la aberración o aberraciones se detectan
mediante técnicas estándar, tales como PCR, usando metodologías y
cebadores referidos más arriba.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido
gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden
excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a
este respecto.
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<110> Wyeth
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Moléculas de ácido nucleico aisladas
que codifican factores inducibles de células T (TIFs), las
proteínas codificadas y usos de las mismas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<160> 29
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<220>
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\hfill21
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<210> 20
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<211> 36
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<400> 20
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\hskip-.1em\dddseqskipggccacgcgt cgactagtac gggiigggii gggiig
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccacgcgt cgactagtac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccttccccag tcaccagttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaattgttat tcttagcagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 690
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4797
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcagatgga ttactgaatg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5935
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
Claims (34)
1. Molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una proteína que induce la activación de una proteína
STAT, la secuencia complementaria de la que hibrida, bajo
condiciones rigurosas, a al menos una de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:
8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, en
donde las condiciones rigurosas comprenden la hibridación a 65ºC en
3.5xSSC, seguido de lavados a temperatura ambiente en 2xSSC y a
65ºC en 0.1xSSC;
con la condición de que dicha molécula de ácido
nucleico sea diferente de:
- un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
-
20
\vskip1.000000\baselineskip
- (b)
- la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 del nucleótido 65 al nucléotido 601;
- (c)
- la secuencia de nucleótidos de una secuencia del clon hGIL-191AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231 que codifica una proteína de longitud completa;
- (d)
- la secuencia de nucleótidos de una secuencia del clon HGIL-191AE289 depositado con el número de acceso ATCC 207231 que codifica una proteína madura;
- (e)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2
\vskip1.000000\baselineskip
-
21
\newpage
- (f)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende aproximadamente del aminoácido 34 a 179 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; y
- (g)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende un fragmento de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, comprendiendo el fragmento una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 50-60, 63-81 y 168-1 77 de SEQ ID NO:2.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Molécula de ácido nucleico aislado de la
reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico aislada
codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la
proteína codificada por SEQ ID NO: 7, SEQ ID
NO: 8, SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.
NO: 8, SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25.
3. Molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1, en la que dicha molécula es cDNA.
4. Molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1, en donde dicha molécula es DNA genómico.
5. Molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 2, la secuencia nucleotídica consistiendo en la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
9, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID
NO: 25.
NO: 25.
6. Molécula de ácido nucleico que codifica la
proteína codificada por la molécula de ácido nucleico aislado de la
reivindicación 1.
7. Vector de expresión que comprende la molécula
de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4, en donde dicha molécula de ácido nucleico está unida
operativamente a un promotor.
8. Vector de expresión que comprende la molécula
de ácido nucleico aislada de cualquiera de la reivindicación 5, en
donde dicha molécula de ácido nucleico está unida operativamente a
un promotor.
9. Célula recombinante que comprende la molécula
de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 o reivindicación
2.
10. Célula recombinante que comprende el vector
de expresión de la reivindicación 7.
11. Proteína aislada codificada por la molécula
de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 y que tiene un
peso molecular de aproximadamente 17-30 kilodaltons
según se determina por SDS-PAGE.
12. Proteína aislada de la reivindicación 11 que
comprende al menos 120 aminoácidos de la proteína codificada por
SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29.
13. Proteína aislada de la reivindicación 12,
que comprende al menos todos excepto los 40 aminoácidos
N-terminales codificados por SEQ ID NO: 7, SEQ ID
NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29.
14. Proteína aislada de la reivindicación 13,
que comprende al menos todos excepto los 20 aminoácidos
N-terminales codificados por SEQ ID NO: 7, SEQ ID
NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29.
15. Anticuerpo que se une de manera específica a
la proteína aislada de la reivindicación 11.
16. Anticuerpo de la reivindicación 15, en donde
dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
17. Método in vitro para determinar la
eficacia de la interleuquina-9 en una célula, que
comprende poner en contacto dicha célula con un agente específico
para al menos uno de:
(i) una molécula de ácido nucleico que codifica
una proteína cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la
secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos
de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29; y
(ii) una proteína cuya secuencia de aminoácidos
es idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por la
secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o
SEQ ID NO: 29;
y determinar la interacción de dicho agente con
(i) o (ii) como determinación de la efectividad de la
interleuquina-9 en dicha célula;
en donde dicho agente se selecciona de entre una
molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con
al menos una de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID
NO: 29, y un anticuerpo que se une específicamente a la secuencia
de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID
NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Método de la reivindicación 17 donde dicho
agente es un anticuerpo que se une de manera específica a la
secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos
de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29.
19. Método de la reivindicación 17 en donde
dicho agente comprende la complementaria aislada de la molécula de
ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID
NO: 29.
20. Proteína de acuerdo con la reivindicación 11
para usar en un método de estimulación de la activación de una
proteína STAT.
21. Método para determinar la presencia de una
proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7,
SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:29 en una muestra, que
comprende poner en contacto dicha muestra con un agente que se une
a dicha proteína o dicha molécula de ácido nucleico que comprende la
secuencia de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:29,
y determinar dicha unión como determinación de dicha proteína en
dicha muestra, en donde dicho agente se selecciona de un anticuerpo
y una molécula de ácido nucleico.
22. Método de la reivindicación 21, en donde
dicho agentes es un anticuerpo.
23. Método de la reivindicación 21, en donde
dicho agentes es una molécula de ácido nucleico.
24. Método in vitro de cribado para
determinar si una sustancia influye en la actividad de
IL-9, que comprende añadir dicha sustancia a una
muestra de células que producen una proteína codificada por la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o
SEQ ID NO:29, en presencia de IL-9, y determinar la
producción de dicha proteína, en donde una diferencia en la
producción de dicha proteína por dichas células, cuando se compara
con la producción de dicha proteína por dichas células en presencia
de IL-9 pero sin dicha sustancia, indica que dicha
sustancia influye en la actividad de IL-9.
25. Método de la reivindicación 24, en donde
dicha sustancia es un inhibidor o antagonista de
IL-9, dicho método comprendiendo determinar niveles
bajos en la producción de dicha proteína por dichas células en
presencia de dicha sustancia cuando se compara con su ausencia.
26. Método de la reivindicación 24, en donde
dicha sustancia es un activador de IL-9, dicho
método comprendiendo adicionalmente determinar niveles elevados en
la producción de dicha proteína por dichas células en presencia de
dicha sustancia cuando se compara con su ausencia.
27. Método in vitro para determinar un
nivel aberrante de actividad IL-9 en un sujeto, que
comprende determinar el nivel de una proteína codificada por la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o
SEQ ID NO:29 en un sujeto y comparar dicho nivel con un nivel
normal, las diferencias entre ellas siendo indicativas de un nivel
aberrante de IL-9 en dicho sujeto.
28. Método de la reivindicación 27, en donde
dicho nivel aberrante es de IL-9 endógena en
exceso.
29. Método de la reivindicación 27, en donde
dicho nivel aberrante es de IL-9 endógena
insuficiente.
30. Método de la reivindicación 28, en donde
dicho sujeto sufre de asma, alergia o linfoma.
31. Inhibidor de una proteína codificada por la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o
SEQ ID NO:29 suficiente para inhibir la actividad inducida por
IL-9 para su uso en un método de inhibición de la
actividad inducida por IL-9 en un sujeto que lo
necesite, en donde dicho inhibidor se selecciona de un anticuerpo
que se une específicamente a la secuencia de aminoácidos codificada
por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ
ID NO: 9 o SEQ ID NO: 29 y una molécula antisentido.
32. Inhibidor para usar de acuerdo con la
reivindicación 31, en donde dicho inhibidor es una molécula
antisentido.
33. Inhibidor para usar de acuerdo con la
reivindicación 31, en donde dicho inhibidor es un anticuerpo que se
une específicamente a la secuencia de aminoácidos codificada por la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
9 o SEQ ID NO: 29.
34. Método in vitro para determinar si
una muteína de una proteína codificada por la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:29
es terapéuticamente útil, que comprende poner en contacto una
célula que producía IL-9 con dicha muteína, y
determinar el efecto de dicha muteína en la producción de
IL-9, la reducción de la misma siendo indicativa de
la posible eficacia terapéutica de dicha muteína.
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