ES2349649T3 - Complejo sonda. - Google Patents
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Abstract
Un complejo sonda en el que proteínas o polímeros de péptidos con un peso molecular de 2.000 o más como intermedio hidrófilo está covalentemente unido directamente a un vehículo con un peso molecular de 20.000-4.000.000, y una sonda y una(s) substancia(s) marcada(s) o una(s) substancia(s) capaz(capaces) de unirse a una substancia marcada como marcador de detección están covalentemente unidas directamente al intermedio.
Description
Complejo sonda.
La presente invención se refiere a una técnica
para producir complejos sonda en la que las sondas y los marcadores
de detección tales como haptenos o péptidos de bajo peso molecular
están unidos a vehículos vía intermedios. Los complejos sonda
producidos de este modo encuentran una amplia gama de aplicaciones
en medidas inmunológicas que usan reacciones inmunes que incluyen
inmunoensayos enzimáticos e inmunohistoquímica.
Los métodos inmunohistoquímicos e inmunoensayos
se han usado como método para detectar
auto-antígenos o antígenos extraños en organismos
utilizando reacciones inmunológicas entre antígenos y anticuerpos.
La alta especificidad y sensibilidad de estos métodos hace posible
detectar una pequeña cantidad de substancias en organismos sin
aislarlas.
Los métodos inmunohistoquímicos son
procedimientos para detectar la localización de antígenos en células
y tejidos por medio de reacciones específicas entre antígenos y
anticuerpos. Un método inmunohistoquímico ampliamente usado en
virtud del método ABC se lleva a cabo según las siguientes etapas.
Se preparan secciones de tejido a partir de tejidos congelados o
tejidos fijados con parafina. Se someten a bloqueo con seroalbúmina
bovina y similares para prevenir la unión no específica. Esto se
hace reaccionar con anticuerpos biotinilados que se unen a
antígenos de interés para formar complejos inmunes entre antígenos y
anticuerpos biotinilados. A los complejos inmunes se añaden enzimas
conjugadas con avidina tales como peroxidasa de rábano (HRP) para
formar complejos enzimáticos de biotina-avidina y
los antígenos de interés se detectan por medio de substratos
cromógenos o luminiscentes para las enzimas. Alternativamente, la
detección de antígenos de interés se puede conseguir añadiendo a
avidina materiales fluorescentes que incluyen fluoresceína o
materiales luminiscentes que incluyen ésteres de acridinio.
Los métodos de medida inmunológica para detectar
antígenos en muestras biológicas tales como suero se realizarán
según las siguientes etapas. Los anticuerpos de captura que se unen
con antígenos que se van a medir se inmovilizan a la fase sólida
tal como una microplaca. Subsecuentemente, se lleva a cabo el
procedimiento de bloqueo con seroalbúmina bovina y similares para
prevenir la adsorción no específica a anticuerpos y la fase sólida.
Las muestras que contienen antígenos que se van a medir se añaden a
esto para unirse los antígenos de interés con los anticuerpos de
captura. Los complejos sonda, en los que están unidas las sondas
tales como anticuerpos que reconocen los antígenos y haptenos tales
como biotina, se añadirán a los antígenos capturados. Esto da como
resultado la formación de complejos inmunes, complejos de captura
anticuerpo-antígeno-sonda, en una
fase sólida tal como una microplaca. La biotina en los complejos
inmunes está conjugada con avidina marcada con HRP, y se añaden
substratos cromógenos o luminiscentes para HRP para medir los
antígenos de interés.
Como se describe anteriormente, los métodos
inmunohistoquímicos e inmunoensayos usan complejos sonda que
comprenden sondas tales como anticuerpos y biotina unida a ellos.
Además, se han desarrollado métodos en los que se unen haptenos
como dinitrofenilo (DNP), digoxigenina (DIG) o FITC a anticuerpos en
lugar de biotina para producir complejos sonda y se conjugan
enzimas a anticuerpos que reconocen estos haptenos para detección
(véase, por ejemplo, la referencia 1, no patente).
Se han desarrollado inmunoensayos sin el uso de
enzimas en los que los complejos sonda se preparan uniendo, en
lugar de biotina, substratos fluorescentes tales como fluoresceína y
substratos luminiscentes tales como ésteres de acridinio a
anticuerpos, la detección se realiza a continuación usando
fluorescencia o luminiscencia.
Estos métodos inmunoquímicos e inmunoensayos son
métodos de detección específicos y muy sensibles. Sin embargo, hay
varias substancias traza en organismos que son difíciles de detectar
por métodos generales. Por ejemplo, la concentración en suero de
precursores de péptido liberador de gastrina humana (proGRP) en
sujetos normales es aproximadamente 14 pg/ml, que indica que se
requiere aproximadamente una sensibilidad de 1.000 veces comparado
con el antígeno carcinoembriónico (CEA) o
\alpha-fetoproteína de los que la concentración en
suero en sujetos normales es 5-20 ng/ml. Siendo un
antígeno extraño, el nivel viral del virus de hepatitis C (HCV) en
sangre es muy bajo, y debido al hecho de que tal sensibilidad se
requiere para detectar 100-1.000 copias/ml de ARN
viral, que es aproximadamente igual a 0,03-0,3 pq/ml
de antígenos nucleares tal como se expresa por la concentración de
proteína.
Ha habido intentos de mejora para incrementar la
sensibilidad de los métodos inmunohistoquímicos e inmunoensayos
para detectar substancias traza en organismos. Entre varios factores
que pueden influir en el incremento de sensibilidad de los métodos
inmunohistoquímicos e inmunoensayos, un factor es mejorar las
funcionalidades de los complejos sonda a los que se unen las sondas
tales como anticuerpos que se unen a los antígenos descritos
anteriormente y biotina. Por ejemplo, el incremento del número de
moléculas de biotina unidas a una molécula de anticuerpo conducirá
al incremento del número de moléculas que incluyen avidina que se
une a la biotina y enzimas unidas a la avidina, mejorando por ello
las señales cromógenas o luminiscentes para provocar el incremento
de sensibili-
dad.
dad.
Sin embargo, los haptenos se unen directamente a
los anticuerpos para preparar complejos sonda convencionales que
comprenden sondas tales como anticuerpos y biotina o haptenos unidos
a ellos. Por ejemplo, en un método, se hacen reaccionar grupos
amino en anticuerpos y ésteres de NHS introducidos en biotina para
unir biotina a anticuerpos vía enlace covalente. En este método,
los estudios de las condiciones de reacción incrementarán el número
de moléculas de biotina unidas a una molécula de anticuerpo. Sin
embargo, el número de grupos amino contenidos en los anticuerpos y
el número de biotinas que se pueden unir a los anticuerpos están
ambos limitados. Además, la biotina unida a grupos amino en la
vecindad de determinantes de antígeno de anticuerpos puede provocar
efectos adversos en la asociación de anticuerpos con sus antígenos
debido al impedimento estérico.
Además, cuando los haptenos que se van a unir
son substancias hidrófobas, los complejos sonda en su conjunto
tendrán hidrofobicidad mejorada por la unión de muchos haptenos
hidrófobos a anticuerpos. Al realizar métodos inmunohistoquímicos e
inmunoensayos, la fuerte hidrofobicidad de los complejos sonda
conducirá a una unión no específica de los complejos a tejidos o
placas debido a la unión hidrófoba y el incremento resultante de
fondo previene la consecución de suficiente sensibilidad.
Referencia no patente 1: Harlow E, and
Lane, D. "Antibodies: A LABORATORY MANUAL" (U.S.),
Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, p.
340-341.
El documento US 5.216.130 describe un complejo
macromolecular para localización de dianas que comprende un núcleo
biocompatible, un brazo separador, una molécula diana específica y
un procedimiento para producir dicho complejo. Los complejos se
pueden usar para detectar sitios de interés clínico usando
dispositivos de imagen externos no invasivos.
El documento US 4.778.751 se refiere a un método
para medir antígenos circulantes o anticuerpos usando un antígeno
específico marcado con un ligando o un anticuerpo específico marcado
con un ligando, químicamente unido a una matriz o cadena principal
soluble, un anti-antígeno o
anti-anticuerpo marcado de otra manera y un
anti-ligando en fase sólida dirigido al ligando,
unido al antígeno específico o anticuerpo específico.
El documento US 6.252.053 se refiere a un
complejo enzima-anticuerpo, en el que una enzima, en
la que se introduce un grupo maleimida o grupo tiol, está
covalentemente conjugada con un vehículo. El complejo resultante es
útil como anticuerpo marcado con enzima, particularmente en
inmunoensayo enzimático.
Por consiguiente, es un objetivo de la presente
invención proporcionar un complejo sonda soluble muy sensible con
alta capacidad funcional que asegura la manejabilidad en
inmunoensayos de alta sensibilidad.
Para tratar los asuntos descritos anteriormente,
los inventores han encontrado ahora un complejo sonda muy sensible,
según la reivindicación 1, que se puede producir uniendo
directamente intermedios hidrófilos a un vehículo y uniendo
directamente marcadores de detección tales como biotina, haptenos,
radioisótopos o péptidos de bajo peso molecular y anticuerpos a los
intermedios, y completaron por ello la presente invención. En virtud
de la unión de intermedios hidrófilos a un vehículo, se pueden unir
un número incrementado de los marcadores de detección y el complejo
sonda en su conjunto se vuelve hidrófilo, de modo que se ha
completado un complejo sonda con alta capacidad funcional que no
induciría reacciones no específicas.
Figura
1
Una vista esquemática de complejos sonda según
la presente invención.
Los complejos sonda según la presente invención
son complejos sonda mejorados para detectar antígenos y proteínas
endógenas de organismos. El uso de estos complejos sonda permite la
medida de antígenos y proteínas por medio de métodos
inmunohistoquímicos e inmunoensayos, que no se podían medir
previamente.
Además, dado que la hidrofilia de los
intermedios incrementa la de los complejos sonda, la hidrofobia
global se reducirá incluso si los marcadores de detección tales
como haptenos, biotina, radioisótopos y péptidos de bajo peso
molecular son hidrófobos. Se esperará de este modo una reducción de
reacciones no específicas por medio de los enlaces hidrófobos en
las reacciones inmunes.
En la presente invención, las substancias
hidrófilas como intermedios se unen a vehículos y sondas y los
marcadores de detección tales como biotina, haptenos,
radioisótopos, péptidos de bajo peso molecular y lectinas están
unidos directamente a las substancias hidrófilas. Los marcadores de
detección usados aquí son substancias marcadas para usar los
complejos sonda según la presente invención en reacciones
inmunes.
En la presente invención, no hay limitación en
los vehículos con tal de que su peso molecular varíe entre 20.000 y
4.000.000. Sin embargo, para mejorar la sensibilidad, son deseables
los vehículos que tienen peso molecular por encima de un cierto
nivel de modo que las sondas como anticuerpos y haptenos se puedan
unir a ellos en grandes cantidades. Los ejemplos de vehículos
incluyen polisacáridos y proteínas de alto peso molecular y
polímeros de péptidos, y tienen apropiadamente peso molecular de
20.000-20.000.000, preferentemente
20.000-4.000.000, más preferentemente
70.000-2.000.000. Cuando se usan polisacáridos y
polímeros de péptidos, los vehículos que tienen más cadenas
laterales pueden unirse a más intermedios comparado con aquellos que
tienen el mismo peso molecular pero menos cadenas laterales.
Los vehículos de polisacárido como los usados
para la presente invención incluyen, pero no están limitados a,
dextrano, aminodextrano, ficol, dextrina, agarosa, varias celulosas,
quitina, quitosano soluble en agua y almidón soluble. Los vehículos
proteináceos de alto peso molecular en la presente invención
incluyen, pero no están limitados a,
\beta-galactosidasa, tiroglobulina y hemocianina y
similares. Los vehículos de polímero de péptido disponibles en la
presente invención son varios polímeros de péptido que incluyen
polilisina.
Varias substancias solubles en agua con un peso
molecular no menor de 2.000 se pueden usar como intermedios en la
presente invención. Los intermedios, por ejemplo, incluyen proteínas
tales como seroalbúmina bovina, seroalbúmina humana, transferrina,
ribonucleasa, caseína, hemoglobina, y ovalbúmina así como quitosano
soluble en avidina. También están disponibles polímeros de péptido
como polilisina.
Las sondas pueden ser cualquier proteína que se
puede unir a substancias que se van a medir, tales como anticuerpos
(anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales) y sus
fragmentos (F(ab'2, Fab', Fab, F(abc'), Fabc' y
similares) y varios receptores. Se pueden usar también varias
avidinas (avidina D, estreptavidina y similares, proteína A,
proteína G, proteína L, varias lectinas (concanavalina A,
lentil-lectina, lectina de Phaseolus
Vulgaris y similares) y analitos de sonda unida a ácido nucléico
y similares.
Está disponible cualquier anticuerpo con tal de
que se una a cualquier antígeno o analito de interés. El tratamiento
de anticuerpos con proteasas tales como pepsina y papaína puede
producir fragmentos como F(ab')_{2} y Fab. Las cadenas
pesadas (cadenas H) de anticuerpos se unen generalmente entre sí vía
un enlace S-S, y el enlace se escindirá por medio
de agentes de reducción. Los agentes de reducción incluyen
cisteamina y mercaptoetanol, y F(ab')2 también se puede
escindir en Fab' por medio de agentes de reducción, generando por
ello nuevos grupos tiol (SH). Tales fragmentos de anticuerpo
(F(ab')_{2}, Fab', Fab, F(abc'), Fabc' y similares)
están disponibles en la presente invención.
A los intermedios según la presente invención,
se pueden unir substancias tales como haptenos, péptidos de bajo
peso molecular y lectinas como marcadores de detección, que están
disponibles para la detección de señales producidas por reacciones
inmunes. Los marcadores de detección son substancias marcadoras para
permitir el uso de complejos sonda en medidas inmunológicas. Se
contemplan como tales marcadores de detección la biotina o los
haptenos. Los haptenos incluyen dinitrofenilo (DNP), digoxigenina
(DIG) y FITC y similares. Cuando la biotina está unida a complejos
sonda, por ejemplo, la avidina con afinidad a biotina está marcada
con enzimas tales como HRP, substancias fluorescentes tales como
fluoresceína o materiales luminiscentes tales como ésteres de
acridinio, se hace reaccionar con los complejos sonda y se pueden
detectar señales por revelado de color, fluorescencia o
luminiscencia o
similares.
similares.
También, los materiales fluorescentes y los
materiales luminiscentes tales como isotiocianato de fluoresceína
(FITC) y ésteres de acridinio se pueden unir directamente a los
intermedios tales como haptenos. De nuevo, se pueden detectar las
señales por fluorescencia o luminiscencia.
Además, está permitida la unión directa de
radioisótopos a intermedios y la unión de haptenos marcados con
radioisótopo a intermedios. En este caso, las señales se pueden
detectar por su radioactividad.
Además, se pueden unir como haptenos DIG y DNP.
Aquí, se detectan las señales generadas haciendo reaccionar
anticuerpos que se unen a DIG o DNP marcados con enzimas, materiales
fluorescentes o materiales luminiscentes. En este caso, está
disponible cualquier material como marcador de detección para
sistemas de medida inmunológica con tal de que sean obtenibles
anticuerpos contra haptenos.
Además de los haptenos, están disponibles como
marcadores de detección péptidos de bajo peso molecular. Los
péptidos de bajo peso molecular están unidos a intermedios de
complejos sonda, y el marcaje de anticuerpos contra los péptidos
con enzimas, materiales fluorescentes o materiales luminiscentes
permite la detección de la señal. Estos péptidos pueden contener
cadenas de azúcar o lípidos.
En el caso de señales de detección de reacciones
inmunológicas por medio de anticuerpos contra marcadores de
detección, están también disponibles materiales distintos de
haptenos y péptidos de bajo peso molecular con tal de que los
marcadores de detección sean materiales antígenos contra los que se
pueden criar anticuerpos y se pueden unir a intermedios.
Los substratos para enzimas luminiscentes o
cromógenas están también disponibles como marcadores de detección
estando unidos a intermedios, porque la reacción con enzimas para
sus substratos permite la detección de la señal.
Los marcadores de detección que se van a unir a
los complejos sonda según la presente invención tienen deseablemente
un peso molecular no mayor de 10.000. Esto es porque aquellos
marcadores con peso molecular más alto pueden no contribuir a la
mejora de sensibilidad de inmunoensayos debido al número limitado de
moléculas que están unidas a los intermedios.
Además, también están disponibles como
marcadores de detección varias lectinas (concanavalina A,
lentil-lectina, lectina de Phaseolus
Vulgaris y similares).
Hacemos ahora una breve ilustración de un método
de fabricación de complejos sonda sin ninguna limitación.
En la presente invención, se producen complejos
en los que están unidos vehículos e intermedios. Por ejemplo,
cuando están unidos a dextrano que tiene una cadena de azúcar o
ficol y similares que sirven como vehículos y a proteínas tales
como BSA y caseína que sirven como intermedios, el dextrano o ficol
se hacen reaccionar primero con peryodato de sodio para generar
grupos aldehído. Los grupos aldehído reaccionan con grupos amino en
proteínas como BSA, dando como resultado la formación de complejos
que comprenden vehículos e intermedios.
Los complejos no solo tienen hidrofilia
incrementada comparada con aquellos con vehículos solos sino también
tienen áreas incrementadas disponibles para la unión con sondas y
haptenos y similares.
Las sondas y haptenos como marcadores de
detección se unen a continuación a intermedios. Para controlar las
cantidades de sondas y haptenos unidos, se usan grupos funcionales
para cada unión deseablemente diferentes entre sí. Por ejemplo, si
está unida biotina como haptenos y Fab' como sondas a BSA
(intermedios), se contemplará el siguiente método.
Los ésteres de NHS de
Sulfo-NHS-LC-biotina,
en los que los ésteres de NHS (N-hidroxisuccinimida)
están unidos a biotina, están unidos a grupos amino en BSA. Al
mismo tiempo, se introducen ligantes en BSA para unir a Fab' y BSA.
Los enlaces S-S dentro de la BSA se reducen con
hidrocloruro de cisteamina, DTT (ditiotreitol) y similares para
generar grupos tiol. Los grupos tiol se hacen reaccionar con
1,2-bismaleimida como ligante para introducir
grupos maleimida. La reacción entre los grupos maleimida y los
grupos tiol de Fab puede dar complejos sonda que comprenden
vehículos, intermedios, marcadores de detección y sondas.
Los marcadores de detección incluyen varios
haptenos, radioisótopos y péptidos. Cuando los péptidos se unen a
los intermedios, las cisteínas se introducen en los terminales de
los péptidos, por ejemplo, y se pueden usar los grupos tiol y los
grupos amino en los intermedios tales como BSA para la unión.
También se pueden introducir grupos succinimidilo y similares en
los intermedios usando ligantes para hacerlos reaccionar con grupos
amino en péptidos.
El enlace covalente está disponible para la
unión de vehículos tal como se describe anteriormente a intermedios,
unión de intermedios a marcadores de detección y unión de
intermedios a sondas. Se pueden usar varios grupos funcionales para
el enlace covalente. Por ejemplo, está disponible el enlace
covalente entre grupos aldehído y grupos amino, grupos hidracina y
grupos aldehído, grupos meleimida y grupos tiol, grupos
succinimidilo y grupos amino, grupos vinilo y grupos hidroxilo,
grupos vinilo y grupos tiol, pero no está limitado a uniones entre
estos grupos funcionales. Si los vehículos, intermedios, marcadores
de detección y sondas carecen de los apropiados grupos funcionales,
la unión se conseguirá introduciendo moléculas enlazantes que tienen
grupos funcionales.
Será aceptable cualquier enlazante con tal de
que tenga dos o más grupos funcionales que pueden ser iguales o
diferentes.
Los complejos sonda resultantes que comprenden
vehículos, intermedios, sondas y haptenos o péptidos de bajo peso
molecular como marcadores de detección han encontrado uso en
reacciones inmunológicas tales como inmunohistoquímica e
inmunoensayos. En el caso en el que se use biotina, la detección se
puede conseguir uniendo antígenos a complejos sonda, haciendo
reaccionar a continuación avidina-HRP y añadiendo
substratos colorimétricos o substratos luminiscentes. En lugar de
HRP, está disponible para detección avidina unida a enzimas tales
como fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa,
glucosaoxidasa o luciferasa unidas a ella.
Alternativamente, se pueden unir a complejos
sonda ésteres de acridinio y sus derivados. Los ésteres de acridinio
pueden reaccionar con grupos amino en BSA etc. porque tienen
ésteres de NHS. Los ésteres de acridinio están disponibles para
inmunoensayos de quimiluminiscentes y se pueden usar como sistema de
medida muy sensible.
Cuando se usan como marcadores de detección DNP,
DIG, FITC o péptidos de bajo peso molecular, pueden estar unidos a
intermedios vía enlace covalente. Las enzimas tales como HRP pueden
estar unidas a anticuerpos que se pueden unir a estos materiales
específicamente, y la detección se puede llevar a cabo usando
revelador de color o luminiscencia.
Describimos ahora Ejemplos en lo que se refiere
a un método de fabricación de complejos sonda y su rendimiento para
ilustrar la presente invención con más detalle y sin limitación.
Ejemplo
1
Se pesaron 44 mg de Ficol 400 (Amersham
Biosciences) y se disolvieron en 0,8 ml de tampón de fosfato 0,1 M
(pH 7,0) y se añadieron y mezclaron 0,4 ml de disolución de
peryodato de sodio. Después de la incubación durante dos horas a
temperatura ambiente, se retiró el exceso de peryodato de sodio por
filtración con gel (Sephadex G25, Amersham Biosciences), se añadió
disolución de seroalbúmina bovina (BSA) y se hizo reaccionar durante
3 horas a temperatura ambiente, y el BSA se introdujo en el Ficol.
Para estabilizar el producto de reacción, se añadió borato de
dimetilamina (DMAB; Seikagaku Corporation) y se mezcló para
reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente, a continuación se
añadió disolución de Tris para bloquear los grupos aldehído sin
reaccionar en el Ficol. Después de reacción durante la noche a
temperatura ambiente, el producto de reacción se purificó por
filtración con gel (Sephacryl S300, 1.6*30) y se midió la
absorbancia a 280 nm para calcular la concentración de conjugados
de BSA-vehículo. 1 mg de los conjugados de
BSA-vehículo se redujo con hidrocloruro de
cisteamina, se retiró el exceso de hidrocloruro de cisteamina por
filtración con gel (Sephadex G25, Amersham Biosciences), se
añadieron y mezclaron 1,2-bismaleimida y disolución
acuosa de
sulfo-NHS-LC-Biotina
(Pierce nº 21335) que se disolvieron en dimetilformamida y a
continuación la mezcla se incubó durante 1,5 horas de reacción a
temperatura ambiente, y se introdujeron grupos meleimida y biotina
en el conjugado de vehículo-BSA. El exceso de
1,2-bismaleimida y
sulfo-NHS-LC-biotina
se retiró por filtración con gel (Sephadex G25, Amersham
Biosciences). A la disolución de F(ab)'_{2} de anticuerpos
monoclonales de antígeno nuclear anti-HCV en tampón
de fosfato 0,1 M (pH 6,0) (una mezcla de igual cantidad de
F(ab)'_{2} de C11-14 y F(ab)'_{2}
de C11-9) se añadió 1/10 de volumen de hidrocloruro
de cisteamina 0,15M, la mezcla se incubó durante 1,5 horas a 37ºC,
se retiró el exceso de hidrocloruro de cisteamina por filtración con
gel (Sephadex G25, Amersham Biosciences) para obtener anticuerpo
monoclonal de antígeno nuclear anti-HCV Fab'. Se
mezclaron este Fab' y la maleimida y BSA-vehículo
conjugado con biotina, se incubaron durante la noche a 4ºC, se
realizó una filtración con gel (Sephacryl S300, 1,6x30) para
retirar Fab' libre. En este caso, el complejo
Fab'-vehículo-BSA según la presente
invención apareció cerca de las fracciones vacías, y en vista del
límite de exclusión del Sephacryl S300 que es de un peso molecular
de 1,5 millones, se estimó que el peso molecular del complejo era de
varios cientos de miles o más. Se midió la absorbancia a 280 nm de
los complejos de Fab'-vehículo-BSA
que fueron preparados de este modo, y se calculó la concentración
suponiendo que la absorción es igual a la del anticuerpo.
Ejemplo
2
Se realizó la preparación de anticuerpos
biotinilizados según el método descrito en un documento adjunto a
Sulfo-NHS-LC-Biotin
(Pierce #21335). El
sulfo-NHS-LC-Biotina
se mezcló con anticuerpo monoclonal de antígeno nuclear
anti-HCV en PBS (mezcla de una cantidad igual de IgG
de C11-14 e IgG de C11-9) y se
incubó durante una hora a temperatura ambiente, el exceso de
sulfo-NHS-LC-biotina
se retiró a continuación por filtración con gel (Sephadex G25,
Amersham Biosciences). Se midió la absorbancia a 280 nm de
anticuerpos monoclonales de antígeno nuclear
anti-HCV biotinilados para calcular la concentración
de anticuerpo.
Ejemplo
3
Los anticuerpos monoclonales de antígeno nuclear
anti-HCV se ajustaron para que fueran 4 \mug/ml
con acetato 0,1M/tampón de fosfato 0,1M (pH 4,8), se añadieron 250
\mul a cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos, y cada
pocillo se incubó durante la noche a 4ºC. Después de lavar con PBS,
se añadieron 350 \mul de caseína al 0,5% a cada pocillo, y cada
pocillo se incubó durante tres horas a temperatura ambiente. Se
añadieron como muestras antígenos nucleares de HCV recombinante
(c11) preparados a concentraciones de 0 fmol/l, 148 fmol/l, 444
fmol/l, 1.333 fmol/l, 4.000 fmol/l, 12.000 fmol/l, y 36.000 fmol/l,
y cada pocillo se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con
agitación. Después de lavar seis veces con tampón de fosfato 10mM,
pH 7,3, que contiene Tween 20 al 0,05% (disolución de lavado). Se
prepararon 200 \mul de cada uno de los complejos de
biotina-anticuerpo monoclonal de antígeno nuclear
anti-HCV en el Ejemplo 1 y los anticuerpos
monoclonales de antígeno nuclear anti-HCV
biotinilados que se prepararon en el Ejemplo 2 por métodos
convencionales a la concentración de 1 \mul/ml como anticuerpos
secundarios se añadieron a cada pocillo, y cada pocillo se incubó
durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar seis veces
con la disolución de lavado, se añadieron a cada pocillo 200 \mul
de disolución diluida 5.000 veces de avidina unida a HRP, y cada
pocillo se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Subsecuentemente, después de lavar con la disolución de lavado seis
veces, se añadieron a cada pocillo 200 \mul de disolución de
substrato (mezcla de ortofenilendiamina-peróxido de
hidrógeno), cada pocillo se incubó durante 30 minutos a temperatura
ambiente, y se añadieron 50 \mul de ácido sulfúrico 5N para poner
fin a la reacción. Se midió la absorbancia a 492 nm (longitud de
onda de referencia 600 nm) en un lector de microplacas (MPRA4i,
TOSOH). La tabla 1 muestra los valores obtenidos substrayendo los
valores de absorbancia a 0 fmol/l de aquellos de los pocillos a los
que se añadió cada concentración de los antígenos nucleares de HCV
recombinante.
Como se muestra en la Tabla 1, no pudimos
encontrar ninguna diferencia entre 444 fmol/l de antígenos nucleares
y 0 fmol/l cuando se usaron anticuerpos biotinilados por métodos
convencionales, mientras que los complejos de
biotina-anticuerpo preparados en el Ejemplo 1
claramente permitieron la detección suficiente de 444 fmol/l de
antígenos nucleares e incluso de 148 fmol/l de antígenos nucleares
que se diluyeron adicionalmente tres veces. Cuando se comparó la
absorbancia, los presentes complejos
biotina-anticuerpo exhibieron aproximadamente cinco
veces más alta absorbancia a 1.333 fmol/l y aproximadamente seis
veces más alta absorbancia a 444 fmol/l que la obtenida por un
método convencional.
Claims (8)
1. Un complejo sonda en el que proteínas o
polímeros de péptidos con un peso molecular de 2.000 o más como
intermedio hidrófilo está covalentemente unido directamente a un
vehículo con un peso molecular de 20.000-4.000.000,
y una sonda y una(s) substancia(s) marcada(s) o
una(s) substancia(s) capaz(capaces) de unirse a
una substancia marcada como marcador de detección están
covalentemente unidas directamente al intermedio.
2. Un complejo sonda según la reivindicación 1,
en el que el marcador de detección tiene un peso molecular de
10.000 o menos.
3. El complejo sonda según la reivindicación 1 o
2, en el que los marcadores de detección son biotinas.
4. El complejo sonda según la reivindicación 1 o
2, en el que los marcadores de detección son haptenos.
5. El complejo sonda según la reivindicación 1 o
2, en el que los marcadores de detección son haptenos, en el que el
hapteno es éster de acridinio.
6. El complejo sonda según la reivindicación 1 o
2, en el que los marcadores de detección son substancias
fluorescentes o substancias luminiscentes.
7. El complejo sonda según la reivindicación 1 o
2, en el que los marcadores de detección tienen radioisótopos.
8. El complejo sonda según la reivindicación 1 o
2, en el que el marcador de detección tiene materiales fluorescentes
y materiales luminiscentes, tales como isotiocianato de
fluoresceína (FITC) y éster de acridinio.
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