JPH01227061A - イオン捕捉イムノアッセイ法および装置 - Google Patents

イオン捕捉イムノアッセイ法および装置

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JPH01227061A
JPH01227061A JP1019408A JP1940889A JPH01227061A JP H01227061 A JPH01227061 A JP H01227061A JP 1019408 A JP1019408 A JP 1019408A JP 1940889 A JP1940889 A JP 1940889A JP H01227061 A JPH01227061 A JP H01227061A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般にイムノアッセイ装置および方法に関する
。さらに詳しくは、本発明は、均一イムノアッセイを行
うのに有用な装置および方法に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）種々
の分析手順および装置が、生物学的流体または他の物質
中に存在しているかもしれない興味の持たれるまたは臨
床的に重要な物質の存在および／まｈは濃度を決定する
ためのアッセイに一般に用いられている。そのような物
質は一般に「分析対象物」と称され、抗体、抗原、医薬
、ホルモンなどが含まれる。
イムノアッセイ法は高等生物の免疫系の機構を利用する
ものであり、その場合、生物にとって病原性または外来
の抗原の存在に応答して抗体が産生される。特定の抗原
に応答してその抗原と結合することのできる１種または
２種以上の抗体が産生され、そのことによって高度に特
異的な反応機構か生み出される。この反応機構は、生物
学的試料中の特定の抗原の存在または濃度を決定するた
めにインビボで用いることかできる。
固相イム／アッセイ法は、一般に用いられているイムノ
アッセイ法である。数多くの固相イムノアッセイ法があ
り、それらにおいてはデイツプスティック（ｄｉｐｓｔ
ｉｃｋ）、試験ストリップ、紙、ファイバーマトリック
ス、１／４インチビーズまたは他の固体物質などの「固
相」上での反応によって分析対象物の存在が示される。
従来の固相酵素イムノアッセイ形態の一つには、繊維性
マトリックスに結合したポリスチレンビーズやラテック
ス微細粒子のような不溶性固相物質に結合した抗分析対
象物抗体（捕捉抗体）が用いられている。第二の抗分析
対象物抗体は酵素で標識して可溶性の指示試薬を生成さ
せ、この酵素は酵素基質と反応して検出可能な生成物を
生成する（第二の抗体は、放射性同位体、蛍光団、化学
発光団、他の容易に検出可能なシグナル生成体で標識す
ることかできる）。これら２つの抗体結合体は、試験試
料中に分析対象物が存在するときには分析対象物と不溶
性の３成分系免疫複合体（「サンドイッチ」）を生成す
る。酵素基質の添加および生成物の検出または測定に先
立って、反応混合物から固相に結合した免疫複合体を物
理的に除くことにより、免疫複合体を過剰の指示試薬お
よび他の妨害物質から分離する。酵素基質を加えると酵
素基質は指示体の酵素部分と反応し、その場合、固相結
合サンドイッチに付随する標識抗体の量は試験試料中の
分析対象物の量に正比例する。
他の方法は競合アッセイによるものである。この場合も
捕捉機構には不溶性固相に結合した抗分析対象物抗体を
用いるが、指示体として第二の抗体よりもむしろ酵素標
識分析対象物を用い、これを試験試料および固相ととも
に同時にインキュベートする。従って、競合アッセイに
おいては指示体は固相との結合について試料中に存在す
る分析対象物と競合し、２成分系の免疫複合体、すなわ
ち固相／分析対象物結合体および固相／指示体結　　　
　・合体を生成する。競合アッセイにおいては、捕捉さ
れた指示試薬の量は試験試料中に存在する分析対象物の
量と反比例する。
上記アッセイ法は、その有用性が大きいにもかかわらず
幾つかの欠点を有する。第一に、可溶性および不溶性の
試薬および流体試料の反応混合物が不均一系であること
によって反応の速度か遅くなる。反応混合物中で不溶性
固相系、試験試料中の遊離の分析対象物、可溶性指示試
薬および新たに生成した不溶性複合体との間で平衡が達
せられるまでに長期のインキュベート期間が必要である
。
第二に、捕捉試薬を固相物質に付着させるための吸着な
どの従来の方法により、固相物質が分析対象物以外の物
質と容易に結合するようになる。このことは非特異的結
合と呼ばれ、明確な結果の検出を妨害する。第三に、蛍
光偏光イム／アッセイ（Ｆ　Ｐ　Ｉ　Ａ）や酵素多重（
ｍｕｌｔ　ｉｐｌ　１ｅｄ）イムノアッセイ技術（ＥＭ
ＩＴ）などのある種の方法では均一アッセイの利点が得
られ固相競合結合イムノアッセイの幾つかの問題が克服
されるが、試料のバックグラウンドの存在下でシグナル
を検出する点で欠点を有する。
（課題を解決するための手段） 本発明は新規なアッセイ法および分離手順を提供するも
のである。本発明によれば、捕捉試薬および指示試薬の
両方を溶液中に存在させることかでき、反応速度が遅い
という問題を回避することができる。
本発明の分離手順には、荷電物質に結合した可溶性の特
異的結合物質、すなわち捕捉試薬、および該荷電物質と
反対に荷電した不溶性の固相物質を用いる。分析対象物
を含んでいると思われる流体試料を溶液状態の捕捉試薬
と混合して荷電複合体を生成させる。結合が完了してか
らこの溶液を反対に荷電した固相物質と接触させて誘引
、付着し、新たに生成した複合体を流体試料から分離す
る。
さらに指示試薬、すなわちシグナルを生成することが可
能な標識に結合させた第二の分析対象物特異的結合物質
を添加することによっても、流体試料中の分析対象物を
検出するために本発明を用いることができる。指示試薬
は競合アッセイまたはサンドイッチアッセイにおいて用
いることができ、その場合、指示試薬は分析対象物およ
び捕捉試薬と接触して標識されかつ荷電された捕捉試薬
／分析対象物／指示試薬複合体を生成する。ついでこの
複合体は反対に荷電した固相物質と接触させることによ
って溶液から分離することができ、分析対象物の存在ま
たは量は指示試薬の標識を検出することによりモニター
する。
さらに、反対に荷電した捕捉試薬およびアッセイ複合体
に誘引、付着させるために固相物質に結合させることの
できる特定の荷電分子種、とりわけポリマー性イオン性
物質と同様に、数多くの荷電固相物質を用いることがで
きる。荷電物質を用いることにより、分離方法が非常に
特異的であり、非特異的結合を最小に抑えることができ
、かつ感度の高いアッセイ手順を得ることができる。
知られたアッセイ技術においては、捕捉試薬（−般には
抗体）を固相に結合させ、流体試験試料を固相を通して
または固相上を通過させて抗体が溶液中の分析対象物を
誘引、分離することができるようにする。従って、抗体
の分析対象物に対する親和性により試験試料から分析対
象物を捕捉する効率が制限され、反応混合物の不均一性
（すなわち、可溶性の分析対象物および固相上に固定化
された捕捉抗体）と相まって低い反応速度、および固相
中に試料を短い間「通過（ｐａｓｓ　−ｔｈｒｏｕｇｈ
）　Ｊさせる間の分離が不充分な結果となる。
本発明においては捕捉試薬および指示試薬の両者はとも
に可溶性であり、流体試験試料中に分散されて均一な反
応混合物を生成する。均一な反応混合物は、荷電捕捉抗
体および標識抗体が抗原分析対象物と複合体を形成する
機会を増加させると考えられている。溶液中に分散した
分析対象物および荷電捕捉抗体は、「通過」技術におけ
る結合に比べて反応速度と分析対象物／抗体の結合の確
率との両方を増大させると考えられている。
荷電捕捉抗体と分析対象物（および／または指示試薬）
の複合体が該荷電捕捉抗体とは反対に荷電した固相中を
通過するときには、複合体を溶液から分離する際の効率
を支配するものは、反対に荷電した分子種間でのイオン
性の引力である。イオン性の引力は、とりわけ複数のポ
リカチオン性およびポリアニオン性のものを使用する場
合に、他の分離技術における抗原に対する抗体の引力よ
りも大きな引力が得られるように選択することができる
。本発明の他の利点は、「イオン捕捉」法により妨害物
質の固相物質上への非特異的吸着を最小限に抑えること
ができるため、分析の正確さが向上することである。
すなわち本発明は、流体試料中の分析対象物の検出方法
であって、 （ａ）（ｉ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電物
質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕捉試薬、 （１１）分析対象物に対して特異的で検出可能なシグナ
ルを生成することのできる標識に結合した第二の結合成
分からなる可溶性指示試薬、および （ｉｉｉ）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固
相物質 を用意し、 （ｂ）流体試料を該捕捉試薬と接触させることによって
捕捉試薬を試料中の分析対象物と結合させて捕捉試薬／
分析対象物複合体を生成させ、（ｃ）該捕捉試薬／分析
対象物複合体を該指示試薬と接触させることによって該
指示試薬を分析対象物と結合させて捕捉試薬／分析対象
物／指示試薬サンドイッチ複合体を生成させ、 （ｄ）試料を該固＋目物質と接触させることによって該
固相物質を該サンドイッチ慢合体の該第一の荷電物質に
誘引、付着させて該サンドイッチ複合体を試料から分離
し、ついて （ｅ）試料中の分析対象物の存在または量の指標として
、該同相または未結合指示試薬に付随する該標識を検出
する ことを特徴とする方法、 および流体試料中の分析対象物の検出方法であって、 （ａ）（ｉ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電物
質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕捉試薬、 （ｉｉ）該第一の結合成分に対して特異的で検出可能な
シグナルを生成することのできる標識に結合した第二の
結合成分からなる可溶性指示試薬、および （ｉｉｉ）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固
相物質 を用意し、 （ｂ）流体試料を該捕捉試薬および該指示試薬と接触さ
せることによって、該捕捉試薬と結合することについて
試料中の分析対象物を該指示試薬と競合させて捕捉試薬
／分析対象物複合体および捕捉試薬／指示試薬複合体を
生成させ、 （ｃ）試料を該固相物質と接触させることによって該固
相物質を該第一の荷電物質に誘引、付着させて該複合体
を試料から分離し、ついで （ｄ）試料中の分析対象物の存在または量の指標として
、該固相または未結合指示試薬に付随する該標識を検出
する ことを特徴とする方法を提供するものである。
さらに本発明は、流体試料から分析対象物を分離する方
法であって、 （ａ）　（ｉ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電
物質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕捉試薬
、および （ｉｉ）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固相
物質 を用意し、 （ｂ）流体試料を該捕捉試薬と接触させることによって
捕捉試薬を試料中の分析対象物と結合させて捕捉試薬／
分析対象物複合体を生成させ、ついで（ｃ）試料を該固
相物質と接触させることによって該固相物質を該第一の
荷電物質に誘引、付着させて該捕捉試薬／分析対象物複
合体を試料から分離する ことを特徴とする方法をも提供するものである。
本発明はまた、（ａ）分析対象物に対して特異的で第一
の荷電物質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕
捉試薬、（ｂ）分析対象物に対して特異的で検出可能な
シグナルを生成することのできる標識に結合した第二の
結合成分からなる可溶性指示試薬、および（ｃ）該第一
の荷電物質と反対に荷電した不溶性固相物質からなるこ
とを特徴とする、流体試料中の分析対象物の存在または
量を決定するためのサンドイッチイムノアッセイキット
、および（ａ）分析対象物に対して特異的で第一の荷重
物質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕捉試薬
、（ｂ）捕捉試薬に対して特異的で検出可能なシグナル
を生成することのできる標識に結合した第二の結合成分
からなる可溶性指示試薬、および（ｃ）該第一の荷電物
質と反対に荷電した不溶性固相物質からなることを特徴
とする、流体試料中の分析対象物の存在または量を決定
するための競合イム／アッセイキットをも提供する。
さらに本発明は、第一の荷電物質に結合した特異的結合
成分、および該第一の荷電物質と反対に荷電した第二の
荷電物質からなり、該第一の荷電物質および該第二の荷
電物質は互いにイオン結合的に結合している配合物をも
提供する。
本発明のアッセイ方法および試薬は、種々の形態のイム
ノアッセイに用いることかできる。しかしなから、本発
明は免疫反応アッセイに限られるものではない。特異的
結合成分を用いたあらゆるアッセイを行うことか可能で
ある。本明細書にいう「特異的結合成分」とは、特異的
結合ペア、すなわち一方の分子が化学的または物理的手
段により第二の分子と結合するような２つの異なる分子
のうちの一方をいう。従って、抗原と抗体との特異的結
合ペアに加えて、他の特異的結合ペアとしてはビオチン
とアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド
配列、エフェクター分子とレセプター分子、酵素補助因
子と酵素、酵素インヒビターと酵素などが含まれる。さ
らに特異的結合ペアには、もともとの特異的結合成分の
類似体、たとえば分析対象物類似体が含まれる。免疫反
応性の特異的結合成分には抗原、ハプテン、抗体および
これらの複合体が含まれ、また組換えＤＮＡ技術により
生成されたものも含まれる。
サンドイッチアッセイにおいては、アニオンまたはカチ
オンのような荷電物質と結合させた特異的結合成分を含
む可溶性捕捉試薬が用いられる。
イオン性分子はモノマーまたはポリマーてあってよい。
特異的結合成分が免疫反応成分であるときは、分析対象
物に特異的な抗体、抗原またはこれらの複合体であって
よ（、また抗体を用いるときには、モノクローナル抗体
、ポリクローナル抗体、抗体断片、または組換え抗体、
およびそれらの混合物、または抗体と他の特異的結合成
分との混合物であってよい。捕捉試薬を、分析対象物を
含有していると思われる試験試料、およびシグナル生成
化合物（たとえば酵素、または蛍光もしくは化学発光化
合物）で標識した第二の特異的結合成分を含む指示試薬
と接触させる。これらの試薬は、単独もしくは組み合わ
せて同時に混合するがまたは逐次加えることかできる。
結合反応により捕捉試薬／分析対象物／指示試薬複合体
が生成される。
アッセイにはまた、捕捉試薬とは反対に荷電しているか
またはアニオン性もしくはカチオン性ポリマーのような
反対に荷電した物質を保持している固相物質を用いるこ
とにより、得られた可溶性複合体を過剰の試薬および試
験試料から分離する工程が含まれる。反対に荷電した固
相物質は、反対の荷電間の相互作用により捕捉試薬／分
析対象物／指示試薬複合体に誘引、付着する。固相物質
はいかなる適当な物質であってもよいが、紙、ガラスマ
イクロファイバー物質などの多孔質物質が好ましい。
固相物質上に保持された複合体は、指示試薬について固
相を調べることにより検出する。試料中に分析対象物が
存在するときは、固相物質上には標識が存在するであろ
う。固相上の標識の量は、試料中の分析対象物の量に正
比例する。酵素標識は、酵素基質の添加のあとに視覚に
より検出するかまたは分光学的に測定することができる
。または、用いた標識の種類に依存して、蛍光、化学発
光、放射能放射を測定することにより標識を検出するこ
とができる。
本明細書において「分析対象物」とは、本発明を用いて
検出または試料から分離するための物質をいう。分析対
象物としては、天然に特異的結合成分（たとえば抗体）
が存在するかまたは特異的結合成分を調製することがで
きればいかなる物質であってもよい。従って、分析対象
物とは、アッセイ中の特異的結合成分の１種または２種
以上と結合することのできる物質である。「分析対象物
」にはまた、あらゆる抗原性物質、ハプテン、抗体およ
びこれらの組合わせが含まれる。特異的結合ペアの一方
として分析対象物は、ビタミンＥ３＋ｔの決定のために
捕捉試薬および／または指示試薬中に内因子タンパク質
を用いること、または炭水化物の決定のために捕捉試薬
および／または指示試薬中にレクチンを用いることのよ
うに、天然に存在する特異的結合ペアの他方により検出
することができる。分析対象物には、タンパク質、ペプ
チド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、医
薬（治療目的で投与されるものおよび不法目的で投与さ
れるものを含む）、細菌、ウィルス、およびこれらの代
謝産物またはこれらに対する抗体が含まれる。
本発明はまた競合アッセイを行うためにも用いることが
できる。競合アッセイ形態においても、可溶性捕捉試薬
は、アニオン性ポリマーまたはカチオン性ポリマーのよ
うな荷電物質に結合した特異的結合成分を含んでいる。
捕捉試薬を試験試料と指示試薬との両方に接触させる。
指示試薬にはシグナル生成化合物で標識した分析対象物
または分析対象物類似体が含まれている。反応か起こり
、その結果、（１）捕捉試薬／試験試料分析対象、およ
び（２）捕捉試薬／指示試薬からなる可溶性複合体が生
成される。
ついて反応混合物を反対に荷電した固相物質と接触させ
ることにより、可溶性複合体を過剰の試薬および試験試
料から取り除く。複合体は、反対に荷電した捕捉試薬の
引力により固相上に保持されている。固相上に保持され
た複合体は指示試薬上の標識により検出される。競合ア
ッセイにおいては、固相上の標識の量は試料中の分析対
象物の量に反比例する。従って、陽性の試験試料からは
陰性のシグナルが得られる。
たとえばテオフィリンのアッセイにおいては、抗テオフ
ィリン抗体（モノクローナルかまたはポリクローナル）
をアニオン性物質に結合させて可溶性捕捉試薬を生成さ
せることかでき、この抗体に対する結合を可溶性標識テ
オフィリン（すなわち指示試薬）と試験試料の非標識テ
オフィリンとの間で競合させることができる。インキュ
ベートした後、均一混合物をカチオンでコーティングし
た多孔質固相物質中に通すことができる。捕捉試薬と固
相の間における反対に荷電したイオン種間での引力によ
り、免疫複合体が反応混合物から分離される。ついで指
示試薬からのシグナルを検出することかできる。この場
合、試験試料中のテオフィリンが高レベルであると固相
に付随するシグナル生成は減少するであろう。
同様に本発明は、捕捉試薬／分析対象物／指示試薬から
なる免疫複合体を生成するサンドイノチア、セイおよび
その変法、たとえば捕捉試薬／分析対象物／抗分析対象
物抗体／指示試薬からなる複合体を生成する間接イムノ
アッセイに用いることができる。従って、指示試薬は、
サンドイッチアッセイにおいては分析対象物に対する、
競合アッセイにおいては捕捉試薬に対する、間接アッセ
イにおいてはそれ自身分析対象物に対して特異的な補助
特異的結合成分に対する、特異的結合ペアの一方を含ん
でいる。同様に捕捉試薬は、サンドイノチア、セイにお
いては分析対象物に対する、競合アッセイにおいては分
析対象物および指示試薬に対する、間接アッセイにおい
てはそれ自身分析対象物に対して特異的な補助特異的結
合成分に対する、特異的結合ペアの一方を含んでいる。
本発明はまた、物質を溶液から分離するためにのみ用い
ることもできる。たとえば試験試料から分析対象物を分
離する目的のためには、指示試薬を用いることなく捕捉
試薬および固相物質を用いることができる。さらに捕捉
試薬を、捕捉試薬の荷電物質とは反対に荷電した第二の
可溶性荷電物質と接触させることができる。第二の可溶
性荷電物質は試料を固相物質に接触させる前は固相物質
上に保持されていないが、生成するアッセイ複合体が固
相上に保持されるように捕捉試薬に誘引、付着する。
指示試薬 指示試薬は、特異的結合成分に結合した標識からなる。
指示試薬は、試験試料中の分析対象物の量に比例したレ
ベルで検出可能なシグナルを生成する。一般に指示試薬
は固相物質上に捕捉された後に検出または測定されるが
、未結合指示試薬もまた測定してアッセイの結果を決定
することができる。
指示試薬の特異的結合ペアの一方は抗体かまたは抗原で
ある場合の他に、ビオチンかまたはアビジン、炭水化物
かまたはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェク
ターかまたはレセプター分子、酵素補助因子かまたは酵
素、酵素インヒビターかまたは酵素などを含むいかなる
特異的結合ペアの一方であってよい。免疫反応性の特異
的結合成分は抗体、抗原または抗体／抗原複合体であっ
てよく、これらはサンドイッチアッセイの場合における
ように分析対象物に対してが、競合アッセイの場合にお
けるように捕捉試薬に対してが、または間接アッセイの
場合におけるように補助特異的結合成分に対して結合す
ることができる。抗体を用いる場合には、モノクローナ
ル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、組換え抗体、
それらの混合物、または抗体と池の特異的結合成分との
混合物であってよい。それら抗体の調製法および特異的
結合成分として使用する適合性については当業者によく
知られている。
指示試薬の標識は、外部手段により検出、測定が可能な
シグナルを生成することができる。種々の標識には、色
原体、触媒、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合
物、および直接目に見える標識が含まれる。特定の標識
を選択することは重要ではないが、それ自身でまたは１
または２以上の物質と組み合わせてシグナルを生成する
ことができる。
標識かまたは特異的結合成分を変えることにより種々の
異なった指示試薬を得ることができる。
本発明の一実施態様においては、指示試薬は酵素標識に
結合したモノクローナル抗体、たとえば抗癌胎児性抗原
抗体断片に結合したアルカリホスファターゼからなる。
捕捉試薬 本発明の捕捉試薬は、二つの基本成分からなる。
第一の成分は特異的結合成分であり、これはサンドイッ
チアッセイの場合におけるように分析対象物に対して、
競合アッセイの場合におけるように指示試薬および分析
対象物に対して、または間接アッセイの場合におけるよ
うにそれ自身分析対象物に対して特異的な補助特異的結
合成分に対して特異的である。第二の成分は第一の成分
に結合した荷電物質である。これら２成分の結合は本質
的に不可逆的であり、共有結合機構を含むことができる
。
荷電物質としては、アニオン性またはカチオン性のモノ
マーまたはポリマーが挙げられる。たとえばアニオン性
ポリマーには、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、アルブミ
ンのようなアニオン性タンパク質または誘導タンパク質
、ヘパリンもしくはアルギン酸のようなアニオン性糖類
、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸、および適当な
ｐＨ（たとえば４〜１０のｐＨ範囲）で正味の負の荷電
を有するポリアミノ酸が含まれる。さらに特異的結合成
分を２種以上の荷電モノマーまたはポリマーと結合させ
て捕捉試薬に付随する正味の荷電を増加させることかで
きる。
捕捉試薬の特異的結合成分は、指示試薬の特異的結合成
分と同じように、他方と特異的に結合することのできる
いかなる分子であってもよい。捕捉試薬の特異的結合成
分は、抗体、抗原または抗体／抗原複合体などの免疫反
応性成分であってよい。抗体を用いる場合には、モノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、それら
の混合物、または抗体と他の特異的結合成分との混合物
であってもよい。
固相物質 本発明にはまた固相物質が含まれる。固相物質は固有の
荷電および捕捉試薬に対する誘引能により選択すること
かでき、たとえばメチル化ウール、ナイロン、正に荷電
した特定のガラスか含まれる。
固相物質はまた、捕捉物質の荷電物質とは反対に荷電し
た別の荷電物質を保持していることができる。たとえば
、アニオン性の物質を捕捉試薬に結合させ固相物質上に
はカチオン性の物質を保持させることができるし、この
逆にカチオン性の物質を捕捉試薬に結合させアニオン性
の物質を固相物買上に保持させることもできる。
一担複合体が生成されると、固相を分離手段として用い
る。すなわち、均一な反応混合物を固相物質と接触させ
、固相物質と捕捉試薬との反対の荷電間での引力により
新たに生成した複合体が固相物買上に保持される。
本発明のためのアッセイ装置は多くの形態を有している
ことかできるが、そのうちの幾つかは固相物質として選
択した物質に依存している。固相物質にはあらゆる適当
な多孔質物質が含まれる。
ここで「多孔質」とは、物質が、その中を流体が流れる
かまたは容易に通過することができるものであることを
意味する。本発明において、固相物質には１種または２
種以上のアッセイ試薬を含む１または２以上の層を有す
るポーアンドフロースルー（ｐｏｕｒ　ａｎｄ　ｆｌｏ
ｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）アッセイ装置に使用するためのフ
ァイバーガラス、セルロースまたはナイロンパッド：デ
ィソブアンドリードアソセイのためのデイツプスティッ
ク；試薬の１種またはすべてが固相物質の単片の別々の
ゾーン中に含まれているクロマトグラフ（たとえばペー
パークロマトグラフ）または薄層クロマトグラフ（たと
えばニトロセルロース）法に用いるための試験ストリッ
プ；または当業者によく知られた他の多孔質物質か含ま
れる。しかしながら、本発明の固相物質はこれら多孔質
物質に限られるものではない。固相物質にはまた、１／
４インチビーズ、磁性ビーズ、ラテックス粒子、ガラス
試験管、または固有の荷電を有するかまたは荷電物質を
保持することのできる他の物質が含まれる。
天然の物質、合成物質、または合成的に修飾した天然物
質を固相物質に用いることかでき、たと、ｔば紙やセル
ロース誘導体（酢酸セルロース、ニトロセルロースなど
）などのセルロース物質のような多糖類；シリカ；不活
化アルミナ、けいそう土、Ｍｇ５Ｏ，、または多孔質ポ
リマーマトリックス（ポリマーとしては塩化ビニル、塩
化ビニル−プロピレン共重合体および塩化ビニル−酢酸
ビニル共重合体など）中に均一に分散された他の無機細
粉物質のような無機物質：天然に存在す布（たとえば綿
）および合成の布（たとえばナイロン）；シリカゲル、
アガロース、デキストランおよびゼラチンのような多孔
質ゲル；ポリアクリルアミドのようなポリマーフィルム
などが含まれる。固相物質は適度の強度を有しているか
または支持体によって強度が与えられなければならず、
また検出可能なシグナルの生成を妨害することがあって
はならない。
好ましい固相物質には、名目上の厚さが０．３３収の「
フ７　’７トマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　９３４−Ａ　Ｈ
Ｊ、アボット・ラボラトリーズ（アボットバーク、■Ｌ
、６００６４）製の使捨てＩＭｘＴＭウェッジおよびテ
ストバック（Ｔ　ｅｓｔ　Ｐ　ａｃｋ）”（ファイバー
マトリックス）装置のような多孔質ファイバーガラス物
質が含まれる。そのような物質の厚さは重要ではなく、
アッセイしようとする試料または分析対象物の性質、た
とえば試験試料の流動性などに依存する選択の問題に過
ぎない。
固相物質の固有荷電を変化または増強させるために、荷
電物質を固相物質に直接コーティングするが、または荷
電物質を微細粒子上にコーティングした後に微細粒子を
固相ベース物質に保持させることができる。別法として
、微細粒子を単独で荷電固相物質として用いることがで
きる。可能な荷電物質の一つはポリマーカチオンであり
、これは固相物質により保持され、反対に荷電した分子
種を誘引、保持し、捕捉試薬を介してアッセイ複合体の
一部となる。
非常に多種の専売ポリカチオンが入手でき、その例とし
ては、ガフコート（Ｇ　ａｆＱ　ｕａｔ）”（Ｇ　Ａ　
Ｆコーポレーション、ウニイン、ＮＪ、０７４７０）、
ジエチルアミノエチル−デキストラン（ングマケミカル
、セントルイス、Ｍｏ、）、およびセルコート（Ｃｅｌ
ｑｕａｔ）ＴＭＬ　−２００およびセルコート”Ｈ−１
００（ナショナル・スターチ・アンド・ケミカル・コー
ポレーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ　５ｔａｒｃｈ　＆　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、プリン
ジウォーター、ＮＪ、０８８０７）などが挙げられる。
補助物質 本発明にとって重大なことではないが、荷電物質はまた
粒子（たとえば「ビーズ」や「微細粒子」）上にコーテ
ィングすることもできる。これらの粒子は、カラム中に
保持することにより、または可溶性試薬と試験試料との
混合物中に懸濁させることによって固相としても働くこ
とができるし、粒子それ自身を固相）−ス物質に保持お
よび固定化することかできる。ここで「保持および固定
化」とは、粒子か一担固相物買上に置かれたら固相物質
内の他の位置へは実質的に移動できないことを意味する
。粒子はポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリプロ
ピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポ
リアクリロニトリル、ポリカーボネートまたは同様の物
質からなる微細粒子物質のあらゆる適当なタイプから当
業者により選択することができる。粒子のサイズは重大
ではないが、粒子の平均直径は用いた同相ヘース物質の
平均孔径よりも小さいのが好ましい。
「補助特異的結合成分」とは、捕捉試薬および指示試薬
の特異的結合成分に加えてアッセイまたは分離手順に用
いたあらゆる特異的結合ベアの一方をいう。以下の実施
例にも示すように、１種または２種以上の補助特異的結
合成分をアッセイに用いることかできる。
つぎに本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、
本発明はこれらに限られるものではない。
実施例）（癌胎児性抗原のサンド仁ノチア・ソセイ）（
１）捕捉試薬の調製 以下に述べる工程に従って、抗体／ポリグルタミン酸（
ＰＧＡ）結合体、すなわち抗体／アニオン性ポリマー捕
捉試薬を調製した。
（ａ）追跡可能なアニオン性ポリマーの調製ックダ（Ｔ
　５ｕｋｕｄａ）らの方法（ＪＮＣＩ；７３；７２１〜
７２９．１９８４）に以下のような修正を加えて、ＰＧ
Ａのナトリウム塩（ｌｙ；７．１４ｘｌＯ−５モル；平
均分子１ｔ１４，０００；ングマ・ケミカル、セントル
イス、Ｍｏ、）を３−（２−ピリジルチオ）プロピオニ
ル−ＰＧＡ（ＦＤＰ−ＰＧＡ）に変えた。ＦＤＰ−ＰＧ
Ａは、チオプロピルセファロ−妥５Ｂ単離の前は遊離の
スルフヒドリルに還元しなかった。その代わり、ＦＤＰ
−ＰＧＡを０゜１Ｍリン酸ナトリウムおよび１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ（ｐＨ６，５）中に溶解し、チオプロピルセフ
ァロース６　Ｂ（６０ｔｔｔＱ：３０９：ファルマシア
・ケミカルズ、ウプサラ、スウェーデン）とともに撹拌
した。透析および凍結乾燥した後、収量２４％のＰＤＰ
−ＰＧＡ結合体か得られた（０．２４４９；１．７２ｘ
１０−５モル）。
以下の手順でジスルフィドが維持されるのを確実にする
ために、チオピリジル基を５−チオ−２〜ニトロベンゾ
ニー）（ＴＮＢ）保護基と交換した。
０．１Ｍｌノン酸ナトリウム（４ｉ（２；ｐＨ７）に溶
解させたＰＤＰ−ＰＧＡ（２０Ｒ９；１．４２Ｘ　１０
−’モル）の溶液に１００モル過剰の１．４−ジチオト
レイトール（分子量１５４．２）を加え、４０°Ｃで１
時間反応させた。混合物を５ｍＭ酢酸すＩ−１）ラム、
０．１４Ｍ　　ＮａＣ１および１ｍＭ　　ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ５５）でＩＭに希釈し、２０００分子量カットオフ（
ＭＷＣ○）管中で希釈バッファーに対して透析した。さ
らに蒸留水に対して透析を続け、ついで凍結乾燥させた
。チオプロピル−ＰＧＡの収】は１３．５ｚ９であった
。Ｈ３−ＰＧＡ（１３，５ｘ９）を０．１Ｍリン酸ナト
リウム（ｐＨ７；９．６ｘ　１０−７モル）中に溶解し
、１０モル過剰の５，５°ジチオビス（２−ニトロ安息
香酸）（ＤＴＮＢ）と室温で１時間反応させた。この混
合物を０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）でＬＯｐｔ
Ｑに希釈し、２００ＯＭＷＣＯ管中で希釈バッファーに
対して透析した。
さらに蒸留水に対して透析を続け、ついで凍結乾燥して
５−（２−ニトロベンゾジチオ）プロピオニル−ＰＧＡ
（ＴＮＢ−ＰＧＡ；３．５次９；６．０７　Ｘ１０−７
モル）を得た。
各捕捉試薬抗体に結合したアニオン性ポリマー分子の数
を追跡するために、ついでＴＮＢ−４４ＰＧＡをフルオ
レセインのエチレンジアミン誘導体−ｃｐ識した。ＴＮ
Ｂ−ＰＧＡ（８，５ｒｔｒ９）を乾燥Ｎ、Ｎ−ジメチル
ホルムアミド（２ｍＱ）中に溶解し、９０モル過剰のＮ
−メチルモルホリン（分子１１０１．１５）で処理し、
温度をＯ′Ｃに下げ、過剰のイソブチルクロロホルメー
ト（分子１１３６．５８）を加えることにより、ＴＮＢ
−ＰＧＡにエチレンジアミン誘導体化フルオレセイン（
ＥＤＡ−Ｆｌ；分子ｆｆ１５３２）を組み込んだ。この
反応はＯ′Ｃで１時間行った。混合物を室温に温め、３
０モル過剰のＥＤＡ−Ｆｌを加え、室温で撹拌しながら
反応を一夜行った。混合物をＯ，１Ｍリン酸ナトリウム
（ｐＨ７）でＩＣ）ＩＱに希釈し、２００ＯＭＷＣＯ管
中で希釈バッファーに対して透析した。さらに透析を蒸
留水に対して続け、ついで凍結乾燥してＴＮＢ−ＰＧＡ
／ＥＤＡ−Ｆｌ結合体（７，８Ｒｙ；５．６Ｘ１０−７
モル）を得た。
ＴＮＢ−ＰＧＡ／ＥＤＡ−Ｆｌ（７，８巧）を０゜１Ｍ
リン酸ナトリウム（３ｍＱ：ｐＨ７）中に溶解し、１０
０モル過剰の１，４−ジチオトレイトールを用いて４０
°Ｃて１時間処理することによりＴＮＢ基を除いた。３
３４　ｎｍから４１２ｎｍへピークがシフトすることに
ついてＵＶ／ＶＩＳ分光光度計上で反応をモニターした
。物質を蒸留水でｌＯｍＱに希釈し、２００ＯＭＷＣＯ
管中で蒸留水に対して透析した。凍結乾燥後、チオプロ
ピル−ＰＧＡ／ＥＤＡ−Ｆｌ（Ｈ３−ＰＧＡ／ＥＤＡ−
Ｆｌ；８．４ｘ９）を得た。この時点でＰＧＡ分子当た
りのフルオレセインの数（すなわちローディング）を決
定するためにＵＶ／ＶＩＳスキャンをとった。この調製
物からはＰＧＡ当たり０．８１フルオレセインの値か計
算された。
（ｂ）抗体の活性化 モノクローナル抗体である抗ＣＥＡ抗体を、ツクダらの
方法（ＪＮＣＩニア３；７２１〜７２９．１９８４）に
従い、下記の手順は例外としてマレイミド活性化した。
抗体の濃度は１ｍ９／ｍ（！であり、１５０モル過剰の
Ｎ−スクシンイミジルｍ−（Ｎ−マレイミド）ベンゾエ
ート（ＳＭＢＥ、分子ｆｆ１３１４．３；シグマ）を用
いた。３〜５個のマレイミド基を抗ＣＥＡ抗体に導入す
るのに１５０モル過剰か必要であることが実験的に決定
された。ノアレス（Ｍｅａｒｅｓ）らの遠心分離法（ア
ナリティカル・バイオケミストリー：１１４２；６８〜
７８．１９８４）により３ｘＱ洗浄カラム中のセファデ
ックスＧ−５０／８０（シグマ）を用いて清浄化（ｃｌ
ｅａｎ　−ｕｐ）を行った。抗体角たりのマレイミド数
は、リウ（Ｌｉｕ）らの滴定法【バイオケミストリー：
１８：６９０〜６９６．１９７９）を用いて決定した。
この抗体活性化の間に抗体角たりに導入されたマレイミ
ドの数は４．６であるのがわかった。
ついで上記工程（１）（ａ）で得たチオプロピル−保護
フルオレセイン標識ＰＧＡをマレイミド誘導抗体と反応
させて、癌胎児性抗原イオン捕捉イムノア、セイに適し
た抗体／ＰＧＡ結合体を得た。
０．１Ｍリン酸ナトリウム（１〜２　ｍＱ：ｐＨ７）中
のマレイミド活性化抗体（１，ｏｉｙ；６．２５Ｘ　Ｉ
Ｑ−’モル）を、ＩＮ　　ＨＣＩを用いてｐＨ６，５に
調節した。ついでＯ，１Ｍリン酸ナトリウム（１００μ
の中の１０モル過剰のＨ３−ＰＧＡ／ＥＤＡ−Ｆｌ（約
１１１９）を活性化抗体調製物に加えた。室温で穏やか
に撹拌しなから結合を一夜行った。混合物を０゜１Ｍリ
ン酸ナトリウム（ｐＨ７）中でＬＭに希釈し、５０．Ｏ
ＯＯＭＷＣＯ管中で０．００１Ｍリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７）に対して透析し、ついで凍結乾燥させた。乾燥物
質を蒸留水（０，２５ｍ＋２）中に再び溶解し、Ａ２８
０での最大のピークを得るために高速液体クロマトグラ
フィー分画を行った。
クロマトグラフィーはＢｌｏ−３ｉｌ　ＴＳＫ２５０（
バイオ−ラド・ラボラトリーズ、リノチモンド、カリフ
ォルニア）３００ｘｘｘ　７．５．ｖｘカラムを用いて
行い、５０ｍＭ硫酸ナトリウム、２０１１１Ｍリン酸ナ
トリウム、および０．３Ｍ　　ＮａＣ１（ｐＨ６，８）
を用いて１　ｍＱ／分で溶比した。
最大ピークのアッセイは、ウシＩｇＧ標準を用いたパイ
オーラドのブラッドフォード（Ｂ　ｒａｄｆｏｒｄ）ア
ッセイに゛よりタンパク質含量のために行った。
ピークには９５５μｙ／＋（ｌのタンパク質が含まれて
おり、これは５．９７Ｘ１０−７モルタンパク質（Ｉｇ
ｃの分子量１６０，０００）に等しかった。ＵＶ／Ｖ　
Ｉ　Ｓをスキャニングし４９４　ｎｍでの吸光度を取る
ことにより、このフラクションにはまた２゜１２モルの
フルオレセインか含まれていることか決定された。モル
フルオレセインの等式から計算した抗体分子当たりのフ
ルオレセイン数は３．６であった。ＰＧＡ分子当たりの
フルオレセイン数が０．８１であることがわかっていた
ので、このことは各抗体に４．４個のＰＧＡが結合して
いることに相当した。ピークのフラクションを凍結し、
引き続きアッセイに用いた。
上記工程で重要なことは、各ポリマーアニオンと抗体と
の間に付着部位か１個しか存在しないことである。両者
の間に共有結合が１個しか存在しないことにより、複数
の活性化基を有するポリマーアニオンを用いた場合に起
こるかもしれない分子内および分子間架橋の可能性を回
避することができる。
上記捕捉試薬の例の代わりに、アニオン性の固相物質と
組み合わせて用いるためにカチオン誘導抗体もまた調製
することができた。
（２）固相物質の調製 使い捨てＩＭｘ”ウェッジの固相繊維マトリックスをポ
リマー四級化合物でコーティングして固相物質に正の電
荷を与えた。セルコートＴＭＬ　　２００（水溶性セル
ロース誘導体）を用いた。セルコー）”＞２００　（５
０μＱ）の１％水溶液を固相物質に加え、ついで３００
ｍＭ　　ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスおよび０．１％Ｎａ
Ｎ３を含有する希釈液（７５μＱ　；ｐＨ７，５）で洗
浄した。
（３）指示試薬 指示試薬はアルカリフォスファターセと抗ＣＥＡ抗体断
片との結合体からなっていたが、この抗体断片は上記工
程（ＩＸｂ）の捕捉試薬で特定した抗体とは異なるエピ
トープに結合するものである。アルカリフォスファター
ゼ標識抗ＣＥＡ抗体断片を５０ｍＭトリス、５０ｍＭ　
　ＮａＣｌ、１ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ、Ｑ、　ｌ　ｍＭ　
　Ｚ　ｎ　Ｃ１２，５ｍＭ酒石酸ナトリウム、０．５％
ウシ皮膚ゼラチンおよび３％マウス血清を含有するバッ
ファー中に入れておいた。
（４）イムノアッセイプロトコール：　ＣＥＡの決定 イオン捕捉イムノアッセイプロトコールには上記工程（
２）で調製した固相物質を使用することが含まれてた。
上記工程（３）の指示試薬（７０μδ）を反応ウェル中
に置いた。ついで上記工程（１）のバッファー中の捕捉
試薬（５０ｍＭ　　Ｎａ　、Ｓ　Ｏ，，２０ｍＭリン酸
ナトリウムおよび３００ｍＭ　　ＮａＣｌ　　（ｐＨ６
，８）からなるバッファー中の抗ＣＥＡ／ＰＧＡ結合体
２０μｑ）をウェルに加えた。ＣＥＡを含有する試料を
ウェルに加え、均一免疫反応混合物を３４．５°Ｃで２
０分間インキュベートした。４つの異なる試料をアッセ
イしたが、それぞれアボット・ラボラトリーズＣＥＡ酵
素イムノアッセイキットからのＣＥＡカリプレーターで
あった。各反応混合物のアリコート（１００μＱ）を四
級化合物処理固相物質に加え、ついて希釈液（７５μＣ
×３）で洗浄した。最後に酵素基質（７０ＩＩＱ　：　
１００ｍＭ　　ＡＭＰ、１ｍＭＭｇｃｌｙ、０．１％Ｎ
ａＮ３および４ｍＭテトラミソルからなる溶ｅ　（ｐＨ
１０，３）中の４−メチルウンベリフェリルホスフェー
ト１．２ｍ）を３４．５°Ｃで加えて指示試薬と反応さ
せ、得られた蛍光の割合を測定した。アッセイの用量作
用結果を第１表に示す。
第１表（ＣＥＡイオン捕捉サンドイッチアッセイ） 捕捉試薬：ＰＧＡ／抗ＣＥＡ抗体結合体指示試薬：アル
カリフォスファターゼ標識抗ＣＥＡ抗体断片 実施例２（マウス免疫グロブリンの競合抑制アッセイ） （１）捕捉試薬の調製 プロティンＡアフィニティー精製マウスモノクローナル
ＩｇＧを、以下の手順に従い水溶性カルボジイミド試薬
（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド；　ＥＤＣＩ）を用いて負に荷電したＰＧ
Ａに結合させた。
フルオレセイ”Ｆ識ＰＧＡ　（１０ｏ；　Ｆ　Ｉ　−Ｐ
ＧＡ）を、リン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ；７５ｍＭ
　　ＫＨ２ＰＯ，および３００ｍＭ　　ＮａＣ１゜ｐＨ
７，２）中の抗体（４，８＋９／戚）の水冷溶液に加え
た。この溶液に新たに調製したＥＤＣＩ水冷溶液（１０
０ｕＱ　；　１０ｔ９ｙｌＱ）を加え、得られた反応混
合物を２．５時間撹拌し続けて室温に温めた。この反応
混合物に、さらに新たに調製したＥＤＣＩの水冷溶液（
５０ａＱ　；　１００ｘｙ／１ｒ２）を急速に撹拌しな
から加えた。反応混合物をさらに１．５時間撹拌した。
ついで混合物を、スフエロゲルＴＳＫ−Ｇカードカラム
（２，１５ｃｘＸ７゜５ｃａ；ベックマン・インスツル
メンツ（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉ
ｎｃ、　、　）　、フラートン、ＣＡ、９２６３４）を
取り付けたスフエロゲルＴＳＫ−３０００ＳＷＧカラム
（２，１５ｃＩＩＩＸ　３０ｃＲ）を用いたゲル濾過ク
ロマトグラフィーにより分画した。
カラムを５１ｇ／分の流速で溶出した。これらプールの
ＰＧＡ／抗体比を、抗体のＦｌ−ＰＧＡ結合体中の蛍光
を定量することにより決定した。結果を第２表に示す。
第２表（ＥＤＣＩを用いて調製したＰＧＡ／抗ＣＥＡ抗
体結合体） （２）固相物質の調製 固相物質をポリマー性四級アンモニウム化合物（ガフコ
ート”７５５Ｎ　；　ＧＡＦコーポレーション）でコー
ティングした。０．５％ガフコートＴＭの水溶液（５０
μのを固相物質の表面に加え、ついで水（７５μｒ：ｌ
）で洗浄した。
（３）指示試薬の捕捉試薬への結合 指示試薬である羊抗マウス免疫グロブリン（ジャクソン
・イムノリサーチ・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ　
ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、　Ｉｎｃ、　、　）、ウェストグローブ、ＰＡ、
１９３９０）のアルカリフォルファターゼ結合体を、１
％魚肉ゼラチンを含有するトリスバッファー食塩水［２
５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび
１００ｍＭＮａＣ１、ｐＨ７，５］中に希釈した。ＰＧ
Ａ／マウスモノクローナル抗体結合体（上記工程（１）
のプール１）の捕捉試薬も同様に処理した。各試薬２０
０μＱを一連の試験管に加え、ついで３７°Ｃで３０分
間インキュベートした。反応混合物のアリコート（７５
μのを上記工程（２）の四級化合物処理固相物質に加え
、ついで直ちにトリスバッファー食塩水（１５０μＱ×
３）でＲ浄した。最後に酵素基質（７０μに１００ｍＭ
ＡＭＰ、１ｍＭ　　ＭｇＣｌ　２．０．１％ＮａＮ３お
よび４ｍＭテトラミソル、ｐＨ１０，３からなる溶ｉｆ
　中の４−メチルウンベリフェリルホスフェ−）１．２
ｍＭ）を３２．７°Ｃで固相物質に加え、得られた蛍光
の割合を測定した。実験結果を第３表および第４表にま
とめて示す。
第３表（捕捉試薬／指示試薬結合の用量作用）（注）※
１０００倍希釈アルカリフォルファターゼ標識羊抗マウ
ス免疫グロブリンと混合する前のＰＧＡ結合抗体の初期
濃度 鼻を考（指示試薬／捕捉試薬奎結合の用量作用） （注）＊アルカリフォルファターゼ標識羊抗マウス免疫
グロブリンと混合する前のＰＧＡ結合抗体の初期濃度は
５μ９／ｍ（ｌてあった。
※※指示試薬の力価は試薬スト／りの希釈に反比例する
。
（４）マウスＩｇＧの競合抑制アッセイ捕捉試薬および
指示試薬を上記工程（３）のようにして調製した。すべ
ての試薬を１％魚肉ゼラチンを含有するトリスバッファ
ー食塩水中に希釈した。指示試薬をストック溶液から１
０００倍に希釈し、捕捉試薬を１０μ９／１に希釈した
。一連の試験管中で適当に希釈した指示試薬、捕捉試薬
、およびマウスモノクローナル抗体各１５０μＱを混合
した。混合物を３７°Ｃで３０分間インキユヘートした
。混合物のアリコート（７５μのを上記工程（２）の四
級化合物処理した固相物質に加え、ついで直ちにトリス
バッファー食塩水（１５０μＣＸ３）で洗浄した。つい
で酵素基質（７０ｔｔＱ：　１００ｍＭ　　ＡＭＰ、１
ｍＭ　　ＭｇＣｌ、、０１％ＮａＮ３および４ｍＭテト
ラミソル、ｐＨ１０，３からなる溶液中の４−メチルラ
ンへりフエリルホスフエート１　、２　ｍＭ）を３２．
７°Ｃで固相物質に加え、得られた蛍光の割合を測定し
た。
マウスＩｇＧの競合抑制アッセイを示すこの実施例の結
果を第５表に示す。
第５表（マウスモノクローナル抗体による指示試薬結合
の抑制） 捕捉試薬：　ＰＧＡ／マウスモノクローナルＩｇＧ結合
体 指示試薬：アルカリホスファターゼ羊抗マウス免疫グロ
ブリン結合体 実施例３（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のサ
ンドイッチアッセイ） （１）捕捉試薬の調製 以下の手順に従い、大きく負に荷電したアルブミン誘導
体を調製して抗ｈＣＧ抗体に結合させて捕捉試薬を生成
した。
（ａ）ウサギ血清アルブミンの修飾による負に荷電した
タンパク質誘導体の調製 ジュー（Ｊｏｕ）らの手順（メソッズ・イン・エンシモ
ロシー：　Ｖｏｌ、　９２、Ｐａｒｔ　Ｅ、　２５７〜
２７６、アカデミツクプレス、１９８３）に従い、ウサ
ギ血清アルブミン（Ｒ３Ａ）を広範囲にわたってスクン
ニル化しパラアゾベンセンスルホネートに結合させた。
リン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ。
１４ｍ（！、ｐＨ８）中の２％Ｒ８Ａを、パラジオキサ
ン中の５％無水コハク酸（２，２８次のと混合した。ｌ
Ｎ　　ＮａＯＨを加えることによりｐＨを８に保った。
反応混合物を室温で３０分間撹拌した。塩酸ヒドロキシ
ルアミン（０，６９）を加え、５Ｎ　　ＮａＯＨの適量
を加えることにより溶液のｐ＋を９，５に調節した。つ
いで混合物を水に対して透析した。得られた５ｔＪＣ，
５−Ｒ３Ａを、以下の反応に従ってパラアゾベンセンス
ルホネートに結合させた。
ＩＮ　　ＨＣＩ　　（０，８１）中のパラアゾベンゼン
スルホン酸（０，１５ミリモル、２６ｘ９）の懸濁液を
水浴中で冷却し、急速に撹拌しなからｌＮＮａＮ０ｔ　
（０，２１１Ｑ）で３０分間処理した。得られたジアゾ
ニウム塩溶液を、急速に撹拌しながら水冷ＳＵＣ，，−
Ｒ３Ａ溶液に滴下した。ｌＮＮａＯＨを加えることによ
り反応混合物のｐＨを１１に保った。暗赤色の反応混合
物を撹拌し、１時間放置して室温に温めた後、水に対し
て広範囲に透析した。得られた５ｐ−３ＵＣ６，−Ｒ３
Ａアニオン性誘導体化タンパク質を使用するときまで冷
蔵して保存した。
（ｂ）抗ｈＣＧＦ（ａｂ’）を断片の調製ニソノフ（Ｎ
　１ｓｏｎｏｆ　ｆ　）らの方法（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙ、　：　８９　；　２３０〜２４４．１９
６０）に従い、アフィニティー精製ヤギ抗ｈＣＧ抗体か
ら抗ｈＣＧＦ（ａｂ’）２断片を調製した。リン酸バッ
ファー食塩水（ｐＨ７，２）中のアフィニティー精製抗
体溶液の一部を、酢酸を加えることによりｐＨ４の酸性
にした。この時点での抗体の好ましい濃度は１　ｍｙ／
　ｍＱであった。ペプシンを加えて最終濃度を２０μ９
／ｍＱにした。混合物を３７°Ｃで一夜インキユベート
した。５Ｎ　　ＮａＯＨを添加することにより反応を停
止させて反応混合物のｐＨを７．５にもっていった。消
化した抗体断片溶液を２０ｍｇ／ｍＱまで濃縮した。Ｆ
（ａｂ’）を断片の精製を、スフエロゲルＴＳＫ−Ｇガ
ードカラム（２、１５ｃｚＸ　７．５ｃｍ）を取り付け
たスフェロゲルＴＳＫ−３０００ＳＷＧカラム（２，１
５ｃｚｘ　３０ｃ１りを用いたケル濾過高速液体クロマ
トグラフィーにより行った。
（Ｃ）抗ｈＣＧ　　ＴＮＢ−Ｆａｂ’断片の調製パーハ
ム（Ｐａｔｈａｍ）ら（Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅ
ｔｈｏｄ、　：５３°１３３〜１７３．１９８２）およ
びブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）ら（サイエンス：２２９
：８１〜８３．１９８５）の方法の変法に従い、抗ｈＣ
ＧＦａｂ’断片を調製しチオール反応体に誘導体化した
。撹拌しながら２０ｍＭ　　ＥＤＴＡを含有する０、Ｉ
Ｍ　　ＮａＡｓ０．の溶液（１５８μＱ）を、ＰＢＳ中
の”　Ｉ　　Ｆ　（ａ　ｂ’）ｓを痕跡量含有するヤギ
Ｆ　（ａ　ｂ’）ｚ　（ヤギ抗ヒト絨毛性性腺刺激ホル
モン抗体断片、１６ｘｙ／ｚｃ）　　（１，２８ｍのに
加えた。０．１Ｍシスティン−ＨＣｌ　　（１５８μＱ
）を加えることにより還元的開裂反応を開始させた。
反応混合物を窒素ガス雰囲気下に撹拌しながら３７°Ｃ
で１時間インキュベートした。ついで５，５−ジチオビ
ス−（２−ニトロ安息香酸）（１９ｉ９）を加えること
により反応を停止させた。室温で一夜撹拌した後、混合
物をＰＢＳで前以て平衡化したＰＤ−１０カラム（ファ
ルマシア、ビス力タウエイ、ＮＪ）上でクロマトグラフ
ィーにかけ、ついでサイズ排除高速液体クロマトグラフ
ィー［スフェロゲルＴＳＫ−Ｇガードカラム（２，ｌ　
５ｃ屑Ｘ７．５ｃｍ）を取り付けたスフェロゲルＴＳＫ
−２０００ＳＷＧカラム（２，１５ｃ１１ｘ　３０ｃｍ
）］上のクロマトグラフィーにかけた。精１９Ｆａｂ’
チオニトロベンゾエート誘導体をＣＸ−１０１Ｆ’に濾
過ユニット（ミリボア、ベツドフォード、ＭＭＡ）を用
いて７　、９　ｍｙ／ｍＱに濃縮した。
（ｄ）抗ｈＣＧ　　ＴＮＢ−Ｆａｂ’断片の５ｐ−３Ｕ
Ｃ，、−Ｒ３Ａへの結合 １Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ；８６μのの溶液を、
３７．５ｍＭリン酸ナトリウム、１５ＱｍＭ　　ＮａＣ
１および２ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ６，８）中に５ｐ
−３ＵＣ，５−Ｒ３Ａ　（２，２ｚ９／ＩＱ）を含有す
る溶液（４，２ｆｆＱ）に加えた。混合物を３７°Ｃで
３時間、ついで室温で一夜イキュベートした。得られた
反応混合物を、セフアゾ、ソクス”Ｇ−２５（ファルマ
シア）を充填し７５ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ
　　ＮａＣｌおよび２ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ６，８
）で前以て平衡化した２、５ｃｍｘ２０ｃｍカラム上で
クロマトグラフィーにかけた。還元５ｐ−３ＵＣ，５−
Ｒ３Ａ　（０、４８ｍ９／！ＩＱ’）のプールしたフラ
クションの２μＱを抗ｈＣＧ　　ＴＮＢ−Ｆａｂ’（０
，１５＋Ｑニア９　ｍｙ／　ｍＱ）と混合した。混合物
を室温で一夜撹拌した。ついて反応混合物を１００ｍＭ
ヨード酢酸（１０７μｅ）で処理し、室温で１時間撹拌
した。
Ｆａｂ’−８ｐ−３ＵＣ，、−Ｒ３Ａ結合体を、スフェ
ロゲルＴＳＫ−Ｇガードカラム（２，１５ＣＩＸ７，５
ｃｍ）を取り付けたスフェロゲルＴＳＫ−３０００ＳＷ
Ｇカラム（２，１５ＣπＸ　３　Ｑ　ｃｍ）を用いたサ
イズ排除液体高速クロマトグラフィーにより精製した。
（ｅ）抗ｈＣＧ抗体の５ｐ−３ＵＣ８５−Ｒ３Ａへの結
合 Ｎ、Ｎ−ジエチルホルムアミド中の３ＱｍＭスクシンイ
ミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−７クロヘキサン
ー１−カルボキシレートの溶液（２７μＩ２）を、ＰＢ
Ｓ中のアフィニティー精製ヤギ抗ｈＣＧ抗体（３ｘｙ／
＊（り（２、２５ｕ□に加えた。
反応混合物を室温で１時間撹拌し、ついで７５ｍＭリン
酸ナトリウム、３００ｍＭ　　ＮａＣｌおよび２ｍＭ　
　ＥＤＴＡ　（ｐＨ６，８）で前以て平衡化したＰＤ−
１０カラム上でクロマトグラフィーにかけた。修飾抗体
（１，６ｏ／１Ｈののプールしたフラクションの１．８
１ｉ２を上記工程（ｄ）のＤＴＴ還元５ｐ−３ＵＣ，、
−Ｒ３Ａ　（０，４８ｚ９／１ｉ２Ｘ３ｉｃ）と混合し
た。室温で一夜撹拌した後、１００ｍＭヨード酢酸（０
，２５だのを加え室温で１時間撹拌することにより反応
を停止させた。
抗体−３ｐ−８ＵＣｅｓ−Ｒ３Ａ結合体を、上記工程（
ｄ）と同様にしてサイズ排除高速液体クロマトグラフィ
ーにより精製した。
（２）指示試薬の調製 指示試薬は、２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、１００ｍＭ　　ＮａＣ１，１ｍＭ　　Ｍ　ｇ
　Ｃｌ　２．０　、１　ｍＭ　　Ｚ　ｎ　ＣＩ　ｔ、０
．０７％Ｎ　ａ　Ｎ　３および１％魚肉ゼラチンを含有
するアッセイバッファー（ｐＨ７，５）中のアルカリホ
スファターセーヤギ抗ｈＣＧ抗体結合体からなっていた
。
（３）ｈＣＧのサンドイッチイムノアッセイイオン捕捉
イムノアッセイプロトコールには、実施例２の工程（２
）で調製した固相物質、上記工程（２）の指示試薬（ア
ルカリホスファターゼーヤギ抗ｈＣＧ抗体結合体）、上
記工程（１）（ｄ）および（ｅ）で調製した２つの異な
る捕捉試薬（ヤギ抗ｈＣＧＦａｂ’−３ｐ−３ＵＣ，５
−Ｒ３Ａおよびヤギ抗ｈＣＧ　　Ｉｇｃ　　Ｓｐ　　５
ｕｃｓｓ　　Ｒ３Ａ）のうちの１つ、および精製ｈＣＧ
標準溶液を使用することが含まれていた。すべての試薬
はアッセイバッファー中に適当に希釈した。等Ｎ（７５
０μｇ）の指示試薬およびｈＣＧ標準溶液を一連の試験
管中に入れた。３７°Ｃで３０分間インキュベートした
後、各インキュベート混合物の１２５μＱアリコートを
別々の試験管中で等量の捕捉試薬と混合した。得られた
混合物を３０分間インキュベートした。ついでアッセイ
混合物（７５μのを各固相物質に加えた。ついで固相物
質を洗浄バッファー［２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、１００ｍＭ　　ＮａＣｌ、１ｍＭ　
　Ｍｇｃｌ、、０．１ｍＭ　　ＺｎＣ１，および０．０
７％ＮａＮ３、ｐＨ７，５］　　（１５０μＣｘ３）で
洗浄した。ついで酵素基質（７０μρ：１００ｍＭＡＭ
Ｐ、１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．０．１％ＮａＮ、および４
ｍＭテトラミソル、ｐＨ１０，３からなる溶液中の４−
メチルウンベリフェリルホスフェート１．）ｍＭ）を固
相物質に加えた。得られた蛍光の割合を３２．７°Ｃで
測定した。実験結果を第６表にまとめて示す。
皐旦衣（異なる捕捉試薬を比較したｈＣＧイオン捕捉サ
ンドイッチアッセイ） 指示試薬・ｈＣＧ特異特異的ヤギ１−Ｇルカリホスファ
ターゼ イ 間接イオン捕捉イムノアッセイには、実施例２の工程（
２）で調製した固相物質、アルカリホスファターセー羊
抗マウスＩｇＧ結合体（ジャクソン・イムノリサーチ・
ラボラトリーズ）の指示試薬、上記工程（ＩＸｅ）で調
製したヤギ抗ｈＣＧ　　Ｆ（Ｆａ　ｂ’）　　ＳＴ）　
　５ＵＣｅｓ　　Ｒ３Ａ、ｖウスモノクローナル抗ｈＣ
Ｇ抗体の補助特異的結合成分（ムノリサーチ：トーマス
リバー、ＮＪ、０８７５３）および精製ｈＣＧ標準溶液
を使用することが含まれていた。補助特異的結合成分は
、分析対象物および指示試薬と結合させるために用いた
。
すべての試薬はアッセイバッファー中に適当に希釈した
。等ｆｆ１（１５０μのの指示試薬、ｈＣＧ試料溶液お
よび補助特異的結合成分を一連の試験管中に入れた。３
７°Ｃで５分間インキュベートした後、捕捉試薬（１５
０μのを各試験管に加えた。得られた混合物を５分間イ
ンキュベートした。ついでアッセイ混合物（２００μｍ
２）を各調製固相物質に加えた。ついで上記工程（３）
と同様にして固相物質を洗浄バッファーで洗浄し、酵素
基質溶液で処理した。得られた蛍光の割合を３２．７°
Ｃで測定した。アッセイの結果を第７表に示す。
第７表（ｈＣＧのイオン捕捉間接サンドイッチイムノア
ッセイ） 捕捉試薬：ヤギ抗ｈＣＧ　　Ｆ（Ｆａｂ’）−３ｐ−８
ＵＣ１＋５−Ｒ３Ａ 指示試薬：羊抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ 補助特異的結合成分：マウスモノクローナル抗ｈＣＧ抗
体 （５）ｈＣＧの二重間接サンドイッチイム／アッセイ イオン捕捉イム７アツセイプロトコールには、実施例２
の工程（２）で調製した固相物質、アルカリホスファタ
ーセー羊抗マウスＩｇＧ結合体（ジャクソン・イムノリ
サーチ・ラボラトリーズ）の指示試薬、マウスモノクロ
ーナル抗ｈＣＧ抗体の補助特異的結合成分（イムノサー
チ・トーマスリバー、ＮＪ、０８７５３）および精製ｈ
ＣＧ標準溶液を使用することか含まれていた。プロトコ
ールにはさらに、アフィニティー精製ヤギ抗ｈＣＧ抗体
の第二の補助特異的結合成分およびウサギ抗ヤギＩｇＧ
−３ｐ−３ＵＣ，、−Ｒ３Ａの捕捉試薬を使用すること
か含まれていた。補助特異的結合成分の調製は、上記工
程（１）（ｅ）に記載の手順に従ってアフィニティー精
製ウサキ抗ヤギＩｇＧ　（カッペル（Ｃａｐｅｌ）　　
；コクランビル、ＰＡ、１９３３０）を５ｐ−３ＵＣ，
５−Ｒ３Ａに結合させることにより行った。すべての試
薬はアッセイバッファー中に適当に希釈した。等量（１
００μのの指示試薬、ｈＣＧ試料溶液および第一の補助
特異的結合成分を一連の試験管中に入れた。３７°Ｃで
１０分間インキュベートした後、第二の補助特異的結合
成分（１００μｅ）を加え、インキュベートを３７°Ｃ
でさらに５分間続けた。最後に捕捉試薬（１００μＱ）
を各試験管に加えた。得られた混合物を５分間インキュ
ベートした。ついでアッセイ混合物（２００μＱ）を各
調製固相物質に加えた。ついて上記工程（４）と同様に
して固相物質を洗浄バッファーで洗浄し、酵素基質溶液
で処理し、蛍光の割合をで測定した。アッセイの結果を
第８表に示す。
（以下余白） 第８表（ｈＣＧのイオン捕捉二重間接サンドイッチイム
ノアッセイ） 捕捉試薬・ウサギ抗ヤギＩｇＧ−３ｐ−３ＵＣｅｓＲ３
Ａ 指示試薬、羊抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ 補助特異的結合成分：マウスモノクローナル抗ｈＣＧ抗
体 補助特異的結合成分：ヤギ抗ｈＣＧ抗体ン） （１）捕捉試薬の調製 以下に述べる手順に従って、抗体／ポリグルタミン酸結
合体を調製した。
（ａ）ＰＧＡナトリウム塩の遊離酸への変換ＰＧＡのナ
トリウム塩＜２００ｍ９：　１．４７Ｘ１０−５モル；
平均分子量１３，６００；シグマ・ケミカル、セントル
イス、Ｍｏ、）　を、水（６０ｎの中で陽イオン交換樹
脂（ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８；１３９；バイオラド、リッチセ
ント、ＣＡ）とともに３時間撹拌した。上澄み液をデカ
ントし、濾過し、蒸発させてＰＧＡの遊離酸（１３７ｘ
ｙ：平均分子Ｎｉｌ　１６２０）を白色粉末として８０
％の収率て得た。
（ｂ）ＩＴＣ−ＰＧＡの調製 ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ　；　２ｘＱ’）中の遊
離酸ＰＧＡ　（６５ｕ；　５．６ｘ　１０−’モル）の
溶液に、トリエチルアミン（１００μＱ、７．２Ｘ１０
−４モル）およびｌ、３−フェニレンジイソシアネート
（１１０肩９：　５．７Ｘ　１０−’モル；アルトリ、
チ・ケミカル、ミルウオーキー、Ｗｌ）を加えた。室温
で一夜撹拌した後、酢酸（１００μＱ；１．７Ｘ１０−
’モル）を加え、ついで反応混合物を蒸発させた。残渣
に塩化メチレン（２５１Ｑ＞を加え、混合物を２時間撹
拌した後に濾過してＩＴＣ−ＰＧＡを白色粉末（１０１
ｍｇ）として得た。
（ｃ）ＰＧＡ標識ヤギ抗マウス捕捉試薬の調製ＩＴＣ−
ＰＧＡ　（２９５μｙ；　２．５ｘ　１０−８モル；２
０％ＤＭＦ１０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０（
４０μｇ）中）を、ヤギ抗マウスＩｇＧ（２００μ９；
　１．２５Ｘ　１０−”モル；シグマ・ケミカル；　Ｏ
，１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７（４０μの中）の緩衝
溶液に加えてＰＧＡ標識ヤギ抗マウス捕捉試薬を調製し
た。室温にて２日間撹拌した後、０゜１Ｍトリス（２０
μＱ；ｐＨ７，４）を加え、得られた混合物を使用する
ときまで８゜Ｃで保存した。
（２）抗プロゲステロン抗体の間接イムノア・ソセイ 抗プロゲステロン抗体イオン捕捉イムノアッセイには、
実施例１工程（１）に記載のようにポリマー性四級化合
物でコーティングした固相物質、を使用することが含ま
れていた。試料（６０μのを反応ウェルに加えた。試料
にはリン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ；５０ｍＭリン酸
ナトリウム、９９ｍＭ　　ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ３
、ｐＨ７゜４）中にモノクローナル抗プロゲステロン抗
体が０．５．５０．１００．２５０および５００ｎ９／
！ｔ２の濃度で含まれていた。ついでＰＢＳ　（２０μ
のを反応ウェルに加え、ついで指示試薬であるアルカリ
フォスファターゼ標識プロゲステロンの緩衝溶液＜２０
ｕＱ：　５０ｍＭトリス、ｐＨ７４，１５０ｍＭ　　Ｎ
ａＣ１，１％ＮａＮ３．１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．０．１
ｍＭ　　ＺｎＣｌ２および１％ＢＳＡからなるトリスバ
ッファー中に３μ９／ＩＲＩ２）を加えた。混合物を３
４．５°Ｃで１０分間インキュベートした後、捕捉試薬
（２０μＱ；上記工程（１）に記載のようにＰＢＳスト
ック溶液中に１７１００に希釈したＰ　Ｇ　Ａ　、１識
ヤギ抗マウス抗体）を加えた。ついで混合物を３４．５
°Ｃでさらに１０１インキユベートした。ついで混合物
の１００μｇアリコートを固相物質に加え、ついで希釈
液（７５μＱ×３）で洗浄した。最後に酵素基質溶ンｆ
ｆ１（７０μ＆；　　１００ｍＭ　　　ＡＭＰ、　　１
ｍＭ　　Ｍｇ　Ｃ＋　２．０．１％ＮａＮ３および４ｍ
Ｍテトラミソル、ｐＨ１０，３の溶液中の４−メチルウ
ンベリフェリルホスフェート１．２ｍＭ）を固相物質に
加え、得られた蛍光の割合を測定した。ア／セイの結果
を第９表に示す。
第９表（マウスモノクローナル抗プロゲステロン抗体イ
オン捕捉アッセイ） 捕捉試薬：　ＰＧＡ標識ヤギ抗マウス抗体指示試薬：ア
ルカリフォスファターゼ標識プロゲステロン （３）プロゲステロンの間接競合イムノア・ノセイ固相
を実施例１工程（２）に記載のようにして調製した。Ｐ
Ｂ’Ｓ中にプロゲステロンを種々の濃度で含有する試料
（６０μｇ）をプロゲステロン標識アルカリフォスファ
ターゼ指示試薬（上記工程（２）のトリスバッファー中
に０４μｙ／７ＩＱ）を混合した。混合物を３４５°Ｃ
で１０分間インキュベートした後、上記工程（２）に記
載のようにしてＰＧＡ標識ヤキ抗マウス抗体捕捉試薬（
２０μＱ）を加えた。得られた混合物を３４．５°Ｃで
さらに１０分間インキュベートした。ついで混合物の１
００μｅアリコートを固相物質に加え、ついで希釈液で
３回洗浄した。最後に酵素基質溶液（上記工程（２）に
記載のもの、７０μのを固相物質に加え、得られた蛍光
の割合を測定した。
アッセイの結果を第１０表に示す。
（以下余白） 第１０表（プロゲステロンのイオン捕捉間接競合アッセ
イ） 捕捉試薬：　ＰＧＡ標識ヤギ抗マウス抗体指示試薬：ア
ルカリフォスファターゼ標識プロゲステロン 補助特異的結合成分：マウス抗ブロケステロン抗体 本発明の概念は種々のタイプの結合アッセイに適用する
ことができる。しかしながら、当業者には、本発明概念
を適用することができる他の多くのタイプのアッセイ（
抗体または抗原以外の分析対象物のアッセイを含む）を
想起することができるであろう。

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）流体試料中の分析対象物の検出方法であって、（
    ａ）（ｉ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電物質
    に結合した第一の結合成分からなる可溶 性捕捉試薬、 （ｉｉ）分析対象物に対して特異的で検出可能なシグナ
    ルを生成することのできる標識に結合 した第二の結合成分からなる可溶性指示試 薬、および （ｉｉｉ）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固
    相物質 を用意し、 （ｂ）流体試料を該捕捉試薬と接触させることによって
    捕捉試薬を試料中の分析対象物と結合させて捕捉試薬／
    分析対象物複合体を生成させ、 （ｃ）該捕捉試薬／分析対象物複合体を該指示試薬と接
    触させることによって該指示試薬を分析対象物と結合さ
    せて捕捉試薬／分析対象物／指示試薬サンドイッチ複合
    体を生成させ、 （ｄ）試料を該固相物質と接触させることによって該固
    相物質を該サンドイッチ複合体の該第一の荷電物質に誘
    引、付着させて該サンドイッチ複合体を試料から分離し
    、ついで （ｅ）試料中の分析対象物の存在または量の指標として
    、該固相または未結合指示試薬に付随する該標識を検出
    する ことを特徴とする方法。
  2. （２）捕捉試薬と指示試薬とを流体試料と同時に接触さ
    せる請求項（１）記載の方法。
  3. （３）捕捉試薬および指示試薬の少なくとも一方が、少
    なくとも１つの補助特異的結合成分に対して特異的であ
    り、該補助特異的結合成分はサンドイッチ複合体の生成
    に必要なものである請求項（１）記載の方法。
  4. （４）流体試料中の分析対象物の検出方法であって、（
    ａ）（ｉ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電物質
    に結合した第一の結合成分からなる可溶 性捕捉試薬、 （ｉｉ）該第一の結合成分に対して特異的で検出可能な
    シグナルを生成することのできる標識 に結合した第二の結合成分からなる可溶性 指示試薬、および （ｉｉｉ）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固
    相物質 を用意し、 （ｂ）流体試料を該捕捉試薬および該指示試薬と接触さ
    せることによって、該捕捉試薬と結合することについて
    試料中の分析対象物を該指示試薬と競合させて捕捉試薬
    ／分析対象物複合体および捕捉試薬／指示試薬複合体を
    生成させ、 （ｃ）試料を該固相物質と接触させることによって該固
    相物質を該第一の荷電物質に誘引、付着させて該複合体
    を試料から分離し、ついで （ｄ）試料中の分析対象物の存在または量の指標として
    、該固相または未結合指示試薬に付随する該標識を検出
    する ことを特徴とする方法。
  5. （５）捕捉試薬と指示試薬とを流体試料と逐次接触させ
    る請求項（４）記載の方法。
  6. （６）捕捉試薬および指示試薬の少なくとも一方が、少
    なくとも１つの補助特異的結合成分に対して特異的であ
    り、該補助特異的結合成分はサンドイッチ複合体の生成
    に必要なものである請求項（４）記載の方法。
  7. （７）流体試料から分析対象物を分離する方法であって
    、 （ａ）（ｉ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電物
    質に結合した第一の結合成分からなる可溶 性捕捉試薬、および （ｉｉ）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固相
    物質 を用意し、 （ｂ）流体試料を該捕捉試薬と接触させることによって
    捕捉試薬を試料中の分析対象物と結合させて捕捉試薬／
    分析対象物複合体を生成させ、ついで（ｃ）試料を該固
    相物質と接触させることによって該固相物質を該第一の
    荷電物質に誘引、付着させて該捕捉試薬／分析対象物複
    合体を試料から分離する ことを特徴とする方法。
  8. （８）第一の荷電物質と反対に荷電した第二の荷電物質
    を固相物質上に保持させることにより第二の荷電物質が
    該第一の荷電物質に誘引、付着する請求項（１）、（４
    ）または（７）記載の方法。
  9. （９）第一の荷電物質と反対に荷電した第二の荷電物質
    に捕捉試薬を接触させる工程をさらに含み、そのことに
    よって捕捉試薬を固相物質と接触させる前に第二の荷電
    物質が第一の荷電物質に誘引、付着するようにする請求
    項（１）、（４）または（７）記載の方法。
  10. （１０）第一の荷電物質がアニオン性物質であり、第二
    の荷電物質がカチオン性物質である請求項（８）記載の
    方法。
  11. （１１）第一の荷電物質と反対に荷電した多数の荷電微
    細粒子が固相物質に保持されている請求項（１）、（４
    ）または（７）記載の方法。
  12. （１２）捕捉試薬が補助特異的結合成分の少なくとも１
    つに対し特異的であり、該補助特異的結合成分は分析対
    象物に対し特異的である請求項（１）、（４）または（
    ７）記載の方法。
  13. （１３）（ａ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電
    物質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕捉試薬
    、 （ｂ）分析対象物に対して特異的で検出可能なシグナル
    を生成することのできる標識に結合した第二の結合成分
    からなる可溶性指示試薬、および（ｃ）該第一の荷電物
    質と反対に荷電した不溶性固相物質 からなることを特徴とする、流体試料中の分析対象物の
    存在または量を決定するためのサンドイッチイムノアッ
    セイキット。
  14. （１４）（ａ）分析対象物に対して特異的で第一の荷電
    物質に結合した第一の結合成分からなる可溶性捕捉試薬
    、 （ｂ）捕捉試薬に対して特異的で検出可能なシグナルを
    生成することのできる標識に結合した第二の結合成分か
    らなる可溶性指示試薬、および （ｃ）該第一の荷電物質と反対に荷電した不溶性固相物
    質 からなることを特徴とする、流体試料中の分析対象物の
    存在または量を決定するための競合イムノアッセイキッ
    ト。
  15. （１５）第一の荷電物質と反対に荷電され固相物質上に
    保持された第二の荷電物質をさらに含む請求項（１３）
    または（１４）記載のキット。
  16. （１６）第一の荷電物質に結合した特異的結合成分、お
    よび該第一の荷電物質と反対に荷電した第二の荷電物質
    からなり、該第一の荷電物質および該第二の荷電物質は
    互いにイオン結合的に結合している配合物。
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